CN115851900B - circRNA制备肾脏纤维化诊断试剂中的用途以及诊断设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及尿液外泌体环状核糖核酸(circRNA)在用于预测肾脏纤维化中的用途，属于医学分子生物学技术领域。本发明发现尿液外泌体中的环状核糖核酸可以用于反映慢性肾脏病进展，并提示肾纤维化程度，通过发掘尿液外泌体中环状核糖核酸的表达，将其结果作为肾纤维化生物标志物。

Description

circRNA制备肾脏纤维化诊断试剂中的用途以及诊断设备

技术领域

本发明涉及尿液外泌体环状RNA在用于预测肾脏纤维化中的用途，属于医学分子生物学技术领域。

背景技术

慢性肾脏病是中国乃至世界范围内的一个重要公共卫生问题。最近针对中国人的横断面调查显示，慢性肾病的发病率为10.8％[1]。以肾小球硬化和肾小管间质纤维化(TIF)为特征的肾纤维化是终末期肾病的常见病理表现[2]。肾纤维化的诊断是一个长期而艰巨的临床问题。肾活检是目前诊断慢性纤维化的金标准。肾活检是一种有创性检查，可能会导致严重的并发症，如出血、误穿其他脏器等。但在临床实践中，很难进行重复进行肾活检，无法动态监测肾纤维化的发展。到目前为止，还没有无创的检测方法能够准确诊断肾纤维化[3]。近年来，尿液生物标志物引起了广泛关注。Li等人首次建立了尿RNA定量PCR检测方法[4]。微阵列技术的发展使得尿液RNA检测成为研究热点。

References:

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发明内容

本发明提供了一种用于诊断肾脏纤维化的标志物，其在患者尿液外泌体中表达下调，能够有效地对样本进行分类和诊断。

对circRNA的表达量进行检测的试剂用于制备肾脏纤维化诊断试剂中的用途，所述的circRNA是指hsa_circ_0036649。

所述的表达量是指尿液外泌体中的表达量。

还包括对尿液外泌体中hsa_circ_0036649的表达量进行检测的步骤。

还包括通过正向引物和反向引物扩增hsa_circ_0036649逆转录产物的步骤。

还包括通过正向引物和反向引物对内参基因进行扩增的步骤。

所述的内参基因是U6。

还包括从尿液外泌体中提取circRNA的步骤。

一种肾脏纤维化诊断设备，包括：

尿外泌体分离模块，用于从尿液样本中分离出尿外泌体；

RNA提取模块，用于从外泌体中提取得到circRNA；

反转录模块，用于对提取得到的circRNA进行反转录后获得cDNA；所述的circRNA是指hsa_circ_0036649；

定量PCR模块，用于对cDNA进行定量检测；

判定模块，用于根据样本cDNA表达量进行区分，小于阈值的判定为存在肾纤维化的样本。

所述的阈值为0.597时显示敏感性和特异性最佳。

有益效果

本发明发现尿液外泌体中的环状核糖核酸可以用于反映慢性肾脏病进展，并提示肾纤维化程度，通过发掘尿液外泌体中环状核糖核酸的表达，将其结果作为肾纤维化生物标志物。

附图说明

图1是尿外泌体鉴定。A:健康对照和慢性肾病患者外泌体的透射电镜图像。B:NTA尿液外泌体粒径分析。C:蛋白质印迹显示健康对照和慢性肾病患者的外体表达CD9和TSG101。

图2是人类环状核糖核酸微阵列。A:环状核糖核酸微阵列火山图。B：环核糖核酸微阵列的热图。

图3是hsa_circ_0036649在慢性肾病患者和健康对照者尿液外泌体中的表达。A:与健康对照组相比，慢性肾病患者hsa_circ_0036649的表达显著降低。B:CKD患者中，轻、中、重度肾纤维化患者尿液外泌体hsa_circ_0036649表达较无纤维化患者显著降低(A图中：#P<0.001CKDvs健康对照；B图中：*P＝0.012轻度-中度纤维化vs无纤维化；**P＝0.041重度纤维化vs轻度-中度纤维化，P<0.001重度纤维化vs无纤维化)。

图4是hsa_circ_0036649表达与临床参数的相关性。A:hsa_circ_0036649与Scr的Spearman相关性(rs＝-0.366，P<0.001)。B:hsa_circ_0036649与BUN的Spearman相关性(rs＝-0.215，P＝0.006)。C:hsa_circ_0036649与胱抑素c的Spearman相关性(rs＝-0.424，P<0.001)。D:hsa_circ_0036649与eGFR的Spearman相关性(rs＝0.374，P<0.001)。

图5是hsa_circ_0036649表达与24h蛋白尿、肾纤维化病理参数的相关性。A:hsa_circ_0036649与24h蛋白尿的Spearman相关性(rs＝-0.214，P＝0.024)。B:hsa_circ_0036649与TIF评分的Spearman相关(rs＝-0.360，P<0.001)。C:hsa_circ_0036649与肾小球硬化评分的Spearman相关性(rs＝-0.273，P＝0.004)。

图6是受试者工作特征曲线显示尿外泌体hsa_circ_0036649对肾纤维化的诊断价值。ROC曲线显示尿外泌体hsa_circ_0036649可区分肾纤维化(AUC为0.706，95％CI，0.606-0.807；P＝0.001)。

图7是circRNA引物验证过程说明。

图8是circRNA引物验证过程说明。

图9-1是Hsa_circ_0036649的扩增曲线。

图9-2是内参基因U6的扩增曲线。

具体实施方式

外泌体是由直径为40-100纳米的多囊复合体和细胞膜融合而成的一种微脂质双层微胶囊结构。在外泌体形成过程中，外泌体从细胞的细胞质中捕获一些生物分子，包括蛋白质和核糖核酸[5，6]。Pisitkun等人首先在尿液中发现了外泌体[7]。本发明发现：尿液外泌体中的环状核糖核酸可以用于反映慢性肾病进展，并提示肾纤维化损伤程度，通过发掘尿液外泌体中环状核糖核酸的表达，将其结果作为肾纤维化生物标志物。

[5]Théry C,Zitvogel L,Amigorena S.Exosomes:composition,biogenesis andfunction.Nat Rev Immunol.2002；2(8):569-79.

[6]Vlassov AV,Magdaleno S,Setterquist R,Conrad R.Exosomes:currentknowledge of their composition,biological functions,and diagnostic andtherapeutic potentials.Biochim Biophys Acta.2012；1820(7):940-8.

[7]Pisitkun T,Shen RF,Knepper MA.Identification and proteomicprofiling of exosomes in human urine.Proc Natl Acad Sci.2004；101(36):13368-73.

研究方法

首先选择3例无肾纤维化的CKD(慢性肾脏病)患者和3例肾纤维化患者作为研究对象。收集尿液样本，分离尿液外泌体中的总RNA，用人circRNA芯片进行分析。进行初步的circRNA筛选。

然后，选取皖南医学院附属弋矶山医院肾内科经病理证实的110例CKD患者对筛选得到的circRNA进行验证。110例CKD患者的病理类型分别为：IgA肾病(42例)、膜性肾病(28例)、微小病变型肾小球肾炎(7例)、局灶节段性肾小球硬化(7例)、糖尿病肾病(2例)、高血压肾病(4例)、毛细血管内增生性肾小球肾炎(1例)，系膜增生性肾小球肾炎(n＝5)、膜增生性肾小球肾炎(n＝3)、新月体肾炎(n＝1)和轻微肾小球异常(n＝10)。排除标准为：患者年龄在18岁以下或80岁以上；患有慢性肝病、尿路感染、癌症或器官移植的患者；使用类固醇或免疫抑制药物。收集实验室检查结果。共有年龄和性别匹配的健康志愿者(n＝54)也入选，定义是常规尿液分析无异常且肾功能正常(估计肾小球滤过率(eGFR)>90ml^-1·min^-1·1.73m^-2)。

肾纤维化的诊断标准

肾纤维化采用石蜡包埋切片，用高碘酸-希夫马森三色染色。根据Schaier等人的方法，使用半定量评分系统在高碘酸Schiff染色切片中评估肾小球硬化。每个肾小球根据硬化程度从0到4进行分级，计算整个组织样本中所有肾小球的平均值进行分析。评估染色切片上肾小管间质纤维化(Tubulointerstitial fibrosis，TIF)的百分比，并估计TIF的严重程度。诊断标准确定为：0％为无纤维化，≤50％情况下为轻-中度纤维化，>50％为重度纤维化。

样品收集和处理方法

尿液标本和外泌体来源于入院后采集的清晨尿液标本。样品在3000g、4℃离心30分钟，然后将上清液在13500g、4℃离心30分钟，丢弃沉淀物，并在4小时内以100000g离心上清液70分钟，沉淀物悬浮在100μL磷酸盐缓冲液(PBS)。悬浮液为尿液外泌体(U-EXO)，通过透射电子显微镜(TEM，Hitachi，HT-7700)、纳米颗粒追踪分析(NTA)(ParticleMetrix’ZetaView)和western blot(检测CD9和TSG101)对提取物进行鉴定。

RNA提取方法：

使用Trizol LS分离外泌体中的RNA。采用agilent2100生物分析仪对RNA进行质量控制。使用NanoDrop 2000(Thermo，USA)中260/280处的相对吸光度比评估RNA的浓度和纯度。

circRNA表达的测试

采用联川生物科技有限公司的ceRNA芯片检测3例无纤维化CKD患者U-EXO(NFU-EXO)和3例肾纤维化U-EXO(FU-EXO)的circRNA表达。

实时RT定量PCR

初步筛选得到的circRNA为has_circ_0036649，其相关的参考序列可以通过circBase数据库进行检索得到。

使用PrimeScript RT试剂盒(TAKARA，Japan)进行逆转录。采用TB Green PremixEx Taq Kit试剂盒(TAKARA,Japan)进行荧光定量PCR，针对has_circ_0036649的聚合酶链反应引物如下：

正义：5'-TCTCCATTGACAAAATCCATCT-3'(SEQ ID NO.1)

反义：5’-GCCTTCTAGACTGAAATGTCCA-3’(SEQ ID NO.2)

通过SnapGene软件验证Hsa_circ_0036649的引物的准确性。如图7，输入Hsa_circ_0036649序列，勾选以circular形式呈现：反义链(蓝色)匹配到了297-302-junction-1-16这个位置，正义链匹配到了248-269这个位置，如图8所示。验证结果提示Hsa_circ_0036649的引物序列匹配无误。

针对U6的聚合酶链反应引物如下：

正义：5’-GCTTCGGCACATACTAAAT-3’(SEQ ID NO.3)

反义：5’-CGCTTCACGAATTGTCAT-3’(SEQ ID NO.4)

Hsa_circ_0036649和内参基因U6的扩增曲线如图9-1和图9-2所示。

Hsa_circ_0036649的相对表达量通过2^-ΔΔCt方法计算。

Western blot

用RIPA裂解缓冲液(Beyotime，China)收集U-EXO蛋白。使用BCA试剂盒(Beyotime)测定蛋白质浓度。通过western blot检测U-EXO中CD9和TSG101蛋白的表达，其中，采用兔抗人CD9抗体(PROTEINTECH，美国)和兔抗人TSG101抗体(PROTEINTECH，美国)。以HRP标记的羊抗兔IgG(Beyotime，China)为二抗。

统计方法

采用Mann-Whitney检验计算方差不齐或者非正态分布数据。基因表达水平与临床参数之间的相关性通过Spearman相关系数进行评估。采用逐步多元logistic回归分析评估肾纤维化的预测因素。通过受试者操作特征曲线(ROC)评价生物标志物的诊断特性。

提取外泌体的结果测试

外泌体的TEM图像如图1的A区域所示。图1的B区域所示的NTA表示外显体的纯度。Western blot显示健康对照组和CKD患者的U-EXO均表达外泌体标志物CD9和TSG101(图1的C区域)。

circRNA的表达差异结果

图2的A区域为火山图，图2的B区域是circRNA微阵列的热图。CircRNA在U-EXO中的表达我们发现560个circRNA在FU-EXO与NFU-EXO中有统计学差异。在不同表达的circRNA中，与NFU-EXO相比，FU-EXO上调表达365个circRNA，下调表达195个circRNA。选择FU-EXO表达下调的hsa_circ0036649进行RT-PCR验证。

CKD患者和对照组之间的年龄和性别没有显著差异。CKD组与对照组相比，Scr、BUN、cystatin c显著升高，肾小球滤过率(eGFR)显著降低。CKD组hsa_circ0036649的相对表达显著降低(CKD组的中位表达为0.642，健康对照组为0.951，与对照组相比P<0.001，如图3的A区域所示)。

将110例CKD患者按肾纤维化程度分为3组。如表1所示，3组之间年龄、性别和24小时蛋白尿无显著差异。

表1.慢性肾脏病患者临床和生化检验数据.

缩写:Scr,serum creatinine；eGFR,estimated glomeruar filtration rate；BUN,blood urea nitrogen；SBP,systolic blood pressure；DBP,diastolic bloodpressure.

如图4所示，U-EXO-hsa_circ0036649在轻中度组和重度组中的相对表达显著降低(中位表达轻中度组为0.635，非纤维化组为0.703，两组相比P＝0.012；重度组为0.602，与轻中度组相比P＝0.041，如图3的B区域所示)，并且其与Scr(rs＝-0.366，P<0.001)、BUN(rs＝-0.215，P＝0.006)、cystatin c(rs＝-0.424，P<0.001)和eGFR(rs＝0.374，P<0.001)相关。如图5所示，CKD患者中，U-EXOhsa_circ0036649与24h蛋白尿(rs＝-0.214，P＝0.024)、TIF评分(rs＝-0.360，P<0.001)和肾小球硬化评分(rs＝-0.273，P＝0.004)相关。

逐步多元logistic回归分析进一步显示，U-EXOhsa_circ0036649的相对表达与肾纤维化显著相关(如表2，OR，0.125；95％可信区间0.026-0.599；P＝0.009)。Scr、BUN、cystatinc、eGFR和24h蛋白尿在逐步多元logistic回归分析中无统计学意义(表2)。

表2肾纤维化选定变量的多变量逻辑回归分析

缩写:Scr,serum creatinine；eGFR,estimated glomeruar filtration rate；BUN,blood urea nitrogen；可以看出，外泌体circRNA对肾纤维化的诊断价值结果表明，其能有效区分肾纤维化，最大AUC为0.706(95％CI，0.606-0.807；P＝0.001)，显著高于其它的一些检测指标的区分效果，例如：Scr(AUC为0.575；95％可信区间0.453-0.697；P＝0.214)，BUN(AUC为0.479；95％可信区间，0.358-0.601；P＝0.732)，cystatin c(AUC为0.572；95％可信区间0.454-0.689；P＝0.235)，eGFR(AUC为0.573；95％可信区间0.452-0.695；P＝0.224)和24h蛋白尿(AUC为0.579；95％可信区间0.459-0.700；P＝0.189)。U-EXO hsa_circ_0036649在最佳临界值0.597时显示出45.5％的敏感性和87.9％的特异性(图6)。

Claims (5)

1.对从尿液外泌体中circRNA的表达量进行检测的试剂用于制备肾脏纤维化诊断试剂中的用途，其特征在于，所述的circRNA是指hsa_circ_0036649。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括对尿液外泌体中hsa_circ_0036649的表达量进行检测的步骤。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，还包括通过正向引物和反向引物扩增hsa_circ_0036649逆转录产物的步骤。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，还包括通过正向引物和反向引物对内参基因进行扩增的步骤。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的内参基因是U6。

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