CN111808941B - 一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用 - Google Patents

一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用，所述外周血circRNA标志物为hsa‑circ‑0003638与hsa‑circ‑0058493的组合。与肺纤维化相关的外周血circRNA标志物可用于制备肺纤维化辅助诊断试剂盒。本发明通过研究外周血circRNA在辅助矽肺和IPF相关肺纤维化诊断的应用前景，阐述差异表达的circRNA对肺纤维化发生的影响，揭示其筛查和诊断价值。因此，本发明获得了肺纤维化辅助诊断相关外周血circRNAs表达数据和标志物；通过外周血circRNAs生物标志物和辅助诊断试剂盒的研制和应用，可使得鉴定肺纤维化高风险个体变得可行，对预防和控制矽肺和IPF的发生发展具有重要意义。

Description

一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于医学及分子生物学领域，具体涉及一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用。
背景技术
肺纤维化是以成纤维细胞增殖以及大量细胞外间质聚集并伴有炎症损伤、组织结构破坏为特征的肺部疾病的终末期改变。值得注意的是，肺纤维化并不是一种独立的疾病，而是由物理、化学因素或其他致病因素导致肺间质结构被破坏后引起的肺部组织异常修复。绝大多数的肺纤维化病人病因未明，因此这组疾病也被称为特发性间质性肺炎(Idiopathic Interstitial Pneumonia，IIP)，其中特发性肺纤维化(IdiopathicPulmonary Fibrosis，IPF)是IIP最常见的疾病类型。而病因可查的肺纤维化被称为继发性肺纤维化，常见病因有：职业性粉尘吸入相关，如矽肺等；吸入过敏原相关，如过敏性肺炎等。
矽肺病是一种常见的职业性肺病，主要特征是肺部弥漫性纤维化。根据《2017年全球疾病负担研究》，从1990年到2017年，因矽肺病所致的伤残损失健康生命年增长了45.4％，矽肺病病例数在二十年间也增长了58.25％。显而易见，矽肺病已经给人类的个体健康带来沉重负担，是我国严重的公共卫生问题之一。矽肺病的病因较为明确，是由于长期暴露于游离二氧化硅粉尘所引起的，但是其发病机制尚不明确。更严重的是，矽肺是一种进行性疾病，即使停止接触游离二氧化硅粉尘，肺部所受到的纤维化损害仍会继续发展，由此可见，矽肺纤维化是一种不可逆的且无法治愈的疾病。
IPF是一种慢性、进行性的、可致命的疾病，以肺内瘢痕组织形成、进行性呼吸困难和患者诊断后寿命显著缩短为典型特征，多发于老年人群。研究显示，全球有数百万人遭受IPF的影响。一项回顾性研究分析了21个国家的IPF患病率，发现世界各国的IPF患病率呈现上升趋势，而且随着人口老龄化和聚集性空气污染的增加，使得IPF的患病率进一步提升。我国IPF发病率在过去的二十年里也呈现逐步增长的趋势。由于IPF早期症状不明显，人们对于IPF的认知度低，使得患者确诊时间晚，确诊后中位生存期仅2-3年，五年生存率低于30％。因此，早期诊断或筛查对于预防和治疗IPF至关重要。
值得一提的是，无论是IPF还是矽肺，其肺部纤维化发生发展的调控机制尚不明确，病人一经确诊，肺部纤维化病变仍会持续进展，且无特效药物能够延缓或逆转肺部纤维化进程。因此，明确肺纤维化的发病机制，并探寻生物标志物作为干预肺纤维化进程的靶点，对控制肺纤维化进展、提高患者生活质量及延长生存时间具有重要公共卫生意义和临床应用价值。
非编码RNA广泛存在于外周血中，具有含量丰富、性质稳定、易于实时精确定量检测等特质，更重要的是基于外周血的检测具有侵入性更小、更易获得的优势，因此十分具有临床标志物应用价值。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类重要的非编码RNA，同时由于circRNA具有闭合环状结构，核酸酶对circRNA并不起作用，这使得circRNA在细胞内具有很好的稳定性，被认为是比传统的微小RNA(microRNA，miRNA)等线性RNA更好的生物标记。进一步的实验证据表明，circRNA广泛参与多种纤维化疾病发生发展的调控，包括肾纤维化、心肌纤维化等。综上所述，结合其稳定的结构，circRNA被认定可能是纤维化疾病诊断和预后的新型理想生物标志物。
然而，目前关于circRNA参与调控肺纤维化疾病(如：矽肺和IPF)发生发展的研究相对较少，并且这些研究均是基于微观的分子生物学层面探讨circRNA参与肺部纤维化发生发展的机理机制，尚未结合宏观的人群层面综合探讨circRNA对肺纤维化发生发展的影响。与此同时，目前多数研究是基于候选circRNA的策略来探索circRNA与肺纤维化发生发展之间的关联，与全转录组测序相比，所得结果的全面性和精确性存在很大缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用，通过研究外周血circRNA在辅助矽肺和IPF相关肺纤维化诊断的应用前景，阐述差异表达的circRNA对肺纤维化发生的影响，揭示其筛查和诊断价值；通过外周血circRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得鉴定肺纤维化高风险个体变得可行，对预防和控制矽肺和IPF的发生发展具有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物，所述外周血circRNA标志物为hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的组合。
其中，所述外周血circRNA标志物的引物为：
hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTG TTCAC；
hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGC CAGATATCAG。
本发明还提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，用于制备肺纤维化辅助诊断试剂盒。
其中，所述试剂盒用于检测外周血中的hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493。
其中，所述试剂盒内包含外周血circRNA标志物的引物：
hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTG TTCAC；
hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGC CAGATATCAG。
其中，所述试剂盒内还包含逆转录、PCR反应用的酶和试剂，如：随机引物、逆转录酶、缓冲液、无酶水、2×SYBR Green PCR Master Mix和双蒸水，以及内参(18s)。
进一步，所述试剂盒内还包含标准品和对照品的一种或两种。
本发明还提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的筛选方法，包括如下步骤：
(1)RNA-seq测序方法确定矽肺病例和健康接尘对照中有表达差异的circRNAs：在RNA-seq初筛中，根据circRNA在病例对照之间显著差异表达倍数>1.5且差异有统计学意义P<0.05的情况，确定与矽肺发生可能相关的circRNAs；
(2)第一阶段验证：将初筛中确定的显著差异表达circRNAs数据集，与人血清circRNA数据集进行对比筛选，将两数据集中均存在的circRNAs纳入第二阶段验证；
(3)第二阶段验证：通过GSE102660数据集下载IPF病例和对照之间circRNAs的表达数据，并利用Limma R包进行表达差异分析，计算差异表达倍数和P值；
(4)将第二阶段验证所获的显著差异表达的circRNAs与第一阶段验证所获的候选circRNAs进行对比，进一步筛选出两数据集中均存在的circRNAs，最后筛选出两条既同时影响矽肺和IPF相关肺纤维化的发生、又在血清中稳定存在的circRNAs：hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493；
本发明还提供一种肺纤维化辅助诊断试剂盒的制备方法：
(1)制备肺纤维化辅助诊断试剂盒：辅助诊断试剂盒内包含hsa-circ-0003638引物、hsa-circ-0058493引物、随机引物、逆转录酶、缓冲液、无酶水、2×SYBR Green PCRMaster Mix和双蒸水，以及内参(18s)；
(2)RNA提取：
(2-1)在EP管中加入250ul血清样本和750ul Tirzol LS，吹打混匀，vortex震荡几秒混匀，冰上静置10min；
(2-2)将液体转入一个1.5ml EP管中，加入氯仿200μl，vortex震荡15s，此时溶液应为粉红色的浑浊液体，冰上静置2min，随后进行离心，4℃12000rpm，15min；
(2-3)小心转移上层40μl水相至新EP管，加入400μl(1:1)异丙醇上下颠倒摇匀，冰上静置15min，随后进行离心，4℃12000rpm，10min；
(2-4)小心倒掉上清，向所得沉淀中加入1ml 75％乙醇(新鲜配置，750μl无水乙醇+250μl无酶水)，轻摇EP管或手指弹管壁(50-60次)，使沉淀与75％乙醇充分接触，随后进行离心，4℃7500rpm，10min；
(2-5)小心倒掉上清，以小枪头小心吸掉沉淀周围大部分残留液体，50℃干燥5min至沉淀开始变透明时，加入10μl DEPC水溶解沉淀，60℃加热10min，随后测定RNA浓度和纯度，-80℃储存备用；
(3)RNA逆转录
将提取所得到的RNA进行逆转录成cDNA，具体步骤如下：
(3-1)配制逆转录反应体系：按照RNA逆转录反应体系，在1.5ml去酶EP管中加入相应剂量的试剂，vortex震荡混匀后，进行短暂的离心，最后加入5μl RNA，使得总反应体系达到20μl；
(3-2)逆转录反应条件：在ABI 7500Real-Time PCR仪中进行逆转录，程序如下：
25℃，10min；
42℃，15min
85℃，5min；
最后将逆转录成的cDNA置于4℃保存；
(4)qRT-PCR：采用染料法进行qRT-PCR，以测量circRNA表达水平；
(4-1)配制qRT-PCR反应体系：按照qRT-PCR反应体系，在96孔板每孔样本中加入相应剂量的试剂，使得总反应体系达到20μl；
(4-2)qRT-PCR反应条件：在ABI 7500Real-Time PCR仪中进行qRT-PCR反应，采用两步法PCR扩增标准程序，步骤如下：
95℃，5min；
95℃10s，60℃34s，40个循环；
95℃，15s；
60℃，1min；
95℃，15s；
(4-3)计算表达值：目标circRNA的相对表达量为ΔCt＝Ct circRNA–Ct 18s(18s作为内参)。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明通过研究外周血circRNA在辅助矽肺和IPF相关肺纤维化诊断的应用前景，阐述差异表达的circRNA对肺纤维化发生的影响，揭示其筛查和诊断价值。因此，本发明获得了肺纤维化诊断相关外周血circRNAs表达数据和标志物；通过外周血circRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得鉴定肺纤维化高风险个体变得可行，对预防和控制矽肺和IPF的发生发展具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中描绘外周血circRNA标志物的引物的特异性验证结果的扩增曲线；
图2为本发明中描绘外周血circRNA标志物的引物的特异性验证结果的溶解曲线；
图3为本发明中外周血circRNA标志物的电泳结果图；
图4为本发明中外周血circRNA标志物的环化位点测序结果图；
图5为本发明RNA-seq初筛中80条差异表达的circRNA示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供了一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物，所述外周血circRNA标志物为hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的组合。
其中，所述外周血circRNA标志物的引物为：
hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTG TTCAC；
hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGC CAGATATCAG。
本发明还提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，用于制备肺纤维化辅助诊断试剂盒。
其中，所述试剂盒用于检测外周血中的hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493。
其中，所述试剂盒内包含外周血circRNA标志物的引物：
hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTG TTCAC；
hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGC CAGATATCAG。
所述试剂盒内还包含逆转录、PCR反应用的酶和试剂，如：随机引物、逆转录酶、缓冲液、无酶水、2×SYBR Green PCR Master Mix和双蒸水，以及内参(18s)。
图1和图2中通过扩增曲线和溶解曲线描绘了上述引物的特异性验证结果。其中，图1A为hsa-circ-0003638的扩增曲线，图1B为hsa-circ-0058493的扩增曲线，图2A为hsa-circ-0003638的溶解曲线，图2B为hsa-circ-0058493的溶解曲线。电泳结果如图3所示，电泳产物Sanger测序结果证实了hsa-circ-0003638和hsa-circ-0058493序列及环化位点与circBase中的序列及环化位点一致，如图4所示。其中，图3A为hsa-circ-0003638的电泳结果图，图3B为hsa-circ-0058493的电泳结果图，图4A为hsa-circ-0003638的环化位点测序结果图，图4B为hsa-circ-0058493的环化位点测序结果图。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)外周血淋巴细胞RNA-seq测序初筛：选择矽肺病例、与矽肺病例二氧化硅粉尘暴露年限相匹配的健康接尘对照，检测并分析他们的外周血淋巴细胞circRNAs表达数据，筛选显著差异表达(差异倍数>1.5，P<0.05)的circRNAs进行进一步多阶段验证。(3)对于筛选出在外周血淋巴细胞中显著差异表达的circRNAs，为了确定其是否也在血清中存在，将初筛阶段显著差异表达的circRNAs与现有血清中存在的circRNAs数据集进行比对，取交集得到既在血清中存在又与矽肺发生显著相关的circRNAs。(4)为了验证上一阶段所获取的circRNAs是否也影响IPF的发生，将上一步中获取的circRNAs,与IPF病例和对照之间显著差异表达的circRNAs数据集(GSE102660)进行比对，再一次筛选取交集获取在矽肺和IPF病例对照之间均差异表达且在血清中稳定存在的circRNAs。(5)外周血circRNA诊断试剂盒的研制：根据第4步中获取的在矽肺和IPF病例对照之间均显著差异表达且在血清中稳定存在的circRNAs开发肺纤维化辅助诊断试剂盒，从而实现对矽肺和IPF相关肺纤维化的辅助诊断目的。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1、研究样本的选择
(1)经影像学明确诊断的矽肺和IPF病例。
2、Trizol LS试剂(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)提取外周血circRNA，按常规方法操作。
3、与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的筛选方法，包括如下步骤：
3.1、RNA-seq测序方法确定矽肺病例和健康接尘对照中有表达差异的circRNAs：在RNA-seq初筛中，根据circRNA在病例对照之间显著差异表达倍数>1.5且差异有统计学意义P<0.05的情况，确定与矽肺发生可能相关的circRNAs；
3.2、第一阶段验证：将初筛中确定的显著差异表达circRNAs数据集，与人血清circRNA数据集进行对比筛选，将两数据集中均存在的circRNAs纳入第二阶段验证；
3.3、第二阶段验证：通过GSE102660数据集下载IPF病例和对照之间circRNAs的表达数据，并利用Limma R包进行表达差异分析，计算差异表达倍数和P值；
3.4、将第二阶段验证所获的显著差异表达的circRNAs与第一阶段验证所获的候选circRNAs进行对比，进一步筛选出两数据集中均存在的circRNAs，最后筛选出两条既同时影响矽肺和IPF相关肺纤维化的发生、又在血清中稳定存在的circRNAs：hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493。
4、肺纤维化辅助诊断试剂盒的制备方法：
4.1辅助诊断试剂盒内包含hsa-circ-0003638引物、hsa-circ-0058493引物、随机引物、逆转录酶、缓冲液、无酶水、2×SYBR Green PCR Master Mix和双蒸水，以及内参(18s)。
4.2RNA提取：
4.2.1、在EP管中加入250ul血清样本和750ul Tirzol LS，吹打混匀，vortex震荡几秒混匀，冰上静置10min；
4.2.2、将液体转入一个1.5ml EP管中，加入氯仿200μl，vortex震荡15s，此时溶液应为粉红色的浑浊液体，冰上静置2min，随后进行离心，4℃12000rpm，15min；
4.2.3、小心转移上层40μl水相至新EP管，加入400μl(1:1)异丙醇上下颠倒摇匀，冰上静置15min，随后进行离心，4℃12000rpm，10min；
4.2.4、小心倒掉上清，向所得沉淀中加入1ml 75％乙醇(新鲜配置，750μl无水乙醇+250μl无酶水)，轻摇EP管或手指弹管壁(50-60次)，使沉淀与75％乙醇充分接触，随后进行离心，4℃7500rpm，10min；
4.2.5、小心倒掉上清，以小枪头小心吸掉沉淀周围大部分残留液体，50℃干燥5min至沉淀开始变透明时，加入10μl DEPC水溶解沉淀，60℃加热10min，随后测定RNA浓度和纯度，-80℃储存备用。
4.3、RNA逆转录
将提取所得到的RNA进行逆转录成cDNA，具体步骤如下：
4.3.1、配制逆转录反应体系：按照表1所示，在1.5ml去酶EP管中加入相应剂量的试剂，vortex震荡混匀后，进行短暂的离心，最后加入5μl RNA，使得总反应体系达到20μl。
表1 RNA逆转录反应体系
Figure BDA0002539808190000091
4.3.2、逆转录反应条件：在ABI 7500Real-Time PCR仪中进行逆转录，程序如下：
25℃，10min；
42℃，15min；
85℃，5min；
最后将逆转录成的cDNA置于4℃保存。
4.4、qRT-PCR
采用染料法进行qRT-PCR，以测量circRNA表达水平。
4.4.1、配制qRT-PCR反应体系：按照表2所示，在96孔板每孔样本中加入相应剂量的试剂，使得总反应体系达到20μl。
表2 qRT-PCR反应体系
Figure BDA0002539808190000101
4.4.2、qRT-PCR反应条件：在ABI 7500Real-Time PCR仪中进行qRT-PCR反应，采用两步法PCR扩增标准程序，步骤如下：
95℃，5min；
95℃10s，60℃34s，40个循环；
95℃，15s；
60℃，1min；
95℃，15s。
4.4.3、计算表达值：目标circRNA的相对表达量为ΔCt＝Ct circRNA–Ct 18s(18s作为内参)。
5、统计分析方法
5.1、运用双侧χ2检验(用于分类变量)和Student's t检验(用于连续性变量)评估病例和对照组之间的人口特征以及环境暴露分布差异。差异倍数>1.5且P<0.05视为两组间的表达值差异显著且有统计学意义。
5.2、通过多阶段的病例对照研究，发现有2个circRNAs与矽肺和IPF相关的肺纤维化发病情况有显著关联，且在血清中稳定存在。统计学分析均由Stata Version 12.0软件(Stata,College Station,TX)和R Version3.6.2软件(http://www.r-project.org)进行。所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明进一步的说明：
首先，使用RNA-seq测序在矽肺病例和健康接尘对照的外周血淋巴细胞中进行差异circRNA筛选。得到80个在两组间显著表达差异(差异倍数>1.5，P<0.05)的circRNAs，这80个circRNAs中有44个上调，36个下调。80个差异表达的circRNAs的聚类分析(热图)显示在图5中。其中，
hsa-circ-0058493、hsa-circ-0001769、hsa-circ-0004790、hsa-circ-0001639、hsa-circ-0024834、hsa-circ-0006856、hsa-circ-0002360、hsa-circ-0003298、hsa-circ-0001771、hsa-circ-0006151、hsa-circ-0001617、hsa-circ-0002837、hsa-circ-0000940、hsa-circ-0001006、hsa-circ-0071174、hsa-circ-0007761、hsa-circ-0008678、hsa-circ-0029853、hsa-circ-0000639、hsa-circ-0079284、hsa-circ-0003832、hsa-circ-0001487、hsa-circ-0005318、hsa-circ-0004245、hsa-circ-0002584、hsa-circ-0008794、hsa-circ-0007503、hsa-circ-0058497、hsa-circ-0003638、hsa-circ-0006577、hsa-circ-0006278、hsa-circ-0067774、hsa-circ-0067735、hsa-circ-0060762、hsa-circ-0001518、hsa-circ-0006208、hsa-circ-0037130、hsa-circ-0000698、hsa-circ-0000373、hsa-circ-0003764、hsa-circ-0035957、hsa-circ-0108638、hsa-circ-0000681、hsa-circ-0004791在病例组表达显著上调。
hsa-circ-0049792、hsa-circ-0058514、hsa-circ-0035198、hsa-circ-0004872、hsa-circ-0035199、hsa-circ-0141422、hsa-circ-0025750、hsa-circ-0002660、hsa-circ-0000095、hsa-circ-0001459、hsa-circ-0001058、hsa-circ-0005720、hsa-circ-0084582、hsa-circ-0067716、hsa-circ-0004746、hsa-circ-0006010、hsa-circ-0001723、hsa-circ-0003571、hsa-circ-0141655、hsa-circ-0005315、hsa-circ-0002906、hsa-circ-0087391、hsa-circ-0004901、hsa-circ-0006007、hsa-circ-0001503、hsa-circ-0001460、hsa-circ-0141064、hsa-circ-0000362、hsa-circ-0066536、hsa-circ-0006063、hsa-circ-0001264、hsa-circ-0007883、hsa-circ-0074371、hsa-circ-0006508、hsa-circ-0001187、hsa-circ-0001432在病例组表达显著下调。
根据上述RNA-seq初筛结果，为了探索该80条circRNAs在血清中的分布情况，将上述80个显著差异表达的circRNAs与人血清中稳定存在的circRNA数据集进行对比，发现上述80个circRNAs中，有28个circRNAs在人血清中稳定存在，包括：
hsa-circ-0058514、hsa-circ-0025750、hsa-circ-0000095、hsa-circ-0001459、hsa-circ-0005720、hsa-circ-0084582、hsa-circ-0087391、hsa-circ-0066536、hsa-circ-0058493、hsa-circ-0001769、hsa-circ-0004790、hsa-circ-0024834、hsa-circ-0006856、hsa-circ-0002360、hsa-circ-0006151、hsa-circ-0002837、hsa-circ-0071174、hsa-circ-0000639、hsa-circ-0079284、hsa-circ-0003832、hsa-circ-0058497、hsa-circ-0003638、hsa-circ-0006577、hsa-circ-0006278、hsa-circ-0067735、hsa-circ-0006208、hsa-circ-0003764、hsa-circ-0000681，具体信息如表1所示。
表1 28条差异表达的circRNAs
Figure BDA0002539808190000121
Figure BDA0002539808190000131
病例组相对于对照组表达差异倍数，差异倍数大于1，表示相应的circRNA在病例组中表达上调，小于1表示下调。
在第二阶段验证中，为了探索该28条circRNAs是否也同时影响IPF的发生，通过GSE102660数据集获取了IPF病例和对照的circRNAs表达数据，再利用Limma R包进行circRNAs表达差异分析，得到316条显著差异表达的circRNAs(P<0.05)。通过将第一阶段验证的28条circRNAs与这316条circRNAs进行对比验证，发现28条circRNAs中有2条被包含于这316条circRNAs中，即最终获取2条同时影响矽肺和IPF相关肺纤维化发生、又稳定存在于血清之中的circRNAs，分别为：hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493。在RNA-seq初筛阶段和第二阶段验证中，病例组中hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的表达水平均显著高于健康对照组(hsa-circ-0003638：初筛阶段P＝7.24×10-3，第二阶段验证P＝0.023；hsa-circ-0058493：初筛阶段P＝0.021，第二阶段验证P＝0.043)。
分析结果表明，这两个circRNAs与矽肺和IPF相关的肺纤维化的发生均存在显著关联：这两个circRNAs在矽肺和IPF病例组中均为高表达。
根据上述实验结果，制备了一种能用于矽肺和IPF相关肺纤维化诊断的试剂盒，该试剂盒包含测定受试者外周血中稳定存在且可检测的成熟hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的引物和其他检测试剂。
具体而言，hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493构成的相关辅助诊断试剂盒有助于筛选和识别高危人群，对预防矽肺和IPF的发生具有重要意义。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的阐述。
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2017月9月开始从江苏省无锡市职业病研究所收集矽肺患者的外周血样品，并从2017年10月至2018年5月，在无锡市随机选择类似的健康接尘对照并收集其外周血样品，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了符合下列标准的样本作为RNA-seq测序的实验样品：
1、每个研究对象完成了由经过培训的研究人员使用结构化问卷进行的访谈，以收集有关人口统计特征和环境暴露的信息；
2、与病例二氧化硅粉尘暴露年限匹配的健康接尘对照；
3、所有受试者均提供书面知情同意书，该研究由南通大学伦理委员会审核批准。
4、系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。
实施例2外周血淋巴细胞中的RNA-seq初筛
在上述符合条件的4例矽肺患者和4例健康接尘对照中，两组二氧化硅粉尘暴露年限匹配。将这两组人群经RNA-seq测序筛选获得相关circRNA差异表达结果。具体步骤为：
1、向白细胞中添加700μl的QIAzol裂解液，室温下放置5分钟；
2、再向每管中加入140μl的氯仿，盖紧管盖，晃动15秒，再次室温放置2-3分钟；
3、4℃、12000转离心15分钟，将上清液小心移到新的EP管中，加入约1.5倍体积的无水乙醇，混匀；
4、吸取700μl的样本移至Rneasy mini柱内，放入2ml的收集管，室温条件下8000转离心15秒，弃除收集管中液体，重复此步，收集剩余液体；
5、之后，通过对剩余液体加入Buffer RWT/RPE，离心及弃滤液，得到浓度较高的RNA样本；
6、使用Illumina HiSeq 2500测序平台对4例矽肺病例和4例健康对照的外周血淋巴细胞RNA进行测序；
7、数据分析与处理：矽肺病例组和对照组中，通过RNA-seq初筛发现的差异表达的circRNAs已在上文中罗列出。
实施例3第一阶段验证
对于通过RNA-seq测序所获取的circRNAs，为了确定是否在血清中依然存在，通过人血清中稳定存在的circRNA表达数据集，将初筛所获得80条差异表达的circRNAs与血清circRNA数据集进行比对，筛选出28条circRNAs在两数据集中均存在，即确定有28条circRNAs既在矽肺的病例与对照中差异表达，也稳定存在于血清中。
实施例4第二阶段验证
对于实施例3所获得的28条circRNAs，为了验证其与IPF的发生发展之间的关联，从Gene Expression Omnibus(GEO)数据集(GSE102660)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载了IPF病例和对照的血浆circRNA表达数据，共4731条circRNAs，通过Limma R包对4731条circRNAs进行表达差异分析，确定其中316条circRNAs在IPF病例和对照之间的表达有显著差异(P<0.05)。
将上述28条circRNAs与这316条circRNAs进行对比筛选，最终发现有两条circRNAs同时存在于实施例3中的28条circRNAs和本实施例中的316条circRNAs中，表明这两条circRNAs既与矽肺和IPF的发生均显著相关，同时又在血清中存在，可能是潜在的矽肺和IPF相关的肺纤维化的生物标志物。
实施例5初筛和两阶段验证研究中的统计分析及相关过程
使用分类变量的双侧χ2检验和连续变量的Student's t检验来评估病例和对照组之间的人口特征以及环境暴露分布差异。所有表达值均以均数±标准差(SD)表示。计算每一阶段病例组和对照组的同一变量的P值。若P>0.05，则该变量在病例组和对照组中无统计学差异，具有可比性。反之，差异有统计学意义。
在RNA-seq初筛中，根据circRNA在两组间显著差异表达(差异倍数>1.5，P<0.05)的情况，确定了与矽肺可能相关的80条circRNA。将这80条有表达差异的circRNA绘制成热点图，以便观察每个circRNA在病例组和对照组中的表达情况。
第一阶段验证采用的血清circRNA数据集，验证上述80条在矽肺病例对照之间差异表达的circRNAs；第二阶段验证中，首先通过下载GSE102660数据集获取4731条circRNAs，并利用Limma R包对该数据集的circRNAs的表达数据进行分析，计算差异倍数和P值。差异倍数大于1，表示所在阶段相应的circRNA在病例组中表达上调，小于1表示下调。P值表示差异倍数的统计学检验结果：P>0.05，表示所在阶段相应的circRNA的差异倍数无统计学意义；P<0.05，差异倍数有统计学意义，所在阶段相应的circRNA在病例组和对照组中表达有差异，最终获取316条在IPF病例和对照之间显著差异表达的circRNAs。
统计分析使用Stata Version 12.0软件(Stata,College Station,TX)和RVersion3.6.2软件(http://www.r-project.org)进行。
实施例6用于肺纤维化辅助诊断的circRNA试剂盒的制作
circRNA试剂盒的制作和操作流程是基于RNA-seq测序，qRT-PCR等技术。
试剂盒包括外周血circRNA引物
(hsa-circ-0003638的上下游引物分别为GGTCCTCATAAACAGGTTT和AGAACACAGTTGCTGTTCAC，hsa-circ-0058493的上下游引物分别为CATTTATTCTCACCAGGGTTC和GTTGCATGGCCAGATATCAG)，还有相应逆转录和PCR反应所需的常用酶和试剂，如：随机引物、逆转录酶、缓冲液、无酶水、2×SYBR Green PCR Master Mix和双蒸水，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和试剂是本领域技术人员熟知的，另外还有内参(18s)。
此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光染料法检测circRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助诊断肺纤维化及其病变，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高肺纤维化诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导区分高风险个体。
1、本发明中的外周血circRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、广泛存在、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于肺纤维化高危人群筛选，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
2、本发明提供的外周血circRNAs试剂盒是一种系统、全面的辅助诊断和进展动态监测试剂盒，可用于肺纤维化的早期诊断及进展的动态监测，有助于反映肺纤维化病例的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
3、本发明采用严密的设计和评价体系，相较于其他研究探索肺纤维化标志物时所采用的候选基因策略，本发明人采用RNA-seq测序技术，全面系统的检测了可能影响矽肺相关肺纤维化发生发展的circRNAs，使得最终结果的可靠性和精确性得以保证。并且对于RNA-seq测序得出的差异表达的circRNAs，先后采用血清circRNAs数据集和IPF病例对照差异表达的circRNAs数据集进行对比验证，保证最终获得的circRNAs既同时影响矽肺和IPF相关肺纤维化发生，又在血清中得以稳定表达。RNA-seq测序技术筛选以及两阶段的验证策略，确保整个研究过程思路缜密、设计严格，使得生物标志物的筛选结果有了较高的准确度和可信度，也为其他疾病生物标志物的研制提供了方法和思路。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种检测与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的引物在制备肺纤维化辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物为hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的组合；所述外周血circRNA标志物的引物为：
hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTG TTCAC；
hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGCCAGATATCAG。
2.根据权利要求1所述的一种检测与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的引物在制备肺纤维化辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒内还包含逆转录、PCR反应用的酶和试剂。
3.根据权利要求1或2所述的一种检测与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的引物在制备肺纤维化辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒内还包含内参。
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