JP2004513345A

JP2004513345A - 既知リガンドの質量分析による検出に基づく、連続フロー方式の均一系生化学的分析方法

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Publication number: JP2004513345A
Application number: JP2002539814A
Authority: JP
Inventors: イルス、フベルトゥス
Original assignee: キアディス　ビー．ブイ．
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2004-04-30
Also published as: EP1330648A2; DE60125056D1; EP1330648B1; AU2002224201A1; ATE347694T1; EP1202056A1; US20040053424A1; WO2002037111A3; WO2002037111A2; DE60125056T2

Abstract

本発明は、相互作用、特に質量スペクトル法を使用する測定法における生体特異的相互作用に関する。さらに詳しくは本発明は、均一系の生化学的分析法において特異的相互作用を測定することを可能にする。本発明のオンライン検出法は、分画工程の流出物と一緒の一定量の親和性分子を含み、この親和性分子は、流出物中に存在することが推定される試験対象物質に結合する。この工程の後に、一定量の既知リガンドを添加する工程（このリガンドは親和性分子に結合する）が続き、この工程により、リガンド／親和性分子複合体が形成される。本発明では、質量スペクトル計を使用して、リガンド／親和性分子複合体の存在下で遊離のリガンドが検出される。

Description

【０００１】
本発明は、生体に特異的な相互作用の測定方法に関し、特に、質量分析を用いる分析により生体に特異的な相互作用を測定する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、均一系の生化学的な分析法で、生体に特異的な相互作用を測定することを可能にする。具体的な態様においては、この検出手段は、既知のリガンドを使用する生化学的な分析のモニタリング手法として使用される。さらにまた、本発明は、新たに検出された化合物の親和性分子のリガンドとしての使用に関する。
【０００２】
生化学的な分析は、生体に特異的な相互作用を測定するための高感度な検出手段である。親和性分子（例えば、抗体、受容体または酵素のような親和性タンパク質）を求めて試験されるリガンドの親和性は、一般的に、レポーター分子として、標識リガンド（すなわち、放射能標識物、蛍光物質、または酵素のような検出可能な部位を含み、タンパク質などの親和性分子に対して既知の親和性を有する化合物）を使用して試験される。
【０００３】
生化学的測定法は、バッチ式（例えば、マイクロタイタープレート中）または連続フロー方式で行われる。一般的に、親和性分子は、試料および適当な標識物とインキュベートされ、一定時間のインキュベーション後、遊離標識または結合標識の量を測定する。遊離標識および結合標識の検出特性が同じ場合には、検出前に両方の画分を分離する必要がある。いくつかの均一系による測定法の形態が知られており、これらは、遊離標識物と結合標識物との検出較差（例えば、異なる蛍光量収率）を利用する。そのような場合、ある画分は他の画分の存在下で測定でき、時間がかかり手間のかかる分離工程を避けることができる。
【０００４】
特定の標識を使用する生化学的な分析法の欠点は、スクリーニングされる親和性分子（例えば、タンパク質）にとって適当な標識を見つける必要があることである。一方で高感度な検出特性を有しながら、他方で好ましい高い結合親和特性を保持する標識の合成は、困難な課題であり、特に、既知のリガンドへの蛍光物質または酵素の付着が、しばしば合成された標識の結合親和性を大幅に低下させる場合があり、その場合には受容体の検出が困難である。
【０００５】
特殊な化学的または生化学的なレポーター分子（例えば、蛍光物質または酵素）を必要としない検出器が使用されるなら、新しい標識の合成を回避できる。質量分析計（ＭＳ）は、そのままの状態で要求される感度による化合物の測定が可能、即ち、化合物を化学的な修飾をすることなく検出できる検出器の例である。従って、生化学的な分析における検出手段として質量分析を使用することにより、測定法を開発し使用する前に、新たな標識を合成する必要性が無くなる。
【０００６】
セイフェルト（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ）ら（Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３６３（１９９９）７６７−７７０）は、固定化受容体カラムを使用して、試料から活性リガンドを単離する質量分析に基づくスクリーニング法を提唱している。後に、結合画分が脱着され、液体クロマトグラフィー‐質量分析法により測定されるものである。この方法は、質量分析を用いて活性分子を直接検出する方法を提示するものである。これは、質量分析を、やや低感度の総イオン流（ＴＩＣ）モードで実行する必要があるので、新規の未知のリガンドを検出しなければならない応用には特に不利である。さらに、受容体の固定化は、立体障害のためにタンパク質を部分的または完全に不活性化することがある。また、結合した活性リガンドを放出するための脱着条件は、しばしば受容体の不可逆的変性を引き起こしており、固定化受容体カラムの頻繁な交換が必要となっている。
【０００７】
ネドベド（Ｎｅｄｖｅｄ）ら（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，　６８（１９９６）４２２６−４２３６）は、逆相液体クロマトグラフィーに連結された固定化免疫親和性カラムとイオン噴霧質量分析計を使用して、小分子のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする類似の方法を記載する。この方法でもやはり、活性化合物は、フルスキャンモードで直接検出される。固定化抗体カラムの使用は、上記のセイフェルト（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ）らの方法と同一であり、この分析形態におけるすべての欠点を有する。
【０００８】
シー（Ｈｓｉｅｈ）ら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１９９６），１８９−１９６）は、検出のために質量分析計を使用する多次元クロマトグラフィースクリーニング法を記載する。親和性タンパク質を、スクリーニングされる化合物とインキュベーションした後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結合画分を非結合画分から分離する。次に、タンパク質結合画分を、質量スペクトルと連結した逆相液体クロマトグラフィーカラムに送り、親和性タンパク質に結合した小分子を測定する。セイフェルト（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ）らとネドベド（Ｎｅｄｖｅｄ）らの方法とは異なり、シー（Ｈｓｉｅｈ）らは、リガンドと受容体との相互作用が溶液中で起きる、すなわち、受容体は固定化されていない生化学的測定法を記載する。しかし、１次インキュベーション工程後、活性化合物の直接的な検出を可能とするに際して、２つのクロマトグラフィーを適用する必要がある。さらに、活性化合物の構造は未知であるため、質量分析計は、非選択的ＴＩＣモードで運転しなければならない。
【０００９】
未公開のＥＰ−Ａ−１０４８９５１号（アース（Ｉｒｔｈ）とバンデルグリーフ（ＶａｎｄｅｒＧｒｅｅｆ））は、生体に特異的な相互作用を測定するための検出手段として、質量分析の使用を記載する。試料中の活性化合物の存在を検出するために、標識を使用せずに、良好な質量分析検出特性を有する既知リガンドをレポーター分子として使用するものである。記載の方法は、試料を親和性タンパク質とインキュベートし、次いで、残存する未結合部位を滴定するために、既知リガンドを加える、一連の生化学的工程を含んでいる。最後の工程で、中空繊維分離モジュールまたは制限アクセスカラム（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄａｃｃｅｓｓｃｏｌｕｍ）を使用して、既知リガンドの遊離画分を、タンパク質結合画分から分離する。遊離画分のみを質量スペクトル計に送り、その一方で、タンパク質画分を廃棄する。従って、ＥＰ−Ａ−１０４８９５１号の方法は、タンパク質結合画分から検出分子を分離することを要する不均一系での分析形態である。
【００１０】
本発明は、遊離レポーター分子及びタンパク質結合レポーター分子の分離を必要とする非均一系の分析法より、実施がより容易な方法の提供を目的とする。さらに詳しくは、本発明は読取り手段として質量分析を使用する均一系の生化学的測定方法である。この測定方法は、アース（Ｉｒｔｈ）及びバンデルグリーフ（ＶａｎｄｅｒＧｒｅｅｆ）によって記載されているような遊離標識と結合標識の分離を必要としない。アース（Ｉｒｔｈ）及びバンデルグリーフ（ＶａｎｄｅｒＧｒｅｅｆ）の方法と本発明の方法との相違を、スキーム１に示す。
【００１１】
本発明に基づく、分画工程の流出物に、一定量の親和性分子を接触させる工程と、次いで、親和性分子を、流出物中に存在すると想定される分析対象物に結合させる工程と、次いで、一定量の既知リガンドを添加する工程と、次いで、リガンドを親和性分子に結合させて、リガンド／親和性分子複合体を形成する工程と、次いで、リガンド／親和性分子複合体の存在下で、質量スペクトル計を使用して遊離のリガンドを検出する工程とを含んでなるオンライン検出法は、上記問題を克服できることがわかった。
【００１２】
驚くべきことに、リガンド／親和性タンパク質複合体の存在下で、遊離リガンドを検出するのに、ＭＳを使用することができ、従って面倒な分離工程の必要が無くなった。本発明はさらに、アース（Ｉｒｔｈ）とバンデルグリーフ（ＶａｎｄｅｒＧｒｅｅｆ）の方法のような先行技術の方法に必要な、分離手段（例えば、中空繊維モジュールまたは制限アクセス相）表面へのタンパク質の非特異結合による分離工程に伴う問題を克服する。さらに、分離手段の再生が不要となり、測定系の連続操作を可能にする。さらにまた、分離条件を検討したり最適化する必要が無いため、新しいスクリーニング法の測定系の開発時間が大幅に短縮される。
【００１３】
本発明は、生化学的反応モジュールに、液体クロマトグラフィーのような分画工程を、オンラインで連結することによって行なわれる。分画工程の流出物に、一定量の親和性分子（例えば、受容体、抗体または酵素のようなタンパク質）が添加される。短い反応時間（最大、約３分）後、一定量の既知リガンドが反応混合物に添加され、短時間（例えば、２〜３分）相互作用させられる。全反応混合物を、あらかじめ既知の遊離リガンドと結合リガンドとを分離することなく、質量スペクトル計に導入する。質量分析により検出された既知リガンドの量の変化は、流出物中の親和性分子に結合する化合物の存在を示す。アース（Ｉｒｔｈ）とバンデルグリーフ（ＶａｎｄｅｒＧｒｅｅｆ）が記載した不均一系の測定法とは異なり、遊離既知リガンドの量は、結合したリガンド−親和性タンパク質複合体の存在下で検出される。親和性分子との複合体中の結合リガンドの量とは独立に、遊離リガンドが質量分析により検出されることは驚くべきことである。
【００１４】
本発明の方法は、特定の質量対電荷比で、既知リガンドの濃度の変化を観測することにより、混合物中の活性化合物の存在を検出することを可能にする。さらに活性化合物の分子量は、既知リガンドのピーク極大が起きる時に、総イオン流クロマトグラムを観測することにより同時に測定することができる（スキーム２を参照）。
【００１５】
連続フロー系に、分析対象物を注入した時に得られる質量分析データと、一定量の親和性分子及び検出可能なリガンドを導入した時に得られるシグナルとを比較すると、分画工程の流出物中に存在する分析対象物により占領された結合部位の割合に関する情報が得られる。当業者は、その検出方法から得られたデータを処理し評価する知識を持っている。流出物中に存在する分析対象物により占領される結合部位の割合は、既知の親和性分子と相互作用を示す新しい化合物を見つけるのに使用することができる。この情報は、例えば薬物の発見において、本発明のオンラインでの分離／親和性分子検出プロセスを実施する可能性を提供する。
【００１６】
例えば、薬物発見で使用されるハイスループットスクリーニングのシステムは、次の工程からなる。例えば、上流コンビナトリアル化学システムにより生成される複雑な試料は、例えば、固相抽出手段や電気泳動による試料処理原理を使用して、極性の似た化合物を含有する画分に、予備分画される。各画分はさらに、分析または予備スケールの液体クロマトグラフィー分離カラムを使用して、分離される。前記液体クロマトグラフィーカラムから溶出する化合物は、適切な親和性分子検出手段を使用して、オンラインで検出される。予備スケールの分離カラムが適用される場合、ポストカラムフロースプリット（ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎｆｌｏｗ−ｓｐｌｉｔ）を生じさせるであろう。２つの流れのうちの１つは、親和性分子検出手段を使用して検出され、他の流れは、フラクションコレクターに送られる。親和性分子検出器から得られる信号にしたがって、肯定応答を生じる化合物を含有する画分が採取され、否定応答を生じる画分は廃棄されるであろう。この完全なスクリーニング法は、既知のバルブスイッチング法を使用して、自動化することができる。
【００１７】
本発明の方法で使用される適当な分画手段としては、液体クロマトグラフィー分離または毛細管電気泳動工程を含む。しかし、当業者に公知であり、比較的連続的に流れを生じることが可能な他の分離手段や分画手段も同様に使用できる。
【００１８】
好適な実施態様において、液体クロマトグラフィー分離手段は、逆相ＨＰＬＣである。
【００１９】
本発明によれば、異なる化合物の混合物が注入されるフロー注入の流出物もまた、分画工程の流出物として理解されるべきである。質量分析の選択的な追跡性が得られるように質量分析を行なうことにより、必要な選択性を得ることができる。
【００２０】
フロー注入法は、柔軟で迅速なスクリーニング法を提供するため、本発明の好適な実施態様である。
【００２１】
質量分析操作のすべてのモードは、フロー注入モードで可能であるが、高いバックグランドのために、特に、選択された単一のｍ／ｚトレース（ｍ／ｚｔｒａｃｅ）または選択された複数のｍ／ｚトレースのイオンを検出することを含む非常に選択的なモードが適している。
【００２２】
すでに記載したように、分画手段は、液体クロマトグラフィー分離、毛細管電気泳動法工程、またはコンビナトリアル化学システムとすることができる。好適な液体クロマトグラフィー分画手段としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄｐｈａｓｅＨＰＬＣ）、毛細管電気泳動法（ＣＥ）、毛細管電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、またはミセル電気動力学的クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）があり、これらのすべては、当業者に公知である。
【００２３】
当該分野で公知の質量分析手段におけるすべての可能な変更は、本発明により利益を受けるであろう。好ましくは、質量分析は、電子噴霧イオン化型、大気圧イオン化型、四重極型、磁気セクター型、飛行時間型、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ^ｎ、ＦＴＭＳ型、イオン捕捉型、およびこれらの組合せよりなる群から選択される型である。
【００２４】
例えば、化合物を追跡するためのスキャニングモードにおいては、質量分析のすべての可能な計測設計を持つ低分解能質量分析を使用することができ、特に四重極、磁気セクター、飛行時間、ＦＴＭＳ、およびイオン捕捉を使用することができる。これによれば、一般的に、まずまずの質量精度を持つ分子量データが得られる。
【００２５】
高分解能質量分析が適用される場合には、すべての可能な高分解計測設計、特に、磁気セクター、飛行時間、ＦＴＭＳ、およびイオン捕捉を使用すれば、化合物の元素組成と結び付けられる高い質量精度を持つ分子量データが得られる。
【００２６】
他の公知の質量分析手段としては、タンデムＭＳ（例えば、ＭＳ／ＭＳまたはＭＳ^ｎ（例えばＭＳ^３））がある。これらの手段の適用は、本発明の好適な実施態様であるリガンドの構造情報の収集を可能にする。スキャニングモードのデータは、自動的に観測された各ピークについて、タンデムＭＳ測定が行われることを意味するデータ依存性モードで得られる。これ以外に、タンデムＭＳ測定で誘導される断片化は、より進んだ方法（例えば、ブロードバンド励起、これも、天然の生成物スクリーニングにおいて［プロトン化分子−Ｈ_２Ｏ］^＋ピークのような、あまり必要ではない予測される断片を断片化する）と組合せることができる。
【００２７】
質量分析はまた、単一／複数イオンモニタリングモードで操作することができ、このモードは、高い選択性を持つ検出に使用することができる。
【００２８】
単一／複数イオンモニタリングモードは、高い選択性を有する検出に使用することができる。すべての可能な低分解装置設計、特に、四重極、磁気セクター、飛行時間、ＦＴＭＳ、およびイオン捕捉を用いる、単一／複数イオンモニタリングモードの低分解質量分析を使用すれば、予め測定したｍ／ｚトレースのモニタリングに基づく選択的な検出が得られる。高分解質量分析を適用する場合には、質量分析のすべての可能な装置設計、特に、四重極、磁気セクター、飛行時間、ＦＴＭＳ、およびイオン捕捉を使用することができる。これは、通常、予め測定したｍ／ｚトレースの高い分解特性でのモニタリングに基づく、非常に選択的な検出を可能にする。タンデム質量分析が適用される場合には、すべての可能な装置設計、特に、イオン捕捉、四重極−飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）、三重四重極（ＱＱＱ）、ＦＴＭＳおよびセクター装置と四重極およびイオン捕捉との組合せを使用することができる。これは、ＭＳ／ＭＳおよび／またはＭＳ^ｎ測定で生じるピークをモニタリングすることに基づく、非常に選択的な検出を可能にする。
【００２９】
質量分析を走査モードで行なうことも可能である。こうして、予め測定したシグナルの低下は、他のシグナルの上昇と相関し、同じサイクルの中で活性化合物を解析することを可能にする。
【００３０】
本発明の分析法により、例えば、生物学的流体又は抽出物；天然産物の抽出物；バイオテクノロジー、コンビナトリアル技術および方法などの化学的な実験からの溶液または抽出物等の複合的な性質を有する溶液中における（生物）活性化合物の追跡を、高い効率性、選択性、及び柔軟性をもって行うことができる。さらに本発明は、バックグランド化合物の妨害を制限する可能性を提示する。
【００３１】
本発明はさらに、従来の質量スペクトル、高分解データまたはＭＳ^ｎに基づく質量分析による化合物の同定を可能にする。
【００３２】
本発明の方法により、様々な質量分析の実験手法に基づいて、ライブラリー検索を行うことができ、多系列の試料をスクリーニングし、これらスクリーニングした試料を、化合物の完全な同定を要することなく同様の活性を有する化合物を基準とするクラス分けが可能となる。
【００３３】
本発明の分析方法は、チップ技術に基づくスクリーニングシステムなど、分析システムを小型化した形態にも応用することができる。
【００３４】
本発明の方法において、他の分子との相互作用または結合が可能なすべての分子は、親和性分子として使用することができる。親和性分子としては、例えば、エストロゲン、糖質コルチコイド受容体等のサイトゾル受容体；β受容体等の可溶化膜結合受容体；抗体、酵素、アビジン等の親和性タンパク質；ポリヌクレオチドおよび多糖よりなる群から選択される。
【００３５】
流出物に添加される「一定量の親和性分子」は、既知の濃度および既知の流量（ｆｌｏｗｒａｔｅ）のものと理解される。
【００３６】
本願の詳細な説明および請求項における「既知リガンド」は、上記親和性分子と相互作用または反応することができ、質量分析により検出できるリガンドを意味する。検出可能なリガンドの例としては、親和性分子が結合可能な、既に見い出されている分析対象となる物質（ａｎａｌｙｔｅ）である。
【００３７】
本発明は、標識の調製を要しないという大きな利点を有する。これは、既知リガンドの標識が、例えば、立体障害による親和性の劇的な低下を生じさせる場合に、そのような親和性分子にとって特に有利となる。レポーター分子として標識の無い既知の天然のリガンドを使用する分析法は、非常に迅速に開発することができる。
【００３８】
本発明の方法で使用されるオンラインによる連結は、余分なカラムバンドの広がりを最小にするのに、高速の反応時間が必要である。これは、反応時間が時間のオーダーではなく分のオーダーを有する親和性分子−リガンド相互作用を考慮すべきことを意味する。
【００３９】
親和性分子が試験対象物質に結合する適当な結合条件には、接触時間があり、これは同様のオーダーの時間である。適当な結合条件は、親和性分子とアナライトとの最適の結合を提供する条件である。温度、保持時間、化学組成等の精密な条件は、分析方法の種類やそれに用いられるタンパク質に強く依存することが理解される。バックグランド緩衝溶液が、主に不揮発性のリン酸塩またはトリス緩衝液からなる蛍光標識、放射性標識又は酵素標識による生化学的な分析法とは対照的に、本明細書に記載の均一系の質量分析による生化学的な分析法は、蟻酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム等の中性ｐＨ揮発性緩衝液を使用して行われる。さらに、既知リガンドのイオン化特性を改良するために、少量のメタノール（２．５〜１０％）がバックグランド緩衝液に添加される。
【００４０】
他の好ましい実施態様において、親和性タンパク質と既知リガンドとの組合せを使用して、いろいろな生体分子標的を同時にスクリーニングすることができる（スキーム３を参照）。
【００４１】
この目的のために、親和性タンパク質の混合物を調製し、これを、分画手段における流出物に加える。次いで、親和性タンパク質１つ当たり少なくとも１つの既知リガンドを含有する既知リガンドの混合物を加える。反応混合物が、質量分析に供せられる。質量分析において、各活性既知リガンドが、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）によりモニタリングされる。分画流出物中の活性化合物の存在は、質量分析計において対応する既知リガンドトレースのシグナルに変化をもたらす。本発明の好しい実施態様によれば、各親和性分子は、２つ以上の異なる種類の親和性分子の混合物中に存在し、各既知リガンドは異なるリガンドの混合物中に存在する。一方、各リガンドは、当該各親和性分子の１つに結合することが知られている。
【００４２】
他の好ましい実施態様において、オンラインによる生化学的な分析系は、質量スペクトル計に向け複数入り口ユニットに連結している（スキーム４を参照）。複数入り口ユニットは、１つの質量スペクトル計と複数（例えば８つ）の異なる分画ラインへの連結を可能にする。各ラインで、個別の既知リガンドによる分析が行われる。この方法は、類似親和性タンパク質のスクリーニングに特に有用である。これは、複数の分析を、互いに影響することなく、同時に実施することを可能にする（例えば、いくつかの親和性タンパク質と反応する活性化合物による）。こうして、オンライン生化学的測定法は、単一の質量スペクトル計を検出器として使用して、平行して行うことができる。
【００４３】
スキーム１は、アース（Ｉｒｔｈ）及びバンデルグリーフ（ＶａｎｄｅｒＧｒｅｅｆ）の方法（ＥＰ−Ａ−１０４８９５１号）と比較した、本発明のオンライン測定法の略図である。
【００４４】
スキーム２は、本発明の方法で得られる典型的なクロマトグラムを示す。上のクロマトグラム（ＭＳシグナル対保持時間）は、選択イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）の流出物をスクリーニングすることにより得られ、すなわちＭＳは、既知リガンド（Ｌ）に典型的なｍ／ｚ値についてのみスクリーニングする。クロマトグラムは、ある保持時間での遊離リガンド濃度［Ｌ］の上昇を示し、これは、親和性分子に結合する化合物（アナライト）の存在を示す。このピークはまた、総イオン流モード（スキーム２の真ん中の図）で測定される。［Ｌ］中のピークに対応する保持時間での完全な質量スペクトルは、スキーム２の下の図に示す。このスペクトルから、アナライトについての構造情報を得ることができる。
【００４５】
スキーム３は、本発明の好適な実施態様を示し、親和性タンパク質と既知リガンドの組合せを使用して、いくつかの生物学的分子標的が同時にスクリーニングされることを示す。
【００４６】
スキーム４は、質量スペクトル計の複数入り口ユニットを使用する好適な実施態様である。
【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】
【実施例】
実施例１
親和性タンパク質としてストレプトアビジン、レポーター分子としてフルオレセイン−ビオチン、検体としてビオチン化化合物を使用して、均一系のオンライン質量分析による生化学的分析法の実効性を実証した。ストレプトアビジンは、ビオチンとビオチン化化合物に対して高親和性を有する、よく知られた親和性タンパク質である。５０μｌ／分の流量で輸送された１０ｍｍｏｌ／ｌの蟻酸アンモニウム／メタノール（９０：１０、ｖ／ｖ）からなる担体溶液に、１０ｍｍｏｌ／ｌの蟻酸アンモニウムに溶解された３２ｎｍｏｌ／ｌのストレプトアビジンの溶液を、５０μｌ／分の流量で加えた。混合物を、内部容量が１７μｌの内径３００ｍｍのポリ（テトラフルオロエチレン）反応コイル中を輸送した。次に、１０ｍｍｏｌ／ｌの蟻酸アンモニウム／メタノール（９０：１０、ｖ／ｖ）に溶解した９６ｎｍｏｌ／ｌフルオレセイン−ビオチンの溶液を、流量１００μｌ／分で添加された。次に、混合物を、内部容量が３３μｌで内径３００ｍｍのポリ（テトラフルオロエチレン）反応コイル中を輸送し、次に、電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）源を備えた質量スペクトル計中に導入した。質量分析計は、［Ｍ＋Ｈ］^＋及び１つ以上の強いフラグメントイオンによる陽イオン（ＰＩ）モードの選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）で運転した。
【００５２】
ストレプトアビジン／ビオチン系のためのＥＳＩ光源条件
光源温度：８０℃
毛細管電圧：３．２ｋＶ
サンプリングコーン電圧は、ビオチンとフルオレセイン標識ビオチンに対して、それぞれ、３０と６０Ｖであった。
【００５３】
図１は、全反応結果を確認できる実験結果を示す。Ｐ１では、担体緩衝液のみが、質量スペクトル計中にポンプで供給され、対象バックグランドシグナルを与える。Ｐ２では、フルオレセイン−ビオチンポンプのスイッチが入れられ、ｍ／ｚ３９９で選択イオンモニタリングＭＳシグナルが上昇した。Ｐ３では、ストレプトアビジンポンプのスイッチが入れられた。親和性タンパク質であるストレプトアビジンの添加により、遊離のフルオレセイン−ビオチンの濃度が低下し、選択イオンモニタリングＭＳシグナルが低下した。Ｐ４では、ビオチンの注入により、遊離のストレプトアビジンの結合部位が減少し、遊離のフルオレセイン−ビオチン濃度が上昇し、これは、ｍ／ｚ３９９で選択イオンモニタリングＭＳシグナルのピークとして見られる。
【００５４】
図２は、スクリーニング法が、ビオチン化された分析対象物質について選択的であることを示す。等しい濃度のビオチン（ｍ／ｚ２４５）、Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸ヒドラジド（ｍ／ｚ３７２）、ビオチン−ヒドラジド（ｍ／ｚ２５９）、およびＮ−ビオチン−Ｌ−リジン（ｍ／ｚ３７３）の注入により、フルオレセイン−ビオチン（ｍ／ｚ３９０）でほとんど同じシグナルが得られ、すべての化合物が、レポーター分子であるフルオレセイン−ビオチンの、ストレプトアビジンへの結合を防止できることを示す。さらに、活性化合物の分子量を、選択条件下でイオン化された化合物について同定することができるであろう。
【００５５】
実施例２
親和性タンパク質として抗ジゴキシゲニン抗体のｆａｂ断片（ｆａｂ抗ジゴキシゲニン）、レポーター分子としてジゴキシゲニン、およびアナライトとしてジゴキシンを使用して、ストレプトアビジン／ビオチンより弱い相互作用の分析に対する、均一系のオンライン質量分析生化学的分析法の実効性を証明した。５０μｌ／分の流量で輸送された１０ｍｍｏｌ／ｌの蟻酸アンモニウム／メタノール（９０：１０、ｖ／ｖ）からなる担体溶液に、１０ｍｍｏｌ／ｌの蟻酸アンモニウムに溶解された１００ｎｍｏｌ／ｌのｆａｂ抗ジゴキシゲニンの溶液を、５０μｌ／分の流量で添加した。混合物を、内部容量が６５μｌの内径３００ｍｍのポリ（テトラフルオロエチレン）反応コイル中を輸送した。次に、１０ｍｍｏｌ／ｌの蟻酸アンモニウム／メタノール（９０：１０、ｖ／ｖ）に溶解した２００ｎｍｏｌ／ｌジゴキシゲニンの溶液を、流量１００μｌ／分で加えた。次に混合物を、内部容量が３３μｌの内径３００ｍｍのポリ（テトラフルオロエチレン）反応コイル中を輸送し、次に電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）源を備えた質量スペクトル計中に導入した。質量スペクトル計は、［Ｍ＋Ｈ］^＋及び１つ以上の強度フラグメントによるイオン陽性イオン（ＰＩ）モードで選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）において運転した。
【００５６】
図３は、全反応結果を確認できる実験結果を示す。Ｐ１では、担体緩衝液のみが、質量分析計中にポンプで供給され、対象バックグランドシグナルを与える。Ｐ２では、ジゴキシゲニンポンプのスイッチが入れられ、ｍ／ｚ４０８（ジゴキシゲニンのアンモニウム付加物）で選択イオンモニタリングＭＳシグナルが上昇した。Ｐ３では、ｆａｂ抗ジゴキシゲニンポンプのスイッチが入れられた。親和性タンパク質であるｆａｂ抗ジゴキシゲニンを添加すると、遊離のジゴキシゲニンの濃度が低下し、選択イオンモニタリングＭＳシグナルが低下した。Ｐ４では、ジゴキシンの注入が行われ、遊離のｆａｂ抗ジゴキシゲニンの結合部位が減少し、遊離のジゴキシゲニン濃度が上昇した。これは、ｍ／ｚ４０８で選択イオンモニタリングＭＳシグナルのピークとして見ることができた。
【００５７】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、実施例１で得られる結果を示す（ｍ／ｚ３９０でのＭＳシグナルの時間）。
【図２】
図２は、ビオチン化された検体について得られた結果を示す（実施例１）。
【図３】
図３は、ｍ／ｚ４０８でのＭＳシグナルの選択イオンモニタリングを示す（実施例２）。

Claims

分画手段からの流出物に、一定量の親和性分子を接触させる工程と、該親和性分子を、該流出物中に存在することが想定される分析対象物に結合させる工程と、一定量の既知リガンドを添加する工程と、該リガンドを親和性分子に結合させて、リガンド／親和性分子複合体を形成する工程と、質量分析計を用いて、該リガンド／親和性分子複合体の存在下で、遊離のリガンドを検出する工程、とを含んでなるオンライン検出方法。
前記分画手段が、液体クロマトグラフィー分離、毛細管電気泳動手段、又はコンビナトリアル化学システムである、請求項１の方法。
前記液体クロマトグラフィー分離手段が、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ＣＥ、ＣＥＣ、ＩＥＦ、又はＭＥＫＣによる手段である、請求項２の方法。
電子噴霧イオン化型、大気圧イオン化型、四重極型、磁気セクター型、飛行時間型、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ^ｎ、ＦＴＭＳ型、イオン捕捉型、及びこれらの組合せよりなる群から選択される質量分析計を使用する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記親和性分子が、２つ以上の異なる種類の親和性分子の混合物中に存在し、かつ前記既知リガンドが、異なるリガンドの混合物中に存在し、それら各リガンドが、該各親和性分子の１つに結合することが知られている、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
複数入り口ユニットを有する質量スペクトル計が使用され、この複数入り口ユニットに、異なる分画ラインが接続され、各分画ラインが、一定量の親和性分子と既知リガンドを前記請求項のそれぞれに記載のように添加した流出物を含むオンライン検出方法。
前記請求項のいずれか１項に記載の方法により検出される化合物。
親和性分子のリガンドとしての請求項７の化合物の使用。