CN105785038A - 双检测线saa免疫荧光层析定量检测试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双检测线血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A protein，SAA)免疫荧光层析定量检测试剂及其制备方法；旨在提供一种能同时提高灵敏度和检测范围，满足临床上对急性炎症、慢性炎症患者体内SAA水平检测的一种双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂，其技术要点：包括底板，所述的底板上衔接样品垫，结合垫、包被膜和吸收垫，所述的结合垫上喷有抗SAA单克隆抗体1和鸡IgY，所述的抗SAA单克隆抗体1和鸡IgY被同一种荧光微球标记；所述的包被膜上设有检测线T1、检测线T2和质控C线，所述的检测线T1包被的是抗SAA单克隆抗体2，所述的检测线T2包被有抗原SAA蛋白，质控C线包被有羊抗鸡IgY；属于体外诊断试剂技术领域。

Description

双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂及其制备方法
技术领域
本发明提供一种免疫荧光层析定量检测试剂，具体地说，是一种双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂及其制备方法；属于体外诊断试剂技术领域。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SerumamyloidAprotein，SAA)，是一种敏感的急性期炎症标志物，正常人血清SAA值为0-0.78mg/l，当机体受到感染、炎症、损伤、肿瘤等刺激后，肝脏细胞大量分泌SAA，血清中SAA水平随着机体炎性反应的发展可在5-6小时内迅速升高约1000倍，8-12h内SAA即可达到峰值，增高幅度可达正常值的2000倍，在临床诊断中当SAA含量>10mg/l时，才作为急性炎症的标志。当机体的炎性反应被控制以后，SAA迅速降低至正常水平，正是这种特征使SAA可作为反应机体感染或创伤的等炎症状态的敏感指标，同时作为炎症恢复的评价指标。临床意义与CRP相类似，检测血液中SAA的浓度水平，有助于诊断非特异炎症、评估炎症活动程度、监控炎症活动及治疗后效果。
除了急性期由肝脏大量分泌SAA外，在正常的脂肪细胞、肿瘤细胞以及动脉粥样硬化斑块中的多种细胞也能合成。因此，在过度肥胖处于亚健康状态的人群及患有动脉粥样硬化的人群中，血清SAA的含量也高于正常人，而处于慢性炎症的状态。SAA不仅仅是炎症标志物，也是炎症信号触发剂，可诱导IL-6、IL-8和MCP-1等多种促炎性细胞因子的分泌，促发全身系统性慢性低度炎症的发生，同时SAA能够刺激巨噬细胞、内皮细胞等相关靶细胞，上调各种炎症因子的表达，进一步加重机体的炎症水平。SAA进入血浆后，能迅速与HDL结合，形成SAA-HDL复合物，SAA结合到HDL上后能使其更容易与血管上的蛋白聚糖黏附，从而引起和加重血管动脉粥样硬化的形成。
此外，类风湿性关节炎、结核病、麻风病患者体内SAA浓度的变化是一个慢性升高的过程，是合成AA-淀粉纤维的先决条件，继而会引发淀粉样变性。因此，能对慢性变化的SAA进行检测，有利于临床对患者治疗方案的调整。
临床目前针对的是急性期SAA进行检测，而对非急性期，SAA含量低于急性期，却又明显高于正常人血清的含量，长期处于慢性炎症的患者缺乏快速检测的方法。因此，发明一种能同时适用于急性期和慢性炎症期SAA含量检测的试纸在个人在诊断、体检等方面的运用具有重要的意义。
目前，SAA的检测方法主要有以下几种：
酶联免疫吸附法(ELISA)，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。采用这种方法进行测定具有较高的灵敏度，但是操作过程繁琐，每次测值均需要绘制标准曲线，准确度误差大，测定时间较长，仪器昂贵且需要经过一定专业培训的人员进行操作，因此不符合临床快速检测的要求。
胶体金免疫层析法，该方法操作简单，但灵敏度低，当样本中的含量低时会出现漏检的情况，通常用于定性或者半定量的测定，不符合临床上进行含量测定的需求，因此受到一定的限制。
免疫比浊法，利用抗原抗体反应形成一定结构的免疫复合物，根据复合物在溶液中具有的特殊光学性质进行检测，但在检测时抗原或抗体过量会造成误差较大，并且容易受到血脂的影响。
荧光免疫层析法，利用荧光物质在特定的激发光照射下发射荧光的特点，具有特异性强、重复性好的特点，针对急性炎症时SAA含量进行检测，目前已在医学上进行推广，并且发展迅猛。
中国专利201510583004.1公开了一种CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸及其制备方法，中国专利201510014077.9公开了PCT/SAA联合快速检测用试纸条及其制备方法，但是，针对SAA快速的检测免疫层析法中，胶体金疫层析和荧光免疫层析在进行质控线C的设置时，一般在包被膜4上包被一条抗IgG的单克隆抗体或者是抗IgG的多克隆抗体，用来捕获胶体金或者是荧光微球标记的单克隆抗体，因此在测值的过程中受层析效果的影响造成C值的波动较大，起到的作用也仅仅是试纸条检测结果是否有效，在定量检测的实验中，测值的重复性差。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种能同时提高灵敏度高和检测范围，满足了临床上对急性炎症、慢性炎症患者体内SAA水平的检测的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂，本发明还公开上述检测试剂的制备方法。
本发明提供的第一个技术方案是这样的：
一种双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂，包括PVC底板，所述的底板上衔接样品垫，结合垫、包被膜和吸收垫，所述的结合垫上喷有抗SAA单克隆抗体1和鸡IgY，所述的抗SAA单克隆抗体1和鸡IgY被同一种荧光微球标记；所述的包被膜上设有检测线T1、检测线T2和质控C线，所述的检测线T1包被的是抗SAA单克隆抗体2，所述的检测线T2包被有抗原SAA蛋白，质控C线包被有羊抗鸡IgY。
本发明提供的第二个技术方案是这样的：
一种双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的方法，是在PVC底板上依次衔接样品垫，结合垫、包被膜和吸收垫，其特征在于，
所述的结合垫3的制备方法是：将耦联荧光微球标记抗SAA抗体1与鸡IgY荧光微球溶液按2:1的体积比混合均匀，用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为3-5μL/cm，放入37℃烘箱，干燥8小时；
所述的荧光微球标记抗SAA抗体1的制备步骤依次包括下述步骤：
1)制备荧光微球溶液
2)将抗SAA单克隆抗体1按100μg/1mL的量，加入到步骤1)荧光微球溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min；
3)按10μg/1mL的量，向步骤2)中加入BSA，封闭未耦联抗体的活化羧基位点，反应30-60min，反应完成后将荧光微球溶液过分子筛层析柱进行纯化，用pH7.4，0.01MPBS为液洗脱，收集荧光微球洗脱液以4℃，16000rpm，30min离心，弃去上清，加入pH9.0浓度0.05MTris-HCl的复溶液后超声混匀；
所述的荧光微球标记鸡IgY抗体的制备步骤如下：
1)制备荧光微球溶液
2)将鸡IgY抗体按100μg/1mL的量，加入到步骤1)荧光微球溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min；
3)按10μg/1mL的量，向步骤2)中加入BSA，封闭未耦联抗体的活化羧基位点，反应30-60min，反应完成后将荧光微球溶液过分子筛层析柱进行纯化，用pH7.4，0.01MPBS为洗脱液，收集荧光微球洗脱液，以4℃，16000rpm，30min离心，弃去上清，加入pH9.0浓度0.05MTris-HCl的复溶液后超声混匀；
D)所述的包被膜的制备方法如下：
1、包被
1)检测T1线：用0.01MPBS，pH7.4内含0.5％-3％的海藻糖，将抗SAA抗体2稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；
2)检测T2线：用0.01MPBS，pH7.4内含0.5％-3％的海藻糖将SAA抗原稀释到2.5mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；
3)质控C线：用0.01M的PBS，pH7.4将羊抗鸡IgY单克隆抗体稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；
2、干燥
放入37℃烘箱，干燥8小时。
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，所述的样品垫的制备方法是：将样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，30min之后取出，于室温干燥16-18小时；
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，所述的样品垫的缓冲液配方如下：将0.5wt％BSA、1wt％海藻糖、1wt％S9溶解于0.01M，pH7.4的PBS缓冲液中。
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，步骤B)中所述的荧光微球溶液的制备方法是：用1ml0.1MPH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸加入0.3mg0.3μM时间分辨荧光微球；加入25μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和30μL50mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺，室温反应30min；4℃，16000rpm离心20min，去上清除去未反应的EDC和NHS，加入1ml0.1MPH6.0的MES，超声混匀，得到荧光微球溶液。
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，所述的检测线T1线与包被膜下缘的距离为0.5cm，与上缘的距离为2cm。
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，所述的检测线T2线位于检测线T1线与质控线C线之间，与T1线的距离为0.5cm，与C线为0.8cm。
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，所述的质控线C线与包被膜下缘的距离为1.8cm，与上缘的距离为0.7cm。
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，所述的抗SAA单克隆抗体1的克隆号SC-52211，鼠源克隆抗体，亚型IgG1，识别SAA蛋白的氨基端19-30氨基酸序列，所述的氨基端19-30氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
进一步的，上述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，所述的抗SAA单克隆抗体2为抗体克隆号SC-52216，鼠源克隆抗体，亚型IgG1，识别SAA蛋白氨基端70-79，氨基酸序列SEQIDNO.2所示。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案的有益效果：
(1)在包被膜4上采用双T线形式，低浓度时采用竞争法，高浓度时采用双抗夹心法，提高了检测的灵敏度，拓宽了试剂的检测范围，避免了免疫反应中常常出现的HOOK效应；
(2)C、T线采用了双控系统，保证了质控线C的荧光值的稳定，减少了测试过程中由于C值波动而造成的误差；
(3)在荧光微球标记的过程中，利用分子筛的原理对微球进行纯化，将未与微球结合的抗体分开，提高了微球上抗体的标记效率，较少了层析过程中未标记抗体与抗原的结合，减小了误差，提高了检测的准确度。
附图说明
图1是本发明提供的试纸条结构示意图；
图2是全范围SAA测值T1、T2、C线荧光值变化曲线；
图3是低浓度样本检测与荧光值曲线；
图4高浓度样本检测与荧光值曲线；
图5芯片拟合曲线；
图6荧光值T1<T2时，芯片T2/C线性拟合曲线；
图7荧光值T1≥T2时，芯片T1/C线性拟合曲线。
图中符号代表元件或者类似元件如下：
底板1、样品垫2、结合垫3、包被膜4、吸收垫5。
具体实施方式
下面结合具体实施，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
实施例1
本发明提供的一种双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂，其结构如图1所示，依次由PVC底板1、样品垫2、结合垫3、包被膜4、吸收垫5构成。在结合垫3上喷有同一种荧光微球标记的抗SAA单克隆抗体1和鸡IgY；在包被膜4上T1位置包被的是抗SAA单克隆抗体2，T2位置包被的是抗原SAA蛋白，C线位置包被的是羊抗鸡IgY。SAA荧光微球免疫层析检测试剂的制备方法
(1)样品垫的制备方法
将规格为20cm×30cm的大小样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，30min之后取出，于室温干燥16-18小时，干燥后切割成1.6cm×30cm规格的样品垫。
样品垫的缓冲液配方如下：0.5wt％BSA、1wt％海藻糖、1wt％S9溶解于0.01MPBS(pH7.4)缓冲液中。
(2)偶联荧光微球的抗SAA抗体1/鸡IgY与结合垫3的制备方法
荧光微球标记抗SAA抗体1的步骤
①在1ml0.1MPH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)加入0.3mg0.3μM时间分辨荧光微球；加入25μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和30μL50mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应30min。4℃，16000rpm离心20min，去上清除去未反应的EDC和NHS，加入1ml0.1MPH6.0的MES，超声混匀。
②将抗SAA单克隆抗体1按100μg/1mL的量，加入到步骤①荧光微球溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min。
所述的SAA1：抗体克隆号SC-52211；鼠源克隆抗体，亚型IgG1，识别SAA蛋白的氨基端19-30；氨基酸序列，具体为：Arg-Ser-Phe-PheSer-Phe-Leu-Gly-Glu-AlaPhe-Asp，如SEQIDNO.1所示
③按10μg/1mL的量，向步骤②中加入BSA，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30-60min。
④反应完成后将荧光微球溶液过分子筛层析柱进行纯化，用0.01MPBS(pH7.4)为洗脱液，分离溶液中为与微球结合的蛋白。
⑤收集荧光微球洗脱液以4℃，16000rpm，30min离心，弃去上清，加入pH9.0浓度0.05MTris-HCl的复溶液后超声混匀。
荧光微球标记鸡IgY抗体的步骤
①在1ml0.1MPH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)加入0.3mg0.3μM时间分辨荧光微球；加入25μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和30μL50mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应30min。16000rpm离心20min，去上清除去未反应的EDC和NHS，加入1ml0.1MPH6.0的MES，超声混匀。
②将鸡IgY抗体按100μg/1mL的量，加入到步骤①荧光微球溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min。
③按10μg/1mL的量，向步骤②中加入BSA，封闭未耦联抗体的活化羧基位点，反应30-60min。
④反应完成后将荧光微球溶液过分子筛层析柱进行纯化，用0.01MPBS(pH7.4)为洗脱液，分离溶液中为与微球结合的蛋白。
⑤收集荧光微球洗脱液以4℃，16000rpm，30min离心，弃去上清，加入pH9.0浓度0.05MTris-HCl的复溶液后超声混匀。
将上述所得的抗SAA抗体1荧光微球溶液与鸡IgY荧光微球溶液按2:1的体积比混合均匀，用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为3-5μL/cm(优选4μL/cm)，放入37℃烘箱，干燥8小时。
包被膜的制备方法
1)包被，包被包被膜4宽度为25mm。
检测线(T1线)：在硝酸纤维膜上划线，在膜的一端用记号笔做好T1线、T2线、C线的标记，T1线与硝酸纤维素膜下缘的距离为0.5cm，与上缘的距离为2cm，用0.01MPBS(pH7.4)内含0.5％-3％的海藻糖将将抗SAA抗体2稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。所述的SAA2的抗体克隆号SC-52216；鼠源克隆抗体，亚型IgG1，识别SAA蛋白氨基端70-79氨基酸序列Trp-AlaAla-GluAla-Ile-Ser-Asp-Ala-Arg，SEQIDNO.2所示。
检测线(T2线)：T2线位于T1线与C线之间，与T1线的距离为0.5cm，与C线为0.8cm，用0.01MPBS(pH7.4)内含0.5％-3％的海藻糖将SAA抗原稀释到2.5mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
质控线(C线)：C线与硝酸纤维素膜下缘的距离为1.8cm，与上缘的距离为0.7cm用0.01M的PBS(pH7.4)将羊抗鸡IgY单克隆抗体稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
2)干燥
放入37℃烘箱，干燥8小时。
SAA荧光微球免疫层析检测试剂的组装方法如下
各组件在底板上的排列顺序依次为吸收垫5--硝酸纤维素膜--结合垫3--样品垫
①吸收垫5的粘贴：将底板平铺于工作台面上；揭开底板上缘吸收垫5粘贴处的保护膜，将吸收垫5粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，吸收垫5覆盖在硝酸纤维素膜上2mm。
②结合垫3粘贴：将结合垫3裁为宽15mm×长300mm，揭开硝酸纤维素膜下缘结合垫3粘贴处的保护膜，将结合垫3粘附于其上，方法同吸收垫5，结合垫3覆盖在硝酸纤维素膜上2mm。
③样品垫2粘贴：将样品垫粘附于结合垫3下部，方法同吸收垫5。样品垫覆盖在结合垫3上2mm。
④试纸条切割：将粘贴好的底板放入切条机中，切成4mm宽的试纸条。
⑤装卡与入袋：将每一试纸条装入塑料卡内，将每一试剂置于铝膜袋中，并加入1g干燥剂1包，热合封口。
双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂检测原理
在SAA浓度为0-500mg/L范围内测值，T1、T2、C线荧光仪读数曲线如图2所示，检测时，将稀释后的样品(血清、血浆、全血)加入样品孔时，样品依次透过样品垫2，结合垫3，在毛细管作用下样品将沿着试剂条向吸收垫5的方向移动。
当机体处于慢性炎症时，SAA浓度约在0.78-10mg/l范围内，样品中SAA的浓度低时，样品中的SAA可与偶联荧光微球的抗SAA抗体1和包被在包被膜4上抗SAA抗体2发生特异结合，在T1处形成双抗体夹心结构，而未与SAA蛋白结合的荧光微球抗体1则与包被膜4上T2处的SAA蛋白结合，形成荧光微球抗体1-SAA蛋白的复合物，随着SAA浓度的升高，T1捕获的带荧光微球的SAA蛋白增多，使T2处捕获的带荧光微球的SAA蛋白减少，此时T1荧光强度与SAA含量呈正相关，T2荧光强度与样本中SAA含量呈负相关。相对于T1，T2对浓度变化敏感，此时T1<T2，表明测试机体处于非急性感染期，此时SAA含量由T2、C线的荧光强度根据T2/C进行计算，在此范围内荧光仪读数曲线如图3所示。
当机体处于急性炎症时，机体SAA浓度迅速上升至10mg/L以上，样品中的SAA可与偶联荧光微球的抗SAA单克隆抗体1和包被在包被膜4上抗SAA单克隆抗体2发生特异结合，在T1处形成双抗体夹心结构，即荧光微球抗体1-SAA-抗体2复合物，而随着SAA浓度的升高，T1捕获的带荧光微球的SAA蛋白增多，T2处捕获的荧光微球标记的抗SAA抗体1减少，此时T1荧光强度与SAA含量呈正相关，T2荧光强度与样本中SAA含量呈负相关。相对于T2，T1对浓度变化敏感增加趋势明显，包被膜4上荧光值T1≥T2时，表明测试机体处于急性感染期，此时样本中SAA含量由T1、C的荧光强度根据T1/C进行计算，在此范围内荧光仪读数曲线如图4所示。
如果测试时C处不出现荧光，则表明此次测值无效，应进行重复实验。
这种在低浓度时采用竞争法检测抗原，而高浓度时采用双抗体夹心法进行检测的方式，与单纯的双抗体夹心法或竞争法相比，表现出了该试纸条同时提高灵敏度高和检测范围，满足了临床上对急性炎症、慢性炎症患者体内SAA水平的检测。
SAA荧光微球免疫层析检测试剂使用：
SAA荧光微球免疫层析检测试剂荧光读数仪芯片数据拟合曲线如图5所示：
当样本低浓度时包被膜4上荧光强度T1<T2,表明测试机体处于非急性感染期，此时SAA含量由T2、C线的荧光强度根据T2/C进行计算，拟合曲线如图6所示。
当样本高浓度时包被膜4上荧光值T1≥T2时，表明测试机体处于急性感染期，此时样本中SAA含量由T1、C的荧光强度根据T1/C进行计算，线性拟合如图7所示。
打开仪器，插入与试剂批号相同的芯片；使用时除去试剂外包装，取出试剂，水平放置；精确吸取稀释后75μl血清或血浆，或100μl全血样品，加入到检测卡的加样孔中，然后开始计时；待室温反应10min后，将检测卡放入到仪器的卡槽中；点击仪器上的“测试”按键，仪器将开始测试，并显示结果；点击“打印”，可打印检测结果报告。
为了更好的说明本发明型的有益效果，下面给出采用本发明型提供的检测试剂与传统的酶联免疫分析法、胶体金免疫层析法、传统荧光免疫层析法在检测SAA时的结果对比实验。

Claims (10)

1.一种双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂，包括PVC底板1，所述的底板上衔接样品垫2，结合垫3、包被膜4和吸收垫5，其特征在于，所述的结合垫上喷有抗SAA单克隆抗体1和鸡IgY，所述的抗SAA单克隆抗体1和鸡IgY被同一种荧光微球标记；所述的包被膜上设有检测线T1、检测线T2和质控C线，所述的检测线T1包被的是抗SAA单克隆抗体2，所述的检测线T2包被有抗原SAA蛋白，质控C线包被有羊抗鸡IgY。
2.制备权利要求1所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的方法，是在PVC底板上依次衔接样品垫，结合垫、包被膜和吸收垫，其特征在于:
A.所述的结合垫3的制备方法是：将耦联荧光微球标记抗SAA抗体1与鸡IgY荧光微球溶液按2:1的体积比混合均匀，用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为3-5μL/cm，放入37℃烘箱，干燥8小时；
B.所述的荧光微球标记抗SAA抗体1的制备步骤依次包括下述步骤：
1)制备荧光微球溶液
2)将抗SAA单克隆抗体1按100μg/1mL的量，加入到步骤1)荧光微球溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min；
3)按10μg/1mL的量，向步骤2)中加入BSA，封闭未耦联抗体的活化羧基位点，反应30-60min，反应完成后将荧光微球溶液过分子筛层析柱进行纯化，用pH7.4，0.01MPBS为液洗脱，收集荧光微球洗脱液以4℃，16000rpm，30min离心，弃去上清，加入pH9.0浓度0.05MTris-HCl的复溶液后超声混匀；
C.所述的荧光微球标记鸡IgY抗体的制备步骤如下：
1)制备荧光微球溶液
2)将鸡IgY抗体按100μg/1mL的量，加入到步骤1)荧光微球溶液中，混匀室温条件下旋转反应30min；
3)按10μg/1mL的量，向步骤2)中加入BSA，封闭未耦联抗体的活化羧基位点，反应30-60min，反应完成后将荧光微球溶液过分子筛层析柱进行纯化，用pH7.4，0.01MPBS为洗脱液，收集荧光微球洗脱液，以4℃，16000rpm，30min离心，弃去上清，加入pH9.0浓度0.05MTris-HCl的复溶液后超声混匀；
D.所述的包被膜的制备方法如下：
1、包被
1)检测T1线：用0.01MPBS，pH7.4内含0.5％-3％的海藻糖，将抗SAA抗体2稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；
2)检测T2线：用0.01MPBS，pH7.4内含0.5％-3％的海藻糖将SAA抗原稀释到2.5mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；
3)质控C线：用0.01M的PBS，pH7.4将羊抗鸡IgY单克隆抗体稀释到1mg/mL进行包被，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；
2、干燥
放入37℃烘箱，干燥8小时。
3.根据权利要求2所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的样品垫2的制备方法是：将样品垫浸泡在样品垫缓冲液中，30min之后取出，于室温干燥16-18小时。
4.根据权利要求3所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的样品垫的缓冲液配方如下：将0.5wt％BSA、1wt％海藻糖、1wt％S9溶解于0.01M，pH7.4的PBS缓冲液中。
5.根据权利要求2所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤B)中所述的荧光微球溶液的制备方法是：用1ml0.1MPH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸加入0.3mg0.3μm时间分辨荧光微球；加入25μL10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和30μL50mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺，室温反应30min；以4℃，16000rpm离心20min，弃上清除去未反应的EDC和NHS，加入1ml0.1MPH6.0的MES，超声混匀，得到荧光微球溶液。
6.根据权利要求2所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的检测线T1线与包被膜下缘的距离为0.5cm，与上缘的距离为2cm。
7.根据权利要求2所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的检测线T2线位于检测线T1线与质控线C线之间，与T1线的距离为0.5cm，与C线为0.8cm。
8.根据权利要求2所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的质控线C线与包被膜下缘的距离为1.8cm，与上缘的距离为0.7cm。
9.根据权利要求2所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的方法，其特征在于，所述的抗SAA单克隆抗体1的克隆号SC-52211，鼠源克隆抗体，亚型IgG1，识别SAA蛋白的氨基端19-30氨基酸序列，所述的氨基端19-30氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
10.根据权利要求2所述的双检测线SAA免疫荧光层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的抗SAA单克隆抗体2为抗体克隆号SC-52216，鼠源克隆抗体，亚型IgG1，识别SAA蛋白氨基端70-79，氨基酸序列SEQIDNO.2所示。
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