CN104865387A - 快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法 - Google Patents

快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104865387A
CN104865387A CN201510261064.1A CN201510261064A CN104865387A CN 104865387 A CN104865387 A CN 104865387A CN 201510261064 A CN201510261064 A CN 201510261064A CN 104865387 A CN104865387 A CN 104865387A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pad
antibody
conjugates
biotin
probnp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510261064.1A
Other languages
English (en)
Inventor
刘红剑
威廉姆·努特
刘丽萍
张丹
黄凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Silgen Biotech (jiangsu) Co Ltd
Original Assignee
Silgen Biotech (jiangsu) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Silgen Biotech (jiangsu) Co Ltd filed Critical Silgen Biotech (jiangsu) Co Ltd
Priority to CN201510261064.1A priority Critical patent/CN104865387A/zh
Publication of CN104865387A publication Critical patent/CN104865387A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法，它包括支撑片以及支撑片上顺次搭接粘贴的样品垫片、检测膜和吸水垫片，所述样品垫片和检测膜之间设有偶合物垫片，所述检测膜上设有检测线，所述检测线包被有抗ST2和/或抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述ST2抗体和/或NT-proBNP抗体设在同一位置或设在相邻位置，所述检测线另一边设有控制线，控制线包被有抗链霉亲和素（SAV）抗体，所述偶合物垫片上涂布有含有不同荧光标记的ST2抗体和NT-proBNP抗体偶合物。该试纸具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点，适于临床快速诊断。

Description

快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于临床医学诊断领域，具体涉及一种快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)和N末端脑钠肽(NT-proBNP)的免疫荧光试纸条及其制备方法。
背景技术
可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)基因是1989年由Tominaga等首先在BALB/c-3T3细胞系中得到的，是I L-1(白细胞介素1)受体家族成员之一，该基因表达两种蛋白产物：一种带有跨膜结构，称为跨模型ST2(ST2L)，一种可以分泌到细胞外，称为分泌型ST2(sST2)。研究发现ST2可由心脏成纤维细胞和心肌细胞表达，是生物机械应力诱导产生的一种心肌蛋白。ST2基因表达于肥大细胞激活的辅助性T细胞2(Th2)巨噬细胞和心肌细胞。人的ST2基因约40kb，位于人类染色体2q12，可编码一种可溶性蛋白(sST2)和一种跨膜形式蛋白(ST2L)，两者的转录分别受到不同的启动子调控。
研究表明sST2是IL-33的诱骗受体，它可以与IL-33结合，从而阻断IL-33与ST2L结合，继而削弱IL-33/ST2L信号通路的心血管保护作用在心肌受到过度牵拉造成损伤的过程中，大量sST2生成使心肌缺乏足够的IL-33的保护，从而加速心肌重构和心室功能障碍，最终导致死亡风险增高。IL-33是IL-1家族成员，可以与靶细胞上的膜受体结合后介导下游信号通路，或者被运输到靶细胞的细胞核作为DNA结合因子行使功能。研究表明，机械应力可刺激心脏成纤维细胞产生IL-33，与其受体复合物(由ST2L和IL-1RAcP组成)结合后，将活化信号传递至细胞内，经过下游的IL-1相关蛋白激酶髓样分化因子88和肿瘤坏死因子受体相关因子6等一系列信号分子，激活核转录因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，从而调节基因转录，导致Th2细胞效应分子IL-5IL-4和IL-13等的释放。当心脏成纤维细胞和心肌细胞受到过大的压力负荷时，这些效应分子可以使心脏作出适应性反应，防止过度牵拉导致的心肌肥大和心肌纤维化发生。与此同时，心肌sST2大量生成，sST2与IL-33结合后竞争性抑制其与ST2L结合，阻断经ST2L的信号传导，最终抑制NF-B和MAPK激活，从而大大降低IL-33/ST2L信号通路的内源性心肌保护作用。ST2能够独立的判断心力衰竭预后，结合NT-proBNP时，其对心衰的诊断,治疗,及预后的敏感性和特异性均高于ST2和NT-proBNP单独诊断的结果，其中NT-proBNP是指N末端脑钠肽，脑钠肽(B-type-Natriuretic Peptide,BNP)由日本学者Sudoh等于1988年首先在猪脑中发现，而Hunt等在1995年第一次对N-端脑钠肽前体(N-terminal-pro-BNP,NTproBNP)进行了描述。BNP主要由左心室分泌，在心肌细胞受到容量负荷和压力负荷增高时，非活性前体Pro-BNP裂解为活性BNP和非活性的NT-proBNP。2000年11月美国食品药物管理局批准美国Biosite公司的BNP检测应用于临床，发展到今天，美国心脏协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)等全球心血管权威机构以及美国临床生化学院(NACP)在其制订的“心衰诊断和治疗指南”及“心脏标志物的应用指南”中，把BNP/NT-proBNP列为不可缺少的心脏标志物，以指导心衰的治疗。NT-proBNP能客观反映充血性心力衰竭(CHF)及严重程度，其血浆水平随心衰程度增加而增高，能更好地辅助诊断心衰分级。超声判断CHF的金标准是左室射血分数(LVEF)下降，而血清NT-proBNP水平升高则预示左室射血功能的减退更加严重，甚至比超声检查更具优越性。
免疫荧光技术(Fluorescence Immunoassay technique)是以荧光分子作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。生物素－亲合素系统(Biotin-Streptavidin—System，BAS)是一种非常有效的生物反应放大系统。生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。BAS在实际应用中所具有的巨大优越性，主要表现在以下几个方面：
(1)生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比恬度高，具多价性。因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
(2)亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
(3)亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，提高测定的精确度。(4)生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素—受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。
目前，检测ST2和NT-proNP的方法目前主要是酶联免疫技术(ELISA)，ELISA技术存在以下缺点：检测设备要求高，成本高；干扰因素较多，重复性不好；检测时间长。因此酶联免疫技术检测ST2和NT-proBNP不适合临床快速诊断。如何能够制作出快速的定量检测设备成为需要迫切解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条，本发明另一目的时还提供一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条的制备方法。
本发明的快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)和N-末端脑钠肽(NT-proBNP)的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片(4)以及试纸条支撑片(4)上顺次搭接粘贴的样品垫片(1)、检测膜(2)和吸水垫片(3)，所述样品垫片(1)和检测膜(2)之间设有偶合物垫片(5)，所述的偶合物垫片(5)一端上方设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)，其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者偶合物垫片(5)一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，所述检测膜(2)上设有检测线1(7-1)、检测线2(7-2)，所述检测线1(7-1)包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线2(7-2)包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述的检测线1(7-1)、检测线2(7-2)设在检测膜(2)的同一位置或设在相邻位置，若为不同位置，则检测线1(7-1)、检测线2(7-2)均位于控制线(8)同一侧，控制线(8)包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片(5)上涂布有含有不同荧光标记的ST2抗体和NT-proBNP抗体偶合物，
所述偶尔物垫片(5)中的含有不同荧光标记的ST2抗体偶合物和NT-proBNP抗体偶合物通过如下步骤制成：
1)Dye-649NHS Ester-ST2抗体偶合物以及Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
1.1)Dye-649NHS Ester-ST2抗体偶合物的制备：
ST2抗体溶于碳酸盐缓冲液(0.5M Boarte buffer,pH＝8.5)中，活化的Dye-649NHS Ester溶解于二甲基亚砜(DMSO)中溶解，然后把ST2抗体加入碳酸盐缓冲液(0.5M Boarte buffer,pH＝8.5)中混匀后，加入准备好的Dye-649NHS Ester溶液，37度反应1小时，反应完成后，将偶合物溶液转移至超滤管中进行纯化，并多次用1XPBS磷酸盐缓冲液冲洗，直至超滤管的底部无游离的荧光分子，并计算纯化后的Dye-649NHS Ester-ST2抗体偶合物的标记个数；
1.2)Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
NT-proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把生物素(Biotin)加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素(Biotin)，并计算每个NT-proBNP抗体可能结合的生物素(Biotin)个数；
2)DyLight-800NHS Ester-SAV的制备：
抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液(0.05M Borate buffer)进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800NHSEster-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的标记个数；
3)DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP抗体偶合物的制备：
DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP偶合物的制备方法：按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800NHS Ester-SAV和Biotin-NT-proBNP抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS,Biotin-NT-proBNP和DyLight-800NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率(T％)，并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP。
所述的快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)和N-末端脑钠肽(NT-proBNP)的免疫荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)制备检测线；检测膜(2)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线(7-1)是将抗ST2抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上；检测线(7-2)是将抗NT-proBNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上，然后将检测膜(2)充分干燥并烘烤数日后即得；检测线(7-1)、检测线(7-2)位于同一位置或不同位置，若为不同位置，则检测线(7-1)、检测线(7-2)均位于控制线(8)同一侧，即液体首先接触的位置；
2)制备控制线；所述控制线(8)是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上，然后将检测膜(2)充分干燥并烘烤数日后即得；
3)制备偶合物垫；所述偶合物垫片(5)的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片(5)的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将Dye-649NHS Ester标记的-ST2抗体偶合物和DyLight-800NHS Ester标记的-NT-proBNP抗体偶合物涂布在偶合物垫片(5)上，充分干燥即得；
4)制备样本垫片；所述样本垫片(1)可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5)试纸条的组装；在试纸条支撑片(4)由下而上依次粘附检测膜(2)、吸水垫片(3)和偶合物垫片(5)，在偶合物垫片(5)上设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)、第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者仅设第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片(1)；将上述材料组装后，切成小条，即制得所述定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条。
本发明的快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片(4)以及试纸条支撑片(4)上顺次搭接粘贴的样品垫片(1)、检测膜(2)和吸水垫片(3)，所述样品垫片(1)和检测膜(2)之间设有偶合物垫片(5)，所述的偶合物垫片(5)一端上方设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)，其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者偶合物垫片(5)一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，所述的检测膜(2)上设有检测线(7)，检测线(7)包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，检测线(7)另一边设有控制线(8)，控制线(8)包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片(5)上涂布有荧光标记的ST2抗体偶合物。
偶尔物垫片(5)中荧光标记的ST2抗体偶合物的制备包括如下步骤：
(1)Biotin-ST2抗体的制备：
ST2抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把生物素(Biotin)加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的ST2抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素(Biotin)，并计算每个ST2抗体可能结合的生物素(Biotin)个数；
(2)荧光分子-SAV的制备：
抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液(0.05M Borate buffer)进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800NHSEster-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的标记个数；
(3)DyLight-800NHS Ester标记的ST2抗体偶合物的制备：
按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800NHSEster-SAV和Biotin-ST2抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS,Biotin-ST2和DyLight-800NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率(T％)，并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-ST2。
所述的快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)制备检测线；检测膜(2)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线(7)是将抗ST2抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上；然后将检测膜(2)充分干燥并烘烤数日后即得；
2)制备控制线；控制线(8)是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上，然后将检测膜(2)充分干燥并烘烤数日后即得；
3)制备偶合物垫；偶合物垫片(5)的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片(5)的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将Dye-649NHS Ester标记的-ST2抗体偶合物涂布在偶合物垫片(5)上，充分干燥即得；
4)制备样本垫片：样本垫片(1)可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5)试纸条的组装；在试纸条支撑片(4)由下而上依次粘附检测膜(2)、吸水垫片(3)和偶合物垫片(5)，在偶合物垫片(5)上设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)、第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者仅设第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片(1)；将上述材料组装后，切成小条，获得快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条。
本发明的快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片(4)以及试纸条支撑片(4)上顺次搭接粘贴的样品垫片(1)、检测膜(2)和吸水垫片(3)，所述样品垫片(1)和检测膜(2)之间设有偶合物垫片(5)，所述的偶合物垫片(5)一端上方设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)，其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者偶合物垫片(5)一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，所述检测膜(2)上设有检测线(7)，所述检测线(7)包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线(7)另一边设有控制线(8)，控制线(8)包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片(5)上涂布有荧光标记的NT-proBNP抗体偶合物。
所述偶尔物垫片(5)中荧光标记的NT-proBNP抗体偶合物的制备包括如下步骤：
(1)Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
NT-proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把生物素(Biotin)加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素(Biotin)，并计算每个NT-proBNP抗体可能结合的生物素(Biotin)个数；
(2)荧光分子-SAV的制备：
抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液(0.05M Borate buffer)进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800NHSEster-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的标记个数；
(3)DyLight-800NHS Ester标记的NT-proBNP抗体偶合物的制备：
按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800NHSEster-SAV和Biotin-NT-proBNP抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS,Biotin-NT-proBNP和DyLight-800NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率(T％)，并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP。
所述的快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)制备检测线；检测膜(2)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线(7)是将抗NT-proBNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上，然后将检测膜(2)充分干燥并烘烤数日后即得；
2)制备控制线；所述控制线(8)是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜(2)上，然后将检测膜(2)充分干燥并烘烤数日后即得；
3)制备偶合物垫；所述偶合物垫片(5)的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片(5)的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将DyLight-800NHS Ester标记的-NT-proBNP抗体偶合物涂布在偶合物垫片(5)上，充分干燥即得；
4)制备样本垫片；所述样本垫片(1)可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5)试纸条的组装；在试纸条支撑片(4)由下而上依次粘附检测膜(2)、吸水垫片(3)和偶合物垫片(5)，在偶合物垫片(5)上设有第一层玻璃纤维垫片(6-1)、第二层玻璃纤维垫片(6-2)或者仅设第一层玻璃纤维垫片(6-1)或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片(1)；将上述材料组装后，切成小条，获得快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条。
采用如上技术方案后，其有益效果为：
本发明所述的快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条的工作原理是：采用免疫侧流反应原理，通过双抗体夹心法制备而成。检验时样本中的ST2和NT-proBNP抗原首先分别与偶合垫上的ST2和NT-proBNP抗体偶合物发生免疫反应，形成免疫复合物。其后免疫复合物随着样本在硝基纤维素膜上层析流动，当免疫复合物层析至硝基纤维素膜上的检测区(ST2和NT-proBNP检测线)时，分别与预先包被在硝基纤维素膜上的抗ST2和NT-proBNP抗体发生反应从而被固定在硝基纤维素膜的检测线上。样本中的ST2和NT-proBNP越多，检测线上的复合物越多，条带上的光密度值就越高。同时，在检测过程中，未结合的荧光标记的ST2和NT-proBNP抗体偶合物也会随样本在检测膜上层析，当层析至检测膜的控制线时，荧光标记的ST2和NT-proBNP会与预先包被在检测膜上的抗SAV抗体发生反应从而被固定在对照区(控制线)上。样本中ST2和NT-proBNP浓度分别与检测线中两种不同波长的荧光的光密度值成正比关系。
当反应结束后，利用检测仪将控制线和检测线的光密度进行分析，并将所分析得到的结果进行运算，从而得到相对光密度值(RI)。然后检测仪根据已预先设置在检测仪内的标准曲线对ST2和NT-proBNP的浓度进行计算并显示结果，以ng/mL为单位表示，其反应结果如下表1所示：
本发明新型所述快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条，具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点，适于临床快速诊断。
附图说明
图1是实施例1和实施例2的快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条的结构示意图。
图2是实施例3的快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条的结构示意图。
其中：1为样品垫片，2为检测膜，3为吸水垫片，4为支撑片，5为偶合物垫片，6-1为第一层玻璃纤维垫片，6-2为第二层玻璃纤维垫片，7为检测线，7-1为检测线1，7-2为检测线2，8为控制线。
具体实施方式
本发明中，抗ST2抗体和抗NT-proBNP抗体，供应商和货号如下；
抗体名称 目录号 厂家
Monoclonal mouse anti-human NT-proBNP 4NT1 Hytest
Monoclonal mouse anti-human NT-proBNP 4NT1 Hytest
ST2 Recombinant Fab Monoclonal antibody BR139 BBI
ST2 Recombinant Fab Monoclonal antibody BR139 BBI
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，不能理解为是对本发明的限制；
实施例1
如图1所示，一种快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条，它包括试纸条支撑片4以及试纸条支撑片上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片1和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2，也可以在偶合物垫片5一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，检测膜2上设有检测线7，检测线7包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，检测线7另一边设有控制线8，控制线8包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片5上涂布有荧光标记的ST2抗体偶合物。
偶尔物垫片5中荧光标记的ST2抗体偶合物的制备包括如下步骤：
(1)Biotin-ST2抗体的制备：
ST2抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把生物素(Biotin)加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的ST2抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素(Biotin)，并计算每个ST2抗体可能结合的生物素(Biotin)个数；
(2)荧光分子-SAV的制备：
抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液(0.05M Borate buffer)进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800NHSEster-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的标记个数；
(3)DyLight-800NHS Ester标记的ST2抗体偶合物的制备：
按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800NHSEster-SAV和Biotin-ST2抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS,Biotin-ST2和DyLight-800NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率(T％)，并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-ST2；
快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条的制备方法如下：
1)制备检测线；检测膜2在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线7是将抗ST2抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上；然后将检测膜2充分干燥并烘烤数日后即得；
2)制备控制线；控制线8是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥并烘烤数日后即得；
3)制备偶合物垫；偶合物垫片5的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片5的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将Dye-649NHS Ester标记的-ST2抗体偶合物涂布在偶合物垫片5上，充分干燥即得；
4)制备样本垫片：样本垫片1可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5)试纸条的组装；将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫片4上，获得快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条。
按以下步骤进行检测：
1)抽取的病人尿液样本，如低温保存样本需恢复至室温。
2)将待测样品加入样本垫片1上，反应。
3)判读，将所述免疫荧光试纸条置于(瑞莱)免疫荧光检测仪以及其相关仪器中判定结果。其结果如下表所示：
从上表可以看出：单项检测的ST2免疫荧光试纸条的灵敏度和检测范围等性能符合临床检测要求。
实施例2
如图1所示，一种快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片4以及试纸条支撑片4上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片1和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2，也可以在偶合物垫片5一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，所述检测膜2上设有检测线7，所述检测线7包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线7另一边设有控制线8，控制线8包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片5上涂布有荧光标记的NT-proBNP抗体偶合物。
所述偶尔物垫片5中荧光标记的NT-proBNP抗体偶合物的制备包括如下步骤：
(1)Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
NT-proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把生物素(Biotin)加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素(Biotin)，并计算每个NT-proBNP抗体可能结合的生物素(Biotin)个数；
(2)荧光分子-SAV的制备：
抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液(0.05M Borate buffer)进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800NHSEster-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的标记个数；
(3)DyLight-800NHS Ester标记的NT-proBNP抗体偶合物的制备：
按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800NHSEster-SAV和Biotin-NT-proBNP抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS,Biotin-NT-proBNP和DyLight-800NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率(T％)，并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP；
快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条的制备方法包括如下步骤：
1)制备检测线；检测膜2在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线7是将抗NT-proBNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥并烘烤数日后即得；
2)制备控制线；所述控制线8是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥并烘烤数日后即得；
3)制备偶合物垫；所述偶合物垫片5的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片5的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将DyLight-800NHS Ester标记的-NT-proBNP抗体偶合物涂布在偶合物垫片5上，充分干燥即得；
4)制备样本垫片；所述样本垫片1可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5)试纸条的组装；将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫片4上，获得快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条。
按以下步骤进行检测：
1)抽取的病人尿液样本，如低温保存样本需恢复至室温。
2)将待测样品加入样本垫片1上，反应。
3)判读，将所述免疫荧光试纸条置于(瑞莱)免疫荧光检测仪以及其相关仪器中判定结果。其结果如下表所示：
从上表可以看出：单项检测的NT-proBNP免疫荧光试纸条的灵敏度和检测范围等性能符合临床检测的要求。
实施例3
如图2所示，一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条，它包括试纸条支撑片4以及试纸条支撑片4上顺次搭接粘贴的样品垫片1、检测膜2和吸水垫片3，所述样品垫片1和检测膜2之间设有偶合物垫片5，偶合物垫片5一端上方设有第一层玻璃纤维垫片6-1，其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片6-2，也可以在偶合物垫片5一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片6-1或者不设有任一垫片，所述检测膜2上设有检测线1(7-1)、检测线2(7-2)，所述检测线1(7-1)包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线2(7-2)包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述的检测线1(7-1)、检测线2(7-2)设在检测膜(2)的同一位置或设在相邻位置，若为不同位置，则检测线1(7-1)、检测线2(7-2)均位于控制线(8)同一侧，控制线8包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体，所述偶合物垫片5上涂布有不同荧光标记的ST2抗体和NT-proBNP抗体偶合物。
所述偶尔物垫片5中含有不同荧光标记的ST2抗体偶合物和NT-proBNP抗体偶合物的制备包括如下步骤：
(1)Dye-649NHS Ester-ST2抗体偶合物以及Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
(1.1)Dye-649NHS Ester-ST2抗体偶合物的制备：
ST2抗体溶于碳酸盐缓冲液(0.5M Boarte buffer,pH＝8.5)中，活化的Dye-649NHS Ester溶解于二甲基亚砜(DMSO)中溶解，然后把ST2抗体加入碳酸盐缓冲液(0.5M Boarte buffer,pH＝8.5)中混匀后，加入准备好的Dye-649NHS Ester溶液，37度反应1小时，反应完成后，将偶合物溶液转移至超滤管中进行纯化，并多次用1XPBS磷酸盐缓冲液冲洗，直至超滤管的底部无游离的荧光分子，并计算纯化后的Dye-649NHS Ester-ST2抗体偶合物的标记个数；
(1.2)Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
NT-proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度，然后把生物素(Biotin)加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素(Biotin)，并计算每个NT-proBNP抗体可能结合的生物素(Biotin)个数；
(2)荧光2-SAV的制备：
抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液(0.05M Borate buffer)进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800NHSEster-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的标记个数；
(3)DyLight-800NHS Ester标记的NT-proBNP抗体偶合物的制备：
按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800NHSEster-SAV和Biotin-NT-proBNP抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS,Biotin-NT-proBNP和DyLight-800NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率(T％)，并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP；
快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)和N-末端脑钠肽(NT-proBNP)的免疫荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)制备检测线；检测膜2在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线7-1是将抗ST2抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上；检测线7-2是将抗NT-proBNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥并烘烤数日后即得；检测线7-1、检测线7-2位于同一位置或不同位置，若为不同位置，则检测线7-1、检测线7-2均位于控制线8同一侧，即液体首先接触的位置；
2)制备控制线；所述控制线8是将抗链霉亲和素(SAV)抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜2上，然后将检测膜2充分干燥并烘烤数日后即得；
3)制备偶合物垫；所述偶合物垫片5的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片5的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将Dye-649NHS Ester标记的-ST2抗体偶合物和DyLight-800NHS Ester标记的-NT-proBNP抗体偶合物涂布在偶合物垫片5上，充分干燥即得；
4)制备样本垫片；所述样本垫片1可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5)试纸条的组装；将上述各组成部件按图2所示结构粘贴在支撑垫片4上，将上述材料组装后，切成小条，即制得所述定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条。
按以下步骤进行检测：
1)抽取的病人血清/血浆/全血样本，如低温保存样本需恢复至室温。
2)将待测样品加入样本垫片1上，反应。
3)判读，将所述免疫荧光试纸条置于(瑞莱)免疫荧光检测仪
以及其相关仪器中判定结果。其结果如下表所示：
从上表可以看出：ST2+NT-proBNP双项免疫荧光检测试纸条采用了两种荧光偶合体系，减少两种荧光偶合物中的相关干扰，并从各项性能等同于各自的单项检测试纸条。

Claims (6)

1.一种快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2）和N-末端脑钠肽（NT-proBNP）的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片（4）以及试纸条支撑片（4）上顺次搭接粘贴的样品垫片（1）、检测膜（2）和吸水垫片（3），所述样品垫片（1）和检测膜（2）之间设有偶合物垫片（5），所述的偶合物垫片（5）一端上方设有第一层玻璃纤维垫片（6-1），其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片（6-2）或者偶合物垫片（5）一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片（6-1）或者不设有任一垫片，其特征在于：所述检测膜（2）上设有检测线1（7-1）、检测线2（7-2），所述检测线1（7-1）包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线2（7-2）包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述的检测线1（7-1）、检测线2（7-2）设在检测膜（2）的同一位置或设在相邻位置，若为不同位置，则检测线1（7-1）、检测线2（7-2）均位于控制线（8）同一侧，控制线（8）包被有抗链霉亲和素（SAV）抗体，所述偶合物垫片（5）上涂布有含有不同荧光标记的ST2抗体和NT-proBNP抗体偶合物，
所述偶尔物垫片（5）中的含有不同荧光标记的ST2抗体偶合物和NT-proBNP抗体偶合物通过如下步骤制成：
1）Dye-649 NHS Ester-ST2抗体偶合物以及Biotin-NT-proBNP抗体的制备
1.1）Dye-649 NHS Ester-ST2抗体偶合物的制备：
ST2抗体溶于碳酸盐缓冲液（0.5M Boarte buffer, pH=8.5）中，活化的Dye-649 NHS Ester溶解于二甲基亚砜（DMSO）中溶解，然后把ST2抗体加入碳酸盐缓冲液（0.5M Boarte buffer, pH=8.5）中混匀后，加入准备好的Dye-649 NHS Ester溶液，37度反应1小时，反应完成后，将偶合物溶液转移至超滤管中进行纯化，并多次用1XPBS磷酸盐缓冲液冲洗，直至超滤管的底部无游离的荧光分子，并计算纯化后的Dye-649 NHS Ester-ST2抗体偶合物的标记个数；
1.2）Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
NT-proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，活化的生物素（Biotin）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中保证其活化度，然后把生物素（Biotin）加入溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素（Biotin），并计算每个NT-proBNP抗体可能结合的生物素（Biotin）个数；
2）DyLight-800 NHS Ester-SAV的制备：
抗链霉亲和素（SAV）粉末溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的抗链霉亲和素（SAV）快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液（0.05M Borate buffer）进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800 NHS Ester-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素（SAV）的标记个数；
3）DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP抗体偶合物的制备：
DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP偶合物的制备方法：按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800 NHS Ester-SAV和Biotin-NT-proBNP抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS , Biotin-NT-proBNP和DyLight-800 NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率（T%），并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP。
2.如权利要求1所述的快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2）和N-末端脑钠肽（NT-proBNP）的免疫荧光试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）制备检测线；检测膜（2）在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线（7-1）是将抗ST2抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜（2）上;检测线（7-2）是将抗NT-proBNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜（2）上，然后将检测膜（2）充分干燥并烘烤数日后即得；检测线（7-1）、检测线（7-2）位于同一位置或不同位置，若为不同位置，则检测线（7-1）、检测线（7-2）均位于控制线（8）同一侧，即液体首先接触的位置；
2）制备控制线；所述控制线（8）是将抗链霉亲和素（SAV）抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜（2）上，然后将检测膜（2）充分干燥并烘烤数日后即得；
3）制备偶合物垫；所述偶合物垫片（5）的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片（5）的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将Dye-649 NHS Ester标记的-ST2抗体偶合物和DyLight-800 NHS Ester标记的-NT-proBNP抗体偶合物涂布在偶合物垫片（5）上，充分干燥即得；
4）制备样本垫片；所述样本垫片（1）可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5）试纸条的组装；在试纸条支撑片（4）由下而上依次粘附检测膜（2）、吸水垫片（3）和偶合物垫片（5），在偶合物垫片（5）上设有第一层玻璃纤维垫片（6-1）、第二层玻璃纤维垫片（6-2）或者仅设第一层玻璃纤维垫片（6-1）或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片（1）；将上述材料组装后，切成小条，即制得所述定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条。
3.一种快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片（4）以及试纸条支撑片（4）上顺次搭接粘贴的样品垫片（1）、检测膜（2）和吸水垫片（3），所述样品垫片（1）和检测膜（2）之间设有偶合物垫片（5），所述的偶合物垫片（5）一端上方设有第一层玻璃纤维垫片（6-1），其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片（6-2）或者偶合物垫片（5）一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片（6-1）或者不设有任一垫片，其特征在于：所述的检测膜（2）上设有检测线（7），检测线（7）包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，检测线（7）另一边设有控制线（8），控制线（8）包被有抗链霉亲和素（SAV）抗体，所述偶合物垫片（5）上涂布有荧光标记的ST2抗体偶合物；
偶尔物垫片（5）中荧光标记的ST2抗体偶合物的制备包括如下步骤：
（1）Biotin-ST2抗体的制备：
ST2抗体溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，活化的生物素（Biotin）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中保证其活化度，然后把生物素（Biotin）加入溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的ST2抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素（Biotin），并计算每个ST2抗体可能结合的生物素（Biotin）个数；
（2）荧光分子-SAV的制备：
抗链霉亲和素（SAV）粉末溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的抗链霉亲和素（SAV）快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液（0.05M Borate buffer）进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800 NHS Ester-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素（SAV）的标记个数；
（3）DyLight-800 NHS Ester标记的ST2抗体偶合物的制备：
按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800 NHS Ester-SAV和Biotin-ST2抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS , Biotin-ST2和DyLight-800 NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率（T%），并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-ST2。
4.如权利要求3所述的快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备检测线；检测膜（2）在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线（7）是将抗ST2抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜（2）上；然后将检测膜（2）充分干燥并烘烤数日后即得；
2）制备控制线；控制线（8）是将抗链霉亲和素（SAV）抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜（2）上，然后将检测膜（2）充分干燥并烘烤数日后即得；
3）制备偶合物垫；偶合物垫片（5）的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片（5）的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将Dye-649 NHS Ester标记的-ST2抗体偶合物涂布在偶合物垫片（5）上，充分干燥即得；
4）制备样本垫片：样本垫片（1）可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5）试纸条的组装；在试纸条支撑片（4）由下而上依次粘附检测膜（2）、吸水垫片（3）和偶合物垫片（5），在偶合物垫片（5）上设有第一层玻璃纤维垫片（6-1）、第二层玻璃纤维垫片（6-2）或者仅设第一层玻璃纤维垫片（6-1）或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片（1）；将上述材料组装后，切成小条，获得快速定量检测ST2的免疫荧光试纸条。
5.一种快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条，包括试纸条支撑片（4）以及试纸条支撑片（4）上顺次搭接粘贴的样品垫片（1）、检测膜（2）和吸水垫片（3），所述样品垫片（1）和检测膜（2）之间设有偶合物垫片（5），所述的偶合物垫片（5）一端上方设有第一层玻璃纤维垫片（6-1），其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片（6-2）或者偶合物垫片（5）一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片（6-1）或者不设有任一垫片，其特征在于：所述检测膜（2）上设有检测线（7），所述检测线（7）包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线（7）另一边设有控制线（8），控制线（8）包被有抗链霉亲和素（SAV）抗体，所述偶合物垫片（5）上涂布有荧光标记的NT-proBNP抗体偶合物；
所述偶尔物垫片（5）中荧光标记的NT-proBNP抗体偶合物的制备包括如下步骤：
（1）Biotin-NT-proBNP抗体的制备：
NT-proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，活化的生物素（Biotin）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中保证其活化度，然后把生物素（Biotin）加入溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，以4000rpm并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素（Biotin），并计算每个NT-proBNP抗体可能结合的生物素（Biotin）个数；
（2）荧光分子-SAV的制备：
抗链霉亲和素（SAV）粉末溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中活化，然后把溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的抗链霉亲和素（SAV）快速溶解荧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液（0.05M Borate buffer）进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离心浓缩，并多次纯化，直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部，纯化好的DyLight-800 NHS Ester-SAV，在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值，然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素（SAV）的标记个数；
（3）DyLight-800 NHS Ester标记的NT-proBNP抗体偶合物的制备：
按照SAV：Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight-800 NHS Ester-SAV和Biotin-NT-proBNP抗体的浓度，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）补充反应体积，按照计算所需的量依次加入1XPBS , Biotin-NT-proBNP和DyLight-800 NHS Ester-SAV，充分混合后，在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率（T%），并在透过率达到要求时进行终止反应，形成DyLight-800 NHS Ester-SAV-Biotin-NT-proBNP。
6.如权利要求5所述的快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备检测线；检测膜（2）在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；检测线（7）是将抗NT-proBNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜（2）上，然后将检测膜（2）充分干燥并烘烤数日后即得；
2）制备控制线；所述控制线（8）是将抗链霉亲和素（SAV）抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释，划线于所述检测膜（2）上，然后将检测膜（2）充分干燥并烘烤数日后即得；
3）制备偶合物垫；所述偶合物垫片（5）的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片（5）的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液中浸泡后取出，充分干燥后，用包膜仪器将DyLight-800 NHS Ester标记的-NT-proBNP抗体偶合物涂布在偶合物垫片（5）上，充分干燥即得；
4）制备样本垫片；所述样本垫片（1）可对液态样品起到初步过滤作用，将样本垫片用封闭液浸泡后，充分干燥即得；
5）试纸条的组装；在试纸条支撑片（4）由下而上依次粘附检测膜（2）、吸水垫片（3）和偶合物垫片（5），在偶合物垫片（5）上设有第一层玻璃纤维垫片（6-1）、第二层玻璃纤维垫片（6-2）或者仅设第一层玻璃纤维垫片（6-1）或者不设有任一垫片，最上一层为样品垫片（1）；将上述材料组装后，切成小条，获得快速定量检测NT-proBNP的免疫荧光试纸条。
CN201510261064.1A 2015-05-20 2015-05-20 快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法 Pending CN104865387A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510261064.1A CN104865387A (zh) 2015-05-20 2015-05-20 快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510261064.1A CN104865387A (zh) 2015-05-20 2015-05-20 快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104865387A true CN104865387A (zh) 2015-08-26

Family

ID=53911364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510261064.1A Pending CN104865387A (zh) 2015-05-20 2015-05-20 快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104865387A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105445450A (zh) * 2015-12-30 2016-03-30 天津诺星生物医药科技有限公司 一种心衰疾病检测系统
CN105527445A (zh) * 2015-12-30 2016-04-27 天津诺星生物医药科技有限公司 一种急性心梗检测系统
CN107328926A (zh) * 2017-06-29 2017-11-07 海格德生物科技（深圳）有限公司 快速检测多项心衰标志物的试剂卡、制备方法及检测方法
CN108398553A (zh) * 2018-02-06 2018-08-14 国为生物科技泰州有限公司 一种NT-proBNP的检测试剂盒及其检测方法
CN109863404A (zh) * 2016-04-18 2019-06-07 豪夫迈·罗氏有限公司 用于鉴定一般群体中lvh的进展者的可溶性st2
CN110927394A (zh) * 2019-12-12 2020-03-27 光景生物科技(苏州)有限公司 一种BNP、NT-proBNP、sST2的联合检测试剂条及制备方法
CN112946259A (zh) * 2021-02-02 2021-06-11 瑞莱生物科技江苏有限公司 降钙素原、白介素6和肝素结合蛋白联合检测试剂盒
CN114113636A (zh) * 2021-12-09 2022-03-01 河北特温特生物科技发展有限公司 一种心肺肾四项联检试纸卡、试剂盒及制备方法
CN114167052A (zh) * 2021-12-03 2022-03-11 广州达泰生物工程技术有限公司 时间分辨荧光免疫层析法定量检测NT-proBNP/ST2的试剂盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103197063A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 瑞莱生物科技（江苏）有限公司 一种免疫层析试剂盒及其检测方法
WO2014086833A1 (en) * 2012-12-04 2014-06-12 Roche Diagnostics Gmbh Biomarkers in the selection of therapy of heart failure
CN103926401A (zh) * 2014-03-31 2014-07-16 瑞莱生物科技（江苏）有限公司 一种快速定量检测igfbp-7和timp-2的免疫荧光试纸条及其制备方法
CN204287196U (zh) * 2014-04-22 2015-04-22 瑞莱生物科技（江苏）有限公司 一种快速定量检测st2的免疫荧光试纸条

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014086833A1 (en) * 2012-12-04 2014-06-12 Roche Diagnostics Gmbh Biomarkers in the selection of therapy of heart failure
CN103197063A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 瑞莱生物科技（江苏）有限公司 一种免疫层析试剂盒及其检测方法
CN103926401A (zh) * 2014-03-31 2014-07-16 瑞莱生物科技（江苏）有限公司 一种快速定量检测igfbp-7和timp-2的免疫荧光试纸条及其制备方法
CN204287196U (zh) * 2014-04-22 2015-04-22 瑞莱生物科技（江苏）有限公司 一种快速定量检测st2的免疫荧光试纸条

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105445450A (zh) * 2015-12-30 2016-03-30 天津诺星生物医药科技有限公司 一种心衰疾病检测系统
CN105527445A (zh) * 2015-12-30 2016-04-27 天津诺星生物医药科技有限公司 一种急性心梗检测系统
CN105527445B (zh) * 2015-12-30 2018-04-17 天津诺星生物医药科技有限公司 一种急性心梗检测系统
CN109863404A (zh) * 2016-04-18 2019-06-07 豪夫迈·罗氏有限公司 用于鉴定一般群体中lvh的进展者的可溶性st2
CN107328926A (zh) * 2017-06-29 2017-11-07 海格德生物科技（深圳）有限公司 快速检测多项心衰标志物的试剂卡、制备方法及检测方法
CN108398553A (zh) * 2018-02-06 2018-08-14 国为生物科技泰州有限公司 一种NT-proBNP的检测试剂盒及其检测方法
CN110927394A (zh) * 2019-12-12 2020-03-27 光景生物科技(苏州)有限公司 一种BNP、NT-proBNP、sST2的联合检测试剂条及制备方法
CN112946259A (zh) * 2021-02-02 2021-06-11 瑞莱生物科技江苏有限公司 降钙素原、白介素6和肝素结合蛋白联合检测试剂盒
CN114167052A (zh) * 2021-12-03 2022-03-11 广州达泰生物工程技术有限公司 时间分辨荧光免疫层析法定量检测NT-proBNP/ST2的试剂盒及其应用
CN114113636A (zh) * 2021-12-09 2022-03-01 河北特温特生物科技发展有限公司 一种心肺肾四项联检试纸卡、试剂盒及制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104865387A (zh) 快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法
CN102680692B (zh) 基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂
CN109406778B (zh) 一种检测烟叶中青枯病菌的时间分辨荧光定量试纸条及其制备方法和应用
EP2539695B1 (en) A method for determining a correct test performance for a flow test element
CN106053794A (zh) 一种用于准确检测待测物的试剂卡、试剂盒和用途
CN103926401A (zh) 一种快速定量检测igfbp-7和timp-2的免疫荧光试纸条及其制备方法
CN204228723U (zh) 定量检测n末端脑钠肽前体的试剂条和试剂卡
CN103869079A (zh) 一种快速定量检测半乳糖凝集素-3的胶体金试纸
Cho et al. Two-dimensional paper chromatography-based fluorescent immunosensor for detecting acute myocardial infarction markers
CN108918883A (zh) 一种快速定量检测心肌肌钙蛋白ｉ、肌酸激酶同工酶和肌红蛋白的免疫荧光试剂盒
CN103941007A (zh) 一种快速定量检测阿司匹林疗效的免疫荧光试纸条及其制备方法
CN102087285B (zh) 急性胰腺炎免疫层析快速检测试纸条及其制备方法
CN110514828A (zh) 一种快速检测孕妇胎盘生长因子的免疫层析检测卡及其制备方法
CN107505459B (zh) 定量检测人h-fabp的时间分辨荧光免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
CN108226468A (zh) 一种检测NT-proBNP的试纸条及其制备方法与应用
CN104698181A (zh) 近红外荧光分子免疫层析试纸及其制备方法
CN107478848A (zh) 定量检测人NT‑proBNP的试剂盒及其制备方法
CN204514934U (zh) 一种快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白的试纸
CN103941019A (zh) 快速定量检测l-fabp的免疫荧光试纸条及其制备方法
CN208270585U (zh) St2检测试纸以及检测试剂盒
KR20150058509A (ko) 비희석계 면역 크로마토그래피법 시약에 있어서 희석 시료를 측정하기 위한 첨가물
CN108267594A (zh) 一种基于双分子荧光互补技术的st2检测试剂盒、制备及使用方法
CN204287192U (zh) 髓过氧化物酶免疫层析定量检测试纸条
CN108181465A (zh) 检测25-羟基维生素d的荧光层析试剂盒及其定量检测方法
CN204495843U (zh) 一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的试纸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150826