JPWO2015060269A1 - 被験物質の濃度測定方法および検出装置 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)被験物質から過酸化物を発生させ、当該過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて得られる重合物質、または(ii)被験物質に、当該被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて得られる重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録することによって所期の目的が達成されることを見出し、本発明を完成した。
(1)第1の方法:
被験物質から過酸化物を発生させる工程と、
前記過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、
前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含む被験物質の濃度測定方法。
被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、
前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含むことを特徴とする被験物質の濃度測定方法。
この工程は、被験物質由来の過酸化物に酵素を反応させ、酵素の酸化還元反応に伴って重合基質を二量化するなどして重合物質を得るものである。
前述したように上記第2の方法は、酵素の酸化還元反応に伴う重合基質の重合物質化を行なう点では上記第1の方法と共通するが、その前提として、上記第1の方法のように、被験物質由来の過酸化物を用いるのではなく、被験物質と、被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を混合し、得られた物質に過酸化物および重合基質を混合したものを用いる点で、上記第1の方法と相違する。
上記工程を詳しく述べると、まず、上記重合物質に光を照射する。光の照射により酸化重合が進み、上記重合物質が光を吸収して重合体が形成され、重合度が高められる。その重合体が、光透過基体上の集光スポット内で凝集してナノ構造体(光を散乱する重合体)が形成される。上記散乱光には、反射光、後方反射光、後方散乱光も含まれる。また、散乱光強度の変化を精度良く測定するには、上記光として、レーザー光が好ましく用いられる。また、光の照射に当たっては、ガラス基板などの基体と被験物質由来の重合物質を含む溶液との界面に集光させることが好ましい。
o−フェニレンジアミン(酸化還元酵素の基質):o−PD
2,3−ジアミノフェナジン(重合物質):DAP
ポリフェニレンジアミン:重合体
グルコースオキシダーゼ:GOD
西洋ワサビペルオキシダーゼ(酸化還元酵素):HRP
アルコールオキシダーゼ:AOD
1−1.試薬
o−フェニレンジアミン(Wako)
グルコースオキシダーゼ(162unit/mg、東洋紡績株式会社)
西洋ワサビペルオキシダーゼ(100unit/mg、Wako)
メチレンブルー(Wako)
これらの溶媒にはクエン酸バッファー(pH4.6)を用い、所定濃度となるように溶解した。
アルコールオキシダーゼ(Pichia pastoris、38unit/mL、SIGMA−ALDRICH)
エタノール(99.5%、Wako)
マイクロカバーガラス17(サイズ24mm×36mm、厚さ0.12〜0.17mm、MATSUNAMI)を洗剤(decon90、Decon Laboratories Limited)で洗浄して乾燥し、その上にパンチで直径3.5mmの穴を9〜12個開けたシリコンシート15(厚さ0.2mm、Asone)を載せ、図4のマルチウェル基板(以下、基板と略記する場合がある。)を作製した。図中、16は測定対象の溶液である。
1−3−1.測定装置
本実験に用いたレーザー集光装置の概略図を図3に示す。レーザー光源1には波長473nmのDPSSレーザー(SDL−473−050TL、Shanghai Dream Lasers Technology)、波長532nmのYAGレーザー(SDL−532−020TL、Shanghai Dream Lasers Technology)、波長633nmのHe−Neレーザー(31−2066−000、COHERENT)を用いた。レーザー光をビームエキスパンダー2で拡げた後、NDフィルター3を通し、倒立型顕微鏡5(IX70−S1F2、OLYMPUS)へ導入した。レーザー光はハーフミラー6(70%反射)で反射され、対物レンズ7(UPlanFL N、60x、OLYMPUS)を用いて倒立型顕微鏡のステージ8上にセットした基板9の上面(基板−溶液の界面)へ集光させた。集光スポットには重合体のナノ構造体10が形成される。表1に各レーザー光源の集光点でのレーザー強度を示す。後方散乱光は、カップラー11により光ファイバー12を通り、光電子増倍管(Hamamatu Photonics、R1166)13で検出され、電気信号に変換された後、データ収録用拡張ボード14を介してコンピュータ(PC)に出力される。レーザーの光路上には外部入力で開閉を制御できるメカニカルシャッター4を置き、コンピュータからプログラムで自動制御できるようにした。
基板9を倒立型顕微鏡5のステージ上に固定し、レーザー光を基板上面に集光するため、基板上面で反射したレーザー集光スポット径が小さくなるように対物レンズ7の高さを調整した。シャッター4を閉じ、レーザー光を遮断してからo−PDを含む試料溶液を基板9のウェルに10〜20μL滴下した。プログラムにより光電子増倍管13からの電圧の測定レートを50Hz、測定ポイント数を3000〜15000に設定することで測定時間を1〜5分に調整した。コンピュータの操作によりシャッター4を開くと、レーザーが試料に集光され、ポリフェニレンジアミンナノ構造形成に伴う後方散乱光強度の測定を開始した。メカニカルシャッター4は設定した時間が経過すると自動的に閉じて測定を終了した。
比較のため、o−PDの酸化によって生成したDAP(ダイマー)の吸収スペクトルを分光光度計で測定した。吸収スペクトルの測定には分光光度計(UV−2550、SHIMADZU)を用いた。試料と対照用の純水をそれぞれ測定用セル(10×10×45mm、ディスポセルUV、ニッコー・ハンセン株式会社)に入れ、分光光度計にセットする。そして波長300〜900nmの範囲でサンプリングピッチを0.5nm、スキャンスピードを高速に設定して試料の吸収スペクトルを測定した。
基板上に形成した重合体を、走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope、以下、SEMと略記する。)(FEI、DB−235)を用いて観察した。SEMは、電子線を絞った電子ビームを測定する試料に照射させ、その試料から放出される2次電子を検出することで試料を観察することが出来る電子顕微鏡の一つである。SEMは電子ビームを試料に照射するため、試料表面に導電性が必要である。そのため、本実験ではネオオスミウムコーター(メイワフォーシス株式会社、NeoC−ST)を用い、基板表面にオスミウム金属導電被膜を約2.5nm堆積形成させて、表面に導電性を付与させてから、SEMによる測定を行った。
ここでは、HRP酵素反応を用いる代わりに、o−PDに緑色LEDを照射してDAPを形成させ、o−PD溶液中に含まれるDAPの光吸収によって、ポリマー凝集体であるナノ構造体が得られることを示す。
o−PD溶液(0.33mM)を分光装置の測定用セルに入れ、200mW/cm2の緑色LED(波長530nm)を一定時間照射した後、各照射時間におけるo−PD溶液の吸収スペクトルを分光光度計で測定した。得られた吸光スペクトルを図5(a)に示す。上記図より、緑色LEDの照射時間が長くなる程、波長450nm付近をピークとする光吸光度スペクトルの吸光度が増加した。この吸収スペクトルの形状は、o−PDのダイマーであるDAPの吸収スペクトルの形状と一致する。すなわち、o−PD溶液の酸化によりDAPが生成し、橙色に呈色したことが分かった。
0.2mM、1mM、4mMの三種類のo−PD水溶液を上記基板上に滴下し、波長532nm、強度2mWの緑色レーザー光を集光して80秒間照射し、後方散乱光強度を測定して、その時間的変化を調べた。この結果を図7(a)に示す。図7(a)に示すように、o−PD水溶液の濃度が高いほど、後方散乱光強度が最初に極大となる時間(最初のピーク強度が得られるまでのピーク時間)が早い。
図8(a)〜(f)は、1mMのo−PD水溶液に緑色レーザーを集光し、4秒ごとに反射光の画像を光学顕微鏡に取り付けたCCDカメラで順次撮影したものである。中心部の緑色のスポットがレーザー集光点からの反射光である。後方散乱光強度は図8(a)〜(d)にかけて増加し、その後、図8(d)〜(f)にかけて減少していることが分かる。
ここでは、後方散乱光強度の時間的変化と、形成されるナノ構造体の高さとの関係を調べた。図9(a)に本実験の測定手順を示す。
ここでは、後方散乱光強度の時間的変化のメカニズムを示すため、モデル系に対するフレネルの式を計算した。
ここでは、DAP濃度と後方散乱光強度のピーク時間の関係について調べた。図12(a)に本実験の測定手順を示す。
ここでは、酵素によってo−PDの酸化重合反応が促進されることを説明する。レーザーを基板上に集光すると、酵素による酸化重合反応によって得られるDAPの光吸収により活性酸素種が発生する。活性酸素の高い酸化力により酸化重合が進行し、集光点にポリマー凝集体であるナノ構造体が形成される。このナノ構造体がレーザー反射光強度を変化させる。
HRP溶液、過酸化水素(0〜200μM)、及びo−PD溶液(1mM)をそれぞれ20μL採取してマイクロチューブ内で混合し、その混合液を基板上に20μL滴下して後方散乱光強度を測定した。以下に、HRP酵素反応によるo−PDの酸化重合反応[o−PD→DAP→Poly(OPD)(=重合体)]を示す。
o−PD溶液(0.33mM)20μL、o−PD溶液(1mM)、HRP溶液、および過酸化水素(0.2mM)の各20μLを加えた混合液20μLを基板上に滴下し、2分間レーザー光を集光し、集光点に形成されたナノ構造体のSEM観察を行なった。比較のため、o−PD溶液のみにレーザー光を集光し、同様にSEM観察を行なった。
4−1.グルコース濃度の定量
図15(a)に本実験の測定手順を示す。具体的には、グルコース水溶液(0〜1mM)20μLと、GODとHRPを1:1で混合した溶液(以下、GOD/HRPと略記する。)20μLを混合し、1分間恒温放置した。o−PD溶液(1mM)20μLを加えた混合溶液から20μL採取し、基板に滴下し、後方散乱光強度を測定した。コントロールとしてGODに活性がないリボース、ラクトース水溶液(5mM)を用いて同様に後方散乱光強度の測定を行った。
図16(a)に本実験の測定手順を示す。具体的には、分光光度計の測定用セルにグルコース水溶液(0〜1mM)300μLと、GOD/HRP溶液300μLを混合し、1分間恒温放置した。ここにo−PD溶液(1mM)300μLを加えて混合し、分光光度計で吸収スペクトルを測定した。図16(b)に得られた吸収スペクトルを示す。また、図16(c)に、各グルコース濃度に対するピーク吸光度をプロットしたグラフを示す。
波長473nm、532nm、633nmのレーザー光源を用いてグルコースの検出における後方散乱光強度を測定し、レーザー波長依存性を調べた。得られた後方散乱光強度の時間的変化を図17(波長473nm)、図18(波長532nm)、図19(波長633nm)に示す。更に図20に、上記の各波長における、グルコース濃度に対する後方散乱光強度のピーク時間を示す。これらの図より、波長473nmではグルコースが1μM〜1mM、波長532nmでは100nM〜1mM、波長633nmでは0.5〜2.5mMの濃度範囲を定量できることが分かった。よって、本実験の条件下では、波長532nmの緑色レーザー光がグルコースの検出に最も適していることが分かった。
ここでは、o−PD溶液の吸収スペクトルと重合体の後方散乱光強度スペクトルとの関係を調べた。
本実験では、光増感剤の一つであるメチレンブルーによる酸化重合反応促進効果を調べた。
ここでは、本発明法によりエタノールを検出した。以下に、エタノールとAOD、o−PDとHRPの反応式を示す。
ここでは、IgG抗体を固定化したIgG抗体固定化基板を用い、これにHRP標識抗IgG抗体を結合させ、集光レーザービームによるo−PDの酸化重合反応を利用してHRP標識抗IgG抗体の検出を行った。
IgG抗体固定化基板の作製に用いられる試料溶液を以下のようにして調製した。まず、レセプターとして用いるIgG抗体(ChromPure Human IgG,whole molecule、Jackson ImmunoReserch LABORATORIES,INC.,11.8mg/mL)の濃度が100μg/mLとなるようにHEPESバッファー(10 mM、pH7.25)に溶解した。検出用抗原としてHRP標識抗IgG抗体(Rabbit polyclonal Secondary Antibody to Human IgG−H&L(HRP),pre−adsorbed、0.5mg/mL)を純水に溶解し、濃度10ng/mLの水溶液を作製した。その水溶液を純水で10倍希釈を繰り返し、濃度10fg/mL〜10ng/mLの11種のHRP標識抗IgG抗体水溶液を作製した。
ここでは、基板として、一般的に用いられる市販のマイクロプレートよりもサイズの小さい顕微鏡用カバーガラスを用いた。マイクロプレートを用いたELISA法では、サンプル溶液や試薬などがそれぞれ、1ウェル当たり100μL程度必要であるが、サイズの小さい上記カバーガラスを用いれば、サンプル溶液などの容量を減らすことができる。よって、微量の被験物質を簡便且つ感度良く検出することができる。
図30(a)に、本測定法による概略図を示す。
抗IgG抗体の検出を、HRP標識抗IgG抗体との競合法によって検出した。図31(a)に、本測定法による概略図を示す。
上述したとおり、ELISA法では、被験物質に対する抗体、抗原のレセプターのほか、被験物質も固定化した基板を用いることができる。しかし、抗体などが固定化された基板表面は分子レベルでは平坦でないため、ナノ構造体が形成されにくい。
一般的にELISA法では、検出対象物質の抗体が固相化されたマイクロプレート、酵素標識抗体(二次抗体)、希釈やブロッキングなどに必要な溶液、酵素と反応して発色や蛍光性物質を産生する発色基質などが含まれた試薬キットを用いることが多い。そこで、以下では、市販のELISAキットを用いて、従来の吸光度測定法と本発明の後方散乱光強度測定法の比較実験を行った。
本実験では、被験物質としてIgG抗体を用いた。また、実験に使用するHRP標識抗IgG抗体(二次抗体)、ブロッキング溶液、洗浄液、および各工程のプロトコルは、KPL社のProtein Detector ELISA Kit,Anti−Humanを使用した。
IgG抗体(14.7mg/L)をマイクロプレート(Nunc、マキシプレート)の各ウェルに100μL滴下し、室温で3時間静置した後、洗浄して固相化した。具体的には、各ウェルにブロッキング溶液を300μL滴下し、室温で5分間静置した後、洗浄してブロッキングを行った。次いで、各濃度に希釈したHRP標識抗IgG抗体を各ウェルに100μL滴下し、室温で1時間静置した後、洗浄してIgG抗体固相基板を作製した。
上記のようにして得られた静置後の溶液を各ウェルから10μL採取し、別に用意したガラス基板に滴下した後、レーザー(波長532nm、強度8mW)を、60倍の対物レンズを用いて上記ガラス基板と上記溶液との固液界面に集光して後方散乱光強度変化を測定した。
各ウェルにおける波長405nmの吸光度を、マイクロプレートリーダー(コロナ電気、SH−1000)を用いて測定した。
これらの結果を図36(従来法)および図37(本発明法)に示す。詳細には図36は、吸光度とHRP標識抗IgG抗体の濃度との関係を示すグラフである。図37は、後方散乱光強度の最初のピークが現れた時間(図の縦軸では「ピーク時間」と記載)と、HRP標識抗IgG抗体の濃度との関係を示すグラフである。これらの図を対比すると、両者は、HRP標識抗IgG抗体濃度が100pg/mL以下の極微量レベルで明瞭な差が見られた。よって、本発明の方法を用いれば、従来の吸光度法では困難であった、例えば10pg/mL以上の極微量濃度における定量測定が可能であることが分かった。
本実験では、被験物質としてC反応性タンパク(C−reactive protein:CRP)を用いた。CRPは、体内で炎症反応や組織の破壊が起きているときに血中に現れるタンパク質であり、感染症、悪性腫瘍、心筋梗塞などの疾病の指標となる。本実験では、一般的なサンドイッチ法を利用してCRPの測定を行った。具体的には、抗体固相化マイクロプレート、HRP標識二次抗体、希釈溶液、および各工程のプロトコルは、Biocheck社のHigh Sensitivity C−reactive Protein Enzyme Immunoassay Test Kitを用いて実施した。
まず、抗CRP抗体が固相化されたマイクロプレートの各ウェルに、濃度を調整したCRP溶液を10μL滴下した。続いて、各ウェルにHRP標識二次抗体を100μL滴下し、室温で45分間静置した。
反応溶液として、2mMのo−PDと10mMの過酸化水素のクエン酸バッファー溶液との混合溶液100μLを各ウェルに滴下し、室温で1時間静置した。
反応溶液として、本実験に用いた上記Kitに付属の反応溶液[3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)と過酸化水素の混合溶液]を各ウェルに100μL滴下し、室温で1時間静置した後、上記Kitに付属の反応停止液を各ウェルに100μL滴下した。各ウェルにおける波長405nmの吸光度を、マイクロプレートリーダー(コロナ電気、SH−1000)を用いて測定した。
これらの結果を図38(従来法)および図39(本発明法)に示す。詳細には図38は、吸光度とCRP濃度との関係を示すグラフである。図39は、後方散乱光強度が一度減少して、再び元の強度まで増加する時間を計測したときの時間(図の縦軸では「所定時間」と記載)と、CRP濃度との関係を示すグラフである。厳密な測定感度は使用するELISAキットに依存するが、本発明の方法を用いれば、従来の吸光度法では困難であった、例えば500pg/mL以上の極微量濃度におけるCRPの定量測定が可能であることが分かった。
本実験では、被験物質としてIgG抗体を用いると共に、微量測定のため、基板として、マイクロプレートよりサイズの小さいカバーガラスを用いた。本実験に用いたHRP標識抗IgG抗体(二次抗体)、ブロッキング溶液、洗浄液、および各工程のプロトコルは、KPL社のProtein Detector ELISA Kit,Anti−Humanを使用した。
図40を参照しながら、本実験の測定手順を説明する。まず、顕微鏡用カバーガラス17(サイズ24mm×36mm、厚さ0.12〜0.17mm、MATSUNAMI)にポリスチレン溶液(溶媒キシレン、濃度10wt%)を滴下し、スピンコート法によりポリスチレン薄膜を作製した。次に、直径3mmの穴の開いたシリコンシート15(厚さ0.2mm、Asone)を密着させ、ウェルを作製した。次いで、IgG抗体25(14.7mg/L)を各ウェルに10μL滴下し、室温で3時間静置した後、洗浄した。次に、各ウェルにブロッキング溶液を10μL滴下し、室温で5分間静置した後、洗浄してブロッキングを行ってIgG抗体固相化基板を得た(以上、図40の(1)を参照)。
得られた結果を図41に示す。図41は、後方散乱光強度の最初のピークが現れた時間(図の縦軸では「ピーク時間」と記載)と、HRP標識抗IgG抗体(二次抗体)濃度との関係を示すグラフである。本実験のように抗体固相化基板と清浄な基板を重ねて、上記清浄な基板からレーザーを集光する方法を用いれば、1ng/mL以上の抗IgG抗体を再現性良く測定できることが分かった。
上述したようにo−PD溶液に緑色レーザー光を集光すると、基板上の集光点で酸化重合反応が進行し、反応により形成されるナノサイズの重合体の成長に伴って後方散乱光強度が時間的に変化する。この酸化重合反応は、HRPなどのペルオキシダーゼ酵素反応によって促進され、重合体の形成速度が増加することがSEM観察像により確認された。本発明の方法は、これらの現象を利用したものであり、100nM〜1mMのグルコース濃度を感度良く定量することができた。また、グルコースの検出におけるレーザー波長依存性を調べたところ、グルコースの検出には、波長532nmの緑色レーザー光が適していることが分かった。更に、レーザー光の波長依存性とo−PD溶液の吸収スペクトル、重合体の後方散乱光強度スペクトルの関係から、本発明の検出方法では、o−PD溶液中のDAP(ダイマー)と、集光点に形成される重合体の両方による光吸収が重要であることが強く示唆された。更に本発明の方法により、エタノールを定量良く検出することができた。
2 ビームエキスパンダー
3 NDフィルター
4 メカニカルシャッター
5 倒立型顕微鏡
6 ハーフミラー
7 対物レンズ
8 ステージ
9 基板
10 ナノ構造体
11 カップラー
12 光ファイバー
13 光電子増倍管
14 データ収録用拡張ボード
15 シリコンシート
16 溶液
17 カバーガラス
21 基板
22 多孔質担体
23 抗体
24 スペーサー
25 抗体(IgG)
26 重合物質含有溶液
27 抗体固相基板
28 清浄な基板
A 抗体存在領域
B 抗体非存在領域
Claims (13)
- 被験物質から過酸化物を発生させる工程と、
前記過酸化物に、重合物質生成用酸化還元酵素、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、
前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含む被験物質の濃度測定方法。 - 前記被験物質は、酵素反応によって過酸化物を生成する物質である請求項1に記載の被験物質の濃度測定方法。
- 被験物質に、前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質に重合物質生成用酸化還元酵素が修飾された修飾物質を接触させた後、過酸化物、および前記重合物質生成用酸化還元酵素の基質を接触させて重合物質を得る工程と、
前記重合物質に光を照射して、照射点からの散乱光の強度の時間的変化情報を記録する工程と、
を含むことを特徴とする被験物質の濃度測定方法。 - 前記被験物質に対して特異的な相互作用が抗原抗体反応である請求項3に記載の被験物質の濃度測定方法。
- 前記時間的変化情報が信号波形を構成しており、前記被験物質への前記光の照射開始時以降の所定の時から、前記信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する工程をさらに含む請求項1〜4のいずれかに記載の被験物質の濃度測定方法。
- 前記重合物質を得る工程は基体の上で行なうものである請求項1〜5のいずれかに記載の被験物質の濃度測定方法。
- 前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるX群物質の少なくとも一種が存在する第1の基体と、
前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるX群物質の少なくとも一種が存在しない第2の基体と、
を重ね合わせ、前記第2の基体から光を照射するものである請求項6に記載の被験物質の濃度測定方法。 - 前記基体は、前記被験物質、および前記被験物質に対して特異的な相互作用を有する物質よりなるX群物質の少なくとも一種が存在するX群物質存在領域と、前記X群物質が存在しないX群物質非存在領域とを有しており、前記X群物質非存在領域に前記光を照射するものである請求項6に記載の被験物質の濃度測定方法。
- 前記基体の上に多孔質担体を設け、前記多孔質担体によって前記X群物質を固定している請求項8に記載の被験物質の濃度測定方法。
- 被験物質に光を入射できる光源と、
前記被験物質由来の重合物質からの散乱光を検知する光電変換素子と、
前記光電変換素子から出力される信号を所定時間のあいだ続けて記録する記録媒体と、を有することを特徴とする被験物質の検出装置。 - 前記被験物質由来の重合物質が光透過基体の第1面側に存在しており、
前記光透過基体の第2面側に対向しているレンズを更に有する請求項10に記載の検出装置。 - 前記被験物質由来の重合物質への前記光の照射開始時以降の所定の時から、前記記録媒体に記録されている信号波形が極値を示すまでにかかる時間を特定する計算手段をさらに有することを特徴とする請求項10または11に記載の検出装置。
- 前記光透過基体の第1面側に、前記被検物質由来の重合物質、および前記被験物質由来の重合物質に対する特異的な相互作用を有する物質よりなるX群物質の少なくとも一種が存在するX群物質存在領域と、前記X群物質が存在しないX群物質非存在領域とを有する請求項10〜12のいずれかに記載の検出装置。
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