JPH02259568A - 光重合による免疫検定および核酸検定用の組成物およびその方法 - Google Patents

光重合による免疫検定および核酸検定用の組成物およびその方法

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JPH02259568A
JPH02259568A JP2036017A JP3601790A JPH02259568A JP H02259568 A JPH02259568 A JP H02259568A JP 2036017 A JP2036017 A JP 2036017A JP 3601790 A JP3601790 A JP 3601790A JP H02259568 A JPH02259568 A JP H02259568A
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photosensitizer
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addition polymerization
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Gerald Oster
ジェラルド・オスター
Baruch J Davis
バルーク・ジェイ・デイビス
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物活性を有する被験物質を検出および定量
するための診断試験用組成物と、生物活性を有する被験
物質を検出および定量するための方法とにおける付加重
合、例えばビニル重合の利用に関する。
［従来の技術］ 生物活性を有する痕跡量の、例えば臨床的実験医学にお
いて扱われるような被験物質に対する最近の診断試験に
は、免疫反応（すなわち抗原抗体反応）がしばしば用い
らている。
核酸分析のための、核酸とハイブリッドを形成するプロ
ーブを用いる類似の手法も、いまや臨床検査室および研
究室の取扱い範囲に含まれるに至っている。
このような高度に特異的な反応は、成分の１つに「ラベ
ル」あるいは「タグ」とよばれる標識を結合させること
によって、これを検出することができるが、これには、
そのような信号を発することができる発色団、螢光剤、
放射性物質、化学発光剤、あるいは酵素のいずれかが用
いられる。発色団による標識を痕跡被験物質の検出に用
いることは、その感度が低いことから、歴史的および学
術的興味の対象であるに過ぎない。比色検出法は、１ｍ
！あたりＩＯ１〜１０”を下回る数の被験物質分子は検
出できないのに対して、放射性同位元素検出法は、１ｍ
ｌあたりＩＯ１〜ｌｏ７という範囲の被験物質分子の検
出感度に迫ることができる。　　゛ 相対的比活性を特徴とする螢光剤、化学発光剤、および
酵素による方法は、放射性同位元素による方法よりも、
少なくとも２等級またはそれ以上更に感度を上げること
ができる。しかしながら、これらの数字は、あくまでも
目標値であって達成値ではない。これらの方法が洗練さ
れるにつれて、感度の向上が絶えず報告されているが、
飛躍的な向上は期待されていない。
本発明以前には、外来の非触媒性物質をビニル重合の触
媒成分と結び付けて考えることは誰にもなされていない
。外来性の物質が、問題の標的被験物質に対して高度に
特異的なリガンドである場合には、検出可能なポリマー
の生成を被験物質の存在およびその部位の指標とするこ
とができる。このような結合は、独自な検出系の基盤と
なり得る。本発明は、これを生物学的関心の対象となる
被験物質に適用した場合の医学および農学分野における
有用な診断手法を提供するものである。
［発明が解決しようとする課ＩＩ］ 本発明は、下記の形態の被験物質の検出および定量を意
図してなされた。
１、付加重合、例えばビニル重合によるポリマーの生成
のための光触媒としての特性を有する被験物質。
２、上記のような特性を有してはいないが、そのような
光触媒系の１またはそれ以上の部分と結合することがで
きる特異的リガンドと安定な複合体を形成する被験物質
。
このような被験物質としては特に、免疫反応性物質およ
び核酸がある。
したがって、本発明の目的は、生物活性を有する被験物
質の検出および定量のための、経済的かつ適用が容易な
高感度の方法を提供することである。
更に、本発明は、上記の被験物質の検出および定量のた
めの、短時間で結果が得られる方法を提供することも目
的としている。
［課題を解決するための手段］ 上記およびその他の目的、その意図、および利点は、本
発明によって充足される。
本発明は、生物活性を有する被験物質を検出するための
診断試験用組成物であって、（ａ）付加重合が可能なモ
ノマーを、光に被曝した際に付加重合によってポリマー
に転化することができ、（イ）被験物質がその少なくと
も１化学的部分を含み、または少なくとも前記１化学的
部分を生成させ、あるいは（ロ）光触媒特性を欠く場合
の被験物質が特異的リガンドによって少なくともその１
化学的部分に結合され、または特異的リガンドによって
少なくともその１化学的部分の生成原に結合される、１
またはそれ以上の前記化学的部分を含む光触媒が構成す
る光触媒系と、 （ｂ）付加重合が可能な少なくとも１種類のモノマーと
、 からなる組成物に関する。
本発明は更に、前記特異的リガンドが、抗体。
抗体の抗原結合セグメント、抗原、およびハプテンから
なる１群から選択され、前記特異的リガンドが抗体また
は抗体の抗原結合セグメントである場合は、被験物質は
抗原またはハプテンであり、前記特異的リガンドが抗原
またはハプテンである場合は、被験物質は抗体または抗
体の抗原結合セグメントである免疫検定の診断試験用組
成物にも関する。
本発明は更に、前記特異的リガンドが、既知の配列を、
含有するハイブリッド形成可能な核酸プローブであって
、前記配列が１本鎖であり、かつ核酸被験物質の１本鎖
セグメントに相補的である、核酸検定の診断試験用組成
物にも関する。
本発明は更に、光増感剤、あるいは光増感剤を生成させ
る酵素である被験物質の検出方法であって、 （ａ）（イ）付加重合が可能なモノマーを光に被曝した
際に電子供与体の存在下で付加重合によってポリマーに
転化できる光増感剤である被験物質、あるいは（ロ）前
記光増感剤をその前駆体から生成させる酵素である被験
物質、（ハ）電子供与体、および（ニ）前記酵素が用い
られる場合は前記光増感剤の前駆体を、（ホ）付加重合
が可能な少なくとも１種類のモノマーと混合する段階と
、 （ｂ）（、）の段階の結果的な混合物を光に被曝させる
段階と、 （ｃ）被験物質の存在または量の指標としての付加重合
の重合度を測定する段階と、からなる検出方法をも志向
する。
本発明は更に、電子供与体、あるいは電子供与体を生成
させる酵素である被験物質の検出方法であって、 （ａ）（イ）付加重合が可能なモノマーを付加重合によ
ってポリマーに転化できる光増感剤を光によって励起さ
れた状態で還元できる電子供与体である被験物質、ある
いは（ロ）前記電子供与体をその前駆体から生成させる
酵素である被験物質、（ハ）光増感剤、および（ニ）前
記酵素が用いられる場合は電子供与体の前駆体を、（ホ
）付加重合が可能な少なくとも１種類のモノマーと混合
する段階と、 （ｂ）（ａ）の段階の結果的な混合物を光に被曝させる
段階と、 （ｃ）被験物質の存在または量の指標とじての付加重合
の重合度を測定する段階と、からなる検出方法をも志向
する。
本発明は更に、抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメン
トの検出方法であって、 （ａ）抗原またはハプテンを（イ）付加重合が可能なモ
ノマー１例えばビニルモノマーまたはビニリデンモノマ
ーを光に被曝した際にポリマー、例えばビニルポリマー
に転化できる光増感剤と、あるいは（ロ）前記光増感剤
をその前駆体から生成させる酵素と結合させる段階と、
（ｂ）結合した抗原またはハプテンを付加重合が可能な
少なくとも１種類のモノマーとともに電子供与体の存在
下で、および、前記酵素が用いられる場合は前記光増感
剤の前駆体の存在下で、相補的な抗体、あるいは抗体の
抗原結合セグメントに接触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的１こ得られる物質を光に
被曝させる段階と、 （ｄ）抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメントの存在
または量の指標としての付加重合の重合度を測定する段
階と、 からなる検出方法をも志向する。
本発明は更にまた、抗原、あるいはハプテンの検出方法
であって、 （ａ）抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメントを（イ
）付加重合が可能なモノマー、例えばビニルモノマーま
たはビニリデンモノマーを光に被曝した際に電子供与体
の存在下でポリマ、例えばとニルポリマーに転化できる
光増感剤と、あるいは（ロ）前記光増感剤をその前駆体
から生成させる酵素と結合させる段階と、（ｂ）結合し
た抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメントを付加重合
が可能な少なくとも１種類のモノマーとともに電子供与
体の存在下で。
および、前記酵素が用いられる場合は前記光増感剤の前
駆体の存在下で、相補的な抗原またはハプテンに接触さ
せる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得られる物質を光に被
曝させる段階と。
（ｄ）抗原またはハプテンの存在または量の指標として
の付加重合の重合度を測定する段階と、 からなる検出方法をも志向する。
本発明は更に、抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメン
トの検出方法であって、 （ａ）抗原またはハプテンを（イ）付加重合が可能なモ
ノマー、例えばビニルモノマーまたはビニリデンモノマ
ーを光に被曝した際にポリマー、例えばビニルポリマー
に転化できる光増感剤を光によって励起された状態で還
元できる電子供与体と、あるいは（ロ）前記電子供与体
をその前駆体から生成させる酵素と結合させる段階と、 （ｂ）結合した抗原またはハプテンを、付加重合が可能
な少なくとも１種類のモノマーとともに光増感剤の存在
下で、および、前記酵素が用いられる場合は、前記電子
供与体の前駆体の存在下で、相補的な抗体、あるいは抗
体の抗原結合セグメントに接触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得られる物質を光に被
曝させる段階と、 （ｄ）抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメントの存在
または量の指標としての付加重合の重合度を測定する段
階と、 からなる検出方法をも志向する。
本発明は更にまた、抗原またはハプテンの検出方法であ
って、 （ａ）抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメントを（イ
）付加重合が可能なモノマー、例えばビニルモノマ゛−
またはビニリデンモノマーを光に被曝した際にポリマー
、例えばとニルポリマーに転化できる光増感剤を光によ
って励起された状態で還元できる電子供与体と、あるい
は（ロ）前記電子供与体をその前駆体から生成させる酵
素と結合させる段階と、 （ｂ）結合した抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメン
トを付加重合が可能な少なくとも１種類のモノマーとと
もに光増感剤の存在下で、および、前記酵素が用いられ
る場合は前記電子供与体の前駆体の存在下で、相補的な
抗原またはハプテンに接触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得られる物質を光に被
曝させる段階と、 （ｄ）抗原またはハプテンの存在または量の指標として
の付加重合の重合度を測定する段階と、 からなる検出方法をも志向する。
本発明は更に、核酸の検出方法であって、（ａ）１本鎖
であり、かつ被験核酸の１本鎖セグメントに相補的であ
る既知の配列が含まれるハイブリッド形成可能な核酸プ
ローブを（イ）付加重合が可能なモノマー、例えばビニ
ルモノマーまたはビニリデンモノマーを光に被曝した際
にポリマー、例えばビニルポリマーに転化できる光増感
剤と、あるいは（ロ）前記光増感剤をその前駆体から生
成させる酵素と結合させる段階と、 （ｂ）結合した核酸プローブを付加重合が可能な少なく
とも１種類のモノマーとともに、電子供与体の存在下で
、および、前記酵素が用いられる場合は前記光増感剤の
前駆体の存在下で、被験核酸に接触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得られる物質を光に被
曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標としての付加重合
の重合度を測定する段階と、からなる検出方法をも志向
する。
本発明は更にまた、核酸の検出方法であって、（ａ）１
本鎖であり、かつ被験核酸の１本鎖セグメントに相補的
である既知の配列が含まれるハイブリッド形成可能な核
酸プローブを（イ）付加重合が可能なモノマー１例えば
ビニルモノマーまたはビニリデンモノマーを光に被曝し
た際にポリマー、例えばとニルポリマーに転化できる光
増感剤を光によって励起された状態で還元できる電子供
与体と、あるいは（ロ）前記電子供与体をその前駆体か
ら生成させる酵素と結合させる段階と、 （ｂ）結合した核酸プローブを付加重合が可能な少なく
とも１種類のモノマーとともに、光増感剤の存在下で、
および、前記酵素が用いられる場合は前記光増感剤の前
駆体の存在下で、被験核酸に接触させる段階と、 （Ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得られる物質を光に被
曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標としての付加重合
の重合度を測定する段階と、からなる検出方法をも志向
する。
本発明はまた、核酸である被験物質の検出方法であって
、 （ａ）１本鎖であり、かつ被験核酸の１本鎖セグメント
に相補的である既知の配列が含まれるハイブリッド形成
可能な核酸プローブを前記被験核酸に接触させる段階と
、 （ｂ）前記プローブを付加重合が可能な少なくとも１種
類のモノマーとともに、（イ）付加重合が可能なモノマ
ー′、例えばビニルモノマーまたはビニリデンモノマー
を光に被曝した際にポリマー、例えばビニルポリマーに
転化できる光増感剤と、あるいは（ロ）前記光増感剤を
その前駆体から生成させる酵素と、電子供与体の存在下
で、および、前記酵素が用いられる場合は前記光増感剤
の前駆体の存在下で結合させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得られる物質を光に被
曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標としての付加重合
の重合度を測定する段階と、からなる検出方法をも志向
する。
本発明はまた、核酸である被験物質の検出方法であって
、 （ａ）１本鎖であり、かつ被験核酸の１本鎖セグメント
に相補的である既知の配列が含まれるハイブリッド形成
可能な核酸プローブを前記被験核酸に接触させる段階と
、 （ｂ）前記プローブを付加重合が可能な少なくとも１種
類のモノマーとともに、（イ）付加重合が可能なモノマ
ー１例えばビニルモノマーまたはビニリデンモノマーを
光に被曝した際にポリマー、例えばとニルポリマーに転
化できる光増感剤を光によって励起された状態で還元で
きる電子供与体と、あるいは（ロ）前記電子供与体をそ
の前駆体から生成させる酵素と、光増感剤の存在下で、
および、前記酵素が用いられる場合は前記電子供与体の
前駆体の存在下で結合させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得られる物質を光に被
曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標としての付加重合
の重合度を測定する段階と、からなる検出方法をも志向
する。
上記のように、既に充分確立された方法の洗練に従来払
われてきた努力とは対照的に、本発明は、（ビニル）付
加重合の触媒的および連鎖反応的性格に固有の要因を更
に増幅するものである。下記の理由から、その可能な感
度は極めて高い。
（１）光増感剤を不可逆的な光酸化から保護する電子供
与体供給源の存在下で、ビニル重合のための光触媒系の
光増感剤を無限に再循環させることができる。連鎖的重
合反応を開始させることが可能な遊離基が、各光還元サ
イクルの都度創出される。
（２）酵素で標識した被験物質によって、光増感剤また
は電子供与体を生成させることができる。セイヨウワサ
ビのペルオキシダーゼは、そのような酵素の一例である
。
（３）ただ１個の遊離基の分子によって、１０５〜１０
＠のモノマー分子単位で構成されるポリマー分子鎖の形
成を開始させることができる。わずか２〜４個の遊離基
分子の生成物が、光飲乱を利用した条件下では肉眼でも
視認できる粒子となり得る。
逐次的に濃度を下げたチオニン色素溶液ｔｐｔの試料を
、それぞれ直径が約２１１１１１となるように顕微鏡用
スライドグラスに滴下、乾燥するという簡単な操作によ
って、本発明の感度の大まかな指標が得られる。次いで
、スライドをアクリル酸バリウムおよび電子供与体の水
溶液に浸し、窒素ガスを数分間通気して酸素濃度を下げ
、スライドおよびその容器を、フィルタを取り付けた２
５０ワツト白熱電灯で５ｃｒｏの距離から２〜３分間照
射する。この時間の経過時点で、約１０＠〜１０７の色
素分子が含まれる部位に、直径２ｍｍの白色不透明な円
盤状のポリアクリル酸バリウムを大まかながら認めるこ
とができる。
本発明は、実質的にすべての免疫検定手法および核酸ハ
イブリッド形成手法に適用可能であり、これによって、
そのような手法は、前記慣用の手法よりもはるかに高感
度かつ簡便なものとなる。本発明は、広く確立されたペ
ルオキシダーゼ検定法など、酵素と結び付いた検定法に
直ちに適用することができる。本発明によれば、代謝回
転率が高いことで知られる（酵素１分子あたり１分間に
５００万の過酸化水素分子が転化される）、セイヨウワ
サビペルオキシダーゼは、光増感剤の生成を介して付加
重合、例えばビニル重合を触媒できるようになる。
本発明は、生物学的関心の対象となる、１種類またはそ
れ以上の試験すべき物質を含有する化学的組成物を用い
た診断試験に関する。この組成物は、被験物質の存在下
で付加重合、例えばビニル重合を行なって、定量可能量
のポリマーを生じる。具体的には、この組成物には、（
ａ）モノマーをポリマーに転化するよう設定された光触
媒系、および（ｂ）遊離基の存在下で付加重合が可能な
１種類またはそれ以上のモノマー１例えばビニルモノマ
ーまたはビニリデンモノマーが含まれる。
光触媒系は、光増感剤１種類、あるいはそのような光増
感剤を生成させる酵素１種類と、１種類またはそれ以上
の電子供与体、あるいは電子供与体を生成させる酵素１
種類とからなる。
光触媒系の１またはそれ以上の化学的部分には、被験物
質に対する特異的リガンド１種類が結合させられる。こ
のリガンドは、標的となる被験物質に接触する複合体の
一部であって、これに特異性を与え、かつ、被験物質を
光触媒、あるいはそのような部分の生成原と結合させる
架橋を形成するのである。
試験すべき物質（被験物質）は、下記の２群からなる： （ａ）被験物質は、光増感剤、または光増感剤を生成さ
せる酵素、あるいは、電子供与体、または電子供与体を
生成させる酵素である。
（ｂ）被験物質は、光触媒特性には欠けるが、光増感剤
部分、またはそのような部分の生成原（酵素）と、ある
いは、電子供与体、またはそのような部分の生成原（酵
素）と結合できる特異的リガンドと、安定な複合体を形
成することができる。
光触媒系としての特性を有し、あるいはそのような部分
を生成させることが可能な群に含まれる物質は、その種
類は比較的少ないが、強い生物学的関心の対象となって
いる。リボフラビン、ポルフィリン、還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）　、および還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドニ燐酸（ＮＡ
ＤＰ）は光増感剤である。後２者は、電子供与体として
も作用できる。加水分解酵素、例えばエステラーゼは、
例えばクマリンおよびフルオレセイン誘導体のエステル
から光増感剤を生成させることができる。ＮＡＤおよび
ＮＡＤＰ酸化還元酵素なる酵素は、それぞれ還元型のＮ
ＡＤおよびＮＡＤＰを生成させることができる。
被験物質の第２の群、すなわち、光触媒特性には欠ける
が、その特異的リガンドと安定な複合体を形成できるも
のは、２つの大きな下位群、すなわち、免疫反応性被験
物質および核酸被験物質と、より少さな下位群、例えば
レクチン類、情報伝達物質、特異的細胞表面受容体、遺
伝子調節蛍白質、ハプトグロビン類等々とからなる非常
に成員の多い群である。
免疫検定法の場合、特異的リガンドとその標的被験物質
とは、結合してすべての免疫検定法の手順に共通の免疫
複合体を形成する基本要素であって、免疫グロブリン抗
体、相補的部位を有する抗体セグメント、抗原、および
ハプテンがこれに包含される。これも明白な通り、複合
体のいずれの基本要素も、他方を被験物質としてその検
出のための特異的リガンドとして作用することができる
。
ハイブリッド形成が可能なプローブを用いる核酸検定法
の場合は、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）　、リポー
ス核酸（ＲＮＡ）　、あるいは核酸のポリヌクレオチド
部分であって、そのハイブト７ド形成のための相補的部
分が１本鎖の状態にあるものが被験物質となる。
わずかな例外を除けば、免疫反応性物質および核酸の検
定用の特異的リガンドには光触媒特性がないことから、
標的被験物質との特異的複合体形成の前後のいずれかに
おいて、リガンドを光触媒系の１部分、あるいは１部分
の生成原と結合させなければならない。結合および中間
的結合分子の形態は、従来の技術において広く公知であ
り、免疫検定法および核酸検定法の双方に適用可能であ
る。例えば、ある薬剤に免疫原性を持たせることができ
たならば、それが誘起する抗体は、所要の結合を作らせ
る特異的リガンドとして作用する。すなわち、光増感剤
または光増感剤の生成原（酵素）、あるいは、電子供与
体または電子供与体の生成原（酵素）を抗体と結合させ
ることによって、薬剤に特異的に結合して、ポリマー形
成を開始させる試薬が形成されることになる。免疫診断
用検定、および核酸検定の手法に現在用いられているよ
うな中間的結合の組合わせの多くは、本発明にも同等に
適用可能である。したがって、ペルオキシダーゼなる酵
素をアビジンと、および、抗体の抗原または核酸プロー
ブをビオチンと結合させることができ、その結果、この
結合系に限っては、この酵素が光増感剤であり、抗体お
よび核酸がそれぞれ被験物質となる。この際、酵素は、
ビオチン−アビジン複合体によって抗体、あるいは核酸
と結合させられるが、この複合体は、形成されてしまえ
ば基本的に非解離性である。
これに代えて、例えば抗体を用いてのアビジンとの、抗
体を用いてのビオチンとの、あるいは、プロティンＡを
用いての、というような結合をこの両横定法に利用する
こともできる。
多数の光触媒部分を天然または合成ポリマーと結合させ
、次いで、後者を特異的リガンドと結合させれば、更に
感度を上げることができる。
触媒部分を担う分子がそのようなポリマー、あるいは酵
素である場合は、それが巨大であるためにリガンドによ
る被験物質との複合体形成が妨げられることがある。こ
の問題は、初めにリガンドと被験物質との複合体形成を
行い、次いでリガンドを光触媒の要素と結合させること
によって回避することができる。
本発明において重合を生起させる際は、このようにして
被験物質の部位にポリマーを形成させる。−殻内には、
生物試料においては常に、光触媒部分は（共有結合ある
いはその他を用いて）結合されているので、本発明によ
って、ポリマーはその部位に形成される。
更に、本発明は、顕微鏡レベルで適用することが可能で
あり、（例えば組織切片、個々の細胞、および微生物と
いう）組織化学的および細胞化学的レベルでの被験物質
の検出および定位が可能となる。
本発明においては、付加重合を開始させるには、遊離基
の作用機序を用いて触媒系を作動させるのが好適である
。触媒系の作用には光が必要である。光の照射によって
、電子供与体を用いて光で励起された部分（光増感剤）
を還元可能にするためのエネルギーが供給される。
光増感剤なる用語は、適当な電子供与体の存在下で、か
つ光の作用下で、付加重合１例えばビニル重合を開始さ
せることが可能な遊離基を生成させる物質を意味する。
本発明においては、電子供与体とは、電子を与える、す
なわち、光で励起された光増感剤を還元する物質として
定義される。しかしながら、光の不在下では、電子供与
体は、光増感剤を還元することができない。
電子供与体は、付加重合、例えばビニル重合のための開
始物質、すなわち遊離基を生成するために存在しなけれ
ばならない。本発明においては、光増感剤は、電子供与
体の存在下で再循環され、かくして、付加重合、例えば
ビニル重合の開始が効率的に行われる。光増感剤がこの
ように継続的に再循環されるために、重合には痕跡量が
必要なだけである。反対に、被験物質が適当な電子供与
体（すなわち、その酸化状態が可逆的なもの）に結合さ
れ、あるいはそのような供与体の生成原に結合されてい
る場合は、電子供与体が継続的に再循環され、重合には
痕跡量のみ必要となる。
これに代えて、付加重合にイオンの作用機序を用いた触
媒系も、本発明では適用可能である。
本発明においては、遊離基によるモノマーの光重合のた
めの光増感剤には、下記の群が含まれる： フラビン、クマリン、キサンチン、アクリジン、および
フェノチアジン。　酵素によって光増感剤に転化される
前駆体には、前記光増感剤の下記の誘導体が含まれる； 酢酸塩、高級エステル、燐酸塩、ペプチド、硫酸塩、グ
ルクロン酸塩、ガラクトシド、およびジヒドロ誘導体。
本発明に用いるためのクマリンの非制約的な例には、ア
ミノクマリン、およびヒドロキシクマリンが含まれ、そ
の具体的な例は下記の通りであるニ ツーアミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−ト
ノフルオロメチルクマリン、および、７−ヒドロキシ−
４−メチルクマリンおよび７−ヒドロキシクマリン。
本発明に用いるためのアクリジンの非制約的な例には、
モノ＝およびジ：アミノアクリジンが含まれ、例えば下
記のものがそれであるニアクリジンイエロー、コリホス
フィンＯ、アクリフラビン、ニーフラビン、プロフラビ
ン、ホスフィン、およびレオニンへ〇 本発明に用いるためのキサンチンの非制約的な例には、
フルオレセイン、およびフルオレセイン誘導体が含まれ
、例えば下記のものがそれである： フルオレセイン、エオシン、ジクロロフルオレセイン、
ローズベンガル、およびジブロモエオシン。キサンチン
としては他に、ピロニアおよびローダミンに属するもの
がある。
本発明に用いるためのフェノチアジンの非制約的な例に
は、モノアミノ＝およびジアミノ：フェノチアジンが含
まれ、例えば下記のものがそれである： チオニン、アズールＣ１アズールＡ、　　ｌ−ルイジン
ブルーＯ、メチレンブルー、メチレングリーン、オヨび
ニューメチレンブルー。
本発明に用いられる光増感剤の生成原（酵素）の非制約
的な例には、ペルオキシダーゼ、加水分解酵素、および
酸化酵素などの酵素が含まれる。
本発明に用いられるペルオキシダーゼなる酵素の非制約
的な例には、下記のものが含まれる：セイヨウワサビベ
ルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペル
オキシダーゼ、唾液腺ペルオキシダーゼ、腸ペルオキシ
ダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、およびミクロペルオ
キシダーゼ。
ペルオキシダーゼは、非制約的な例として、還元型キサ
ンチン、および還元型フェノチアジンの群から選択され
る光増感剤を生成させることができる。
還元型キサンチンは、下記の群、すなわちフルオレセイ
ン、およびそのハロゲン化された誘導体からこれを選択
することができ、その非制約的な例としては、ジクロロ
フルオレセイン、およびジヒドロエオシンがある。
過酸化水素を生成させる酸化酵素は、その作用によって
、前駆体から光増感剤をペルオキシダーゼを用いて生成
させるための酸化体をもたらす。本発明に用いるための
そのような酸化酵素の非制約的な例としては、下記のも
のがある：アルコール酸化酵素、アスコルビン酸酸化酵
素、コリン酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、グルコー
ス酸化酵素、シュウ酸酸化酵素、ピルビン酸酸化酵素、
およびキサンチン酸化酵素。
加水分解酵素は、非制約的な例として下記の群からこれ
を選択することができる： エステラーゼ、リパーゼ、スルファターゼ、グルクロニ
ダーゼ、ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、あるいは
ペプチダーゼ。
エステラーゼ、およびリパーゼは、フルオレセイン、お
よびそのハロゲン化誘導体、例えばジクロロフルオレセ
インのエステル、および、７−ヒドロキシクマリンの酢
酸塩がら選択される光増感剤を生成させることができる
。
ホスファターゼは、フルオレセインの二燐酸塩およびそ
のハロゲン化誘導体、例えばジクロロフルオレセインニ
燐酸、および、７−ヒドロキシクマリンの燐酸塩がら選
択される光増感剤を生成させることができる。
ペプチダーゼは、チオニアおよびチオニア誘導体のペプ
チドから光増感剤を生成させることができる。
被験物質が光増感剤、あるいは光増感剤の生成原に結合
されている場合の、最も効果的な電子供与体の非制約的
な例としては下記のものがあるニ トリエタノールアミン、ＢＩＳＴＲＩＳ　［ヒス（２ヒ
ドロキシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）
メタン］、Ｎ−フェニルグリシン、ＢＥＳ［Ｎ、Ｎ−ビ
ス（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノエタンスルホ
ン酸］　、Ｂ［ＣｆＮＥ　［Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）−グリシンコ、　ＴＲＩＣＩＮＥ　［Ｎ−
）Ｊス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、）ＩＥ
ＰＥＳ　［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸］、ＴＡＰＳ［トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸］、ＰＩ
ＰＥＳ　Ｃピペラジン−Ｎ、　Ｎ’−ビス（２−エタン
）スルホン酸］　、　ＭＯＰＳ　［３−（Ｎ−モルホリ
ン）プロパンスルホン酸］　、　ＭＯＰＳＯ［３−（Ｎ
−モルホリン）−２−ヒトロキシブロバンスルホン酸］
　、ＡＤＡ　［Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミ、
ノニ酢酸］　、　ＡＭＰＳＯ［Ｎ−（１，１−ジメチル
−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキ
シプロパンスルホン酸］　、　ＤＩＰＳＯ［Ｎ、Ｎ−ビ
ス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロ
キシプロパンスルホンｅ］　、　ＥＰＰＳ　［Ｎ−（２
−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎｏ−３−プロパン
スルホン酸］　、ＨＥＰＰＳＯ［４−（２−ヒドロキシ
エチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンス
ルホン酸）１．２−モルホリンエタノール、ＰＯＰＳＯ
［ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパン
スルホン酸）　］　、ＭＥＳ　［２−モルホリノエタン
スルホン酸］。
これに含まれるものとしては更に、ＥＤＴＡ　［エチレ
ンジアミン四酢酸］　、ＴＥＭＥＤ　［テトラメチルエ
チレンジアミン］、トリエチレンテトラアミン、アセチ
ルアセトン、５．５−ジメチル−１−３シクロヘキサン
ジオン、ジヒドロキシフマール酸、バラトルエンスルフ
ィン酸、ジチオエリトリトール、システィン、還元型グ
ルタチオン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
ＮＡＤ　）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド燐酸（ＮＡＤＰ）がある。また、本発明の電子供与
体として効果的なものに、低い方の原子価での遷移金属
、例えば、コバルト（ＩＩ）、マンガン（１１）、銅（
１）、セリウム（ＩＩり、ニッケル（ＩＩ）、モリブデ
ン（ＩＩ）、および鉄（１りの塩もある。
本発明の電子供与体の生成原としては、下記の酸化還元
酵素がある： ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化還元酵素、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸酸化還元酵
素、シトクロム酸化還元酵素、およびフェレドキシン酸
化還元酵素。
２種類またはそれ以上の電子供与体の併用は、単一の電
子供与体よりも効果的であることが知られている。最も
効果的なのは、第三アミン、β−ジケトン、および遷移
金属の塩からなる組合わせである。
リガンド−被験物質が、光触媒系の電子供与体部分と結
合している場合は、光増感剤は、上記の群から選択され
る。しかしながら、電子供与体の数および種類は、リガ
ンド−被験物質が光増感剤と結合している場合よりも限
定されるが、それは、検出感度が充分であるためには、
電子供与体の再循環が必要だからである（他の場合には
有用な電子供与体が、光触媒の際には不可逆的に酸化さ
れるからである）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ）　、およびニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド燐酸（ＮＡＤＰ）は双方とも、酸化状態の間
を循環させることができ、双方とも、光で励起された光
増感剤の光還元のための電子供与体として機能すること
ができる。キャリコー（Ｒ，Ｊ、　Ｃａｒｒｉｃｏ）は
、その論文［「酵素による補因子の循環を用いた免疫検
定法（Ｉｍｃ＋ｕｎｏａｓｓａｙｓｌ　Ｕｓｉｎｇ　Ｅ
ｎｚｙｍｉｃＣｙｃｌｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｏｆａｃｔｏｒ
）　Ｊ　　：ボグスラスキー（Ｒ。
Ｃ，Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ）　、マッギオー（Ｅ、　Ｔ
、　Ｍａｇｇｉｏ）、およびナカムラ（Ｒ，Ｍ、　Ｎａ
ｋａｍｕｒａ）編、「臨床免疫化学：方法の原理および
応用（Ｃｌｉｎｉｃａｌｆｍｕｎｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒ
ｙ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　Ｊ　　（１９８４
年）９９−１１４ページ、ボストンおよびトロント所在
、リトルブラウン社発行］で、還元されたテトラゾリウ
ム誘導体を生成物とする同質免疫検定法における、再循
環可能なハプテン結合ＮＡＤＨ（ＮＡＤの還元型）につ
いて報告している。本発明に用いられる循環可能な好適
な電子供与体には、（非制約的例示）ＮＡＤ、　ＮＡＤ
Ｐ、リボフラビン、フラビンアデニンジヌクレオチド（
ＦＡＤ）　、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）　、
フェリシトクロム、フェレドキシン、スルフヒドリル化
合物、メチルビオロゲンおよびその誘導体が含まれる。
リガンド−被験物質が電子供与体の生成原と結合してい
る場合は、上記の光増感剤のうちの１種類を用いること
ができる。電子供与体の生成原は、ｒ酸化還元＃素」な
る１群中の酵素に見出され、下記の下位群を構成する：
　　ＮＡＤ酸化還元酵素１．ＮＡＤＰ酸化還元酵素、フ
ェリシトクロム酸化還元酵素、およびフェレドキシン酸
化還元酵素（命名法にこだわるならば、これらは「脱水
素酵素」および「還元酵素」として特定される）。中で
も、グルコース−６−燐酸脱水素酵素、アルコール脱水
素酵素、乳酸脱水素酵素、およびグルコース脱水素酵素
は、比較的良く知られている。
とニルモノマーの付加重合は連鎖反応であって、ただ１
個の開始物質分子（典型的には遊離基）が数千、あるい
は数百万ものモノマー単位を次々に転化して、高分子量
のポリマー分子を形成させることができる。ビニルポリ
マーの重合過程は、工業界において広汎に実用化されて
いて、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリア
クリロニトリルその他の有用なプラスチックが生産され
ているが、痕跡量の生体物質の指標としては、従来用い
られることがなかった。
反応の感度は別としても、この過程の結果は、直ちに観
察され、容易に定量される。高分子量のポリマーは、そ
の物理的特性が生成因のモノマーのそれと著しく異なる
という事実が特徴的である。したがって、例えば、アク
リルアミドはメタノールに可溶であるが、ポリアクリル
アミドはメタノールに不溶であり、アクリロニトリルは
（７％までは）水溶性であるが、ポリアクリロニトリル
は水に不溶であり、アクリル酸カルシウムは水溶性であ
るが、ポリアクリル酸カルシウムは、高度に架橋結合さ
れたポリマーであって、水中で別な相を形成する等々の
ことが知られている。このように、これらのポリマーは
、適当な溶媒中でモノマーを重合させた場合に、光散乱
性の白色の物体が形成されることによって識別される。
それを沈澱させない溶媒中にあってさえ、多くの高分子
量ポリマーは、それが粘着性であるのにモノマーはそう
ではないという点で生成因のモノマーと異なる。したが
って、ポリマー、例えばポリアクリルアミドやポリメタ
クリル酸の水溶液は、著しく粘稠で、粘着性に富んだ無
色の溶液を形成し、これが多孔性のふるいの目を詰まら
せるのに、モノマーの水溶液は粘性が低いのである。し
たがって、高分子量ポリマーの生成は、たとえ少量とい
えどもこれを直ちに観察し、かつ定量することが可能で
ある。
中でも下記のモノマーは、本発明において単独に、ある
いは併用によって用いることができるニ アクリルアミド、Ｎ−オクチルアクリルアミド、メタク
リルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、アクリル酸、
メタクリル酸、ヒドロキシメチルアクリルアミド、メチ
レンビスアクリルアミド、アクリロニトリル、アクリル
酸メチル（または更に高級なエステル）、メタクリル酸
エチレングリコール、メタクリル酸プロピレングリコー
ル、アクリルアミドプロパンスルホン酸、ビニルピロリ
ドン、ビニルピリジン、および、アクノル酸およびメタ
クリル酸の多価塩、例えばカルシウム、バリウム、スト
ロンチウム、カドミウム、ネオジム、ウラニウム、およ
びユウロピウムとの塩。更にまた、ビニル基と結合し、
かつ付加重合ポリマーを形成することができる、あらか
じめ形成された合成または天然のポリマーを用いること
もできる。
ポリマーの検出を意図とする方法は、モノマーの選択に
よって決定されることになるのが通常である。最も明白
に視認が可能なポリマーは、濃密な架橋が形成されてい
る、すなわち、モノマーが多機能的、例えば二機能的で
あるようなポリマーである。メチレンビスアクリルアミ
ドは、そのようなモノマーの１種である。最も汎用性の
あるモノマーは、アクリル酸の２価金属塩である。本発
明の検出系で非常に感度の高いものの多くは、アクリル
酸カルシウム、あるいはアクリル酸バリウムが用いられ
ている。アクノル酸バリウムは、電子顕微鏡に用いるの
に効果的であると思われる。ポリマーは感光物質の生成
部位に拘束されていることから、解像力が高いだけでな
く、ポリマーの密度が比較的高くて、電子の透過に好都
合でもある。したがって、わずか数オングストロームと
いう非常に薄い試料でも、強いコントラストが得られる
。
更に効果的なのがアクリル酸ウラニウムである。ウラニ
ウム（１１）塩は螢光性があるため、そのポリマーは、
紫外領域近くの光の作用の下で螢光を発する。ポリマー
のモノマー単位のそれぞれが螢光性であることから、螢
光は特に強いのである。−層効果的なモノマーは、アク
リル酸ユウロピウム（１１）である。この場合、ポリア
クリル酸ユウロピウムを更に処理して、波長３６５ｎｍ
の光の照射によって励起されると赤色光（最大６１５ｎ
ｍ）を発する、別のユウロピウムキレートを生じさせる
ことができる。背景の螢光は無視し得ることから、生物
試料においては、赤色螢光を非常に高い精度で測定する
ことができる。
本発明の感度および利便を更に高める補助的手法は、数
多く存在する。例えば、モノマーがアクリルアミドであ
れば、得られるポリマーは、粘着性があり、色素顆粒を
捕捉あるいは搬送して、着色力の強い色を帯びるように
なる。
ポリマーの検出を促進する顆粒形態としては他に、反射
性金属（例えば粉末アルミニウム）、燐光性色素（例え
ばドーピングを施した硫化カドミウム）、あるいは磁気
読取り用の磁性色素がある。更にまた、重合中のポリマ
ーに取り込まれ、あるいはポリマー表面に捕捉された可
溶性または粒状の試薬を、例えば付加重合ポリマーまた
は着色生成物を生成させることができる第２段階のカス
ケードの開始物質として働かせることもできる。
ラテックス粒子の懸濁液の凝集反応は、ビニル重合の非
常に鋭敏な尺度となることができる。
ポリマーは、モノマーとは異なり、ラテックス粒子に粘
着することができ、粒子の凝集を引き起こす。
重合を開始させるための光源の選択は、どのような増感
剤が用いられるかによって決定される。したがって、７
−ヒドロキシクマリンに対しては、紫外領域近くの光を
用いるべきである。
３６５ｒ＋ｎのスペクトルに富むことから、中圧または
高圧の水銀灯を用いるのが典型的である。例えばジクロ
ロフルオレセインがそうであるように、光増感剤が青色
光を吸収する場合は、青色のフィルタを用いてすべての
紫外線を除去し、このようにして、紫外線光増感剤とし
て作用する不純物の存在によって重合が引き起こされる
ような影響を取り除くのが良い。更に良いのは、青く着
色した（および、それ故赤色光を吸収する）色素を光増
感剤として用いることである。
そのような色素としては、フェノチアジンなる１群の色
素に属するもの、例えば、チオニア、およびメチレンブ
ルーがある。この場合は、光源をタングステン灯とする
ことができる。化学発光性溶液さえも光重合の光源に利
用することができる。
写真用閃光灯を光源に用いれば、光化学の段階を１ミリ
秒という時間に短縮することもできる。極度に粘稠な媒
体中では、反応は、発光の終了後においてさえ進行する
。
本発明の光化学段階はまた、問題の光増感剤の吸収スペ
クトルに対応する発光スペクトルのレーザを用いて、こ
れを活性化することもできる。したがって、メチレンブ
ルーに対しては、ヘリウムネオンレーザが有効である。
色素がエオシンであれば、銅レーザの緑色スペクトルが
有効である。２．７−ジクロロフルオレセインなる色素
には、アルゴンレーザの青色スペクトルが必要である。
７−ヒドロキシクマリンに対しては、可視光レーザの量
子的倍化、あるいは赤外線レーザの量子的４倍化によっ
て、有効な紫外線照射を実現することができる。レーザ
線束は、照射光の波長に等しい直径の点に絞り込むこと
ができるため、本発明を用いて、狭い領域にポリマーを
生成させることができる。
本発明を用いた免疫反応、あるいは核酸ハイブリッド形
成は、検出の感度および速度が高いため、与えられた被
験化学種が生起し得る、非常に多数の基質、あるいは相
補的化学種との相互作用を定量するための効率的かつ経
済的な検索が実践可能となる。また、本発明は、遺伝子
組成物の分析に求められるような、莫大な数の配列を含
む物質を自動的、かつ迅速にふるい分ける手段をも提供
する。このような配列としては、免疫現象、あるいは核
酸のハイブリッド形成の分野に出現するような、核酸お
よびその下位単位、あるいは、蛋白質およびその下位単
位の配列があるものと思われる。
光重合においては、酸素もこの反応に参加する。しかし
ながら、当業界において周知の通り、過剰な酸素はビニ
ル重合を抑制する。重合の誘導期間を（したがってまた
、開始の遅延も）短縮するには、瞬間的に系に窒素ガス
を充満させることも一般的に行われ、少なくとも一時的
には、最適条件に近付けることができる。最適濃度の維
持は、最高の性能を助長するはずである。
本発明においては、これは、酸素緩衝剤を用いることに
よって達成される。コバルトのキレート、例えば、グリ
シルダリシン、ヒスチジン、ジエチレンテトラアミン、
トリエチレンテトラアミン、およびビタミンＢ１１ｍは
、アルカリ性の範囲で適当であり［ヤング（Ｎ、　Ｌ、
　Ｙａｎｇ）、およびオスター（Ｇ、　０ｓｔｅｒ）　
　’　フィジカル・ケミストリー（Ｐｈｙｓｉｃａｌ　
Ｃｈｅｍ、）　、第７４巻（１９７０年）８５６ページ
］、酸化酵素、例えば、アルコール酸化酵素、アスコル
ビン酸酸化酵素、アミノ酸酸化酵素、キサンチン酸化酵
素、ガラクトース酸化酵素、グルコース酸化酵素、サル
コシン酸化酵素、ピルビン酸酸化酵素、およびコリン酸
化酵素は、中性のｐＨ範囲で適当である。
［実施例］ 以下の実施例は、本発明の説明として記載されるもので
あって、本発明を制約するためのものではない。
実施例１：酵素によらない免疫検定法 イ、フルオレセインを結合させた抗体を、初めにスライ
ドグラスに滴下、定着させたその抗原と結合させる。未
結合の抗体は洗い流す。１５％のアクリル酸バリウム、
および電子供与体を含有する溶液中に、スライドを浸す
。５０ワツトのタングステン沃素灯を用いて照明すると
、白色のポリマーが抗体部位に生成されるのを視認する
ことができる。
口、フルオレセインを結合させた抗体を、トリイジンブ
ルー０と結合させた抗体と置き換えても、同様の結果が
得られる。
ハ、上記実施例１を、アクリル酸バリウムに代えてアク
リル酸ウラニウムを用いて繰り返すが、用いる抗原の量
を１０００分の１にする。
短時間の光の照射後、肉眼ではポリマーは視認されない
が、鉱物学者用（ウッズ３６５ｎｍ）　を灯を用いて検
査すると、螢光を発するポリマーが抗原部位に認められ
る。抗原処理をしなかった対照部位では、否定的な結果
となる。
抗原をアルブミンで処理した別の対照部位もまた、結果
は否定的である。
上記のすべての例において、照明の前に試料を窒素で処
理した場合は、効果は更に顕著である。
実施例２：酵素によらない免疫検定法 イ、二機能、性結合剤であるゲルタールアルデヒドを用
いて、チオニアをアビジンに結合させる。ビオチニル化
させた抗体を用いて、ポリスチレンの凹みの壁に吸収さ
せたその抗原を検出する。未結合の抗体は洗い流す。次
いで、凹みをチオニア化させたアビジンで処理し、製置
後、未結合のチオニア化アビジンを洗い流す。０．５％
トリエタノールアミンおよび０，５％アセチルアセトン
なる電子供与体の対とともに、１０％アクリルアミド溶
液を凹みに加える。この系を、１２５ミリワツトのへリ
ウムーネオンレーザで照射する。上清液の除去後、カー
ボンブラック懸濁液を用いて凹みを洗浄すると、結合し
た抗原の部位に粘着性のポリマー（これにカーボンブラ
ックの顆粒が粘着している）が認められる。
口、前項の電子供与体の対の代わりに、下記の電子供与
体の対のそれぞれを用いて、同様の実験を繰り返しても
、同様の結果が得られる：１％トリエタノールアミンお
よび０．０５％塩化コバルト　（■１）、 １％トリエタノールアミンおよび０．０５％硫酸マンガ
ン（■１）、 １％トリエタノールアミンおよび０．０５％硫酸鋼（１
１）、 １％トリエタノールアミンおよび０．０５％塩化セリウ
ム（ＩＩ＋　）、 ５％ニトリロトリスプロピオンアミドおよび０．５％ア
セチルアセトン、 ０．５％ＢＩＳＴＲＩＳおよび０．５％アセチルアセト
ン。
ハ、チオニアを前掲の他のフェノチアジンに代えても、
同じ結果が得られる。チオニアーアビジン結合体の代わ
りにチオニアービオチン抗体結合体を用いても、結果は
同じである。これは、免疫検定を行うための代替手段と
なる。
レーザを写真用閃光灯に置き換えても、１回の閃光で同
じ結果が得られる。
上記の例のすべてにおいて、照明の前に試料を窒素で処
理した場合は、効果は更に顕著である。
実施例３：酵素によらない免疫検定法 抗原−抗体反応によって不溶性の複合体が形成される以
下の例では、複合体は、陰イオン性色素、特にローズベ
ンガル（テトラヨードテトラクロロフルオレセイン）の
ような分極率が高いそれらに対する親和性を有するもの
と思われる。ローズベンガルは光増感剤である。
一定量の抗原、および１０〜３モルのローズベンガルを
、一連のガラス製試験管にとる。これに抗体の逐次希釈
液を加える。試験管を一定時間装置し、次いで、遠心分
離を施して免疫反応による生成物を沈澱させ、上清を除
去する。ベレットを３０％アクリルアミド、０．５％ト
リエタノールアミン、および０．５％アセチルアセトン
に再懸濁させ、試料の入った試験管を５０ワツトタング
ステン沃素灯で照射する。短時間の照射後、溶液をメタ
ノールに注入してポリマーを検査し、ポリアクリルアミ
ドの沈澱の量を記録しておく。このポリマーが不溶性の
抗原−抗体複合体形成の指標となる。最大量のポリマー
が存在する試験管はまた、抗原−抗体複合体の結合比率
が最適である試料でもあって、これを用いて被験物質の
力価測定を行う。
実施ＰＡ４：酵素による免疫検定法 イ、ジクロロジアセチルフルオレセイン（ＤＣＤＡＦ）
が、（アルカリ、あるいはエステラーゼなる酵素による
）加水分解、およびそれに続く、過酸化水素の存在下で
のペルオキシダーゼなる酵素を用いての処理後に螢光を
発することは公知である。知られていなかったのは、本
発明におけるような、最終産物であるジクロロフルオレ
セインがビニルポリマーの重合のための光増感剤として
作用できるということである。
ペルオキシダーゼと結合させた抗体を、スライドグラス
に滴下、定着させたその抗原と結合させる。未結合抗体
は洗い流す°。スライドグラスをＤＣＤＡＦノ１０−’
−［：　ル溶液、０．００１％ｘｘテラーゼ、０．０３
％過酸化水素、１５％アクリル酸カルシウム、０．５％
トリエタノールアミン、および０．１％塩化セリウム（
ＩＩ＋　）に浸し、コバルトブルーのガラスフィルタを
取り付けた２５０ワツト中庄水銀灯で照射すると、ポリ
マーの粘着性白色沈澱が抗原部位に形成される。
口、この例では、抗体と結合させたグルコース酸化酵素
、および５％グルコースが、今Ｄｏハ遊離溶液としたペ
ルオキシダーゼに対する過酸化水素の供給源となる。実
施例４のイと同じ結果が得られる。
実施例５：酵素による免疫検定法 イ、抗原と結合させたブタの肝エステラーゼを、スライ
ドグラスに滴下、定着させたその抗原と結合させる。未
結合抗原を洗い流す。スライドグラスをｔｏ−’モルニ
酢酸フルオレセイン、３０％アクリル酸カルシウム、お
よび電子供与体を含有する溶液に浸す。窒素気泡の通気
による脱酸素を行い、次いで、ガラス製紫外線遮断フィ
ルタを取り付けた１５０ワツトキセノン水銀灯で溶液を
照射すると、白色のポリマーが抗原部位に沈殿するのが
視認される。
ロ、窒素を用いた脱酸素の段階を、照射前のモノマー溶
液へのグルコース酸化酵素（０，００１％）、および８
％グルコースの添加、および１０分間の製置に置き換え
ても、同様な結果が得られる。
上記のグルコース酸化酵素を用いた脱酸素段階で、グル
コース酸化酵素−グルコースの系を下記の組合わせのジ
オキシゲナーゼなる酵素およびその基質のいずれかと置
き換える：（ａ）アスコルビン酸酸化酵素−アスコルビ
ン酸、（ｂ）キサンチン酸化酵素−キサンチン、（Ｃ）
アルコール酸化酵素−アルコール、（ｄ）ガラクトース
酸化酵素〜ガラクトース。
抗原と結合させたブタの肝エステラーゼに代えて、抗原
と結合させたアルカリ性ホスファターゼを、また、二酢
酸フルオレセインに代えて、１Ｏ−４モルニ燐酸エオシ
ンを用いても、同じ結果が得られる。
実施例６：酵素による免疫検定法 濃度を順次増加させた抗体溶液をポリスチレンの凹みに
吸着させる。酵素を結合させた抗原を、抗体と一定時間
結合させる。未結合抗原を洗い流して、光増感剤の前駆
体である酵素基質の緩衝溶液と置き換え、一定時間製置
する。各凹みの上清からアリコートを取り、電子供与体
とともにビニルモノマーに加え、光源を用いて被曝させ
る。選定されたモノマー、すなわちアクリル酸カルシウ
ムは、重合して光散乱性のポリマーを生成する。各試験
管の散乱量は、抗体（被験物質）の量に比例する。した
がって、この系は、被験物質定量の尺度となる。この手
順はまた、熱帯諸国において起こり得ることであるが、
簡便に運搬できない不安定な物質の検定をも可能にする
。その理由は、この検定法は、（ａ）その場での光増感
剤の生成、および、（ｂ）別の場所でのポリマーの生成
およびその定量、という２段階に分けられるからである
。
照射前の第２の段階で、窒素を用いた溶液の脱酸素が行
われる。
実施例７：酵素による免疫検定法 この例では、脱水素酵素なる酵素はＮＡＤＰを還元型Ｎ
ＡＤＰに転化するが、後者は光増感剤の電子供与体であ
る。
グルコース−６−燐酸脱水素酵素を抗体と結合させ、結
合体を、あらかじめスライドグラスに滴下、定着させた
抗原と結合させる。未結合結合体を洗い流す。スライド
グラスを、３％メチレンビスアクリルアミド、０．２５
％グルコース−６−燐酸、０．１％ＮＡＤＰ、０．０５
％エオシンを含有する溶液に浸し、琥珀色のガラスフィ
ルタを取り付けたタングステン沃素灯で照射する。白色
沈澱が抗原部位に形成されるのを視認できる。
琥珀色のガラスフィルタは、紫外領域近くの光線を遮断
するのに用いられる。還元型のＮＡＤおよびＮＡＤＰは
、電子供与体であると同時に光増感剤としても作用する
ことができる。これらの試薬は紫外領域近くの光線を吸
収する不純物とともに、紫外領域近くの照射を遮断しな
い限り、偽りの肯定的な結果をもたらす可能性がある。
グルコース−６−燐酸脱水素酵素は、これをＮＡ［）あ
るいはＮＡＤＰを還元できるいかなる脱水素酵素と置き
換えることもできる。
限定量の抗体に対してＮＡＤ−ハプテン結合体と競合す
るハプテンが被験物質となる、キャリコー（Ｃａｒｒｉ
ｃｏ）の方法による同質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　）
検定法のこれは一例である。抗体と複合体を形成しない
ＮＡＤ−ハプテンのみ、２つの酸化状態の間の循環が可
能である。循環は、脱水素酵素を用いて行われる。試料
中の被験物質の濃度は、遊離ＮＡＤ−ハプテンの量に比
例する。
被験物質であるハプテン、ＮＡＤ−ハプテン結合体、お
よび限定量の抗体をガラス試験管内で平衡に達させる。
次いで、乳酸脱水素酵素、乳酸リチウム、およびメチレ
ンブルーなる色素を添加し、琥珀色のガラスフィルタを
取り付けたタングステン灯で試験管を照射する。被験物
質の量に比例する速度で次第に光′散乱が液体中に発生
する。
実施例９：同質酵素免疫検定法 イ、グルコース酸化酵素の補欠分子族であるフラビンア
デニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が、他の化学物質、例
えば抗原と共有結合で結合している場合は、抗原−抗＃
−複合体中の酵素は不活性であるとの知見に基づいて、
モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）は、同質免疫検定法を開発した
［［フラビンアデニンジヌクレオチドを標識として用い
るアポ酵素再活性化免疫検定法（Ａｐｏｅｎｚｙｍｅ　
ＲｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　
　Ｕｓｉｎｇ　　Ｆｌａｖｉｎ　　Ａｄｅｎｉｎｅ　　
Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｓ　Ｌａｂｅｌ）　Ｊ　　
’前出、ホブラスキー、マッギオ、およびナカムラ編「
臨床免疫化学：方法の原理と応用Ｊ　　（１９８４年）
１１５〜１３０ページ、リトルブラウン社発行］。更に
、非生理的条件下で、酵素を補酵素の補欠分子族と、蛍
白質部分あるいはアポ酵素とに分解することができる。
分離された成分は不活性であるが、生理的条件下で混合
すると、両者は再会合して、充分に活性のある完全な酵
素を形成する。被験物質を既知量の被験物質−補欠分子
族結合体と混合し、アポ酵素を加えることによって、検
査が行われる。
ここで少量の抗体を加えた場合、活性酵素の、すなわち
抗体と結合しなかった酵素の量は、添加された被験物質
の量に直接的に比例することになる。
したがって、既知量のＦＡＤと結合した抗原を、被験物
質である未知量の抗原に加える。過剰なグルコース酸化
酵素のアポ酵素を加え、ＦＡＤ結合抗原のＦＡＤと結合
させる。次いで、少量の抗体を加え、ＦＡＤ結合抗原、
および被験抗原と結合させる。抗体との複合体形成（ア
ポ酵素−ＦＡＤ結合抗原−抗体）によって不活化されな
かった完全な酵素（アポ酵素−ＦＡＤ結合抗原）の検出
は、３％メチレンビスアクリルアミド、５％グルコース
、０．００１％セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ｏ、
ｏｏｉ％ブタ肝エスチエステラーゼトリエタノールアミ
ン、０．１％塩化セリウム（Ｉｌｌ　）、および１０−
’モルのジクロロジアセチルフルオレセインの添加によ
ってなされる。この溶液を、コバルトブルーのフィルタ
を取り付けた２５０ワツト中圧水銀灯で照射すると、ポ
リメチレンビスアクリルアミドの形成とともに不透明に
なる。
口、実施例９のイを繰り返すが、グルコース酸化酵素の
アポ酵素、およびグルコースをそれぞれキサンチン酸化
酵素のアポ酵素、およびキサンチンに置き換えても、同
じ結果が観察される。これら両酵素とも、フラビンアデ
ニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）　、あるいはフラビンモ
ノヌクレオチド（ＦｌｉＩＮ）など、フラビン景白質の
酵素として同定される４０以上の酵素からなる群に属す
る。
実施例１Ｏ：酵素による核酸検定法 この例では、実施例４の要領の酵素による検定法を用い
て、特定の核酸配列を検出する。
ビオチン化した核酸プローブを用いて、初めにニトロセ
ルロース紙に移して固定化しておいた、被験物質である
相補的１本鎖ＤＮＡとバイブノット形成を行わせる。ハ
イブリッド形成に続いて、未結合のプローブを洗浄して
除去する。
次いで、ニトロセルロース紙をウシアルブミン溶液に漬
けて、非特異的な吸着を遮断する。次に、アビジンと結
合させたセイヨウワサビペルオキシダーゼを含有する溶
液にニトロセルロース紙を浸す。未結合のペルオキシダ
ーゼ−アビジンを洗い流した後、１０−４モルのＤＣＤ
ＡＦ、０．００１％エステラーゼ、０．０３％過酸化水
素、１５％アクリルアミド、０．５％トリエタノールア
ミン、および０．０５％塩化セリウム（Ｉｌｌ　）を含
有する溶液に、ニトロセルロース紙を浸す。窒素ガス気
泡を溶液に通気する。コバルトガラスフィルタを取り付
けた２５０ワツト中庄水銀灯で照射すると、ハイブリッ
ド形成部位にポリアクリルアミドが沈澱する。ポリマー
を検出するには、ニトロセルロース紙を、試料が含まれ
る面を下側にして、二酸化チタン色素の白色粉末の平坦
がっ滑らかな層と接触させる。次いで、垂直に保ったこ
の紙を、クランプを用いてこれに取り付けた音響振動器
具を用いて振動させる。このような手段によって、紙に
残る色素粒子は、粘着性のポリアクリルアミドの存在部
位のもののみとなり、したがって、ハイブリッド形成に
よるポリアクノルアミドに被われた部位が示される。次
いで、この紙を乾燥させ、液浸法用の油に浸して透明に
する。黒色の紙を背景にして検分すると、白色の二酸化
チタン色素がその部位に認められる。
実施例１１＝酵素によらない核酸プローブイソチオシア
ン酸エオシンを核酸プローブのエチレンジアミン誘導体
と反応させて、エオシン化された核酸プローブを生成さ
せる。このブローフヲ、ニトロセルロース紙に固定化し
ておいた１本鎖の相補的核酸とハイブリッド形成させる
。ハイブリッド形成に続いて、未結合プローブを洗浄、
除去する。
次に、このニトロセルロース紙をウシアルブミン溶液に
漬けて、非特異的な吸着を遮断する。
未結合アルブミンを洗い流した後、１５％アクリルアミ
ド、１％メチレンビスアクリルアミド、０．５％トリエ
タノールアミン、およびセイヨウワサビペルオキシダー
ゼの飽和溶液を含有する溶液に、ニトロセルロース紙を
浸す。窒素ガス気泡を溶液に通気する。コバルトブルー
のガラスフィルタを取り付けた２５０ワツト中庄水銀灯
で照射すると、メチレンビスアクリルアミドで架橋結合
され、かつ捕捉されたペルオキシダーゼを含有するポリ
アクリルアミドが、ハイブリッド形成部位に沈澱する。
反応しなかったモノマー混合液を洗い流し、０．０３％
過酸化水素、および４−クロロナフトールを含有する緩
衝液（ｐＨ６）で置き換える。ポリアクリルアミドのゲ
ルが位置する表面が青く発色する。
本明細書および請求の範囲は、実例を用いて説明されて
いるが、これらに制約されるものではないこと、したが
ってまた、本発明の情神および対象範囲から逸脱するこ
となく、各種の修正および変更を加え得ることが理解さ
れるはずである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）生物活性を有する被験物質の検出および定量のた
    めの診断試験用組成物であっ て、 （ａ）付加重合が可能なモノマーを光 に被曝した際にポリマーに転化すること ができ、（イ）被験物質が少なくともそ の１化学的部分を含み、あるいは少なく とも前記１化学的部分の生成原であり、 あるいは（ロ）光触媒特性を全く欠く場 合の被験物質が特異的リガンドによって 少なくともその１化学的部分の生成原に 結合されている、１またはそれ以上の前 記化学的部分からなる光触媒が構成する 光触媒系と、 （ｂ）付加重合が可能な少なくとも１ 種類のモノマーと、 からなることを特徴とする光重合による 検定用組成物。 （２）被験物質が光触媒の１部分、あるいは光触媒の１
    部分の生成原である請求項 （１）記載の光重合による検定用組成物。 （３）付加重合のための光触媒系が、遊離基による反応
    開始によって作用する請求項 （１）記載の光重合による検定用組成物。 （４）免疫検定の診断試験用組成物であって、特異的リ
    ガンドが、抗体、抗体の抗原結 合セグメント、抗原、およびハプテンか らなる１群から選択され、前記特異的リ ガンドが抗体または抗体の抗原結合セグ メントである場合は被験物質は抗原また はハプテンであり、前記特異的リガンド が抗原またはハプテンである場合は被験 物質は抗体または抗体の抗原結合セグメ ントである請求項（１）記載の光重合に よる検定用組成物。 （５）核酸検定の診断試験用組成物であって、特異的リ
    ガンドが、１本鎖であり、かつ 被験核酸の１本鎖セグメントに相補的で ある既知の配列を含有するハイブリッド 形成可能な核酸プローブである請求項 （１）記載の光重合による検定用組成物。 （６）光触媒系が、光重合のための光増感剤と、前記光
    増感剤が光による励起状態に ある場合にのみ電子を供与できる電子供 与体とからなる請求項（１）記載の光重 合による検定用組成物。 （７）被験物質が、電子供与体である化学的部分と結合
    している請求項（１）記載の 光重合による検定用組成物。 （８）電子供与体が、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
    オチド、ニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド燐酸、シトクロムＣ、 フェレドキシン、リボフラビン、フラビ ンアデニンジヌクレオチド、フラビンモ ノヌクレオチド、メチルビオローゲン、 およびメチルビオローゲン誘導体からな る１群から選択される請求項（７）記載 の光重合による検定用組成物。 （９）生成原が前駆体から電子供与体を生成させる請求
    項（１）記載の光重合による 検定用組成物。 （１０）電子供与体の生成原が酸化還元酵素である請求
    項（９）記載の光重合による検 定用組成物。 （１１）酸化還元酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌ
    クレオチド酸化還元酵素、ニコ チンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸 酸化還元酵素、シトクロム酸化還元酵素、 およびフェレドキシン酸化還元酵素から なる１群から選択される請求項（１０）記 載の光重合による検定用組成物。 （１２）酸化還元酵素が、グルコース−６−燐酸脱水素
    酵素、アルコール脱水素酵素、乳 酸脱水素酵素、およびグルコース脱水素 酵素からなる１群から選択される請求項 （１０）記載の光重合による検定用組成物。 （１３）化学的部分が光増感剤である請求項（１）記載
    の光重合による検定用組成物。 （１４）光増感剤が、フラビン、クマリン、アクリジン
    、キサンテン、およびフェノチ アジンからなる１群から選択される請求 項（１３）記載の光重合による検定用組成 物。 （１５）クマリンが、アミノクマリンおよびヒドロキシ
    クマリンからなる１群から選択 される請求項（１４）記載の光重合による 検定用組成物。 （１６）クマリンが、７−アミノ−４−メチルクマリン
    、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−
    ヒドロキシ−４−メチルクマリン、および７−ヒドロキ
    シクマリンから なる１群から選択される請求項（１４）記 載の光重合による検定用組成物。 （１７）アクリジンが、モノアミノアクリジン、および
    ジアミノアクリジンからなる１群 から選択される請求項（１４）記載の光重 合による検定用組成物。 （１８）アクリジンが、アクリジンイエロー、コリホス
    フィンＯ、アクリフラビン、ユ ーフラビン、プロフラビン、ホスフィン 、およびレオニンＡからなる１群から選 択される請求項（１４）記載の光重合によ る検定用組成物。 （１９）キサンテンが、フルオレセイン、およびフルオ
    レセイン誘導体からなる１群か ら選択される請求項（１４）記載の光重合 による検定用組成物。 （２０）キサンテンが、フルオレセイン、エオシン、ジ
    クロロフルオレセイン、ローズ ベンガル、ジブロモエオシン、ピロニン 類の成員、およびローダミン類の成員か らなる１群から選択される請求項（１４） 記載の光重合による検定用組成物。 （２１）フェノチアジンが、モノアミノフェノチアジン
    、およびジアミノフェノチアジ ンからなる１群から選択される請求項 （１４）記載の光重合による検定用組成物。 （２２）フエノチアジンが、チオニン、アズールＣ、ア
    ズールＡ、トルイジンブルーＯ、 メチレンブルー、ニューメチレンブルー、 およびメチレングリーンからなる１群か ら選択される請求項（１４）記載の光重合 による検定用組成物。 （２３）生成原が前駆体から光増感剤を生成させる請求
    項（１）記載の光重合による検 定用組成物。 （２４）光増感剤の生成原が、ペルオキシダーゼ、酸化
    酵素、および加水分解酵素から なる１群から選択される請求項（２３）記 載の光重合による検定用組成物。 （２５）酸化酵素が過酸化水素を生成させ、これによっ
    てペルオキシダーゼによる光増 感剤生成のための酸化剤をもたらす請求 項（２３）記載の光重合による検定用組成 物。 （２６）酸化酵素が、アルコール酸化酵素、アスコルビ
    ン酸酸化酵素、コリン酸化酵素 、ガラクトース酸化酵素、グルコース酸 化酵素、シュウ酸酸化酵素、ピルビン酸 酸化酵素、およびキサンチン酸化酵素か らなる１群から選択される請求項（２４） 記載の光重合による検定用組成物。 （２７）ペルオキシダーゼが、セイヨウワサビのペルオ
    キシダーゼ、ミエロペルオキシ ダーゼ、甲状腺ベルオキシダーゼ、唾液 線ペルオキシダーゼ、腸ベルオキシダー ゼ、ラクトペルオキシダーゼ、およびミ クロペルオキシダーゼからなる１群から 選択される請求項（２４）記載の光重合に よる検定用組成物。 （２８）セイヨウワサビペルオキシダーゼが、還元型キ
    サンテン、および還元型フェノ チアジンからなる１群から選択される光 増感剤を生成させる請求項（２７）記載の 光重合による検定用組成物。 （２９）還元型キサンテンが、フルオレシン、およびフ
    ルオレシン誘導体からなる１群 から選択される請求項（２８）記載の光重 合による検定用組成物。 （３０）還元型キサンテンが、ジクロロフルオレシン、
    およびジヒドロエオシンからな る１群から選択される請求項（２８）記載 の光重合による検定用組成物。 （３１）加水分解酵素が、エステラーゼ、ホスファター
    ゼ、ペプチダーゼ、スルファタ ーゼ、グルクロニダーゼ、およびガラク トシダーゼからな る１群から選択される請求項（２４）記載 の光重合による検定用組成物。 （３２）エステラーゼが、フルオレセインのエステル、
    フルオレセインのエステルのハ ロゲン化誘導体、および７−ヒドロキシク マリンのエステルからなる１群から選択 される光増感剤を生成させる請求項（３１）記載の光重
    合による検定用組成物。 （３３）ホスファターゼが、フルオレセインの二燐酸塩
    、フルオレセインの二燐酸塩の ハロゲン化誘導体、および７−ヒドロキシ クマリンの燐酸塩からなる１群から選択 される光増感剤を生成させる請求項（３１）記載の光重
    合による検定用組成物。 （３４）スルファターゼが、フルオレセインジスルファ
    ート、フルオレセインジスルフ ァートのハロゲン化誘導体、および７−ヒ ドロキシクマリンの硫酸塩からなる１群 から選択される光増感剤を生成させる請 求項（３１）記載の光重合による検定用組 成物。 （３５）グルクロニダーゼが、フルオレセインジグルク
    ロニド、フルオレセインジグル クロニドのハロゲン化誘導体、および７− ヒドロキシクマリンのグルクロニドから なる１群から選択される光増感剤を生成 させる請求項（３１）記載の光重合による 検定用組成物。 （３６）ガラクトシダーゼが、フルオレセインジガラク
    トシド、フルオレセインジガラ クトシドのハロゲン化誘導体、および７− ヒドロキシクマリンのガラクトシドから なる１群から選択される光増感剤を生成 させる請求項（３１）記載の光重合による 検定用組成物。 （３７）ペプチダーゼがチオニンのペプチド誘導体また
    はチオニン誘導体から光増感剤 を生成させる請求項（３１）記載の光重合 による検定用組成物。 （３８）酸素緩衝剤が更に含まれる請求項（１）記載の
    光重合による検定用組成物。 （３９）酸素緩衝剤が、コバルトのキレート、および酸
    化酵素からなる１群から選択さ れる請求項（３８）記載の光重合による検 定用組成物。 （４０）コバルトのキレートが、グリシルグリシン、ヒ
    スチジン、ジエチレントリアミ ン、トリエチレンテトラアミン、および ビタミンＢ＿１＿２＿ａのコバルトとのキレート化合物
    からなる１群から選択される請求 項（３９）記載の光重合による検定用組成 物。 （４１）酸化酵素が、アルコール酸化酵素、アスコルビ
    ン酸酸化酵素、ガラクトース酸 化酵素、グルコース酸化酵素、サルコシ ン酸化酵素、ピルビン酸酸化酵素、コリ ン酸化酵素、アミノ酸酸化酵素、および キサンチン酸化酵素からなる１群から選 択される請求項（３９）記載の光重合によ る検定用組成物。 （４２）付加重合可能なモノマーであるビニルモノマー
    が、アクリルアミド、Ｎ−オクチ ルアクリルアミド、メタクリルアミド、 Ｎ−メチルアクリルアミド、アクリル酸、 メタクリル酸、ヒドロキシメチルアクリ ルアミド、メチレンビスアクリルアミド、 アクリロニトリル、アクリル酸メチル、 メタクリル酸エチレングリコール、メタ クリル酸プロピレングリコール、アクリ ルアミドプロパンスルホン酸、Ｎ−（３−アミノプロピ
    ル）−メタクリルアミド、三 アクリル酸ペンタエリトリトール、二ア クリル酸ポリエチレングリコール、ビニ ルピロリドン、ビニルピリジン、アクリ ル酸の多価塩、メタクリル酸の多価塩、 および上記モノマーの組合わせからなる １群から選択される請求項（１）記載の 光重合による検定用組成物。 （４３）多価塩が、カルシウム、バリウム、ストロンチ
    ウム、カドミウム、ネオジム、 ウラニウム、およびユウロピウムの各塩 からなる１群から選択される請求項（４２）記載の光重
    合による検定用組成物。 （４４）光増感剤、あるいは光増感剤を生成させる酵素
    である被験物質の検出方法であっ て、 （ａ）（イ）光増感剤である被験物質、 あるいは（ロ）付加重合が可能なモノマ ーを光に被曝した際に電子供与体の存在 下で付加重合によってポリマーに転化で きる光増感剤をその前駆体から生成させ る酵素である被験物質、（ハ）電子供与 体、および（ニ）前記酵素が用いられる 場合は前記光増感剤の前駆体を、（ホ） 付加重合が可能な少なくとも１種類のモ ノマーと混合する段階と、 （ｂ）（ａ）の段階の結果的な混合物 を光に被曝させる段階と、 （ｃ）被験物質の存在または量の指標 としての付加重合の重合度を測定する段 階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （４５）電子供与体、あるいは電子供与体を生成させる
    酵素である被験物質の検出方法 であって、 （ａ）（イ）付加重合が可能なモノマ ーを光に被曝した際にポリマーに転化で きる光増感剤を光によって励起された状 態で還元できる電子供与体である被験物 質、あるいは（ロ）前記電子供与体をそ の前駆体から生成させる酵素である被験 物質、（ハ）光増感剤、および（ニ）前 記酵素が用いられる場合は前記電子供与 体の前駆体を、（ホ）付加重合が可能な 少なくとも１種類のモノマーと混合する 段階と、 （ｂ）（ａ）の段階の結果的な混合物 を光に被曝させる段階と、 （ｃ）被験物質の存在または量の指標 としての付加重合の重合度を 測定する段階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （４６）抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメントの検
    出方法であって、 （ａ）抗原またはハプテンを（イ）付 加重合が可能なモノマーを光に被曝した 際にポリマーに転化できる光増感剤と、 あるいは（ロ）前記光増感剤をその前駆 体から生成させる酵素と結合させる段階 と、 （ｂ）結合した抗原またはハプテンを 付加重合が可能な少なくとも１種類のモ ノマーとともに電子供与体の存在下で、 および、前記酵素が用いられる場合は光 増感剤の前駆体の存在下で相補的な抗体、 あるいは抗体の抗原結合セグメントに接 触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得ら れる物質を光に被曝させる段階と、 （ｄ）抗体、あるいは抗体の抗原結合 セグメントの存在または量の 指標としての付加重合の重合度を測定す る段階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （４７）抗原、あるいはハプテンの検出方法であって、 （ａ）抗体、あるいは抗体の抗原結合 セグメントを（イ）付加重合が可能なモ ノマーを光に被曝した際に電子供与体の 存在下でポリマーに転化できる光増感剤 と、あるいは（ロ）前記光増感剤をその 前駆体から生成させる酵素と結合させる 段階と、 （ｂ）結合した抗体、あるいは抗体の 抗原結合セグメントを付加重合が可能な 少なくとも１種類のモノマーとともに電 子供与体の存在下で、および、前記酵素 が用いられる場合は光増感剤の前駆体の 存在下で相補的な抗原、あるいはハプテ ンに接触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得ら れる物質を光に被曝させる段階と、 （ｄ）抗原、あるいはハプテンの存在 または量の指標としての付加重合の重合 度を測定する段階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （４８）抗体、あるいは抗体の抗原結合セグメントの検
    出方法であって、 （ａ）抗原またはハプテンを（イ）付 加重合が可能なモノマーを光に被曝した 際にポリマーに転化できる光増感剤を光 によって励起された状態で還元できる電 子供与体と、あるいは（ロ）前記電子供 与体をその前駆体から生成させる酵素と 結合させる段階と、 （ｂ）結合した抗原またはハプテンを 付加重合が可能な少なくとも１種類のモ ノマーとともに光増感剤の存在下で、お よび、前記酵素が用いられる場合は電子 供与体の前駆体の存在下で相補的な抗体、 あるいは抗体の抗原結合セグメントに接 触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得ら れる物質を光に被曝させる段階と、 （ｄ）抗体、あるいは抗体の抗原結合 セグメントの存在または量の指標として の付加重合の重合度を測定する段階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （４９）核酸の検出方法であって、 （ａ）１本鎖であり、かつ核酸の１本 鎖セグメントに相補的である既知の配列 が含まれるハイブリッド形成可能な核酸 プローブを（イ）付加重合が可能なモノ マーを光に被曝した際にポリマーに転化 できる光増感剤と、あるいは（ロ）前記 光増感剤をその前駆体から生成させる酵 素と結合させる段階と、 （ｂ）結合した核酸プローブを付加重 合が可能な少なくとも１種類のモノマー とともに、電子供与体の存在下で、およ び、前記酵素が用いられる場合は光増感 剤の前駆体の存在下で被験物質である核 酸に接触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得ら れる物質を光に被曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標 としての付加重合の重合度を測定する段 階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （５０）核酸である被験物質の検出方法であって、 （ａ）１本鎖であり、かつ被験核酸の １本鎖セグメントに相補的である既知の 配列が含まれるハイブリッド形成可能な 核酸プローブを（イ）付加重合が可能な モノマーを光に被曝した際にポリマーに 転化できる光増感剤を光によって励起さ れた状態で還元できる電子供与体と、あ るいは（ロ）前記電子供与体をその前駆 体から生成させる酵素と結合させる段階 と、 （ｂ）結合した核酸プローブを付加重 合が可能な少なくとも１種類のモノマー とともに、光増感剤の存在下で、および、 前記酵素が用いられる場合は前記電子供 与体の前駆体の存在下で、被験核酸に接 触させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得ら れる物質を光に被曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標 としての付加重合の重合度を測定する段 階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （５１）核酸である被験物質の検出方法であって、 （ａ）１本鎖であり、かつ被験核酸の １本鎖セグメントに相補的である既知の 配列が含まれるハイブリッド形成可能な 核酸プローブを前記被験核酸に接触させ る段階と、 （ｂ）前記プローブを付加重合が可能 な少なくとも１種類のモノマーとともに、 （イ）付加重合が可能なモノマーを光に 被曝した際にポリマーに転化できる光増 感剤と、あるいは（ロ）前記光増感剤を その前駆体から生成させる酵素と、電子 供与体の存在下で、および、前記酵素が 用いられる場合は前記光増感剤の前駆体 の存在下で結合させる段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得ら れる物質を光に被曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標 としての付加重合の重合度を測定する段 階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。 （５２）核酸である被験物質の検出方法であって、 （ａ）１本鎖であり、かつ被験核酸の １本鎖セグメントに相補的である既知の 配列が含まれるハイブリッド形成可能な 核酸プローブを前記被験核酸に接触させ る段階と、 （ｂ）前記プローブを付加重合が可能 な少なくとも１種類のモノマーとともに、 （イ）付加重合が可能なモノマーを光に 被曝した際にポリマーに転化できる光増 感剤を光によって励起された状態で還元 できる電子供与体と、あるいは（ロ）前 記電子供与体をその前駆体から生成させ る酵素と、前記光増感剤の存在下で、お よび、前記酵素が用いられる場合は前記 電子供与体の前駆体の存在下で結合させ る段階と、 （ｃ）（ｂ）の段階から結果的に得ら れる物質を光に被曝させる段階と、 （ｄ）被験核酸の存在または量の指標 としての付加重合の重合度を測定する段 階と、 からなることを特徴とする光重合による 検定のための方法。
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