FI91920B - Menetelmä biospesifisen moniparametrisen määritysmenetelmän tarkkuuden parantamiseksi - Google Patents

Description

91920

MENETELMÄ BIOSPESIFISEN MONIPARAMETRISEN MÄÄRITYSMENETELMÄN TARKKUUDEN PARANTAMISEKSI - FÖRFARANDE FÖR FÖRBÄTTRING AV NOGGRANNHETEN HOS EN BIOSPECIFIK MULTIPARAMETRISK BESTÄMNINGSMETOD

Keksinnön kohteena on menetelmä biospesifisen moniparamet-risen määritysmenetelmän tarkkuuden parantamiseksi.

Immunomääritys on vakiintunut biospesifinen määritys-5 menetelmä ja sen eri sovellutuksia käytetään laajalti rutiinidiagnostiikassa ja tutkimuslaboratorioissa. Toinen biospesifisten määritysten ryhmä, joskin vielä kehityksen alaisena oleva, on DNA- ja RNA-hybridisaatiomääritykset. Biospesifisissä määrityksissä käytetään yleensä kahta 10 biospesifistä reagenssia, primäärireagenssia ja sekundääri-reagenssia (esim. vasta-*ainetta, DNA- tai RNA-koetinta), jotka kumpikin sitoutuvat analyyttimolekyylin spesifisiin determinantteihin muodostaen kolmen molekyylin kompleksin (kerrosrakenteen) ja normaalisti toinen näistä rea-15 gensseista on leimattu. Nykyisin käytettyjä leimoja ovat radioisotoopit, entsyymit, luminoivat leimat ja fluoresoivat leimat.

Rutiinidiagnostiikassa on jatkuvasti kasvava tarve moni-parametrisesta analytiikasta. Valitettavasti nykyiset 20 menetelmät eivät salli useamman kuin kahden tai kolmen samanaikaisesti mitattavan leiman käyttöä, koska näiden eri leimojen antamien signaalien spektrometrinen erottelu ei ole mahdollista riittävällä tarkkuudella. Eri radioi-sotooppien tai fluoresoivien leimojen emissiospektrit 25 peittävät huomattavasti toisiaan ja sen seurauksena eri analyyttien erottelu samasta näytteestä on huono vaaditulla pitoisuusalueella.

Moniparametristä analytiikkaa varten on esitetty menetelmä, joka perustuu mikropartikkelien käyttöön biospesifisten 30 reagenssien kiinteänä reaktioalustana (USA:n patentti no 5,028,545). Tässä menetelmässä käytetään fluoresoivia 91920 2 mikropartikkeleita reaktioalustana ja luxninoivaa merkkiainetta vasta-aineiden leimaamiseksi. Mikropartikkeleiden fluoresenssi on peräisin mikropartikkeleiden polymeerissä olevasta fluoresoivasta väriaineesta ja sen viritystiloilla 5 on lyhyt puoliintumisaika (1-10 ns). Fluoresoiva väriaine voi olla tasaisesti jakautunut mikropartikkelin sisällä tai se voi olla mikropartikkelin kuorikerroksessa tai pinnassa. Luminesenssilla tarkoitetaan jäljempänä fluoresoivien lantanidikelaattien pitkäikäistä fluoresenssia, mutta tässä 10 tarkoitettu luminesenssi voi olla muidenkin metallo-orgaa-nisten kompleksien pitkäikäistä fluoresenssia tai fosfore-senssia (puoliintumisaika 10 με - 1 ms) tai bio- tai kemi-luminesenssia. Oleellista menetelmässä on se, että mikropartikkeleiden fluoresenssisignaali ja biospesifisen 15 leiman luminesenssisignaali voidaan mitata laajalla dynamiikka-alueella ilman, että ne häiritsevät toisiaan, koska emissiot tapahtuvat oleellisesti eri aikoina. Tämä moni-parametrinen määritys suoritetaan keinotekoisesti valmistettujen mikropartikkeleiden suspensiossa, joka on eri 20 luokkiin kuuluvien ja eri analyyttejä sitovien mikropartikkeleiden sekoitus. Jokaiseen eri luokkaan kuuluvat mikro-partikkelit päällystetään ensin spesifisellä primääri-reagenssillä (vasta-aine, DNA, RNA) eli mikropartikkelit toimivat näiden reagenssien ja biospesifisen reaktion 25 kiinteänä kantajana. Menetelmälle on luonteenomaista erityisesti se, että siinä käytetään mikrofotometristä tekniikkaa mikropartikkeleiden luokan ja samalla analyytin tunnistamiseksi fluoresoivan väriaineen avulla sekä luraini-senssiin perustuvaa mittausta analyytin pitoisuuden määrit-30 tämiseksi mikropartikkeleiden pinnalta biospesifisen reaktion avulla.

Kyseessä oleva menetelmä ja siihen tarvittava laitteisto voidaan toteuttaa käytännössä monella eri tavalla. Menetelmässä on kuitenkin oleellista se, että jokainen erillinen 35 mikropartikkeli, joka edustaa eri analyyttiluokkaa, tunnistetaan ja mitataan erikseen ja näin voidaan suorittaa moniparametrinen biospesifinen määritys samasta näytteestä.

3 91920

Tunnistaminen perustuu fluoresenssimittaukseen, kuten yllä on esitetty. Sopivalla mittausjärjestelyllä voidaan suhteellisen lyhytikäinen fluoresenssiemissio ja luminesenssi erottaa toisistaan, koska niiden valoemissiot tapahtuvat 5 eri aikoina ja fluoresenssiemissio on täydellisesti loppunut, ennenkuin luminesenssireaktio aktivoidaan eikä se aiheuta häiriötä analyytin pitoisuuden määrittämiseen luminesenssin avulla.

Tasakokoisia mikropartikkeleita läpimitaltaan 1-200 μιη 10 (rajoittumatta kuitenkaan näihin kokoihin) voidaan valmistaa sopivasta polymeeristä, joka on siinä määrin hydro-fiilistä, että ne sopivat hyvin vesisuspensioon. Mikro-partikkeleiden pintaominaisuudet sallivat makromolekyylien sitomisen niihin fysikaalisen adsorption tai kovalentin 15 sidoksen avulla aktivoimalla pinnan OH-ryhmiä (L.Johansen et ai., J. Immunol. Methods 59, 255-264, 1983). Tässä menetelmässä näytettä, jossa ovat siis kaikki kyseeseen tulevat analyytit, inkuboidaan sekundäärireagenssien seoksen kanssa mikropartikkelisuspensiossa mahdollisimman 20 pienessä (esim. 10-100 μΐ) tilavuudessa, jotta saavutettaisiin mahdollisimman täydellinen reaktio lyhyessä ajassa. Koska mikropartikkelisuspensiossa tapahtuvassa reaktiossa analyyttimolekyylien ja leimattujen reagenssien keskimääräinen etäisyys on hyvin pieni, voidaan reaktio-25 tasapaino saavuttaa nopeasti ja sen seurauksena syntyy mikropartikkeleiden pinnalla olevien reagenssien yhteyteen leimatusta reagenssistä ja analyytistä muodostuvia komplekseja. Tällaista rakennetta kutsutaan kirjallisuudessa yleisesti kerrosrakenteeksi. Jos inkubaatioajät voidaan 30 säätää tarkasti, ei ole tarvetta viedä reaktiota päätepisteeseen. Inkubaation jälkeen suspensio laimennetaan riittävästi vapaan leimatun sekundäärireagenssin pitoisuuden alentamiseksi ja yksittäisten mikropartikkeleiden pinnalla olevien leimattujen kompeksien määrä mitataan 35 luminometrisesti. Useimmiten riittää yhden kertaluvun suuruinen laimennus riittävän tehokkaaseen sitoutuneen ja vapaan leimatun reagenssifraktion antamien signaalien 91920 4 erottamiseksi toisistaan, koska tässä menetelmässä käytetty mikroluminometrinen ilmaisin pystyy optisesti erottamaan mittauskammion fokuspisteessä olevan mikropartikkelin luminisenssiemission sen ympäristössä olevan vapaan lei-5 matun reagenssin antamasta signaalista. Mikropartikkeleita analysoidaan tilastollisesti riittävä määrä ja kunkin partikkelin luminesenssisignaalin voimakkuus rekisteröidään tietokoneelle.

Mikropartikkeleiden analysointi voidaan suorittaa ohuessa 10 mittauskammiossa joko pysäyttämällä virtaus tai virtauksen ollessa käynnissä. Mittausinstrumentissa tapahtuu mikropartikkeleiden mikrofotometrinen havainnointi ohuessa mittauskammiossa, johon laimennettu raikropartikkeli-suspensio johdetaan. Mikropartikkelisuspensiota mitataan 15 ensin fluoresenssi-ilmaisimella ja kunkin mikropartikkelin analyyttiluokan määritys tapahtuu fluoresenssin voimakkuuden perusteella. Seuraavaksi suspensio aktivoidaan ruiskuttamalla sisään luminesenssiaktivaattori. Analyytin pitoisuuden määritys tapahtuu luminesenssivoimakkuuden 20 mittauksen avulla. Mittauskyvetin apertuuri valitaan optimaalisesti käytetyn mikropartikkelin suuruuden mukaan ja luminesenssiemissio mitataan valomonistinputkella tai muulla herkällä fotoni-ilmaisimella tai sopivalla kuva-ilmaisimella. Ilmaisimena voidaan käyttää myös mikrokanava-25 kuvavahvistinta ja puolijohdekuvailmaisinta (CCD). Riittävä lukumäärä mikropartikkeleita tunnistetaan ja analysoidaan tilastollisesti riittävän tarkan tuloksen saamiseksi jokaiselle analyytille. Mittaustulokset suhteutetaan standardi-näytteillä suoritettuihin mittauksiin, joiden perusteella 30 lopputulokset lasketaan.

Edellä kuvattu analyysimenetelmä edellyttää tasakokoisia mikropartikkeleita. Käytännössä partikkelit eivät kuitenkaan ole tasakokoisia, vaan niiden koko vaihtelee 1 - 15 %. Mikropartikkelien hankintahinta riippuu myös koon tarkkuu-35 desta. Valikoitujen mikropartikkelien käyttö tulee kalliiksi. Kokovaihtelu aiheuttaa virheen mittaustuloksiin. Nor- 91920 5 maalisti valikoimattomien mikropartikkeleiden halkaisijan vaihtelu on 5 -15 %. Koska niiden pinta-ala kasvaa ne-liöllisesti halkaisijaan verrattuna, vaihtelee niiden pinta-ala vastaavasti 10 - 32 %. Jos kuitenkin voitaisiin 5 mikropartikkelien luokan tunnistuksen yhteydessä mitata myös niiden koko, voitaisiin kokovaihtelusta aiheutunut analyysituloksen virhe korjata.

Tämän keksinnön tarkoituksena on parantaa määritysmenetelmän tarkkuus korjaamalla mikropartikkelien koko-10 vaihtelusta aiheutuva virhe.

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksesta 1.

Mikropartikkelien kokovaihtelusta aiheutuvaa mittausvirhettä voidaan pienentää suorittamalla mikropartikkeleiden koon mittaus esimerkiksi luokan identi-15 fioinnin yhteydessä. Mikropartikkelien koon mittaus voi olla optinen ja se voi tapahtua samoilla optisilla ilmaisimilla, kuin luokan tunnistus. Koon mittaus voi olla myös sähköinen, mutta silloin on mittauskammioon asennettava asianmukaiset elektrodit. Seuraavassa on lueteltu erilaisia 20 mahdollisesti kyseeseen tulevia koon mittausperiaatteita.

1. Optinen mittaus kuvantavalla ilmaisimella. Mikro-partikkelit voidaan kuvata mikroskoopin objektiivilinssin kautta video- tai still-kameralla, jossa on esimerkiksi CCD-matriisi tai CCD-viivaelementti kuvailmaisimena. Mikro- 25 partikkelin kuva siirretään tietokoneelle, jossa partikkelin koko määritetään.

2. Optinen mittaus mikropartikkelin lähettämän lyhytikäisen fluoresenssin voimakkuuden avulla. Sama fluoresenssi-ilmaisin, joka määrittää mikropartikkelin luokan, voi myös 30 antaa tietoa mikropartikkelin koosta, koska luokan signaa-livoimakkuus eroaa nimellisarvostaan partikkelin koko-vaihtelua vastaavasti.

91920 6 3. Optinen mittaus mikropartikkelin lähettämän lyhytikäisen fluoresenssisignaalin pituuden avulla. Jos mikro-partikkelisuspensio virtaa tasaisesti ohuessa mittaus-kammiossa, saadaan tunnistusilmaisimeen signaali, jonka 5 kesto on suoraan verrannollinen mikropartikkelin halkaisijaan.

4. Optinen mittaus mikropartikkelin aiheuttaman valon diffraktion tai sironnan avulla. Kun mikropartikkelia valaistaan monokromaattisella ja yhdensuuntaisella valolla, 10 muodostuu mikropartikkelin taustalle diffraktio- tai si-rontakuvio, jonka muoto ja dimensiot ovat partikkelin koosta riippuvaisia.

5. Sähkön johtavuuteen perustuva mittaus ohuessa virtaus-kanavassa. Kun mikropartikkelisuspensio, jossa nesteenä 15 käytetään sähköä johtavaa nestettä, virtaa ohuessa kanavassa, jonka sisäläpimitta on vain vähän suurempi kuin mikropartikkelin halkaisija, muuttuu virtauskanavaan asennettujen galvaanisten elektrodien välissä olevan nesteen-patsaan sähkönjohtavuus, koska sähköä johtamaton mikro-20 partikkeli syrjäyttää tilavuuttaan vastaavan osan nesteestä. Sähkönjohtavuuden muutos voidaan mitata esimerkiksi normaalilla vaihtovirtasiltakytkennällä.

• 6. Dielektrisyyden muutokseen perustuva mittaus ohuessa virtauskavavassa. Kun mikropartikkelisuspensio, jossa 25 nesteenä käytetään sähköä johtavaa nestettä, virtaa ohuessa kanavassa, jonka sisäläpimitta on vain vähän suurempi kuin mikropartikkelin halkaisija, muuttuu virtauskanavaan asennettujen kapasitiivisten elektrodien välissä olevan nes-teenpatsaan dielektrisyys, koska sähköä johtamaton mikro-30 partikkeli syrjäyttää tilavuuttaan vastaavan osan nesteestä, jonka dielektrisyys poikkeaa mikropartikkelin dielektrisyydestä. Dielektrisyyden muutos voidaan mitata esimerkiksi normaalilla vaihtojännitteen ohjaamalla kapa-sitiivisella siltakytkennällä tai kytkemällä elektrodit 35 itsestään värähtelevän korkeataajuisen oskillaattoripiirin 91920 7 induktanssin rinnalle.

7. Permeabiliteetin muutokseen perustuva mittaus ohuessa virtauskavavassa. Kun mikropartikkelisuspensio virtaa ohuessa kanavassa, jonka sisäläpimitta on vain vähän suu-5 rempi kuin mikropartikkelin halkaisija, muuttuu virtaus-kanavan ympärille asennetun käämin induktanssi, koska mikropartikkeli syrjäyttää tilavuuttaan vastaavan osan nesteestä, jonka permeabiliteetti poikkeaa mikropartikkelin permeabiliteetistä. Tätä ilmiötä voidaan tehostaa lisää-10 mällä mikropartikkeliin magneettisuuteen vaikuttavia aineita. Permeabiliteetin muutos voidaan mitata esimerkiksi kytkemällä käämi itsestään värähtelevän korkeataajuisen oskillaattoripiirin induktanssiksi.

Edellä esitetyt ja yleisesti muissa sovelluksissa käytetyt 15 menetelmät ovat esimerkkejä siitä, miten mikropartikkelin koko voidaan määrittää tässä kysymyksessä olevassa moni-parametrisessä analyysilaitteistossa. Näitä tunnettuja menetelmiä käyttäen voidaan mikropartikkeleiden koko-vaihtelusta aiheutuva virhe korjata suhteuttamalla bio-20 spesifisen reaktion analyysitulokset mikropartikkelien kokoon.

Tämän keksinnön mukainen mittaustarkkuuden parannus soveltuu mihin tahansa moniparametriseen määritysmenetelmään, jossa käytetään mikropartikkeleita edellä kuvatulla tavalla 25 kiinteänä reaktioalustana ja jossa fluoresenssisignaali partikkelin luokan määräämiseksi erotetaan biospesifisen leiman antamasta signaalista siten, että ne syntyvät eri aikoina tai ovat luonteeltaan niin erilaisia säteilyn lajeja, että niiden erottaminen toisistaan on riittävän 30 tehokasta. Edellämainitut fluoresoivat, fosforoivat ja luminesenssia synnyttävät tai katalysoivat molekyylit ovat esimerkkejä tällaisista leimoista.

Claims (9)

91920 s

1. Biospesifinen moniparametrinen määritysmenetelmä, jossa käytetään ennakolta valmistettuja, eri luokkiin jaettuja ja eri analyyttejä edustavia mikropartikkeleita, jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sisältävät eri pitoi-5 suuksia fluoresoivaa väriainetta ja jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit on päällystetty eri analyyttejä sitovilla biospesifisillä reagensseilla, jossa - eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sekoitetaan yhteen suspensioksi ja analysoitava näyte lisätään tähän suspen- 10 sioon, - suspensioon lisätään biospesifisten leimattujen sekun-däärireagenssien seos, jolloin alkaa biospesifinen sitoutu-misreaktio analyyttimolekyylien, leimattujen sekundääri-reagenssien ja mikropartikkeleihin liittyneiden reagenssien 15 välillä, - suspensio laimennetaan vapaiden leimattujen reagenssien pitoisuuden alentamiseksi, - suspensio johdetaan ohueen virtauskanavaan, jossa fluoresoiva väriaine viritetään valonsäteellä ja fluoresenssi- 20 emission voimakkuus mitataan jokaisesta partikkelista erikseen, - fluoresenssisignaali muunnetaan sähköiseksi signaaliksi mikropartikkeliluokan tunnistamista varten fluoresenssi-signaalista saadun sähköisen signaalin voimakkuuden perus- 25 teella, - sen jälkeen kun fluoresenssisignaali on loppunut, bio-spesifisen reagenssin leimasta saatava signaali mitataan ko. säteilylajille soveltuvalla ilmaisimella ja saadun signaalin voimakkuuden perusteella analysoidaan jokaiseen 30 mikropartikkeliin liittyneen analyyttimolekyylin määrä, II 91920 tunnettu siitä, että mikropartikkelien koko mitataan ohuessa virtauskanavassa optisesti tai sähköisesti ja kokovaihtelusta aiheutunut virhe korjataan suhteuttamalla analyysitulokset mikropartikkelien kokoon.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropartikkelin koko mitataan optisesti kuvantavalla ilmaisimella.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropartikkelin koko mitataan 10 optisesti mikropartikkelin lähettämän lyhytikäisen fluoresenssin voimakkuuden avulla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä,, että mikropartikkelin koko mitataan optisesti mikropartikkelin lähettämän lyhytikäisen fluore- 15 senssisignaalin pituuden avulla.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropartikkelin koko mitataan optisesti mikropartikkelin aiheuttaman valonsironnan tai diffraktion avulla. 20

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropartikkelin koko mitataan virtauskanavaan asennettujen galvaanisten elektrodien välissä olevan partikkelisuspension sähkönjohtavuudessa 25 tapahtuvan muutoksen avulla.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikropartikkelin koko mitataan virtauskanavaan asennettujen kapasitiivisten elektrodien välissä olevan partikkelisuspension dielektrisyydessä 30 tapahtuvan muutokseen avulla.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 91920 tunnettu siitä, että mikropartikkelin koko mitataan virtauskanavan ympärille asennetun käämin sisällä olevan partikkelisuspension permeabiliteetissä tapahtuvan muutoksen avulla.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biospesifisen reaktantin leima on fluoresoiva, fosforoiva tai kerni- tai bioluminesenssia synnyttävä tai katalysoiva molekyyli. li 91920