CN113567415A - 表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法 - Google Patents

表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于布鲁氏杆菌检测技术领域，公开了一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括：进行鲁氏杆菌抗体分组；制备纳米材料；制备SERS标记检测探针；制备拉曼免疫层析试纸条；进行试纸条性能检测。本发明提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，在临床快速诊断中具有极大的推广和应用价值。同时，本发明方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在布鲁氏杆菌早期感染检测中具有广阔的应用和推广前景。

Description

表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法
技术领域
本发明属于布鲁氏杆菌检测技术领域，尤其涉及一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法。
背景技术
目前，布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的，是目前世界上流行较广、危害较大的人畜共患病，引起流产、不孕以及各种组织的局部病灶。布鲁氏菌可通过鼻、咽、口腔感染，主要是通过粘膜上皮组织浸入。目前，布鲁氏菌属已有10余个种的布鲁氏菌存在，不同种的布鲁氏菌具有明显的宿主危害倾向性，但大多具有不同宿主间的交叉感染能力，可引起严重的公共卫生问题。随着我国近年来，畜牧业的快速发展，布鲁氏菌病成为了限制我国畜牧业发展的严重病害之一。
布鲁氏菌包括羊群布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌等种源。布鲁氏菌检测技术主要有虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、乳环试验(MRT)、补体结合试验(CFT)、ELISA和PCR等方法。常规方法分离鉴定病原所需条件苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低。PBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。PCR检测方法较前几种快速也准确许多，但需要复杂的仪器设备，成本高，不适合基层和现场检测。表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scatterimg，SERS)是一种振动光谱技术，该技术灵敏度高、特异性强，将SERS与免疫层析技术结合是当前病原检测的重要研究方向之一。因此，针对这一现状，在布鲁氏杆菌检测工作中，亟需实现将SERS与免疫层析技术结合，并建立一种高灵敏度SERS-免疫层析检测新技术，以快速、准确且定量检测布鲁氏杆菌的方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：常规方法分离鉴定病原所需条件苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低；其中，PBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便；PCR检测方法需要复杂的仪器设备，成本高，不适合基层和现场检测。
解决以上问题及缺陷的难度为：传统技术缺陷难度主要是：耗时长；操作技术水平要求高，需要配备专业的实验室技术人员；需要复杂昂贵的仪器设备；不能进行现场的快速检测。
解决以上问题及缺陷的意义为：检测快速、准确，操作简单，无需专业人员，不需经过特殊培训，适合在基层现场进行快速检测，大大方便基层兽医工作开展。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法。
本发明是这样实现的，一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括以下步骤：
步骤一，进行鲁氏杆菌抗体分组；
步骤二，制备纳米材料；
步骤三，制备SERS标记检测探针；
步骤四，制备拉曼免疫层析试纸条；
步骤五，进行试纸条性能检测。
进一步，步骤一中，所述鲁氏杆菌抗体分组，包括：
将获得的一对鲁氏杆菌抗体所包含的鲁氏杆菌标记抗体和鲁氏杆菌捕获抗体两个鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用。
进一步，步骤二中，所述制备纳米材料，包括：
选择步骤一获得的其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20-35nm的AuNPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8-12mM的DTNB，搅拌反应3-6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5-1.5％w/v的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5-1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10-20min，得到Au/DTNB@Ag NPs；向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5-5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料。
进一步，步骤三中，所述制备SERS标记检测探针，包括：
向步骤二制备得到的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，用1.5-2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育1.3-2.5h；加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，加入用SERS检测探针复溶液重悬，制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子；对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20-40℃恒温环境下干燥3h后，即可得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针。
其中，所述EDC使用量为2.0-3.5μL，所述NHS使用量为2.0-3.5μL，所述BSA使用量为90-120mL。
进一步，步骤四中，所述制备拉曼免疫层析试纸条，包括：
将步骤一剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30-40℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线T，羊抗鼠抗体作为质控线C；将干燥后的硝酸纤维素膜与步骤三制备的含SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用。
其中，所述布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.3-0.7mg/mL，所述羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3-0.7mg/mL。
进一步，所述制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板；所述试纸条优化宽度为2-4cm，优化长度为5-10cm。
进一步，步骤五中，所述试纸条性能检测，包括：
采用国家标准品对步骤四所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察，通过临床样品对步骤四所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测，进而实现对步骤四所制备检测试纸条检测性能的全面评测。
进一步，所述试纸条的的灵敏度、特异性、重复性和稳定性检测，包括：
(1)试纸条的灵敏度检测目的：检测试纸条的灵敏度
使用试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
(2)试纸条的特异性检测目的：检测试纸条的特异性
使用试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
(3)试纸条的重复性检测目的：检测试纸条的可重复性
制备八批次布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15min观察结果；拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号，从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15min观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号；
(4)试纸条的稳定性检测目的：检测试纸条的稳定性
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阳性国家标准品：羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品P1、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品P2、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品P3、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品P4、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品P5，及使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型N1、肠道病毒71型N2、大肠杆菌N3、多杀性巴氏杆菌N4、副伤寒甲型沙门氏菌N5、副伤寒乙型沙门氏菌N6、副伤寒丙型沙门氏菌N7、小肠结肠炎耶尔森氏菌N8、金黄色葡萄球菌N9，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
进一步，所述临床样品检测，包括：
通过对若干例布鲁氏杆菌临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置8-20min由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
进一步，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，包括：
对布鲁氏杆菌基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取布鲁氏杆菌全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，包括Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数；
用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测；在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，首先通过合成双层拉曼分子标记的金核银壳纳米材料(Au/DTNB@Ag/DTNB NPs)，在此材料上修饰布鲁氏杆菌抗体，制备出SERS检测探针；SERS-免疫层析试纸条由吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及底板组成；结合垫上固定制备好的布鲁氏杆菌SERS检测探针，硝酸纤维素膜是固定检测线(RV抗体)与控制线(羊抗鼠IgG)。当含有布鲁氏杆菌的样品滴加在样品垫上后，溶液在结合垫上发生特异性识别与结合，在层析作用下经过结合垫到达控制线，与控制线上特异性RV抗体识别捕获，形成复合物，剩余的SERS检测探针继续移动到达控制线，被羊抗鼠IgG捕获，在控制线与检测线上的SERS检测探针累积显现可视化的两条红色线条；当只有控制线显现红色线条时，证明该样品中没有布鲁氏杆菌的存在，检测线出现红色线条代表该试纸条体系完整良好。
本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中，在临床快速诊断中具有极大的推广和应用价值。本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在布鲁氏杆菌早期感染检测中具有广阔的应用和推广前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括以下步骤：
S101，进行鲁氏杆菌抗体分组；
S102，制备纳米材料；
S103，制备SERS标记检测探针；
S104，制备拉曼免疫层析试纸条；
S105，进行试纸条性能检测。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1：准备材料
本发明实施例提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌的方法，包括以下步骤：
S1，布鲁氏杆菌抗体分组，将获得的一对布鲁氏杆菌抗体所包含的布鲁氏杆菌标记抗体组和布鲁氏杆菌捕获抗体组布鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，先选择S1步骤其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20nm的AuNPs胶体金溶液；然后在AuNPs胶体金溶液中加入8mM的DTNB，搅拌反应3h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用1.5mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育1.3h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子，然后对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线(T)，羊抗鼠抗体作为质控线(C)，然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的含SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
其中，所述进一步的，所述S3步骤中，EDC使用量为2.0μL；NHS使用量为2.0μL；BSA使用量为90mL；同时，所述S4步骤中布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.3mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3mg/mL。
此外，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板。
进一步优化的，所述试纸条优化宽度为3cm，优化长度为6.5厘米。
重点说明的，所述S5步骤中：
灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
重复性检测的具体方法为：
制备八批次布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号，从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
稳定性检测的具体方法为：
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阳性国家标准品：羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P1)、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P2)、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品(P3)、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P4)、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P5)，及使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型(N1)、肠道病毒71型(N2)、大肠杆菌(N3)、多杀性巴氏杆菌(N4)、副伤寒甲型沙门氏菌(N5)、副伤寒乙型沙门氏菌(N6)、副伤寒丙型沙门氏菌(N7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(N8)、金黄色葡萄球菌(N9)，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
同时，所述S5步骤中，临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例布鲁氏杆菌临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置8分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
需要特别说明的，所述S5步骤中，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对布鲁氏杆菌基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取布鲁氏杆菌全基因组核酸，在以其作为模板进行PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
实施例2
本发明实施例提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌的方法，包括以下步骤：
S1，布鲁氏杆菌抗体分组，将获得的一对布鲁氏杆菌抗体所包含的布鲁氏杆菌标记抗体组和布鲁氏杆菌捕获抗体组布鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出35nm的AuNPs胶体金溶液；然后在AuNPs胶体金溶液中加入12mM的DTNB，搅拌反应6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNBNPs搅拌加热至煮沸，加入1.5％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾20分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育2.5h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子，然后对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在40℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在40℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线(T)，羊抗鼠抗体作为质控线(C)，然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的含SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
其中，所述S3步骤中，EDC使用量为3.5μL；NHS使用量为3.5μL；BSA使用量为120mL；同时，所述S4步骤中布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.7mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.7mg/mL。
此外，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板，且所述试纸条优化宽度为2cm，优化长度为5厘米。
重点说明的，所述S5步骤中：
(1)灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
(2)特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
(3)重复性检测的具体方法为：
制备八批次布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号，从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
所述S5步骤中稳定性检测的具体方法为：
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阳性国家标准品：羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P1)、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P2)、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品(P3)、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P4)、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P5)，及使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型(N1)、肠道病毒71型(N2)、大肠杆菌(N3)、多杀性巴氏杆菌(N4)、副伤寒甲型沙门氏菌(N5)、副伤寒乙型沙门氏菌(N6)、副伤寒丙型沙门氏菌(N7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(N8)、金黄色葡萄球菌(N9)，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例布鲁氏杆菌临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置20分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
需要特别说明的，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对布鲁氏杆菌基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，
提取布鲁氏杆菌全基因组核酸，在以其作为模板进行PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，
并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
实施例3
本发明实施例提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌的方法，包括以下步骤：
S1，布鲁氏杆菌抗体分组，将获得的一对布鲁氏杆菌抗体所包含的布鲁氏杆菌标记抗体组和布鲁氏杆菌捕获抗体组布鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出25nm的AuNPs胶体金溶液；然后在AuNPs胶体金溶液中加入10mM的DTNB，搅拌反应4h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNBNPs搅拌加热至煮沸，加入1％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加1mM硝酸银溶液，持续沸腾15分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应4h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用2mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育2h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子，然后对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在37℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在37℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线(T)，羊抗鼠抗体作为质控线(C)，然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
其中，所述进一步的，所述S3步骤中，EDC使用量为2.5μL；NHS使用量为2.5μL；BSA使用量为100mL；所述S4步骤中布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.5mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.5mg/mL。
同时，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板，且所述试纸条优化宽度为4cm，优化长度为10厘米。
重点说明的，所述S5步骤中：
(1)灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，12分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
(2)特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；13分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
(3)重复性检测的具体方法为：
制备八批次布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，13分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，13分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
(4)稳定性检测的具体方法为：
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阳性国家标准品：羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P1)、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P2)、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品(P3)、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P4)、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P5)，及使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型(N1)、肠道病毒71型(N2)、大肠杆菌(N3)、多杀性巴氏杆菌(N4)、副伤寒甲型沙门氏菌(N5)、副伤寒乙型沙门氏菌(N6)、副伤寒丙型沙门氏菌(N7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(N8)、金黄色葡萄球菌(N9)，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例布鲁氏杆菌临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置15分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
需要特别说明的，所述S4步骤中，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对布鲁氏杆菌基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取布鲁氏杆菌全基因组核酸，在以其作为模板进行PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
此外，为了更好的对本发明所采用的技术手段进行详细说明，便于本领域技术人员充分理解掌握本发明涉及技术方案内容及效果，现结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明，具体实施方法如下：
S1，布鲁氏杆菌抗体分组，将获得的原始布鲁氏杆菌抗体分为两组，并分别对两组布鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用；其中：
(1)主要试剂和材料
硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane，NC膜)；玻璃纤维素膜；血清样品垫；吸水纸；PVC底板，以上均购自上海杰一生物技术有限公司；划膜仪(Bio-Dot公司)；微电脑自动斩切机(上海金标生物科技公司)；i-Raman PlusBWS465-785 H拉曼光谱仪(B&WTek公司)；加热磁力搅拌器(北京世纪华科)。离心机(德国Eppendorf)；Hitachi H-9000高清透射电镜(日本日立)；电热鼓风干燥箱(重庆万达仪器有限公司)。
(2)试剂
次氯金酸(HAuCl4)、硝酸银(AgNO3)、无水乙醇、柠檬酸钠均为国产分析试剂；5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)；N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS(Sulfo-NHS)均购于Sigma公司；布鲁氏杆菌抗体(布鲁氏杆菌标记抗体与布鲁氏杆菌捕获抗体)购于深圳市鼎抗生物技术有限公司。
具体实施步骤为：
S2，Au/DTNB@Ag/DTNB纳米材料的合成与制备Au NPs的合成：首先选择S1步骤其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出25nm的Au NPs胶体金溶液。Au/DTNBNPs的合成:在Au NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应4h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备出Au/DTNB NPs。Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的合成：取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入1％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加1mM硝酸银溶液，持续沸腾15分钟，形成Au/DTNB@Ag NPs。于Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应反应4h合成Au/DTNB@Ag/DTNBNPs。
S3，布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子的制备
在Au/DTNB@Ag/DTNB NPs中分别加入一定量的EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，用2mM的硼酸钠缓冲液(BBS)重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育2h；加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，用SERS检测探针复溶液重悬，制备出布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子，稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上，干燥3h备用。
S4，拉曼免疫层析试纸条的制备
首先将S1步骤剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，并将布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠稀释至所需浓度，分别作为T线(检测线)和C线(质控线)，置于37℃干燥3h备用。将制备好的结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和样品垫相互压叠，贴于PVC底板上，切割为宽3mm、长6.5cm的试纸条，装入卡壳，置于干燥环境密封备用。
S5，拉曼免疫层析试纸条的性能考察
(1)布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条灵敏度检测
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
(2)布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条参考品检测
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阳性国家标准品：羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P1)、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P2)、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品(P3)、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P4)、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P5)，及使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型(N1)、肠道病毒71型(N2)、大肠杆菌(N3)、多杀性巴氏杆菌(N4)、副伤寒甲型沙门氏菌(N5)、副伤寒乙型沙门氏菌(N6)、副伤寒丙型沙门氏菌(N7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(N8)、金黄色葡萄球菌(N9)，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
(3)布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条特异性检测
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
(4)布鲁氏杆菌免疫层析试纸条重复性检测
制备八批次布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
(5)布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条临床样品检测
为了验证制备的拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌的有效性与灵敏性，检测了10例布鲁氏杆菌临床阳性样品和7例阴性样本进行验证，各取60μL逐滴加入至试纸条，10分钟左右观察结果，拉曼光谱检测仪检测拉曼信号。
(6)荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比
首先对布鲁氏杆菌基因进行多重序列比对，设计2对引物探针用于基因序列扩增，提取布鲁氏杆菌全基因组核酸，在以其作为模板进行PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等。之后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品。最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，进行对17例实际样本进行荧光PCR定量检测。荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测17例临床样本结果与拉曼免疫层析试纸条检测结果进行对比。
下面试验结果对本发明技术效果作详细的描述。
1.拉曼标记分子的表征
在本实验中，以粒径为25nm左右的Au NPs作为基底。将拉曼分子DTNB修饰到AuNP表面，加入硝酸银形成Au/DTNB@Ag。再修饰拉曼分子DTNB于金核银壳上形成Au/DTNB@Ag/DTNB NPs。
Au NPs、Au/DTNB NPs、Au/DTNB@Ag NPs和Au/DTNB@Ag/DTNB NPs四类纳米材料的紫外光谱表明，Au NPs的吸收峰出现在波长525nm附近，Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的吸收峰偏移18nm。根据1331cm-1拉曼位移处的峰值来比较拉曼信号的强弱，观察可得Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的SERS信号强度为Au/DTNB NPs的两倍。
2.拉曼免疫层析试纸条的灵敏度检测结果
基于双层拉曼分子的SERS拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品结果，可以观察到检测低稀释倍数的布鲁氏杆菌国家标准品时，检测线上形成可视化的红色线条；随着稀释倍数的增加，检测线上的颜色逐渐变浅，检测浓度低于稀释5000倍时，观察不到检测线，
得出结论：基于双层拉曼分子的SERS拉曼免疫层析检测布鲁氏杆菌试纸条工作良好，且可视化信号为稀释浓度5000倍。检测不同稀释倍数的SERS光谱，可以观察到随着稀释倍数的增加，拉曼信号逐渐变弱，当稀释倍数为50000倍时，1331cm-1拉曼位移处的主峰显著高于阴性，且根据公式：LOD＝Vblank+3SDblank，可得最低检测限的主峰信号为：1441.91。因此基于双层拉曼分子的SERS拉曼免疫层析检测布鲁氏杆菌的检测限为稀释浓度50000倍。通过绘制布鲁氏杆菌国家标准品稀释浓度与1331cm-1拉曼位移处的主峰SERS信号强度之间的校正曲线，在稀释倍数为10倍至100000倍之间具有良好的线性关系(R2＝0.995)，误差线代表了五次独立检测拉曼信号的标准偏差。
3.拉曼免疫层析试纸条的重复性检测结果
用同一批十根试纸条检测稀释100倍布鲁氏杆菌国家标准品结果，证明：该试纸条批内重复性良好。用八批SERS拉曼免疫层析试纸条检测稀释100倍布鲁氏杆菌国家标准品的结果显示：该试纸条批间重复性良好。
4.拉曼免疫层析试纸条国家标准品检测结果
根据布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品结果，检测柯萨奇病毒A16(N1)、肠道病毒71型(N2)、大肠杆菌(N3)、多杀性巴氏杆菌(N4)、副伤寒甲型沙门氏菌(N5)、副伤寒乙型沙门氏菌(N6)、副伤寒丙型沙门氏菌(N7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(N8)、金黄色葡萄球菌(N9)与羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P1)、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P2)、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品(P3)、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品(P4)、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品(P5)阳性国家标准品(P5)的SERS拉曼免疫层析试纸条结果，可以观察到：N1-N9只有控制线上形成可视化的红色线条，P1-P5检测线上形成可视化的红色线条；通过14种国家标准品的SERS光谱，N1-N9：1331cm-1拉曼位移处均未有明显主峰，P1-P5：1331cm-1拉曼位移处的主峰信号均高于1441.91。结果显示：该试纸条国家标准品检测结果符合率100％。
5.拉曼免疫层析试纸条对临床样品的检测结果
布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌临床样品结果及检测布鲁氏杆菌临床样品的试纸条图片，阳性组1-10号标本的检测线与控制线为肉眼可见的红色，阴性组1-7号标本仅有肉眼可见的一条红色控制线。通过检测布鲁氏杆菌临床样品的SERS光谱，阳性组所有的拉曼信号在1331cm-1处都有明显峰值，阴性组都无明显信号，阳性组的拉曼信号都明显高于阴性组，并且高于临界值1441.91。得出结论：布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，临床阳性标本检出率为100％。
6.布鲁氏杆菌荧光定量PCR检测结果
拉曼免疫层析检测结果与荧光定量PCR检测结果比较经荧光定量PCR及拉曼免疫层析试纸条检测，该试纸条特异性为100％，两种方法符合率为100％。
由上述试验可知，本发明实施检测的基本原理为：
首先，合成双层拉曼分子标记的金核银壳纳米材料(Au/DTNB@Ag/DTNB NPs)，在此材料上修饰布鲁氏杆菌抗体，制备出SERS检测探针。SERS-免疫层析试纸条由吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及底板组成。结合垫上固定制备好的布鲁氏杆菌SERS检测探针，硝酸纤维素膜是固定检测线(RV抗体)与控制线(羊抗鼠IgG)。当含有布鲁氏杆菌的样品滴加在样品垫上后，溶液在结合垫上发生特异性识别与结合，在层析作用下经过结合垫到达控制线，与控制线上特异性RV抗体识别捕获，形成复合物，剩余的SERS检测探针继续移动到达控制线，被羊抗鼠IgG捕获，在控制线与检测线上的SERS检测探针累积显现可视化的两条红色线条。当只有控制线显现红色线条时，证明该样品中没有布鲁氏杆菌的存在，检测线出现红色线条代表该试纸条体系完整良好。
本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中；另一方面本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在布鲁氏杆菌感染的早期检测中具有广阔的应用和推广前景。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法包括以下步骤：
步骤一，进行鲁氏杆菌抗体分组；
步骤二，制备纳米材料；
步骤三，制备SERS标记检测探针；
步骤四，制备拉曼免疫层析试纸条；
步骤五，进行试纸条性能检测。
2.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤一中，所述鲁氏杆菌抗体分组，包括：将获得的一对鲁氏杆菌抗体所包含的鲁氏杆菌标记抗体和鲁氏杆菌捕获抗体两个鲁氏杆菌抗体进行独立存放备用。
3.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤二中，所述制备纳米材料，包括：选择步骤一获得的其中一个布鲁氏杆菌抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20-35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8-12mM的DTNB，搅拌反应3-6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5-1.5％w/v的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5-1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10-20min，得到Au/DTNB@Ag NPs；向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5-5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料。
4.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤三中，所述制备SERS标记检测探针，包括：向步骤二制备得到的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，用1.5-2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入布鲁氏杆菌抗体孵育1.3-2.5h；加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，加入用SERS检测探针复溶液重悬，制备得到布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子；对布鲁氏杆菌特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20-40℃恒温环境下干燥3h后，即可得到SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针；
其中，所述EDC使用量为2.0-3.5μL，所述NHS使用量为2.0-3.5μL，所述BSA使用量为90-120mL。
5.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤四中，所述制备拉曼免疫层析试纸条，包括：将步骤一剩余的另一个布鲁氏杆菌抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30-40℃恒温环境下干燥，其中布鲁氏杆菌抗体检测探针作为检测线T，羊抗鼠抗体作为质控线C；将干燥后的硝酸纤维素膜与步骤三制备的含SERS标记的布鲁氏杆菌抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
其中，所述布鲁氏杆菌抗体检测探针稀释后浓度为0.3-0.7mg/mL，所述羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3-0.7mg/mL。
6.如权利要求5所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板；所述试纸条优化宽度为2-4cm，优化长度为5-10cm。
7.如权利要求1所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，步骤五中，所述试纸条性能检测，包括：采用国家标准品对步骤四所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察，通过临床样品对步骤四所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测，进而实现对步骤四所制备检测试纸条检测性能的全面评测。
8.如权利要求7所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述试纸条的的灵敏度、特异性、重复性和稳定性检测，包括：
(1)试纸条的灵敏度检测
使用试纸条检测布鲁氏杆菌国家标准品，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
(2)试纸条的特异性检测
使用试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
(3)试纸条的重复性检测
制备八批次布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条，分别稀释布鲁氏杆菌国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15min观察结果；拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号，从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15min观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号；
(4)试纸条的稳定性检测
使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阳性国家标准品：羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品P1、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品P2、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品P3、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品P4、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品P5，及使用布鲁氏杆菌拉曼免疫层析试纸条检测布鲁氏杆菌阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型N1、肠道病毒71型N2、大肠杆菌N3、多杀性巴氏杆菌N4、副伤寒甲型沙门氏菌N5、副伤寒乙型沙门氏菌N6、副伤寒丙型沙门氏菌N7、小肠结肠炎耶尔森氏菌N8、金黄色葡萄球菌N9，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
9.如权利要求7所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，所述临床样品检测，包括：通过对若干例布鲁氏杆菌临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置8-20min由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
10.如权利要求7所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测布鲁氏杆菌方法，其特征在于，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，包括：对布鲁氏杆菌基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取布鲁氏杆菌全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，包括Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数；
用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测；在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114544591A (zh) * 2022-02-25 2022-05-27 江南大学 一种基于表面增强拉曼散射的革兰氏阳性菌的检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002541790A (ja) * 1999-04-09 2002-12-10 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 抗菌ワクチン組成物
CN104360058A (zh) * 2014-08-18 2015-02-18 石河子大学 一种新型检测人布鲁氏菌病抗体的免疫层析试纸及制备方法
CN109212203A (zh) * 2018-09-11 2019-01-15 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种快速检测布鲁氏菌抗体的量子点免疫层析试纸条
CN111172306A (zh) * 2020-03-22 2020-05-19 上海市动物疫病预防控制中心(上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心) 一种用于检测结核分枝杆菌和/或布鲁氏菌的组合物、试剂盒及其应用
CN111537493A (zh) * 2020-05-07 2020-08-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法
CN111879925A (zh) * 2019-12-30 2020-11-03 杭州奥泰生物技术股份有限公司 一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸
AU2021100733A4 (en) * 2021-02-05 2021-04-22 Fujian Shengwei technology co., LTD Immunochromatographic Test Strip and Its Preparation Method for Brucella Antibody of Zoonoses

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002541790A (ja) * 1999-04-09 2002-12-10 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 抗菌ワクチン組成物
CN104360058A (zh) * 2014-08-18 2015-02-18 石河子大学 一种新型检测人布鲁氏菌病抗体的免疫层析试纸及制备方法
CN109212203A (zh) * 2018-09-11 2019-01-15 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种快速检测布鲁氏菌抗体的量子点免疫层析试纸条
CN111879925A (zh) * 2019-12-30 2020-11-03 杭州奥泰生物技术股份有限公司 一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸
CN111172306A (zh) * 2020-03-22 2020-05-19 上海市动物疫病预防控制中心(上海市兽药饲料检测所、上海市畜牧技术推广中心) 一种用于检测结核分枝杆菌和/或布鲁氏菌的组合物、试剂盒及其应用
CN111537493A (zh) * 2020-05-07 2020-08-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法
AU2021100733A4 (en) * 2021-02-05 2021-04-22 Fujian Shengwei technology co., LTD Immunochromatographic Test Strip and Its Preparation Method for Brucella Antibody of Zoonoses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张洪培: "《畜禽疾病诊治指南》", 四川科学技术出版社, pages: 7 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114544591A (zh) * 2022-02-25 2022-05-27 江南大学 一种基于表面增强拉曼散射的革兰氏阳性菌的检测方法

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