CN111537493A - 表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，包括轮状病毒抗体分组、制备纳米材料，制备SERS标记检测探针，制备拉曼免疫层析试纸条及试纸条性能检测等五个步骤。一方面本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中；另一方面本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在轮状病毒的早期检测中具有广阔的应用和推广前景。

Description

表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法
技术领域
本发明属于轮状病毒检测技术领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法。
背景技术
腹泻是全球公共卫生的一个重要问题，全球每年约有17亿急性肠胃炎病例，约有52.5万名5岁以下儿童因患腹泻病而死亡，是全世界儿童患病、死亡的主要原因之一。在儿童中，大多数腹泻病例与病毒感染有关，包括轮状病毒、诺如病毒、星状病毒等。其中轮状病毒感染引起的腹泻病占每年胃肠炎病例的37.5% ，每年在亚洲造成死亡人数众多，而且是全世界婴幼儿四大常见病之一。根据2009年世界卫生组织估计：每年约有450000名5岁以下儿童因轮状病毒腹泻死亡。腹泻病因的早期确诊是制定治疗方案的依据，同时也可避免用抗生素治疗病毒性腹泻，减少细菌耐药性的产生。目前常用荧光定量PCR法、ELISA法和胶体金免疫层析法检测轮状病毒，其中荧光定量PCR法灵敏度较高，但技术难度较大，耗时较长；ELISA法具有较好的特异性与重复性，但极易受到主观因素影响而造成假阳性；胶体金免疫层析法虽然快速简便但灵敏度较低，且无法进行临床定量检测。表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scatterimg，SERS）是一种振动光谱技术，该技术灵敏度高、特异性强，将SERS与免疫层析技术结合使当前病毒的检测的重要研究方向之一。
因此，针对这一现状，在病毒检测工作中，急需实现将SERS与免疫层析技术结合，并建立一种高灵敏度SERS-免疫层析检测新技术，以快速、定量检测儿童腹泻粪便中轮状病毒的产品及方法。
发明内容
本发明提供一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，以解决背景技术存在的问题，本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，临床快速诊断中具有极大的推广和应用价值。
为实现以上技术目的，本发明提供以下技术方案：
一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，包括以下步骤：
S1，轮状病毒抗体分组，将获得的一对轮状病毒抗体所包含的轮状病毒标记抗体组和轮状病毒捕获抗体组轮状病毒抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20—35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8—12mM的DTNB，搅拌反应3—6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5—1.5%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5—1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10—20分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5—5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用1.5—2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育1.3—2.5h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到轮状病毒特异性SERS标记分子，然后对轮状病毒特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20—40℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的轮状病毒抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个轮状病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30—40℃恒温环境下干燥，其中轮状病毒抗体检测探针作为检测线（T），羊抗鼠抗体作为质控线（C），然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的含SERS标记的轮状病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
进一步的，所述S3步骤中，EDC使用量为2.0—3.5μL；NHS使用量为2.0—3.5μL ；BSA使用量为90—120ml；所述S4步骤中轮状病毒抗体检测探针稀释后浓度为0.3—0.7mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3—0.7mg/mL。
进一步的，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板。
进一步的，所述试纸条优化宽度为2—4cm，优化长度为5—10厘米。
进一步的，所述S5步骤中，灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒国家标准品，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
进一步的，所述S5步骤中，特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、大肠杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
进一步的，所述S5步骤中，重复性检测的具体方法为：
制备八批次轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
进一步的，所述S5步骤中稳定性检测的具体方法为：
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阳性国家标准品：G2亚型轮状阳性国家标准品（P1）、G3亚型轮状阳性国家标准品（P2）、G4亚型轮状阳性国家标准品（P3）、G8亚型轮状阳性国家标准品（P4）、G9亚型轮状阳性国家标准品（P5），及使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型（N1）、肠道病毒71型（N2）、大肠杆菌（N3）、大肠杆菌（N4）、副伤寒甲型沙门氏菌（N5）、副伤寒乙型沙门氏菌（N6）、副伤寒丙型沙门氏菌（N7）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（N8）、金黄色葡萄球菌（N9）,各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
进一步的，所述S5步骤中，临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例轮状病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置8—20分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
进一步的，所述S5步骤中，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对轮状病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取轮状病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
本发明较传统的检测工具及方法具有下述效果：
一方面本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中；另一方面本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在轮状病毒的早期检测中具有广阔的应用和推广前景。
附图说明
图1为本发明方法流程图；
图2为SERS-免疫层析检测轮状病毒的检测原理图；
其中，（A）SERS检测探针合成原理图；（B）SERS-免疫层析试纸条检测轮状病毒原理图；
图3为拉曼标记分子的表征图一；
其中，（A）Au NPs的透射电镜表征图；（B）Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的透射电镜表征图；（C）Au NPs和Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料的图像；
图4为拉曼标记分子的表征图二；
其中，(A)为Au NPs、Au/DTNB NPs、Au/DTNB@Ag NPs和Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的紫外光谱的紫外光谱图；（B）四种纳米材料的SERS图谱图；
图5为拉曼免疫层析试纸条的灵敏度检测结果图；
其中，（A）检测浓度为稀释10倍-稀释100000倍轮状病毒国家标准品的SERS-侧流免疫层析试纸条图片；（B）检测浓度为稀释10倍-稀释100000倍轮状病毒国家标准品的SERS光谱；（C）使用拉曼位移1331cm-1处的SERS信号强度所获得的的轮状病毒国家标准品在稀释10倍-100000倍时的校正曲线，误差线代表四次独立测量的标准偏差；
图6为拉曼免疫层析试纸条的重复性检测结果；
其中，（A）批内重复性检测；（B）批间重复性检测。
图7为荧光定量PCR与试纸条对比结果；
图8为试纸条结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
如图1—8所示，一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，包括以下步骤：
S1，轮状病毒抗体分组，将获得的一对轮状病毒抗体所包含的轮状病毒标记抗体组和轮状病毒捕获抗体组轮状病毒抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8mM的DTNB，搅拌反应3h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用1.5mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育1.3h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到轮状病毒特异性SERS标记分子，然后对轮状病毒特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的轮状病毒抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个轮状病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30℃恒温环境下干燥，其中轮状病毒抗体检测探针作为检测线（T），羊抗鼠抗体作为质控线（C），然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的含SERS标记的轮状病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
其中，所述进一步的，所述S3步骤中，EDC使用量为2.0μL；NHS使用量为2.0μL ；BSA使用量为90ml；
同时，所述S4步骤中轮状病毒抗体检测探针稀释后浓度为0.3mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3mg/mL。
此外，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板，
进一步优化的，所述试纸条优化宽度为3cm，优化长度为6.5厘米。
重点说明的，所述S5步骤中：
灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒国家标准品，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、大肠杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
重复性检测的具体方法为：
制备八批次轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
稳定性检测的具体方法为：
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阳性国家标准品：G2亚型轮状阳性国家标准品（P1）、G3亚型轮状阳性国家标准品（P2）、G4亚型轮状阳性国家标准品（P3）、G8亚型轮状阳性国家标准品（P4）、G9亚型轮状阳性国家标准品（P5），及使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型（N1）、肠道病毒71型（N2）、大肠杆菌（N3）、大肠杆菌（N4）、副伤寒甲型沙门氏菌（N5）、副伤寒乙型沙门氏菌（N6）、副伤寒丙型沙门氏菌（N7）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（N8）、金黄色葡萄球菌（N9）,各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
同时，所述S5步骤中，临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例轮状病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置8分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
需要特别说明的，所述S5步骤中，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对轮状病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取轮状病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
实施例2
如图1—8所示，一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，包括以下步骤：
S1，轮状病毒抗体分组，将获得的一对轮状病毒抗体所包含的轮状病毒标记抗体组和轮状病毒捕获抗体组轮状病毒抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入12mM的DTNB，搅拌反应6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入1.5%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾20分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育2.5h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到轮状病毒特异性SERS标记分子，然后对轮状病毒特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在40℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的轮状病毒抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个轮状病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在40℃恒温环境下干燥，其中轮状病毒抗体检测探针作为检测线（T），羊抗鼠抗体作为质控线（C），然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的含SERS标记的轮状病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
其中，所述S3步骤中，EDC使用量为3.5μL；NHS使用量为3.5μL ；BSA使用量为120ml；
同时，所述S4步骤中轮状病毒抗体检测探针稀释后浓度为0.7mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.7mg/mL。
此外，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板，且所述试纸条优化宽度为2cm，优化长度为5厘米。
重点说明的，所述S5步骤中：
灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒国家标准品，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、大肠杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
重复性检测的具体方法为：
制备八批次轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
所述S5步骤中稳定性检测的具体方法为：
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阳性国家标准品：G2亚型轮状阳性国家标准品（P1）、G3亚型轮状阳性国家标准品（P2）、G4亚型轮状阳性国家标准品（P3）、G8亚型轮状阳性国家标准品（P4）、G9亚型轮状阳性国家标准品（P5），及使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型（N1）、肠道病毒71型（N2）、大肠杆菌（N3）、大肠杆菌（N4）、副伤寒甲型沙门氏菌（N5）、副伤寒乙型沙门氏菌（N6）、副伤寒丙型沙门氏菌（N7）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（N8）、金黄色葡萄球菌（N9）,各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例轮状病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置20分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
需要特别说明的，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对轮状病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取轮状病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
实施例3
如图1—8所示，一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，包括以下步骤：
S1，轮状病毒抗体分组，将获得的一对轮状病毒抗体所包含的轮状病毒标记抗体组和轮状病毒捕获抗体组轮状病毒抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出25nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入10mM的DTNB，搅拌反应4h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入1%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加1mM硝酸银溶液，持续沸腾15分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应4h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用2mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育2h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到轮状病毒特异性SERS标记分子，然后对轮状病毒特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在37℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的轮状病毒抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个轮状病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在37℃恒温环境下干燥，其中轮状病毒抗体检测探针作为检测线（T），羊抗鼠抗体作为质控线（C），然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
其中，所述进一步的，所述S3步骤中，EDC使用量为2.5μL；NHS使用量为2.5μL ；BSA使用量为100ml；所述S4步骤中轮状病毒抗体检测探针稀释后浓度为0.5mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.5mg/mL。
同时，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板，且所述试纸条优化宽度为4cm，优化长度为10厘米。
重点说明的，所述S5步骤中：
灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒国家标准品，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，12分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、大肠杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；13分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
重复性检测的具体方法为：
制备八批次轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，13分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，13分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
稳定性检测的具体方法为：
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阳性国家标准品：G2亚型轮状阳性国家标准品（P1）、G3亚型轮状阳性国家标准品（P2）、G4亚型轮状阳性国家标准品（P3）、G8亚型轮状阳性国家标准品（P4）、G9亚型轮状阳性国家标准品（P5），及使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型（N1）、肠道病毒71型（N2）、大肠杆菌（N3）、大肠杆菌（N4）、副伤寒甲型沙门氏菌（N5）、副伤寒乙型沙门氏菌（N6）、副伤寒丙型沙门氏菌（N7）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（N8）、金黄色葡萄球菌（N9）,各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例轮状病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置15分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
需要特别说明的，所述S4步骤中，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对轮状病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取轮状病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
此外，为了更好的对本发明所采用的技术手段进行详细说明，便于本领域技术人员充分理解掌握本发明涉及技术方案内容及效果，现结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明，具体实施方法如下：
S1，轮状病毒抗体分组，将获得的原始轮状病毒抗体分为两组，并分别对两组轮状病毒抗体进行独立存放备用；其中：
主要试剂和材料
硝酸纤维素膜（ nitrocellulose membrane， NC 膜）；玻璃纤维素膜；血清样品垫；吸水纸； PVC 底板，以上均购自上海杰一生物技术有限公司；划膜仪(Bio-Dot公司)；微电脑自动斩切机(上海金标生物科技公司)；i-Raman PlusBWS465-785 H 拉曼光谱仪（B&W Tek公司）；加热磁力搅拌器（北京世纪华科）。离心机（德国Eppendorf）； Hitachi H-9000高清透射电镜（日本日立）；电热鼓风干燥箱（重庆万达仪器有限公司）
试剂
次氯金酸（HAuCl4）、硝酸银（AgNO3）、无水乙醇、柠檬酸钠均为国产分析试剂；5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)（DTNB）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）；N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS（Sulfo-NHS）均购于Sigma公司；轮状病毒抗体（轮状病毒标记抗体与轮状病毒捕获抗体）购于中美歆新生物科技有限公司。
具体实施步骤为：
S2，Au/DTNB@Ag/DTNB纳米材料的合成与制备
Au NPs的合成：首先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出25nm的Au NPs胶体金溶液。Au/DTNB NPs的合成:在Au NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应4h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备出Au/DTNB NPs。Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的合成：取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入1%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加1mM硝酸银溶液，持续沸腾15分钟，形成Au/DTNB@Ag NPs。于Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB,搅拌反应反应4h合成Au/DTNB@Ag/DTNB NPs。
S3， 轮状病毒特异性SERS标记分子的制备
在Au/DTNB@Ag/DTNB NPs中分别加入一定量的EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，用2mM的硼酸钠缓冲液（BBS）重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育2h；加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，用SERS检测探针复溶液重悬，制备出轮状病毒特异性SERS标记分子，稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上，干燥3h备用。
S4， 拉曼免疫层析试纸条的制备
首先将S1步骤剩余的另一个轮状病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，并将轮状病毒抗体和羊抗鼠稀释至所需浓度，分别作为T线（检测线）和C线（质控线） ，置于37℃干燥3h备用。将制备好的结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和样品垫相互压叠，贴于PVC底板上，切割为宽3mm、长6.5cm的试纸条，装入卡壳，置于干燥环境密封备用。
S5，拉曼免疫层析试纸条的性能考察
轮状病毒拉曼免疫层析试纸条灵敏度检测
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒国家标准品，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
轮状病毒拉曼免疫层析试纸条参考品检测
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阳性国家标准品：G2亚型轮状阳性国家标准品（P1）、G3亚型轮状阳性国家标准品（P2）、G4亚型轮状阳性国家标准品（P3）、G8亚型轮状阳性国家标准品（P4）、G9亚型轮状阳性国家标准品（P5），及使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型（N1）、肠道病毒71型（N2）、大肠杆菌（N3）、大肠杆菌（N4）、副伤寒甲型沙门氏菌（N5）、副伤寒乙型沙门氏菌（N6）、副伤寒丙型沙门氏菌（N7）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（N8）、金黄色葡萄球菌（N9）,各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
轮状病毒拉曼免疫层析试纸条特异性检测
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、大肠杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
轮状病毒拉曼免疫层析试纸条重复性检测
制备八批次轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
轮状病毒拉曼免疫层析试纸条临床样品检测
为了验证制备的拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒的有效性与灵敏性，检测了85例轮状病毒临床阳性样品和7例阴性样本进行验证，各取60μL逐滴加入至试纸条，10分钟左右观察结果，拉曼光谱检测仪检测拉曼信号。
1.8 荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比
首先对轮状病毒基因进行多重序列比对，设计2对引物探针用于基因序列扩增，提取轮状病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等。之后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品。最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，进行对95例实际样本进行荧光PCR定量检测。荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测95例临床样本结果与拉曼免疫层析试纸条检测结果进行对比。
试验结果
拉曼标记分子的表征
在本实验中，以粒径为25nm左右的Au NPs作为基底。将拉曼分子DTNB修饰到Au NP表面，加入硝酸银形成Au/DTNB@Ag。再修饰拉曼分子DTNB于金核银壳上形成Au/DTNB@Ag/DTNBNPs。
Au NPs、Au/DTNB NPs、Au/DTNB@Ag NPs和Au/DTNB@Ag/DTNB NPs四类纳米材料的紫外光谱表明，Au NPs的吸收峰出现在波长525nm附近，Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的吸收峰偏移18nm。根据1331cm-1拉曼位移处的峰值来比较拉曼信号的强弱，观察可得Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的SERS信号强度为Au/DTNB NPs的两倍。
拉曼免疫层析试纸条的灵敏度检测结果
基于双层拉曼分子的SERS拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒国家标准品结果，可以观察到检测低稀释倍数的轮状病毒国家标准品时，检测线上形成可视化的红色线条；随着稀释倍数的增加，检测线上的颜色逐渐变浅，检测浓度低于稀释5000倍时，观察不到检测线，得出结论：基于双层拉曼分子的SERS拉曼免疫层析检测轮状病毒试纸条工作良好，且可视化信号为稀释浓度5000倍。检测不同稀释倍数的SERS光谱，可以观察到随着稀释倍数的增加，拉曼信号逐渐变弱，当稀释倍数为50000倍时，1331cm-1拉曼位移处的主峰显著高于阴性，且根据公式:LOD=Vblank+3SDblank，可得最低检测限的主峰信号为：1441.91。因此基于双层拉曼分子的SERS拉曼免疫层析检测轮状病毒的检测限为稀释浓度50000倍。通过绘制轮状国家标准品稀释浓度与1331cm-1拉曼位移处的主峰SERS信号强度之间的校正曲线，在稀释倍数为10倍至100000倍之间具有良好的线性关系（R2=0.995），误差线代表了五次独立检测拉曼信号的标准偏差。
拉曼免疫层析试纸条的重复性检测结果
用同一批十根试纸条检测稀释100倍轮状病毒国家标准品结果，证明：该试纸条批内重复性良好。用八批SERS拉曼免疫层析试纸条检测稀释100倍轮状病毒国家标准品的结果显示：该试纸条批间重复性良好。
拉曼免疫层析试纸条国家标准品检测结果
根据轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒国家标准品结果，检测柯萨奇病毒A16(N1)、肠道病毒71型(N2)、大肠杆菌(N3)、大肠杆菌(N4)、副伤寒甲型沙门氏菌(N5)、副伤寒乙型沙门氏菌(N6)、副伤寒丙型沙门氏菌(N7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(N8)、金黄色葡萄球菌(N9)与G2亚型轮状阳性国家标准品(P1)、G3亚型轮状阳性国家标准品(P2)、G4亚型轮状阳性国家标准品(P3)、G8亚型轮状阳性国家标准品(P4)、G9亚型轮状阳性国家标准品(P5)的SERS拉曼免疫层析试纸条
结果，可以观察到: N1-N10只有控制线上形成可视化的红色线条，P1- P5检测线上形成可视化的红色线条；通过十五种种轮状病毒阳性国家标准品的SERS光谱，N1-N10：1331cm-1拉曼位移处均未有明显主峰P1- P5：1331cm-1拉曼位移处的主峰信号均高于1441.91。结果显示：该试纸条国家标准品检测结果符合率100%。
拉曼免疫层析试纸条对临床样品的检测结果
轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒临床样品结果及检测轮状病毒临床样品的试纸条图片，阳性组1-10号标本的检测线与控制线为肉眼可见的红色，阴性组1-7号标本仅有肉眼可见的一条红色控制线。通过检测轮状病毒临床样品的SERS光谱，阳性组所有的拉曼信号在1331cm-1处都有明显峰值，阴性组都无明显信号，阳性组的拉曼信号都明显高于阴性组，并且高于临界值1441.91。得出结论：轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，临床阳性标本检出率为100%。
轮状病毒荧光定量PCR检测结果
拉曼免疫层析检测结果与荧光定量PCR检测结果比较
经荧光定量PCR及拉曼免疫层析试纸条检测，该试纸条特异性为100%，两种方法符合率为100%。
由上述试验可知，本发明实施检测的基本原理为：
首先，合成双层拉曼分子标记的金核银壳纳米材料（Au/DTNB@Ag/DTNB NPs），在此材料上修饰轮状病毒抗体，制备出SERS检测探针。SERS-免疫层析试纸条由吸水纸1、样品垫2、结合垫3与硝酸纤维素膜4及底板5组成。结合垫上固定制备好的轮状病毒SERS检测探针，硝酸纤维素膜是固定检测线（RV抗体）与控制线（羊抗鼠IgG）。当含有轮状病毒的样品滴加在样品垫上后，溶液在结合垫上发生特异性识别与结合，在层析作用下经过结合垫到达控制线，与控制线上特异性RV抗体识别捕获，形成复合物，剩余的SERS检测探针继续移动到达控制线6，被羊抗鼠IgG捕获，在控制线7与检测线上的SERS检测探针累积显现可视化的两条红色线条。当只有控制线显现红色线条时，证明该样品中没有轮状病毒的存在，检测线出现红色线条代表该试纸条体系完整良好。
本一方面本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中；另一方面本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在轮状病毒的早期检测中具有广阔的应用和推广前景。
以上内容是对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims (10)

1.一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法包括以下步骤：
S1，轮状病毒抗体分组，将获得的一对轮状病毒抗体所包含的轮状病毒标记抗体和轮状病毒捕获抗体两个轮状病毒抗体进行独立存放备用；
S2，制备纳米材料，首先选择S1步骤其中一个轮状病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20—35nm的Au NPs胶体金溶液；然后在Au NPs胶体金溶液中加入8—12mM的DTNB，搅拌反应3—6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到Au/DTNB NPs；最后取Au/DTNB NPs搅拌加热至煮沸，加入0.5—1.5%（w/v）的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5—1.5mM硝酸银溶液，持续沸腾10—20分钟，得到Au/DTNB@Ag NPs，再向Au/DTNB@Ag NPs中加入10mM的DTNB，搅拌反应3.5—5.5h，即可得到Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料；
S3，制备SERS标记检测探针，首先向S2步骤制备的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs纳米材料中加入EDC和NHS进行活化，活化后离心弃上清，然后用1.5—2.8mM的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入轮状病毒抗体孵育1.3—2.5h；然后加入BSA进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用SERS检测探针复溶液重悬，即制备得到轮状病毒特异性SERS标记分子，然后对轮状病毒特异性SERS标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20—40℃恒温环境下干燥3h后，得到SERS标记的轮状病毒抗体检测探针；
S4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将S1步骤剩余的另一个轮状病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30—40℃恒温环境下干燥，其中轮状病毒抗体检测探针作为检测线（T），羊抗鼠抗体作为质控线（C），然后将干燥后的硝酸纤维素膜与S3步骤制备的含SERS标记的轮状病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在PVC底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
S5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对S4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对S4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对S4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测。
2.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S3步骤中，EDC使用量为2.0—3.5μL；NHS使用量为2.0—3.5μL ；BSA使用量为90—120ml；所述S4步骤中轮状病毒抗体检测探针稀释后浓度为0.3—0.7mg/mL；羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3—0.7mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S4制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及PVC底板。
4.根据权利要求1或3所述的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述试纸条优化宽度为2—4cm，优化长度为5—10厘米。
5.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S5步骤中，灵敏度检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒国家标准品，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
6.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S5步骤中，特异性检测的具体方法为：
使用试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型、大肠杆菌、大肠杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
7.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S5步骤中，重复性检测的具体方法为：
制备八批次轮状病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释轮状病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
8.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S5步骤中稳定性检测的具体方法为：
使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阳性国家标准品：G2亚型轮状阳性国家标准品（P1）、G3亚型轮状阳性国家标准品（P2）、G4亚型轮状阳性国家标准品（P3）、G8亚型轮状阳性国家标准品（P4）、G9亚型轮状阳性国家标准品（P5），及使用轮状病毒拉曼免疫层析试纸条检测轮状病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒A16型（N1）、肠道病毒71型（N2）、大肠杆菌（N3）、大肠杆菌（N4）、副伤寒甲型沙门氏菌（N5）、副伤寒乙型沙门氏菌（N6）、副伤寒丙型沙门氏菌（N7）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（N8）、金黄色葡萄球菌（N9）,各取60μL逐滴加入至试纸条上；10-15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
9.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S5步骤中，临床样品检测的具体方法为：
通过对若干例轮状病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μL逐滴加入至试纸条，并静置8—20分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可。
10.根据权利要求1或9所述的一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测轮状病毒的方法，其特征在于，所述S5步骤中，在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量PCR与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
首先对轮状病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取轮状病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行RT-PCR进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有Buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字PCR扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光PCR定量检测，并在荧光PCR定量完成后，将荧光定量PCR检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
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