CN112540070A - 用于体液中抗癌药物检测的试纸盒及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物检测技术领域，具体公开了一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒及其制备和使用方法。本发明提供了试纸盒包括试纸和检测盒，试纸包括纸尖以及与纸尖连接的尾芯，纸尖沉积金属纳米材料作为SERS基底，用以增强拉曼散射的信号，试纸盒包括进样器和盒体，盒体设置有用于放置试纸的斜坡和用于放置进样器的空腔，所述斜坡连通，试纸的纸尖放置在斜坡上，尾芯正好置于所述进样器的下方；本发明制作简单，成本低廉，无需笨重设备和无菌条件，并且制作出的这种试纸盒体积小、结构紧凑，便于携带，并且试纸盒的在使用过程中耗时短，操作方便、简单，促进了SERS检测的标准化和一体化，此方法还可以使药物的预浓缩效果明显提高，检测灵敏度高。

Description

用于体液中抗癌药物检测的试纸盒及其制备和使用方法

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，尤其涉及一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒及其制备和使用方法。

背景技术

生物液体中的药物检测一直是临床诊断的重要内容，目前已存在多种检测技术，如高效液相色谱法、免疫分析法、液相色谱-质谱法(LC-MS)等，可以对生物液中的药物进行较为准确的测量和定量，由于它们的多仪器协作和多步操作，不仅增加了引入人为错误的风险，而且致使他们的应用被局限在实验室中。一方面，由于生物体液组成复杂，检测生物体液中的特定物质通常需要一些复杂的预处理过程，如纯化、预浓缩等，这就涉及到离心、色谱柱等多种预处理仪器；另一方面，检测仪器往往体积庞大，而且需要昂贵的试剂、耗时的样品制备和操作人员的专门知识，在这种情况下，不仅阻碍了药物检测的临床应用，也制约了即时药物检测设备的发展，因此，急需开发一种体积小、结构紧凑，便于携带，并且制作简单，成本低廉，操作简单的检测设备。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其包括试纸和检测盒；所述试纸包括纸尖以及与纸尖连接的尾芯，所述纸尖沉积金属纳米材料作为SERS基底，用以增强拉曼散射的信号；所述检测盒包括进样器和盒体，所述盒体设置有用于放置试纸的斜坡和用于放置进样器的空腔，所述空腔与所述斜坡连通；所述试纸的纸尖放置在斜坡上，尾芯正好置于所述进样器的下方。

进一步的，所述试纸的纸尖角度为大于5°的锐角；所述用于放置试纸的斜坡坡度角为锐角。

进一步的，所述试纸采用滤纸制作，其纸尖角度为10°；所述用于放置试纸的斜坡坡度角为30°。

进一步的，所述金属纳米材料为金或者银，所述金属纳米材料的形状为纳米线、纳米棒、纳米颗粒、纳米星或者纳米片的一种，其沉积在纸尖的浓度为0-8mg/mL。

进一步的，所述进样器包含漏斗形的进样口、出样口，所述进样口的直径大于出样口；用于放置进样器的空腔底部靠近斜坡的一边设置有一条凹槽。

进一步的，所述检测盒还包括有防尘盖和废液池，所述防尘盖可拆卸密封扣合在进样器上端，并且在对应进样器进样口处设置有进样孔；所述废液池设置在所述盒体的用于放置试纸的斜坡下方。

本发明还提供了一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的制备方法，包括以下步骤：

S101：制作试纸，取一张白纸，并在纸上一处沉积等离子纳米材料，并裁剪出纸尖和尾芯，使纸尖处带有沉积的等离子纳米材料；

S102：制作检测盒，采用3D打印技术，依次打印出所述检测盒的防尘盖、进样器、以及盒体；打印的盒体包含有用于放置试纸的斜坡和用于放置进样器的空腔，所述空腔与所述斜坡相连通，盒体在斜坡的下方还设置有废液池；

S103：装配，将3D打印完成的进样器放入所述盒体的空腔内，将试纸放置在斜坡上，所述试纸的纸尖朝下，尾芯位于进样器出样口的下方，最后在所述进样器上方扣上防尘盖，装配完成，即可用于体液中抗癌药物的检测。

本发明还提供了一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的使用方法，包括以下步骤：

S201：将样品溶液从防尘盖的进样孔中滴入，由进样器的出样口流出并滴在试纸的尾芯上，样品溶液在纸张毛细效应和重力的共同作用下由尾芯汇聚通过纸尖，滴进废液池，药品吸附在纸尖完成预浓缩；

S202：完成样品溶液的预浓缩以后，将放置有试纸的检测盒整体移动到干燥通风的地方进行干燥；

S203：干燥结束后，采用便携式拉曼光谱仪对所述试纸的纸尖进行SERS检测，最后对检测结果进行定量分析。

进一步的，所述步骤S202中，干燥时间为40分钟。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其试纸的纸尖沉积金属纳米材料作为SERS基底，可以增强拉曼散射的信号，使得用于检测时灵敏度更高，生化信息充足、检测速度更快；盒体空腔内的进样器可以使样品溶液缓慢而均匀地释放在试纸上；另外，盒体上设置的用于放置试纸的斜坡，利用试纸本身的毛细管力和重力的作用，使得纸尖聚集更多样品溶液，提高预浓缩性能；最后，防尘盖可拆卸密封扣合在进样器上，既可以稳定进样器，而且可以达到防尘的效果，防止样品溶液在测试过程中被污染，废液池的设计，使得从纸尖溢出的多余溶液得以回收。

(2)本发明提供的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的制作方法，采用3D打印技术制作，可以手工组装防尘盖、进样器、以及盒体部分，制作简单，成本低廉，无需笨重设备和无菌条件，并且制作出的这种试纸盒体积小、结构紧凑，便于携带。

(3)本发明提供的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的使用方法，可以在短时间内完成样品预浓缩、样品干燥、测量分析过程，相对于现有技术中多种协作、多步操作，本操作方法整个过程耗时短，操作方便、简单，促进了SERS检测的标准化和一体化，并且预浓缩的效果明显提高，使得检测灵敏度高，另外，其还可检测血液或者尿液中的多种药物。

附图说明

图1a：本发明的用于体液中抗癌药物检测的试纸盒剖视示意图；

图1b：本发明的用于体液中抗癌药物检测的试纸盒示意图；

图2a：本发明的试纸示意图；

图2b：本发明的防尘盖示意图；

图2c：本发明的进样器示意图；

图3：本发明样品在试纸上完成预浓缩的原理示意图；

图4a：10°纸尖不同区域的荧光图像(标尺为200μm)；

图4b：滴下荧光素染料(2μM，200μ)后不同角度的纸尖荧光图像(2μM，200μL，标尺为200μm)；

图4c：纸尖的不同区域的样品增强倍数；

图4d：具有不同角度的纸尖的样品增强倍数；

图5a：不同盒体斜坡角度时样品增强倍数；

图5b：不同半径的进样器的漏液时间和增强倍数的比较；

图5c：进样器具有不同角度的斜坡时，10°纸尖的荧光图像；

图5d：盒体具有不同角度的斜坡时，10°纸尖的荧光图像；

图6a-6d：基于纸尖的SERS基底在不同浓度的AgNWs(标尺为10μm)下的低倍SEM图像；

图7a-7b：基于纸尖的SERS基底在不同浓度的AgNWs(标尺为2μm)下的高放大倍率SEM图像；

图8：试纸盒一体化检测过程示意图；

图9：不同浓度AgNWs的纸尖SERS基底侧视图的SEM图像:0mg/mL(a)、1mg/mL(b)、2mg/mL(c)和4mg/mL(d)(标尺为100μm)；

图10：具有不同浓度的AgNWs的纸尖SERS基底上的SERS光谱：0mg/mL(a)，1mg/mL(b)，2mg/mL(c)和4mg/mL(d)；

图11：不同浓度在1175cm^-1处的相应平均峰面积：0mg/mL(a)，1mg/mL(b)，2mg/mL(c)和4mg/mL(d)(n＝10)；

图12：在1175cm^-1(n＝10)时，不同浓度Ag NWs在纸尖基底上10^-5MCV的平均峰面积；

图13：FDTD仿真(a，b，c)显示了不同数目的AgNWs周围的局部电场分布：2个AgNWs(a)，4个AgNWs(b)，6个AgNWs(c)；

左侧图像中标记区域的局部放大图(d，e，f，g，h，i)：2个AgNWs(d)，4个AgNWs(e，f)，6个AgNWs(g，h，i)；

图14a：本发明试纸盒(标尺为1mm)滴入环磷酰胺钠盐溶液后不同时间(2min、5min、10min、20min、30min、40min、50min)的纸尖照片；

图14b：不同干燥时间收集10^-5MCV的SERS光谱；

图14c：不同干燥时间平均峰面积1175cm^-1(n＝5)；

图15a：不预浓缩测量示意图；

图15b：预浓缩测量示意图；

图15c：增强的预浓缩测量(本发明的方法)示意图；

图15d：通过不预浓缩测量CV的SERS光谱；

图15e：通过预浓测量的CV的SERS光谱；

图15f：通过增强的预浓测量获得CV的SERS光谱；

图15g：三种方法在1175cm^-1处CV的平均峰面积的比较；

图15h：三种方法在1175cm^-1处CV的平均峰RSD的比较；

图16a：在一次操作收集10个10^-5MCV的光谱；

图16b：10个CV光谱在1175cm^-1处的峰面积；

图16c：在10个独立实验中收集CV的SERS光谱；

图16d：各试验在1175cm^-1处的平均峰面积(n＝5)

图17a：使用试纸盒检测LOD的不同浓度的盐酸表柔比星和血清的SERS光谱；

图17b：LOD检测的平均峰面积(n＝5)；

图17c：盐酸表柔比星的SERS光谱，浓度为8×10^-7至1×10^-5M；

图17d：使用1244cm^-1处的平均峰面积获得的逻辑校正曲线；

图18：采用纸尖基底吸收牛血清的SERS光谱，随机收集的五个光谱的平均值；

图19：用于所有实验的纸尖基材上吸收的人造尿液的SERS光谱；

图20a：不同摩尔浓度的盐酸表柔比星和人工尿液吸附在纸尖基底上的LOD检测SERS光谱；

图20b：用于LOD检测的SERS峰面积(n＝5)；

图20c：合适的范围内的盐酸表柔比星的SERS光谱；

图20d：使用在1244cm^-1处的平均峰面积获得的校准曲线；

图21a：在合适范围内的环磷酰胺SERS光谱；

图21b：1317cm^-1处平均峰面积的校准曲线；

图22a：盐酸表柔比星、环磷酰胺及其混合物在血清中的SERS光谱；

图22b：混合药物(盐酸表柔比星与环磷酰胺混合物)的回收检测SERS光谱；

图23：荧光试剂在不同浓度下的图像:4μM(a)、6μM(b)、20μM(c)、30μM(d)和40μM(e)；

图24：荧光染料的灰度值与浓度(4μM～40μM)的线性关系图。

附图标记说明：

1-试纸；101-纸尖；102-尾芯；2-进样器；201-进样口；202-出样口；3-盒体；301-用于放置试纸的斜坡；302-斜坡的坡度角；303-用于放置进样器的空腔；304-废液池；305-凹槽；4-防尘盖；401-进样孔。

具体实施方式

为了使本发明的方案更加清楚，下面将结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例提供了一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，如图1a-1b所示，其包括试纸和检测盒；试纸包括纸尖以及与纸尖连接的尾芯，纸尖沉积金属纳米材料作为SERS基底，用以增强拉曼散射的信号，并可以实现对生物体液中药物的预浓缩(参考图2a)，上述金属纳米材料可以是金或者银，其形状为纳米线、纳米棒、纳米颗粒(纳米球)、纳米星、纳米片等；试纸盒包括防尘盖(参考图2b)、进样器(参考图2c)和盒体，盒体设置有用于放置试纸的斜坡和用于放置进样器的空腔，空腔与斜坡连通，斜坡的坡度为锐角，斜坡下方还设置有废液池，用于收集从纸尖滴下的废液；进样器包含漏斗形的进样口、出样口，并且进样口的直径大于出样口，这样可以保证样品溶液的流下速度适中，既不会因为流速过快而无法在纸尖聚集，也不会因为流速过慢而不能使样品溶液达到纸尖，用于放置进样器的空腔底部靠近斜坡的一边设置有一条凹槽，使得样品溶液从试纸的尾芯流向纸尖时，不会在空腔与斜坡接触的位置聚集；防尘盖可拆卸密封扣合在进样器上端，并且在对应进样器进样口处设置有进样孔，使溶液可以通过防尘盖的进样孔加入到进样器中，其作用既可以稳定进样器，防止其晃动，而且可以达到防尘的效果，防止样品溶液在测试过程中被污染，测试时，试纸的纸尖放置在斜坡上，尾芯正好置于进样器出样口的下方(参考图1a)。

本实施例还提供了上述用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的制备方法，按照以下步骤进行(参考图3)：

第一步，制作试纸，取一张白纸，也可以是滤纸等吸水性好的材料，并在纸上的一处沉积等离子纳米材料，然后裁剪出纸尖和尾芯，使纸尖处正好带有沉积的等离子纳米材料；

第二步，制作检测盒，采用3D打印技术，依次打印出上述检测盒的防尘盖、进样器、以及盒体；打印的盒体包含有用于放置试纸的斜坡和用于放置进样器的空腔，空腔与所述斜坡相连通，斜坡下方还包含有废液池；

第三步，装配，将3D打印完成的进样器放入所述盒体的空腔内，将试纸放置在斜坡上，纸尖朝下，尾芯正好位于进样器出样口的下方，最后在进样器上方扣上防尘盖，装配完成，即可用于体液中抗癌药物的检测。

本实施例同时提供了上述制备方法制备的用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的使用方法(参考图8)，按照以下步骤进行：

首先，将样品溶液从防尘盖的进样孔中滴入，样品溶液会由进样器的出样口流出并滴在试纸的尾芯上，并且在纸张毛细效应和重力的共同作用下从尾芯驱动聚集在纸尖，完成预浓缩(如图3，为样品溶液在纸尖处预浓缩示意图)；

接着，在完成样品溶液的预浓缩以后，将放置有试纸的检测盒整体移动到干燥通风的地方进行干燥，干燥时间大概为40分钟左右；

最后，干燥结束后，采用便携式拉曼光谱仪对所述试纸的纸尖进行SERS检测，最后对检测结果进行定量分析。

实施例2：

为了使本发明的有益效果更加明显，本实施例做了四组对比实验，以挑选最优方案。

实验1：在实施例1的基础上，制作纸尖长40mm，初始宽度为6.6mm，尾芯长度为10mm，纸尖角度为10°(如图2a)的试纸，并同时制备纸尖角度为15°、20°、25°、30°的试纸分别进行实验；按照实施例1中的使用方法，将样品溶液加到各个角度纸尖的试纸上时，样品溶液在毛细管作用和重力沿斜坡方向的分量作用下，在纸尖处聚集，加入重力分量的矢量，驱动更多的溶液到纸尖，吸附更多的样品，进而提高预浓缩，另外，残留溶液直接快速地进入废液池，缩短了后期干燥时间；为了定量评价纸尖预浓缩能力，研究了纸尖上荧光素溶液浓度与荧光图像灰度值的关系，圆形滤纸浸泡在不同浓度荧光素溶液后的图像见图23，显然，随着染料浓度的增加，图像变得更亮；图24给出了一个线性函数，适用于不同浓度的荧光素染料，范围从4μM到40μM，相关系数较高(R²>0.99)。干燥完成后，对纸尖角度为10°的试纸不同区域和每个角度纸尖的区域均进行荧光素溶液表征，其荧光图像如图4a和图4b所示，其样品增强倍数如图4c和图4d所示，由图像可知，纸尖角度为10°的试纸，不同区域的样品浓度不同，其纸尖附近有更多的荧光素分子，图像变得更亮，因此，增强倍数随着区域靠近尖端而增加，另外，增强倍数会随着纸尖角度的增大而减小，其中增强倍数最大出现在10°的纸尖处。

实验2：在实施例1的基础上，采用3D打印制作测试盒，其盒体长约65mm、宽22mm、高49mm，其进样器(如图2c)的漏斗形进样口上端的半径约6mm，进样口下端到出样口的半径变化设置三组，从0.5mm到0.2mm，从0.6mm到0.3mm，从0.7mm到0.4mm，按照实施例1的使用方法完成后，对各组试纸纸尖上的样品浓度进行测量，结果如图5a所示，另外，上述各个进样器尺寸的纸尖进行了荧光素溶液表征，如图5c所示；将用于放置试纸的斜坡坡度分别设为20°、25°、30°、35°、40°时进行实验，纸尖的样品溶液的增强倍数，如图5a所示，增强倍数随着试纸盒斜坡角度的斜率的增大呈现先增大后减小的趋势，这种现象可以归因于在这种情况下沿着斜坡的重力分量矢量适当，由于试纸盒斜坡倾斜角小，毛细管作用无法驱动足够的溶液到针尖进行样品吸收，对于较高的倾斜度，使样品迅速远离尖端部位，随着进样器的半径在30°试纸盒斜率下增大，漏液时间和增强倍数迅速减小(如图5b)，其中试纸盒斜率为30°时增强倍数最大，对上述各个坡度的纸尖进行了荧光素溶液表征，结果如图5d所示。

通过上述几组对比实验可知，当试纸盒斜坡的倾斜角为30°，进样器为0.5→0.2mm时，选取该条件进行进一步研究，10°纸尖处的增强倍数最高，达到18.13倍；与现有技术相比，该试纸盒可以摆脱复杂的预处理过程，在上述最优的条件下对样品进行18.13倍的预浓缩，具有很好的检测限。

实验3：金属纳米材料在纸基SERS基底中起着重要的作用，本实验采用AgNWs(银纳米线)作为沉积的SERS基底，探讨浓度对SERS效果的依赖性。

SERS基底的低倍和高倍扫描电子显微镜(SEM)图像如图7-8所示，显示了AgNWs在0-4mg/mL范围内的SERS基底形貌；在图7a和图8a中可以清楚地观察到纤维素纤维，当1mg/mL的AgNWs沉积在纸尖上时(图7b和8b)，不足以完全覆盖纸张，随着浓度的增加，AgNWs相互交织形成密集的三维网，完全覆盖在纸上(如图7c、7d、8c、8d)，说明在叶尖表面可以分布大量的“热点”，与之对应，沉积的AgNWs纸基SERS基底断面SEM图像如图9所示，沉积的AgNWs浓度从0到4mg/mL，纸张的厚度约为94.3μm(纯纸尖)，134.9μm，151.4μm和164.0μm，分别(图9a，9b，9c和9d)，表现出其密度与AgNWs浓度一致的趋势。

为了评价纸基的SERS性能，我们使用10^-5MCV作为SERS模型分子测量增强的拉曼信号，不同浓度AgNWs沉积在底物1175cm^-1处的SERS光谱和平均峰面积分别如图10-11所示，结果表明，当AgNWs浓度为2mg/mL时，得到的峰面积为471374，RSD为9.14％，表明纸基底具有良好的拉曼信号增强性能。

如图12所示，测试了更多不同浓度AgNWs沉积的底物，结果表明，随着AgNWs浓度的增加，光谱信号的强度呈现先升高后降低的趋势，最后选择AgNWs为2mg/mL的底物进行进一步的SERS测量。

为进一步评价该试纸盒的SERS性能，增强因子(EF)由式(1)计算：

I_SERS和I_bare分别表示CV分子在1175cm^-1的试纸盒和裸硅片上的SERS峰面积，c_SERS和c_bare分别为吸附在上述底物上的CV分子浓度，如表1所示，EF被计算为1.11×10⁵。

为了更好地理解AgNWs的增强机理，采用时域有限差分(FDTD)方法进行了局部电场模拟，根据上述SEM图像，将AgNWs建模为间隙为1nm的垂直线，设定长度为21μm，直径为148nm；不同数目AgNWs的模拟结果如图13所示，其中镶嵌描绘了银纳米线的三维几何形状；由于图13a、13b、13c的局部电场分布相似，因此随机选取区域放大显示，图13a、13b、13c分别为2、4、6条纳米线，分别有一条垂直线和多条水平线。

表1评估试纸盒SERS增强因子的相关参数

结果表明，在缝隙之间和银纳米线周围存在明显的局域电场分布，表明“热点”主要出现在这些位置，是局部表面等离子体共振效应的结果，这部分解释了AgNWs网的增强机制；通过对局域电场分布图像的定量计算，|E/E0|总强度分别为46355、87033和126547，显示了较好的AgNWs增强效果。

实验4：为了证明本发明的试纸盒的SERS检测能力，还进行了干燥时间实验、不同测量方法的比较、稳定性和重复性实验；本实验通过观察纸尖处环磷酰胺钠盐溶液随时间的变化，并测量不同干燥时间下CV的SERS光谱，研究了纸基底的干燥程度与SERS性能的关系。

如图14a所示，随着时间的推移，纸尖逐渐变亮，并且在40分钟后没有明显的差异，表明整个干燥时间约为40分钟；图14b表明，在连续干燥过程中收集到的10^-5MCV的SERS光谱强度存在明显差异，计算这些SERS光谱在1175cm^-1处对应的平均峰面积，如图14c所示，平均峰面积在40分钟前迅速增加，在40分钟和60分钟时分别为462694和493109，说明没有显著差异，这与上面的结论一致。

结果表明，40分钟的干燥时间足以使SERS增强效果良好，缩短了检测时间。具体来说，液体样品在干燥条件不充分的情况下，由于布朗运动而游离在AgNWs表面，导致SERS信号较弱，随着干燥，样品逐渐附着在表面，SERS信号增强。

为了进一步验证本发明的试纸盒的有益效果，图15a-15b显示了两种不同测量方法的SERS能力比较。第一种(图15a)为非预浓缩测量，以圆纸为底物，将样品滴在纸的一边，另一边检测样品(图15a)，滴入200μLCV溶液，干燥40分钟后，检测非预浓缩法CV的SERS光谱(图15d)；第二种(图15b)是预浓缩测量，将纸尖平放，将样品滴在纸芯上，在纸尖处检测样品(图15b)，在滴入等量CV溶液并同时干燥后，采集预浓缩法CV的SERS光谱(图15e)。值得注意的是，我们的试纸盒是一种增强的预浓度测量方法(图15c)，同样操作后，检测本发明的试纸盒测量CV的SERS光谱(图15f)。三种测量方法在1175cm^-1处的平均峰面积及对应的RSD比较分别如图15g和15h所示。

图15g显示三种方法的平均综合峰面积分别为47607、61454和472703，这意味着与其他两种方法相比，本发明的试纸盒分别增强了9.93倍和7.69倍；图15h显示对应的RSD分别为6.46％、14.81％和9.31％。

结果表明，该试纸盒的RSD值与其他两种方法的RSD值相差较大，具有良好的稳定性，试纸盒的出色增强效果可归因于沿试纸盒斜坡的重力分量矢量所引起的增强的预浓缩作用；对于非预浓缩法，圆形纸不提供预浓缩作用；对于预浓缩法，当试纸盒的斜坡为0°时是一种特例。因此，与其它两种方法相比，该试纸盒提高了预浓缩作用；通过在单个实验中检测10^-5MCV的SERS信号，进一步评估了本实验的试纸盒的稳定性，如图16a和16b所示，随机收集了10个CV的SERS光谱，并计算了1175cm^-1处的峰面积，十个光谱的平均积分面积和RSD分别为466179和8.06％，进一步证明了其良好的稳定性。

本发明的试纸盒在拉曼信号上的可重复性是SERS测量的另一个重要因素。如图16c和16d所示，进行了十次独立实验以研究每个实验之间的差异，在每个实验中，随机收集十个光谱，并用于计算峰面积的平均值和RSD；十个实验的平均面积和RSD分别为485092和8.26％，证明试纸盒是有前途的液体SERS检测的工具。

通过以上4个实验，进一步验证了本发明的试纸盒的稳定性和可重复性，并确认该试纸盒出色的SERS能力，从而显著促进了液体样品的检测。

实施例3：

生物体液中抗癌药物的检测对临床化疗具有重要意义，但现有的检测技术仍然停留在耗时的实验室研究中，盐酸表柔比星和环磷酰胺是临床上广泛应用的抗肿瘤药物，在本实施例中，采用本发明的用于体液中抗癌药物检测的试纸盒以及其制备和使用方法的结合，来快速直接地定量测定牛血清和人工尿液中的盐酸表柔比星，以及牛血清中的环磷酰胺及盐酸表柔比星和环磷酰胺的混合物，进一步证明本发明的有益效果。

本实施例在实施例1和实施例2的基础上，在未进行其他预处理的情况下，使用本发明的试纸盒及其使用方法进行直接预浓缩，来检测血清中盐酸表柔比星，其SERS光谱如图17a和17c所示，标记区域为O-H在1244cm^-1处的一个峰，表明存在盐酸表柔比星；使用本试纸盒获得牛血清的SERS光谱，如图18所示，血清中可以识别出一些重要的峰，包括1697cm^-1处的酰胺I、1591cm^-1处的酰胺II、718cm^-1处的色氨酸等。由于1244cm^-1的血清光谱中没有峰，因此该波数可以清晰地从血清信号中分离出盐酸表柔比星的特征拉曼峰，选择1244cm^-1计算峰面积并拟合校准曲线(作为检测背景，牛血清的SERS强度较弱，不影响药物的检测)。盐酸表柔比星血清5×10^-8M至5×10^-5M的SERS光谱(图17a)显示，盐酸表柔比星的LOD为5×10^-8M，灵敏度与LC-MS相当。这可能是由于纸的层析作用，与血清中其他大分子相比，更多的盐酸表柔比星小分子聚集在纸张尖端，对应的平均峰面积如图17b所示。

为了准确定量，对在血清中浓度为8×10^-7M-5×10^-5M的盐酸表柔比星的SERS光谱进行检测，如图17c所示，逻辑校准曲线适用于这个大的浓度范围，R²为0.99(图17d)。从8×10^-7M到1×10^-5M的线性拟合R²为0.97(图17d)，说明该试纸盒可以在低浓度下直接定量血清中的药物。虽然在低浓度下具有良好的线性特性，但由于基底表面有限的吸收能力，该逻辑曲线在2×10^-5M时开始饱和。

用该试纸盒检测人工尿液中的盐酸表柔比星，图19观察人工尿液的SERS光谱，其中O＝C-N在665cm^-1处的拉曼峰变形，1452cm^-1处的色氨酸振动和1606cm^-1处的环拉伸出现；检测人工尿中不同浓度盐酸表柔比星，其检测限(LOD)为5×10^-7M(图21a)，高于血清，盐酸表柔比星在1244cm^-1处的平均峰面积见图21b，盐酸表柔比星的浓度从4×10^-6M至2×10^-5M的SERS光谱如图20c所示，利用1244cm^-1处的积分拉曼峰面积拟合校准曲线，对应浓度范围的逻辑拟合曲线显示R²为0.99(图21d)，浓度从4×10^-6M到1×10^-5M的线性拟合R²为0.95(图21)显示了低浓度人工尿液试纸盒的直接定量能力。尽管在低浓度下具有良好的线性特性，但逻辑曲线在1×10^-5M时也开始饱和，因此该试纸盒有望在更多生物液体中实现药物检测。

为了说明本试纸盒的能力，我们还检测了血清中环磷酰胺和盐酸表柔比星与环磷酰胺的混合物。首先定量检测血清中的环磷酰胺，见图20；环磷酰胺的SERS光谱(图20a)显示在1317cm^-1处有一个特征拉曼峰，可以清晰地从血清信号中分离出环磷酰胺的拉曼信号，选择1317cm^-1计算峰面积并拟合校准曲线；6×10^-4M到1.2×10^-3M的线性拟合R²为0.98(图20b)；盐酸表柔比星、环磷酰胺及其混合物的SERS光谱如图22a所示；在盐酸表柔比星和环磷酰胺各自的SERS光谱中，分别在1244cm^-1和1317cm^-1处有两个明显的拉曼峰，而这两个峰同时出现在它们混合物的SERS光谱中，说明该试纸盒可以同时检测两种抗癌药物。同时对两种混合药物进行回收检测，回收后的SERS光谱如图22b所示，可以识别出两个特征拉曼峰。计算回收率如表2所示，盐酸表柔比星回收率为108.88％，RSD为16.24％，环磷酰胺回收率为92.33％，RSD为17.29％。从检测结果可以看出，本试纸盒有望实现生物液体中多种药物的同时检测。因此，使用本发明的这种试纸盒，可以提高预浓缩和实现生物液体中药物的直接定量，与LC-MS相比，它速度更快，成本更低，携带更方便。

表2混合药物的回收检测

综上，为了克服现有技术预处理复杂的局限性，本发明将试纸纸尖集成到检测盒中，并引入重力来提高预浓缩效果；为获得较高的预浓缩能力，研究了纸尖区域和角度、进样器半径和检测盒斜坡角度对预浓缩的影响，建立了集成的SERS检测装配和操作流程程序；通过检测时间、不同测量方法的比较、稳定性和重复性以及FDTD仿真等方法评价了该试纸盒的SERS检测能力，并且，在无需额外预处理的情况下，利用该便试纸盒定量检测了牛血清和人工尿液中的盐酸表柔比星，以及牛血清中的环磷酰胺及其混合物，证明了生物液中两种药物的同时检测能力。相对于现有技术的多步骤操作，本发明的试纸盒其完整检测流程只需1小时，减少了重复实验中的人为误差，促进了SERS标准化检测；这种试纸盒将是一个强大的用于生物液体中的医疗药物检测的便携式工具，并已展示了临床应用的潜力。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其特征在于，包括试纸和检测盒；所述试纸包括纸尖以及与纸尖连接的尾芯，所述纸尖沉积金属纳米材料作为SERS基底，用以增强拉曼散射的信号；所述检测盒包括进样器和盒体，所述盒体设置有用于放置试纸的斜坡和用于放置进样器的空腔，所述空腔与所述斜坡连通；所述试纸的纸尖放置在斜坡上，尾芯正好置于所述进样器的下方。

2.如权利要求1所述的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其特征在于，所述试纸的纸尖角度为大于5°的锐角；所述用于放置试纸的斜坡坡度角为锐角。

3.如权利要求2所述的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其特征在于，所述试纸采用滤纸制作，其纸尖角度为10°；所述用于放置试纸的斜坡坡度角为30°。

4.如权利要求1所述的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其特征在于，所述金属纳米材料为金或者银，所述金属纳米材料的形状为纳米线、纳米棒、纳米颗粒、纳米星或者纳米片的一种，其沉积在纸尖的浓度为0-8mg/mL。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其特征在于，所述进样器包含漏斗形的进样口、出样口，所述进样口的直径大于出样口；用于放置进样器的空腔底部靠近斜坡的一边设置有一条凹槽。

6.如权利要求5所述的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒，其特征在于，所述检测盒还包括有防尘盖和废液池，所述防尘盖可拆卸密封扣合在进样器上端，并且在对应进样器进样口处设置有进样孔；所述废液池设置在所述盒体的用于放置试纸的斜坡下方。

7.一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S101：制作试纸，取一张白纸，并在纸上一处沉积等离子纳米材料，并裁剪出纸尖和尾芯，使纸尖处带有沉积的等离子纳米材料；

S102：制作检测盒，采用3D打印技术，依次打印出所述检测盒的防尘盖、进样器、以及盒体；打印的盒体包含有用于放置试纸的斜坡和用于放置进样器的空腔，所述空腔与所述斜坡相连通，所述盒体在斜坡的下方还设置有废液池；

S103：装配，将3D打印完成的进样器放入所述盒体的空腔内，将试纸放置在斜坡上，所述试纸的纸尖朝下，尾芯位于进样器出样口的下方，最后在所述进样器上方扣上防尘盖，装配完成，即可用于体液中抗癌药物的检测。

8.一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S201：将样品溶液从防尘盖的进样孔滴入，由进样器的出样口流出并滴在试纸的尾芯上，样品溶液在纸张毛细效应和重力的共同作用下由尾芯汇聚通过纸尖，滴进废液池，药品吸附在纸尖完成预浓缩；

S202：完成样品溶液的预浓缩以后，将检测盒移动到干燥通风的地方进行干燥；

S203：干燥结束后，采用便携式拉曼光谱仪对所述试纸的纸尖进行SERS检测，最后对检测结果进行定量分析。

9.如权利要求8所述的一种用于体液中抗癌药物检测的试纸盒的使用方法，其特征在于，所述步骤S202中，干燥时间为40分钟。

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