CN105527277A - 一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法及应用。采用Nafion作为阳离子交换剂和MWCNT对三联吡啶钌静电吸附作用以及溶胶凝胶法制备成分子印迹电化学发光传感器，实现了对雌酮的高灵敏度和选择特异性检测分析，有效克服目前检测雌酮方法的不足，对环境检测具有重要的科学意义和应用价值。本发明不仅能有效减少复杂样品中基质的干扰，提高检测雌酮的技术可靠性，同时相比于其他的免疫法、电化学方法，该方法操作简便、检测时间短并且成本更低以及检测灵敏度更高。

Description

一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米功能材料、环境检测及传感技术领域，具体涉及一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法及应用。
背景技术
环境水体内分泌干扰物对于人类健康与环境中其他生物的影响范围的渐渐扩大也引起人们对它越来越广泛的关注，这类污染物通过摄入、转化、新陈代谢、累积等各种途径对生物体起作用，它浓度低、慢性地危害于人类与其他生物体主要是通过生殖系统作用，雌酮作为典型的内分泌干扰物，其分子作用模式类似于生物体内源激素，雌酮通过受体-介导途径，结合细胞胞外受体，与启动子识别位置结合从而将雌酮转运到细胞核内进行，开始目的基因的表达，因而可以模拟、阻止或者干扰雌激素、雄性激素等内分泌过程。
雌酮等内分泌干扰物引起了许多野生生物如鱼类、两栖类、海洋哺乳动物和鸟类等出现了性器官变形和生殖紊乱、引起雌性化等病理症状，流行病理学研究发现，内分泌干扰物对人类胚胎时期的影响可能导致成年如糖尿病、心脏病甚至与生殖繁殖率下降等有关的慢性疾病。由此可见，雌酮等内分泌干扰物对生殖发育有着不可逆转的生理效应，也与人类健康密切相关，而受精卵、性未成熟的个体等更容易受到影响。
雌酮作为典型的内分泌干扰物，在环境水体中分布广、浓度低、基质复杂和对生态系统及人体潜在危害性大，因此分析雌酮时环境样品的前处理及仪器分析技术要求尤为严格，建立水体中雌酮简便、低成本、高选择性和高灵敏度的检测分析方法显得更加重要。常用的雌酮检测方法为液相色谱、气相色谱及其联用技术等，近年来，雌酮检测技术如电化学检测法和免疫法发展迅速。
CN101946005A公开了通过质谱法检测雌酮的方法。CN104849262公开了一种电化学发光传感器阵列以及制备方法及应用。CN104297305A公开了一种CdS敏化TiO2环境雌激素光电化学传感器制备方法与应用。
本发明采用Nafion作为阳离子交换剂和MWCNT对三联吡啶钌静电吸附作用以及溶胶凝胶法制备成分子印迹电化学发光传感器。
本发明提供了一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法及应用，实现了对雌酮的高灵敏度和选择特异性检测分析。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的及其制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的雌酮分子印迹电化学发光传感器用于高灵敏度检测环境中雌酮浓度。
本发明的技术方案如下：本发明所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)在离心管中分别加入四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、浓度为0.05~0.2mol/L的盐酸和超纯水组成溶胶混合液，所述的四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、浓度为0.05~0.2mol/L的HCl、超纯水的体积比为：20:6:4:20:1:20~20:6:8:20:1:20，混悬后得到均一、透明的溶胶-凝胶，得到的溶胶-凝胶即为非分子印迹聚合物；
(2)在上述非分子印迹聚合物中加入50~150mg/L的雌酮溶液，混悬后形成分子印迹聚合物，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比为5:1~15:1，在干燥条件下室温存放；
(3)称取多壁碳纳米管(MWCNT)加入浓硫酸和浓硝酸的混合液中，所述多壁碳纳米管与浓硫酸和浓硝酸的混合液的比例为8mg/12mL~15mg/12mL，所述浓硫酸与浓硝酸的体积比为2:1~5:1，所述浓硫酸的浓度为16.0~18.4mol/L，所述浓硝酸的浓度为14~16mol/L；在70~100℃加热回流后，用纯水反复洗至中性，用纤维滤纸抽滤，40~60℃真空干燥箱烘干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯下研磨成粉状储存；
(4)称取步骤（3）酸处理后的端基羧酸化的MWCNT加入二甲亚砜，超声分散后得到均一、稳定的端基羧酸化的MWCNT悬浊液；
(5)称取三联吡啶钌固体至超纯水中溶解配制成1~2mmol/LRu(bpy)3 2+溶液；
(6)在金电极表面滴2~3μL的全氟化树脂溶液（Nafion），待其室温晾干后制成Nafion电极，再滴4~6μL步骤（4）制备的端基羧酸化的MWCNT悬浊液，室温晾干制备成MWCNT/Nafion电极，将该电极置于步骤（5）配制的Ru(bpy)3 2+溶液中浸泡30~40min后取出，用超纯水将表面未吸附的Ru(bpy)3 2+溶液冲洗干净，室温晾干，得到Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极；
(7)在步骤（6）制备成Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8~10μL步骤（2）制得的分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40~50℃超纯水中磁力搅拌洗脱以去除模板分子雌酮，得到分子印迹电化学发光传感器（ECL-MIP传感器）。
在上述步骤（1）中所述的HCl浓度优选0.1mol/L；所述四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、0.1mol/LHCl和超纯水的体积比优选为20:6:6:20:1:20。
在上述步骤（1）中所加入的四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、HCl和超纯水组成溶胶混合液，通过混悬1h，得到均一、透明的溶胶-凝胶。
在上述步骤（2）中，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比优选10:1，所述雌酮溶液的浓度优选100mg/L。
在上述步骤（3）中，称取多壁碳纳米管(MWCNT)10mg加入到浓硫酸和浓硝酸的12mL混合液中，所述浓硫酸和浓硝酸体积比=3:1，持续4h的90℃加热回流，纯水反复洗至中性，用0.25μm的纤维滤纸抽滤，40℃真空干燥箱烘干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯下研磨成粉状储存。
在上述步骤（4）中，称取1.0mg酸处理后的端基羧酸化的MWCNT加入1mL二甲亚砜中，超声分散20min，得到均一、稳定的悬浊液；取2.5μL悬浊液滴涂于金电极表面，室温晾干即得MWCNT修饰的金电极。
在上述步骤（6）中，在金电极表面滴2.5μL的Nafion，待其室温晾干后制成Nafion电极，再滴5μLMWCNT悬浊液，室温晾干制备成MWCNT/Nafion电极；称取15mg三联吡啶钌固体至20mL超纯水中溶解得到1mmol/LRu(bpy)3 2+溶液，将该电极置于1mmol/LRu(bpy)3 2+溶液中浸泡30min后取出，用超纯水将表面未吸附的Ru(bpy)3 2+溶液冲洗干净，室温晾干，得到Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极。
在上述步骤（7）中，制备成Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8μL分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40℃超纯水中磁力搅拌洗脱40min，得到分子印迹电化学发光传感器（ECL-MIP传感器）。
本发明所述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学发光传感器，应用于雌酮环境内分泌干扰物的检测，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将电化学工作站与发光分析系统以及光电倍增管组合成电化学发光检测体系，并通过三电极体系进行测试，使用上述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学发光传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，在3mL、pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液配制的1mg/L雌酮溶液中检测分析；
(2)电化学工作站采用循环伏安法在-1.2~2.0V电压范围内扫描，扫描速率为0.1V/s，发光分析系统的电压值为-1000~-800V，检测得到雌酮具有增强雌酮分子印迹电化学发光传感器发光信号的作用；
(3)10μL正三丙胺作为共反应剂加入到1mg/L雌酮溶液中进行混合均匀，能极大提高雌酮分子印迹电化学发光传感器的发光信号；
(4)与步骤(2)在相同条件下将雌酮分子印迹电化学发光传感器用于检测与雌酮结构相近的雌二醇、双酚A以及壬基酚的溶液，并且加入10μL的98%正三丙胺溶液，确定雌酮分子印迹电化学发光传感器对雌酮具有特异选择功能；
(5)由步骤(2)得到的雌酮对雌酮分子印迹电化学发光传感器具有增强发光信号的作用，根据所得发光强度值与雌酮标准溶液浓度之间的线性关系，建立定量曲线；
(6)将待测水样代替雌酮的标准溶液，待测水样经0.25μm过滤，按照步骤(5)雌酮定量曲线的方法进行检测分析。
本发明所述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学发光传感器，其特征在于，所述的雌酮分子印迹电化学发光传感器能够特异性、高灵敏度识别溶液中雌酮，并且实现对水体中的雌酮分子进行现场及时快速定量检测分析。
具体地说，本发明所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其制备方法的步骤是：
(1)在离心管中分别加入四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、HCl(0.1mol/L)和超纯水组成溶胶混合液，所述的四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、HCl(0.1mol/L)、超纯水的体积比为：20:6:6:20:1:20，混悬1h后得到均一、透明的溶胶-凝胶，得到的溶胶-凝胶即为非分子印迹聚合物；
(2)在非分子印迹聚合物中加入100mg/L的雌酮溶液，混悬1h后形成分子印迹聚合物，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比为10:1，在干燥条件下室温存放；
(3)称取多壁碳纳米管(MWCNT)加入浓硫酸和浓硝酸的混合液中，所述多壁碳纳米管与浓硫酸和浓硝酸的混合液的比例为（10mg：12mL），所述浓硫酸与浓硝酸的体积比为3:1，所述浓硫酸的浓度为（16.0~18.4mol/L），所述浓硝酸的浓度为（14~16mol/L）；在70~100℃加热回流后，用纯水反复洗至中性，用纤维滤纸抽滤，40℃真空干燥箱烘干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯下研磨成粉状储存；
(4)称取1.0mg酸处理后的MWCNT加入二甲亚砜，超声分散后得到均一、稳定的悬浊液；
(5)称取三联吡啶钌固体至超纯水中溶解配制成1mmol/LRu(bpy)3 2+溶液；
(6)在金电极表面滴2.5μL的Nafion，待其室温晾干后制成Nafion电极，再滴5μL步骤（4）制备的MWCNT悬浊液，室温晾干制备成MWCNT/Nafion电极，将该电极置于步骤（5）配制Ru(bpy)3 2+溶液中浸泡30min后取出，用超纯水将表面未吸附的Ru(bpy)3 2+溶液冲洗干净，室温晾干，得到Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极；
(7)在Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8μL分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40℃超纯水中磁力搅拌洗脱40min，得到分子印迹电化学发光传感器（ECL-MIPs传感器），同样将Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8μL非分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40℃超纯水中磁力搅拌洗脱40min，得到非分子印迹电化学发光传感器（ECL-NIPs传感器），
本发明所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，应用于环境水体中雌酮的检测，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将电化学工作站与发光分析系统以及光电倍增管组合成电化学发光检测体系，并通过三电极体系进行测试，雌酮分子印迹电化学发光传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，在3mL、pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液配制的1mg/L雌酮溶液中检测分析；
(2)电化学工作站采用循环伏安法在-1.2~2.0V电压范围内扫描，扫描速率为0.1V/s，发光分析系统的电压值为-1000~-800V，检测得到雌酮具有增强雌酮分子印迹电化学发光传感器发光信号的作用；
(3)10μL正三丙胺作为共反应剂加入到1mg/L雌酮溶液中进行混合均匀，能极大提高雌酮分子印迹电化学发光传感器的发光信号；
(4)与步骤(2)在相同条件下将雌酮分子印迹电化学发光传感器用于检测与雌酮结构相近的雌二醇、双酚A以及壬基酚的1mg/L溶液，确定雌酮分子印迹电化学发光传感器对雌酮具有特异选择功能；
(5)由步骤(2)得到的雌酮对雌酮分子印迹电化学发光传感器具有增强发光信号的作用，根据所得发光强度值与雌酮标准溶液浓度之间的线性关系，即将雌酮标准品溶于甲醇，配置成高浓度的储备液，再将储备液用磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4,0.1mol/L)配置成0.1~8μg/L的六个不同系列雌酮溶液，并且在溶液中加入10μL的正三丙胺溶液，在同样条件下将磷酸缓冲溶液作为空白样进行检测，以雌酮浓度为横坐标，对应的发光峰值与空白样的发光峰值的差值为纵坐标，建立定量曲线；
(6)将待测水样代替雌酮的标准溶液，待测水样经0.25μm过滤，按照步骤(5)雌酮定量曲线的方法进行检测分析。
本发明的有益成果
1.本发明利用分子印迹溶胶凝胶法制备雌酮分子印迹聚合物，并且将分子印迹技术与电化学发光传感器结合制备成分子印迹电化学发光传感器，同时该传感器具有高选择性和高灵敏度识别环境中的雌酮分子。如图1所示本发明的（ECL-MIPs）、（ECL-NIPs）传感器在1mg/LE1溶液中电化学发光强度图，图2为ECL-MIPs传感器对1mg/L不同溶液的电化学发光图。本发明不仅能有效减少复杂样品中基质的干扰，提高检测雌酮的技术可靠性，同时相比于其他的免疫法、电化学方法，该方法操作简便、检测时间短并且成本更低以及检测灵敏度更高。
2.本发明将10μL正三丙胺作为共反应剂加入雌酮检测溶液中并混合均匀，极大提高雌酮分子印迹电化学发光传感器的发光信号，提高了该方法的检测灵敏度。
3.本发明在实际环境水体中检测雌酮的检测限为4.7ng/L,而采用经典的串联四级杆液质联用法（LC-MS/MS）在实际环境水体中检测雌酮的检测限为52ng/L。因此较其低一个数量级。
4.采用本发明方法在实际样品检测中获得检测结果与采用经典的LC-MS/MS法所得结果的相对偏差均小于8%，说明该发明方法定量结果准确。
附图说明
图1为本发明实施例一制备的ECL-MIPs传感器与ECL-NIPs传感器在1mg/L雌酮溶液中的电化学发光图。
图2为1mg/L雌酮溶液中是否加入10μL正三丙胺溶液的分子印迹电化学发光检测分析图。
图3为ECL-MIPs传感器对与雌酮分子结构相近的分子如E2、BPA、NP浓度为1mg/L溶液的基质的干扰图。
图4为ECL-MIPs传感器在不同雌酮浓度的发光图及其与发光峰值的线性关系图。
图5为分子印迹电化学发光传感器用于检测1mg/L雌酮溶液的电化学发光图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对发明进行详细说明：
1.制备方法的实施例一
(1)在离心管中分别加入四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、HCl(0.1mol/L)和超纯水组成溶胶混合液，所述的四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、HCl(0.1mol/L)、超纯水的体积比为：20:6:6:20:1:20，混悬1h后得到均一、透明的溶胶-凝胶，得到的溶胶-凝胶即为非分子印迹聚合物；
(2)在非分子印迹聚合物中加入100mg/L的雌酮溶液，混悬1h后形成分子印迹聚合物，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比为10:1，在干燥条件下室温存放；
(3)称取多壁碳纳米管(MWCNT)加入浓硫酸和浓硝酸的混合液中，所述多壁碳纳米管与浓硫酸和浓硝酸的混合液的比例为（10mg：12mL），所述浓硫酸与浓硝酸的体积比为3:1，所述浓硫酸的浓度为（16.0~18.4mol/L），所述浓硝酸的浓度为（14~16mol/L）；在70~100℃加热回流后，用纯水反复洗至中性，用纤维滤纸抽滤，40℃真空干燥箱烘干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯下研磨成粉状储存；
(4)称取1.0mg酸处理后的端基羧酸化的MWCNT加入二甲亚砜，超声分散后得到均一、稳定的悬浊液；
(5)称取三联吡啶钌固体至超纯水中溶解配制成1mmol/LRu(bpy)3 2+溶液；
(6)在金电极表面滴2.5μL的全氟化树脂溶液（Nafion），待其室温晾干后制成Nafion电极，再滴5μL步骤（4）制备的MWCNT悬浊液，室温晾干制备成MWCNT/Nafion电极，将该电极置于步骤（5）配制Ru(bpy)3 2+溶液中浸泡30min后取出，用超纯水将表面未吸附的Ru(bpy)3 2+溶液冲洗干净，室温晾干，得到Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极；
(7)在Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8μL分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40℃超纯水中磁力搅拌洗脱40min，得到分子印迹电化学发光传感器（ECL-MIPs传感器），同样将Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8μL非分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40℃超纯水中磁力搅拌洗脱40min，得到非分子印迹电化学发光传感器（ECL-NIPs传感器）如图1。
如图1所示，本发明实施例一制备的ECL-MIPs传感器与ECL-NIPs传感器在1mg/L雌酮溶液中的电化学发光图和图2为1mg/L雌酮溶液中是否加入10μL正三丙胺溶液的分子印迹电化学发光检测分析，从图2可知，正三丙胺作为共反应剂能够极大的提高发光强度，因此检测灵敏度更高。图3的ECL-MIPs传感器对与雌酮分子结构相近的分子如E2、BPA、NP浓度为1mg/L溶液，有效减少复杂样品中基质的干扰，提高检测雌酮的技术可靠性，同时相比于其他的免疫法、电化学方法，该方法操作简便、检测时间短并且成本更低以及检测灵敏度更高。
2.本发明实施例一制备的雌酮分子印迹电化学发光传感器用于检测0.1~8μg/L的六个不同系列雌酮溶液以及空白样品得到的标准曲线为图4，图4为ECL-MIPs传感器在不同雌酮浓度的发光图及其与发光峰值的线性关系。线性拟合方程为ΔY=180.6443x+20.4915，式中ΔY为标准溶液的发光强度减去空白溶液的发光强度，R2=0.99135，检出限为0.0047μg/L。表明该发明适用于环境水体中雌酮的检测。
应用实例
第一步，以上述本发明实施例一制备的分子印迹电化学发光传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构成三电极系统。
第二步，将电化学工作站与发光分析系统以及光电倍增管组合成电化学发光检测体系。
第三步，随机取F市A、B、C河流水样，分别对应样品编号为样品1，样品2，样品3，三个样品各取3个10mL分别经过0.45μm的过滤器过滤，用磷酸盐缓冲溶液调节pH值为7.4左右。
第四步，取第二步中的水样3mL至电解池中并且加入10μL正三丙胺溶液，搅拌混合均匀在进入三电极系统，电化学工作站采用循环伏安法在-1.2~2.0V电压范围内扫描，扫描速率为0.1V/s，发光分析系统的电压值为，同时将磷酸盐缓冲溶液作为空白样品在相同的电化学参数和发光参数条件上机检测分析得到发光图。
在检测过程中，检测条件与上述0.1~8μL雌酮标准浓度相同，将发光图的峰值代入建立的雌酮定量曲线公式ΔY=180.6443x+20.4915计算，分别测得样品1、样品2、样品3中雌酮浓度为2.8620μg/L、1.7143μg/L、0.7251μg/L。采用经典的LC-MS/MS法同时对该三个实际环境水样中的雌酮进行定量检测，检测结果表明该三个样品中雌酮浓度为3.11μg/L、1.69μg/L、0.723μg/L，这与ECL-MIPs法检测结果的相对偏差均小于8%。说明本专利获得的新方法定量结果准确。具体见下表所示：

Claims (10)

1.一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)在离心管中分别加入四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、浓度为0.05~0.2mol/L的盐酸和超纯水组成溶胶混合液，所述的四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、浓度为0.05~0.2mol/L的HCl、超纯水的体积比为：20:6:4:20:1:20~20:6:8:20:1:20，混悬后得到均一、透明的溶胶-凝胶，得到的溶胶-凝胶即为非分子印迹聚合物；
(2)在上述非分子印迹聚合物中加入50~150mg/L的雌酮溶液，混悬后形成分子印迹聚合物，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比为5:1~15:1，在干燥条件下室温存放；
(3)称取MWCNT加入浓硫酸和浓硝酸的混合液中，所述MWCNT与浓硫酸和浓硝酸的混合液的比例为8mg/12mL~15mg/12mL，所述浓硫酸与浓硝酸的体积比为2:1~5:1，所述浓硫酸的浓度为16.0~18.4mol/L，所述浓硝酸的浓度为14~16mol/L；在70~100℃加热回流后，用纯水反复洗至中性，用纤维滤纸抽滤，40~60℃真空干燥箱烘干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯下研磨成粉状储存；
(4)称取步骤（3）酸处理后的端基羧酸化的MWCNT加入二甲亚砜，超声分散后得到均一、稳定的端基羧酸化的MWCNT悬浊液；
(5)称取三联吡啶钌固体至超纯水中溶解配制成1~2mmol/LRu(bpy)3 2+溶液；
(6)在金电极表面滴2~3μL的全氟化树脂溶液，待其室温晾干后制成Nafion电极，再滴4~6μL步骤（4）制备的端基羧酸化的MWCNT悬浊液，室温晾干制备成MWCNT/Nafion电极，将该电极置于步骤（5）配制的Ru(bpy)3 2+溶液中浸泡30~40min后取出，用超纯水将表面未吸附的Ru(bpy)3 2+溶液冲洗干净，室温晾干，得到Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极；
(7)在步骤（6）制备成Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8~10μL步骤（2）制得的分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40~50℃超纯水中磁力搅拌洗脱以去除模板分子雌酮，得到分子印迹电化学发光传感器。
2.根据权利要求1所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中所述的HCl浓度为0.1mol/L；所述四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、0.1mol/LHCl和超纯水的体积比为20:6:6:20:1:20。
3.根据权利要求1所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中所加入的四乙氧基硅烷、甲基甲氧基硅烷、苯基甲氧基硅烷、无水乙醇、HCl和超纯水组成溶胶混合液，通过混悬1h，得到均一、透明的溶胶-凝胶。
4.根据权利要求1所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的非分子印迹聚合物与雌酮溶液的体积比为10:1，所述雌酮溶液的浓度为100mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，称取MWCNT10mg加入到浓硫酸和浓硝酸的12mL混合液中，所述浓硫酸和浓硝酸体积比=3:1，持续4h的90℃加热回流，纯水反复洗至中性，用0.25μm的纤维滤纸抽滤，40℃真空干燥箱烘干，得到端基羧酸化的MWCNT，红外灯下研磨成粉状储存。
6.根据权利要求1所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，称取1.0mg酸处理后的端基羧酸化的MWCNT加入1mL二甲亚砜中，超声分散20min，得到均一、稳定的悬浊液；取2.5μL悬浊液滴涂于金电极表面，室温晾干即得MWCNT修饰的金电极。
7.根据权利要求1所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在步骤（6）中，在金电极表面滴2.5μL的Nafion，待其室温晾干后制成Nafion电极，再滴5μLMWCNT悬浊液，室温晾干制备成MWCNT/Nafion电极；称取15mg三联吡啶钌固体至20mL超纯水中溶解得到1mmol/LRu(bpy)3 2+溶液，将该电极置于1mmol/LRu(bpy)3 2+溶液中浸泡30min后取出，用超纯水将表面未吸附的Ru(bpy)3 2+溶液冲洗干净，室温晾干，得到Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极。
8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，在步骤（7）中，制备成Ru(bpy)3 2+/MWCNT/Nafion固相发光电极上滴8μL分子印迹聚合物，室温晾干，将晾干后的电极置于40℃超纯水中磁力搅拌洗脱40min，得到分子印迹电化学发光传感器。
9.权利要求1~8任一所述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学发光传感器，应用于雌酮环境内分泌干扰物的检测，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将电化学工作站与发光分析系统以及光电倍增管组合成电化学发光检测体系，并通过三电极体系进行测试，使用权利要求1~8任一所述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学发光传感器作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，在3mL、pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲溶液配制的1mg/L雌酮溶液中检测分析；
(2)电化学工作站采用循环伏安法在-1.2~2.0V电压范围内扫描，扫描速率为0.1V/s，发光分析系统的电压值为-1000~-800V，检测得到雌酮具有增强雌酮分子印迹电化学发光传感器发光信号的作用；
(3)10μL正三丙胺作为共反应剂加入到1mg/L雌酮溶液中进行混合均匀，能极大提高雌酮分子印迹电化学发光传感器的发光信号；
(4)与步骤(2)在相同条件下将雌酮分子印迹电化学发光传感器用于检测与雌酮结构相近的雌二醇、双酚A以及壬基酚的溶液，并且加入10μL的98%正三丙胺溶液，确定雌酮分子印迹电化学发光传感器对雌酮具有特异选择功能；
(5)由步骤(2)得到的雌酮对雌酮分子印迹电化学发光传感器具有增强发光信号的作用，根据所得发光强度值与雌酮标准溶液浓度之间的线性关系，建立定量曲线；
(6)将待测水样代替雌酮的标准溶液，待测水样经0.25μm过滤，按照步骤(5)雌酮定量曲线的方法进行检测分析。
10.权利要求1~8任一所述的制备方法制得的雌酮分子印迹电化学发光传感器，其特征在于，所述的雌酮分子印迹电化学发光传感器能够特异性、高灵敏度识别溶液中雌酮，并且实现对水体中的雌酮分子进行现场及时快速定量检测分析。
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