CN104849262A - 一种电化学发光传感器阵列以及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电化学发光传感器阵列，所述阵列由4～20个传感单元集成在同一基底上构成，所述传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成，所述人工合成性激素传感单元包括基体、修饰于基体的分子印迹传感膜以及导电引线，所述分子印迹传感膜由以下原料组成：模板分子、功能单元、交联剂、溶剂以及光引发剂，且各原料间的摩尔比为1:3～5:7～9:13～16:1，所述模板分子为多种待检测的人工合成性激素；还涉及该传感器阵列的制备方法以及其在人工合成性激素检测中的应用。该电化学发光传感器阵列能够实现多个目标物的同时分析，减少基体对检测结果的干扰，检测可靠性高，操作方便，该传感器阵列易于组装和调整，可应用于环境监测、食品安全等领域。

Description

一种电化学发光传感器阵列以及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种环境监测和分析化学技术领域，尤其涉及一种电化学发光传感器阵列以及制备方法和应用。

背景技术

随着社会发展，越来越多的化学物质进入到环境中，再经过食物链或接触方式进入人体，其中有些进入人体的化学物质，能够影响人体内源性雌激素雌二醇、雌酮、雌三醇等的正常分泌，从而导致不孕不育、生殖器官癌变、肥胖等各种生殖系统相关的疾病，国际上把这类物质称为内分泌干扰素，亦称环境雌激素。内分泌干扰素的种类很多，主要包括塑料制品中的邻苯二甲酸酯类增塑剂、农业中广泛使用的有机氯类农药、化学工业中的多氯联苯类和表面活性剂类化合物、天然动植物中的天然类雌激素化合物、养殖业中为促进生长发育或疾病治疗而过度使用的人工合成激素类药物等。

人工合成性激素在人体和动物疾病治疗方面发挥着重要作用，但是在养殖业中的滥用将会导致这些激素通过食品和环境进入健康人体造成危害。因此，农业部对各类激素的使用做了严格限制，有些禁用，有些允许使用但不得在动物性食品中检出。例如，农业部2002年公告第176号禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录中规定了性激素类药物己烯雌酚、雌二醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、氯烯雌醚、炔诺醇、炔诺醚、醋酸氯地孕酮、左炔诺孕酮、炔诺酮、绒毛膜促性腺激素、促卵泡生长激素。农业部2002年公告第235号规定性激素类药物雌二醇、戊酸雌二醇、氯稀雌醚、炔诺醇、炔诺醚、醋酸氯地孕酮、左炔诺孕酮、炔诺酮、绒毛膜促性腺激素(促绒性素)、促卵泡生长激素、苯甲酸雌二醇、玉米赤霉醇、去甲雄三烯醇酮、醋酸甲孕酮允许作治疗用，但不得在动物性食品中检出。

这些性激素的原料药和商品药的检测一般采用简单方便的紫外-可见分光光度法、薄板层析法等方法完成，但是涉及饲料、饮用水、养殖业污水和动物性食品中性激素非法添加和残留的检测，由于基体复杂，需要在前处理的基础上完成，主要的检测方法是色谱、色谱质谱联用技术，其他方法，如：细胞学方法、生物学方法、生物化学方法、基于酶联免疫技术的快速检测试剂盒等。例如，牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚及双烯雌酚残留量的测定，利用液相色谱-串联质谱法——GB/T 20767-2006；牛奶和奶粉中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚及双烯雌酚残留量的测定，利用液相色谱-串联质谱法——GB/T 22992-2008；鸡肉和鸡肝中己烯雌酚残留检测，利用气相 色谱质谱法——农业部1031号公告-4-2008；饲料中醋酸氯地孕酮的测定，利用高效液相色谱法——农业部2086号公告-2-2014等。上述检测方法中，色谱质谱方法的可靠性高，但存在仪器昂贵、普及性不高等不足，而其他方法则往往存在通用性相对较差、重现性相对较低、稳定性相对不高、检测项目单一等缺点。

下表列出了农业部公告中禁止和限制使用的一些常见人工合成雌激素及分子结构。根据相同的母体结构特征，将其分为三组(1)己烯雌酚、氯烯雌醚、己烷雌酚、醋酸双烯雌酚，(2)雌二醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌醇，(3)炔诺酮、双醋炔诺醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮。

由于结构的相似性，通用的固相/液相萃取/微萃取技术很难实现选择性的分离富集，需要在样品前处理基础上，进一步利用更高效的色谱分离检测技术实现定量分析，如需进一步定性则需要通过与质谱联用实现。分子印迹技术(Molecular imprinting technique简称MIT)是利用化学方法模拟生物体系中抗原-抗体的高选择性分子识别技术，能够有效的实现相似结构化合物的识别。虽然MIT技术能够对结构相似物实现较为显著的识别，但仍然不能做到完全识别，而且为了提高选择识别性能，MIT技术的使用条件非常苛刻，给实际应用带来了许多限制。尽管基于分子印迹技术的电化学传感器/电化学发光传感器已经有了较多的报道和研究，但是其目标分析物单一，不能很好的适用于复杂样品的检测，也不能很好的解决多种结构相似物的快速检测。因此，对于实际样品中性激素残留的多成分快速检测方法，急需改进。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种能实现多成分快速检测的电化学发光传感器阵列。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而一种的上述电化学发光传感器阵列的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种检测结果准确、检测快速的上述电化学发光传感器阵列在人工合成性激素检测中的应用。

本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种电化学发光传感器阵列，其特征在于，所述阵列由4～20个传感单元集成在同一基底上构成，所述传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成；所述人工合成性激素传感单元包括基体、修饰于基体的分子印迹传感膜以及导电引线，所述分子印迹传感膜由以下原料组成：模板分子、功能单元、交联剂、溶剂以及光引发剂，且各原料间的摩尔比为 1:3～5:7～9:13～16:1；所述空白传感单元包括基体、修饰于基体的非分子印迹传感膜以及导电引线，所述非分子印迹传感膜由以下原料组成：功能单元、交联剂、溶剂以及光引发剂，且各原料间的摩尔比为3～5:7～9:13～16:1。

上述方案中人工合成性激素传感单元作为检测点，而两个空白传感单元作为参考点。

作为优选，所述模板分子为己烯雌酚、氯烯雌醚、己烷雌酚、醋酸双烯雌酚，雌二醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌醇，炔诺酮、双醋炔诺醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮中的至少二种。

作为优选，所述基体为ITO石英玻璃电极，所述功能单元为甲基丙烯酸，所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，所述溶剂为二甲基甲酰胺，所述光引发剂为安息香乙醚。

本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：上述电化学发光传感器阵列的制备方法包括以下步骤：

第一步，以边长为1～6cm的正方形ITO石英玻璃电极为基体，将基体的导电层分割成4～20个边长4mm的正方形电极单元并引出导线，从而构成4～20个传感单元，该传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成，其中将模板分子、功能单元、交联剂、溶剂以及光引发剂按摩尔比为1:3～5:7～9:13～16:1混合均匀制成反应液，取9～15μL反应液滴涂在洁净干燥的ITO石英玻璃电极单元上，用450～550W紫外灯距离在25～30cm处照射25～30min完成聚合制成分子印迹传感膜，淋洗分子印迹膜除去模板分子和杂质得人工合成性激素传感单元；两个空白传感单元除其反应液中不加入模板分子外，其他制备过程与人工合成性激素传感单元相同。

第二步，用石蜡做围栏将每个传感单元围起1～1.5mm高度，加入对应的反应液，上述人工合成性激素传感单元中每一个ITO石英玻璃电极单元对应一种模板分子。

上述各方案中的电化学发光传感器阵列在人工合成性激素检测中的应用包括以下步骤：第一步，以所述电化学发光传感器阵列为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，构成三电极系统；

第二步，以所述电化学发光传感器阵列为底面，以四块与所述传感器阵列基体尺寸相同的石英玻璃为侧面，用结构胶粘结成电化学发光反应池，在该电化学发光反应池中加入pH为10～11的缓冲溶液，加入9～10μL浓度为0.01mol/L的鲁米诺，加入目标分析物混合溶液，超声混合均匀；

第三步，开启电化学发光检测系统，控制电化学工作站的检测电位在-0.2V～0.6V之间，超微弱发光分析仪的扫描速度为100mV/s，记录电化学发光强度-电位曲线(I_ECL-E)、循环伏安曲线(CV)，直至信号稳定，依次记录每一个传感器单元的电化学发光强度I；

第四步，对获得的多维测量数据利用数理统计中的主成分分析、线性判别分析、典 型判别分析进行数据分析，优选主成分分析。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明利用分子印迹技术制备分子印迹传感膜，能较好地识别结构相似的同类型化合物，有效地减少复杂样品中基体的干扰，提高检测的可靠性，相比于酶联免疫技术，稳定性更高，成本更低。

(2)本发明采用传感器阵列，避免了传统传感器对敏感元件高选择性的情况，使得在分子印迹传感膜的制备过程中，无需严格控制分子印迹聚合物的制备条件和精细的调控措施，使得传感器的制备更加容易；同时在传感器阵列获得多维测量数据的基础上，借助于数理统计方法，能够实现多个目标物的同时分析，克服了单一传感器仅能测量一种目标化合物的不足。

(3)本发明采用电化学发光检测系统，相比目前主流的高效液相色谱和质谱检测，仪器价格低廉、运行费用低、容易控制和自动化、操作简单方便；

(4)本发明的传感器阵列易于组装和调整，通过改变模板分子和传感单元数目，可在环境监测、食品安全等领域获得更多应用,尤其适用于水体中人工合成性激素类以及其他同类型化合物的同时快速检测，具有较强的使用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中电化学发光传感器阵列应用于水体中人工合成性激素检测的示意图；

图2为本发明实施例1中电化学发光传感器阵列示意图；

图3为本发明实施例1中电化学发光传感器阵列识别示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

1.1电化学发光传感器阵列的制备，如图2所示：

第一步，以边长为6cm的正方形ITO石英玻璃电极为基体，将基体的导电层分割成8个边长4mm的正方形电极单元并引出导线，从而构成8个传感单元。

第二步，传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成，其中将模板分子、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基甲酰胺以及安息香乙醚按摩尔比为1:4:8:15:1混合均匀制成反应液，取10μL反应液滴涂在洁净干燥的ITO石英玻璃电极单元上，用500W紫外灯距离在30cm处照射30min完成聚合制成分子印迹传感膜，依次用体积比为4:2:1的乙醇-乙酸-去离子水混合溶剂30mL、体积比为2：1的乙醇-去 离子水30mL以及去离子水30mL以1mL/min的速度淋洗分子印迹膜除去模板分子和杂质，得人工合成性激素传感单元；两个空白传感单元除其反应液中不加入模板分子外，其他制备过程与人工合成性激素传感单元相同。

第三步，用石蜡做围栏将每个传感单元围起1mm高度，加入对应的反应液，上述人工合成性激素传感单元中每一个ITO石英玻璃电极单元对应一种模板分子。

本实施例中，分子印迹传感膜的模板分子为雌二醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌醇。

1.2样品中人工合成性激素的检测，如图1所示：

第一步，以上述制备的电化学发光传感器阵列为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，构成三电极系统。

第二步，以上述电化学发光传感器阵列为底面，以四块与所述传感器阵列基体尺寸相同的石英玻璃为侧面，用结构胶粘结成电化学发光反应池，在该电化学发光反应池中加入pH为11的缓冲溶液，加入10μL浓度为0.01mol/L的鲁米诺，加入目标分析物混合溶液，超声1min混合均匀。

第三步，开启电化学发光检测系统，控制电化学工作站的检测电位在-0.2V～0.6V之间，超微弱发光分析仪的扫描速度为100mV/s，记录电化学发光强度-电位曲线(I_ECL-E)、循环伏安曲线(CV)，直至信号稳定，依次记录每一个传感器单元的电化学发光强度I。

第四步，如图3所示，对获得的多维测量数据矩阵利用数理统计中的主成分分析工具进行数据分析。

检测过程中，按照上述检测步骤，以0.5～500μg/L的标准溶液绘制校准曲线，用人工合成样品(分别含20μg/L的雌二醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇，100μg/L的雌三醇、雌酮、炔雌醇)进行方法的验证，识别准确率达84％。

实施例2：

2.1电化学发光传感器阵列的制备：

第一步，以边长为2cm的正方形ITO石英玻璃电极为基体，将基体的导电层分割成6个边长4mm的正方形电极单元并引出导线，从而构成6个传感单元。

第二步，传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成，其中将模板分子、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基甲酰胺以及安息香乙醚按摩尔比为1:5:9:16:1混合均匀制成反应液，取15μL反应液滴涂在洁净干燥的ITO石英玻璃电极单元上，用550W紫外灯距离在30cm处照射30min完成聚合制成分子印迹传感膜，依次用体积比为4:2:1的乙醇-乙酸-去离子水混合溶剂30mL、体积比为2：1的乙醇-去离子水30mL以及去离子水30mL以1mL/min的速度淋洗分子印迹膜除去模板分子和 杂质，得人工合成性激素传感单元；两个空白传感单元除其反应液中不加入模板分子外，其他制备过程与人工合成性激素传感单元相同。

第三步，用石蜡做围栏将每个传感单元围起1mm高度，加入对应的反应液，上述人工合成性激素传感单元中每一个ITO石英玻璃电极单元对应一种模板分子。

本实施例中，分子印迹传感膜的模板分子为己烯雌酚、氯烯雌醚、己烷雌酚、醋酸双烯雌酚。

2.2样品中人工合成性激素的检测：

第一步，以上述制备的电化学发光传感器阵列为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，构成三电极系统。

第二步，以上述电化学发光传感器阵列为底面，以四块与所述传感器阵列基体尺寸相同的石英玻璃为侧面，用结构胶粘结成电化学发光反应池，在该电化学发光反应池中加入pH为10的缓冲溶液，加入9μL浓度为0.01mol/L的鲁米诺，加入目标分析物混合溶液，超声1min混合均匀。

第三步，开启电化学发光检测系统，控制电化学工作站的检测电位在-0.2V～0.6V之间，超微弱发光分析仪的扫描速度为100mV/s，记录电化学发光强度-电位曲线(I_ECL-E)、循环伏安曲线(CV)，直至信号稳定，依次记录每一个传感器单元的电化学发光强度I。

第四步，对获得的多维测量数据矩阵利用数理统计中的主成分分析工具进行数据分析。

检测过程中，按照上述检测步骤，以1～1000μg/L的标准溶液绘制校准曲线，用人工合成样品(分别含100μg/L的己烯雌酚、氯烯雌醚，500μg/L的己烷雌酚、醋酸双烯雌酚)进行方法的验证，识别准确率达92％。

实施例3：

3.1电化学发光传感器阵列的制备：

第一步，以边长为3cm的正方形ITO石英玻璃电极为基体，将基体的导电层分割成6个边长4mm的正方形电极单元并引出导线，从而构成6个传感单元。

第二步，传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成，其中将模板分子、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基甲酰胺以及安息香乙醚按摩尔比为1:3:7:13:1混合均匀制成反应液，取12μL反应液滴涂在洁净干燥的ITO石英玻璃电极单元上，用450W紫外灯距离在25cm处照射25min完成聚合制成分子印迹传感膜，依次用体积比为4:2:1的乙醇-乙酸-去离子水混合溶剂30mL、体积比为2：1的乙醇-去离子水30mL以及去离子水30mL以1mL/min的速度淋洗分子印迹膜除去模板分子和杂质，得人工合成性激素传感单元；两个空白传感单元除其反应液中不加入模板分子外， 其他制备过程与人工合成性激素传感单元相同。

第三步，用石蜡做围栏将每个传感单元围起1.5mm高度，加入对应的反应液，上述人工合成性激素传感单元中每一个ITO石英玻璃电极单元对应一种模板分子。

本实施例中，分子印迹传感膜的模板分子为炔诺酮、双醋炔诺醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮。

3.2样品中人工合成性激素的检测：

第一步，以上述制备的电化学发光传感器阵列为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，构成三电极系统。

第二步，以上述电化学发光传感器阵列为底面，以四块与所述传感器阵列基体尺寸相同的石英玻璃为侧面，用结构胶粘结成电化学发光反应池，在该电化学发光反应池中加入pH为11的缓冲溶液，加入10μL浓度为0.01mol/L的鲁米诺，加入目标分析物混合溶液，超声1min混合均匀。

第三步，开启电化学发光检测系统，控制电化学工作站的检测电位在-0.2V～0.6V之间，超微弱发光分析仪的扫描速度为100mV/s，记录电化学发光强度-电位曲线(I_ECL-E)、循环伏安曲线(CV)，直至信号稳定，依次记录每一个传感器单元的电化学发光强度I。

第四步，对获得的多维测量数据矩阵利用数理统计中的主成分分析工具进行数据分析。

检测过程中，按照上述检测步骤，以100～1000μg/L的标准溶液绘制校准曲线，用人工合成样品(分别含300μg/L的炔诺酮、双醋炔诺醇，600μg/L的醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮)进行方法的验证，识别准确率达95％。

Claims (5)

1.一种电化学发光传感器阵列，其特征在于，所述阵列由4～20个传感单元集成在同一基底上构成，所述传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成；

所述人工合成性激素传感单元包括基体、修饰于基体的分子印迹传感膜以及导电引线，所述分子印迹传感膜由以下原料组成：模板分子、功能单元、交联剂、溶剂以及光引发剂，且各原料间的摩尔比为1:3～5:7～9:13～16:1；

所述空白传感单元包括基体、修饰于基体的非分子印迹传感膜以及导电引线，所述非分子印迹传感膜由以下原料组成：功能单元、交联剂、溶剂以及光引发剂，且各原料间的摩尔比为3～5:7～9:13～16:1。

2.如权利要求1所述的电化学发光传感器阵列，其特征在于，所述模板分子为己烯雌酚、氯烯雌醚、己烷雌酚、醋酸双烯雌酚，雌二醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌醇，炔诺酮、双醋炔诺醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮中的至少二种。

3.如权利要求1所述的电化学发光传感器阵列，其特征在于，所述基体为ITO石英玻璃电极，所述功能单元为甲基丙烯酸，所述交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯，所述溶剂为二甲基甲酰胺，所述光引发剂为安息香乙醚。

4.一种如权利要求1～3中任一权利要求所述的电化学发光传感器阵列的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，以边长为1～6cm的正方形ITO石英玻璃电极为基体，将基体的导电层分割成4～20个边长4mm的正方形电极单元并引出导线，从而构成4～20个传感单元；

第二步，所述传感单元由人工合成性激素传感单元和两个空白传感单元组成，其中将模板分子、功能单元、交联剂、溶剂以及光引发剂按摩尔比为1:3～5:7～9:13～16:1混合均匀制成反应液，取9～15μL反应液滴涂在洁净干燥的ITO石英玻璃电极单元上，用450～550W紫外灯于距离25～30cm处照射25～30min完成聚合制成分子印迹传感膜，淋洗分子印迹膜除去模板分子和杂质，得人工合成性激素传感单元；两个空白传感单元除反应液中不加入模板分子外，其他制备过程与人工合成性激素传感单元相同；

第三步，用石蜡做围栏将每个传感单元围起1～1.5mm高度，加入对应的反应液，上述人工合成性激素传感单元中每一个ITO石英玻璃电极单元对应一种模板分子。

5.一种如权利要求1～3中任一权利要求所述的电化学发光传感器阵列在人工合成性激素检测中的应用，其特征在于包括以下步骤：

第一步，以所述电化学发光传感器阵列为工作电极，铂丝电极作为辅助电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，构成三电极系统；

第二步，以所述电化学发光传感器阵列为底面，以四块与所述传感器阵列基体尺寸相同的石英玻璃为侧面，用结构胶粘结成电化学发光反应池，在该电化学发光反应池中加入pH为10～11的缓冲溶液，加入9～10μL浓度为0.01mol/L的鲁米诺，加入目标分析物混合溶液，超声混合均匀；

第三步，开启电化学发光检测系统，控制电化学工作站的检测电位在-0.2V～0.6V之间，超微弱发光分析仪的扫描速度为100mV/s，记录电化学发光强度-电位曲线(I_ECL-E)、循环伏安曲线(CV)，直至信号稳定，依次记录每一个传感器单元的电化学发光强度I；

第四步，对获得的多维测量数据利用数理统计中的主成分分析、线性判别分析、典型判别分析进行数据分析，优选主成分分析。