CN112782404B - 基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒 - Google Patents

基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，属于生物标志物诊断技术领域。所述检测试剂盒是以联合检测炎症感染类生物标志物降钙素原(PCT)、白介素6(IL‑6)、C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)为目的，利用夹心法原理进行检测，其中特异性抗体1标记上不同种类荧光基团，特异性抗体2偶联磁珠。所述试剂盒在一个反应中能够受不同的激发光产生多个波长荧光信号，以达到同时检测4种生物标志物的目的。所述试剂盒与单独检测生物标志物的商品试剂盒相比，具有误差小，操作简便和检测时间短的特点。

Description

基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物标志物诊断技术领域，具体涉及基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒。
背景技术
荧光免疫技术是是标记免疫技术中发展最早的一种检测技术。它是集免疫学、生物化学和显微镜技术等多项技术的综合。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescent antibody technology)。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法：用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。
荧光免疫技术因具有特异性强、敏感性高、速度快、无放射性污染、仪器设备简单等优势，在临床诊断、生命分析、环境科学等领域得到了广泛应用。
目前，采用荧光免疫技术检测生物标志物的试剂，但现有技术中都是针对某一种生物标志物进行检测，该方法虽然能得到准确检测结果，但该单独方法检测，不仅检测成本较高，而且操作繁琐，检测耗时长，不利于多种生物标志物临床应用推广。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，具有操作简易、反应时间短、并能同时检测多个生物标志物等特点。
本发明提供了基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，包括标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液和磁珠包被特异性抗体2的悬浊液；
所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液包括荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1；所述荧光基团1、荧光基团2、荧光基团3和荧光基团4选自AMCA、FITC、RBITC和Cy5中的一种；
所述磁珠包被特异性抗体2的悬浊液包括磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、磁珠包被的白介素6特异性抗体2、磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2。
优选的，所述荧光基团标记的降钙素原特异性抗体1中降钙素原特异性抗体1的货号为菲鹏PCT-Ab7#；
所述磁珠包被的降钙素原特异性抗体2中降钙素原特异性抗体2的货号为PCT-Ab4#。
优选的，所述荧光基团标记的白介素6特异性抗体1中白介素6特异性抗体1的货号为Medix 100328；
所述磁珠包被的白介素6特异性抗体2中白介素6特异性抗体2的货号为Medix100329。
优选的，所述荧光基团标记的C反应蛋白特异性抗体1中C反应蛋白特异性抗体1的货号为菲鹏CRP-Ab7#；
所述磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2中C反应蛋白特异性抗体2的货号为菲鹏CRP-Ab8#。
优选的，所述荧光基团标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1中血清淀粉样蛋白A特异性抗体1的货号为Medix 100279；
优选的，所述磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2中血清淀粉样蛋白A特异性抗体2的货号为Medix 100289。
优选的，所述荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1的质量比为1:1:4:1。
优选的，所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液以pH值为7.4、20mM磷酸盐缓冲液为溶剂，还包括以下含量组分：2μg/ml荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、2μg/ml荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、8μg/ml荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、2μg/ml荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1、体积浓度30％甘油和质量浓度0.1％防腐剂。
优选的，所述磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、磁珠包被的白介素6特异性抗体2、磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2的质量比为2:2:1:1。
优选的，所述磁珠包被特异性抗体2的悬浊液以20mM磷酸盐缓冲液为溶剂，还以下含量的组分：质量浓度2％的磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、质量浓度2％的磁珠包被的白介素6特异性抗体2、质量浓度1％的磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和质量浓度1％的磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2、体积浓度30％小牛血清、体积浓度10％甘油、体积浓度0.05％吐温20和质量浓度0.1％的防腐剂。
本发明提供的基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，以降钙素原(PCT)、白介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)为生物标志物，采用免疫夹心法原理检测生物标志物，利用多种荧光基团标记不同生物标志物的抗体后，使在一个反应中能够同时受不同的激发光产生多个波长荧光信号，以达到同时相对检测多种待测物的目的。该方法具有灵敏度高、结果准确、操作简易、反应时间短，并能同时检测多个生物标志物等特点。
本发明进一步的限定了用于检测4种生物标志物的特异性抗体1和特异性抗体2的来源。经过抗体对筛选实验结果表明，特定来源的配体抗体能有效提高对应生物标志物的检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明提供的试剂盒的检测示意图；
图2为PCT标准曲线；
图3为IL-6标准曲线；
图4为CRP标准曲线；
图5为SAA标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，包括标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液和磁珠包被特异性抗体2的悬浊液；所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液包括荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1；所述荧光基团1、荧光基团2、荧光基团3和荧光基团4选自AMCA、FITC、RBITC和Cy5中的一种。所述磁珠包被特异性抗体2的悬浊液包括磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、磁珠包被的白介素6特异性抗体2、磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2。
在本发明中，实验证明不同来源特异性抗体对对检测生物标志物的检测灵敏度有差异，所述荧光基团标记的降钙素原特异性抗体1中降钙素原特异性抗体1的货号优选为菲鹏PCT-Ab7#；所述磁珠包被的降钙素原特异性抗体2中降钙素原特异性抗体2的货号优选为PCT-Ab4#。所述荧光基团标记的白介素6特异性抗体1中白介素6特异性抗体1的货号优选为Medix 100328；所述磁珠包被的白介素6特异性抗体2中白介素6特异性抗体2的货号优选为Medix 100329。所述荧光基团标记的C反应蛋白特异性抗体1中C反应蛋白特异性抗体1的货号优选为菲鹏CRP-Ab7#；所述磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2中C反应蛋白特异性抗体2的货号优选为菲鹏CRP-Ab8#。所述荧光基团标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1中血清淀粉样蛋白A特异性抗体1的货号优选为Medix 100279；所述磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2中血清淀粉样蛋白A特异性抗体2的货号优选为Medix 100289。所述荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1的质量比优选为1:1:4:1。所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液优选以pH值为7.4、20mM磷酸盐缓冲液为溶剂，还包括以下含量组分：2μg/ml荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、2μg/ml荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、8μg/ml荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、2μg/ml荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1、体积浓度30％甘油和质量浓度0.1％防腐剂。AMCA是7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸，FITC是异硫氰酸荧光素，RBITC是异硫氰酸罗丹明B，Cy5是花氰染料Cy5。在本发明实施例中，标记不同荧光基团的特异性抗体1分别为AMCA-PCT Ab1、FITC-IL-6 Ab1、RBITC-CRP Ab1、Cy5-SAA Ab1。所述荧光基团的激发波长依次为345nm、492nm、555nm、648nm，发射波长依次为425nm、520nm、600nm、662nm，能有效区分不同生物标记物的荧光强度，且不同生物标志物的存在，不会对其他种类生物标志物的检测结果造成影响。
在本发明中，所述磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、磁珠包被的白介素6特异性抗体2、磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2的质量比优选为2:2:1:1。所述磁珠包被特异性抗体2的悬浊液优选以20mM磷酸盐缓冲液为溶剂，还以下含量的组分：质量浓度2％的磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、质量浓度2％的磁珠包被的白介素6特异性抗体2、质量浓度1％的磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和质量浓度1％的磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2、体积浓度30％小牛血清、体积浓度10％甘油、体积浓度0.05％吐温20和质量浓度0.1％的防腐剂。本发明对上述溶液中所涉及的药品来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的药品来源即可。
在本发明中，所述试剂盒的制备方法，包括标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液的配制和磁珠包被特异性抗体2的悬浊液的配制。所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液的配制包括标记荧光基团1的降钙素原特异性抗体1的制备方法、标记荧光基团2的C反应蛋白特异性抗体1的制备方法、标记荧光基团3的C反应蛋白特异性抗体1的制备方法、标记荧光基团4的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1的制备方法。上述4种制备方法均相同，本发明以AMCA-PCT Ab1的制备方法加以说明，首先合成5’端修饰DIBO基团和3’端修饰AMCA的单链5’-DIBO-DNA-AMCA-3’；使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody AzidoModification Kit对PCT Ab1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；将5’-DIBO-DNA-AMCA-3’与重氮化后的PCT Ab1(N3-PCT Ab1)进行反应偶联生成AMCA-PCTAb1。
在本发明中，磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、磁珠包被的白介素6特异性抗体2、磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2的制备方法均采用相同的偶联方法制备。本发明以Mb-PCT Ab2的偶联方法为例加以说明，首先采用SDS清洗液清洗羧基磁珠2次，加入EDC和NHS活化，清洗后，再加入PCT Ab2抗体和MES偶联，封闭，清洗后得到Mb-PCT Ab2。
在本发明中，所述试剂盒的检测方法，见图1，优选包括以下步骤：
将标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液、待测样品溶液和磁珠包被的特异性抗体2的悬浮液混合，孵育，洗涤，检测荧光强度带入各生物标志物的回归方程中，得到样品中各生物标志物的浓度。
在本发明中，所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液、待测样品溶液和磁珠包被的特异性抗体2的悬浮液的体积比为5:1:5。所述孵育的温度优选为37℃。所述孵育的时间优选为5min。所述洗涤的次数优选为3次。所述洗涤用洗液优选为PBST缓冲液(包含PBS，0.1％Tween-20，pH值7.4)。所述检测荧光强度优选采用Spark 10M多功能酶标仪平台荧光检测模块进行读数。AMCA、FITC、RBITC、Cy5的激发波长依次为345nm、492nm、555nm、648nm，AMCA、FITC、RBITC、Cy5的发射波长分别为425nm、520nm、600nm、662nm。
实验证明，采用本发明提供的试剂盒以及商品降钙素原(PCT)测定试剂盒(电化学发光法)、白介素6(IL-6)检测试剂盒(电化学发光法)、全量程C反应蛋白(CRP)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)分别测试血清样品，本发明检测方法与目前市售试剂盒检测临床复合样本时，差异较小，说明本发明提供的试剂盒结果准确可靠。同时本发明检测试剂盒能够同时在一个反应杯中完成多项指标的检测，且互相不干扰结果，缩短检测时间，降低检测成本，更适合临床检测使用。
下面结合实施例对本发明提供的基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、各组分的制备方法
1.组份1的制备方法：
1.1 AMCA-PCT Ab1的标记方法
①人工合成5’端修饰DIBO基团和3’端修饰AMCA的单链5’-DIBO-DNA-AMCA-3’；
②使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody Azido Modification Kit对PCT Ab1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；
③将5’-DIBO-DNA-AMCA-3’与重氮化后的PCT Ab1(N3-PCT Ab1)进行反应偶联生成AMCA-PCT Ab1；
表1 AMCA-PCT Ab1的标记的反应体系和条件
Figure BDA0002857520770000071
④反应结束后，使用分子筛纯化得到AMCA-PCT Ab1。
1.2 FITC-IL-6 Ab1的标记方法
①人工合成5’端修饰DIBO基团和3’端修饰FITC的单链5’-DIBO-DNA-FITC-3’；
②使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody Azido Modification Kit对IL-6 Ab1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；
③将5’-DIBO-DNA-FITC-3’与重氮化后的IL-6 Ab1(N3-IL-6 Ab1)进行反应偶联生成FITC-IL-6 Ab1；
表2 FITC-IL-6 Ab1的标记的反应体系和条件
Figure BDA0002857520770000081
④反应结束后，使用分子筛纯化得到FITC-IL-6 Ab1。
1.3 RBITC-CRP Ab1的标记方法
①人工合成5’端修饰DIBO基团和3’端修饰RBITC的单链5’-DIBO-DNA-RBITC-3’；
②使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody Azido Modification Kit对SAA Ab1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；
③将5’-DIBO-DNA-RBITC-3’与重氮化后的CRP Ab1(N3-CRP Ab1)进行反应偶联生成RBITC-CRP Ab1；
表3 RBITC-CRP Ab1的标记的反应体系和条件
Figure BDA0002857520770000082
④反应结束后，使用分子筛纯化得到RBITC-CRP Ab1。
1.4 Cy5-SAA Ab1的标记方法
①人工合成5’端修饰DIBO基团和3’端修饰Cy5的单链5’-DIBO-DNA-Cy5-3’；
②使用ThermoFisher公司的SiteClickTM Antibody Azido Modification Kit对SAA Ab1进行处理，使该抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团；
③将5’-DIBO-DNA-Cy5-3’与重氮化后的SAA Ab1(N3-SAA Ab1)进行反应偶联生成Cy5-SAA Ab1；
表4 Cy5-SAA Ab1的标记的反应体系和条件
Figure BDA0002857520770000091
④反应结束后，使用分子筛纯化得到Cy5-SAA Ab1。
1.5组份1的配制方法：
组份1的配制方法按下表5配方进行配制。
表5组分1的配方
成分 浓度
磷酸盐缓冲液，pH7.4 20mM
AMCA-PCT Ab1溶液 2μg/ml
FITC-IL-6 Ab1溶液 2μg/ml
RBITC-CRP Ab1溶液 8μg/ml
Cy5-SAA Ab1溶液 2μg/ml
甘油 30％
Proclin 300 0.1％
按上述方法配制后保存在2～8℃条件下保存备用。
2.组份2的制备方法
2.1 Mb-PCT Ab2的偶联方法
①取200μL的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2mL的离心管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；
③向离心管中同时加入100μL的50mg/mL EDC，和100μL的50mg/mL NHS震荡混匀；
④将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02M MES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入120ug的PCT Ab2抗体，300μL的0.02M MES，偶联2-3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30mL的磁珠保存液中保存待用。
2.2 Mb-IL-6 Ab2的偶联方法
①取200μL的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2mL的离心管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；
③向离心管中同时加入100μL的50mg/mL EDC，和100μL的50mg/mL NHS震荡混匀；
④将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02M MES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入80ug的IL-6 Ab2抗体，300μL的0.02M MES，偶联2-3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30mL的磁珠保存液中保存待用。
2.3 Mb-CRP Ab2的偶联方法
①取200μL的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2mL的离心管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；
③向离心管中同时加入100μL的50mg/mL EDC，和100μL的50mg/mL NHS震荡混匀；
④将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02M MES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入80ug的CRP Ab2抗体，300μL的0.02M MES，偶联2-3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30mL的磁珠保存液中保存待用。
2.4 Mb-SAA Ab2的偶联方法
①取200μL的羧基磁珠(ThermoFisher DynabeadsTM M-270 Carboxylic Acid)加入1个2mL的离心管中，磁分离3min，然后去上清；
②向离心管中加入2倍体积的SDS清洗液，震荡混匀，磁分离去上清，清洗2次；
③向离心管中同时加入100μL的50mg/mL EDC，和100μL的50mg/mL NHS震荡混匀；
④将两个离心管置于混匀器上活化30min。活化完成后，使用2倍体积的0.02M MES清洗两次，去上清；
⑤在离心管中加入80ug的SAA Ab2抗体，300μL的0.02M MES，偶联2-3h。偶联结束后用2倍体积的磁珠封闭液清洗2次，去上清。
⑥再向离心管中加入2倍体积的磁珠封闭液，震荡混匀30min，去上清。
⑦用2倍体积的磁珠保存液清洗一次，去上清，然后移至30mL的磁珠保存液中保存待用。
2.5组份2的配制方法：
组份2的配制方法按下表6配方进行配制。
表6组份2的配方
Figure BDA0002857520770000111
Figure BDA0002857520770000121
按上述方法配制后保存在2～8℃条件下保存备用。
实施例2
抗体筛选
为了排除多个标志物同时检测时产生的非特异性干扰问题，需要对抗体原料进行筛选，筛选方法见表7：
1.抗体候选(Ab1均为磁珠偶联抗体，Ab2均为信号输出标记抗体)
表7不同生物标志物的抗体对来源一览表
Figure BDA0002857520770000122
2.筛选方法
2.1将不同来源的PCT Ab1、IL-6 Ab1、CRP Ab1和SAA Ab1分别与磁珠偶联，获得Mb-PCT Ab1、Mb-IL-6 Ab1、Mb-CRP Ab1和Mb-SAA Ab1；
2.2将不同来源的PCT Ab2、IL-6 Ab2、CRP Ab2和SAA Ab2分别与吖啶酯(AE)(苏州亚科，货号Y0266)标记获得AE-PCT Ab2、AE-IL-6 Ab2、AE-CRP Ab2和AE-SAA Ab2；
2.2分别取PBS溶液、50ng/LPCT纯抗原溶液(medix，货号610080)、500pg/L IL-6纯抗原溶液(medix，货号710015)、10mg/L CRP纯抗原溶液(Yashraj BiotechnologyLimited，货号FCRhp-13)、10mg/L SAA纯抗原溶液(medix，货号610070)与Mb-PCT Ab1、Mb-IL-6 Ab1、Mb-CRP Ab1和Mb-SAA Ab1同时反应5min，然后再加入AE-PCT Ab2、AE-IL-6 Ab2、AE-CRP Ab2和AE-SAA Ab2进行夹心反应5min，使用PBST溶液反复清洗三次后，加入吖啶酯化学发光激发液后使用吖啶酯化学发光检测仪(科斯迈SMART500)完成检测，观察发光值；
表8不同浓度的抗体对的荧光免疫检测结果
Figure BDA0002857520770000131
/>
Figure BDA0002857520770000141
结果显示，PCT配对抗体优选来源1的抗体对，IL-6配对抗体优选来源2的抗体对，CRP配对抗体优选来源1的抗体对，SAA配对抗体优选来源2的抗体对。
实施例3
样品检测评价
1.标准曲线制备
1.1 PCT标准曲线制备
取不同浓度的PCT校准品进行测试定标，其定标数据如下表1，结果显示，PCT定标方程为y＝3524.8x+4164.6，R2＝0.9956。
表9 PCT校准品定标数据
Figure BDA0002857520770000142
/>
Figure BDA0002857520770000151
1.2 IL-6标准曲线制备
取不同浓度的IL-6校准品进行测试定标，其定标数据如下表2，结果显示，IL-6定标方程为y＝5.2355x+948.67，R2＝0.9951。
表10 IL-6校准品定标数据
校准品 浓度(pg/ml) 荧光值
C0 0 78
C1 5 456
C2 10 702
C3 50 1203
C4 100 1870
C5 500 4480
C6 1000 7029
C7 2000 11098
C8 5000 26988
1.3 CRP标准曲线制备
取不同浓度的CRP校准品进行测试定标，其定标数据如下表3，结果显示，CRP定标方程为y＝2548.2x+14394，R2＝0.9934。
表11 CRP校准品定标数据
Figure BDA0002857520770000152
/>
Figure BDA0002857520770000161
1.4 SAA标准曲线制备
取不同浓度的SAA校准品进行测试定标，其定标数据如下表4，结果显示，SAA定标方程为y＝2497.8x+14564，R2＝0.9921。
表12 SAA校准品定标数据
校准品 浓度(mg/L) 荧光值
C0 0 108
C1 0.1 935
C2 0.5 3377
C3 1 5741
C4 5 24318
C5 10 41036
C6 50 159533
C7 200 575549
C8 400 975494
2.样品收集
从长沙市第一医院检验科获得经降钙素原(PCT)测定试剂盒(电化学发光法)(罗氏，国械注进20152401562，批号43058803，效期至2020-11-30)、白介素6(IL-6)检测试剂盒(电化学发光法)(罗氏，国械注进20162404369，批号43676102，效期至2020-12-31)、全量程C反应蛋白(CRP)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(宁波美康，浙械注准20172400911，批号20200401，效期至2021-04-30)、血清淀粉样蛋白A(SAA)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(上海奥普，沪械注准20172400383，批号20200203，效期至2021-02-16)分别测定后的20例血清样本(血清样本是指经静脉抽血至非抗凝管中，经过离心获得的上层透明液体，不含血细胞)，定值如下表13。
表13 20例血清样本的检查结果
Figure BDA0002857520770000171
2.样品检测评价
2.1检测参数(单位：μL)如表14所示。
表14检测参数一览表
Figure BDA0002857520770000172
Figure BDA0002857520770000181
2.2临床样本测试
取经化学发光定值后的临床样本进行对比测试，对比结果如下表15。
表15本发明试剂盒和商品试剂盒检测结果比较
Figure BDA0002857520770000182
Figure BDA0002857520770000191
结果表明，本发明提供的检测试剂盒与目前市售试剂盒检测临床复合样本时，差异较小，说明检测试剂盒具有检测结果准确可靠的特点，同时本发明所述试剂盒能够同时检测四种生物标志物，具有操作简便，结果准确性好的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，其特征在于，包括标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液和磁珠包被特异性抗体2的悬浊液；
所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液包括荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1；所述荧光基团1、荧光基团2、荧光基团3和荧光基团4选自AMCA、FITC、RBITC和Cy5中的一种；
所述磁珠包被特异性抗体2的悬浊液包括磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、磁珠包被的白介素6特异性抗体2、磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2；
所述荧光基团标记的降钙素原特异性抗体1中降钙素原特异性抗体1的货号为菲鹏PCT-Ab7#；
所述磁珠包被的降钙素原特异性抗体2中降钙素原特异性抗体2的货号为PCT-Ab4#；
所述荧光基团标记的白介素6特异性抗体1中白介素6特异性抗体1的货号为Medix100328；
所述磁珠包被的白介素6特异性抗体2中白介素6特异性抗体2的货号为Medix100329；
所述荧光基团标记的C反应蛋白特异性抗体1中C反应蛋白特异性抗体1的货号为菲鹏CRP-Ab7#；
所述磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2中C反应蛋白特异性抗体2的货号为菲鹏CRP-Ab8#；
所述荧光基团标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1中血清淀粉样蛋白A特异性抗体1的货号为Medix100279；
所述磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2中血清淀粉样蛋白A特异性抗体2的货号为Medix100289；
所述荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1的质量比为1:1:4:1；
所述磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、磁珠包被的白介素6特异性抗体2、磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2的质量比为2:2:1:1。
2.根据权利要求1所述基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，其特征在于，所述标记不同荧光基团的特异性抗体1溶液以pH值为7.4、20mM磷酸盐缓冲液为溶剂，还包括以下含量组分：2μg/ml荧光基团1标记的降钙素原特异性抗体1、2μg/ml荧光基团2标记的白介素6特异性抗体1、8μg/ml荧光基团3标记的C反应蛋白特异性抗体1、2μg/ml荧光基团4标记的血清淀粉样蛋白A特异性抗体1、体积浓度30％甘油和质量浓度0.1％防腐剂。
3.根据权利要求1所述基于荧光免疫检测方法的多重生物标志物检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠包被特异性抗体2的悬浊液以20mM磷酸盐缓冲液为溶剂，还包括以下含量的组分：质量浓度2％的磁珠包被的降钙素原特异性抗体2、质量浓度2％的磁珠包被的白介素6特异性抗体2、质量浓度1％的磁珠包被的C反应蛋白特异性抗体2和质量浓度1％的磁珠包被的血清淀粉样蛋白A特异性抗体2、体积浓度30％小牛血清、体积浓度10％甘油、体积浓度0.05％吐温20 和质量浓度0.1％的防腐剂。
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