CN108226517A - 一种双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法，包括：两个互补的荧光蛋白片段、蛋白与抗体的连接肽、抗体和抗原待测物，首先将荧光蛋白按特定位点切开形成不发荧光的两个片段，通过基因重组技术，表达纯化含有连接序列的两个荧光蛋白片段，荧光蛋白N端片段与一抗体通过偶联剂相连，荧光蛋白C端片段与另一抗体通过偶联剂相连，在待测物存在情况下，两个抗体和待测物形成三元复合物，同时荧光蛋白N端片段和荧光蛋白C端片段靠近、互补，并重新形成有活性的荧光蛋白，通过检测荧光强度的变化，可判断目标待测物的量。此方法适用于抗体与抗原反应的免疫检测，可同时检测多种待测物，及时诊断多种疾病，在体外免疫诊断中具有巨大前景。

Description

一种双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法
技术领域
本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测的方法，属于疾病诊断检测领域。
背景技术
双分子荧光互补技术是一种以荧光蛋白为材料的片段互补系统。其基本原理是将荧光蛋白在合适的位点切开，成形成不发荧光的两个片段，这两个片段不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光，但当这两个荧光片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，由于目标蛋白的相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光波长激发下，发射荧光。双分子荧光互补技术能够特异性的检测到蛋白的相互作用，是一种检测蛋白相互作用的简便、直观、灵敏的方法。
本发明提出的基于双分子荧光互补技术的免疫诊断检测方法是首先将荧光蛋白按特定位点切开形成不发荧光的两个片段，通过基因重组技术，表达纯化含有连接序列的两个荧光蛋白片段，得到的含有连接序列的荧光蛋白N端片段与一抗体通过偶联剂相连，含有连接序列的荧光蛋白C端片段与另一抗体通过偶联剂相连，在待测物存在情况下，两个抗体和待测物形成三元复合物，同时荧光蛋白N端片段和荧光蛋白C端片段靠近、互补，并重新形成具有活性的荧光蛋白，荧光蛋白活性由荧光强度所体现，待测物的含量与形成的荧光蛋白强度呈正相关。通过检测待测物的荧光强度，然后再通过标准曲线把信号转换成待测物的浓度，可判断目标待测物的量。此种技术方法适用于所有技术平台的抗体与抗原反应的免疫检测，不同的双分子荧光之间的光谱差异可用于同时检测多种待测物，及时诊断多种疾病，在体外免疫诊断中具有巨大应用前景。
目前，针对荧光免疫检测的方法，需要对抗原抗体反应液进行清洗，洗去未结合抗原的荧光标记抗体，由于清洗会造成试剂的精密度下降，而基于双分子荧光互补技术的免疫检测方法不需要对反应完成后的反应液进行清洗，从而能大大提高试剂的精密度和准确度。
在此之前，双分子荧光互补技术主要用于细胞内蛋白质之间的相互作用，用于免疫诊断的检测几乎空白，本发明首次提出了一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测的方法，可快速、简便、准确地诊断相关疾病。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测的方法。
本发明所提供的免疫检测待测抗原的方法，具体可包括如下步骤：
(1)将荧光蛋白分成N端部分和C端部分：在所述N端部分的编码基因的5’或3’末端加上连接序列基因，形成含有连接序列的荧光蛋白N端片段；在所述C端部分的编码基因的5’或3’末端加上连接序列基因，形成含有连接序列的荧光蛋白C端片段；
其中，所述连接序列的加入是为了使荧光蛋白能够充分折叠。
(2)将所述含有连接序列的荧光蛋白N端和C端基因序列导入表达宿主，诱导表达纯化得到目的蛋白。
(3)将所述含有连接序列的荧光蛋白N端和C端通过戊二醛一步法或两步法、或EDC/NHS法、或过碘酸钠氧化法分别偶联到抗体上。
(4)在待测物存在情况下，两个抗体和待测物形成三元复合物，同时荧光蛋白N端片段和荧光蛋白C端片段靠近、互补，并重新形成能具有活性的荧光蛋白，荧光蛋白活性由荧光强度所体现，待测物的含量与形成的荧光蛋白强度呈正相关。通过检测待测物的荧光强度，然后再通过标准曲线把信号转换成待测物的浓度，可判断目标待测物的量。
本发明建立了基于双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测方法，具有较高的灵敏度和准确度，适用于体外检测抗原的含量。
附图说明
图1双分子荧光互补技术用于免疫检测的示意图；
附图标记说明：1、抗体，2、连接序列，3、荧光蛋白N端片段，4、待测物，5、抗体，6、荧光蛋白C端片段，7、连接序列。
图2本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术用于免疫检测待测物的标准曲线示意图。
图3本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术用于免疫检测TSH标准曲线示意图。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测方法进行详细说明，检测机理如图1所述。
实施例一：
试剂盒主要组成：
(1)抗待测物抗体偶联的荧光蛋白N端片段；
(2)抗待测物抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
荧光蛋白为绿色荧光蛋白及其突变体、或蓝色荧光蛋白及其突变体、或青色荧光蛋白及其突变体、或黄色荧光蛋白及其突变体、或红色荧光蛋白及其突变体。
以黄色荧光蛋白(YFP)互补技术为例，具体实施过程为：
(1)含有连接序列的YFPN端片段的制备：
a、重组质粒的构建
以YFP为模板，通过PCR(上游引物：5’-CACGCATATGCGCTCCATCGCCACGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG-3’，下游引物：5’-CCACTCGAGTTAGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTC-3’)得到含有连接序列RSIAT的YFP1-154位氨基酸的N端片段的基因，通过采用NdeI和XhoI双酶切处理后，连入质粒pET28a上，构建含有YFP N端片段的重组质粒pET28a-YFPN1-154；
b、目的蛋白的获得
将上述重组质粒通过CaCl2法转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，鉴定正确后使用诱导剂IPTG进行诱导表达，诱导条件为摇床转速为200rpm，30℃，诱导3h后，5000rpm，室温下离心收集菌体，使用超声波破碎后，在15000rpm，4℃条件下离心30min，使用Ni亲和柱对目的蛋白进行纯化。
(2)含有连接序列的YFP C端片段的制备：
与上述YFP N端片段制备方法一致，但引物序列为：
上游引物：5’-CACGCATATGCGCCCGGCCTGCAAGATCCCGAACGACCTGAAACAGAAGGTCATGAACCACGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTG-3’
下游引物：5’-CCACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3’
连接序列为：RPACKIPNDLKQKVMNH
其中，所述连接序列的加入是为了使荧光蛋白能够充分折叠。
(3)将所述含有连接序列的YFP N端和C端通过偶联剂戊二醛或EDC/NHS法或过碘酸钠分别偶联到抗体上。
YFP N端片段偶联抗体，以戊二醛一步偶联法为例，具体实施过程为：
1)将0.1mg YFP N端片段加入到离心管中，用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFP N端片段稀释到1mg/mL。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25％的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗体，用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体，将活化的YFPN端片段和抗体混合。
6)4℃，反应过夜。
7)封闭：加入50μL 0.2mol/L赖氨酸溶液，室温封闭2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过SephadexG-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物，用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物，使用前稀释至所需浓度。
(4)YFP C端片段偶联抗体：
与上述YFP N端片段制备方法一致。
(5)待测物含量的检测：
检测方法为夹心法或竞争法或间接法，以双抗体夹心法为例。
本发明采用高度特异性的抗原抗体反应及双分子荧光互补技术，将荧光蛋白的N端和C端片段分别和待测物的两株特异性抗体连接。
检测时，将待测样品加入到含有待测物特异性抗体偶联的荧光蛋白N端和C端片段，混合反应5-60min。
在待测物存在情况下，两个抗体和待测物形成三元复合物，同时荧光蛋白N端片段和荧光蛋白C端片段靠近、互补，并重新形成能具有活性的荧光蛋白，待测物的含量与形成的荧光蛋白强度呈正相关。
a、待测物标准曲线的绘制：
配制不同浓度的待测物标准品溶液。
在反应孔中分别加入5-100μL标准品、加入10-100μL抗待测物抗体偶联的YFP N端片段，加入10-100μL抗待测物抗体偶联的YFP C端片段，37℃温育5-60min。温育后，用514nm激发光照射反应孔，测量每个反应孔527nm下的发光量，获得荧光信号值。
如图2所示，以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。
b、待测物含量的检测：
待测物含量的检测为检测一种待测物的含量或同时检测多种待测物，以检测一种待测物的含量为例。
在一定浓度范围内，待测物的含量与形成的荧光蛋白强度呈正相关，通过检测待测物的荧光强度，然后再通过标准曲线把信号转换成待测物的浓度。
以促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)为例，检测TSH在标本中的含量：
配制浓度为0μlU/mL，0.1μIU/mL，0.5μIU/mL，1μIU/mL，5μIU/mL，25μIU/mL，50μIU/mL，100μIU/mL的TSH标准品溶液。在反应孔中分别加入20μL标准品、加入50μL抗TSH抗体偶联的荧光蛋白N端片段，加入50μL抗TSH抗体偶联的荧光蛋白C端片段，37℃温育10min。温育后，用514nm激发光照射反应孔，测量每个反应孔527nm下的荧光发射光强度，记录荧光信号值。
如图3所示，以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。
含待测物样本测的荧光值为15783RFU，通过标准曲线换算待测物浓度为4.80μIU/mL。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法，其特征在于，将荧光蛋白按特定位点切开，通过基因重组技术表达纯化含有连接序列的两个互补荧光蛋白片段对，通过偶联剂将两个抗体分别与两个含有连接序列的互补荧光蛋白片段共价键连接，当两个抗体和待测物形成多元复合物，两个荧光蛋白片段靠近，重构荧光蛋白的活性，通过检测荧光强度的变化，判断待测物的量。
2.根据权利要求1所述的双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法，其特征在于是通过一种或多种偶联剂将荧光蛋白片段和抗体同时通过共价键连接，偶联剂包括戊二醛、EDC、NHS、过碘酸钠。
3.根据权利要求1所述的双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法，其特征在于荧光蛋白按特定位点切开，在待测物存在下，能重新构建荧光蛋白活性的任意荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白及其突变体、蓝色荧光蛋白及其突变体、青色荧光蛋白及其突变体、黄色荧光蛋白及其突变体、红色荧光蛋白及其突变体的一种，或任意两种或多种。
4.根据权利要求1所述的双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法，其特征在于可以将多对抗体同时分别与不同的互补蛋白片段对相连接，可同时检测多种待测物。
5.根据权利要求1所述的双分子荧光互补技术用于免疫诊断检测的方法，其特征在于，所述方法包括夹心法、竞争法、间接法。
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