FR2996918A1 - Antigenes gra recombinants et leur application pour le diagnostic precoce de la toxoplasmose - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à un procédé pour identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti-Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact dudit sérum préalablement prélevé, avec des antigènes capables de se lier avec lesdits anticorps anti-Toxoplasma gondii et la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes, le procédé étant caractérisé en ce que lesdits antigènes comprennent la combinaison de deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6. En particulier, les antigènes sont fixés sur un support, en particulier sur une plaque de test ELISA. Ce test sera préférentiellement réalisé en complément d'un autre test de diagnostic de la toxoplasmose.

Description

ANTIGENES GRA RECOMBINANTS ET LEUR APPLICATION POUR LE DIAGNOSTIC PRECOCE DE LA TOXOPLASMOSE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode pour diagnostiquer in vitro de façon précoce une infection par la toxoplasmose chez l'humain, ainsi qu'un kit de diagnostic. INTRODUCTION La toxoplasmose, infection causée par le protozoaire parasite Toxoplasma affecte au moins un tiers de la population humaine mondiale. Il n'existe qu'un seul genre et une seule espèce du parasite Toxoplasma gondii, mais les isolats parasitaires sont classés actuellement en 12 haplogroupes I à XII. Les souches rencontrées majoritairement en Europe et en Amérique du Nord sont de type II. Le parasite infecte le plus souvent des animaux à sang chaud, y compris l'être humain, mais son hôte définitif est un félidé. La prévalence de la toxoplasmose varie d'un pays à l'autre ; elle est comprise entre 60% et 80% dans certaines régions d'Amérique du Sud. En Europe de l'Ouest, la prévalence de la toxoplasmose varie de 50 à 70% ; elle varie de 20 à 50% en Europe du Sud ainsi que dans les régions humides de l'Afrique ; elle est de moins de 30% dans les pays Scandinaves et au Royaume-Uni, de 25 à 30% dans les pays d'Europe Centrale et elle est très faible en Asie du Sud Est et en Amérique du Nord (Pappas et al., 2009). En France, on estime que 40 à 50 % de la population adulte est infectée (source : Haute Autorité de Santé, 2009; Centre National de Référence de la Toxoplasmose (CNR)), généralement sans symptôme apparent, et qu'il y a de 200 000 à 300 000 nouvelles infections chaque année, dont 27 000 cas chez les femmes enceintes. Trois cents foetus présentant une toxoplasmose congénitale (CNR 2011), dont 30 développeront des séquelles graves, sont identifiés chaque année en France. Aux USA, la prévalence serait de 11% chez les femmes enceintes nées aux USA et de 28,1% chez celles nées hors limites des frontières (Jones et al., 2007). Dans ce pays, 1 enfant sur 10 000 est atteint de toxoplasmose congénitale (Brown et al., 2009; Lopez et al., 2000) et la toxoplasmose oculaire est responsable de 17% des cas d'uvéites et de 25% des cas d'uvéites postérieures.

Si l'infection des sujets immunocompétents par des souches de type II est généralement bénigne, elle peut s'avérer dramatique chez les sujets immuno-déficients ou lorsque le système immunitaire n'est pas encore fonctionnel (atteintes congénitales). Chez l'enfant atteint de toxoplasmose congénitale, les atteintes sont principalement cérébrales et oculaires (hydrocéphalie, calcifications intracrâniennes, convulsions, retard mental, choriorétinite). De plus, l'infection de sujets, même immunocompétents, par des souches atypiques peut être mortelle. Enfin, l'inflammation cérébrale temporaire qui se produit lors de l'infection par T. gondii a récemment été corrélée de façon positive à un ensemble de désordres neuropsychiatriques, parmi lesquels la schizophrénie (Yolken et al., 2009 ; Pedersen et al., 2011), les troubles bi-polaires, les maladies neuro-dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (Kusbeci et al., 2011) et la maladie de Parkinson (Miman et al., 2010). Il est donc important de pouvoir diagnostiquer précocement l'infection par T. gondii afin de mettre en place les traitements adéquats : combinaison de pyriméthamine-sulfadiazine et d'acide folique chez les patients atteints de toxoplasmose congénitale ou immuno-déprimés, et spiramycine chez la femme enceinte. ETAT DE LA TECHNIQUE Le diagnostic actuel de la toxoplasmose repose essentiellement sur la détection, à partir du sérum des patients, d'anticorps spécifiques d'isotypes G et M dirigés contre l'ensemble du parasite. Les taux d'immunoglobulines M (IgM), en principe marqueurs d'une infection récente, puis d'immunoglobulines G (IgG) sériques s'élèvent en effet dans les deux semaines qui suivent la contamination. Si les IgM sont le signe d'une infection récente (ils apparaissent en quelques jours, le pic est atteint en 2 - 3 mois puis ils diminuent), ils peuvent persister plusieurs mois, voire plusieurs années et ne sont donc pas des indicateurs fiables d'une séroconversion récente. De plus, chaque patient étant différent, il n'existe pas de niveau « seuil » des IgG qui permette de distinguer une infection ancienne d'une infection récente. La grande majorité des diagnostics est réalisée chez la femme enceinte, dans le cadre d'un diagnostic multiple nommé TORCH qui vise les agents pathogènes qui peuvent passer la barrière placentaire (T - Toxoplasma gondii, 0 - Other infections (Coxsackievirus, Syphilis, Varicella-Zoster Virus, HIV, Parvovirus B19), R - Rubella, C - Cytomegalovirus, H - Herpes simplex virus). Des résultats sérologiques positifs sont complétés par un test d'avidité des IgG et par la recherche de la présence du parasite par polymerase chain reaction (PCR) à partir du liquide amniotique dans le cas des femmes enceintes ou à partir de liquide céphalo-rachidien chez l'enfant (dans certains pays uniquement mais pas en France) ou les sujets immuno-déprimés suspectés d'une infection récente (Montoya and Remington, 2008). La majorité des trousses commercialisées de diagnostic de la toxoplasmose utilise des lysats parasitaires (antigènes totaux) pour la détection des anticorps spécifiques. Ces kits sont sensibles, spécifiques et automatisables mais sont soumis à des variations de qualité dans le temps et ils restent onéreux, du fait du mode de préparation des antigènes soumis à l'amplification des parasites dans la cavité intra-péritonéale de souris ou dans des cellules humaines en culture. La sensibilité des tests est également variable. L'utilisation de protéines recombinantes en tant qu'antigènes pour sensibiliser des supports utilisés pour la détection des anticorps spécifiques est donc en plein développement. Plusieurs antigènes de Toxoplasma gondii ont été identifiés et classés en différentes familles en fonction de leur localisation cellulaire : - Les antigènes des granules denses du toxoplasme (GRA1, GRA2, GRA3, GRA4, GRA5, GRA6, GRA7, GRA8...) - Les protéines de surface (SAG1 , SAG2, ...) - Les antigènes des rhoptries (organites de sécrétion propres aux Apicomplexa) tels que ROP1.... Un premier type de test, Architect, basé sur la détection de la protéine majeure de surface du parasite (SAG1) et de la protéine de granules denses GRA8, est commercialisé par la compagnie Abbott. La demande de brevet EP 1 082 343 d'Abbott décrit une composition diagnostique comprenant les antigènes p29 (GRA7), p30 (SAG1) et p35 (GRA8), ou p29 (GRA7), p35 (GRA8) et p66 (ROP1). Les antigènes GRA2 / p28 (Mercier et al., 1993; FR 2 692 282) et GRA6 /p32 (Lecordier et al., 1993; FR 2 702 497) sont des antigènes issus des granules denses, sécrétés par T. gondii et jouant un rôle essentiel dans le parasitisme intracellulaire. Il s'agit de composants majeurs des granules denses (organites de sécrétion propres aux Apicomplexa) et de la vacuole dans laquelle le parasite se multiplie, au sein de la cellule infectée. Ces protéines, très immunogènes, sont de bons candidats pour des applications diagnostiques.

La protéine recombinante GRA2, purifiée à partir d'un système de production bactérien, a été testée dans un test ELISA dont la spécificité était de 96.4% et la sensibilité de 95.8% à 100% pour des infections aiguës, plus faible pour des infections chroniques (Golkar et al., 2007) La protéine recombinante GRA6 a été testée dans un test ELISA qui montre une bien meilleure spécificité pour les sérums de patients présentant une infection aiguë que pour ceux des patients présentant une infection chronique (Golkar et al., 2008). Il a été proposé d'associer plusieurs antigènes recombinants pour augmenter la spécificité et la sensibilité des tests. En particulier, la protéine recombinante GRA2 a été associée à l'antigène ROP1 (P66) ; ces deux antigènes sont détectés plus fréquemment par les sérums des patients présentant une infection aiguë que par les sérums des patients présentant une infection chronique, permettant ainsi une distinction entre les deux cas cliniques (Holec-Gasior et al., 2009). La protéine recombinante GRA6 a été associée à GRA1, un autre antigène des granules denses, dans un test ELISA. Ce test, destiné à différencier des patients présentant un profil d'infection récente de ceux ayant une infection chronique, s'est avéré insuffisamment sensible pour cette application (Ferrandiz et al., 2004).

La combinaison des antigènes recombinants GRA2 et GRA6 a été utilisée dans une combinaison vaccinale mais la stimulation antigénique induite par la combinaison était décevante par rapport à celle obtenue par l'injection de la protéine GRA2 seule (Golkar et al., 2007). Un des grands enjeux du traitement de la toxoplasmose, notamment chez la femme enceinte, est de traiter la femme le plus précocement possible après la primo infection, afin de limiter au maximum les risques de passage du parasite à travers la barrière placentaire. Ceci n'est possible que si le diagnostic est établi au plus tôt. Ainsi, la mise au point de nouveaux tests permettant de diagnostiquer précocement l'infection répond à un réel besoin du corps médical. Par ailleurs, la spécificité des tests connus doit être améliorée car ceux-ci détectent encore trop de « faux-positifs ». En particulier, lors de la détection chez les nouveau-nés, il est nécessaire de distinguer, le plus précocement possible, une réaction positive due à la simple présence des anticorps maternels acquis pendant l'accouchement, d'une réelle réaction positive liée à une toxoplasmose congénitale.

EXPOSE DE L'INVENTION L'invention concerne une méthode pour détecter la présence d'anticorps antiToxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact de ce sérum avec une composition comprenant des protéines recombinantes GRA2 et GRA6.

Plus particulièrement, l'invention est relative à un test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) direct ou indirect qui permet la détection précoce dans le sérum humain, des anticorps spécifiques dirigés contre la combinaison antigénique GRA2 et GRA6. La sensibilité et la spécificité de ce test permettent d'envisager son utilisation pour la confirmation d'une séroconversion récente chez la femme enceinte et pour le diagnostic d'une toxoplasmose congénitale chez les nouveau-nés. Le premier avantage de ce test est sa précocité car il permet de détecter une infection très récente dans le sérum des individus testés. Le deuxième avantage majeur de ce test est qu'il permet de distinguer plus rapidement, sur des sérums de nouveau-nés prélevés à différents moments après la naissance, la présence d'anticorps, ce qui a pour intérêt d'exclure ou de confirmer rapidement le diagnostic d'une toxoplasmose congénitale chez le nouveau-né.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention concerne une méthode pour détecter la présence d'anticorps antiToxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact de ce sérum avec une composition comprenant des protéines recombinantes GRA2 et GRA6.

La sensibilité et la spécificité de cette méthode et du test ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) direct ou indirect qui applique cette méthode, permet d'envisager son utilisation pour la confirmation d'une séroconversion récente chez la femme enceinte et pour le diagnostic d'une toxoplasmose congénitale chez les nouveau-nés. L'invention concerne un procédé pour identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti-Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact dudit sérum préalablement prélevé, avec des antigènes capables de se lier avec lesdits anticorps anti-Toxoplasma gondii et la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes, procédé caractérisé en ce que lesdits antigènes comprennent la combinaison de deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6.

Un anticorps est une protéine complexe produite et utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les agents pathogènes de manière spécifique. Les anticorps sont des glycoprotéines de la superfamille des immunoglobulines. Ils sont formés de 4 chaînes polypeptidiques : 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères qui sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures. Ces chaînes forment une structure en Y. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant et d'un domaine variable ; les chaînes lourdes sont composées d'un fragment variable et de 3 ou 4 fragments constants selon l'isotype. Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères. Les anticorps ont la capacité de reconnaître et de se fixer de manière spécifique à un antigène, cette spécificité étant conférée par la présence des domaines variables. Par « anticorps anti-Toxoplasma gondii », on entend tout anticorps capable de se fixer à un antigène issu de ce parasite Toxoplasma gondii. Cette appellation désigne les anticorps polyclonaux et monoclonaux. Par « sérum préalablement prélevé », on entend tout prélèvement de sang humain ou animal, prélevé selon les techniques bien connues de l'homme du métier, notamment au moyen d'une seringue, et centrifugé pour éliminer les cellules sanguines et les facteurs de coagulation. Le sérum sera de préférence conservé au froid pour limiter la dégradation des protéines. Le sérum pourra également être désigné dans la présente demande, par le terme « échantillon ».

Le terme « antigène » désigne, selon l'invention, toute protéine issue de Toxoplasma gondii ou toute protéine recombinante synthétisée à partir d'ADN issu de Toxoplasma et susceptible d'induire une réponse immunitaire chez un sujet infecté. Un antigène possède généralement plusieurs épitopes différents qui sont autant de sites de liaison aux anticorps. Le terme « liaison d'anticorps avec lesdits antigènes » désigne l'interaction entre un antigène et un anticorps spécifique de cet antigène et plus spécifiquement, le complexe immun résultant de la combinaison d'un épitope immunogène de l'antigène avec un anticorps dirigé spécifiquement contre cet épitope. Les deux protéines GRA2 et GRA6 font référence à des protéines à haut pouvoir antigénique de Toxoplasma gondii, telles que décrites précédemment.

Le terme « protéines recombinantes » désigne des protéines produites dans des cellules modifiées génétiquement, notamment par introduction d'un vecteur d'expression portant un gène d'intérêt. Ce gène codant pour une protéine d'intérêt est exprimé par l'espèce productrice (bactéries, cellules mammifères en culture, etc.). Préférentiellement, les protéines recombinantes seront produites dans un système bactérien et notamment, chez Eschetichia colt. Après purification, elles seront utilisées pour 'capturer' les anticorps potentiellement présents dans un sérum humain ou animal. Les antigènes présents dans le procédé selon l'invention comprennent au moins les protéines recombinantes GRA2 et GRA6 mais peuvent également comprendre d'autres protéines recombinantes telles que GRA1, GRA3, GRA4, GRA5, GRA7, GRA8, etc.

Selon un aspect préféré de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que les antigènes consistent en la combinaison des deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6 seulement. Les protéines GRA2 et GRA6 peuvent être présentes en toutes proportions et notamment, leur rapport molaire GRA2/GRA6 peut être de 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20, ou 90/10. Selon un aspect préféré de l'invention, le rapport molaire GRA2/GRA6 est compris entre 40/60 et 60/40. Le procédé décrit ci-dessus peut être réalisé selon tous types de dosage immunologiques connus de l'homme du métier, tels que des dosages radio-immunologiques qui utilisent des composés radioactifs associés à des antigènes ou des dosages immuno- enzymatiques qui utilisent des enzymes couplées aux antigènes. Le procédé de détection de présence ou d'absence d'anticorps anti-Toxoplasma gondii dans un sérum, aussi appelé procédé de dosage d'anticorps, peut être réalisé en solution ou sur un support solide.

L'invention est en particulier relative à un procédé caractérisé en ce que les antigènes sont fixés sur un support. Ce support sera de manière préférentielle, une plaque de test ELISA. La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais « enzyme-linked immunosorbent assay », littéralement « dosage d'immunoabsorption par enzyme liée », c'est-à-dire dosage immuno-enzymatique sur support solide) est classiquement utilisée en immunologie pour détecter et doser un anticorps ou un antigène dans un échantillon. Ce test est caractérisé par le fait que le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par spectroscopie. L'ELISA est basé en général sur l'utilisation de deux anticorps : l'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène ou fluorogène. Plusieurs techniques ELISA sont connues de l'homme du métier, telles que l'ELISA direct, l'ELISA indirect, l'ELISA en sandwich ou l'ELISA par compétition.

Les étapes de l'ELISA indirect, technique la plus couramment utilisée pour déterminer la concentration en anticorps du sérum, sont : 1. l'application d'un antigène connu sur une surface, le plus souvent celle d'un puits d'une plaque de micro-titration. L'antigène est fixé à la surface, de façon à le rendre immobile ; 2. La saturation des sites non occupés par l'antigène par une protéine non spécifique, généralement l'albumine sérique bovine ; 3. le recouvrement des puits par les échantillons de sérum à tester, dont la concentration en anticorps est, par définition, inconnue ; 4. le rinçage de la plaque, de façon à retirer les anticorps non liés. Après rinçage, seuls les complexes antigène-anticorps demeurent attachés à la surface du puits ; 5. l'ajout aux puits des anticorps secondaires qui se lieront à l'anticorps primaire (il s'agit dans ce cas, d'un anticorps anti-immunoglobuline). Ces anticorps secondaires sont couplés à l'enzyme modificatrice de substrat qui permet de suivre l'évolution de la réaction ; 6. le second rinçage de la plaque, de sorte à éliminer les anticorps non liés ; 7. l'application d'un substrat qui, s'il est converti par l'enzyme, émet un signal chromogénique ou fluorescent ; 8. la quantification du résultat par spectrophotométrie ou tout autre appareil d'optique. L'enzyme agit comme amplificateur : quand bien même peu d'anticorps conjugués à l'enzyme seraient attachés, l'enzyme catalyserait la formation de nombreux signaux, ce qui rend ce test très sensible mais augmente également le nombre de faux-positifs. Il faut donc prévoir des puits « contrôles ». Dans le procédé selon l'invention, de manière préférée, la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes comprend l'application de réactifs permettant de détecter les anticorps fixés aux protéines recombinantes. En particulier, ces réactifs permettent de doser la quantité d'anticorps présents dans le sérum. Selon un aspect préféré de l'invention, le sérum provient d'une femme enceinte. Selon un autre aspect préféré de l'invention, le sérum provient d'un nouveau-né.

En particulier, le procédé de l'invention peut être avantageusement utilisé pour diagnostiquer précocement une toxoplasmose congénitale. Le terme « précocement » indique que le diagnostic pourra se faire très tôt au cours des premiers mois de vie de l'enfant. Le procédé selon l'invention peut également être caractérisé en ce qu'il est réalisé en complément d'un autre test de diagnostic de la toxoplasmose. En effet, ce test est préférentiellement un test de « deuxième intention », présentant une très bonne sensibilité vis-à-vis des sérums d'infection récente. Ce test de diagnostic sera préférentiellement proposé dans des situations particulières où une séroconversion récente est suspectée, en tant que test complémentaire aux tests de diagnostic de routine.

La présente invention est également relative à un kit destiné à identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti-Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant : - Un support (plaque ELISA) sur lequel sont fixées les protéines recombinantes G RA2 et G RA6 ; - Des réactifs permettant de détecter les anticorps se fixant aux protéines recombinantes. De préférence, les protéines recombinantes GRA2 et GRA6 seront dans un rapport molaire compris entre 40/60 et 60/40 dans ce kit.

Protocole ELISA - Le support solide est recouvert pendant une nuit, à 4°C, d'une solution comprenant : o 100 pL de GRA2 (21-185) (II) notée GRA2 (II), ou o de protéine GRA6 (41-152) (II) notée GRA6 Nt (II), ou o d'un mélange 50/50 de GRA2 (II) et GRA6 Nt (II) noté GRA2 + GRA6 Nt (II), soit 1,5 pg_de protéines dialysées en PBS puis diluées dans un tampon carbonate pH 9,6, ou nombre équivalent de moles de peptide pUET (= 0,5 pg) dialysé en PBS. En effet, les protéines recombinantes GRA2 et GRA6 sont fusionnées avec le peptide pUET et ainsi purifiées après synthèse ; pour plus de précision du test, on déduit des valeurs d'absorbance obtenues avec GRA2 (II), GRA6 (II) ou le mélange, la valeur d'absorbance du peptide pUET. - Le support solide subit trois lavages avec un tampon classique PBS + 0.05% Tween 20 (PBS-T) sur laveur. - Le blocage des sites non spécifiques se fait avec de la sérum albumine bovine (BSA) en concentration de 1%, pendant une heure à 37°C. - Le support est lavé trois fois dans un tampon PBS-T. - Incubation du sérum humain : à 37°C, pendant 1 h : 100 pL sérum humain 1 /50ème dans PBS-T 0.5% BSA, 5% (v/v) lysat bactérien 4 tg/ml. - Le support est lavé trois fois dans un tampon PBS-T. - Incubation de l'anticorps conjugué. A 37°C, pendant 1 h: 100 pL sérum de lapin anti- IgG humaines (H+L) - peroxydase (Jackson) 1/30,000ème. - Le support est lavé trois fois dans un tampon PBS-T. - Révélation. 10 min, Température ambiante, dans le noir : 100 pL 1-Step Ultra TMB, avec arrêt de la réaction grâce à l'ajout de 50 pL HCI 3 M. - Lecture des résultats à une Densité Optique de 450 nm, réf 630 nm.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1: Analyse récapitulative de 259 sérums négatifs, permettant de déterminer le seuil de positivité (à 2 écarts-types et à 3 écarts-types) de chacun des 3 ELISA GRA, ainsi que la spécificité de chacun des 3 tests : (A) GRA (II) ; (B) GRA6 Nt (II ; (C) GRA2+GRA6 Figure 2. Analyse récapitulative de 253 sérums chroniques (infections datant de plus de 12 mois : sérums positifs en IgG par les tests de routine mais négatifs en IgM) permettant de montrer que les tests ELISA GRA ne sont pas adaptés au diagnostic de première intention ; (A) ELISA GRA2+GRA6 ; (B) IgG Vidas. Figure 3. Analyse de 122 séroconversions récentes datées Figure 4. Analyse de 120 sérums de séroconversions séquentielles, issus de 32 femmes enceintes Figure 5. Analyse cinétique de 106 prélèvements de toxoplasmoses congénitales suspectées Figure 6 : tableau récapitulatif de la sensibilité des tests ELISA GRA.

ET: écart-type ; SC : séroconversion, TC: toxoplasmose congénitale Dans chaque case, est représenté le nombre d'échantillons trouvés positifs dans le test ELISA GRA par rapport au nombre d'échantillons trouvés positifs dans le test VIDAS IgG (colonnes « par rapport au VIDAS IgG ») et par rapport à l'ensemble des deux tests IgG (« colonnes « par rapport aux tests IgG (VIDAS + IF) »).

EXEMPLES Plusieurs tests ont été réalisés sur un total de 860 sérums humains collectés au Service de Parasitologie et de Mycologie de l'Hôpital Michallon, lors d'analyses de routine (sérums de femmes enceintes, d'enfants suspectés de toxoplasmose congénitale, de patients positifs pour le HIV, en attente de greffe, etc). Ces sérums comprenaient : o 259 sérums négatifs par les tests de routine, c'est-à-dire dont le seuil de détection des tests utilisés ne permettait pas de mettre en évidence la présence d'anticorps anti-toxoplasmose ; o 253 sérums diagnostiqués comme positifs pour une toxoplasmose ancienne, c'est-à-dire datant de plus de douze mois (c'est-à-dire sérums pour lesquels des taux positifs d'IgG avaient été détectés mais sans IgM.) o 122 sérums pour lesquels la date de la séroconversion avait pu être estimée comme récente, c'est-à-dire inférieure à 1 an (répartition par intervalles d'un mois) ; parmi ces 122 sérums, 120 étaient positifs en IgG par les tests de routine (ELFA VIDAS et/ou IFI) ; o 120 sérums provenant de 32 patientes suivies séquentiellement sur plusieurs prélèvements, dans le cadre d'une séroconversion en cours de grossesse ; parmi ces 120 sérums, 79 étaient positifs en IgG par les tests de routine (ELFA VIDAS et/ou IFI) ; o 106 prélèvements issus de 20 nourrissons chez qui on soupçonnait une toxoplasmose congénitale (au final, 10 cas confirmés de toxoplasmose congénitale et 10 cas négatifs). Parmi ces 106 sérums, 90 étaient positifs en IgG par les tests de routine (ELFA VIDAS et/ou 'FI). Le procédé selon l'invention est un test dont la sensibilité pour les sérums d'infection récente et la spécificité sont particulièrement bonnes. La sensibilité d'un test est sa capacité de donner un résultat positif lorsque la maladie (ici, l'infection par Toxoplasma gondii) est présente. La spécificité du test est, elle, la capacité du test de donner un résultat négatif lorsque la maladie n'est pas présente. Les exemples présentés ci-dessous illustrent les bonnes performances du procédé selon l'invention. Exemple 1: Analyse récapitulative de 259 négatifs, permettant de déterminer le seuil de positivité de chacun des 3 tests ELISA GRA (à 2 écarts-types et à 3 écarts-types) ainsi que la spécificité de chacun des 3 tests.

Seuils des tests commerciaux utilisés : - Seuil du test IgG ELFA Vidas (bioMérieux) : DO<4 Ul/m1 négatif ; DO>7 Ul/m1 positif, DO = 4-7 Ul/m1 équivoque - Seuil du test IgG IFI (Immunofluorescence Indirecte) : 8 Ul/m1 - Seuil du test IgM ELISA Vidas (bioMérieux) : DO<0.55 négatif ; DO>0.65 positif ; DO=0.55-0.65 équivoque - Seuil du test IgM IFI : 1/40 - Seuil du test IgM ISAGA (bioMérieux) : 9 Les valeurs des tableaux présentés peuvent être analysées en tenant compte des seuils de positivité listés ci-dessus. Ces valeurs définissent la quantité d'anticorps détectée qui est suffisamment significative pour indiquer une infection par Toxoplasma En comparaison, les résultats présentés en figure 1 permettent de déterminer les seuils de positivité et de spécificité des tests de la présente invention.

Seuil de positivité et spécificité des tests ELISA GRA développés par les inventeurs : La spécificité du test ELISA GRA est calculée en divisant le nombre de sérums trouvés négatifs dans le test ELISA GRA par le nombre de sérums négatifs passés dans le test ELISA et le tout multiplié par 100. - Seuil de positivité de l'ELISA GRA2 (II) - résultats en figure lA : A450 =0,218 (2 écarts-types, chiffres en gras dans le tableau) et A450=0,314 (3 écarts-types, chiffres an gras et fond de cellules plus foncé). Sur 253 sérums testés négatifs par les tests de routine, 3 sont au dessus du seuil de positivité du test ELISA GRA2 (II) (3 ET). Ainsi la spécificité est de : 250/253 x100 = 98,81% - Seuil de positivité de l'ELISA GRA6 Nt (II) - résultats en figure 1B : A450= 0,422 (2 écarts-types, chiffres en gras dans le tableau) et A450=0,604 (3 écarts-types, chiffres an gras et fond de cellules plus foncé) Sur 253 sérums testés négatifs par les tests de routine, 6 sont au dessus du seuil de positivité du test ELISA GRA6 Nt (II) (3 ET) ; donc spécificité du test est de: 247/253 x100 = 97,62% - Seuil de positivité de l'ELISA GRA2+GRA6 Nt (II) - résultats en figure 1C: A450=0,264 (2 écarts-type, chiffres en gras dans le tableau) et A450= 0,364 (3 écarts-type, chiffres an gras et fond de cellules plus foncé) Sur 255 sérums testés négatifs par les tests de routine, 3 sont au dessus du seuil de positivité du test ELISA GRA6 Nt (II) (3 ET) ; donc spécificité du test est de: 252/255 x100 = 98,82% La sensibilité d'un test est calculée en divisant le nombre d'échantillons trouvés positifs dans le test (ELISA GRA) par le nombre d'échantillons positifs dans le test de diagnostic de référence et en multipliant le tout par 100. La difficulté, pour le diagnostic de la toxoplasmose, est qu'il n'y a pas de test de référence. C'est l'accumulation des résultats de 5 tests différents recherchant à la fois les IgM et les IgG, ainsi que le suivi du patient dans le temps, qui permet de définir si celui-ci est infecté ou non et s'il l'est, depuis quand. On définira néanmoins la sensibilité de nos tests ELISA GRA: - par rapport au test VIDAS IgG, même si celui-ci est connu pour détecter les IgG tardivement (alors que le test IF IgG, qui détecte les IgG dirigées contre les protéines de surface du parasite, se positive plus précocement) ; - par rapport à l'ensemble des deux tests IgG réalisés au laboratoire en routine (VIDAS IgG et IF IgG) (voir figure 6). Les résultats développés ci-après tendent à prouver que : - La sensibilité des 3 tests ELISA GRA, sur l'ensemble des sérums testés, est très variable, selon que l'on considère des sérums d'infection ancienne (sensibilité faible, de 86,56% pour le test GRA2 + GRA6 Nt (II) Cf. figure 6), de séroconversions récentes ou des sérums issus de nourrissons suspectés de toxoplasmose congénitale (sensibilité supérieure à 100% pour le test GRA2 + GRA6 Nt (II) car il détecte plus de sérums que les tests de routine (Cf. figure 6). - par contre, le test ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) présente une très bonne sensibilité vis-à-vis des sérums d'infection très récente, ce qui justifie de proposer ce test de diagnostic dans des situations particulières où une séroconversion récente est suspectée, en tant que test complémentaire aux tests de diagnostic de routine (voir figure 6). Exemple 2 - Analyse de 253 sérums chroniques (= issus de personnes infectées dans une période datant de plus de 12 mois) Les figures 2A et 2B montrent l'analyse de 253 sérums d'infection ancienne, à l'aide de deux tests différents : - Un ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (II) - voir figure 2A - Le kit commercialisé par Biomérieux, « ELFA IgG VIDAS®», ci-après nommé 'kit Biomérieux'. - voir résultats figure 2B.

Ce kit utilise le principe de dosage « ELFA » associant la méthode ELISA à une lecture finale en fluorescence bleue. Le seuil de positivité du kit est de 4-8 Ul/mL. Il permet de détecter : 1 sérum négatif (chiffre en italique, fond de la cellule blanc) 29 sérums avec un titre entre 4 et 8 Ul/mL, donc requivoques' (chiffres en gras, fond de la cellule gris clair) 223 sérums avec un titre supérieur à 8 Ul/mL c'est-à-dire positifs (fond de la cellule gris foncé) L'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (11) (figure 2A) a un seuil de positivité de 0,364 (3 ET) et 0,264 (2 ET). Il détecte 77,07% des infections anciennes alors que le kit Biomérieux en détecte 88,14%, dans la catégorie « Pos. 3 ET », soit avec un seuil de positivité du test placé à la valeur moyenne d'absorbance des 255 sérums négatifs + 3 écarts-types comme présenté précédemment (0,264 pour 2 ET, 0,364 pour 3 ET).

Si on descend le seuil du test à 2 écarts-types seulement, l'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (11) détecte 86,56% des infections anciennes alors que le kit Biomérieux en détecte 99,6%. Il apparait donc que l'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (11) n'est pas approprié pour détecter les infections anciennes.

Les tableaux présentés dans les figures 3, 4 et 5 reprennent dans le détail, les données issues de l'analyse des différents sérums d'infection récente. EXEMPLE 3 - ANALYSE DE 122 SEROCONVERSIONS DATEES (DONT 120 ECHANTILLONS POSITIFS EN IGG) Les résultats sont présentés en figure 3. Huit tests, dont les seuils sont rappelés entre parenthèses, sont réalisés en parallèle sur chaque sérum : - ELISA IgG Vidas (4-8 Ul/mlequivoque) - IFI IgG (8 Ul/m1) - ELISA IgM Vidas (0,55-0,65 DO equivoque) - IFI IgM (Dil 1/40) - ISAGA IgM (9) - GRA2 (II) (0,218-0,314) - GRA6 Nt (II) (0,422-0,604) - GRA2 + GRA6 Nt (II) 50/50 (0,264-0,364) Pour les tests ELISA GRA : - les couleurs foncées de fond de cellules représentent les valeurs d'absorbance situées au dessus du seuil de positivité (3 ET). - les couleurs claires représentent les valeurs d'absorbance situées entre le seuil de positivité (2 ET) et le seuil de positivité (3 ET). Pour les tests de routine : - les couleurs foncées de fond de cellules représentent les valeurs positives ; - les couleurs claires représentent les valeurs situées dans la zone équivoque, quand elle existe. Les cellules en fond blanc représentent les résultats obtenus en dessous du seuil de chaque test. Les lignes de fond plus foncées sont celles pour lesquelles des sérums sont manquants.

ELISA GRA2 (II) 90 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine 90 + 11 = 101 sérums positifs (2 ET) sur 120 sérums positifs en IgG par les tests de routine ELISA GRA6 Nt (II) 105 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine 105 + 0 = 105 sérums positifs (2 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) 121 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine 121 + 0 = 121 sérums positifs (2 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine VIDAS IgG 102 sérums positifs (3 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine 102 + 8 = 110 sérums positifs (2 ET) sur 120 positifs en IgG par les tests de routine Résultats obtenus avec le test ELISA IgG GRA2 (II) + GRA6 Nt (II) Positivité supérieure à 2 écarts-types : 121/120 = 100,83% Positivité supérieure à 3 écarts-types: 121/120 = 100,83% Equivoques. : 0/120 = 0% Négatifs : 1/120 = 0,83% Résultats obtenus avec le test Biomérieux (ELFA Vidas IgG) Positivité supérieure à 2 écarts-types: 110/120 = 90,66% Positivité supérieure à 3 écarts-types: 102/120 = 85% Equivoques. : 8/120 = 6,66% Negatifs : 12/120 = 10% Si on considère les pos.>3ET, le test GRA2+GRA6 Nt (11) est donc plus sensible et permet de détecter l'infection plus précocement que l'ELFA IgG VIDAS,.

Quand on regarde les résultats plus en détails, par comparaison au test ELFA IgG Vidas, le test GRA2+GRA6 NT (11) permet en fait de « récupérer » : - 8 sérums entre 0 et 1 mois, dont 2 encore négatifs en IFI IgG (tous positifs en IgM) - 3 sérums entre 1 et 2 mois (positifs en IgM), - 1 sérum entre 6 et 7 mois (positif en IgM et en IF IgG) Le test GRA2 + GRA6 permet donc d'identifier des sérums jugés « négatifs » en IgG par un autre test mais qui sont en fait « positifs » pour l'infection à Toxoplasma gondii et pour lesquels le diagnostic ne reposait que sur la détection des IgM.

Ceci est dû au fait que le test développé par les inventeurs présente une meilleure sensibilité vis-à-vis des sérums d'infection récente (supérieure à 100% car permet de détecter plus d'échantillons que les tests de routine) que les tests actuellement commercialisés (entre 85 et 91,66%, selon les écarts types considérés).

EXEMPLE 4 - ANALYSE DE 120 SERUMS DE SEROCONVERSIONS SEQUENTIELLES, ISSUS DE 32 PATIENTES (79 SERUMS POSITIFS EN IGG PAR LES TESTS DE ROUTINE) Les résultats sont présentés en figure 4. Les tests ont été réalisés à partir des sérums de 32 femmes enceintes. Pour chacune d'entre elles, de 3 à 5 échantillons de sérum ont été testés.

Pour 11 patientes, l'ELISA GRA2 + GRA6 Nt (11) a permis une détection de l'infection plus précocement que les tests de routine. Huit tests, dont les seuils sont rappelés entre parenthèses, sont réalisés en parallèle sur chaque sérum : - ELISA IgG Vidas (4-8 Ul/mlequivoque) - IFI IgG (8 Ul/m1) - ELISA IgM Vidas (0,55-0,65 DO equivoque) - IFI IgM (Dil 1/40) - ISAGA IgM (9) - GRA2 (II) (0,218-0,314) - GRA6 Nt (II) (0,422-0,604) - GRA2 + GRA6 Nt (II) 50/50 (0,264-0,364) Une neuvième colonne indique le diagnostic formulé par les praticiens, sans tenir compte des résultats obtenus postérieurement avec les tests ELISA GRA2 (11), GRA6 Nt (11) et GRA2+GRA6 Nt (11). Les mêmes codes couleurs que pour la figure 3 sont utilisés. Résultats sur 120 sérums dont 79 positifs en IgG par les tests de routine : ELISA GRA2 (11) 75 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine 75 + 12 = 87 sérums positifs (2 ET) sur 79 sérums positifs en IgG par les tests de routine ELISA GRA6 Nt (11) 78 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine 78 + 8 = 86 sérums positifs (2 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine ELISA GRA2 + GRA6 Nt (11) 85 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine 85 + 9 = 94 sérums positifs (2 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine VIDAS IgG 56 sérums positifs (3 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine 56 + 6 = 62 sérums positifs (2 ET) sur 79 positifs en IgG par les tests de routine Pour les patientes n°3, 14, 16, 20, 21, 22, 27, 28, 30, 31(10 patientes/32 dont 3 patientes à 2 ET) : le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (11) se révèle positif avant même que les IgM ne soient détectées.

En particulier, la patiente 3 a subi quatre prélèvements à des intervalles de 1 mois. Lors du test du I er sérum, selon le kit Biomérieux, le sérum était considéré comme négatif pour la présence d'IgG anti-Toxoplasma gondii. Or, dès ce premier prélèvement, le test GRA2+GRA6 Nt (II) indiquait la présence d'anticorps IgG anti-GRA.

Pour la patiente 23 (positive uniquement en IgM ISAGA très sensible), le test GRA2+GRA6 Nt (II) indiquait la présence d'anticorps IgG anti-GRA. Pour les patientes n°1, 7, 9, 15, 17, 18, 19, 24, 29, 32 (10 patientes/32) : le diagnostic positif n'a été rendu que sur la seule présence des IgM, ou des IgM et d'une valeur seuil des IgG en IFI. Le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (II) aurait permis d'assurer le diagnostic par la mise en évidence d'IgG précoces anti-GRA. En particulier, la patiente 1 a subi quatre prélèvements à des intervalles de 1 mois. Lors du test du 1 er sérum, selon le kit Biomérieux ainsi qu'avec le kit GRA2 + GRA6 Nt (II), le sérum était considéré comme négatif pour la présence d'IgG anti-Toxoplasma gondii. Lors du test du deuxième sérum, au contraire, les valeurs étaient toujours en dessous du seuil de détection pour le test Biomérieux mais elles indiquaient la présence d'anticorps IgG anti-GRA lors de l'utilisation du test GRA2+GRA6 Nt (II).

Pour les patientes 1 et 8 : le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 Nt (II) se négative en même temps que l'IFI IgM si on considère le seuil de positivité à 3 ET mais il reste positif à 2 ET. Il y a donc une diminution sensible de la quantité d'IgG dirigées contre GRA2 (II) et GRA6 Nt (II). EXEMPLE 5 - ANALYSE CINETIQUE DE 106 PRELEVEMENTS DE TOXOPLASMOSES 25 CONGENITALES (10 CAS +, 10 CAS -) DONT 90 PRELEVEMENTS POSITIFS EN IGG PAR LES TESTS DE ROUTINE Les résultats obtenus sont présentés en figure 5. Les mêmes codes couleurs que pour la figure 3 sont utilisés. 30 106 sérums dont 90 positifs en IgG par les tests de routine : ELISA GRA2 (II) 60 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine 60 + 7 = 67 sérums positifs (2 ET) sur 90 sérums positifs en IgG par les tests de routine 35 ELISA GRA6 Nt (II) 63 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine 63 + 7 = 70 sérums positifs (2 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II) 77 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine 77 + 4 = 81 sérums positifs (2 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine VIDAS IgG 76 sérums positifs (3 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine 76 + 10 = 86 sérums positifs (2 ET) sur 90 positifs en IgG par les tests de routine Le test ELISA IgG GRA2 + GRA6 NT (II) se négative plus rapidement que l'ELFA IgG Vidas : cas des patients 4, 5, 8, 12, 13, 16, 20 (7/10 TC - à 3 ET et 9/10 à 2 ET)).

Le patient N°8 a par exemple été diagnostiqué positif en IgG à la naissance (prélèvement N°37) et a donc dû être suivi, alors qu'il était déjà négatif par le test ELISA GRA2 + GRA6 Nt (Il). Les IgG détectées par les tests de routine (VIDAS IgG et IF IgG) étaient donc des IgG résiduelles de la mère, passées dans le sang de l'enfant lors de l'accouchement. Ces IgG s'éliminent naturellement après quelques semaines. De même, le patient N°12 a été diagnostiqué positif en IgG anti-Toxoplasma gondii par les tests de routine jusqu'au prélèvement N°64 alors qu'il aurait été diagnostiqué négatif dès le prélèvement N°63 par le test ELISA GRA2 + GRA6 Nt (II).

A noter le cas particulier du patient N°20: rebond de ses IgG après s'être négativées.

REFERENCES BREVETS FR 2 692 282 FR 2 702 497 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Pappas G. Roussos N,.Falagas ME « Toxoplasmosis snapshots: global status of Toxoplasma gondii seropre valence and implications for pregnancy and congenital toxoplasmosis." International Journal for Parasitology [2009, 39(12):1385-1394] Jeffrey L. Jones, Deanna Kruszon-Moran, Kolby Sanders-Lewis and Marianna Wilson. "Toxoplasma gondii Infection in the United States, 1999-2004, Decline from the Prior Decade"; Am J Trop Med Hyg September 2007 vol. 77 no. 3405-410 Brown ED, Chau JK, Atashband S, VVesterberg BD, Kozak FK "A systematic review of neonatal toxoplasmosis exposure and sensorineural hearing loss." International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology [2009, 73(5):707-711] Lopez A, Dietz VJ, Wilson M, Navin TR, Jones JL. "Preventing congenital toxoplasmosis." 20 MMVVR Recomm Rep. 2000 Mar 31;49(RR-2):59-68. R.H. Yolken, F.B dickerson, E. Fuller Torrey "Toxoplasma and schizophrenia" Parasite Immunology Volume 31, Issue 11, pages 706-715, November 2009 25 Marianne Giortz Pedersen, M.Sc.; Hanne Stevens, M.Sc.; Carsten Bocker Pedersen, Dr.Med.Sc.; Bent Norgaard-Pedersen, Dr.Med.Sc.; Preben Bo Mortensen, Dr.Med.Sc. "Toxoplasma Infection and Later Development of Schizophrenia in Mothers" Am J Psychiatry 2011;168:814-821. 30 Kusbeci, Ozge Yilmaz MD; Miman, Ozlem MD, PhD; Yaman, Mehmet MD; Aktepe, Orhan Cem MD; Yazar, Suleyman MD, PhD "Could Toxoplasma gondii Have any Role in Alzheimer Disease?" Alzheimer Disease & Associated Disorders: January-March 2011 - Volume 25 - Issue 1 - p 1-3. 0 Miman, OY Kusbeci, OC Aktepe, Z Cetinkaya - "The probable relation between Toxoplasma gondii and Parkinson's disease » Neuroscience letters, 2010- Elsevier Jose G. Montoya and Jack S. Remington - « Management of Toxoplasma gondii Infection during Pregnancy"Clin Infect Dis. (2008) 47 (4): 554-566. Corinne Mercier, Laurence Lecordiera, Françoise Darcya, Didier Desleea, Avril Murraya, Béatrice Tourvieillea, Pierrette Maesb, André Caprona, Marie-France Cesbron-Delauw « Molecular characterization of a dense granule antigen (Gra 2) associated with the network of the parasitophorous vacuole in Toxoplasma gondir Molecular and Biochemical Parasitology , Volume 58, Issue 1, March 1993, Pages 71-82 Laurence Lecordier; Corinne Merciera, Gérard Torpiera, Béatrice Tourvieillea, Francoise Darcya, Liu Jin Lia, Pierette Maesb, André Tartarb, André Caprona, Marie-France Cesbron- Delauw « Molecular structure of a Toxoplasma gondii dense granule antigen (GRA 5) associa ted with the parasitophorous vacuole membrane" Molecular and Biochemical Parasitology Volume 59, Issue 1, May 1993, Pages 143-153 Golkar M, Rafati S, Abdel-Latif MS, Brenier-Pinchart MP, Fricker-Hidalgo H, Sima BK, Babaie J, Pelloux H, Cesbron-Delauw MF, Mercier C. "The dense granule protein GRA2, a new marker for the serodiagnosis of acute Toxoplasma infection: comparison of sera collected in both France and Iran from pregnant women." Diagn Microbiol Infect Dis. 2007 Aug;58(4):419- 26.

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2007 May 22;25(21):4301-11. 10

Claims (6)

1. REVENDICATIONS1.
2. 2.
3. 3.
4. 4. 7. Procédé pour identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti-Toxoplasma gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant la mise en contact dudit sérum préalablement prélevé avec des antigènes capables de se lier avec lesdits anticorps anti-Toxoplasma gondii et la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes, le procédé étant caractérisé en ce que lesdits antigènes comprennent la combinaison de deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les antigènes consistent en la combinaison des deux protéines recombinantes GRA2 et GRA6. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le rapport molaire GRA2/GRA6 est compris entre 40/60 et 60/40. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les antigènes sont fixés sur un support, en particulier sur une plaque de test ELISA.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la constatation d'une liaison ou d'une absence de liaison d'anticorps avec lesdits antigènes comprend l'application de réactifs permettant de détecter les anticorps fixés aux protéines recombinantes. 9. 8.
6. 6. en ce que le sérum en complément d'un autre test de diagnostic de la toxoplasmose. gondii dans un sérum humain ou animal, comprenant : provient d'une femme enceinte. provient d'un nouveau-né. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est réalisé Kit destiné à identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti-Toxoplasma Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé recombinantes. , Un support (plaque ELISA) sur lequel sont fixées les protéines recombinantes GRA2 et GRA6; Des réactifs permettant de détecter les anticorps se fixant aux protéines en ce que le sérum