JP2692004B2 - 抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法 - Google Patents
抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法Info
- Publication number
- JP2692004B2 JP2692004B2 JP1116229A JP11622989A JP2692004B2 JP 2692004 B2 JP2692004 B2 JP 2692004B2 JP 1116229 A JP1116229 A JP 1116229A JP 11622989 A JP11622989 A JP 11622989A JP 2692004 B2 JP2692004 B2 JP 2692004B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antitropical
- malaria parasite
- enzyme
- detecting
- volume
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56905—Protozoa
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/947—Microorganisms using protozoa
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、マラリア寄生虫によるヒトにおける感染を
診断するための新規な免疫−酵素的検出法に係る。
診断するための新規な免疫−酵素的検出法に係る。
さらに詳述すれば、本発明は、熱帯マラリア原虫（Pl
asmodium falciparum）スポロゾイトに対する抗体を均
一相で検出する免疫酵素的方法に係る。
asmodium falciparum）スポロゾイトに対する抗体を均
一相で検出する免疫酵素的方法に係る。
マラリア（ヒトにおける最も重要な寄生虫感染の１つ
である）はプラスモディウム属（Plasmodium）に属する
原虫によって起こり、多段階サイクルに従って、一部は
有脊椎性宿主（ヒト）内において、一部はキャリヤー、
蚊の内部で発現する。
である）はプラスモディウム属（Plasmodium）に属する
原虫によって起こり、多段階サイクルに従って、一部は
有脊椎性宿主（ヒト）内において、一部はキャリヤー、
蚊の内部で発現する。
感染は、ハマダラカ属（Anopheles）の蚊によるスポ
ロゾイト形のプラスモディウム属菌の接種によってヒト
において生ずる。
ロゾイト形のプラスモディウム属菌の接種によってヒト
において生ずる。
ヒトにおいてマラリアを起こさせるプラスモディイウ
ム属菌の主な種は、プラズモディウム・オバーレ（Plas
modium ovale）、プラスモディウム・マラリアエ（Plas
modium malariae）、プラスモディウム・バイバックス
（Plasmodium vivax）及び熱帯マラリア原虫（Plasmodi
um falciparum）である。
ム属菌の主な種は、プラズモディウム・オバーレ（Plas
modium ovale）、プラスモディウム・マラリアエ（Plas
modium malariae）、プラスモディウム・バイバックス
（Plasmodium vivax）及び熱帯マラリア原虫（Plasmodi
um falciparum）である。
特に最後のものは、最も広く分布している種であるだ
けでなく、感染に伴う危篤な病気の発生及び大量死の原
因となる種でもある。
けでなく、感染に伴う危篤な病気の発生及び大量死の原
因となる種でもある。
現在、マラリアは、中でもアジア、アフリカ及びアメ
リカの熱帯地域において、薬剤耐性寄生虫の出現及びそ
の野放しの拡散、及びコントロールシステムの劣化（そ
の結果、ファイトプログラムのコストが上昇する）のた
め復活し、流行している。
リカの熱帯地域において、薬剤耐性寄生虫の出現及びそ
の野放しの拡散、及びコントロールシステムの劣化（そ
の結果、ファイトプログラムのコストが上昇する）のた
め復活し、流行している。
マラリア撲滅キャンペーンを行う際の基本的な要素
は、該キャンペーン前、キャンペーン中及び終了後にお
ける感染の発生に関する情報を得ることである。
は、該キャンペーン前、キャンペーン中及び終了後にお
ける感染の発生に関する情報を得ることである。
従って、このためには、大規模な研究に適し、同時に
高い高度が付与されえた診断方法が利用できなければな
らない。
高い高度が付与されえた診断方法が利用できなければな
らない。
当分野では、ヒトにおけるマラリアの診断法として、
血液を顕微鏡によって検査する方法、本質的に傾向の測
定に基く免疫法（IFA）［E.H.Nardinら「Bull WHO」57
（Suppl.1）,211−217（1979）］及び放射能の測定に基
く免疫法（IRMA）［F.Zavalaら「サイエンス（scienc
e）」228,1436（1985）］が知られている。
血液を顕微鏡によって検査する方法、本質的に傾向の測
定に基く免疫法（IFA）［E.H.Nardinら「Bull WHO」57
（Suppl.1）,211−217（1979）］及び放射能の測定に基
く免疫法（IRMA）［F.Zavalaら「サイエンス（scienc
e）」228,1436（1985）］が知られている。
このような公知の方法は、数百又は数千のサンプルを
検査するものであり、中でも、実施に長時間を要するた
め、必ずしも疫学的に調査には適していない。
検査するものであり、中でも、実施に長時間を要するた
め、必ずしも疫学的に調査には適していない。
さらに、IFA法及びIRMA法は、蛍光物質及び放射性同
位元素の如きあまり安定でなく、かつ非常に有害な物質
の使用に関する欠点を有する。
位元素の如きあまり安定でなく、かつ非常に有害な物質
の使用に関する欠点を有する。
当分野では、上記物質の使用を回避し、本質的に呈色
反応において触媒作用を発揮する酵素の使用に基く（EI
A）も公知である。
反応において触媒作用を発揮する酵素の使用に基く（EI
A）も公知である。
これらの方法の中でも、ヒトにおけるマラリアの新案
を行うために最も広く利用されている方法は、たとえば
F.Zavalら「Fed.Proc.」44,980（1985）;G.Del Giudice
ら［J.Clin.Microbiol.」25,91−96（1987）の開示の如
きELISA法（固相酵素免疫法）である。
を行うために最も広く利用されている方法は、たとえば
F.Zavalら「Fed.Proc.」44,980（1985）;G.Del Giudice
ら［J.Clin.Microbiol.」25,91−96（1987）の開示の如
きELISA法（固相酵素免疫法）である。
さらに詳述すれば、該公知法によれば、天然又は合成
の抗原を、共有結合又は吸着によって、たとえばポリス
チレンの如き固状支持体に結合させ、該支持体の残留結
合部位を適当なタンパク質でブロッキングした後、被検
血清と共にインキュベートする。
の抗原を、共有結合又は吸着によって、たとえばポリス
チレンの如き固状支持体に結合させ、該支持体の残留結
合部位を適当なタンパク質でブロッキングした後、被検
血清と共にインキュベートする。
ついで、反応混合物に、検出用酵素に結合した抗ヒト
免疫グロブリン抗体及び酵素に特異な基質（血清が陽性
である場合には着色生成物を生ずる）を連続して添加す
る。
免疫グロブリン抗体及び酵素に特異な基質（血清が陽性
である場合には着色生成物を生ずる）を連続して添加す
る。
このような方法では、IRMA法及びIFA法における問題
点を解消できるが、所要時間が長いこと（約６時間）及
び煩雑かつ高価な方法によってしか調製され得ない抗ヒ
ト免疫グロブリン−酵素抗体の如き反応体を使用するこ
とに関連する欠点が必ずしも解消されてはいない。さら
に、この方法は、現時点では、その利用の際、感度1ng
（Ab）／μ（血清）の限界があり、低抗体含量を有す
る多数の血清の検査を可能にするものではない。
点を解消できるが、所要時間が長いこと（約６時間）及
び煩雑かつ高価な方法によってしか調製され得ない抗ヒ
ト免疫グロブリン−酵素抗体の如き反応体を使用するこ
とに関連する欠点が必ずしも解消されてはいない。さら
に、この方法は、現時点では、その利用の際、感度1ng
（Ab）／μ（血清）の限界があり、低抗体含量を有す
る多数の血清の検査を可能にするものではない。
実際、この検査方法であ、２つの支持体間の吸光度の
下がら得られる固有の値（specific value）は、該支持
体の均一性及び再現性、従って抗原及びタンパク質の吸
着性に大いに左右される。
下がら得られる固有の値（specific value）は、該支持
体の均一性及び再現性、従って抗原及びタンパク質の吸
着性に大いに左右される。
低感度であることにより、ELISA法は、さらに、多数
の「誤った陰性サンプル」の原因となり、一方、同じサ
ンプルに相当する支持体（ミクロタイトレーションに関
しては滴板（slab）の穴）間の差が「誤った陽性サンプ
ル」を生じうる。
の「誤った陰性サンプル」の原因となり、一方、同じサ
ンプルに相当する支持体（ミクロタイトレーションに関
しては滴板（slab）の穴）間の差が「誤った陽性サンプ
ル」を生じうる。
感度の値は、酵素でラベル付けされた（酵素ラベル
化）第２の抗体による抗スポロゾイト抗体−抗原複合体
の生成反応及び最後の呈色反応が不均一相で行われてい
ることから、該検査法において強く影響されることは明
らかである。
化）第２の抗体による抗スポロゾイト抗体−抗原複合体
の生成反応及び最後の呈色反応が不均一相で行われてい
ることから、該検査法において強く影響されることは明
らかである。
さらに、使用よりも長時間前に抗原により及びタンパ
ク質によって処理した滴板の如き支持体は、安定性及び
保存性に関する問題がある。
ク質によって処理した滴板の如き支持体は、安定性及び
保存性に関する問題がある。
英国特許出願8729975号にはヒトにおけるマラリアの
診断を行う変形ELISA法が開示されており、該方法で
は、合成抗原−酵素結合体（該抗原は反応して、特異的
に抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体を結合する）及
び固状支持体に適当に結合させたタンパク質（該タンパ
ク質は抗体−抗原−酵素複合体の抗スポロゾイト抗体を
結合させる）を使用する。
診断を行う変形ELISA法が開示されており、該方法で
は、合成抗原−酵素結合体（該抗原は反応して、特異的
に抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体を結合する）及
び固状支持体に適当に結合させたタンパク質（該タンパ
ク質は抗体−抗原−酵素複合体の抗スポロゾイト抗体を
結合させる）を使用する。
該方法に従って操作することにより、所要時間を効果
的に短縮できるが、不均一相での操作に関連する問題点
はなお残っている。
的に短縮できるが、不均一相での操作に関連する問題点
はなお残っている。
従って、本発明は、ヒトにおけるマラリアの診断を、
簡単に、再現性良く、迅速に、感度良くかつ経済的に有
利に実施することを目的とする。
簡単に、再現性良く、迅速に、感度良くかつ経済的に有
利に実施することを目的とする。
かかる目的は、本発明に従い、合成抗原（Ｐ）、合成
抗原−酵素結合体（Ｐ−Ｅ）、及び抗スポロゾイト抗体
−合成抗原複合体（該合成抗原は遊離の形（Ｐ）及びラ
ベル付きの形（Ｐ−Ｅ）である）を定量的に沈殿させる
基質を使用することにより、均一相において好適な条件
下で行われる免疫酵素法によって達成される。
抗原−酵素結合体（Ｐ−Ｅ）、及び抗スポロゾイト抗体
−合成抗原複合体（該合成抗原は遊離の形（Ｐ）及びラ
ベル付きの形（Ｐ−Ｅ）である）を定量的に沈殿させる
基質を使用することにより、均一相において好適な条件
下で行われる免疫酵素法によって達成される。
従って、本発明の目的はヒト血液サンプル中の抗熱帯
マラリア原虫スポロゾイト抗体を均一相において測定す
る免疫酵素法にある。
マラリア原虫スポロゾイト抗体を均一相において測定す
る免疫酵素法にある。
本発明の他の目的は、本発明による方法を実施するた
めに必要な反応体を包含してなるヒト血液サンプル中の
抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体を検出する診断用
キットにある。
めに必要な反応体を包含してなるヒト血液サンプル中の
抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体を検出する診断用
キットにある。
本発明のさらに他の目的については、明細書及び後述
の実施例から明らかになるであろう。
の実施例から明らかになるであろう。
特に、本発明による免疫酵素法は、ａ）ヒト血液の同
一サンプルの一定量２個を、該サンプルの一定量２個の
一方にのみ、予め、抗スポロゾイトプル抗体−合成抗原
−酵素複合体（Ab−Ｐ−Ｅ）の生成を完全に阻害する濃
度の未酵素ラベル化合成抗原（Ｐ）と混合した後、別個
に、pH6.5ないし8.00のリン酸緩衝剤溶液中、濃度0.05
％（重量／容量又は容量／容量）（W/V又はV/V）以上の
非イオン系及び／又は弱陰イオン系界面活性剤存在下、
温度15ないし35℃で合成抗原−酵素結合体（Ｐ−Ｅ）
（ここで、合成抗原は被検サンプル中に存在しうる抗熱
帯マラリア原虫スポロゾイト抗体と反応しうるものであ
り、酵素は呈色反応において触媒作用を発揮するもので
ある）と反応させ、ｂ）上記工程ａ）で処理したサンプ
ルに、抗スポロゾイト抗体−合成抗原−酵素複合体を定
量的に沈殿させうる不活性物質を最終濃度13ないし17％
（W/V）で添加し、ｃ）上記工程ｂ）で得られた反応混
合物から、過又は遠沈により沈殿物を分離し、ｄ）該
沈殿物を、前記不活性物質を最終濃度13ないし17％（W/
V）で添加した緩衝剤溶液で繰返し洗浄し、ｅ）得られ
た沈殿物を、非イオン系及び／又は弱陰イオン系の界面
活性剤を最終濃度0.05％（W/V又はV/V）以上で含有する
pH4.0ないし5.5の緩衝剤溶液中に、最終濃度３ないし５
％（W/V）の不活性沈殿化物質の存在下又は不存在下で
溶解させ、ｆ）得られた溶液に、過酸化水素及び被検サ
ンプルが陽性である際に着色生成物を生成する無色の酵
素基質を添加し、最後に、分光測光によって色の強さを
測定する各工程を包含する。
一サンプルの一定量２個を、該サンプルの一定量２個の
一方にのみ、予め、抗スポロゾイトプル抗体−合成抗原
−酵素複合体（Ab−Ｐ−Ｅ）の生成を完全に阻害する濃
度の未酵素ラベル化合成抗原（Ｐ）と混合した後、別個
に、pH6.5ないし8.00のリン酸緩衝剤溶液中、濃度0.05
％（重量／容量又は容量／容量）（W/V又はV/V）以上の
非イオン系及び／又は弱陰イオン系界面活性剤存在下、
温度15ないし35℃で合成抗原−酵素結合体（Ｐ−Ｅ）
（ここで、合成抗原は被検サンプル中に存在しうる抗熱
帯マラリア原虫スポロゾイト抗体と反応しうるものであ
り、酵素は呈色反応において触媒作用を発揮するもので
ある）と反応させ、ｂ）上記工程ａ）で処理したサンプ
ルに、抗スポロゾイト抗体−合成抗原−酵素複合体を定
量的に沈殿させうる不活性物質を最終濃度13ないし17％
（W/V）で添加し、ｃ）上記工程ｂ）で得られた反応混
合物から、過又は遠沈により沈殿物を分離し、ｄ）該
沈殿物を、前記不活性物質を最終濃度13ないし17％（W/
V）で添加した緩衝剤溶液で繰返し洗浄し、ｅ）得られ
た沈殿物を、非イオン系及び／又は弱陰イオン系の界面
活性剤を最終濃度0.05％（W/V又はV/V）以上で含有する
pH4.0ないし5.5の緩衝剤溶液中に、最終濃度３ないし５
％（W/V）の不活性沈殿化物質の存在下又は不存在下で
溶解させ、ｆ）得られた溶液に、過酸化水素及び被検サ
ンプルが陽性である際に着色生成物を生成する無色の酵
素基質を添加し、最後に、分光測光によって色の強さを
測定する各工程を包含する。
工程ａ） 本発明の方法によれば、工程ａ）における被検ヒト血
液サンプルは、全血、血清又は血漿である。
液サンプルは、全血、血清又は血漿である。
特に、全血を使用する場合には、遊離形又は結合形の
抗月との反応終了後、沈殿又は過によって懸濁物質を
除去するか、又は該工程において緩衝剤溶剤で希釈した
血液サンプルについて操作を行う。
抗月との反応終了後、沈殿又は過によって懸濁物質を
除去するか、又は該工程において緩衝剤溶剤で希釈した
血液サンプルについて操作を行う。
本発明の目的に適する合成抗原は、抗熱帯マラリア原
虫スポロゾイト抗体を認識し、特異的に結合しうるポリ
ペプチドである。
虫スポロゾイト抗体を認識し、特異的に結合しうるポリ
ペプチドである。
特にポリペプチドは次のアミノ酸配列によって定義さ
れる。
れる。
（Asn−Ala−Asn−Pro）ｎ （式中、Asn＝アスパラギン、Ala＝アラニン及びPro＝
プロリンであり、ｎは３ないし40である） かかるポリペプチド［熱帯マラリア原虫のサーカムス
ポロゾイトタンパク質（circumsporozoiticprotein）
（CS）のペプチドセグメントを正確に再生する］は、ヨ
ーロッパ特許開口第209643号に開示された種類の重縮合
法によって調製される。
プロリンであり、ｎは３ないし40である） かかるポリペプチド［熱帯マラリア原虫のサーカムス
ポロゾイトタンパク質（circumsporozoiticprotein）
（CS）のペプチドセグメントを正確に再生する］は、ヨ
ーロッパ特許開口第209643号に開示された種類の重縮合
法によって調製される。
これらポリペプチドには２つの端末官能基（すなわち
−NH2及び−COOH）のみ存在するため、本発明による結
合体の調製に特に有用であり、ポリペプチドと酵素との
間で、該酵素の触媒活性を損うことなく、安定した共有
結合を形成させうる。
−NH2及び−COOH）のみ存在するため、本発明による結
合体の調製に特に有用であり、ポリペプチドと酵素との
間で、該酵素の触媒活性を損うことなく、安定した共有
結合を形成させうる。
該ポリペプチドと酵素との結合は、、一般の方法に従
って行われる。
って行われる。
好ましくは、英国特許出願第8729975号に開示された
如くして結合体を調製する。
如くして結合体を調製する。
呈色反応において触媒作用を発揮する酵素は、免疫酵
素検出法において一般的に使用される酵素の中から選ば
れる。
素検出法において一般的に使用される酵素の中から選ば
れる。
かかる酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、酸ホス
ファターゼ、アルカリホスファターゼ、α−ガラクトシ
ダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼがある。
ファターゼ、アルカリホスファターゼ、α−ガラクトシ
ダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼがある。
特に、本発明をさらに説明するため（ただし、これに
限定されない）、合成抗原として（Asn−Ala−Asn−Pr
o）20［（NANP）20］を使用し、酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用した。
限定されない）、合成抗原として（Asn−Ala−Asn−Pr
o）20［（NANP）20］を使用し、酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用した。
本発明の方法に従い、pH6.5ないし8.00のリン酸塩緩
衝剤溶液（PBS）で適当に希釈した同一の血液サンプル
の一定量２個を、別個に、合成抗原−酵素結合体（Ｐ−
Ｅ）を濃度1.0ないし2.0μg/mlでが有する同じリン酸塩
緩衝剤溶液と混合する。
衝剤溶液（PBS）で適当に希釈した同一の血液サンプル
の一定量２個を、別個に、合成抗原−酵素結合体（Ｐ−
Ｅ）を濃度1.0ないし2.0μg/mlでが有する同じリン酸塩
緩衝剤溶液と混合する。
特に、緩衝剤溶液は、非イオン系及び／又は弱陰イオ
ン系の界面活性剤（Ｄ）、又はこれら界面活性剤の混合
物（相互比＝約１）を最終濃度0.05％（重量／容量又は
容量／容量）（W/V又はV/V）以上で含有する。
ン系の界面活性剤（Ｄ）、又はこれら界面活性剤の混合
物（相互比＝約１）を最終濃度0.05％（重量／容量又は
容量／容量）（W/V又はV/V）以上で含有する。
非イオン系及び弱陰イオン系界面活性剤は、当分野で
公知であって、診断の分野で一般的に使用されているも
のの中から選ばれる。
公知であって、診断の分野で一般的に使用されているも
のの中から選ばれる。
これら界面活性剤の例としては、Tween−20（ポリオ
キシエチレンソルダビン脂肪酸エステ）、Triton X（オ
クチルフェノールエトキシレート）及びサニポン（非イ
オン系界面活性剤）、及びコール酸ナトリウム（Na−
Ｃ）、デオキシコール酸ナトリウム（Na−Doc）及びナ
トリウムラウロイル−サルコシネート（Na−Ｌ−Sar）
（弱陰イオン系界面活性剤）がある。
キシエチレンソルダビン脂肪酸エステ）、Triton X（オ
クチルフェノールエトキシレート）及びサニポン（非イ
オン系界面活性剤）、及びコール酸ナトリウム（Na−
Ｃ）、デオキシコール酸ナトリウム（Na−Doc）及びナ
トリウムラウロイル−サルコシネート（Na−Ｌ−Sar）
（弱陰イオン系界面活性剤）がある。
好ましくは、Triton X−100を濃度0.05％又は約0.05
％で使用し、又はTriton X−100とナトリウムラウロイ
ル−サルコシネートとの混合物（各成分間の比＝１）を
使用する。
％で使用し、又はTriton X−100とナトリウムラウロイ
ル−サルコシネートとの混合物（各成分間の比＝１）を
使用する。
本発明によれば、サンプルの一定量２個のうちの一方
を、Ｐ−Ｅ結合体に対して大モル過剰量の端末ラベル化
合成抗原（Ｐ）と混合する。これにより、Ｐ−Ｅと競合
する遊離の抗原は、サンプル中に存在しうる抗スポロゾ
イト抗体（Ab）と一緒になってAb−Ｐ複合体を形成し、
Ab−Ｐ−Ｅの生成を完全に阻害する。
を、Ｐ−Ｅ結合体に対して大モル過剰量の端末ラベル化
合成抗原（Ｐ）と混合する。これにより、Ｐ−Ｅと競合
する遊離の抗原は、サンプル中に存在しうる抗スポロゾ
イト抗体（Ab）と一緒になってAb−Ｐ複合体を形成し、
Ab−Ｐ−Ｅの生成を完全に阻害する。
本発明によれば、モル比P/PE＝100/1では上記複合体
の生成を完全に阻害する。
の生成を完全に阻害する。
ついで、このようにして得られた反応混合物を、濃度
15ないし35℃、好ましくは20ないし30℃において15ない
し30分間、好ましくは20分間インキュベートする。
15ないし35℃、好ましくは20ないし30℃において15ない
し30分間、好ましくは20分間インキュベートする。
工程ｂ） 本発明による方法の工程ｂ）では、前記工程ａ）で生
成されたAb−Ｐ及びAb−Ｐ−Ｅ複合体を、反応混合物に
硫酸アンモニウム又は分子量（MW）4000以上のポリエチ
レングリコール（PEG）から選ばれる不活性物質（反応
性でなく、変性作用のないもの）を上記複合体が定量的
に沈殿するのを可能にする最終濃度で添加することによ
って沈殿させる。
成されたAb−Ｐ及びAb−Ｐ−Ｅ複合体を、反応混合物に
硫酸アンモニウム又は分子量（MW）4000以上のポリエチ
レングリコール（PEG）から選ばれる不活性物質（反応
性でなく、変性作用のないもの）を上記複合体が定量的
に沈殿するのを可能にする最終濃度で添加することによ
って沈殿させる。
好ましくは、PEG−6000を最終濃度13ないし17％（W/
V）で使用する。
V）で使用する。
この工程では、混合物を穏やかに撹拌しながら、温度
15ないし35℃、好ましくは20ないし30℃、時間40ないし
60分で操作を行う。
15ないし35℃、好ましくは20ないし30℃、時間40ないし
60分で操作を行う。
上述の好適な条件下で操作することにより、PEG−600
0はサンプル中に存在する免疫グロブリン（Ab−Ｐ及びA
b−Ｐ−Ｅ複合体を含む）のすべてを沈殿させ、溶液中
に未反応の抗原が残る。
0はサンプル中に存在する免疫グロブリン（Ab−Ｐ及びA
b−Ｐ−Ｅ複合体を含む）のすべてを沈殿させ、溶液中
に未反応の抗原が残る。
工程ｃ） この工程では、遠沈又は過によって反応混合物から
沈殿物を分離する。
沈殿物を分離する。
好ましくは、沈殿物の分離を過によって行う。この
場合、少量（μのオーダー）で操作することにより、
該方法の工程が簡単になる。
場合、少量（μのオーダー）で操作することにより、
該方法の工程が簡単になる。
該目的に関し、たとえば、Millitier Filtration Sys
tem（Millipose Corp.）の如き市販の過装置を使用で
きる。このシステムは、孔サイズ0.22μｍを有する過
板（filtering slab）を包含してなるものであり、使用
後では、ELISAテストで使用される吸収剤板（absorbet
slab）とは異なり、洗浄され、連続分析に再使用され
る。
tem（Millipose Corp.）の如き市販の過装置を使用で
きる。このシステムは、孔サイズ0.22μｍを有する過
板（filtering slab）を包含してなるものであり、使用
後では、ELISAテストで使用される吸収剤板（absorbet
slab）とは異なり、洗浄され、連続分析に再使用され
る。
工程ｄ） この工程では、過板上にある沈殿物を、沈殿化物質
を最終濃度13ないし17％で含有するPBS/D緩衝剤溶液で
繰返し（一般に３−４回）洗浄する。
を最終濃度13ないし17％で含有するPBS/D緩衝剤溶液で
繰返し（一般に３−４回）洗浄する。
工程ｅ） 本発明によれば、この工程では最終濃度３ないし５％
（W/V）の沈殿溶液の存在下又は不存在下、上記工程
ａ）に関して述べたものと同じ濃度で非イオン系又は弱
陰イオン系の界面活性剤を含有するpH4ないし5.％の0.1
M酢酸塩又は酢酸塩−クエン酸塩を一度に又は少量ずつ
に分けて添加することにより、沈殿物を溶解させる。
（W/V）の沈殿溶液の存在下又は不存在下、上記工程
ａ）に関して述べたものと同じ濃度で非イオン系又は弱
陰イオン系の界面活性剤を含有するpH4ないし5.％の0.1
M酢酸塩又は酢酸塩−クエン酸塩を一度に又は少量ずつ
に分けて添加することにより、沈殿物を溶解させる。
好ましくは、PGE−6000 4％及びTriton X−100 0.05
％を含有するpH5.0又は約5.0の緩衝剤溶液を使用する。
％を含有するpH5.0又は約5.0の緩衝剤溶液を使用する。
分散剤としての界面活性剤の存在は、抗体−抗原−酵
素複合体の安定化及び回収において特に有利である。上
述の濃度で存在する沈殿化物質は、これに対応して、酵
素応答の非固有（aspecific）バックグラウンドを低下
させる機能を果たす。
素複合体の安定化及び回収において特に有利である。上
述の濃度で存在する沈殿化物質は、これに対応して、酵
素応答の非固有（aspecific）バックグラウンドを低下
させる機能を果たす。
実際、該物質は、上記pHにおいて、ペルオキシダーゼ
活性を有する非免疫グロブリン性の沈殿物質の多くを不
溶性とする。
活性を有する非免疫グロブリン性の沈殿物質の多くを不
溶性とする。
工程ｆ） 本発明の方法によれば、この工程は、前記工程ｅ）で
得られた混合物に、使用した酵素に対して特異な無色の
気質を添加することによって行われる。
得られた混合物に、使用した酵素に対して特異な無色の
気質を添加することによって行われる。
酵素がペルオキシダーゼ（E.C.1.11.1.7.）である場
合、特異基質は好ましくはABTS［2,2−アジノ−ジ−
（３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホネート）］又
はTMB（3,3′,5,5′−テトラメチル−ベンジジン）であ
る。
合、特異基質は好ましくはABTS［2,2−アジノ−ジ−
（３−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホネート）］又
はTMB（3,3′,5,5′−テトラメチル−ベンジジン）であ
る。
呈色反応は、過酸化水素の存在下、温度15ないし35
℃、好ましくは20ないし30℃において好適な時間で行わ
れる。一般に、10ないし30分の時間で充分である。
℃、好ましくは20ないし30℃において好適な時間で行わ
れる。一般に、10ないし30分の時間で充分である。
本発明の方法によれば、好ましくはTMB及びH2O2を最
終濃度それぞれ0.1mg/ml及び1.3mMで使用し、これら条
件下での反応時間は10分である。終了後強酸（たとえば
H2SO4）を濃度２ないし３モルで添加して酵素反応を停
止させる。各一定量について、ブランク（すなわち、血
液サンプルの不存在下における本発明の各工程で調製さ
れた物質）に対する分光測光による吸光度を測定するこ
とによって色の強度を評価する。
終濃度それぞれ0.1mg/ml及び1.3mMで使用し、これら条
件下での反応時間は10分である。終了後強酸（たとえば
H2SO4）を濃度２ないし３モルで添加して酵素反応を停
止させる。各一定量について、ブランク（すなわち、血
液サンプルの不存在下における本発明の各工程で調製さ
れた物質）に対する分光測光による吸光度を測定するこ
とによって色の強度を評価する。
各サンプルに関してAb−Ｐ−Ｅ複合体に対する固有
値、すなわち固有吸光度（Ａ）は、式 Ａ（サンプル＋Ｐ−Ｅ）−Ａ［サンプル＋（Ｐ＋Ｐ−Ｅ）］ によりすなわち、全吸光度（固有吸光度＋非固有吸光
度）と非固有吸光度との間の差によって示される。
値、すなわち固有吸光度（Ａ）は、式 Ａ（サンプル＋Ｐ−Ｅ）−Ａ［サンプル＋（Ｐ＋Ｐ−Ｅ）］ によりすなわち、全吸光度（固有吸光度＋非固有吸光
度）と非固有吸光度との間の差によって示される。
本発明によれは、サンプルを「陽性」又は「陰性」に
分類するために使用する判断基準は次のとおりである。
分類するために使用する判断基準は次のとおりである。
−固有Ａ［「Ａ（spec.）」と表示する］が0.100より大
であり、全Ａ（固有吸光度及び非固有吸光度の和）の少
なくとも30％である場合、該サンプルを「陽性」とみな
す。
であり、全Ａ（固有吸光度及び非固有吸光度の和）の少
なくとも30％である場合、該サンプルを「陽性」とみな
す。
−Ａ（spec.）が0.100より小である（阻害値（％）がい
くらであっても）場合、該サンプルを「陰性」とみな
す。
くらであっても）場合、該サンプルを「陰性」とみな
す。
本発明による方法の感度は、抗スポロゾイト抗体が濃
度0.2ng/μ（血清）又はほぼ0.2ng/μ（血清）にお
いて検出されうる程度である。
度0.2ng/μ（血清）又はほぼ0.2ng/μ（血清）にお
いて検出されうる程度である。
さらに、本発明の方法に従って温度30℃で操作するこ
とによって得られる結果が温度20−25℃で観察されるも
のと同じであることが確認された。この事実は、該方法
が、マラリアが広く流行している熱帯地域で有利に利用
されることを可能にする。
とによって得られる結果が温度20−25℃で観察されるも
のと同じであることが確認された。この事実は、該方法
が、マラリアが広く流行している熱帯地域で有利に利用
されることを可能にする。
要約すれば、本発明による方法は、当分野における現
状と比べてかなり有効である、特にELISA法よりも優れ
ていることを示す。
状と比べてかなり有効である、特にELISA法よりも優れ
ていることを示す。
中でも、該方法が安価であることに加えて、感度が高
いこと、結果の再現性が高いこと、操作が迅速であり、
正確であること等の利点が指摘される。
いこと、結果の再現性が高いこと、操作が迅速であり、
正確であること等の利点が指摘される。
本発明による方法の感度は、抗ストロゾイト抗体と合
成抗原との間の複合体の生成反応及び呈色反応が均一相
において所定条件下で起るとの事実によるものである。
成抗原との間の複合体の生成反応及び呈色反応が均一相
において所定条件下で起るとの事実によるものである。
さらに、本発明の方法は、各サンプルの固有値に純粋
な（末ラベル化）抗原で阻害することに基くものである
ため、抗原学診断法による半定量的応答（該方法の大き
い感度によって増幅される）を提供する。
な（末ラベル化）抗原で阻害することに基くものである
ため、抗原学診断法による半定量的応答（該方法の大き
い感度によって増幅される）を提供する。
本発明の方法が安価であることに関して、抗原及びテ
ストの実施に必要な反応体（市販品）以外に、Ｐ−Ｅ結
合体（抗体−抗ヒト結合体よりも安価であるとの利点を
有する）が必要である。
ストの実施に必要な反応体（市販品）以外に、Ｐ−Ｅ結
合体（抗体−抗ヒト結合体よりも安価であるとの利点を
有する）が必要である。
本発明による方法の利点は、実施が簡単である点にも
ある。
ある。
さらに、該方法は、小サンプル数及び大サンプル数の
いずれにも適し、融通性があるため、低容量診断要求の
衛生ユニットでの使用にも適している。ヒト血液サンプ
ルについての抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検
出には、本発明の方法を実施するに必要なすべての反応
体を包含する分析パック、たとえば合成抗原、合成抗原
−酵素結合体、基質、緩衝剤溶液抗原−抗体複合体を沈
殿させる物質でなるキットが好適である。
いずれにも適し、融通性があるため、低容量診断要求の
衛生ユニットでの使用にも適している。ヒト血液サンプ
ルについての抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検
出には、本発明の方法を実施するに必要なすべての反応
体を包含する分析パック、たとえば合成抗原、合成抗原
−酵素結合体、基質、緩衝剤溶液抗原−抗体複合体を沈
殿させる物質でなるキットが好適である。
この種又は同様の種類の分析パックでは、抗熱帯マラ
リア原虫スポロゾイト抗体をできるだけ低コストで検出
できる。
リア原虫スポロゾイト抗体をできるだけ低コストで検出
できる。
以下の実施例は説明のためのものであって、本発明を
限定するものではない。
限定するものではない。
実施例１ 健常者及びマラリアに罹った者から採取した未知の源
の血清16検体（参照コード241−711及びKXを付した）、
２人の健常な提供者から採取した血清及びヘパリン処理
血漿、２種類のモノクローナル（Mab）抗（NANP）３抗
体を添加すること［１及び2ng/μ（全血清）］によっ
て陽性英とした健常者からの血清を使用した。
の血清16検体（参照コード241−711及びKXを付した）、
２人の健常な提供者から採取した血清及びヘパリン処理
血漿、２種類のモノクローナル（Mab）抗（NANP）３抗
体を添加すること［１及び2ng/μ（全血清）］によっ
て陽性英とした健常者からの血清を使用した。
Eppendorf試験管内において、各サンプルをpH7.％のP
BS/D緩衝剤溶液（PBS＝0.01Mリン酸ナトリウム,0.3M Na
Cl:D＝0.05％ Triton X−100,V/V及び0.05％ナトリウム
ラウロイルサルコシン,W/V）により1:50で希釈した。
BS/D緩衝剤溶液（PBS＝0.01Mリン酸ナトリウム,0.3M Na
Cl:D＝0.05％ Triton X−100,V/V及び0.05％ナトリウム
ラウロイルサルコシン,W/V）により1:50で希釈した。
実際には、血清、血漿及びMab/陰性血清５μをPBS/
D 245μで希釈した。
D 245μで希釈した。
このように希釈した各サンプルの一定量（50μ）４
個を96穴滴板の同一の縦方向に属する近接する一連の４
つの穴に充填した。従って１つの滴板は22サンプルが充
填されることになる。なお、１番目の列はブランク（最
終酵素反応の基質のみ）として確保している。
個を96穴滴板の同一の縦方向に属する近接する一連の４
つの穴に充填した。従って１つの滴板は22サンプルが充
填されることになる。なお、１番目の列はブランク（最
終酵素反応の基質のみ）として確保している。
各サンプルの３番目及び４番目にの穴に、合成ペプチ
ド（NANP）20（Ｐ）の蒸留水溶液（１μg/μ）２μ
を添加した。
ド（NANP）20（Ｐ）の蒸留水溶液（１μg/μ）２μ
を添加した。
つづいて、サンプルを充填したすべての穴に、Ｐ−Ｅ
結合のPBS/D溶液（２μg/ml）50μを添加した。
結合のPBS/D溶液（２μg/ml）50μを添加した。
室温（20−25℃）に20分間維持した後、１つの穴にPE
G−6000（Fluka）の30％（W/V）溶液0.1mlを導入した。
G−6000（Fluka）の30％（W/V）溶液0.1mlを導入した。
この溶液は高粘度であるため、各々の小さいスチール
製ボール（直径3.1mm）を入れ、滴板をわずかに回転さ
せることにより、サンプルと良好に混合される。
製ボール（直径3.1mm）を入れ、滴板をわずかに回転さ
せることにより、サンプルと良好に混合される。
滴板を室温に60分間維持し、各々の穴からサンプル0.
1mlを採取し、過板（Millipore,STGV 096NS0.22μ
ｍ）の相当する穴に移した。
1mlを採取し、過板（Millipore,STGV 096NS0.22μ
ｍ）の相当する穴に移した。
サンプルを吸引過し、各回PEG−6000の15％PBS/D溶
液0.2mlずつで４回洗浄した。
液0.2mlずつで４回洗浄した。
ついで、各々の穴にTriton X−100（0.05％）及びPEG
−6000（４％）を含有するpH5.0の0.1M酢酸塩緩衝剤溶
液（「ａ溶液」）0.150mlを導入することによってフィ
ルター上の沈殿物を溶解させた。ゆるやかに振盪しなが
ら、滴板を室温に５分間維持した。
−6000（４％）を含有するpH5.0の0.1M酢酸塩緩衝剤溶
液（「ａ溶液」）0.150mlを導入することによってフィ
ルター上の沈殿物を溶解させた。ゆるやかに振盪しなが
ら、滴板を室温に５分間維持した。
その後、溶液を吸引によって下方の受容板に集めた。
ついで、同一の「ａ溶液」0.1mlを使用して吸引を繰
返し行った。
返し行った。
受容板を回収し、各々の穴に3,3′,5,5′−テトラメ
チル−ベンジジン（TMB）及びH2O2を各々最終濃度0.1mg
/ml及び1.3mMを含有する溶液30μを添加した。
チル−ベンジジン（TMB）及びH2O2を各々最終濃度0.1mg
/ml及び1.3mMを含有する溶液30μを添加した。
10分後、各々の穴に3M H2SO425μを添加することに
よって酵素反応を停止させた。ついで、滴板リーダーTi
tertek Multiskan Plusにより、各々の穴の溶液の吸光
度を450nmで測定した。
よって酵素反応を停止させた。ついで、滴板リーダーTi
tertek Multiskan Plusにより、各々の穴の溶液の吸光
度を450nmで測定した。
得られた結果を表１に示す。
なお、表中（後述の表を踏む）、（ａ）は固有急吸光
度＋非固有吸光度を示し、（ｂ）は非固有吸光度を示
し、Ａ（spec.）は固有吸光度を示し、阻害率（％）又
は特異率（％）は本発明の方法の特異性を示す。
度＋非固有吸光度を示し、（ｂ）は非固有吸光度を示
し、Ａ（spec.）は固有吸光度を示し、阻害率（％）又
は特異率（％）は本発明の方法の特異性を示す。
実施例２ 下記の溶液を使用して、上記実施例１と同様にして操
作を行った。
作を行った。
−Triton X−100 0.05％を含有するpH5.0の0.1M酢酸緩
衝剤溶液（「ｂ溶液」）でなる沈殿物用溶媒 −2,2′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリ
ン）−スルホネート（ABTS）及びH2O2を各々最終濃度1.
1mg/ml及び1.3mMで含有する溶液（30μ／穴）。
衝剤溶液（「ｂ溶液」）でなる沈殿物用溶媒 −2,2′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリ
ン）−スルホネート（ABTS）及びH2O2を各々最終濃度1.
1mg/ml及び1.3mMで含有する溶液（30μ／穴）。
酵素反応を停止することなく、15分後及び30分後に、
各々の穴について405nmにおける吸光度を測定した。
各々の穴について405nmにおける吸光度を測定した。
第２表及び第３表に、それぞれ反応時間15分及び30分
で得られた結果を示す。
で得られた結果を示す。
実施例３ 沈殿物用溶媒として「ａ溶液」及び酵素基質としてAB
TSを使用し、反応時間を30分として、上記実施例１と同
様に操作することによって分析法を行った。
TSを使用し、反応時間を30分として、上記実施例１と同
様に操作することによって分析法を行った。
第４表に得られた結果を示す。
実施例４ ABTS基質、反応時間30分及び各種界面改正剤（Ｄ）を
各種濃度で含有するPBS/D緩衝剤溶液を使用し、陽性の
血清（KX）のサンプルについて、上記実施例２に記載の
如くして操作を行った。
各種濃度で含有するPBS/D緩衝剤溶液を使用し、陽性の
血清（KX）のサンプルについて、上記実施例２に記載の
如くして操作を行った。
結果を第５表に示す。なお、吸光度は、サンプル0.5
μを使用し、405nmで測定したものである。
μを使用し、405nmで測定したものである。
実施例５ 工程ｅ）において沈殿物を溶解させるために各種のpH
値及びPEG−6000濃度の緩衝剤溶液を使用し、陽性の血
清KXについて上記実施例２と同様に操作してテストを行
った。
値及びPEG−6000濃度の緩衝剤溶液を使用し、陽性の血
清KXについて上記実施例２と同様に操作してテストを行
った。
結果を第６表に示す。
比較例 ａ）ELISAテスト このテストでは、実施例１に示したものと同じサンプ
ル各0.5μ及び下記の如く処理した滴板２之を使用し
た。
ル各0.5μ及び下記の如く処理した滴板２之を使用し
た。
−合成抗原（NANP）0.1μg/穴を充填し、ついでBSA（ウ
シ血清アルブミン）（３％）−PBSを充填した滴板 −BSAのみ充填した滴板 これらの両滴板の各々の穴に、抗ヒト抗体−アルカリ
ホスファターゼ結合体（Ab″−PA）（サンプル中に存在
しうる抗スポロゾイト抗体（Ab）によりＰ−Ab−Ab″−
PA複合体を生成する）を添加した。
シ血清アルブミン）（３％）−PBSを充填した滴板 −BSAのみ充填した滴板 これらの両滴板の各々の穴に、抗ヒト抗体−アルカリ
ホスファターゼ結合体（Ab″−PA）（サンプル中に存在
しうる抗スポロゾイト抗体（Ab）によりＰ−Ab−Ab″−
PA複合体を生成する）を添加した。
常法に従って操作し、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト（ｐ−NPP）基質を使用することによって検出を行っ
た。
ト（ｐ−NPP）基質を使用することによって検出を行っ
た。
30分後、3M NaOH 25μを添加することによって酵素
反応を停止させた。
反応を停止させた。
吸光度を405nmで測定した。
固有値「Ａ（spec.）」は次式によって与えられる。
固有値［Ａ（spec.）］ ＝吸光度（（NANP）40を添加した滴板） −吸光度（BSAを添加した滴板） 結果を第７表に示す。
ｂ）Ｐ−E/セロファロース−Ａ−プロテイン（P.E/S−P
A）法 英国特許出願第8729975号に開示された方法は、合成
抗原−酵素結合体（Ｐ−Ｅ）（血液サンプル中に存在す
る抗スポロゾイト抗体により、Ａプロテインに結合する
安全な抗体−合成抗原−酵素複合体（Ab−Ｐ−Ｅ）を生
成する）を使用して行うことを特徴とする。
A）法 英国特許出願第8729975号に開示された方法は、合成
抗原−酵素結合体（Ｐ−Ｅ）（血液サンプル中に存在す
る抗スポロゾイト抗体により、Ａプロテインに結合する
安全な抗体−合成抗原−酵素複合体（Ab−Ｐ−Ｅ）を生
成する）を使用して行うことを特徴とする。
実際には、PBS/Triton X−100 0.5％緩衝剤溶液を使
用し、上記実施例１に記載の如くして被検サンプルを調
製した。反応20分後、サンプルを同じ緩衝剤溶液で平衡
化したセロファロース−Ａプロテイン樹脂（Pharamacia
−Uppsala）を収容する（市販の凍結乾燥生成物2mg/
穴）を収容した過板（Millipose）の穴に移した。
用し、上記実施例１に記載の如くして被検サンプルを調
製した。反応20分後、サンプルを同じ緩衝剤溶液で平衡
化したセロファロース−Ａプロテイン樹脂（Pharamacia
−Uppsala）を収容する（市販の凍結乾燥生成物2mg/
穴）を収容した過板（Millipose）の穴に移した。
板を室温で30分間インキュベートし、ついで、同じ平
衡緩衝剤溶液で４回洗浄した。
衡緩衝剤溶液で４回洗浄した。
各々の穴に、ABTS基質及びH2O2を各々最終濃度1.1mg/
ml及び1.3mMで含有するpH5.0の0.1M酢酸塩緩衝剤溶液15
0μを充填した。
ml及び1.3mMで含有するpH5.0の0.1M酢酸塩緩衝剤溶液15
0μを充填した。
30分後、各々の穴に関して反応混合物の色を観察する
ことによってサンプル「陽性」又は「陰性」を判定し
た。
ことによってサンプル「陽性」又は「陰性」を判定し
た。
陽性の血清（マラリアに罹患した血清）及びMab含有
血清は、反応混合物血清＋Ｐ−Ｅに係る穴において緑−
青色を呈し、血清＋Ｐ−Ｅ＋Ｐ混合物を収容する穴にお
いては無色又はわずかに着色していた。陰性の血清は、
同様に、上記２つの反応に係る穴において無色又はわず
かに着色しているのみであった。
血清は、反応混合物血清＋Ｐ−Ｅに係る穴において緑−
青色を呈し、血清＋Ｐ−Ｅ＋Ｐ混合物を収容する穴にお
いては無色又はわずかに着色していた。陰性の血清は、
同様に、上記２つの反応に係る穴において無色又はわず
かに着色しているのみであった。
第８表に、血清16検体を、本発明によるＰ−E/PEG法
（１）、ELISA法（２）、及びP.E/S−PA法（３）によっ
て処理して得られた値を、固有Ａ［Ａ（spec.）］の
値、陽性（＋）及び陰性（−）の判定結果と共に表示す
る。
（１）、ELISA法（２）、及びP.E/S−PA法（３）によっ
て処理して得られた値を、固有Ａ［Ａ（spec.）］の
値、陽性（＋）及び陰性（−）の判定結果と共に表示す
る。
第８表に報告したテスト結果の比較から、下記の事実
が観察される。
が観察される。
1.テストした未知の血清16検体のうち１検体、すなわち
血清No.632についてのみ、ELISAテストでは陰性と判定
し、他の２種類の方法では陽性とする矛盾がある。
血清No.632についてのみ、ELISAテストでは陰性と判定
し、他の２種類の方法では陽性とする矛盾がある。
2.陽性の血清の場合、Ｐ−E/PEG法は、ABTS及びTMB基質
のいずれによってもELISA法よりも高いＡ（spec.）の値
を示し、従って、血清No.632の陽性を検知しうる。
のいずれによってもELISA法よりも高いＡ（spec.）の値
を示し、従って、血清No.632の陽性を検知しうる。
3.血清No.570、620及びKXに関してELISA法ではＡ（spe
c.）の値が低いため、カット−オフ値として0150を採用
しなければならず、これにより、これら３種類の形成を
「不明（ボーダーライン）」と判定しているが、他の２
種類の方法では、これらを正確に「陽性」と判定してい
る。
c.）の値が低いため、カット−オフ値として0150を採用
しなければならず、これにより、これら３種類の形成を
「不明（ボーダーライン）」と判定しているが、他の２
種類の方法では、これらを正確に「陽性」と判定してい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アントニオ・シルビオ・ベルディーニ イタリー国モンテロトンド市ビア・サン マルチーノ 12
Claims (12)
- 【請求項１】血液サンプル中の抗熱帯マラリア原虫スポ
ロゾイト抗体を均一相で免疫−酵素的に測定する方法に
おいて、ａ）ヒト血液の同一サンプルの一定量２個を、
該サンプルの一定量２個の一方についてのみ、予め、抗
スポロゾイト抗体−合成抗原−酵素複合体の生成を完全
に阻害する濃度の未酵素ラベル化合成抗原と混合した
後、別個に、pH6.5ないし8.00のリン酸塩緩衝剤溶液
中、濃度0.05％（重量／容量又は容量／容量）以上の非
イオン系及び／又は弱陰イオン系界面活性剤存在下、温
度15ないし35℃で合成抗原−酵素結合体（ここで、合成
抗原は被検サンプル中に存在しうる抗熱帯マラリア原虫
スポロゾイト抗体と反応しうるものであり、酵素は呈色
反応において触媒作用を発揮するものである）と反応さ
せ、ｂ）上記工程ａ）で処理したサンプルに、抗スポロ
ゾイト抗体−合成抗原−酵素複合体を定量的に沈殿させ
うる不活性物質を最終濃度13ないし17％（重量／容量）
で添加し、ｃ）上記工程ｂ）で得られた反応混合物から
瀘過又は遠沈により沈殿物を分離し、ｄ）該沈殿物を、
前記不活性物質を最終濃度13ないし17％（重量／容量）
で添加した緩衝剤溶液で繰返し洗浄し、ｅ）得られた沈
殿物を、非イオン系及び／又は弱陰イオン系の界面活性
剤を最終濃度0.05％（重量／容量又は容量／容量）以上
で含有するpH4.0ないし5.5の緩衝剤溶液中に、最終濃度
３ないし５％（重量／容量）の不活性沈殿化物質の存在
下又は不存在下で溶解させ、ｆ）得られた溶液に、過酸
化水素及び被検サンプルが陽性である際に着色生成物を
生成する無色の酵素基質を添加し、最後に、分光測光に
よって色の強さを測定することを特徴とする、抗熱帯マ
ラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 - 【請求項２】前記工程ａ）におけるヒト血液の被検サン
プルが、全血、血清又は血漿である、請求項１記載の抗
熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 - 【請求項３】前記合成抗原が、アミノ酸配列 （Asn−Ala−Asn−Pro）ｎ （ここで、Asn＝アスパラギン、Ala＝アラニン及びPro
＝プロリンであり、ｎは３ないし40である）で定義され
るものである、請求項１記載の抗熱帯マラリア原虫ポロ
ゾイト抗体の検出法。 - 【請求項４】前記工程ａ）における酵素が、ペルオキシ
ダーゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、
α−ガラクトシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼであ
る、請求項１記載の抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗
体の検出法。 - 【請求項５】前記工程ａ）における非イオン系界面活性
剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、
オクチルフェノールエトキシレート又はサニポンであ
り、弱陰イオン系界面活性剤が、コール酸ナトリウム、
デオキシコール酸ナトリウム又はナトリウムラウロイル
−サルコシネートである、請求項１記載の抗熱帯マラリ
ア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 - 【請求項６】前記工程ｂ）における不活性物質が、硫酸
アンモニウム又は分子量4000以上のポリエチレングリコ
ールである、請求項１記載の抗熱帯マラリア原虫スポロ
ゾイト抗体の検出法。 - 【請求項７】ポリエチレングリコールが分子量6000のも
のである、請求項６記載の抗熱帯マラリア原虫スポロゾ
イト抗体の検出法。 - 【請求項８】前記工程ｂ）における操作を、温度15ない
し35℃、対応する操作時間30分ないし1.5時間で行う、
請求項１記載の抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の
検出法。 - 【請求項９】温度が20ないし30℃の範囲内であり、反応
時間が60分又は約60分である、請求項８記載の抗熱帯マ
ラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 - 【請求項１０】前記工程ｅ）における緩衝剤溶液がpH5.
0であり、前記不活性物質が濃度４％（重量／容量）で
存在する、請求項１記載の抗熱帯マラリア原虫スポロゾ
イト抗体の検出法。 - 【請求項１１】前記酵素がペルオキシダーゼであり、前
記工程ｆ）における基質が2,2−アジノ−ジ−（３−エ
チル−ベンゾチアゾリンスルホネート）又は3,3′,5,
5′−テトラメチル−ベンジジンである、請求項１記載
の抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 - 【請求項１２】請求項１記載の方法を実施するに必要な
反応体を含有してなる、ヒト血液サンプル中の抗熱帯マ
ラリア原虫スポロゾイト抗体を検出するための診断用キ
ット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT20561A/88 | 1988-05-13 | ||
| IT20561/88A IT1217582B (it) | 1988-05-13 | 1988-05-13 | Metodo immunoenzimatico in fase omogenea per la determinazione di anticorpi antisporozoita di plasmodium falciparum nel sangue umano |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01321364A JPH01321364A (ja) | 1989-12-27 |
| JP2692004B2 true JP2692004B2 (ja) | 1997-12-17 |
Family
ID=11168818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1116229A Expired - Lifetime JP2692004B2 (ja) | 1988-05-13 | 1989-05-11 | 抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5210018A (ja) |
| EP (1) | EP0341767B1 (ja) |
| JP (1) | JP2692004B2 (ja) |
| AT (1) | ATE93324T1 (ja) |
| CA (1) | CA1331129C (ja) |
| DE (1) | DE68908466T2 (ja) |
| ES (1) | ES2042966T3 (ja) |
| IT (1) | IT1217582B (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6110665A (en) * | 1995-02-14 | 2000-08-29 | University Of Kentucky Research Foundation | Sarcocystis neuronadiagnostic primer and its use in methods of equine protozoal myeloencephalitis diagnosis |
| US6153394A (en) * | 1998-09-18 | 2000-11-28 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Immunoassay for equine protozoal myeloencephalitis in horses |
| KR101035111B1 (ko) * | 2004-06-30 | 2011-05-19 | 주식회사 엘지생명과학 | 말라리아 플라스모듐 팔시파룸의 면역학적 측정방법 및이에 사용되는 측정 수단 |
| US9206254B2 (en) * | 2012-04-12 | 2015-12-08 | Repropharm | Method and kit for detecting the preovulatory LH peak |
| US11995833B2 (en) * | 2020-07-31 | 2024-05-28 | The Joan and Irwin Jacobs Technion-Cornell Institute | System and method for on-phase microscopy |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3373353D1 (en) * | 1982-05-07 | 1987-10-08 | Sclavo Inc | Competitive immunofluorescence assay and test kit |
| US4855242A (en) * | 1986-04-14 | 1989-08-08 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Method of detecting antibodies |
| IT1198225B (it) * | 1986-12-04 | 1988-12-21 | Eniricerche Spa | Polipeptidi immunologicamente attivi utili per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoita |
| IT1198233B (it) * | 1986-12-23 | 1988-12-21 | Eniricerche Spa | Metodo per la determinazione di anticorpi antisporozoita di p. falciparum nel sangue umano |
-
1988
- 1988-05-13 IT IT20561/88A patent/IT1217582B/it active
-
1989
- 1989-04-19 DE DE89200997T patent/DE68908466T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-19 AT AT89200997T patent/ATE93324T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-19 EP EP89200997A patent/EP0341767B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-19 ES ES89200997T patent/ES2042966T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-20 US US07/341,041 patent/US5210018A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-21 CA CA000597364A patent/CA1331129C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-11 JP JP1116229A patent/JP2692004B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0341767B1 (en) | 1993-08-18 |
| IT8820561A0 (it) | 1988-05-13 |
| JPH01321364A (ja) | 1989-12-27 |
| ES2042966T3 (es) | 1993-12-16 |
| DE68908466T2 (de) | 1994-01-27 |
| DE68908466D1 (de) | 1993-09-23 |
| ATE93324T1 (de) | 1993-09-15 |
| EP0341767A1 (en) | 1989-11-15 |
| US5210018A (en) | 1993-05-11 |
| IT1217582B (it) | 1990-03-30 |
| CA1331129C (en) | 1994-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wirtz et al. | Comparative testing of monoclonal antibodies against Plasmodium falciparum sporozoites for ELISA development | |
| Wolters et al. | Solid-phase enzyme-immunoassay for detection of hepatitis B surface antigen. | |
| Venkatesan et al. | ELISAs for parasitologists: or lies, damned lies and ELISAs | |
| JP3958797B2 (ja) | 抗原特異的ＩｇＭ検出 | |
| WO2019056673A1 (zh) | 一种血型抗原芯片及其在红细胞意外抗体检测中的应用 | |
| Marsh et al. | Parasite-infected-cell-agglutination and indirect immunofluorescence assays for detection of human serum antibodies bound to antigens on Plasmodium falciparum-infected erythrocytes | |
| JP2004301684A (ja) | ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液及びウイルス検出試薬 | |
| JPH1078435A (ja) | 被検物質の免疫化学的測定における感度の上昇 | |
| JP2692004B2 (ja) | 抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法 | |
| Otoo et al. | Immunity to malaria in young Gambian children after a two-year period of chemoprophylaxis | |
| KR100896396B1 (ko) | 점착성 미세소포의 제거 방법 | |
| JP3327488B2 (ja) | 被検体の免疫化学的測定方法 | |
| JPH05504400A (ja) | 抗体または抗原の併用アッセイ | |
| NL8703102A (nl) | Werkwijze voor het aantonen van anti-p. falciparum sporozoiet antilichamen in menselijk bloed. | |
| US9658227B2 (en) | Recombinant GRA antigens and the use of same for early diagnosis of toxoplasmosis | |
| Amara et al. | Circulating autoantibodies directed against conjugated fatty acids in sera of HIV-1-infected patients | |
| US20020102620A1 (en) | Antibodies and peptides for detection of plasmodium vivax | |
| Valizadeh et al. | Natural acquired inhibitory antibodies to Plasmodium vivax Duffy binding protein (PvDBP-II) equally block erythrocyte binding of homologous and heterologous expressed PvDBP-II on the surface of COS-7 cells | |
| Esposito et al. | Evaluation of an ELISA kit for epidemiological detection of antibodies to Plasmodium falciparum sporozoites in human sera and bloodspot eluates | |
| WO1997024141A1 (en) | Monoclonal antibodies and immuno-capture method for quantitation and speciation of malaria parasites | |
| US9201070B2 (en) | Antigenic structure and uses thereof for screening trypanosomiases in humans and animals | |
| Khusmith et al. | Two-site sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax blood stage antigens using monoclonal and polyclonal antibodies | |
| JP3451783B2 (ja) | コリンエステラーゼの測定法及び肝硬変と肝炎の識別法 | |
| KR102002104B1 (ko) | 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도 | |
| Prevot et al. | A lectin immunotest using erythrocytes as marker (ERYTHRO-LIT) for detection and titration of rotavirus antigen |