DE68908466T2

DE68908466T2 - Immunoenzymatisches Verfahren in homogener Phase zur Bestimmung von Antiplasmodium-Falciparum-Sporozoitantikörpern in menschlichem Blut.

Info

Publication number: DE68908466T2
Application number: DE89200997T
Authority: DE
Inventors: Adriano Bernardi; Carlo Antonio Nuzzolo; Antonello Pessi; Antonio Silvio Verdini
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1988-05-13
Filing date: 1989-04-19
Publication date: 1994-01-27
Anticipated expiration: 2009-04-20
Also published as: IT1217582B; JP2692004B2; JPH01321364A; IT8820561A0; US5210018A; CA1331129C; ATE93324T1; DE68908466D1; ES2042966T3; EP0341767B1; EP0341767A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Enzym-Immun-Verfahren zum Diagnostizieren von durch Malaria-parasiten im Menschen induzierten Infektionen.
Im spezielleren betrifft die vorliegende Erfindung ein Enzym- Immun-Verfahren für den Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozoiten von Plasmodium falciparum in homogener Phase.
Malaria, welche eine der schwersten Parasiteninfektionen des Menschen ist, wird durch ein Protozoon der Gattung Plasmodium verursacht, welches sich - einem vielstufigen Zyklus folgend - teilweise in dem Wirtswirbeltier (dem Menschen) und teilweise in dem Moskito-Überträger entwickelt.
Die Infektion beginnt im Menschen dadurch, daß die Anopheles- Stechmücke (Moskito) die Sporozoiten-Form des Plasmodiums injiziert.
Die hauptsächlichen Plasmodium-Spezies, welche im Menschen Malaria induzieren, sind:
Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum.
Insbesondere diese letztgenannte Spezies stellt nicht nur die am weitesten verbreitete Spezies dar, sondern es ist dies auch diejenige Spezies, welche den Großteil der mit dieser Infektion verbundenen Morbidität und Mortalität hervorruft.
Die Malaria ist derzeit stark im Ansteigen begriffen, insbesondere in den tropischen Zonen von Asien, Afrika und Amerika, und zwar wegen des Auftauchens und des ungeregelten Ausbreitens von arzneimittelresistenten Parasiten und wegen der Verschlechterung in den Kontrollsystemen, woraus sich eine Zunahme in den Kosten der Bekämpfungsprogramme ergibt.
Ein wesentliches Element bei der Durchführung einer Anti-Malaria-Kampagne besteht darin, vor und während einer solchen Kampagne sowie an derem Ende Informationen über das Auftreten der Infektion zu gewinnen.
Dies erfordert daher die Verfügbarkeit eines diagnostischen Verfahrens, welches für Großuntersuchungen geeignet ist, und welches zugleich ein hohes Ausmaß an Empfindlichkeit aufweist.
Auf diesem Gebiet sind zum Diagnostizieren von Malaria im Menschen Verfahren durch mikroskopische Untersuchung von Blutproben oder durch immunologische Verfahren im wesentlichen auf der Basis von Fluoreszenzmessungen (IFA) [Nardin, E.H. et al. (1979), Bull, WHO, 57 (Beil.1), 211-217] und auf Grund von Messungen der Radioaktivität (IRMA) [Zavala, F. et al. (1985) Science, 228, 1436] bekannt.
Diese bekannten Verfahren sind jedoch kaum geeignet für epidemiologische Untersuchungen, bei welchen hunderttausende Proben untersucht werden, und zwar hauptsächlich wegen der langen Zeit, die für die Durchführung des jeweiligen Tests erforderlich ist.
Daruber hinaus sind die IFAS- und IRMA-Verfahren mit den Nachteilen behaftet, welche sich aus der Verwendung von nicht sehr stabilen oder von sehr schädlichen Substanzen, wie z.B. fluoreszierenden Substanzen und radioaktiven Isotopen, ergeben.
Auf diesem Gebiet sind diagnostische Verfahren bekannt, welche die Verwendung solcher Substanzen ausschließen, und welche im wesentlichen auf der Verwendung von Enzymen zum Katalysieren einer kolorimetrischen Reaktion basieren (EIA).
Von diesen Verfahren ist das am häufigsten für die Feststellung von Malaria im Menschen verwendete das ELISA- (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)-Testverfahren, wie z.B. das von Zavala F. et al. [(1985), Fed.Proc. 44, 980] und von Del Giudice G. et al. [(1987), J.Clin.Microbiol. 25, 91-96] beschriebene.
Im spezielleren wird nach diesem bekannten Verfahren ein natürliches oder synthetisches Antigen durch eine kovalente Bindung oder durch Adsorption an einen festen Träger, wie z.B. Polystyrol, gebunden, wonach dieser Träger, nachdem die restlichen Bindungsstellen des Trägers mit einem geeigneten Protein blockiert worden sind, mit dem zu prüfenden Serum inkubiert wird.
Das Verfahren wird dann fortgesetzt, indem man zu dem Reaktionsgemisch nacheinander einen an ein Detektor-Enzym gebundenen Anti-Human-Immunglobulin-Antikörper; und ein für das Enzym spezifisches, farbloses Substrat hinzufügt, was dann, wenn das Serum positiv ist, zu einem gefärbten Produkt führt.
Obwohl es dieses bekannte, zum Stande der Technik gehörende Verfahren ermöglicht, diejenigen Probleme zu überwinden, die sich bei den IRMA- und IFA-Techniken ergeben, so haften ihm dennoch noch immer Nachteile an, welche sich sowohl aus den langen Ausführungszeiten (von etwa 6 h) als auch aus der Verwendung von Reaktionskomponenten, wie z.B. Anti-Human- Immunglobulin-Enzym-Antikörper, ergeben, welche nur mit Hilfe von komplizierten und teuren Verfahren erhalten werden können. Außerdem zeigt dieses Verfahren - beim derzeitigen Stand der Anwendung - eine Empfindlichkeitsgrenze von etwa 1 ng Ab (= Antikörper)/ul Serum, und daher läßt dieses Verfahren den Nachweis der Positivität vieler Seren mit einem niedrigeren Antikörpergehalt nicht zu.
Tatsächlich hängt der bei diesem Test erhaltene, spezifische Wert, welcher Wert durch den Unterschied in der dekadischen Extinktion zwischen zwei Trägern erhalten wird, sehr stark von der Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Träger und demzufolge von der Adsorption des Antigens und des Proteins ab.
Wegen seiner niedrigeren Empfindlichkeit kann der ELISA-Test darüber hinaus zu einer gewissen Anzahl von "falschen Negativproben" führen, während mögliche Unterschiede zwischen den Trägern (Vertiefungen in den Mikrotiterplatten), welche ein und derselben Probe entsprechen, zu "falschen Positivproben" führen können.
Bei diesem Test scheinen die Werte für die Einpfindlichkeit stark durch die Tatsache beeinflußt zu sein, daß die Reaktion der Bildung des Anti-Sporozoiten-Antikörper-Antigen-Komplexes mit dem zweiten, mit dem Enzym markierten Antikörper und die kolorimetrische Entwicklung am Ende in heterogener Phase durchgeführt werden.
Außerdem bringt die Verwendung von solchen Trägern, wie z.B von Platten, welche eine lange Zeit vor ihrer Verwendung mit dem Antigen und mit dem Protein vorbehandelt worden sind, Stabilitäts- und Lagerungsprobleme mit sich.
In der GB-Patentanmeldung Nr. 8729975 (= GB-A-2 199 140) ist ein modifiziertes ELISA-Verfahren zur Bestimmung von Malaria im Menschen beschrieben, bei welchem ein Konjugat aus Synthetischem Antigen und Enzym verwendet wird, wobei dieses Antigen befähigt ist, mit den Antikörpern gegen die Sporozoiten von P. falciparum zu reagieren und dieselben spezifisch zu binden, und bei welchem ein Protein verwendet wird, welches in geeigneter Weise an einen festen Träger gebunden ist, wobei dieses Protein befähigt ist, die Antikörper gegen die Sporozoiten aus dem Antikörper-Antigen-Enzym-Komplex zu binden.
Beim Arbeiten gemäß dem in der obgenannten GB-Anmeldung beschriebenen Verfahren sind zwar die Ausführungszeiten in vorteilhafter Weise reduziert, doch bleiben die Probleme bestehen, welche sich aus dem Arbeiten in heterogener Phase ergeben.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Entwicklung eines einfachen, reproduzierbaren, schnell auszuführenden, empfindlichen und wirtschaftlich vorteilhaften Verfahrens zum Nachweis von Malaria bei Menschen.
Dieses Ziel wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch Schaffung eines Enzym-Immun-Verfahrens erreicht, welches in homogener Phase und unter geeigneten Bedingungen ausgeführt wird, und zwar durch Verwendung eines synthetischen Antigens (P), eines Konjugates (P-E) aus synthetischem Antigen und Enzym, und einer Substanz, welche befähigt ist, die Komplexe aus Anti-Sporozoiten-Antikörpern und synthetischem Antigen quantitativ auszufällen, wobei das synthetische Antigen in seiner freien Form (P) und in seiner markierten Form (P-E) vorliegt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in einem Enzym-Immun-Verfahren zur Bestimmung von Anti-P. falciparum- Sporozoiten-Antikörpern in einer Humanblutprobe in homogener Phase.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in einem diagnostischen Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozoiten von P.falciparum in einer Human-Blutprobe, welcher Kit die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Reaktionskomponenten enthält.
Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der Beschreibung und der nachstehenden Beispiele.
Dieses Ziel wird gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch erreicht, daß ein Enzym-Immun-Verfahren zum Nachweisen und Messen von Antikörpern gegen die Sporozoiten von Plasmodium falciparum in einer Human-Blutprobe, welche aus Vollblut, Blutserum und Blutplasma ausgewählt sind, in einer Testanordnung in homogener Phase geschaffen wird, welches die folgenden Stufen umfaßt:
a) getrenntes Inkubieren von zwei aliquoten Teilen der gleichen Probe mit einem Konjugat (P-E) von (NANP)n mit Peroxidase, worin N Asparagin, A Alanin und P Prolin bedeutet und n eine ganze Zahl von 3 bis 40 ist, in einem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0 in Anwesenheit einer Mindestmenge von 0,05 % (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) eines nichtionischen und/oder eines schwach anionischen Detergens und bei einer Temperatur im Bereich von 15ºC bis 35ºC, wobei ein aliquoter Teil dieser Probe zuvor mit nicht-Peroxidase-markiertem (NANP)n (P) bei einer solchen Konzentration vermischt worden ist, um die Bildung des Komplexes aus Antisporozoit-Antikörper mit (NANP)n und Peroxidase (Ab-P-E) auszuschließen;
b) Zusetzen einer inerten Substanz, ausgewählt unter Ammoniumsulfat und einem Polyethylenglykol mit einem Mindestmolekulargewicht von 4.000, zu jeder der aus Stufe (a) austretenden Proben, um die Ausbildung eines Niederschlages bei einer Endkonzentration im Bereich von 13 % bis 17 % (Gewicht/Volumen) zu bewirken;
c) Abtrennen des in Stufe (b) gebildeten Niederschlages durch Filtrieren oder Zentrifugieren;
d) wiederholtes Waschen des Niederschlages mit einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 13 % bis 17 % (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) einer unter Ammoniumsulfat und einem Polyethylenglykol mit einem Mindestmolekulargewicht von 4.000 ausgewählten Substanz, um die Bildung eines Niederschlages zu bewirken;
e) Auflösen des in Stufe (d) gebildeten Niederschlages in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von 4,0 bis 5,0, welche Pufferlösung eine Mindestmenge von 0,05 % (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) eines nichtionischen oder eines schwach anionischen Detergens enthält, gegebenenfalls in Anwesenheit einer inerten Fällungssubstanz;
f) Zusetzen eines für Peroxidase spezifischen farblosen Substrats zu jeder Lösung in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und spektrophotometrisches Bestimmen des Unterschiedes zwischen der dekadischen Gesamtextinktion und der unspezifischen dekadischen Extinktion der getesteten Proben.

Die Stufe (a)

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in der Stufe (a) die zu analysierende Human-Blutprobe Vollblut, Serum oder Plasma sein.
Insbesondere werden bei Verwendung von Vollblut die suspendierten Substanzen durch Zentrifugieren oder Filtrieren eliminiert, u.zw. am Ende der Reaktion mit den Antigenen in freier und in konjugierter Form, oder in der vorhergehenden Stufe, wo an den mit der Pufferlösung verdünnten Blutproben gearbeitet wird.
Synthetische Antigene, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind regelmäßige Polypeptide, welche befähigt sind, die Anti-P.falciparum-Sporozoiten-Antikörper zu erkennen und spezifisch zu binden.
Insbesondere können diese Polypeptide durch die Aminosäurensequenz (Asn-Ala-Asn-Pro)n definiert werden, worin:
- Asn = Asparagin,
- Ala = Alanin und
- Pro = Prolin
ist,
und worin n einen Wert darstellt, der in einen Bereich von 3 bis 40 fällt.
Dieses Polypeptid, welches das Peptidsegment des circumsporozoitischen Proteins (CS) von P.falciparum genau reproduziert, kann mit Hilfe eines Polykondensationsverfahrens von dem Typus hergestellt werden, wie derselbe in der EP-A-209643 beschrieben ist.
Das Vorliegen in diesem Polypeptid von nur zwei endständigen funktionellen chemischen Gruppen, nämlich -NH&sub2; und -COOH, macht dieses Polypeptid für die Herstellung des Konjugates gemäß der vorliegenden Erfindung besonders gut geeignet, und zwar deshalb, weil dieses Polypeptid die Ausbildung einer stabilen kovalenten Bindung zwischen dem Polypeptid und dem Enzym, ohne die katalytische Wirksamkeit des Enzyms zu gefährden, ermöglicht.
Die Konjugatbildung zwischen diesem regelmäßigen Polypeptid und dem Enzym kann durchgeführt werden, indem man gemäß generellen Techniken arbeitet.
Das Konjugat wird vorzugsweise so hergestellt, wie dies in der GB-Patentanmeldung Nr. 8729975 (= GB-A-2 199 140) beschrieben ist.
Die Enzyme, welche eine kolorimetrische Reaktion katalysieren, können aus einer Gruppe ausgewählt werden, welche aus jenen Enzymen besteht, welche generell in einem Enzym-Immuntest verwendet werden.
Insbesondere sei - zur besseren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung - erwähnt, daß das synthetische Antigen (Asn-Ala-Asn-Pro)&sub2;&sub0;(NANP)&sub2;&sub0; und das Peroxidase-Enzym verwendet werden.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden zwei aliquote Teile der gleichen Blutprobe, welche in geeigneter Weise in einer Phosphatpufferlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 6,5 bis 8,00 verdünnt ist, getrennt mit der gleichen Phosphatpufferlösung vermischt, welche das Konjugat (P-E) aus synthetischem Antigen und Enzym in einer in einen Bereich von 1,0 bis 2,0 ug/ml fallenden Konzentration enthält.
Insbesondere enthält die Pufferlösung ein nichtionisches und/oder schwach anionisches Detergens (D) in einer Endkonzentration von nicht unter 0,05 % (Gew./Vol. oder Vol./Vol.), oder Gemische solcher Detergentien, in einem Verhältnis zueinander von etwa 1.
Nichtionische und schwach anionische Detergentien können aus jenen ausgewählt werden, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, und welche generell in der Diagnostik verwendet werden.
Beispiele dieser Detergentien sind Tween-20, Triton X, Saponin (nichtionische Detergentien) und Natriumcholat (Na-C), Natriumdesoxycholat (Na-Doc) oder Natriumlauroyl-sarkosin (Na-L-Sar) (schwache anionische Detergentien)
Vorzugsweise wird Triton X-100 in einer Konzentration von - oder annähernd von - 0,05 % verwendet; oder es werden Gemische von Triton X-100 und Natriumlauroyl-sarkosin, in einem Verhältnis der Komponenten zueinander von 1, verwendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird einer der zwei aliquoten Teile der Probe zuvor mit dem unmarkierten synthetischen Antigen (P) in einem starken molaren Überschuß, bezogen auf das P-E-Konjugat, vermischt, so daß das freie Antigen, in Konkurrenz mit dem P-E, mit den Anti-Sporozoiten-Antikörpern (Ab), welche möglicherweise in der Probe vorhanden sind, einen Ab-P-Komplex bilden und die Ausbildung von Ab-P-E vollständig hemmen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist von der Anmelderin bzw. Patentinhaberin gefunden worden, daß bei einem Molverhältnis von P/P-E von 100/1 die Bildung des obgenannten Komplexes vollständig gehemmt wird.
Die so erhaltenen Reaktionsgemische werden dann bei einer in einen Bereich von 15º bis 35ºC, vorzugsweise von 20º bis 30ºC, fallenden Temperatur und während einer Zeitspanne in einem Bereich von 15 bis 30 min, und vorzugsweise von 20 min, inkubiert.

Die Stufe (b)

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden in der Stufe (b) des vorliegenden Verfahrens die moglicherweise in der Stufe (a) gebildeten Ab-P- und Ab-P-E-Komplexe durch Zugabe einer inerten (d.i. weder reaktiven noch denaturierenden) Substanz zu den Gemischen ausgefällt, welche inerte Substanz aus Ammoniumsulfat oder Polyethylenglykolen (PEG) mit einem nicht unter 4.000 liegenden Molekulargewicht (MW) ausgewählt ist und in einer solchen Endkonzentration eingesetzt wird, daß es dadurch ermöglicht wird, die obgenannten Komplexe quantitativ auszufällen.
Vorzugsweise wird PEG-6000 verwendet, dessen Endkonzentration in einen Bereich von 13 % bis 17 % (Gew./Vol.) fällt.
In dieser Stufe wird das Verfahren so durchgeführt, daß die Gemische bei Temperaturen, welche in einen Bereich von 15ºC bis 35ºC, vorzugsweise von 20ºC bis 30ºC, fallen, während einer Zeitspanne von 40 bis 60 min leicht gerührt werden.
Indem man unter Anwendung dieser bevorzugten Bedingungen verfährt, werden durch das PEG-6000 alle in der Probe vorhandenen Immunglobuline, einschließlich der Ab-P- und Ab-P-E-Komplexe ausgefällt, wobei nur die nicht-umgesetzten Antigene in Lösung belassen werden.

Die Stufe (c)

In dieser Stufe wird der Niederschlag von den Reaktionsgemischen durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt.
Das Abtrennen des Niederschlages wird vorzugsweise durch Filtrieren durchgeführt, weil dann die Stufen des gleichen Verfahrens einfacher sind, da man mit kleinen Volumensanteilen (in der Größenordnung von Mikrolitern) arbeitet.
Zu diesem Zweck kann man im Handel erhältliche Filtriervorrichtungen verwenden, wie z.B. das "Millititer Filtration System" von der Firma Millipore Corp. Dieses System besteht aus Filtrierplatten mit einer Porengröße von 0,22 um, welche - zum Unterschied von den in dem ELISA-Test verwendeten, absorbierenden Platten - nach ihrem Gebrauch gewaschen und für nachfolgende Analysen wiederverwendet werden können.

Die Stufe (d)

In dieser Stufe wird der auf der Filtrierplatte vorhandene Niederschlag wiederholt (im allgemneinen 3- bis 4-mal) mit der die ausfällende Substanz in einer Endkonzentration in einem Bereich von 13 % bis 17 % enthaltenden PBS/D-Pufferlösung gewaschen.

Die Stufe (e)

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Niederschlag in dieser Stufe aufgelöst, und zwar durch die Zugabe - auf einmal oder in aufeinanderfolgenden, aliquoten Anteilen - einer 0,1M Acetat- oder Acetat-Citrat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 5,5, welche ein nichtionisches und/oder ein schwach anionisches Detergens in den gleichen Konzentrationen, wie dieselben für die Stufe (a) angegeben sind, gegebenenfalls in Anwesenheit der Fällungslösung, in einer Endkonzentration, welche in einen Bereich von 3 % bis 5 % (Gew./Vol.) fällt, enthält.
Vorzugsweise wird eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von - oder von ungefähr - 5,0 verwendet, welche 4 % PEG-6000 und 0,05 % Triton X-100 enthält.
Das Vorliegen des Detergens als Dispergiermittel hat sich als besonders vorteilhaft für die Stabilisierung und Rückgewinnung des Antikörper-Antigen-Enzym-Komplexes erwiesen. Die Fällungssubstanz in den oben angeführten Konzentrationen funktioniert, im Gegensatz hierzu, dahingehend, daß sie den unspezifischen Untergrund der Endenzymantwort reduziert.
Tatsächlich macht diese Substanz, bei den oben angegebenen pH-Werten, die meisten ausgefällten Materialien von nicht-immunglobulinischer Natur mit Peroxidase-Aktivität unlöslich.

Die Stufe (f)

Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird diese Stufe durchgeführt, indem man ein für das verwendete Enzym spezifisches, farbloses Substrat zu den in der Stufe (e) erhaltenen Gemischen hinzufügt.
Vorzugsweise ist das spezifische Substrat dann, wenn das Enzym Peroxidase (E.C. 1. 11. 1.7) ist, ABTS [2,2-Azino-di-(3-ethyl-benzothiazolinsulfonat) oder TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin).
Die kolorimetrische Reaktion wird in Gegenwart von Wasserstoffperoxid bei einer Temperatur, welche in einen Bereich von 15º bis 35ºC, vorzugsweise von 20º bis 30ºC fällt, und während einer geeigneten Zeitspanne durchgeführt.
Generell reicht eine Zeitspanne von 10 bis 30 min aus. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise TMB und H&sub2;O&sub2; bei Endkonzentrationen von 0,1 mg/ml bzw. 1,3 mM verwendet, und die erforderliche Reaktionszeit unter diesen Bedingungen beträgt 10 min. Am Ende wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe einer starken Säure, wie z.B. H&sub2;SO&sub4;, in einer Konzentration, welche in einen Bereich von 2 bis 3 M fällt, abgebrochen. Für jeden aliquoten Teil wird die Farbintensität dann durch Bestimmung der dekadischen Extinktion aufgrund eines spektralphotometrisch abgelesenen Wertes gegenüber einer Leerprobe bewertet, nämlich gegenüber einem Substrat, welches - in Abwesenheit einer Blutprobe - wie für die verschiedenen Stufen der vorliegenden Erfindung beschrieben hergestellt worden ist.
Der spezifische Wert, oder die spezifische dekadische Extinktion (A), welche für den Ab-P-E-Komplex jeder Probe relevant ist, ist gegeben durch:
A (Probe + P-E) - A [Probe + (P+P-E)],
nämlich durch den Unterschied zwischen der dekadischen Gesamtextinktion (spezifische dekadische Extinktion + unspezifische dekadische Extinktion), und der unspezifischen dekadischen Extinktion.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Kriterium, welches herangezogen wird, um die Proben als "positiv" oder "negativ" einzustufen, das folgende:
- eine Probe wird als "positiv" angesehen, wenn ihr spezifischer Wert (A) ["A(spez.)"] größer als 0,100 ist, und wenigstens 30 % des Wertes für die Gesamt-A (gesamte spezifische und unspezifische dekadische Extinktion) ausmacht;
- eine Probe wird als "ngativ" angesehen, wenn ihr Wert für A (spez.) kleiner als 0,100 ist, wie groß auch immer der Wert für die prozentmäßige Hemmung ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Empfindlichkeit des Verfahrens eine solche, daß dadurch der Nachweis von Anti-Sporozoiten-Antikörpern einer Konzentration von gleich - oder von ungefähr gleich - 0,2 ng/ul Serum ermöglicht wird.
Weiterhin wurde gefunden, daß die erhaltenen Ergebnisse beim Arbeiten gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur von 30ºC identisch mit jenen sind, die bei Temperaturen von 20 bis 25ºC beobachtet werden. Durch diese Tatsache wird es ermöglicht, dieses Verfahren vorteilhafterweise in Tropengebieten anzuwenden, in welchen die Malaria weiter verbreitet ist.
Zusammenfassend läßt sich somit sagen, daß das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung beträchtliche Vorteile im Vergleich zu jenen des gegenwärtigen Standes der Technik, und insbesondere gegenüber dem ELISA-Verfahren zeigt.
Unter diesen Vorteilen sind die hohe Empfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, die Schnelligkeit und Genauigkeit der Ausführung sowie die Billigkeit ebendieses Verfahrens zu erwähnen.
Die Empfindlichkeit des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dßaß die Komplexbildungsreaktion zwischen den Anti-Sporozoiten-Antikörpern und dem synthetischen Antigen, sowie die kolorimetrische Entwicklung am Ende in homogener Phase und unter bestimmten Bedingungen stattfinden.
Darüber hinaus liefert das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch, daß es auf der Hemmung des spezifischen Wertes für jede Probe durch das reine (unmarkierte) Antigen basiert, eine spezifische, immundiagnostische, semiquantitative Antwort, welche durch die größere Empfindlichkeit ebendieses Verfahrens noch weiter verstärkt wird.
Was die Billigkeit des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung anbelangt, so erfordert dasselbe, neben dem synthetischen Antigen und den für die Ausführung des Tests erforderlichen, im Handel erhältlichen Reaktionskomponenten, auch noch das P-E-Konjugat, welches mit dem Vorteil ausgestattet ist, daß es billiger als das Antikörper-Anti-Human-Konjugat ist.
Ein beträchtlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht auch in der Möglichkeit der einfachen Ausführung.
Darüber hinaus ist das Verfahren, dank seiner vielseitigen Verwendbarkeit, und indem es für das Testen von sowohl kleinen als auch von großen Zahlen von Proben geeignet ist, auch für den Gebrauch in Gesundheitseinrichtungen geeignet, in welchen ein Bedarf nach der Diagnostik kleiner Volumensanteile besteht. Für die Bestimmung der Anti-P-falciparum-Sporozoiten-Antikörper in Human-Blutproben sind Analysenpackungen gut geeignet, welche alle für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Reaktionskomponenten enthalten, wie z.B. ein Diagnosekit zum Feststellen und Messen von Anti-Plasmodium falciparum-Sporozoiten-Antikörpern in einer Humanblutprobe, ausgewählt unter Vollblut, Blutserum und Blutplasma, in einer Testanordnung in homogener Phase, bestehend aus (NANP)n, worin N Asparagin bedeutet, A Alanin ist und P Prolin darstellt, und n eine ganze Zahl von 3 bis 40 ist, einem Konjugat (P-E) von (NANP)n mit Peroxidase, einem für Peroxidase spezifischen farblosen Substrat, Pufferlösungen und einer unter Ammoniumsulfat und einem Polyethylenglykol mit einem Mindestmolekulargewicht von 4.000 ausgewählten Substanz, um ein Ausfällen des Komplexes aus Antisporozoiten-Antikörper mit (NANP)n zu bewirken.
Eine Analysenpackung dieser Art oder von ähnlicher Art ermöglicht die Bestimmung von Antikörpern gegen die Sporozoiten von Plasmodium zu den niedrigstmöglichen Kosten.
Die nachstehend angeführten, Versuche betreffenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Das Beispiel 6 stellt einen Vergleich mit den herkömmlichen ELISA-Verfahren dar.

Beispiel 1

Es wurden 16 Seren verwendet, welche mit den Bezugszeichen 241 - 711 und KX versehen wurden, und welche unbekannten Ursprungs waren, von gesunden Individuen entnommen bzw. von mit Malaria infizierten Individuen gewonnen worden waren, und wobei ein weiteres Serum und ein mit Heparin versetztes Plasma aus zwei gesunden Spendern entnommen worden waren, und wobei ein weiteres Serum aus einem gesunden Spender entnommen worden war, aber durch Zugabe von zwei monoklonalen (Mab) Anti-(NANP)&sub3;-Antikörpern (1 bzw. 2 ng/ul Gesamtserum) positiv gemacht worden war.
Die Proben wurden in Eppendorf-Proberöhrchen mit der PBS/D-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5 (PBS = 0,01M Natriumphosphat, 0,3M NaCl, D = 0,05 % Triton X-100 (Vol./Vol.) und 0,05 % Natriumlauroylsarkosin (Gew./Vol.)) im Verhältnis von 1:50 verdünnt.
In der Praxis wurden 5 ul Serum, Plasma oder Mab/negatives Serum mit 245 ul PBS/D verdünnt.
Vier aliquote Anteile (50 ul) jeder so verdünnten Probe wurden dann in eine Reihe von vier benachbarten Vertiefungen eingebracht, welche zu einer vertikalen Reihe einer Platte mit 96 Vertiefungen gehörten. Daraus ergibt sich daher eine volle Platte mit 22 Proben, wobei die erste Reihe für die Leerproben, nämlich für das bloße Substrat der enzymatischen Endreaktion, reserviert bleibt.
Zu der dritten und vierten, für jede Probe relevanten Vertiefung wurden 2 ul einer Lösung des synthetischen Peptids (NANP)&sub2;&sub0; in destilliertem Wasser (1 ug/ul) zugegeben.
Anschließend wurden zu allen Vertiefungen mit den Proben 50 ul einer Lösung des P-E-Konjugates in PBS/D (2 ug/ul) zugesetzt.
Nach 20 min bei Zimmertemperatur (20 bis 25ºC) wurden in die einzelnen Vertiefungen jeweils 0,1 ml einer 30%igen Lösung von PEC-6000 (Fluka) (Gew./Vol.) in PBS/D eingebracht.
Wegen der hohen Dichte dieser Lösung wurde ein gutes Vermischen mit der Probe dadurch erhalten, daß man in jede Vertiefung eine kleine Stahlkugel mit einem Durchmesser von 3,1 mm legte, wonach die Platte dann leicht gedreht wurde.
Die Platten wurden während 60 min auf Zimmertemperatur gehalten, wonach aus jeder Vertiefung 0,1 ml an Probe entnommen und in die entsprechenden Vertiefungen einer Filtrierplatte ("Millipore" STGV 096 NS 0,22 um) transferiert wurden.
Die Proben wurden durch Absaugung filtriert, und sie wurden dann viermal gewaschen, und zwar jeweils mit 0,2 ml 15%igem PEG-6000 in PBS/D.
Die Niederschläge auf dem Filter wurden dann aufgelöst, indem man in jede Vertiefung 0,150 ml einer 0,1M Acetatpufferlösung vom pH 5,0, welche Tritin X-100 (0,05 %) und PEG-6000 (4 %) enthielt (nämlich die "a"-Lösung), einbrachte. Die Platte wurde dann unter leichtem Schütteln während 5 min auf Zimmertemperatur gehalten.
Die Lösungen wurden dann - durch Absaugung - in der darunterliegenden Aufnahmeplatte gesammelt.
Die Absaugung wurde dann mit 0,1 ml der gleichen "a"-Lösung wiederholt.
Die Aufnahmeplatte wurde dann rückgewonnen, und zu jeder Vertiefung wurden 30 ul einer Lösung zugegeben, welche 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und H&sub2;O&sub2; bei einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml bzw. 1,3 mM enthielt.
Die Enzymreaktion wurde nach 10 min durch Zugabe von 25 ul einer 3M H&sub2;SO&sub4; zu jeder Vertiefung abgebrochen. Die dekadische Extinktion der Lösungen in jeder Vertiefung wurde dann bei 450 nm mit einem Platten-Lesegerät vom Typus "Titertek Multiskan Plus" gemessen.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt: Tabelle 1 A bei 450 nm nach 10 Minuten , Reaktion mit TMB* % Hemmung (% Spez.) Probe (0,5 ul) Negatives Serum + Mab Negatives Serum Negatives Plasma * Für Peroxidase spezifisches TMB
In der Tabelle bedeuten:
(a) die spezifische dekadische Extinktion + die nicht-spezifische dekadische Extinktion;
(b) die nicht-spezifische dekadische Extinktion;
A(spez.) die spezifische dekadische Extinktion; und
% Hemmung oder % Spezifität zeigen die Spezifität des Verfahrens an.

Beispiel 2

Das Verfahren wurde wie im vorhergehenden Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, und zwar unter Verwendung:
- eines Lösungsmittels für den Niederschlag, welches aus einer 0,1M Acetatpufferlösung vom pH 5,0 und mit einem Gehalt von 0,05 % an Triton X 10() (der "b"-Lösung) bestand:
- einer Lösung (30 ul/Vertiefung), welche 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzothiazolin)sulfonat (ABTS) und H&sub2;O&sub2; bei einer Endkonzentration von 1,1 mg/ml bzw. 1,3 mM enthielt.
Die Werte für die dekadische Extinktion wurden für jede Vertiefung bei 405 nm, ohne die Enzymreaktion abzubrechen, nach 15 und 30 min gemessen.
In den Tabellen 2 und 3 sind die Ergebnisse angeführt, welche für eine Reaktionszeit von 15 min bzw. von 30 min erhalten worden sind. Tabelle 2 A bei 405 nm nach 15 Minuten Reaktionszeit (ABTS)* % Hemmung Probe (0,5 ul) Negatives Serum + Mab Negatives Serum * Für Peroxidase spezifisches ABTS Tabelle 3 A bei 405 nm nach 30 Minuten Reaktionszeit (ABTS)* % Hemmung Probe (0,5 ul) Negatives Serum + Mab Negatives Serum Negatives Plasma * Für Peroxidase spezifisches ABTS

Beispiel 3

Das Analysenverfahren wurde wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wobei die (a)-Lösung als Lösungsmittel für den Niederschlag; und ABTS als Enzymsubstrat verwendet wurden; und eine Reaktionszeit von 30 min angewendet wurde.
In der nachstehenden Tabelle 4 sind die dabei erhaltenen Ergebnisse angeführt. Tabelle 3 A bei 405 nm nach 30 Minuten Reaktionszeit (ABTS)* % Hemmung Probe (0,5 ul) Negatives Serum + Mab Negatives Serum Negatives Plasma * Für Peroxidase spezifisches ABTS

Beispiel 4

Das Verfahren wurde an einer Probe aus positivem Serum (KX) in gleicher Weise wie im Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, und zwar unter Verwendung des ABTS-Substrates, unter Anwendung einer Reaktionszeit von 30 min, und unter Verwendung einer PBS/D-Pufferlösung mit einem Gehalt an verschiedenen Detergentien (D) in verschiedenen Konzentrationen.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 angeführt.
Die dekadische Extinktion wurde bei 405 nm, unter Verwendung von 0,5 ul der Probe, bestimmt. Tabelle 5 A bei 405 nm nach 30 Minuten mit (ABTS)* Detergens (D) % Hemmung Tween 20 Triton X-100 Saponin Na-L Sark. * Für Peroxidase spezifisches ABTS

Beispiel 5

Das Verfahren wurde mit dem positiven Serum KX wie im vorstehenden Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, wobei zum Auflösen des Niederschlages in der Stufe (e) Pufferlösungen mit verschiedenen pH-Werten und mit verschiedenen Konzentrationen von PEG-6000 verwendet wurden.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 6 angeführt: Tabelle 6 A bei 405 nm nach 20 Minuten mit ABTS* % Hemmung * Für Peroxidase spezifisches ABTS

Beispiel 6

(Vergleich mit bekannten Verfahren)

a) "ELISA"-Test

Bei diesem Test wurden 0,5 ul der gleichen Proben, wie dieselben in Beispiel 1 angeführt sind, und zwei Platten verwendet, welche wie folgt vorbehandelt worden waren:
- die eine Platte, mit 0,1 ug Vertiefung eines synthetischen Antigens (NANP) und dann mit 3%igem BSA (Rinderserumalbumin) in PBS;
- die andere Platte, nur mit BSA.
Dann wurde zu jeder Vertiefung von beiden Platten das Anti-Human-Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugat (Ab"-PA) hinzugefügt, welches mit dem in der Probe möglicherweise vorhandenen Anti-Sporozoiten-Antikörper (Ab) den P-Ab-Ab"-PA-Komplex bildet.
Der Nachweis wurde unter Anwendung bekannter Techniken und unter Verwendung von para-Nitrophenylphosphat (p-NPP) als Substrat durchgeführt.
Die enzymatische Reaktion wurde nach 30 min durch Zugabe von 25 ul 3M NaOH abgebrochen.
Die dekadische Extinktion wurde bei 405 nm gemessen.
Der spezifische Wert [A (spez)] ist gegeben durch:
dekadische Extinktion (Platte mit (NANP)&sub4;&sub0;) - dekadische Extinktion (Platte mit BSA)
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 angeführt. Tabelle 7 A bei 405 nm nach 30 Minuten mit p-NPP % Spezifität Probe (0,5 ul Serum) Positives Serum + Mab (niedriger Gehalt) Positives Serum + Mab (hoher Gehalt) Negatives Serum Negatives Plasma

B) P-E/Sepharose-A-Protein (P-E/S-PA)-Verfahren

Dieses Verfahren, welches in der schwebenden GB-Patentanmeldung Nr. 8729975 (= GB-A-2 199 140) beschrieben ist, ist dadurch gekennzeichnet, daß es mit dem Konjugat (P-E) aus synthetischem Antigen und Enzym arbeitet, welches befähigt ist, mit den in der Blutprobe vorhandenen Anti-Sporozoiten-Antikörpern einen stabilen Komplex (Ab-P-E) aus Antikörper/synthetischem Antigen/Enzym zu bilden, welcher an ein A-Protein gebunden ist.
In der Praxis wurden die zu analysierenden Proben unter Verwendung von PBS-Pufferlösung mit einem Gehalt von 0,05 % an Triton X-100 wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Nach einer 20-minütigen Reaktionszeit wurden die Proben in die Vertiefungen einer Filtrierplatte ("millipore") transferiert, welche das Sepharose-A-Protein-Harz (2 mg eines handelsüblichen gefriergetrockneten Produktes/Vertiefung) (Pharmacia- Uppsala) enthielt, und welche mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war.
Die Platte wurde bei Zimmertemperatur während 30 min inkubiert, und sie wurde dann viermal mit der gleichen Äquilibrierungspufferlösung gewaschen.
In jede Vertiefung wurden dann 150 ul eines 0,1M Acetatpuffers vom pH 5,0 eingebracht, welcher das ABTS-Substrat und H&sub2;O&sub2; in deren jeweiliger Endkonzentration von 1,1 mg/ml bzw. von 1,3 mM enthielt.
Nach 30 min wurde die Positivität bzw. Negativität der Proben durch Beobachten der Reaktionsfarbe in den einzelnen Vertiefungen bestimmt.
Die positiven Seren (mit Malaria infizierten Seren) und die Mabenthaltenden Seren zeigten eine grünblaue Farbe in den Vertiefungen, welche dem Reaktionsgemisch Serum + P-E entspachen, und es zeigte sich keine Farbe, oder nur eine geringfügige Farbe, in den Vertiefungen, welche das Gemisch aus Serum + P-E+P enthielten; die negativen Seren waren - ebenfalls in denjenigen Vertiefungen, welche den beiden Reaktionen entsprachen, - farblos, oder nur geringfügig gefärbt.
In der nachstehenden Tabelle 8 sind die Werte angeführt, welche für die 16 Seren mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, P-E/PEG (1), mit dem ELISA-Verfahren (2) und mit dem P-E-/S-PA-Verfahren (3) erhalten worden sind: neben den Werten für die spezifische dekadische Extinktion A [A(spez.)], sind die Positivität (+) bzw. die Negativität (-) angeführt. Tabelle 8 Vergleich zwischen den Werten für die spezifische dekadische Extinktion, welche mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung (1) und nach den durch den Stand der Technik bekannten Verfahren (2) und (3) erhalten worden sind. Verfahren Proben A(spez.) aus Tabelle
Aus einem Vergleich mit den in der Tabelle 6 angeführten Testergebnissen kann man beobachten, daß:
1. für nur ein einziges aus den 16 geprüften, unbekannten Seren, nämlich für das Serum Nr. 632, ein Konflikt insofern besteht, als dieses Serum nach dem ELISA-Test als negativ zu bewerten ist, daß dieses Serum aber beim Testen nach den beiden anderen Verfahren positiv ist;
2. im Falle von positiven Seren, das P-E/PEG-Verfahren sowohl mit dem ABTS-Substrat als auch mit dem TMP-Substrat höhere Werte für A(spez.) als das ELISA-Verfahren ergibt, und daher befähigt ist, die Positivität des Serums Nr. 632 nachzuweisen;
3. die niedrigen Werte für A(spez.) in dem ELISA-Test für die Seren Nrn. 575, 620 und KX - sollte eine Ausschaltung von 0,150 angewendet werden -, dazu führen würden, daß diese drei Seren als ungewiß ("im Randbereich") einzustufen wären, während sie sich nach den beiden anderen Verfahren als eindeutig positiv herausstellen.

Claims

1. Immunoenzymatisches Verfahren zur Feststellung und Messung von Anti-Plasmodium falciparum-Sporozoit-Antikörpern in einer Humanblutprobe, ausgewählt unter Vollblut, Blutserum und Blutplasma, in einer Anordnung in homogener Phase, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) getrenntes Inkubieren von zwei aliquoten Teilen der gleichen Probe mit einem Konjugat (P-E) von (NANP)n mit Peroxidase, worin N Asparagin, A Alanin und P Prolin bedeutet und n eine ganze Zahl von 3 bis 40 ist, in einem Phosphatpuffer bei einem PH-Wert von 6,5 bis 8,0 in Anwesenheit einer Mindestmenge von 0,05 % (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) eines nichtionischen und/oder eines schwach anionischen Detergens und bei einer Temperatur im Bereich von 15º C bis 35º C, wobei ein aliquoter Teil dieser Probe zuvor mit nicht-Peroxidase-markiertem (NANP)n (P) bei einer solchen Konzentration vermischt worden ist, um die Bildung des Komplexes aus Antisporozoit-Antikörper mit (NANP)n und Peroxidase (Ab-P-E) auszuschließen;

b) Zusetzen einer inerten Substanz, ausgewählt unter Ammoniumsulfat und einem Polyethylenglykol mit einem Mindestmolekulargewicht von 4.000, zu jeder der aus Stufe (a) austretenden Proben, um die Ausbildung eines Niederschlages bei einer Endkonzentration im Bereich von 13 % bis 17 % (Gewicht/Volumen) zu bewirken;

c) Abtrennen des in Stufe (b) gebildeten Niederschlages durch Filtrieren oder Zentrifugieren;

d) wiederholtes Waschen des Niederschlages mit einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 13 % bis 17 % (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) einer unter Ammoniumsulfat und einem Polyethylenglykol mit einem Mindestmolekulargewicht von 4.000 ausgewählten Substanz, um die Bildung eines Niederschlages zu bewirken;

e) Auflösen des in Stufe (d) gebildeten Niederschlages in einer Pufferlösung bei einem PH-Wert von 4,0 bis 5,0, welche Pufferlösung eine Mindestmenge an 0,05 % (Gewicht/Volumen oder Volumen/Volumen) eines nichtionischen oder eines schwach anionischen Detergens enthält, gegebenenfalls in Anwesenheit einer inerten Fällungssubstanz;

f) Zusetzen eines für Peroxidase spezifischen farblosen Substrats zu jeder Lösung in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid und spektrophotometrisches Bestimmen des Unterschiedes zwischen der Gesamtabsorption und der aspezifischen Absorption der getesteten Proben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das (NANP)n (NANP)&sub2;&sub0; ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das für Peroxidase spezifische farblose Substrat unter 2,2'-Azino-di(3-ethyl-benzothioazolinsulfonat) (ABTS) und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TBM) ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das nichtionische Detergens unter Polysorbat 20, Octoxynol-9 und Saponin ausgewählt wird und das schwach anionische Detergens unter Natriumcholat, Natriumdeoxycholat und Natriumlauroylsarcosinat ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin in Stufe (b) das Polyethylenglykol ein Molekulargewicht von 6.000 (PEG-6000) aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin Stufe (b) bei einer Temperatur von 15º C bis 35º C und während einer Dauer von 40 min bis 60 min ausgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Temperatur von 20º C bis 30º C beträgt und die Dauer 60 min ausmacht.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pufferlösung von Stufe (e) einen PH-Wert von 5,0 aufweist, die Menge an PEG-6000 4 % (Gewicht/Volumen) beträgt und die Menge an Triton X-100 0,05 % ausmacht.

9. Diagnosekit zum Feststellen und Messen von Antiplasmodium falciparum-Sporozoit-Antikörpern in einer Humanblutprobe, ausgewählt unter Vollblut, Blutserum und Blutplasma, in einer Anordnung in homogener Phase, bestehend aus (NANP)n, worin N Asparagin bedeutet, A Alanin ist und P Prolin darstellt, und n eine ganze Zahl von 3 bis 40 ist, einem Konjugat (P-E) von (NANP)n mit Peroxidase, einem fur Peroxidase spezifischen farblosen Substrat, Pufferlösungen und einer unter Ammoniumsulfat und einem Polyethylenglykol mit einem Mindestmolekulargewicht von 4.000 ausgewählten Substanz, um ein Ausfällen des Komplexes aus Antisporozoit-Antikörper mit (NANP)n zu bewirken.