JPH01321364A - 抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 感染を診断するための新規な免疫一酵素的検出法に係る
。

さらに詳述すれば、本発明は、熱帯マラリア原虫（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイ
トに対する抗体を均一相で検出する免疫酵素的方法に係
る。

マラリア（ヒトにおける最ら重大な寄生虫感染の１つで
ある）はプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）
に属する原虫によって起こり、多段階サイクルに従って
、一部は有を椎性宿主（ヒト）内において、一部はキャ
リヤー、蚊の内部で発現する。

感染は、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）の蚊によ
るスポロゾイト形のプラスモディウム属菌の接種によっ
てヒトにおいて生ずる。

ヒトにおいてマラリアを起こさせるプラスモディウム属
菌の主な種は、プラスモディウム・オバーレ（Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ　ｏｖａｌｅ）、プラスモディウム・マラ
リアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｍａｌａｒｉａｅ）、
プラスモデイウム・パイパックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕ
ｍ　ｖｉｖａｘ）及び熱帯マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏ
ｄｉｕｎ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である。

特に最後のものは、最も広く分布している種であるだけ
でなく、感染に伴う重篤な病気の発生及び大量死の原因
となる種でもある。

現在、マラリアは、中でもアジア、アフリカ及びアメリ
カの熱帯地域において、薬剤耐性寄生虫の出現及びその
野放しの拡散、及びコン）・ロールシステムの劣化（そ
の結果、ファイトプログラムのコストが上昇する）のた
め復活し、流行している。

マラリア撲滅キャンペーンを行う際の基本的な要素は、
該キャンペーン前、キャンペーン中及び終了後における
感染の発生に関する情報を得ることである。

従って、このためには、大規模な研究に適し、同時に高
い感度が付与された診断方法が利用できなければならな
い。

当分野では、ヒトにおけるマラリアの診断法として、血
液を顕微鏡によって検査する方法、本質的に蛍光の測定
に基く免疫法（ＩＦＡ）［Ｅ、Ｈ，ＮａｒｄｉｎらｒＢ
ｕｌｌ　ＹＨＯＪ　５７（Ｓｕｐｐｌ、　１）、　２１
１−２１７（１９７９）］及び放射能の測定に基く免疫
法（ＩＲＭＡ）［Ｆ、　Ｚａｖａｌａら［サイエンス（
ｓｃｉｅｎｃｅ）４２２８．１４３６（１９８５）］が
知られている。

このような公知の方法は、数百又は数千のサンプルを検
査するものであり、中でも、実施に長時間を要するため
、必ずしも疫学的調査には適していない。

さらに、ＩＦＡ法及びＩＲＭＡ法は、蛍光物質及び放射
性同位元素の如きあまり安定でなく、かつ非常に有害な
物質の使用に関する欠点を有する。

当分野では、上記物質の使用を回避し、本質的に呈色反
応において触媒作用を発揮する酵素の使用に基く診断用
（ＥＩＡ）も公知である。

これらの方法の中で６、ヒトにおけるマラリアの診断を
行うために最も広く利用されている方法は、たとえばＦ
、　Ｚａｖａｌａらｒｅｅｄ、　Ｐｒｏｃ、Ｊ　４４．
９８０（１９８５）；　Ｇ、　　Ｄｅｌ　Ｇｉｕｄｉｃ
ｅら［Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ
２５、９ｌ−９６（１９８７）の開示の如きＥＬＩＳＡ
法（同相酵素免疫測定法）である。

さらに詳述すれば、該公知法によれば、天然又は合成の
抗原を、共有結合又は吸着によって、たとえばポリスチ
レンの如き固状支持体に結合させ、該支持体の残留結合
部位を適当なタンパク質でブロッキングした後、被検血
清と共にインキュベートする。

ついで、反応混合物に、検出用酵素に結合した抗ヒト免
疫グロブリン抗体及び酵素に特異な基質（血清が陽性で
ある場合には着色生成物を生ずる）を連続して添加する
。

このような方法では、ＩＲＭＡ法及びＩＦＡ法における
問題点を解消できるが、所要時間が長いこと（約６時間
）及び煩雑かつ高価な方法によってしか調製され得ない
抗ヒト免疫グロブリン−酵素抗体の如き反応体を使用す
ることに関連する欠点が必ずしも解消されてはいない。

さらに、この方法は、現時点では、その利用の際、感度
１　ｎｇ（Ａｂ）／μＱ（血清）の限界があり、低抗体
含量を有する多数の血清の検査を可能にするものではい
。

実際、この検査法では、２つの支持体間の吸光度の差か
ら得られる固有の値（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｖａｌｕｅ）
は、該支持体の均−性及び再現性、従って抗原及びタン
パク質の吸着性に大いに左右される。

低感度であることにより、ＥＬＩＳＡ法は、さらに、多
数の［誤った陰性サンプル」の原因となり、一方、同じ
サンプルに相当する支持体（ミクロタイトレージョンに
関しては滴板（ｓｌａｂ）の穴）間の差が「誤った陽性
サンプル」を生じうる。

感度の値は、酵素でラベル付けされた（酵素ラベル化）
第２の抗体による抗スポロゾイト抗体−抗原複合体の生
成反応及び最後の呈色反応が不均一相で行われているこ
とから、該検査法において強く影響されることは明らか
である。

さらに、使用よりも長時間前に抗原により及びタンパク
質によって処理した滴板の如き支持体は、安定性及び保
存性に関する問題点かある。

英国特許出願第８７２９９７５号にはヒトにおけるマラ
リアの診断を行う変形ＥＬＩＳＡ法が開示されており、
該方法では、合成抗原−酵素結合体（該抗原は反応して
、特異的に抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体と結合
する）及び固状支持体に適当に結合させたタンパク質（
該タンパク質は抗体−抗原−酵素複合体の抗スポロゾイ
ト抗体を結合させる）を使用する。

該方法に従って操作することにより、所要時間を効果的
に短縮できるが、不均一相での操作に関連する問題点は
なお残っている。

従って、本発明は、ヒトにおけるマラリアの診断を、簡
単に、再現性良く、迅速に、感度良くかつ経済的に有利
に実施することを目的とする。

かかる目的は、本発明に従い、合成抗原（Ｐ）、合成抗
原−酵素結合体（Ｐ−Ｅ）、及び抗スポロゾイト抗体−
合成抗原複合体（該合成抗原は遊離の形（Ｐ）及びラベ
ル付きの形（Ｐ−Ｅ）である）を定量的に沈殿させる基
質を使用することにより、均一相において好適な条件下
で行われる免疫酵素法によって達成される。

従って、本発明の目的はヒト血液サンプル中の抗熱帯マ
ラリア原虫スポロゾイト抗体を均一相において測定する
免疫酵素法にある。

本発明の他の目的は、本発明による方法を実施するため
に必要な反応体を包含してなるヒト血液サンプル中の抗
熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体を検出する診断用キ
ットにある。

本発明のさらに他の目的については、明細書及び後述の
実施例から明らかになるであろう。

特に、本発明による免疫酵素法は、ａ）ヒト血液の同一
サンプルの一定量２個を、別個にｐｏｓ、ｓないし８．
００のリン酸塩緩衝液剤溶液中、濃度０．０５％（重量
／容量又は４遣／容量）（Ｗ／Ｖ又はＶ／　Ｖ）以上の
非イオン系及び／又は弱陰イオン系界面活性剤の存在下
、温度Ｉ５ないし３５℃で合成抗原−酵素結合体（Ｐ−
ＥＸここで、合成抗原は被検サンプル中に存在しうる抗
熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体と反応しうるしので
あり、酵素は呈色反応において触媒作用を発揮するもの
である）と反応させ（ただし、該サンプルの一定量２個
の一方に、予め、抗スポロゾイト抗体−合成抗原−酵素
複合体（Ａｂ−Ｐ−Ｅ）の生成を完全に阻害する濃度の
未酵素ラベル化合成抗原（Ｐ）を混合しておく）、ｂ）
上記工程ａ）で処理したサンプルに、抗スポロゾイト抗
体−合成抗原−酵素複合体を定量的に沈殿させうる不活
性物質を最終濃度１３ないし１７％（Ｗ／　Ｖ）で添加
し、Ｃ）上記工程ｂ）で得られた反応混合物から、濾過
又は遠沈により沈殿物を分離し、ｄ）該沈殿物を、前記
不活性物質を最終濃度１３ないし１７％Ｃ３／　Ｖ）で
添加した緩衝剤溶液で繰返し洗浄し、ｅ）得られた沈殿
物を、非イオン系及び／又は弱陰イオン系の界面活性剤
を最終濃度０．０５％（Ｖ／Ｖ又はＶ／　Ｖ）以上で含
有するｐＨ４，０ないし５．５の緩衝剤溶液中に、最終
濃度３ないし５％（Ｗ／　Ｖ）の不活性沈殿化物質の存
在下又は不存在下で溶解させ、「）得られた溶液に、過
酸化水素及び被検サンプルが陽性である際に着色生成物
を生成する無色の酵素基質を添加し、最後に、分光測光
によって色の強さを測定する各工程を包含する。

工程ａ） 本発明の方法によれば、工程ａ）における被検ヒト血液
サンプルは、全血、血清又は血漿である。

特に、全血を使用する場合には、遊離形又は結合形の抗
原との反応終了後、沈殿又は１濾過によって＠濁物質を
除去するか、又は該工程において緩衝剤溶液で希釈した
血液サンプルについて操作を行う。

本発明の目的に適する合成抗原は、抗熱帯マラリア原虫
スポロゾイト抗体を認識し、特異的に結合しうるポリペ
プチドである。

特に、該ポリペプチドは次のアミノ酸配列によって定義
される。

（Ａｓｎ−＾１ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）ｎ（式中、Ａｓｎ
−アスパラギン、＾ｌａ＝ｌミニアラニン及びＰｒｏ＝
プロリンであり、ｎは３ないし４０である）かかるポリ
ペプチド［熱帯マラリア原虫のサーカムスボロゾイトタ
ンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｉｃｐｒｏ
ｔｅｉｎ）（Ｃ３）のペプチドセグメントを正確に再生
するコは、ヨーロッパ特許公開第２０９６．１３号に開
示された種類の重縮合法によって調製される。

これらポリペプチドには２つの末端官能基（すなわち−
ＮＨ，及び−ＣＯＯＨ）のみ存在するため、本発明によ
る結合体の調製に特に有用であり、ポリペプチドと酵素
との間で、該酵素の触媒活性を損うことなく、安定した
共有結合を形成させうる。

該ポリペプチドと酵素との結合は、一般の方法に従って
行われる。

好ましくは、英国特許出願第８７２９９７５号に開示さ
れた如くして結合体を調製する。

呈色反応において触媒作用を発揮する酵素は、免疫酵素
検出法において一般的に使用される酵素の中から選ばれ
る。

かかる酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、酸ホスフ
ァターゼ、アルカリホスファターゼ、α−ガラクトシダ
ーゼ及びβ−ガラクトンダーゼがある。

特に、本発明をさらに説明するため（ただし、これに限
定されない）、合成抗原として（Ａｓｎ　−ＡｌａＡｓ
ｎ　　Ｐｒｏ）ｔｏ［（ＮＡＮＰ）ｔｏ］を使用し、酵
素としてペルオキシダーゼを使用した。

本発明の方法に従い、ｐＨ６，５ないし８．００のリン
酸塩緩衝剤溶液（ＰＢＳ）で適当に希釈した同一の血液
サンプルの一定量２個を、別個に、合成抗原−酵素結合
体ＣＰ−Ｅ）を濃度ｔ、ｏないし２．０μ９／ＩＩＱで
含有する同じリン酸塩緩衝剤溶液と混合する。

特に、緩衝剤溶液は、非イオン系及び／又は弱陰イオン
系の界面活性剤（Ｄ）、又はこれら界面活性剤の混合物
（相互比＝約１）を最終濃度０．０５％（重量／容量又
は容量／容量ＸＷ／Ｖ又はｖ７ｖ）以上で含有する。

非イオン系及び弱陰イオン系界面活性剤は、当分野で公
知であって、診断の分野で一般的に使用されているもの
の中から遭ばれる。

これら界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ　−２０、
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ及びサポニン（非イオン系界面活性剤
）、及びコール酸ナトリウム（Ｎａ−Ｃ）、デオキンコ
ール酸ナトリウム（Ｎａ　−Ｄｏｃ）及びナトリウムラ
ウロイル−サルコンネート（Ｎａ　−Ｌ　−５ａｒＸ弱
陰イオン系界面活性剤）がある。

好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ｏｏを濃度０．０５
％又は約０．０５％で使用し、又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１００とナトリウムラウロイル−サルコシネートとの混
合物（各成分間の比−１）を使用する。

本発明によれば、サンプルの一定量２個のうちの一方を
、Ｐ−Ｅ結合体に対して大モル過剰量の末ラベル化合成
抗原（Ｐ）と混合する。これにより、Ｐ−Ｅと競合する
遊離の抗原は、サンプル中に存在しうる抗スポロゾイト
抗体（Ａｂ）と−緒になってＡｂ−Ｐ複合体を形成し、
Ａｂ−１’−Ｅの生成を完全に阻害する。

本発明によれば、モル比Ｐ／ＰＥ＝　１００／　１では
上記複合体の生成を完全に阻害する。

ついで、このようにして得られた反応混合物を、濃度１
５ないし３５℃、好ましくは２０ないし３０℃において
１５ないし３０分間、好ましくは２０分間インキュベー
トする。

工程ｂ） 本発明による方法の工程ｂ）では、前記工程ａ）で生成
されたＡｂ−Ｐ及びＡｂ−Ｐ−Ｅ複合体を、反応混合物
に硫酸アンモニウム又は分子量（ＭＹ）４０００以上の
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選ばれる不活性
物質（反応性でなく、変性作用のないもの）を上記複合
体が定量的に沈殿するのを可能にする最終濃度で添加す
ることによって沈殿させる。

好ましくは、ＰＥＧ−６０００を最終濃度１３ないし１
７％ｆＪ／　Ｖ）で使用する。

この工程では、混合物を穏やかに撹拌しながら、温度１
５ないし３５℃、好ましくは２０ないし３０℃、時間４
０ないし６０分で操作を行う。

上述の好適な条件下で操作することにより、ＰＥＧ−６
０００”はサンプル中に存在する免疫グロブリン（Ａｂ
−Ｐ及びＡｂ−Ｐ−Ｅ？１合体を含む）のすべてを沈殿
させ、溶液中に未反応の抗原が残る。

工程Ｃ） この工程では、遠沈又は濾過によって反応混合物から沈
殿物を分離する。

好ましくは、沈殿物の分離を濾過によって行う。

この場合、少量（μＱのオーダー）で操作することによ
り、該方法の工程が簡単になる。

該目的に関し、たとえばＭｉｌｌｉｌｉｔｅｒ　Ｆｉｌ
ｔｒａ−ｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ　Ｃｏｒｐ、）の如き市販の濾過装置を使用できる。

このシステムは、孔サイズ０．２２μｍを有する濾過板
（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ　５ｌａｂ）を包含してなるもの
であり、使用後では、ＥＬＩＳＡテストで使用される吸
収剤板（ａｂｓｏｒｂｅｎｔ　５ｌａｂ）とは異なり、
洗浄され、連続分析に再使用される。

工程ｄ） この工程では、濾過板上にある沈殿物を、沈殿化物質を
最終濃度１３ないし１７％で含有するＰＢＳ／　Ｄ緩衝
剤溶液で繰返しく一般に３−４回）洗浄する。

工程ｅ） 本発明によれば、この工程では最終濃度３ないし５％（
Ｗ／Ｖ）の沈殿溶液の存在下又は不存在下、上記工程ａ
）に関して述べたものと同じ濃度で非イオン系又は弱陰
イオン系の界面活性剤を含有するｐＨ４ないし５．５の
０．１Ｍ酢酸塩又は酢酸塩−クエン酸塩を一度に又は少
量ずつに分けて添加することにより、沈殿物を溶解させ
る。

好ましくは、ＰＧＥ−６０００４％及びＴｒｉｔｏｎ　
Ｘ−１０００，０５％を含有するｐＨ５，０又は約５．
０の緩衝剤溶液を使用する。

分散剤としての界面活性剤の存在は、抗体−抗原−酵素
複合体の安定化及び回収において特に有利である。上述
の濃度で存在する沈殿化物質は、これに対して、酵素応
答の非固有（Ｂｓｐｅｃｉｆｉｃ）バックグラウンドを
低下させる機能を果たす。

実際、該物質は、上記ＰＲにおいて、ペルオキシダーゼ
活性を有する非免疫グロブリン性の沈殿物質の多くを不
溶性とする。

工程ｆ） 本発明の方法によれば、この工程は、前記工程ｅ）で得
られた混合物に、使用した酵素に対して特異な無色の基
質を添加することによって行なれる。

酵素がペルオキシダーゼ（Ｅ、Ｃ，１，１１，１，７，
）である場合、特異基質は好ましくはＡＢＴＳ［２，２
−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−スル
ホネート月又はＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメ
チル−ベンジジン）である。

呈色反応は、過酸化水素の存在下、温度１５ないし３５
℃、好ましくは２０ないし３０℃において好適な時間で
行われる。一般に、ｌｏないし３０分の時間で充分であ
る。

本発明の方法によれば、好ましくはＴＭＢ及びＨ−Ｏｔ
を最終濃度それぞれ０．Ｌｚｇ／麓Ｑ及び１　、　：ｌ
ｄで使用し、これら条件下での反応時間は１０分である
。終了後、強酸（たとえばｕｔｓｏ、）を濃度２ないし
３モルで添加して酵素反応を停止させる。。各一定量に
ついて、ブランク（すなわち、血液サンプルの不存在下
における本発明の各工程で調製された物質）に対する分
光測光による吸光度を測定することによって色の強度を
評価する。

各サンプルに関してＡｂ−、Ｐ−Ｅ複合体に対する固有
値、すなわち固有吸光度（Ａ）は、式　　　　　・＾（
サンプル十Ｐ−Ｅ）−Ａ［サンプル＋（Ｐ＋Ｐ−Ｅ）］
により、すなわち全吸光度（固有吸光度十非固有吸光度
）と非固有吸光度との間の差によって示される。

本発明によれば、サンプルを「陽性」又は「陰性」に分
類するために使用する判断基準は次のとおりである。

一固有＾〔［＾（ｓｐｅｃ、月と表示する〕か０．１０
０より大であり、全Ａ（固有吸光度及び非固有吸光度の
和）の少なくとも３０％である場合、該サンプルを「陽
性」とみなす。

−Ａ（ｓｐｅｃ、）が０．１００より小である（阻害値
（％）がいくらであっても）場合、該サンプルを「陰性
」とみなす。

本発明による方法の感度は、抗スポロゾイト抗体が濃度
０．２ｎｇ／ｕＱ（血清）又はほぼ０．２ｎｇ／　ｕ　
ＱＣ血清）において検出されうる程度である。

さらに、本・発明の方法に従って温度３０℃で操作する
ことによって得られる結果が温度２Ｇ−２５℃で観察さ
れるものと同じであることが確認された。

この事実は、該方法が、マラリアが広く流行している熱
帯地域で有利に利用されることを可能にする。

要約すれば、本発明による方法は、当分野における現状
と比べてかなり有利である、特にＥＬＩＳＡ法よりも優
れていることを示す。

中でも、該方法か安価であることに加えて、感度が高い
こと、結果の再現性が高いこと、操作が迅速であり、正
確であること等の利点が指摘される。

本発明による方法の感度は、抗スポロゾイト抗体と合成
抗原との間の複合体の生成反応及び呈色反応が均一相に
おいて所定条件下で起るとの事実によるものである。

さらに、本発明の方法は、各サンプルの固有値を純粋な
（末ラベル化）抗原で阻害することに基くものであるた
め、免疫学診断法による半定屯的応答（該方法の大きい
感度によって増幅される）を提供する。

本発明の方法が安価であることに関して、抗原及びテス
トの実施に必要な反応体（市販品）以外に、１’−Ｅ結
合体（抗体−抗ヒト結合体よりも安価であるとの利点を
有する）が必要である。

本発明による方法の利点は、実施が簡単である点にもあ
る。

さらに、該方法は、小サンプル数及び大サンプル数のい
ずれにも適し、融通性があるため、低容量診断要求の衛
生ユニットでの使用にも適している。ヒト血液サンプル
についての抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出
には、本発明の方法を実施するに必要なすべての反応体
を包含する分析パック、たとえば合成抗原、合成抗原−
酵素結合体、基質、緩衝剤溶液及び抗原−抗体複合体を
沈殿させる物質でなるキットが好適である。

この種又は同様の種類の分析パックでは、抗熱帯マラリ
ア原虫スポロゾイト抗体をできるだけ低コストで検出で
きる。

以下の実施例は説明のためのものであって、本発明を限
定するものではない。

実施例！ 健常者及びマラリアに罹った者から採取した未知の源の
血清１６検体（参照コード２４１−７１１及びＫＸを付
した）、２人の健常な提供者から採取した血清及びヘパ
リン処理血漿、２種類のモノクロナール（Ｍａｂ）抗（
ＮＡＮＰ：ｈ抗体を添加すること［ｌ及び２ｎｇ／μｇ
（全血清）］によって陽性とした健常者からの血清を使
用した。

ＥｐＩ）ｅｎｄｏｒ４試験管内において、各サンプルを
ｐＨ７５のＰＢＳ／　Ｄ緩衝剤溶液（ＰＢＳ＝　０．０
１Ｍリン酸ナトリウム、　０．３Ｍ　ＮａＣＱ：　Ｄ＝
０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００゜Ｖ／Ｖ及び０
．０５％すトリウムラウロイルサルコシン。

Ｗ／Ｖ）によりｌ：５０で希釈した。

実際には、血清、血漿及びＭａｂ／陰性血清５μＱをＰ
ＢＳ／Ｄ　２４５μｇで希釈した。

このように希釈した各サンプルの一定量（５０μＱ）４
個を、９６穴滴板の同一の縦方向列に属する近接する一
連の４つの穴に充填した。従って１つの滴数は２２サン
プルが充填されることになる。なお、１番目の列はブラ
ンク（最終酵素反応の基質のみ）として確保している。

各サンプルの３番目及び４番目の穴に、合成ペプチド（
ＩＩＡＮＰ）　、。（Ｐ）の蒸留水溶液（Ｉμｇ／μ１
２）２Ｉｔ　（ｌを添加した。

つづいて、サンプルを充填したすべての穴に、Ｐ−Ｅ結
合体のＰＢＳ／　Ｄ溶液（２μ９／Ｉｆ２）５０μＱを
添加した。

室温（２０−２５℃）に２０分間維持した後、１つの穴
にＰＥＧ−６０００（Ｆｌｕｋａ）の３０％（Ｗ／　Ｖ
）溶液０．１ｘＱを導入した。

この溶液は高粘度であるため、各々の穴に小さいスチー
ル製ボール（直径３．１＋ｕ）を入れ、滴数をわずかに
回転させることにより、サンプルと良好に混合される。

滴数を室温に６０分間維持し、各々の穴からサンプル０
．１１を採取し、濾過板（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５ＴＧ
Ｖ　０９６ＮＳ　０．２２μつの相当する穴に移した。

サンプルを吸引濾過し、各回ＰＥＧ−６０００の１５％
、　ＰＢＳ／Ｄ溶液０．２１ＪＱずつで４回洗浄した。

ついで、各々の穴に、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００（０
，０５％）及びＰＥＧ−６０００（４％）を含有するｐ
Ｈ５，０の０．１Ｍ酢酸塩緩衝剤溶液（ｒａ溶液Ｊ）０
．１５０ｚ（２を導入することによってフィルター上の
沈殿物を溶解させた。ゆるやかに振盪しながら、滴数を
室温に５分間維持した。

その後、溶液を吸引によって下方の受容板に集めた。

ついで、同一の「ａ溶ｉＪ０．１ｚｃを使用して吸引を
繰返して行った。

受容板を回収し、各々の穴に、３．３′，５，５′−テ
トラメチルーベンジジシ（ＴＭＢ）及びＨ２Ｏ，を各々
最終濃度０．１ｍ９／ｘＱ及び１．３ｍＭを含有する溶
液３０μＱを添加した。

１０分後、各々ノ穴１：　３　Ｍ　）Ｉ、５ｏ４２５μ
（ｔを添加することによって酵素反応を停止させた。つ
いで、滴数リーダーＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋ
ａｎ　Ｐｌｕｓにより、各々の穴の溶液の吸光度を４５
０ｎｍで測定した。

得られた結果を第１表に示す。

なお、表中（後述の表を含む）、（ａ）は固有吸光度十
非固有吸光度を示し、（ｂ）は非固有吸光度を示し、Ａ
（ｓｐｅｃ、）は固有吸光度を示し、阻害率（％）又は
特異率（％）は本発明の方法の特異性を示す。

実施例２ 下記の溶液を使用して、上記実施例１と同様にして操作
を行った。

−Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０００，０５％を含有するｐＨ
５，０のｏ、ｉＭ酢酸塩緩衝剤溶液（ｒｂ溶液」）でな
る沈殿物用溶媒 −２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾ
リン）−スルホネート（ＡＢＴＳ）及びＨｔＯｔを各々
最終濃度！、１ｕ／ｘＱ及び１．３ｎＭで含有する溶液
（３０μＱ／穴）。

酵素反応を停止することなく、１５分後及び３０分後に
、各々の穴について４０５ｒ＋＋ａにおける吸光度を測
定した。

第２表及び第３表に、それぞれ反応時間１５分及び３０
分で得られた結果を示す。

実施例３ 沈殿物用溶媒として「ａ溶液」及び酵素基質としてＡＢ
ＴＳを使用し、反応時間を３０分として、上記実施例１
と同様に操作することによって分析法を行った。

第４表に得られた結果を示す。

実施例４ へＢＴＳ基質、反応時間３０分及び各種界面活性剤（Ｄ
）を各種濃度で含有するＰＢＳ／　Ｄ緩衝剤溶液を使用
し、陽性の血清（ＫＸ）のサンプルについて、上記実施
例　　　　　１２に記載の如（して操作を行った。

結果を第５表に示す。なお、吸光度は、サンプル０．５
μＱを使用し、４０５ｎｍで測定したものである。

第　　５　　表 ＡＢＴＳを使用して３０分間処理した 後の４０５ｎｓｌこおける吸光度　　　　　　　　　　
　　１界面活性剤（Ｄ）　　　　Ｐ二Ｅ　　　Ｐ−Ｅ＋
Ｐ　　人（ｓｐｅｃ、）　　阻害率（２）′Ｔｗｅｅｎ
　２０（Ｑ、０５％）　　　　０．９８９　０．５９０
　　０．３９９　　　　４０Ｔｗｅｅｎ　　２Ｇ（０，
２％）　　　　　　　　　０．９１７　　　０．５０４
　　　　０．４１３　　　　　　　　４５Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００（０，０５％）　　０．７５８　　Ｇ、３
３５　　０．４２３　　　　５６ＴｒｉＬｏｎ　Ｘ−１
００（０，０１％）　　０．８３８　０．３４０　　０
．４９８　　　　５９Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（０，
２％）　　　０．７５９　０．４０６　　０．３５３　
　　　４６サボニン（０，０５％）　　　　０．７４１
　　Ｇ、３１０　　０．４３１　　　　５８Ｎａ−Ｌ　
Ｓａｒ　Ｃ，（０，０５％）　　　０．６３０　０．２
８４　　０．３４６　　　　５５Ｎａ−Ｃ（０，０８６
％）　　　　　　０．８７６　０．４３８　　０．４３
８　　　　５ＯＮａ−ＤＯＣ（０，０８６％）１．００
５　０．５７８　　０．４２９　　　　４３Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−２００（０，０５％）’　　０．６８６　０．
２０６　　０．４８０　　　　７ＯＮａ−Ｌ　Ｓａｒ　
Ｃ，（０，０５％）実施例５ 工程ｅ）において沈殿物を溶解させるために各種のｐＨ
値及びＰＥＧ−ａｏｏｏｉｉ度の緩衝剤溶液を使用し、
陽性の血清ＫＸについて上記実施例２と同様に操作して
テストを行った。

結果を第６表に示す。

第　　６　　表 ＡＢＴＳを使用して２０分間処理した 後の４０５１−における吸光度 ｐＨＰＥＧ−６０００（＄）　　Ｐ　二Ｅ　　　Ｐ−Ｅ
＋Ｐ　　Ａ（ｓｐｅｃ、）　　阻害率（％）４．５　　
　３　　　　０．５０６　０．１８１１　　０．３２６
　　　　６４４．５　　　４　　　　０．４１６　　Ｇ
、１５５　　０．２６１　　　　６３４．５　　　５　
　　　０．３２０　　Ｑ、１４０　　０．１８０　　　
　５６５．０　　　３　　　　０．４９２　０．１９２
　　０．３００　　　　６１５．０　　　４　　　　０
．３６２　０．１１６　　０．２４６　　　　６８５．
０　　　５　　　　０．２４６　０．０６３　　０．１
８３　　　　７４５．５　　　３　　　　０．３１８　
０．１０３　　０．２１５　　　　６７５．５　　　４
　　　　０．１９８　０．０４４　　０．１５４　　　
　７７５．５　　　５　　　　０．１３１　０．０２１
　　０．１１０　　　　８４比較例 ａ）ＥＬＩＳＡテスト このテストでは、実施例１に示したものと同じサンプル
各０．５μＱ及び下記の如く処理した滴板２個を使用し
た。

一合成抗原（ＮＡＮＰ）０．１μ９／穴を充填し、つい
でＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（３％）−ＰＢＳを充
填した滴数 −ＢＳＡのみ充填した滴数 これら両滴数の各々の穴に、抗ヒト抗体−アルカリホス
ファターゼ結合体（Ａｂ”　−ＰＡＸサンプル中に存在
しうる抗スポロゾイト抗体（Ａｂ）によりＰ−Ａｂ−Ａ
ｂ”　−Ｐ＾複合体を生成する）を添加した。

常法に従って操作し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
（ｐ−ＮＰＰ）基質を使用することによって検出を行っ
た。

３０分後、３Ｍ　ＮａＯＨ２５μａを添加することによ
って酵素反応を停止させた。

吸光度を４０５ｎｍで測定した。

固有値ｒＡ（ｓｐｅｃ、）Ｊは次式によって与えられる
。

固有値［Ａ（ｓｐｅｃ、　）］ ＝吸光度（（ＨＡＮＰ）４゜を添加した滴数）−吸光度
（ＢＳＡを添加した滴数） 結果を第７表に示す。

ｂ）Ｐ−Ｅ／セファロース−＾−プロティン英国特許出
願第８７２９９７５号に開示された方法は、合成抗原−
酵素結合体（Ｐ−Ｅ）（血液サンプル中に存在する抗ス
ポロゾイト抗体により、Ａプロティンに結合する安定な
抗体−合成抗原−酵素複合体（＾ｂ−Ｐ−Ｅ）を生成す
る）を使用して行うことを特徴とする。

実際には、ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１０００，０
５％緩衝剤溶液を使用し、上記実施例１に記載の如くし
て被検サンプルを調製した。反応２０分後、サンプルを
同じ緩衝剤溶液で平衡化したセファロース−Ａプロティ
ン樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　−Ｕｐｐｓａｌａ）を収
容する（市販の凍結乾燥生成物２１１９／穴）を収容し
た濾過板（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の穴に移した。

板を室温で３０分間インキュベートし、ついで、同じ平
衡化緩衝剤溶液で４回洗浄した。

各々の穴に、ＡＢＴＳ基質及びＨ２Ｏ，を各々最終濃度
１．１Ｊ１９／１１７２及び１．：（ａＭテ含有すルｐ
Ｈ５，０（７）０．１Ｍ酢酸３０分後、各々の穴に関し
て反応混合物の色を観察することによってサンプルの「
陽性」又は「陰性」を判定した。

陽性の血清（マラリアに罹患した血清）及びＭａｂ含有
血清は、反応混合物血清十Ｐ−Ｈに係る穴において緑−
青色を呈し、血清十Ｐ−Ｅ＋　Ｐ混合物を収容する穴に
おいては無色又はわずかに着色していた。陰性の血清は
、同様に、前記２つの反応に係る穴において無色又はわ
ずかに着色しているのみであった。

、第８表に、血清１６検体を、本発明によるＰ−Ｅ／Ｐ
ＥＧ法（１）、ＥＬＩＳＡ法（２）、及びＰ、Ｅ／５−
ＰＡ法（３）によって処理して得られた値を、固有Ａ［
Ａ（ｓｐｅｃ、）］の値、陽性（＋）及び陰性（＝）の
判定結果と共に表示する。

第８表に報告したテスト結果の比較から、下記の事実が
観察される。

ｌ　テストした未知の血清１６検体のうちの１検体、す
なわち血清Ｎｏ、６３２についてのみ、ＥＬＩＳＡテス
トでは陰性と判定し、他の２種類の方法では陽性とする
矛盾がある。

２　陽性の血清の場合、Ｐ−Ｅ／ＰＥＧ法は、ＡＢＴＳ
及びＴＭＢ基質のいずれによってもＥＬＩＳＡ法よりも
高いＡ（ｓｐｅｃ、）の値を示し、従って、血清Ｎｏ、
６３２の陽性を検知しうる。

３、血清Ｎｏ、５７０．６２０及びＫＸに関してＥＬＩ
ＳＡ法ではＡ（ｓｐｅｃ、）の値が低いため、カット−
オフ値として０．１５０を採用しなければならず、これ
により、これら３種類の血清を［不明（ボーダーライン
）」と判定しているが、他の２種類の方法では、これら
を（ほか１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　血液サンプル中の抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト
   抗体を均一相で免疫−酵素的に測定する方法において、 ａ）ヒト血液の同一サンプルの一定量２個を、別個にｐ
   Ｈ６．５ないし８．００のリン酸塩緩衝液剤溶液中、濃
   度０．０５％（重量／容量又は容量／容量）（Ｗ／Ｖ又
   はＶ／Ｖ）以上の非イオン系及び／又は弱陰イオン系界
   面活性剤の存在下、温度１５ないし３５℃で合成抗原−
   酵素結合体（Ｐ−Ｅ）（ここで、合成抗原は被検サンプ
   ル中に存在しうる抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体
   と反応しうるものであり、酵素は呈色反応において触媒
   作用を発揮するものである）と反応させ（ただし、該サ
   ンプルの一定量２個の一方に、予め、抗スポロゾイト抗
   体−合成抗原−酵素複合体（Ａｂ−Ｐ−Ｅ）の生成を完
   全に阻害する濃度の未酵素ラベル化合成抗原（Ｐ）と混
   合しておく）、 ｂ）上記工程ａ）で処理したサンプルに、抗スポロゾイ
   ト抗体−合成抗原−酵素複合体を定量的に沈殿させうる
   不活性物質を最終濃度１３ないし１７％（Ｗ／Ｖ）で添
   加し、 ｃ）上記工程ｂ）で得られた反応混合物から、ろ過又は
   遠沈により沈殿物を分離し、 ｄ）該沈殿物を、前記不活性物質を最終濃度１３ないし
   １７％（Ｗ／Ｖ）で添加した緩衝剤溶液で繰返し洗浄し
   、 ｅ）得られた沈殿物を、非イオン系及び／又は弱陰イオ
   ン系の界面活性剤を最終濃度０．０５％（Ｗ／Ｖ又はＶ
   ／Ｖ）以上で含有するｐＨ４．０ないし５．５の緩衝剤
   溶液中に、最終濃度３ないし５％（Ｗ／Ｖ）の不活性沈
   殿化物質の存在下又は不存在下で溶解させ、 ｆ）得られた溶液に、過酸化水素及び被検サンプルが陽
   性である際に着色生成物を生成する無色の酵素基質を添
   加し、最後に、分光測光によって色の強さを測定する、 ことを特徴とする、抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗
   体の検出法。 ２　請求項１記載の方法において、前記工程ａ）におけ
   るヒト血液の被検サンプルが、全血、血清又は血漿であ
   る、抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 ３　請求項１記載の方法において、前記合成抗原が、ア
   ミノ酸配列 （Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）ｎ （ここで、Ａｓｎ＝アスパラギン、Ａｌａ＝アラニン及
   びＰｒｏ＝プロリンであり、ｎは３ないし４０である）
   で定義されるものである、抗熱帯マラリア原虫スポロゾ
   イト抗体の検出法。 ４　請求項１記載の方法において、前記工程ａ）におけ
   る酵素がペルオキシダーゼ、酸ホスファターゼ、アルカ
   リホスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ又はβ−ガラ
   クトシダーゼである、抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト
   抗体の検出法。 ５　請求項１記載の方法において、前記工程ａ）におけ
   る非イオン系界面活性剤がＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔ
   ｏｎＸ−１００、又はサポニンであり、弱陰イオン系界
   面活性剤がコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナト
   リウム又はナトリウムラウロイル−サルコシネートであ
   る、抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 ６　請求項１記載の方法において、前記工程ｂ）におけ
   る不活性物質が硫酸アンモニウム又は分子量４０００以
   上のポリエチレングリコールである、抗熱帯マラリア原
   虫スポロゾイト抗体の検出法。 ７　請求項６記載の方法において、ポリエチレングリコ
   ールが分子量６０００のものである、抗熱帯マラリア原
   虫スポロゾイト抗体の検出法。 ８　請求項１記載の方法において、前記工程ｂ）におけ
   る操作を、温度１５ないし３５℃、対応する操作時間３
   ０分ないし１．５時間で行う、抗熱帯マラリア原虫スポ
   ロゾイト抗体の検出法。 ９　請求項８記載の方法において、温度が２０ないし３
   ０℃の範囲内であり、反応時間が６０分又は約６０分で
   ある、抗熱帯マラリア原虫スポロゾイト抗体の検出法。 １０　請求項１記載の方法において、前記工程ｅ）にお
   ける緩衝剤溶液がｐＨ５．０であり、前記不活性物質が
   濃度４％（Ｗ／Ｖ）で存在する、抗熱帯マラリア原虫ス
   ポロゾイト抗体の検出法。 １１　請求項１記載の方法において、前記酵素がペルオ
   キシダーゼであり、前記工程ｆ）における基質が２，２
   −アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリンスルホ
   ネート）（ＡＢＴＳ）又は３，３′，５，５′−テトラ
   メチル−ベンジジン（ＴＭＢ）である、抗熱帯マラリア
   原虫スポロゾイト抗体の検出法。 １２　請求項１記載の方法を実施するに必要な反応体を
   含有してなる、ヒト血液サンプル中の抗熱帯マラリア原
   虫スポロゾイト抗体を検出するための診断用キット。