NL8703102A

NL8703102A - Werkwijze voor het aantonen van anti-p. falciparum sporozoiet antilichamen in menselijk bloed.

Info

Publication number: NL8703102A
Application number: NL8703102A
Authority: NL
Original assignee: Eniricerche Spa
Priority date: 1986-12-23
Filing date: 1987-12-22
Publication date: 1988-07-18
Also published as: US4977079A; AT397581B; ES2005766A6; GR871991B; SE8705074D0; FR2608767B1; CH677032A5; FR2608767A1; CA1299101C; DE3743903A1; ATA338987A; SE468450B; ZA879621B; GB2199140B; IT8622817A0; OA08792A; DE3743903C2; IT1198233B; SE8705074L; BE1000850A3

Description

-1- s

87.3093/vdV/vL

Korte aanduiding: Werkwijze voor het aantonen van anti-P.

falciparum sporozoiet antilichamen in menselijk bloed

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuwe immuno-enzymatische werkwijze voor de diagnose van malaria in menselijk bloed.

Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding be-5 trekking op een werkwijze voor het aantonen en bepalen van anti-p. falciparum sporozoiet antilichamen in menselijk bloed, serum en/of plasma.

Malaria vormt êên van de ernstigste parasitaire ziekten en treft elk jaar honderden miljoenen personen, vooral, in de 10 tropische gebieden van Azië, Afrika en Amerika en veroorzaakt een hoge kindersterfte.

Het etiologisch agens van malaria is een protozo die behoort tot de soort Blasmodium, welke overgebracht wordt op de mens door de beet van Anopheles mosquito.

15 Van de honderden soorten Plasmodium die in de natuur voor komen, zijn er slechts vier pathogeen voor de mens: Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax en Plasmodium falciparum.

Vooral deze laatstgenoemde vormt de meest diffuse soort 20 en veroorzaakt de meeste ziekte en sterfte tengevolge van malaria.

Het aantonen van antisporozoiet antilichamen in bloed van personen die verdacht worden aan malaria te lijden vormt een wezenlijke klinische grootheid voor de diagnose van malaria en 25 het vaststellen van de werkzaamheid van een antimalaria vaccin.

In het algemeen wordt de diagnose van malaria-infecties uitgevoerd door bloed onder het microscoop te onderzoeken, of met behulp van immunologische werkwijzen die berusten op fluorescentiebepalingen (IFA) radio-activiteitsbepalingen (IRMA) 30 en enzymatische werkingsbepalingen (EIA).

De microscopische analyse van bloed is echter moeilijk en ongeschikt voor een epidemiologisch onderzoek, waarbij honderden .8703102 ί -2- van duizenden monsters onderzocht moeten worden.

Ook de immunologische methoden IRMA en IFA geven geen geschikte resultaten, terwijl zij naast de noodzaak van lange bewerkingstijden, gecompliceerd worden door de vele noodzake-5 lijke stappen en door het gebruik van voor de mens instabiele en schadelijke stoffen.

Van de ΕΊΑ immuno-enzymatische methoden, is de meest gebruikte de ELISA (enzym-gebonden-immuno-absorberende-proef) proef, die bestaat uit: 10 a) fixeren, door absorptie, of door een covalente chemische binding, van een natuurlijk of synthetisch antigeen aan een vaste drager; b) blokkeren van de resterende plaatsen op de drager door een geschikt eiwit; .

15 c) incuberen van het aan de drager gebonden antigeen met het onderzochte serum, en d) achtereenvolgens toevoegen van anti-menselijk immuno-globuline antilichaam gebonden aan een aantonend enzym, en een kleurloos substraat voor het enzym dat, in geval 20 van een positieve reactie van het serum, een gekleurd produkt geeft.

Deze proef, hoewel men hierbij bepaalde nadelen van de IRMA en IFA methoden kan ondervangen, door gebruik te maken van stabiele en niet radio-actieve stoffen, vereist echter langere 25 bewerkingstijden (ongeveer 6 uren) en het gebruik van reactie-middelen, zoals anti-immunoglobuline antilichamen-enzym, die slechts verkregen kunnen worden met behulp van complexe en dure methoden.

Er is derhalve op dit gebied een sneller, goedkope en ge-30 voelige diagnostische methode gewenst, die geschikt is voor een op grote schaal toepassen in gebieden waar malaria endemisch is, of in gebieden waar een nauwkeurige controle uitgevoerd moet worden om infectiebronnen te voorkomen en te lokaliseren.

Aan deze eis wordt volgens de uitvinding voldaan, door 35 middel van een nieuwe immuno-enzymatische methode die werkt met een synthetisch antigeen-enzym conjugaat dat met de anti- . 87 0 3 1 02.

-3- 'ν’ sporozoiet antilichamen een stabiel antilichaam-antigeen-enzym-complex kan vormen, en met de eiwitten die zich sterk binden aan het antisporozoiet antilichaam van dit complex.

Een doel van de onderhavige uitvinding is derhalve een 5 immuno-enzymati sche werkwijze voor het aantonen en bepalen van anti-P. falciparum sporozoiet antilichamen in monsters van menselijk bloed en/of van zijn produkten,’ omvattende: incuberen van deze monsters in·aanwezigheid van een synthetisch antigeen-enzym conjugaat dat met antisporozoiet anti-10 lichamen een stabiel an'tilichaam-synthetisch antigeen-enzym-complex kan vormen; binden van het antisporozoiet antilichaam van dit complex met de eiwitten die geadsorbeerd zijn op, of covalent gebonden aan, een vaste drager, en, tenslotte, bepalen van de enzymatische werking van het aan de eiwitten gebonden 15 complex door toevoegen van een kleurloos enzymatisch substraat dat in geval van een positieve reactie, een gekleurd produkt geeft.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is het gebruik van dit synthetisch antigeen-aantonend enzym conjugaat 20 voor het samenstellen van een samenstel voor de diagnose van malaria.

Andere doeleinden van de onderhavige uitvinding zullen duidelijk worden uit de beschrijving en uit de voorbeelden.

Het voor de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding 25 geschikte synthetische antigeen-enzym conjugaat wordt gevormd door een een reeks vormend polypeptide, dat de antisporozoiet antilichamen kan herkennen en binden, en door een enzym.

In het bijzonder is volgens de onderhavige uitvinding het een reeks vormend polypeptide het (Asn-Ala-Asn-Pro) , waarin n 30 een waarde bezit tussen 3 en 40, bij voorkeur van 10 tot 20, en het polypeptidesegment van het natuurlijk circumsporozoiet-eiwit van het membraan van het sporozoiet van P. falciparum nauwkeurig reproduceert.

De aanwezigheid in dit polypeptide van slechts twee eind-35 standige functionele chemische groepen, NH^ en COOH, maakt dit bijzonder geschikt voor de bereiding van het conjugaat volgens de onderhavige uitvinding, daar men hierdoor een stabiele co- -»703102 ί ( -4- valente binding kan vormen tussen het polypeptide en het enzym, zonder nadelige beïnvloeding van de katalytische werking van dit enzym.

Dit polypeptide wordt in zuivere vorm en in hoge opbrengst 5 bereid volgens de werkwijze beschreven in Europese octrooiaanvrage gepubliceerd onder nr. 209 643 door polymerisatie van HC1.H-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP polypeptide, in een inert polaire oplosmiddel, in tegenwoordigheid van een organische tertiaire base.

10 Voor de bereiding van het conjugaat volgens de onderhavige uitvinding geschikte enzymen worden gekozen uit die welke kunnen inwerken op een chromogeen substraat. Voorbeelden van dergelijke enzymen zijn peroxydase, et-galactosidase en alkalifos-fatase. Bij voorkeur wordt peroxydase gebruikt.

15 Volgens de onderhavige uitvinding wordt het synthetisch antigeen-enzym conjugaat bereid door middel van een werkwijze omvattende: 1) het oxyderen van het gezuiverde enzym in een 0,1 M NaHCO^ oplossing, zoals, bijvoorbeeld natriummeta- 20 periodaat, bij kamertemperatuur (20-25°C) in het don ker, gedurende ongeveer'2 uren; 2) toevoegen aan deze oplossing van het polypeptide opge- , lost in NaHCO^ (pH 9,2) in een polypeptide/enzym mo- laire verhouding van ongeveer 40/1, en houden van de 25 bij kamertemperatuur weggezette verkregen oplossing, in het donker, gedurende ongeveer 16 uren; 3) toevoegen aan de verkregen oplossing van een reduceer-middel zoals bijvoorbeeld NaBH^, en, tenslotte 4) afscheiden van het polypeptide-enzym conjugaat.

30 In het bijzonder wordt volgens een praktische uitvoerings vorm van de onderhavige uitvinding een conjugaat bereid waarin het polypeptide (Asn-Ala-Asn-Pro)^ en het enzym peroxydase is. De conjugatiegraad, d.w.z., de raolaire verhouding van polypeptide ten opzichte van enzym in dit conjugaat bedraagt 35 0,9-0,92, dicht bij de verwachte waarde (1) voor het zuivere conjugaat.

.8705102 r Η -5-

De specifieke werking van peroxydase,· bepaald door spec-trofotometrie bij 405 nm zoals beschreven voor H. Galloti (1979), J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Γ7, 1-7, bedraagt 75% van die van het geconjugeerde, enzym, 5 Volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding wordt dit conjugaat ongeveer 20-30 minuten geïncubeerd, in een buffer-oplossing, met een monster van volledig menselijk bloed, menselijk serum of menselijk plasma.

Het reactiemengsel wordt daarna 20-30 minuten geïncubeerd 10 op een vaste drager waarop het A eiwit geadsorbeerd en/of covalent gebonden wordt.

Dit eiwit staat bekend om zich sterk te binden aan menselijke immunoglobulinen, behoudens IgM en IgG^, en vormt derhalve met het aan het antigeen-enzym conjugaat gebonden antispo— 15 rózoiet antilichaam een stabiel complex.

Geschikte vaste dragers voor de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding zijn polysaccharidematerialen zoals cellulose en agarose, en kunststoffen. ·

Aan het einde van de reactie, en na geschikte wasbewerkin-20 gen, wordt.aan de mengsels een oplossing toegevoegd, die het chromogeen enzymatisch substraat en bevat, en ha 2-3 minu ten wordt de kleurontwikkeling waargenomen.

Als geheel bloed geanalyseerd wordt, wordt het aanvangs-monster, alvorens dit toe te voegen aan het A eiwit gecentri-25 fugeerd of gefiltreerd om de gesuspendeerde stof te verwijderen-

De drempelwaarde, d.w.z. de minimale hoeveelheid positief serum dat een kleurontwikkeling geeft die zichtbaar is met. het blote oog bedroeg respectievelijk 0,1 ^ul en 0,4 ^ul, voor twee onderzochte sera.

30 Er wordt bovendien geen kleurontwikkeling waargenomen in de blanco, die bestaat Uit het het conjugaat-bevattende mengsel, zonder het monster van bloed en/of van zijn produkten, met serum en plasma van gezonde personen, met al dan niet ge-hemolyseerd, volledig bloed van niet aan malaria lijdende per-35 sonen en met Jf-globulinen (Globuman - Bern) .

Dit geeft een volledige afwezigheid aan van storingen bij ,8705102 -6- . « i _ de werkwijze volgens de uitvinding.

De mogelijkheid om snel te kunnen werken, ongeveer 60 minuten, in vergelijking tot de 6 uren die nodig zijn voor de ELISA proef, en het gebruik van een klein aantal reactiemid-5 delen, d.w.z. alleen het antigeen-enzym en de eiwitten, vormt een bijzonder voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding.

Een bijzonder voordeel van deze werkwijze bestaat bovendien in de mogelijkheid van het aantonen en bepalen van anti-sporozoiet antilichamen in volledig bloed. Dit is een gevolg 10 van de grote stabiliteit van het conjugaat volgens de uitvinding in.vergelijking met de in bloed aanwezige proteasen,

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is bovendien absoluut specifiek daar alle monsters die positief bleken bij IRMA, IFA en ELISA proeven, bij analyse volgens de onder-15 havige werkwijze, ook een positieve uitslag te zien gaven.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is bijzonder geschikt voor een epidemiologisch onderzoek van malaria en, in het bijzonder, voor het op grote schaal onderzoeken van malaria-infecties in gebieden waar sanitaire voorzieningen ont-20 breken.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe zonder haar echter te beperken.

Voorbeeld 1

Bereidin2_van_j[Asn-Ala-Asn-Proj ^-peroxydas^conjugaat 25 Peroxydase-enzym (Sigma) werd gezuiverd en gedroogd uit de bevroren toestand alvorens het te conjugeren met het peptide.

10 mg zuiver enzym (E) werd daarna opgelost in 1 ml 0,1 M NaHC03 en geoxydeerd met 1 ml 16 mM NalO^ (natriummetaperiodaat), bij kamertemperatuur (20-25°C), in het donker, gedurende 2 uren. 30 Aan het einde van deze periode werd aan het reactiemeng- sel 1 ml NaHCC>3 (pH 9,2) toegevoegd dat 70 mg (Asn-Ala-Asn-Pro)^ peptide (P) bevatte in een molaire verhouding van peptide/en-zym van 40/1.

Het aldus verkregen mengsel werd kwantitatief overgebracht 35 in een Pasteur pipet, die aan zijn einde afgesloten was met (R) glaswol, en hieraan werd 500 mg Sephadex G-25 (Pharmacia . 8 7 0 3 1 0 2

IS

-7-.

Uppsala) poeder toegevoegd; de pipet liet men verv dLgens nog 16 uren, in het donker, bij kamertemperatuur staan.

Aan het uit de pipet afkomstige reactiemengsel werd 150 yUl 0,1 mM NaOH toegevoegd, die 5 mg/ml NaBH^ bevatte en, 5 30 minuten later, werd hieraan 450 ^ul van dezelfde oplossing toegevoegd.

Na ongeveer 1 uur werd het mengsel dat het enzym-peptide conjugaat (E-P) en het niet omgezette peptide (P) en enzym (E) bevatte, in evenwicht gebracht met 5 mM natriumacetaatbuffer, . 10 pH 4,4, in een Sephadex G-10 kolom, die vooraf in evenwicht gebracht is met dezelfde buffer. Het mengsel werd vervolgens gebracht op een kolom (0,9 x 10 cm) van carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose) in evenwicht gebracht met 5 mM natriumacetaat-buffer, pH 4,4, en geëlueerd met 65 mM natriumacetaatbuffer, 15 pH 4,4, en ontzout op een met gedestilleerd water in evenwicht gebrachte Sephadex G10 kolom. Het eluaat dat de E-P verbinding, en het niet omgezette enzym bevatte werd gedroogd uit de bevroren toestand.

Het niet omgezette peptide werd vooraf geëlueerd met de 20 belastingsbuffer en zijn aanwezigheid werd bepaald door infra-roodspectroscopie.

De verkregen resultaten gaven eenzelfde spectrum te zien voor het geëlueerde peptide en voor het als uitgangsmateriaal gebruikte peptide. Hierdoor kon men vaststellen dat tijdens 25 de conjugeringsreactie in het peptide geen wijzigingen waren opgetreden en dat het aan het enzym gebonden peptide derhalve niet beschadigd was.

De mate van E-P conjugering d.w.z., de molaire verhouding van het peptide ten opzichte van het enzym in het conjugaat 30 werd bepaald door berekening van de toename aan Asn, Ala en Pro aminozuurresten in het mengsel dat E-P + vrij E bevat met betrekking tot het oorspronkelijke enzym E.

De analyse van de aminozuren werd uitgevoerd, na 24 uren zure hydrolyse van E-P + E en E met 6N HC1 bij 100°C, in afge-35 sloten ampullen met behulp van een Beekman automatische amino-zuuranalysator.

.8703102 k f t -8-

Daar de aminozuursamenstelling van de twee peroxydase iso-enzymen (B en C) die aanwezig zijn in het oorspronkelijke E, bekend is (Shannan L.M. et al., 1966, J. Biol. Chem. 241, 2, 166) was het mogelijk om voor een E:P molverhouding van 1, 5 overeenkomende met zuiver E-P conjugaat, een theoretische toename aan Asp, Ala en Pro te berekenen van 63%, 68% respectievelijk 100%.

Voor de bovengenoemde aminozuren werden toenamen van 58%, 62% en 90% gevonden,· die overeenkomen met een E:P molverhou-10 ding van 0,90-0,92 die vrijwel gelijk is aan de berekende verhouding voor het zuivere conjugaat.

De resterende .specifieke werking van aan het peptide gebonden peroxydase enzym, bepaald door speetrofotometrie bij 405 nm met 1,7 nM ABTS (2,2'-azino-di(3-ethylbenzothiazolyl-15 sulfonzuur) en 0,83 mM ^ ^ fosfaatbuffer, pH 6,0 (H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1_7, 1-7, 1979) bedroeg vrijwel 75% van die van het oorspronkelijke enzym. Voorbeeld 2

Voor deze proef werden 8 sera van aan malaria lijdende 20 personen, het gehepariniseerde plasma van vier gezonde donors, het serum van 3 gezonde personen en een monster van volledig bloed van een aan malaria lijdende persoon gebruikt, door, in een 1:1 volumeverhouding, het malaria bevattende serum te mengen met het gehemolyseerde en niet-gehemolyseerde volledig 25 bloed van een gezonde pèrsoon.

Aan 100 ^,ul 10 mM fosf aatbuffer, pH 7,5, die 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20 (PBS-T) en 200 ng E-P conjugaat bevat werd: 1 tot 5 ^ul bloed, of plasma, of serum van gezonde personen; of 10 ^ul PBS-T die respectievelijk 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 30 1,6; 3,2 ^.ul serum van aan malaria lijdende personen bevatte, toegevoegd.

De oplossing liet men 15-20 minuten bij kamertemperatuur staan.

In geval van volledig bloed, werd de oplossing gecentrifu-35 geerd, of gefiltreerd, om de gesuspendeerde stof te verwijderen .

. 87 0 3 1 0 2 -9-

.. V

Daarna wérden deze oplossingen overgebracht in kleurloze en doorzichtige micropipet einden van kunststofmateriaal die aan hun einde,· glaswol bevatten en, daarop, een bed bestaande uit een hoeveelheid van ongeveer 6 ^ul A eiwit-Sepharose CL4B 5 (Pharmacia üppsala) voorafgewassen met PBS-T.

De oplossingen liet men door zwaartekracht 20-30 minuten percoleren, waarna de microkolommen 3 maal gewassen werden met steeds 200 ^ul PBS-T en twee maal met steeds 200 ^ul PBS (buffer zonder Tween-20).

10 Daarna werd aan elke microkolom 200 ^ul toegevoegd van een substraatoplossing van 4-chloor-l-naftol (Biorad) en 1 bereid door mengen, op het tijdstip van gebruik, van 1 volume-deel 4-chloor-l-naftol (Biorad) (3 mg/ml in koude methanol) en 5 volumedelen van een oplossing van 6 ^ul 30%'s (v/v) toe- 15 gevoegd aan 10 ml PBS. Na 2-3 minuten werd de ontwikkeling waargenomen van een donkerblauwe kleur bij de positieve monsters.

De drempelwaarde, d.w.z. de minimale hoeveelheid positief serum die een gemakkelijk zichtbare blauwe band te zien geeft, bleek 0,1 ul - 0,4 ^ul voor de twee onderzochte positieve se-20 ra te bedragen.

De specificiteit van de proef werd vastgesteld bij een positief serum van een aan malaria lijdende persoon (ontwikkeling van een blauwe band met E-P), onder gebruik in een proef van 200 ng vrij enzym zonder E-P; in een andere proef werd een 25 grote overmaat (3 ^,ug) (ongeveer 100 maal) vrij P gebruikt in concurrentie met het aanwezige E-P conjugaat (200 ng).

Aan het einde van de reactie werd geen kleurontwikkeling waargenomen.

Voorts werd geen kleurontwikkeling waargenomen in de mi-30 crokolom voor de blanco, gevormd door het reactiemengsel E-P zonder toevoegen van bloed, serum of plasma; voor het serum of plasma van gezonde personen; voor het gehele bloed van niet aan malaria lijdende personen; of voor menselijke tf-globulinen (Globuman - Bern) die onderzocht werden in een hoeveelheid 35 overeenkomende met ongeveer 6 ^ül serum.

Dit toont de volledige afwezigheid van storingen bij de .8703102 > i -10- proef waarbij gebruik gemaakt wordt van E-P conjugaat.

De stabiliteit van het aan het peptide (E-P) gebonden peroxydase-enzym werd spectofotometrisch bepaald, door onttrekken van monsters, op tijdstippen van 0 tot 2 uren, uit een op-5 lossing van PBS-T (100 ^ul) die 200 ng E-P bevat, waaraan monsters serum of plasma toegevoegd waren.

Na 2 uren gaven de verkregen resultaten een ongewijzigde peroxydasewerking te zien.

.8703102

Claims

1. Werkwijze voor het aantonen en bepalen van anti-P. falciparum sporozoiet antilichamen in monsters van menselijk bloed en/of de verbindingen daarvan, met het kenmerk dat: 5 a) deze monsters geïncubeerd worden met een synthetisch antigeenenzymconjugaat dat met in het monster aanwezige antisporoziet antilichamen een stabiel antilichaam-synthetisch antigeen-enzymcomplex kan vormen, zonder inactivering van de enzymatische werking; 10 b) het anti lichaam van dit complex gebondenWOr^aan de ei witten die geadsorbeerd zijn door, en/of chemisch gebonden aan een vaste drager, en, tenslotte, c) de enzymatische werking van het aan de eiwitten gebonden complex bepaald wordt door toevoegen van een kleur-15 loos enzymatisch substraat dat, in geval van een posi tief resultaat, een gekleurd produkt kan vormen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het synthetisch antigeen het een reeks vormend polypeptide: 20 (Asn-AIa-Asn-Pro) is waarin n een waarde bezit van 3 tot 40 en het eiwit A eiwit is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het k e n - merk dat n ligt tussen 10 en 20.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het ken merk dat het enzym gekozen is uit de groep bestaande uit de enzymen die met een specifiek substraat een colorimetrische reactie geven.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het ken- 30. e r k dat het enzym peroxydase en/of alkalifosfatase is,

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk dat het conjugaat bereid wordt door, in homogene fase ,8703102 'I -12- ί in NaHC03, bij kamertemperatuur (20-25°C) ,- in het donker, het geoxydeerde enzym te laten reageren met een molaire overmaat (Asn-Ala-Asn-Pro) polypeptide, waarin n de bovengenoemde betekenis bezit.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, m et het ken merk dat de molaire verhouding van het polypeptide ten opzichte van het enzym in het conjugaat gelijk is aan, of vrijwel gelijk is aan, 0,92.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- 10 me r k dat in de stap (a) de reactie uitgevoerd wordt bij kamertemperatuur (20-25°C) gedurende een reactietijd van 15 tot 20 minuten.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk dat de vaste drager een polysaccharide of kunststof- 15 materiaal is.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk dat polysaccharidedragers cellulose, agarose en dergelijke zijn.

11. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk 20 dat in de stap (b) de reactie uitgevoerd wordt bij kamertemperatuur (20-25°C), gedurende een reactietijd van 20 tot 30 minuten.

12. Diagnostisch samenstel voor het aantonen en bepalen van anti-P. falciparum sporozoiet antilichamen met het 25 kenmerk dat het in conclusie 1 omschreven synthetisch antigeen-enzymconjugaat, en eiwitten, gebruikt worden. .8703102