DE3743903A1

DE3743903A1 - Verfahren zur bestimmung von anti-p.falciparum-sporozoit-antikoerpern im menschlichen blut

Info

Publication number: DE3743903A1
Application number: DE19873743903
Authority: DE
Inventors: Carlo Antonio Nuzzolo; Adriano Bernardi; Antonello Pessi; Antonio Silvio Verdini
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1986-12-23
Filing date: 1987-12-23
Publication date: 1988-07-07
Also published as: BE1000850A3; GB8729975D0; ES2005766A6; AR241963A1; SE8705074D0; ZA879621B; CH677032A5; FR2608767B1; GB2199140A; AT397581B; OA08792A; GB2199140B; NL8703102A; ATA338987A; DE3743903C2; GR871991B; IT8622817A0; SE468450B; IT1198233B; CA1299101C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue immuno enzymatische Methode zur Diagnose von Malaria im mensch lichen Blut.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Methode zum Nachweis und zur Messung von Anti-P.falcipa rum-Sporozoit-Antikörpern im menschlichen Blut, Serum und/oder Plasma.

Malaria stellt eine der schwersten parasitären Erkran kungen dar und befällt jedes Jahr Hunderte von Millionen von Menschen, vor allem in den tropischen Regionen von Asien, Afrika und Amerika, und verursacht dabei eine hohe Kindersterblichkeit.

Die Ursache der Malaria ist ein Protozoon, das zum Genus Plasmodium gehört, das auf den Menschen durch den Stich der Anophelesmücke übertragen wird.

Unter den hunderten von Species von Plasmodium, die in der Natur existieren, sind nur vier für den Menschen pathogen: Plasmodium ovale, Plasmodium maleriae, Plasmodi um vivax und Plasmodium falciparum.

Dieses letztere stellt insbesondere die am meisten ver breitete Species dar und verursacht die meiste Erkran kungshäufigkeit und Mortalität im Zusammenhang mit Malaria.

Die Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern im Blut von Individuen, die verdächtig sind, malariainfiziert zu sein, stellt einen wesentlichen klinischen Parameter für die Diagnose von Malaria dar und die Auswertung der Wirksamkeit einer Antimalaria-Vakzine.

Im allgemeinen wird die Diagnose von Malariainfektionen mittels der Blutprüfung unter dem Mikroskop oder durch immunologische Methoden durchgeführt, die auf Messungen der Fluoreszenz (IFA), der Radioaktivität (IRMA) und der enzymatischen Aktivität (EIA) basieren.

Die mikroskopische Analyse des Blutes ist jedoch schwie rig und für eine epidemiologische Untersuchung ungeeignet, wo hunderte oder tausende Proben geprüft werden, ungeeignet.

Ein nicht sehr geeignetes Ergebnis liefern weiterhin die immunologischen Methoden IRMA und IFA, die, abgesehen davon, daß sie lange Arbeitszeiten benötigen, durch vie le Schritte, die sie erfordern, kompliziert sind und durch die Verwendung von Substanzen, die instabil und für den Menschen schädlich sind.

Unter den EIA-immunoenzymatischen Methoden ist die übli cherweise verwendete der ELISA (Enzyme-Linked-Immuno- Sorbent-Assay)-Test, der umfaßt:

(a) Fixieren durch Absorption oder durch kovalente chemische Bindung eines natürlichen oder synthetischen Antigens auf einen festen Träger;
(b) Blockieren der restlichen Stellen auf dem Trä ger mit einem geeigneten Protein;
(c) Inkubieren des an den Träger gebundenden Anti gens mit dem zu untersuchenden Serum, und
(d) aufeinanderfolgende Zugabe eines Anti-Human- Immunoglobulin-Antikörpers, gebunden an ein Detektor enzym, und eines farblosen Substrats für das Enzym, das im Falle einer positiven Reaktion des Serums ein gefärb tes Produkt ergibt.

Dieser Test erfordert jedoch, obzwar er es ermöglicht, einige der Nachteile der IRMA- und IFA-Methoden zu über winden, durch Verwendung stabiler und nicht-radioaktiver Substanzen, lange Arbeitszeiten (etwa 6 Stunden) und die Verwendung von Reaktanten, wie Anti-Immunoglobolin- Antikörper-Enzym, das nur mittels komplexer und kost spieliger Methoden erhalten werden kann.

Somit existiert das Bedürfnis in der Fachwelt für eine rasche, preiswerte und empfindliche diagnostische Methode, die für Massenuntersuchungen in Gegenden, wo Malaria endemisch ist, oder in Gegenden, wo eine genaue Kontrolle durchgeführt werden muß, um infektiöse Herde zu lokali sieren und diesen vorzubeugen, nützlich ist.

Diesem Bedürfnis wird gemäß der vorliegenden Erfindung nach einer neuen immunoenzymatischen Methode nachgekom men, welche mit einem synthetischen Antigen-Enzym-Konju gat arbeitet, das fähig ist, mit den Antisporoit- bzw. Antisporozoitantikörpern einen stabilen Antikörper-Antigen- Enzym-Komplex zu bilden und mit den Proteinen, welche gleichfalls den Antisporozoitanitkörper dieses Komplexes binden.

Daher ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine immu noenzymatische Methode zum Nachweis und zur Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von menschlichem Blut und/oder seinen Abkömmlingen, die um faßt: Inkubieren dieser Proben in Anwesenheit eines syn thetischen Antigen-Enzym-Konjugats, das fähig ist, mit den Antisporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörper synthetisches Antigen-Enzym-Komplex zu bilden; Binden des Anitsporozoit-Antikörpers diesesKomplexes mit denProte inen, entweder adsorbiert auf oder kovalent gebunden an einen festen Träger; und schließlich Bestimmen der enzy matischen Aktivität des an die Proteine gebundenen Kom plexes durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Sub strats, das im positiven Falle ein gefärbtes Produkt zu ergeben vermag.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Ver wendung dieses synthetischen Antigen-Detektorenzym- Konjugats zur Herstellung einer Ausrüstung für die Dia gnose von Malaria.

Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden aus der Lektüre der folgenden Beschreibung und den Beispielen ersichtlich.

Das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat, das für die er findungsgemäße Methode geeignet ist, wird durch eine Polypeptid-Sequenz gebildet, die in der Lage ist, die Antisporozoit-Antikörper zu erkennen und zu binden, und durch ein Enzym gebildet.

Insbesondere ist gemäß der vorliegenden Erfindung das Sequenz-Polypeptid bzw. die Polypeptid-Sequenz (Asn-Ala- Asn-Pro)_n, worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40, vorzugsweise von 10 bis 20, hat, und exakt das polypepti dische Segment des natürlichen Circumsporozoit-Proteins bzw. Circumsporozoitoize-Proteins der Membran des Sporozoits von P.falciparum reprodu ziert.

Die Anwesenheit von nur zwei endständigen, funktionalen, chemischen Gruppen, NH₂ und COOH, in diesem Polypeptid macht es besonders geeignet für die Herstellung des Kon jugats gemäß der vorliegenden Erfindung, da es ermöglicht, daß eine stabile, kovalente Bindung zwischen dem Poly peptid und dem Enzym gebildet wird, ohne der katalyti schen Aktivität desselben Enzyms schädlich zu sein.

Dieses Polypeptid wird in reiner Form und in hoher Aus beute nach dem Verfahren, wie es in der europäischen Patentanmeldung 2 09 643 beschrieben ist, mittels Polyme risation des HCl.H-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP-Polypeptids in einem inerten, polaren Lösungsmittel in Anwesenheit ei ner tertiären organischen Base hergestellt.

Enzyme, die für die Herstellung des Konjugats der vorlie genden Erfindung nützlich sind, werden unter solchen aus gewählt, die auf einem chromogenen Substrat zu wirken in der Lage sind. Beispiele solcher Enzyme sind Peroxidase, α-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Vorzugsweise wird Peroxidase verwendet.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat hergestellt mittels eines Verfah rens, das umfaßt:

1. Oxidieren des gereinigten Enzyms in einer 0,1 M Lösung von NaHCO₃, wie z. B. Natriummetaperjodat, bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln während etwa 2 Stunden;
2. Zugabe des Polypeptids, gelöst in NaHCO₃ (pH 9,2) zu dieser Lösung in einem Polypeptid/Enzym-Molver hältnis von etwa 40/1 und Halten der entstandenen Lösung durch Stehen bei Raumtemperatur im Dunkeln während etwa 16 Stunden;
3. Zugabe eines reduzierten Mittels zu dieser Lösung, wie z. B. NaBH₄, und schließlich
4. Abtrennen des Polypeptid-Enzym-Konjugats.

Insbesondere wird gemäß einer praktischen Durchführungs form der vorliegenden Erfindung ein Konjugat hergestellt, worin das Polypeptid (Asn-Ala-Asn-Pro)₁₇ und das Enzym Peroxidase ist. Der Kojugationsgrad, d. h. das Molver hältnis von Polypeptid zu Enzym in diesem Konjugat ist 0,9-0,92, nahe bei dem erwarteten Wert (1) für das reine Konjugat.

Die spezifische Aktivität der Peroxidase, bestimmt durch Spektrophotometrie bei 405 nm, wie von H. Galloti (1979), J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, 1-7, berichtet, ist 75% derjenigen des nichtkonjugierten Enzyms.

Gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung wird dieses Konjugat in einer Pufferlösung während etwa 20 bis 30 Minuten mit einer Probe von ganzem menschlichen Blut, Humanserum oder Humanplasma inkubiert.

Das Reaktionsgemisch wird dann weitere 20 bis 30 Minuten auf einem festen Träger inkubiert, auf dem das A-Protein adsorbiert und/oder kovalent gebunden ist.

Von diesem Protein ist bekannt, daß es leicht die mensch lichen Immunoglobuline, ausgenommen IgM und IgG₃, bindet und daher mit dem Antisporozoit-Antikörper, der an das Antigen-Enzym-Konjugat gebunden ist, einen stabilen Kom plex bildet.

Feste Träger, die für das erfindungsgemäße Verfahren ge eignet sind, sind Polysaccharid-Materialien, wie Cellu lose und Agarose, sowie Kunststoff-Materialien.

Am Ende der Reaktion und nach geeigneten Waschungen wird zu den Mischungen eine Lösung gegeben, welche das chromo gene, enzymatische Substrat und H₂O₂ enthält, und nach 2 bis 3 Minuten wird die Entwicklung von Farbe beobachtet.

In dem Fall, wo das gesamte Blut analysiert wird, wird die Ausgangsmischung vor der Zugabe zu dem A-Protein zen trifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen.

Der Threshold-Wert, d. h. die minimale Menge an positivem Serum, welche eine Farbentwicklung, die mit dem bloßen Auge sichtbar ist, erzeugt, war 0,1 µl bzw. 0,4 µl für zwei untersuchte Seren.

Weiterhin wird keine Farbentwicklung beobachtet für die Leerperiode, welche aus einem Gemisch, das das Konjugat ohne die Probe von Blut und/oder seinen Derivaten ent hält, besteht, für Serum und Plasma von gesunden Perso nen, für nicht-malariainfiziertes Gesamtblut, entweder haemolysiert oder nicht, und für γ-Globuline (Globuman- Bern).

Dies zeigt eine vollständige Abwesenheit von Überschnei dungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an.

Die Möglichkeit eines raschen Durchlaufs, etwa 60 Minu ten, verglichen mit den 6 Stunden, die für dem ELISA- Test erforderlich sind, und die Verwendung einer kleinen Anzahl von Reaktanten, d. h. nur das Antigen-Enzym und die Proteine, stellen einen besonderen Vorteil des er findungsgemäßen Verfahrens dar.

Eine beträchtlicher Vorteil dieser Methode besteht weiter hin in der Möglichkeit, die Antisporozoit-Antikörper im Gesamtblut bestimmen und messen zu können. Dies ist verur sacht durch die hohe Stabilität des Konjugats der vorlie genden Erfindung, verglichen mit den im Blut enthaltenen Proteasen.

Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren absolut spe zifisch, und tatsächlich bestätigten alle Proben, welche nach dem IRMA-, IFA- und ELISA-Tests als positiv befun den wurden, bei der Analyse mit der erfindungsgemäßen Methode die Positivität.

Infolgedessen ist das erfindungsgemäße Verfahren beson ders geeignet für eine epidemiologische Studie von Ma laria und insbesondere für Massenprüfungen von Malaria infektion in Gegenden, in denen sanitäre Einheiten und Strukturen fehlen.

Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung von (Asn-Ala-Asn-Pro)₁₇-Peroxidase-Konjugat

Peroxidase-Enzym (Sigma) wurde gereinigt und gefrierge trocknet, bevor es mit dem Peptid konjugiert wurde.

10 mg reines Enzym (E) wurde dann in 1 ml 0,1 M NaHCO₃ gelöst und 2 h mit 1 ml 16 mM NaJO₄ (Natriummetaper jodat) bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln oxidiert.

Am Ende dieses Zeitraums wurde zu dem Reaktionsgemisch 1 ml NaHCO₃ (pH 9,2) enthaltend 70 mg (Asn-Ala-Asn- Pro)₁₇-Peptid (P) in einem Molverhältnis von Peptid/ Enzym gleich 40/1, zugesetzt.

Die so erhaltene Mischung wurde quantitativ in das Innere einer Pasteur-Pipette überführt, die am Ende mit Glas wolle verschlossen wurde, und dazu gab man 500 mg Sepha dex^(R) G-25 (Pharmacia Uppsala)-Pulver. Die Pipette wurde dann weitere 16 h bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen.

Zu dem Reaktionsgemisch, das aus der Pipette eluiert wur de, wurden 150 µl 0,1 mM NaOH, enthaltend 5 mg/ml NaBH₄, zugesetzt und 30 min später wurden dazu 450 µl der glei chen Lösung gegeben.

Nach etwa 1 h wurde das Gemisch, welches das Enzym- Peptid-Konjugat (E-P) und das nichtreagierte Peptid (P) und Enzym (E) enthielt, mit 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, in einer Säule von Sephadex G-10, die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, ins Gleichgewicht gebracht (äquilibriert). Das Gemisch wurde dann auf eine Säule (0,9 × 10 cm) von Carboxymethylcellulose (CM- Cellulose), äquilibriert mit 5 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, gegeben und mit 65 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4, eluiert und auf Sephadex G10-Säule, äquilibriert mit destilliertem Wasser, entsalzt. Das die E-P-Verbindung enthaltende Eluat und das nichtreagierte Enzym wurden gefriergetrocknet.

Das nichtreagierte Peptid wurde zuvor mit dem eingeführ ten Puffer eluiert und seine Unversehrtheit wurde durch IR-Spektroskopie analysiert.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigten das gleiche Spektrum für das eluierte Peptid und für das als Rohmaterial ver wendete Peptid. So war es möglich, zu schließen, daß keine Veränderungen in dem Peptid während der Konjuga tionsreaktion aufgetreten waren und daß das an das Enzym gebundene Peptid unbeschädigt war.

Der Grad der E-P-Konjugation, d. h. das Molverhältnis von Peptid zu Enzym in dem Konjugat, wurde bestimmt, indem die Erhöhung an Asn, Ala und Pro-Aminosäureresten in dem E-P + freies E enthaltenden Gemisch im Verhältnis zu dem Ausgangsenzym E berechnet wurde.

Die Analyse der Aminosäuren wurde nach saurer Hydrolyse von E-P + E und mit 6 N HCl bei 100°C während 24 h in nerhalb verschlossener Ampullen mittels eines automati schen Beckman-Aminosäureanalysators durchgeführt.

In Anbetracht der Tatsache, daß die Aminosäurezusammen setzung der beiden peroxidasischen Isoenzyme (B und C), die in dem Ausgangs-E vorliegen, bekannt ist (L. M. Shannan et. al., 1966, J. Biol. Chem. 241, 2 166), war es möglich, für ein E : P-Molverhältnis von 1, entsprechend dem reinen E-P-Konjugat, eine theoretische Erhöhung an Asp, Ala und Pro von 63% bzw. 68% bzw. 100% zu berech nen.

Für die obenerwähnten Aminosäuren wurden Zunahmen von 58%, 62% und 90% gefunden,was einem E : P-Molverhältnis von 0,90-0,92 entspricht, annähernd äquivalent dem er rechneten Verhältnis für das reine Konjugat.

Die spezifische Restaktivität des an das Peptid gebunde nen Peroxidase-Enzyms, bestimmt durch Spektrophotometrie bei 405 nm mit 1,7 nM ABTS [2,2′-Azino-di-(3-ethylbento thiazolyl-sulfonsäure)] und 0,83 mM H₂O₂ in 50 mM Phos phatpuffer, pH 6,0, (H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. Bio chem. 17, 1-7, 1979), war etwa gleich 75% derjenigen des Ausgangsenzyms.

Beispiel 2

Für diesen Test wurden 8 malariainfizierte Seren, das heparinisierte Plasma von 4 gesunden Spendern, das Serum von 3 gesunden Personen und eine Probe von malariainfi ziertem Gesamtblut verwendet, indem in einem Volumenver hältnis 1 : 1 das malariainfizierte Serum mit dem hämoly sierten und nicht-hämolysierten Gesamtblut einer gesun den Person vermischt wurde.

Zu 100 µl von 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20 (PBS-T) und 200 ng E-P-Kon jugat, wurden zugesetzt: 1 bis 5 µl Blut oder Plasma oder Serum von geunden Personen; oder 10 µl von PBS-T, enthaltend 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 µl Serum von malariainfizierten Personen.

Die Lösungen wurden 15 bis 20 min bei Raumtemperatur ste hengelassen.

Im Falle des Gesamtbluts wurde die Lösung zentrifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen.

Anschließend wurden die Lösungen in farblose und transpa rente Mikropipettenspitzen aus Kunststoffmaterial gegeben, die an ihrem Ende Glaswolle und darauf ein Bett, bestehend aus einer Menge von etwa 6 µl A-Protein-Sepharose Cl-4B (Pharmacia Uppsala), vorgewaschen mit PBS-T, enthielten.

Die Lösungen wurden durch Schwerkraft während einer Zeit von 20 bis 30 min perkoliert, die Mikrosäulen wurden drei mal mit jeweils 200 µl PBS-T und zweimal mit jeweils 200 µl PBS (der Puffer ohne Tween-20) gewaschen.

Anschließend wurden zu jeder Mikrosäule 200 µl einer Sub stratlösung von 4-Chlor-1-naphtol (Biorad) und H₂O₂, hergestellt durch Vermischen zum Zeitpunkt der Verwen dung von 1 Vol-Teil 4-Chlor-1-naphtol (Biorad) (3 mg/ml in kaltem Methanol) und 5 Vol-Teilen einer Lösung von 6 µl H₂O₂ von 30% (Vol/Vol), zugesetzt zu 10 ml PBS, ge geben. Nach 2 bis 3 min wurde die Entwicklung einer tief blauen Farbe für die positiven Proben beobachtet.

Der Threshold-Wert, d. h. die minimale Menge an positivem Serum, welche eine leicht sichtbare blaue Bande bzw. Ring erzeugte, ergab 0,1 µl-0,4 µl für zwei getestete posi tive Seren.

Die Spezifität des Tests wurde an einem positiven, mala riaverseuchten Serum (Entwicklung eines blauen Ringes mit E-P) überprüft unter Verwendung von 200 ng freiem Enzym ohne E-P in einem Test und in einem anderen Test eines großen Überschusses (3 µg) (etwa 100fach) von frei em P in Konkurrenz mit dem vorhandenen E-P-Konjugat (200 ng). Am Ende der Reaktion wurde keine Farbentwick lung beobachtet.

Keine Farbentwicklung wurde ferner in der Mikrosäule be obeachtet für die Leerprobe, gebildet durch das Reaktions gemisch mit E-P ohne Zugabe von Blut, Serum oder Plasma; für das Serum oder Plasma von gesunden Personen; für das nicht-malariainfizierte Gesamtblut; oder für menschliche γ-Globuline (Globuman-Bern), getestet in einer Menge, äquivalent etwa 60 µl Serum. Dies zeigte eine vollstän dige Abwesenheit von Störungen bzw. Überlagerungen in dem Test unter Verwendung des E-P-Konjugats an.

Die Stabilität des an das Peptid gebundenen Per oxidase-Enzyms (E-P) wurde auf spektrophotometrischem Wege be stimmt, indem in Zeiträumen von 0 bis 2 h von einer Lö sung von PBS-T (100 µl), enthaltend 200 ng E-P, zu der Proben von Serum oder Plasma zugesetzt waren, Zeichnun gen bzw. Skizzen gemacht wurden.

Nach 2 h zeigten die erhaltenen Ergebnisse eine unverän derte Peroxidase-Aktivität.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung und Messung von Anti-P. falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von menschli chem Blut und/oder seinen Derivaten, dadurch gekennzeich net, daß

(a) diese Proben mit einem synthetischen Antigen- Enzym-Konjugat, das mit den in der Probe vorhandenen An tisporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörper-synthe tisches Antigen-Enzym-Komplex zu bilden vermag, ohne die enzymatische Aktivität zu entaktivieren, inkubiert werden;
(b) der Antikörper dieses Komplexes mit den Pro teinen, die auf einem festen Träger adsorbiert und/oder chemisch gebunden sind, gebunden wird, und schließlich
(c) die enzymatische Aktivität des an die Proteine gebundenen Komplexes bestimmt wird durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Substrats, das im Falle eines positiven Ergebnisses ein gefärbtes Produkt zu liefern vermag.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß das synthetische Antigen das sequentielle Poly peptid bzw. die Polypeptid-Sequenz (Asn-Ala-Asn-Pro)_nist, worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40 hat, und das Protein ein A-Protein ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeich net, daß n im Bereich von 10 bis 20 liegt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, beste hend aus den Enzymen, die eine colorimetrische Reaktion mit einem spezifischen Substrat zu liefern vermögen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeich net, daß das Enzym Peroxidase und/oder alkalische Phos phatase ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß das Konjugat hergestellt wird, indem in homoge ner Phase in NaHCO₃ bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln das Oxidat-Enzym bzw. oxidierte Enzym mit einem molaren Überschuß von (Asn-Ala-Asn-Pro)_n-Polypeptid, worin n die oben angegebene Bedeutung hat, umgesetzt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, daß das Molverhältnis des Polypeptids zu dem Enzym in dem Konjugat gleich oder etwa gleich 0,92 ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß in Stufe (a) die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25°C) während einer Reaktionszeit im Bereich von 15 bis 20 Minuten durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß der feste Träger ein Polysaccharid oder Plastik- bzw. Kunststoffmaterial ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß die Polysaccharid-Träger Cellulose, Agarose und dergl. sind.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß in Stufe (b) die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25°C) während einer Reaktionszeit im Bereich von 20 bis 30 Minuten durchgeführt wird.

12. Diagnostische Ausrüstung für die Bestimmung bzw. den Nachweis und die Messung von Anti-P.falciparum- Sporozoit-Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat, definiert in An spruch 1, und Proteine verwendet werden.