SE468450B - Saett att bestaemma antikroppar mot sporozoiter fraan p. falciparum i humant blod - Google Patents

Description

2 g b) blockering av de 'återstående ställena ("sites") på bäraren med ett lämpligt protein, I c) inkubering av det till bäraren bundna antigenet tillsammans med det serum som skall undersökas, och d) tillsats i följande ordning av antikroppar mot humant immuno- globelin bundet till ett detektorenzym och ett färglöst substrat för enzymet, vilket ger en färgad produkt om serat reagerar positivt. Även om detta test gör det möjligt att övervinna en del av nackdelarna med metoderna IRMA och IFA genom att använda stabila och icke radioaktiva substanser, kräver detta emellertid långa användningstider (ungefär 6 timmar) och användning av reagens, såsom anti-immunoglobulin- antikroppar-enzym, vilka endast kan erhållas genom komplicerade och dyr- bara metoder.

Sålunda föreligger inom området ett behov av en snabb, billig och känslig diagnostisk metod, som är användbar för massundersökning i områden, där malaria är endemisk eller i områden där en noggrann kontroll måste genomföras för att förhindra och lokalisera infektionshärdar.

Nämnda behov uppfylles enligt föreliggande uppfinning genom en ny immunoenzymatisk metod, som använder ett syntetiskt antigen-enzym- konjugat, som med antisporozoitantikroppar kan bilda ett stabilt antikropp- antigen-enzymkomplex och med de proteiner som starkt binder antisporozoit- antikropparna i nämnda komplex.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är därför en immunoenzy- matisk metod för påvisande och mätning av antikroppar mot sporozoiter från P. falciparum i prover av humant blod och/eller dess derivat, vilken inne- fattar: inkubering av nämnda prover i närvaro av ett syntetiskt antigen- enzymkonjugat, som med antisporozoitantikropparna kan bilda ett stabilt antikropp-syntetiskt antigen-enzymkomplex, bindning av antisporozoitanti- kropparna i nämnda komplex till proteinema som antingen är absorberade på eller kovalent bundna till en fast bärare, och slutligen bestämning av den enzymatiska aktiviteten hos det till proteinerna bundna komplexet genom tillsats av ett färglöst enzymatiskt substrat med förmåga att ge en färgad produkt vid positiv reaktion.

Ytterligare ett syfte med föreliggande uppfinning är användning av nämnda syntetiska antigen-detektorenzym-konjugat för framställning av ett test för diagnos av malaria.

I! 468 450 s .Ytterligare syften med föreliggande uppfinning kommer att fram- går vid genomläsning av beskrivningen och av utföringsexemplen.

Det syntetiska antigen-enzymkonjugatet, som är lämpligt vid metoden enligt föreliggande uppfinning, bildas av en polypeptid med en viss sekvens, som har förmågan att känna igen och binda antisporozoitantikropp- arna, och av ett enzym.

Enligt föreliggande uppfinning utgöres den sekvensiella polypep- tiden närmare bestämt av (Asn-Ala-Asn-Pràn, i vilken n har ett värde som ligger i området från 3 till #0, företrädesvis från 10 till 20, och exakt reproducerar polypeptidsegmentet i det naturliga circumsporozoitproteinet i membranet hos sporozoiter av P. falciparum.

Närvaron i nämnda polypeptid av endast funktionella ändgrupper, NHZ och COOH, gör den särskilt lämplig för framställning av konjugatet enligt föreliggande uppfinning, såtillvida som det gör det möjligt att bilda en stabil kovalent bindning mellan polypeptiden och enzymet, utan att ha någon menlig inverkan på nämnda enzyms katalytiska aktivitet.

Nämnda polypeptid framställes i ren form och i högt utbyte enligt det förfarande som beskrives i den europeiska patentansökan med publice- ringsnummer 209618 genom polymerisation av polypeptiden HCLH-Asn-Ala- Asn-Pro-OPCP i ett inert polärt lösningsmedel i närvaro av en tertiär organisk bas.

Enzymer, som är användbara för framställning av konjugaten enligt föreliggande uppfinning, är valda bland de som har förmågan att verka på ett kromogent substrat. Exempel på dylika enzym är peroxidaser, alfa- galactosidaser och alkaliska fosfataser. Företrädesvis användes peroxidas.

Enligt föreliggande uppfinning framställes det syntetiska antigen- enzymkonjugatet genom ett förfarande innefattande: I) oxidering av det renade enzymet i en 0,1 M lösning av NaHCO3, såsom exempelvis natriummetaperiodat, vid rumstemperatur (20-25°C) i mörker i ungefär 2 timmar, 2) tillsats till nämnda lösning av polypeptiden, löst i NaHCO3 (pH 9,2) i ett molärt förhållande polypeptid/enzym av ungefär 40/1, varvid den erhållna lösningen hålles stående vid rumstemperatur i mörker i ungefär 16 timmar, i 3) tillsats till den erhållna lösningen av ett reduktionsmedel, såsom exempelvis NaßHq, och slutligen l+) separation av polypeptid-enzymkonjugate t.

.Fm (fi '- CO f°\ .g (r: ll- Enligt en praktisk utföringsform av föreliggande uppfinning fram- ställes närmare bestämt ett konjugat, i vilket polypeptiden utgöres av (Asn- Ala-Asn-Prol17 och enzymet utgöres av peroxidas. Konjugeringsgraden, dvs. det molära förhållandet mellan polypeptid och enzym i nämnda konjugat, är 0,9-0,92, vilket är nära det förväntade värdet (l) för det rena konjugatet. bestämd Den specifika aktiviteten för peroxidaset, spektrofotometri vid 405 nm enligt l-l. Galloti (1979), J. Clin. Chem. Clin. genom Biochem. l7, 1-7, är 75% av aktiviteten för det icke konjugerade enzymet.

I enlighet med förfarandet enligt föreliggande uppfinning inkube- ras nämndaikonjugat i en buffertlösning i ungefär 20-30 minuter med ett prov av humant helblod, humant serum eller humant plasma.

Reaktionsblandningen inkuberas sedan i ytterligare 20-30 minuter på en fast bärare, pä vilken protein A är absorberat och/eller kovalent bundet.

Nämnda protein är känt för att starkt binda humana immuno- globuliner med undantag av IgM och IgG3 och bildar sålunda ett stabilt komplex med de till antigen-enzymkonjugatet bundna antisporozoitantikropp- arna.

Fasta bärare, som är användbara vid förfarandet enligt föreligg- ande uppfinning, utgöres av polysackaridmaterial, såsom cellulosa och agaros och plastmaterial.

Vid slutet av reaktionen och efter lämpliga tvättningar sättes till blandningarna en lösning innehållande det kromogena enzymatiska substratet och HzOg, och efter 2-3 minuter iakttages färgutveckling.

I det fall då helblod analyseras centrifugeras eller filtreras den initiala blandningen för att avlägsna suspenderat material innan den tillsättes till protein A.

Tröskelvärdet, dvs. den minsta mängd positivt serum som alstrar en färgutveckling som är synlig för blotta ögat, var lika med 0,1 ill respektive 0,14 pl för tvâ undersökta sera.

Vidare iakttdgs ingen färgutveckling för blanken, vilken utgjordes av den konjugatinnehâllande blandningen utan blodprov och/eller dess derivat, av serum och plasma från friska personer, av icke malariainfekterat helblod, antingen hemolyserat eller ej, och av gamma-globuliner (Blobuman - Bern).

Detta indikerar en fullständig frånvaro av interferenser i metoden enligt föreliggande uppfinning. .fä- CH CO -HL LH (LD Möjligheten av ett snabbt genomförande, ungefär 60 minuter jämfört med de 6 timmar som kräves av ELISA-testet, och användningen av ett litet antal reagens, dvs. endast antigen-enzymet och proteinerna, utgör en särskild fördel medrmetoden enligt föreliggande uppfinning.

En avsevärd fördel med nämnda metod ligger vidare i möjligheten att bestämma och mäta antisporozoitantikroppar i helblod. Detta beror på den höga stabiliteten hos konjugatet enligt föreliggande uppfinning jämfört med proteaserna i blod.

Vidare är metoden enligt föreliggande uppfinning fullständigt specifik. i själva verket bekräftades den positiva reaktionen hos alla prov, som var positiva i IR MA-, IFA- och ELISA-testerna, när de analyserades med föreliggande metod.

Metoden enligt föreliggande uppfinning är därför särskilt lämplig för en epidemiologisk undersökning av malaria och särskilt för massundersök- ning av malariainfektioner i områden, där sanitära enheter och strukturer saknas.

Följande utföringsexempel är belysande och ej begränsande för uppfinningen i fråga.

Exempel l Framställning av (Asn-Ala-Asn-Pro)17j>eroxidas~konjugat Peroxidasenzym (sigma) renades och frystorkades innan det konju- gerades med peptiden. mg rent enzym (E) upplöstes sedan i l ml 0,1 M NaHCOg, och oxiderades med l ml 16 mM NaiOq (natriummetaperiodat) vid rumstempera- tur (20-25°C) i mörker i 2 timmar.

Vid slutet av nämnda tidsperiod försattes reaktionsblandningen med l ml NaHCO3 (pH 9,2) innehållande 70 mg av peptiden (Acn-Ala-Asn- Pro) 17, (P), i ett molärt förhållande peptid/enzym lika med #0/ l.

Den sålunda erhållna blandningen överfördes kvantitativt till en pastörpipett, tillsluten i änden med glasull, och till densamma sattes 500 mg sefadexm) G-25 pulver (Pharmacia, Uppsala). Pipetten hölls sedan stående vid rumstemperatur i mörker i ytterligare 16 timmar.

Till den från pipetten eluerade reaktionsblandningen sattes 150 pl 0,1 mM NaOH, innehållande 5 mg/ml NaBH4 och 30 minuter senare tillsattes 450 pl av samma lösning. ...w- Ö”- CS CJ 6 Efter ungefär l timme jämviktades blandningen, innehållande enzym-peptidkonjugatet (E.-P) och oreagerad peptid (P) och enzym (E), med 5 mM natriumacetatbuffert, pH 4,15 i en kolonn med sefadexm) G-l0, som i förväg jämviktats med samma buffert. Blandningen sattes sedan på en kolonn (10 x 0,9 cm) av karboxymetylcellulosa (CM-cellulosa), jämviktad med 5 mM natriumacetatbuffert, pH 4,4, och eluerades med 65 mM natriumacetat- buffert, pH 4,4, och avsaltades på en kolonn av sefadexm) G-l0, jämviktad med destillerat vatten. Eluatet innehållande E-P-föreningen och oreagerat enzym frystorkades.

Oreagerad peptid eluerades innan med den satsade bufferten och dess integritet analyserades genom IR-spektroskopi.

De erhållna resultaten uppvisade samma spektrum för den elue- rade peptiden och för den som råvara använda peptiden. Man kunde sålunda dra den slutsatsen, att ingen förändring hade inträffat 'i peptiden under konjugeringsreaktionen och att den till enzymet bundna peptiden sålunda var oskadad. ' Graden av E-P-konjugering, dvs. det molära förhållandet mellan peptid och enzym i konjugatet, bestämdes genom att beräkna ökningen av aminosyrorna Asn, Ala och Pro i blandningen innehållande E-P + fri E jämfört med det initiala enzymet E.

Aminosyraanalysen genomfördes efter sur hydrolys av E-P + E och E med 6N HCl vid l00°C i 24 timmar i slutna ampuller med hjälp av en automatisk aminosyraanalysator, fabrikat Beckman.

Eftersom aminosyrasammansättningen av de två peroxidasiso- enzymerna (B och C), som är närvarande i initialt E, är känd (Shannan L.M. et al., 1966, J. Biol. Chem. 241, 2, 166), var det möjligt att beräkna, för ett molärt förhållande E:P av 1 motsvarande det rena E-P-konjugatet, en teoretisk ökning av Asp, Ala och Pro av respektive 63%, 68% och 100%.

För ovan nämnda aminosyror erhölls ökningar på 58%, 62% och 90%, vilket motsvarar ett molärt förhållande E:P av 0,90-0,92, vilket är ungefärligen ekvivalent med det beräknade förhållandet för det rena konju- gatet.

Den återstående specifika aktiviteten hos det till peptiden bundna peroxidasenzymet, bestämt genom spektrofotometri vid #05 nm med 1,7 nM ABTS (2,2baaino-diO-etyl-benzothiazolyl-sulfonsyra)) och 0,83 mM HZQZ 1 50 mM fosfatbuffert, pH 6,0 (H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, l-7, 1979), var ungefär lika med 75% av aktiviteten hos utgångsenzymet. 469 450 7 Exempel 2 För denna test användes åtta malariainfekterade sera, heparini- serad plasma från 4 friska givare, serum från 3 friska personer och ett prov av malariainfekterat helblod, genom att blanda i ett volymsförhållande av 1:1 malariainfekterat serum med hemolyserat och icke hemolyserat helblod från en frisk person.

Till 100 pl 10 mM fosfatbuffert, pH 7,5, innehållande 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20 (PBS-T) och 200 ng E-P-konjugat, tillsattes: 1 till 5 pl blod, plasma eller serum från friska personer; eller 10 pl PBS-T respektive innehållande 0,05; 0,1; 0,2; 0,l+; 0,8; 1,6; 3,2 pl serum från malariainfekterade personer.

Lösningarna hölls vid rumstemperatur i 15-20 minuter.

I fallet helblod centrifugerades eller filtrerades lösningen för att avlägsna suspenderat material.

Därefter överfördes nämnda lösningar till färglösa och genomsyn- liga mikropipettspetsar av plastmaterial, innehållande i sina ändar glasull och ovanpå denna en bädd bestående av en mängd av ungefär 6 pl av Protein-A- Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala), förtvättad med PBS-T.

Lösningarna fick rinna igenom medelst självtryck under en tid av -30 minuter, varefter mikrokolonnerna tvättades tre gånger med 200 pl varje gång med PBS-T och två gånger med vardera 200 pl PBS (buffert utan Tween-20).

Därefter sattes till varje mikrokolonn 200 pl av en substratlösning av ll-klor-l-naftol (Biorad) och H2O2, framställd genom blandning vid an- vändningstillfället, 1 volymsdel ß-klor-l-naftol (Biorad) (3 mg/ml i kall metanol) och 5 volymsdelar av en lösning av 6 pl 30% ig (v/v) H2O2 i l0 ml PBS. Efter 2-3 minuter iakttogs utvecklingen av en djupblå färg i de positiva proverna. _; Tröskelvärdet, dvs. den minsta mängd positivt serum som åstad- kommer ett lätt iakttagbart blått band, visade sig vara O,l-0,l+ p] för två testade positiva sera. i Specificiteten hos testet verifierades på ett positivt malariainfek- terat serum (utveckling av ett blått band med E-P) med användning i ett test av 200 ng fritt enzym utan E-P; i ett annat test ett stort överskott (3 pg) (ungefär 100 gånger) fritt P i konkurrens med det närvarande E-P-konjugatet (zoo ng). ' 8 Vid slutet av reaktionen iakttogs ingen färgutveckling.

Ingen färgutveckling iakttogs vidare i mikrokolonnen för blanken, framställd av reaktionsblandningen med E-P utan tillsats av blod, serum eller plasma; för serum eller plasma från friska personer; för icke malariainfekte- rat helblod; eller för humana gamma-globuliner (Globuman - Bem), testade i en mängd motsvarande omkring 6 pl serum.

Detta indikerade en fullständig frånvaro av interferenser i testet som använde E-P-konjugat.

Stabiliteten hos det till peptiden bundna peroxidasenzymet (E-P) bestämdes på spektrofotometrisk väg genom att ta upp två kurvor under tider som varierade från 0-2 timmar på en lösning av PBS-T (100 Fl) innehållande 200 ng E-P, till vilken prover av serum eller plasma tillsattes.

Efter 2 timmar visade de erhållna resultaten en oförändrad peroxidasaktivitet.

Claims (11)

.pa CA C. I) -F> (n G Patentkrav

1. l. -Enzymimmunologiskt förfarande för att påvisa och mäta antikroppar mot sporozoiter' från P. falciparum i blodprover och/eller dess derivat,kännetecknatavatt: a) nämnda prover inkuberas med ett syntetiskt antigen-enzymkonju- gat med förmåga att bilda ett stabilt antikropp-syntetiskt antigen-enzym- komplex med de i provet närvarande antisporozoitantikropparna utan deakti- vering av enzymaktiviteten, varvid det syntetiska antigenet utgöres av polypeptidsekvensen: (Asn-Ala-Asn-Proh, där n har ett värde som ligger i omrâdet från 3 till 40 och proteinet utgöres av protein A. b) antikroppen i nämnda komplex bindes till proteinerna som är absorberade av och/eller kemiskt bundna till en fast bärare, och slutligen c) den enzymatiska aktiviteten av de till proteinerna bundna komplexet bestämmes genom tillsats av ett färglöst enzymatiskt substrat med förmåga att ge en färgad produkt vid positiv reaktion.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att n ligger i området från 10 till 20.

3. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet är valt bland den grupp som består av enzymer med förmåga att ge en färgreaktion med ett specifikt substrat.

4. Sätt enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att enzymet utgöres av perioxidas och/ eller alkaliskt fosfatas. i

5. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att konjugatet fram- ställes genom att reagera det oxiderade enzymet i homogen fas i NaHCO3 vid rumstemperatur (20-25°C) i mörker med ett molärt överskott av polypeptiden (Asn-Ala-Asn-Prdn, i vilken n har ovan angiven betydelse.

6. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att det molära för- hällandet mellan polypeptid och enzym i konjugatet är lika med eller ungefär lika med 0,92.

7. Sätt enligt krav I, k ä n n e t e c k n a t av att i steg (a) reak- tionen genomföres vid rumstemperatur (20-25°C) under en reaktionstid som ligger i området från 15-20 minuter. CD 43. 5 O 10

8. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den fasta bäraren utgöres av ett polysackarid- eller plastmaterial.

9. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av attpolysackaridbära- ren utgöres av cellulosa, agaros eller liknande.

10. tionen genomföres vid rumstemperatur (20-25°C) under en reaktionstid som Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att i steg (b) reak- ligger i området från 20-30 minuter.

11. ll. zoiter från P. falciparum, k ä n n e t e c k n a t av att det i krav 1 definie- Diagnostest för påvisande och mätning av antikroppar mot sporo- rade, syntetiska antigen-enzymkonjugatet och proteiner användes.