BE1000850A3 - Methode pour la determination d'anticorps antisporozoites de plasmodium falciparum dans le sang humain. - Google Patents

Abstract

Méthode immuno-enzymatique pour la détection et la mesure d'anti-corps anti-sporozoites de Plasmodium falciparum dans un sang humain et/ou dans ses dérivés, cette méthode faisant appel à un produit conjugué synthétique antigène-enzyme capable de former, avec les anticorps anti-sporozoites, un complexe stable anticorps-antigène synthétique-enzyme, ainsi qu'à une ou plusieurs protéines absorbées et/ou liées de manière colvalente sur un support solide fixant avidement l'anticorps anti-sporozoite de ce complexe.

Description

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   DESCRIPTION Methode pour la détermination d'anticorps anti-   sporozoltes   de Plasmodium   falciparum   dans le sang humain. 



   La présente invention concerne une nouvelle méthode immuno-enzymatique pour diagnostiquer 
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 la malaria dans le sang humain. 



   Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode en vue de détecter et de mesurer des anticorps anti-sporozoltes de Plasmodium falciparum dans le sang, le serum et/ou le plasma humains. 



   La malaria représente une des maladies parasitaires les plus graves et chaque année, elle frappe des centaines de millions de personnes, surtout dans les régions tropicales d'Asie, d'Afrique et   d'Amér1que,   en provoquant une haute mortalité infantile. 



   L'agent étiologique de la malaria est 
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 un protozoaire appartenant au genre Plasmodium, qui est transmis ä l'homme par la piqure du mous- tique Anophèle. 



   Parmi les centaines d'espèces de Plasmodium existant dans la nature, quatre seulement sont pathogènes pour l'homme. : Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax et Plasmodium   falciparum.   



   Ce dernier, en particulier, représente l'espèce la plus répandue et il est la cause de la plupart des états de morbidité et de mortalité associés   ä   la malaria. 

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   La détermination d'anticorps anti-   sporozoltes   dans le sang d'individus soupçonnés d'être atteints de la malaria constitue un paramètre clinique essentiel pour le diagnostic de la malaria et l'évaluation de l'efficacité d'un vaccin antimalaria. 



   En règle   generale,   on effectue le diagnostic d'infections dues   ä   la malaria par examen microscopique du sang ou par des méthodes immunologiques basées sur des mesures de fluorescence (IFA), de la radioactivité (IRMA) et de l'activité enzymatique   (EIA).   



   Toutefois, l'analyse microscopique du sang est difficile et inadéquate pour une investigation épidémiologique au cours de laquelle on examine des centaines de milliers d'échantillons. 



   De plus, on n'obtient pas des résultats très appropriés par les méthodes immunologiques IRMA et IFA qui, outre le fait qu'elles nécessitent de longues périodes de traitement, sont compliquées par les nombreuses étapes qu'elles exigent, ainsi que par l'utilisation de substances instables et nocives. pour l'homme. 



   Parmi les méthodes immuno-enzymatiques EIA, celle que l'on adopte le plus couramment est l'essai ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-SorbentAssay = dosage d'immuno-sorbants reliés à des enzymes) consistant à : a) fixer, par absorption ou par une liaison chimique covalente, un antigène naturel ou synthétique sur un support solide ; b) bloquer les sites résiduels sur le support avec une protéine appropriée ; c) incuber l'antigène lié au support avec le sérum sous investigation, et 

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 d) ajouter successivement un anticorps anti-immuno- globuline humaine lié   ä   une enzyme détectrice, ainsi qu'un substrat incolore pour l'enzyme qui, en cas de réaction positive du sérum, donne un produit coloré. 



   Bien qu'il permette d'éviter certains inconvénients des méthodes IRMA et IFA, en utilisant des substances stables et non radioactives, cet essai nécessite toutefois de longues durées de traitement (environ 6 heures), ainsi que l'utilisation de réactifs tels qu'une enzyme d'anticorps anti-immunoglobuline que l'on ne peut obtenir que moyennant des méthodes complexes et coûteuses. 



   Dès lors, dans la technique, il est nécessaire de disposer d'une méthode rapide, écono-   mique   et sensible pour établir un diagnostic et utile pour une exploration de masse dans les régions où la malaria est endémique, ou dans les régions dans lesquelles un contrôle précis doit être effectud afin de prévenir et de localiser les foyers infectieux. 



   Selon la présente invention, cette nécessite est satisfaite grace   ä   une nouvelle méthode immuno-enzymatique faisant appel à un produit synthétique conjugué antigène-enzyme capable de 
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 former, avec les anticorps anti-sporozoltes, un complexe stable anticorps-antigène-enzyme, ainsi qu'avec les protéines qui fixent avidement l'anticorps anti-sporozolte de ce complexe. 



   En consequence, la présente invention a pour objet une méthode immuno-enzymatique pour la détection et la mesure d'anticorps anti-sporo-   zoltes   de Plasmodium falciparum dans des echantillons de sang humain et/ou ses dérivés, cette méthode consistant à : incuber ces échantillons en présence 

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 d'un produit conjugue synthétique antigène-enzyme capable de former, avec les anticorps anti-sporozoltes, un complexe stable anticorps-antigène synthétique-enzyme ;

   fixer l'anticorps anti-sporozolte de ce complexe avec les protéines adsorbées ou liées de manière covalente sur un support solide et enfin, déterminer   l'activiste   enzymatique du complexe   1ié   aux protéines moyennant l'addition d'un substrat enzymatique incolore capable de donner, en cas de resultat positif, un produit colore. 



   Un autre objet de la   presente   invention est d'utiliser ce produit conjugué synthétique 
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 antigène-enzyme détectrice pour la préparation d'un nécessaire destiné ä diagnostiquer la malaria. 



   D'autres objets de la présente invention ressortiront de la lecture de la description et des exemples ci-après. 



   Le produit conjugué synthétique antigèneenzyme approprié pour la méthode selon la présente invention est formé par un polypeptide séquentiel capable de reconnaltre et de lier les anticorps anti-sporozoltes, ainsi que par une enzyme. 



   En particulier, selon la présente invention, le polypeptide séquentiel est   (Asn-Ala-Asn-  
Pro) où n a une valeur comprise dans l'Intervalle allant de 3   ä   40, de préférence, de 10 ä 20, tandis qu'il reproduit exactement le segment polypeptidique de la protéine naturelle qui entoure la membrane du sporozolte de Plasmodium falciparum. 



   La présence, dans ce polypeptide, de deux groupes chimiques fonctionnels terminaux 
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 seulement, à savoir NH2 et COOH, le rend particu- lièrement approprié pour la préparation du produit conjugué selon la présente invention, d'autant plus 

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 qu'il permet de former une liaison covalente stable entre le polypeptide et l'enzyme sans aucun préjudice pour l'activité catalytique de la même enzyme. 



   On prépare ce polypeptide sous forme pure et avec un haut rendement conformément au procédé décrit dans la demande de brevet européen publiée 209. 643 moyennant la polymérisation du polypeptide   HCl. H-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP,   dans un solvant polaire inerte et en présence d'une base organique tertiaire. 



   Les enzymes utiles pour la préparation du produit conjugué de la présente invention sont choisies parmi celles capables d'agir sur un substrat chromogène. Parmi ces enzymes, il y a, par exeniple, les peroxydases, les   0 (-galactosidases   et les phosphatases alcalines ; de préférence, on utilise les peroxydases. 



   Selon la présente invention, on prépare le produit conjugué synthétique antigène-enzyme moyennant un procédé comprenant les étapes consistant 
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 ä    :1)   oxyder l'enzyme purifiée dans une solution
O 1M de   NaHCO, par   exemple, le    métaperiodate.   de sodium,   ä   la température ambiante   (20-25OC),   ä l'obscurité et pendant environ 2 heures ; 2) ajouter, à cette solution, le polypeptide dissous dans NaHC03 (pH :   9, 2)   dans un rapport molaire polypeptide/enzyme d'environ 40/1 et maintenir la solution obtenue au repos à la température 
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 ambiante et ä l'obscurité pendant environ 16 heures ;

   3) ajouter, à la solution obtenue, agent réducteur tel que, par exemple, , enfin 4) séparer le produit conjugué   polypeptide/enzyme.   



   En particulier, selon une forme de réali- 

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 sation pratique de la présente invention, on prepare un produit conjugue dans lequel le polypeptide est (Asn-Ala-Asn-Pro)17, tandis que l'enzyme est uneperoxydase. Le degré de conjugaison, c'est- à-dire le. rapport molaire du polypeptide à l'enzyme dans ce produit conjugué, est de   0, 9-0, 92, soit   une valeur proche de la valeur escomptée   (1)   pour le produit conjugué pur. 



   L'activité spécifique de la peroxydase, déterminée par spectrophotométrie   ä   405 nm comme indiqué par H. Galloti (1979), J. Clin. Chem. 



  Clin. Biochem. 17,1-7, est de 75% de celle de l'enzyme non conjuguée. 



   Selon la méthode de la présente invention, on incube ce produit conjugué dans une solution tampon pendant environ 20-30 minutes avec un chantillon de sang humain complet, de sérum humain ou de plasma. 



   Ensuite, on incube le mélange réactionnel pendant une période supplémentaire de 20   ä   30 minutes sur un support solide sur lequel la protéine A est adsorbée et/ou liée de manière covalente. 



   On sait que cette protéine fixe avidement les immunoglobulines humaines,   ä   l'exception'de 
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 IgM et IgG, bien qu'elle forme un complexe j stable avec   l'anticorps anti-sporozolte lie   au produit conjugue antigène-enzyme. 



   Parmi les supports solides utiles pour la méthode selon la présente invention, il y a les polysaccharides tels que la cellulose et l'agarose, de même que les matières plastiques. 



   Au terme de la réaction et après des lavages appropriés, aux   mé1anges,   on ajoute une solution contenant le substrat enzymatique chromogene et H202 et, après 2-3 minutes, on observe le 

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 développement chromogène. 



   Dans le cas où l'on analyse du sang complet, avant d'etre ajouté   ä   la protéine A, le mélange initial est soumis à une centrifugation ou   ä   une filtration afin d'éliminer les matieres en suspension. 



   La valeur seuil, c'est-à-dire la quantité minimale de sérum positif donnant   lieu'a   un developpement chromogène visible ä l'oeil nu, était respectivement égale à   0, lul   et   0, 4 fil   pour deux sérums ayant fait l'objet d'investigations. 



   De plus, on n'observe aucun développement chromogène pour l'essai témoin, lequel est constitué du mélange contenant le produit conjugue sans l'échantillon de sang et/ou ses derives, concernant le sérum et le plasma de personnes saines, du sang complet non atteint de malaria, hémolysé ou non, de meme que concernant les Y-globulines (Globuman-Bern). 



   Ceci indique une absence complete d'interférences dans la méthode selon la   presente   invention. 



   La possibilité d'effectuer une operation rapide environ 60 minutes comparativement ä la période de 6 heures nécessaire selon l'essai ELISA, de même que l'utilisation d'un petit nombre de réactifs, c'est-ä-dire le produit conjugué antigène-enzyme et les protéines uniquement, constituent un avantage particulier de la méthode selon la présente invention. 



   De plus, un avantage considerable de cette méthode réside dans la possibilité de determiner et de mesurer les anticorps anti-sporozoltes dans du sang complet. Ceci est du à la haute stabilité du produit conjugué de la présente invention, comparativement aux protéases contenues dans le 

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 sang. 



   De plus, la méthode selon la présente invention est absolument spécifique et, en fait, tous les échantillons qui se sont avérés etre positifs selon les essais IRMA, IFA et ELISA, lorsqu'ils ont été analysés par la méthode selon la présente invention, ont confirmé leur nature positive. 



   En consequence, la méthode selon la présente invention est particulièrement appropriée pour une étude épidémiologique de la malaria et, en particulier, pour l'exploration de masse des infections dues ä la malaria dans des régions manquant d'unites et de structures sanitaires. 



   Les exemples expérimentaux ci-après illustrent la présente invention sans aucunement la limiter. 



    EXEMPLE. 1    Préparation du produit conjugué   (Asn-Ala-Asn-Pro)---   peroxydase
On a purifié l'enzyme peroxydase (Sigma) et on l'a lyophilisée avant de la conjuguer avec le peptide. 



   Ensuite, on a dissous 10 mg de l'enzyme pure   (E)   dans 1 ml de NaHC03   0, 1M   et on a procédé   ä   une oxydation avec 1 ml de NaI04 16mM   (meta-   periodate de sodium) ä la température ambiante (20-250C), à l'obscurité et pendant 2 heures. 



   Au terme de cette période, au mélange réactionnel, on a   ajoute l   ml de   NaHCO3   (pH : 9,   2)   contenant 70 mg de    (Asn-Ala-Asn-Pro) 17-peptide   
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 (P) dans un rapport molaire peptide/enzyme égal à. 40/1. 

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   On a transféré quantitativement le   melange   ainsi obtenu ä l'intérieur d'une pipette de Pasteur fermée à ses extrémités avec de la laine de verre et on y a ajoute 500 mg de"Sephadex (marque commerciale déposée)   G-25"   ("Pharmacia Uppsala") en poudre ; on a ensuite laissé la pipette au repos à la temperature ambiante et à l'obscurité pendant une période   supplementaire   de 16 heures. 



   Au mélange réactionnel   elue   de la pipette, on a ajoute 150   ul   de NaOH   0, lmM contenant   5 mg/ml de NaBH4 et, 30 minutes plus tard, on y a ajouté 
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 450 ul de la même solution. 



   Après environ 1 heure, on a équilibré le   melange   contenant le produit conjugué enzymepeptide (E-P), ainsi que l'enzyme (E) et le peptide (P) n'ayant pas réagi, avec un tampon d'acetate de sodium 5mM   (pH   : 4, 4) dans une colonne de "Sephadex G-10" préalablement équilibrée avec le même tampon. On a ensuite   Charge   le mélange dans une colonne (0, 9 x 10 cm) de carboxymethylcellulose (CM-cellulose), équilibrée avec un tampon d'acétate de sodium   5mM     (pH   : 4, 4) et on a élué avec un tampon d'acétate de sodium 65mM   (pH   : 4, 4), puis on a dessalé dans une colonne de "Sephadex   G-10" équilibrée   avec de l'eau distillée. On a lyophilisé l'eluat contenant le composé E-P et l'enzyme n'ayant pas réagi. 



     0n   a élué préalablement le peptide n'ayant pas réagi avec le tampon chargé et on a analysé son intégrité par le spectre d'absorption des rayons infrarouges. 



   Les résultats obtenus ont révélé un même spectre pour le peptide élué et pour le peptide utilise comme matière première. Dès lors, il a été possible de conclure qu'il ne s'était produit 

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 aucune altération dans le peptide au cours de la réaction de conjugaison et que, partant, le peptide   1ié   à l'enzyme n'était nullement détérioré. 



   Le degré de conjugaison E-P, c'est-àdire le rapport molaire du peptide à l'enzyme dans le produit conjugué, a été déterminé en   calcu-   lant l'accroissement des résidus des amino-acides Asn, Ala et Pro dans le mélange contenant E-P + E libre, par rapport   ä   l'enzyme initiale E. 
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  Après hydrolyse acide de E-P + E et E avec HC1 6N ä 1000C pendant 24 heures, ä l'inté- rieur d'ampoules scellées, on a effectué l'analyse des amino-acides au moyen d'un analyseur automatique d'amino-acides de Beckman. 



   Puisque la composition en amino-acides des deux isoenzymes de peroxydases (B et C) présentes dans E initiale est connue (Shannan   L. M.   et   al.,   1966, J. Biol. Chem. 241, 2. 166), il a été possible de calculer, pour un rapport molaire   E : P   de 1 correspondant au produit conjugué pur E-P, un accroissement théorique de 63%, 68% et 100% respectivement pour Asp, Ala et Pro. 



   Pour les amino-acides précités, on a trouvé des incréments de 58%, 62% et 90%, ce qui correspond ä un rapport molaire E : P de 0, 90-0, 92, soit à peu près le rapport calculé pour le produit conjugué pur. 



   L'activité spécifique résiduelle de l'enzyme peroxydase liée au peptide, déterminée par spectrophotométrie à 405 nm avec ABTS 1, 7 mM (acide   2, 2'-azino-di- (3-éthyl-benzothiazolyl-sulfo-   nique)) et H202 0, 83 mM dans un tampon de phosphate 50 mM, pH 6, 0 (H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. 



  Biochem. 17,1-7, 1979), était   ä   peu près égale   ä   75% de celle de l'enzyme initiale. 

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   EXEMPLE 2
Pour cet essai, on a utilisé 8 sérums de sujets atteints de malaria, le sérum   héparinisé   de quatre donneurs sains, le sérum de 3 personnes saines et un échantillon de sang complet de sujet atteint de malaria, en mélangeant, dans un rapport en volume de 1 : 1, le sérum des sujets atteints de malaria avec le sang complet hémolysé et non 
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 hémolysé d'une personne saine. 



   A 100   ul   d'un tampon de phosphate 10 mM, pH :   7, 5,   contenant du   NaCl   0, 15M, 0, 05% de   "Tween-20"   (PBS-T) et 200 ng du produit conjugué E-P, on a ajouté : 1 à 5   ul   de sang, de plasma ou de sérum de personnes saines ; ou 10   ul   de PBS-T contenant respectivement   0, 05 ; 0, 1 ; 0, 2 ;     0,   4   ; 0, 8 ; 1, 6   et   3, 2 fil   de sérum provenant de personnes atteintes de la malaria. 



   On a laissé les solutions au repos   ä   la température ambiante pendant 15-20 minutes. 



   Dans le cas du sang complet, on a centrifugé ou filtré la solution afin d'éliminer les matières en suspension. 



   Ensuite, on a transféré ces solutions à   l'Interieur   de bouts de micropipettes   su matière   plastique incolore et transparente contenant, ä leur   extrémité.   de la laine de verre et, sur celle-ci,   on   on a déposé un lit constitue d'une quantité d'environ 6   fl   d'"A Protein-Sepharose 
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 CL-4B" ("Pharmacia avec PBS-T. 



   On a soumis les solutions   ä   une percolation par gravité au cours d'une période de 20   ä   30 minutes, on a lavé trois fois les microcolonnes en utilisant chaque fois 200   ul   de PBS-T et deux fois en utilisant chaque fois 200   ul   de PBS (tampon 

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Ensuite, dans chaque microcolonne, on a ajouté 200   ul   d'une solution de substrat de 4-chloro-l-naphtol (Biorad) et de   Hop, préparée   en mélangeant, au moment de l'utilisation, 1 partie en volume de 4-chloro-l-naphtol (Biorad) (3 mg/ml dans du méthanol froid) et on a ajouté 5 parties en volume d'une solution de 6   ? 1   de H2O2 à 30% (volume/volume)   ä   10 ml de PBS.

   Après 2-3 minutes, on a observé le développement d'une couleur bleu foncé pour les échantillons positifs. 



   La valeur seuil, c'est-à-dire la quantité minimale de sérum positif donnant une bande bleue aisément visible, résultait des valeurs de 0, 1   ut-0, 4 nul   pour deux sérums positifs soumis   ä   l'essai. 



   On a vérifié la spécificité de l'essai sur un sérum positif provenant de sujets atteints de malaria (développement d'une bande bleue avec E-P) en utilisant, dans un essai, 200 ng d'enzyme libre sans E-P ; dans un autre essai, on a utilisé un important excès   (3     ug)   (environ 100 fois) de P libre en compétition avec le produit conjugué E-P de la présente invention (200 ng). 



   Au terme de la réaction, on   n'a observe   aucun développement chromogene. 



   De plus, dans la microcolonne, on n'a observe aucun développement chromogène pour le témoin forme par le mélange réactionnel avec E-P sans addition de sang, de sérum ou de plasma ; pour le sérum ou le plasma de personnes saines ; pour le sang complet de sujets non atteints de malaria ; ou pour des If-globulines humaines   (Globuman-Berne)   soumises   ä   un essai en une quantité équivalant   ä   environ 6   ul   de sérum. 

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   Ceci indique une absence complète d'inter-   férences   dans l'essai dans lequel on utilise le produit conjugué E-P. 



   La stabilité de l'enzyme peroxydase .. liée au peptide E-P a été déterminée par voie spectrophotométrique (en établissant des tracés)   ä   des périodes se situant entre 0 et 2 heures, ä partir d'une solution de PBS-T (100   ul)   contenant
200 ng de E-P, solution à laquelle on avait ajouté des échantillons de sérum ou de plasma. 



   Après 2 heures, les résultats obtenus ont révélé une activité inchangée de peroxydase.

Claims (1)

1. REVENDICATIONS 1. Méthode pour la détermination et la mesure d'anticorps anti-sporozoltes de Plasmodium falciparum dans des échantillons de sang humain et/ou ses dérivés, caractérisée en ce que : a) on incube ces échantillons avec un produit conjugué synthétique antigene-enzyme capable de former, avec les anticorps anti-sporozoltes présents dans l'échantillon, un complexe stable anticorps-antigene synthétique-enzyme sans neutraliser l'activiste enzymatique ; b) l'anticorps de ce complexe est lié aux protéines adsorbées par et/ou liées chimiquement à un support solide, et enfin c) l'activité enzymatique du complexe lié aux protéines est déterminée moyennant l'addition d'un substrat enzymatique incolore capable de donner, en cas de résultat positif, un produit colore.

   2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antigene synthétique est le polypeptide séquentiel : (Asn-Ala-Asn-Pro) où n a une valeur comprise dans l'intervalle se situant entre 3 et 40, tandis que la protéine EMI14.1 est la protéine A.

   3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que n a une valeur se situant dans l'intervalle allant de 10 ä 20.

   4. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'enzyme est choisie parmi le groupe comprenant les enzymes capables de donner lieu ä une réaction colorimétrique avec un substrat spécifique.

   5. Méthode selon la revendication 4, <Desc/Clms Page number 15> caractérisée en ce que l'enzyme est une peroxydase et/ou une phosphatase alcaline.

   6. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on prépare le produit conjugué EMI15.1 en faisant réagir, en phase homogène dans NaHC03' j à la temperature ambiante (20-25 C) et ä l'obscurité, l'enzyme oxydée avec un exces molaire du polypeptide (Asn-Ala-Asn-Pro) où n a les significations men- EMI15.2 tionnées ci-dessus.

   7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que le rapport molaire du polypeptide ä l'enzyme dans le produit conjugué est EMI15.3 égal ou ä peu près égal à 0, 92.8. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que, lors de l'étape (a), la réaction est effectuée ä la température ambiante (20-25 C) pendant un temps de réaction se situant EMI15.4 dans l'intervalle compris entre 15 et 20 minutes.

   9. Methode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support solide est polysaccharide ou une matière plastique.

   10. Méthode selon la revendication l, caractérisée en ce que les supports de polysaccharides sont la cellulose, l'agarose et analogues.

   11. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que, lors de l'étape (b), la réaction est effectuée à la température ambiante (20-25 C) pendant un temps de réaction se situant dans l'Intervalle compris entre 20 et 30 minutes.

   12. Nécessaire pour diagnostic en vue de déterminer et de mesurer des anticorps anti- sporozoltes Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'on utilise le produit conjugué synthétique antigène-enzyme défini dans la revendication 1, ainsi que des protéines.