DE68908814T2 - Immunoenzymatischer Elisatest auf einer Einzelplatte mit kompetitiver Inhibition zum Nachweis von Antisporozoit-Antikörpern von Plasmodium Falciparum. - Google Patents
Immunoenzymatischer Elisatest auf einer Einzelplatte mit kompetitiver Inhibition zum Nachweis von Antisporozoit-Antikörpern von Plasmodium Falciparum.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Enzym-Immun-Verfahren für die Verwendung zum Diagnostizieren von durch Malaria-Parasiten im Menschen induzierten Infektionen. Im spezielleren betrifft die Erfindung ein Enzym-Immun-Einzelplatten-ELISA-Verfahren mit kompetitiver Hemmung für den Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozoiten von Plasmodium falciparum in Humanblut und in Moskito-Extrakt.
- Malaria, welche eine der schwersten Parasiteninfektionen des Menschen ist, wird durch ein Protozoon der Gattung Plasmodium verursacht, welches sich - einem vielstufigen Zyklus folgend -, teilweise in dem Wirtswirbeltier (dem Menschen) und teilweise in dem Moskito-Überträger entwickelt.
- Die Infektion beginnt im Menschen dadurch, daß die Anopheles-Stechmücke (Moskito) die Sporozoiten-Form des Plasmodiums injiziert.
- Die hauptsächlichen Plasmodium-Spezies, welche im Menschen Malaria induzieren, sind: Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum.
- Insbesondere diese letztgenannte Spezies stellt die am weitesten verbreitete Spezies dar, und es ist auch diejenige Spezies, weiche den Großteil der mit dieser Infektion verbundenen Morbidität und Mortalität hervorruft.
- Die Malaria ist derzeit stark im Ansteigen begriffen, insbesondere in den tropischen Zonen von Asien, Afrika und Amerika, und zwar wegen des Auftauchens und des ungeregelten Ausbreitens von arzneimittelresistenten Parasiten und wegen der Verschlechterung in den Kontrollsystemen, woraus sich eine Zunahme in den Kosten der Eliminierungsprogramme ergibt.
- Ein wesentliches Element bei der Durchfuhrung einer Anti-Malaria-Kampagne besteht darin, vor und während einer solchen Kampagne sowie an deren Ende Informationen über das Auftreten der Infektion zu gewinnen.
- Dies erfordert daher die Verfügbarkeit eines diagnostischen Verfahrens, welches für Großuntersuchungen geeignet ist, und welches zugleich ein hohes Ausmaß an Empfindlichkeit aufweist. Auf diesem Gebiet besteht auch ein großer Bedarf nach einem Verfahren für den Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozoiten in einer Moskito-Extrakt-Probe, nämlich in einer Probe, welche durch Ausdrücken des Hinterleibes und Absorbieren desselben auf Papier gewonnen worden ist. Dies würde es tatsächlich ermöglichen, das Ausbreiten des als Überträger fungierenden Moskitos leicht zu verfolgen, wodurch epidemiologische Untersuchungen über den Überträger als solchen vereinfacht werden.
- Auf diesem Gebiet sind zum Diagnostizieren von Malaria im Menschen Verfahren durch mikroskopische Untersuchung von Blutproben oder durch immunologische Tests auf der Basis von Fluoreszenzmessungen (IFA) [Nardin, E.H. et al. (1979), Bull, WHO, 57 (Beil.1), 211 - 217] und auf Grund von Messungen der Radioaktivität (IRMA) [Zavala,F. et al. (1985) Science, 228, 1436] bekannt. Diese bekannten Verfahren sind jedoch kaum geeignet für epidemiologische Untersuchungen, bei welchen hunderttausende Proben untersucht werden, und zwar hauptsächlich wegen der Zeit, die für die Durchführung des jeweiligen Tests erforderlich ist, und wegen der Verwendung von sehr wenig stabilen oder von sehr schädlichen Substanzen, wie z.B. fluoreszierenden Substanzen und radioaktiven Isotopen.
- Daher sind auf diesem Gebiet diagnostische Verfahren vorgeschlagen worden, welche die Verwendung solcher Substanzen ausschließen, und welche im wesentlichen auf der Verwendung von Enzymen zum Katalysieren einer kolorimetrischen Reaktion basieren (EIA).
- Von diesen Verfahren ist das am häufigsten für die Feststellung von Malaria im Menschen verwendete das ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)-Verfahren, wie z.B. das von Zavala F. et al. [(1985) Fed. Proc. 44, 980] und von Del Giudice G. et al. [(1987) J.Clin.Microbiol. 25, 91 - 96] beschriebene. In dieser letztgenannten Schrift ist spezifisch ein ELISA-Test beschrieben, welcher das Adsorbieren des synthetischen (NANP)&sub4;&sub0;-Antigens an den Vertiefungen von Platten, das Blokkieren der restlichen Bindungsstellen der Platte mit einem inerten Protein und das Hinzufügen des zu untersuchenden Serums zu den Vertiefungen umfaßt.
- Das Verfahren wird dann fortgesetzt, indem man zu den Vertiefungen der Platte nacheinander einen an ein Detektor-Enzym gebundenen Anti-Human-Immunglobulin-Antikörper und ein spezifisches, farbloses Substrat für das Enzym hinzufügt, was dann, wenn das Serum positiv ist, zu einem gefärbten Produkt führt, welches spektralphotometrisch bewertet werden kann. Das Verfahren wird unter Verwendung von zwei Platten durchgeführt, von denen die eine in der beschriebenen Weise behandelt wird, und von denen die andere nur mit dem inerten Protein (Blockierungsprotein) behandelt wird. Obwohl mit diesem Verfahren viele der mit dem bekannten Stande der Technik verbundenen Probleme überwunden werden, so haften ihm dennoch noch immer Nachteile an, welche sich daraus ergeben, daß die Notwendigkeit besteht, mit zwei Platten zu arbeiten.
- Diesbezüglich hängt der spezifische Wert für eine Probe in diesem Test, welcher Wert durch den Unterschied in der dekadischen Extinktion zwischen zwei Platten definiert wird, sehr stark von der Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit der Träger und demzufolge von der Adsorption des synthetischen Antigens und des Proteins ab.
- Dies kann zu einer gewissen Anzahl von "falschen Negativbewertungen" führen, während irgendwelche Unterschiede zwischen den Vertiefungen in der Mikrotiterplatte, welche für ein und dieselbe Probe verwendet werden, zu "falschen Positivbewertungen" führen können. Außerdem bringt die Verwendung von Platten, welche eine beträchtliche Zeit vor ihrer Verwendung mit einem inerten Protein vorbehandelt worden sind, wegen des möglichen Abbaues des Proteins als solchem Stabilitäts- und Konservierungsprobleme mit sich. Nochmals erwähnt sei, daß dieser ELISA-Test auf Serumproben und nicht auf Vollblutproben oder auf Moskito-Extrakte anwendbar ist.
- Daher sind auf diesem Gebiet andere Enzym-Immun-Tests zur Bestimmung von Antikörpern gegen die Sporozoiten von P.falciparum vorgeschlagen worden, welche im wesentlichen auf der Verwendung von Spezialträgern oder Spezialreagentien oder Spezialarbeitsbedingungen basieren.
- So ist z.B. in der GB-A-21 99 140 ein als P-E/SPA bezeichnetes ELISA-Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern gegen die Sporozoiten von P.falciparum beschrieben, bei welchem ein Protein verwendet wird, welches befähigt ist, die Antikörper gegen die Sporozoiten irgendeines Komplexes aus Antikörper-synthetischem Antigen-Enzym, welcher in der Probe vorhanden sein kann, spezifisch zu binden, wobei dieses Protein an einen unlöslichen festen Träger, wie z.B. Sepharose, gebunden ist. Dieses Verfahren ist jedoch mit Nachteilen behaftet, welche sich daraus ergeben, daß teure Harze verwendet werden.
- Die am 15.11.89 veröffentlichte EP-A-0 341 767 bezieht sich auf ein Enzym-Immun-Verfahren (P-E/PEG), bei welchem in der homogenen Phase mit einem Konjugat aus synthetischem Antigen und Enzym und mit einer inerten Substanz gearbeitet wird, welche befähigt ist, den Komplex aus markiertem Antikörper gegen die Sporozoiten von P.falciparum/synthetischem Antigen/Enzym quantitativ zu präzipitieren. Obwohl dieses Verfahren sehr empfindlich und spezifisch ist, ist es der Arbeitsweise nach sehr mühsam, und es ist daher für epidemiologische Untersuchungen nicht sehr gut geeignet. In der WO-A-84/02472 ist ein ELISA-Verfahren für den Nachweis von Plasmodium falciparum beschrieben, welches die Verwendung von einer einzelnen Mikrotiterplatte umfaßt, welche nur mit einem immunogenen Polypeptid von P.falciparum beschichtet ist. Dort wird Triton X-100 (eingetragene Handelsmarke) zum Löslichmachen der Zellstrukturen und der Proteinkomponenten der Malaria-Parasiten in einem Verfahren zur Herstellung von Polypeptidfraktionen verwendet, welche befähigt sind, die Bildung von Malaria-Antikörpern zu induzieren.
- Demzufolge wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Enzym- Immun-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozoiten von P.falicparum in einer Human-Blutprobe und in dem Moskito-Überträger vorgeschlagen, welches Verfahren von den obgenannten Nachteilen frei oder doch im wesentlichen frei ist. Dieses Ziel wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch ein Enzym-Immun-ELISA-Verfahren mit kompetitiver Hemmung erreicht, bei welchem Verfahren eine Einzelplatte verwendet wird, welche nur mit dem synthetischen Antigen (NANP)&sub2;&sub0; vorbehandelt worden ist, wobei als kompetitiver Gesamtinhibitor für die Komplexbildung zwischen dem an der Platte adsorbierten, synthetischen Antigen und dem in der Probe enthaltenen Antikörper das synthetische Peptid (NANP)&sub2;&sub0; in einem Gewichtsverhältnis von wenigstens 20:1, bezogen auf das adsorbierte Antigen, verwendet wird. Mit diesem Verfahren werden Probleme hinsichtlich des unspezifischen Untergrundes selbst in dem Fall von vollständig hämolysierten Vollblutproben in vorteilhafter Weise reduziert, und außerdem kann das positive oder negative Ergebnis der zu untersuchenden Probe nach nur einigen wenigen Minuten der abschließenden Enzymreaktion gesehen werden, wobei "falsche Positivbewertungen" oder "falsche Negativbewertungen", welche auf die Nicht-Gleichförmigkeit der Platten zurückzuführen sind, vermieden werden. Demzufolge besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Schaffung eines Enzym-Immun-Einzelplatten-ELISA-Verfahrens mit kompetitiver Hemmung zum Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozciten von P.falciparum in Human-Blutproben und in Moskito-Extrakten. Ein weiteres Ziel der Erfindung liegt in der Schaffung eines diagnostischen Kits zum Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozoiten von P.falciparum in einer Human-Blutprobe oder in einem Moskito-Extrakt, nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, welcher eine nur mit dem Antigen (NANP)&sub2;&sub0; vorbehandelte Platte und eine mit TRIS gepufferte Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens enthält. Weitere Ziele der Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der Beschreibung und der nachstehenden Beispiele.
- Spezifisch umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Stufen:
- (a) Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit dem synthetischen Antigen (NANP)&sub2;&sub0;, worin N Asparagin ist, A Alanin ist und P Prolin ist, durch Inkubieren der Platte über Nacht in einer feuchten Kammer, bei einer Temperatur von 20ºC bis 25ºC,mit 0,1 ml/Vertiefung von 1 ug/ml-(NANP)&sub2;&sub0;- Lösung in der TRIS gepufferten Kochsalzlösung (TBS);
- (b) Waschen der Platte mit TRIS gepufferter Kochsalzlösung (TBS) zum Entfernen des locker gebundenen synthetischen Antigens;
- (c) Hinzufügen von TRIS gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens zu jeder Vertiefung der Platte;
- (d) Inkubieren der Platte bei einer Temperatur von 20ºC bis 37ºC während wenigstens 30 min;
- (e) Hinzufügen einer aliquoten Menge einer Probe, welche aus Vollblut, Serum, Plasma, und einem Moskito-Extrakt ausgewählt ist, welcher letztgenannte mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt an einem Protease-Inhibitor extrahiert worden ist, und wobei diese Probe mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens verdünnt worden ist,zu jeder von vier benachbarten Vertiefungen der Platte der Stufe (c);
- (f) Einbringen des synthetischen Peptides (NANP)&sub2;&sub0;, entweder vor der verdünnten Probe, oder zugleich mit derselben, in einem Mindestgewichtsverhältnis von 20:1 in bezug auf das adsorbierte synthetische Antigen, in zwei dieser Vertiefungen;
- (g) Inkubieren der Platte bei einer Temperatur von 20ºC bis 37ºC während einer Zeitspanne von 30 min bis 60 min;
- (h) Waschen der Platte mit einer mit TRIS gepufferten Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens;
- (i) Hinzufügen eines Antikörper/Anti-Human-Immunglobulin/Enzym-Konjugates, welches in einer mit TRIS gepufferten Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens verdünnt worden ist, zu jeder Vertiefung der Platte;
- (j) Inkubieren der Platte bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 30 min bis 60 min;
- (k) Waschen der Platte mit einer mit TRIS gepufferten Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens;
- (l) Waschen der Platte mit einer mit TRIS gepufferten Kochsalzlösung (TBS);
- (m) Hinzufügen einer farblosen Substratlösung, welche spezifisch für das Enzym des in der Stufe (i) verwendeten Konjugates ist, zu jeder Vertiefung;
- (n) Inkubieren der Platte während einer Zeitspanne von 10 min bis 60 min; und
- (o) Feststellen des spezifischen Wertes für jede Probe durch den Unterschied in der dekadischen Extinktion zwischen der nicht-gehemmten und der vollständig gehemmten Probe.
- In der Stufe a) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die Mikrotiterplatte nach generell bekannten Verfahren vorbehandelt.
- In der Praxis wird das Peptid (NANP)&sub2;&sub0;, welches wie in der EP-A-0 209 643 beschrieben synthetisiert worden ist, nämlich durch Polykondensation von (NANP) und Isolieren derjenigen Fraktion, welche das dem (NANP)&sub2;&sub0; entsprechende Nolekulargewicht aufweist, in TBS-Puffer (0,02M Tris-HCl, 0,15M NaCl, vom pH 7,8) oder in PBS-Puffer (0,01M Natriumphosphat, 0,15M NaCl, vom pH 7,8) auf eine Endkonzentration von 1 ug/ml aufgelöst. Ein aliquoter Anteil dieser Lösung wird dann in alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eingebracht, welche letztgenannte aus den im Handel erhätlichen ausgewählt wird.
- Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugten Platten sind DYNATECH-Platten (DYNATECH, Alexandria, Va, USA) von mittlerem Adsorptionsvermögen, welche eine Reduzierung des unspezifischen Untergrundes ermöglichen, welcher letztgenannte durch Adsorption der Blutkomponenten und des zu reduzierenden Enzymkonjugates an die Platte verursacht wird.
- Die Platten werden dann bei Umgebungstemperatur (20 bis 25º) während der für das Adsorbieren des (NANP)&sub2;&sub0;-Peptides an den Wänden der Vertiefungen erforderlichen Zeitspanne in einer feuchten Kammer gehalten. Die Platte wird dann mit TBS- oder PBS-Puffer gewaschen, um das überschüssige Peptid zu entfernen, und falls die Platte nicht sofort verwendet wird, wird sie dann in einem Ofen bei 37ºC während etwa 1 h getrocknet und in einem geschlossenen Behälter bei 4ºC gelagert.
- im Vergleich zu einer Platte, welche mit dem Peptid und dem inerten Protein behandelt worden ist, hat eine nur mit dem synthetischen Peptid vorbehandelte Platte die Vorteile der Gleichförmigkeit und einer längeren Lagerungsbeständigkeit.
- In der Stufe c) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die vorbehandelte Platte durch ein Gemisch von Puffer, Protein und Detergens aktiviert. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Komponenten dieses Gemisches so ausgewählt, daß das entstandene Gemisch befähigt ist, den unspezifischen Untergrund so weitgehend wie möglich zu reduzieren, und dem Enzym-Immun- Assay eine hohe Empfindlichkeit zu verleihen, daß dieses Gemisch aber nicht in der Lage ist, während der Ausführung des Verfahrens das an der Platte adsorbierte (NANP)&sub2;&sub0;-Antigen abzutrennen.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, daß ein aus TBS-Puffer, Casein und einem nicht-ionischen Detergens gebildetes Gemisch, welches Detergens aus Triton X-100 , Tween-20 , NONIDET P-40 und Bry 35 ausgewählt ist, diese Eigenschaften besitzt
- Vorzugsweise besteht das Gemisch, welches zum Aktivieren der Platte, zur Verdünnung der Probe und des Enzym-Konjugates sowie für die Waschvorgänge verwendet wird-aus TBS-Puffer, Casein (0,5% (Gew./Vol.)) und Triton X-100 (0,1% (Vol./Vol.))
- Bei Vergleichsuntersuchungen ist festgestellt worden, daß das Detergens Triton X-100 (TX100) zwar Vollblutproben hämolysiert, daß es aber zu keinerlei Problemen hinsichtlich eines unspezifischen Untergrundes Anlaß gibt.
- Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann zu diesem Gemisch Polyethylenglykol-6000 (PEG-6000) in einer Konzentration von 2 % (Gew./Vol.) zugegeben werden.
- Dies ermöglicht in vorteilhafter Weise eine Verringerung der für die Durchführung des Tests erforderlichen Zeit um etwa 1 h. Die Platte wird dadurch aktiviert, daß man zu jeder Vertiefung einen aliquoten Anteil dieses bevorzugten Gemisches hinzufügt, und daß man bei einer Temperatur zwischen 20 und 37ºC wahrend einer Zeitspanne von wenigstens 30 min verfährt (gemäß Stufe d)).
- In den Stufen e) bis h) des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung werden die zu untersuchenden Proben unter der Verwendung der gleichen aktivierten Platte, wie dieselbe in den Stufen c) und d) beschrieben ist, durch totale kompetitive Hemmung mit (NANP)&sub2;&sub0; analysiert.
- Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können die verwendeten Proben Serum, Plasma, Vollblut (als solches oder als Extrakt auf Papier), einschließlich eines völlig hämolysierten Blutes, oder ein Moskito-Extrakt auf Papier sein. Die Proben werden in geeigneter Weise mit dem Gemisch aus TBS/Casein/TX-100 , unter möglicher Zugabe von PEG-6000, verdünnt, und sie werden dann in alle Vertiefungen eingebracht, ausgenommen jene, welche für das Leersubstrat reserviert sind. Typischerweise werden Human-Serum- und Plasma-Proben im Verhältnis von 1:100 oder 1:200 verdünnt, während Vollblutproben im Verhältnis von 1:50 oder 1:100 verdünnt werden. Der Moskito-Extrakt, welcher aus dem auf Filterpapier ausgequetschten und getrockneten Moskito-Hinterleib besteht, wird unter Kältebedingungen (4ºC) mit 0,5 bis 0,6 ml des Gemisches aus TBS/Casein/TX-100 , welches einen Protease-Inhibitor, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), enthält, extrahiert und dann analysiert.
- In der Praxis werden - mit Ausnahme der ersten vertikalen Kolonne der Platte, welche für das Leersubstrat reserviert ist -, vier aliquote Mengen von ein und derselben Probe in vier benachbarte Vertiefungen in einer vertikalen Kolonne eingebracht, wobei die letzten zwei dieser Vertiefungen für die Hemmung durch das Peptid (NANP)&sub2;&sub0; reserviert sind.
- Dieser Inhibitor kann in die für die Hemmung vorgesehenen Vertiefungen entweder zugleich mit der zu untersuchenden Probe, oder vorzugsweise noch vor dieser Probe, eingebracht werden (Stufe f)).
- Erfindungsgemäß ist die dabei verwendete Menge dieses Peptides eine solche, daß deren Gewichtsverhältnis zu dem an der Platte adsorbierten, synthetischen Peptid (NANP)&sub2;&sub0; wenigstens 20:1 beträgt.
- Die Platte wird während einer Zeitspanne zwischen 30 und 60 min auf einer Temperatur zwischen 20 und 37ºC gehalten. (Stufe g)).
- Die Platte wird dann mit dem Gemisch aus TBS/C/TX-100 , zu welchem PEG-6000 möglicherweise zugesetzt worden ist, gewaschen.
- Generell werden drei oder vier Waschvorgänge durchgeführt, von denen ein jeder etwa 3 min dauert. (Stufe h)).
- In der Stufe i) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das enzymatische Antikörper/Anti-Human-Immunglobulin/Enzym-Konjugat, welches in geeigneter Weise mit dem Gemisch aus TBS/Casein/TX-100 verdünnt worden ist, in die Vertiefungen eingebracht, welche die zu untersuchende Probe enthalten.
- Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Enzyme können aus jenen ausgewählt werden, welche generell in einem diagnostischen Enzym-Immun-Assay verwendet werden. Beispiele solcher Enzyme sind Peroxidase, alkalische Phosphatase und Glucoseoxidase.
- Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das Peroxidase-Enzym bevorzugt, weil es die spezifische Empfindlichkeit des betreffenden Tests sowohl hinsichtlich der spezifischen dekadischen Extinktion als auch hinsichtlich der "Sichtbarkeit" des Ergebnisses als entwickelte Farbe erhöht. Erfindungsgemäß wird ein im Handel erhältliches Peroxidase-Konjugat verwendet, welches im Verhältnis von 1:3000 in dem Gemisch aus TBS/Casein/TX-100 oder TBS/Casein/TX-100 -PEG-6000 verdünnt worden ist. Die in dieser Weise behandelten Platten werden während einer Zeitspanne zwischen 30 und 60 min auf einer Temperatur zwischen 20 und 37ºC gehalten (Stufe j). Die Platten werden dann zuerst mit dem Puffergemisch und dann mit dem Puffer allein gewaschen, um das restliche Casein zu entfernen (Stufen k) und l)).
- In diesen Stufen wird ein farbloses Enzym-Substrat, welches spezifisch für das verwendete Enzym ist, zu jeder Vertiefung hinzugefügt, wobei dieses Substrat generell aus ABTS (2,2'- Azino-di-(3-ethyl-benzothiazolin)-sulfonat, TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin), NPP (Nitrophenylphosphat), Phenolphthaleinphosphat oder 5-BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) ausgewählt wird.
- Insbesondere kann das Substrat bei Verwendung des Peroxidase- Konjugates ABTS oder TMB sein. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß das Substrat ABTS verwendet, weil es eine leichtere Bewertung des Farbunterschiedes (grün - blau) zuläßt, der sich zwischen der ungehemmten Probe und der gleichen, durch das (NANP)&sub2;&sub0; gehemmten Probe in den benachbarten Vertiefungen entwickelt hat. In der Praxis kann dieses Substrat in einem 0,1M Acetat-Puffer vom pH 5,0 mit einem Gehalt an H&sub2;O&sub2; (1,3 mM) in einer Konzentration von 1,1 mg/ml aufgelöst werden.
- 1 aliquoter Anteil dieser Lösung wird dann in jede Vertiefung eingebracht, und die behandelte Platte wird während etwa 30 min bei Umgebungstemperatur gehalten. Nach Ablauf dieser Zeitspanne ist es möglich, eine vorläufige Bewertung des Tests vorzunehmen, indem man die Farbe beobachtet, welche sich für ein und dieselbe Probe in den benachbarten Vertiefungen entwickelt hat. Jedweder Farbunterschied zwischen der ungehemmten Probe und der gleichen Probe, welche durch das (NANP)&sub2;&sub0;-Peptid gehemmt ist, zeigt ein positives Ergebnis an, während kein Farbunterschied ein negatives Ergebnis anzeigt. Für eine quantitative Bestimmung wird die Platte in einem ELISA-Lesegerät abgelesen, um die dekadische Extinktion (A) für jede Vertiefung bei einer optischen Wellenlänge zu messen, welche für jede Art von Enzym-Substrat spezifisch ist. Der spezifische Wert (ΔA) ist gegeben durch:
- ΔA oder spezifische dekadische Extinktion = dekadische Extinktion (ohne Inhibitor) - dekadische Extinktion (mit Inhibitor).
- Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das Kriterium, welches herangezogen wird, um eine Probe bei Verwendung des Peroxidase-Konjugates und des Substrates ABTS als positiv oder negativ einzustufen, das folgende:
- - eine Probe ist negativ, wenn der spezifische Wert ΔA nach 30 min kleiner a 0,050 ist, wie groß auch immer die als
- A(-Inhib.)-A(+Inhib.) x 100/A(-Inhib.)
- berechnete, prozentmäßige Hemmung ist;
- - eine Probe ist positiv, wenn der spezifische Wert ΔA größer als 0,050 ist, und wenn die diesem Wert entsprechende, prozentmäßige Hemmung größer als 50 ist.
- Als ein generelles, praktisches Kriterium, welches neben demjenigen auf der Basis der ΔA-Werte herangezogen wird, ist es nützlich,den Farbunterschied zwischen den Vertiefungen mit und ohne Inhibitor mit fortschreitender Zeit, ja sogar noch nach mehreren Stunden, festzustellen.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung hat das Einzelplatten-ELISA- Verfahren mit kompetitiver Hemmung beträchtliche Vorteile im Vergleich zu dem bekannten Stand der Technik (siehe die Beispiele 7 und 9), und insbesondere im Vergleich mit dem Doppelplatten-ELISA-Verfahren.
- Diese Vorteile umfassen eine hohe Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, Geschwindigkeit und Leichtigkeit der Ausführung und das Kosten-Nutzenverhältnis des Verfahrens.
- Die Empfindlichkeit und Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dem Gemisch aus TBS/C/TX-100 und dem (NANP)&sub2;&sub0;-Peptid,und zwar sowohl als dem an der Platte adsorbierten Antigen als auch als kompetitiver Inhibitor, zugeschrieben. Das Verfahren ist nicht nur auf Serum- und Plasmaproben sondern auch auf Vollblutproben und auf Moskito-Extrakt anwendbar, ohne daß Probleme hinsichtlich eines unspezifischen Untergrundes auftauchten. Außerdem werden durch die Verwendung einer Einzelplatte zur Bestimmung der spezifischen dekadischen Extinktion für ein und dieselbe Probe alle Probleme vermieden, welche auf den möglichen Mangel an Gleichförmigkeit zwischen verschiedenen Platten zurückzuführen sind. Ein beträchtlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der einfachen Ausführung desselben und in der schnellen visuellen Bewertung der Ergebnisse. Diagnostische Kits, welche alle Reagentien enthalten, die für die Ausführung des erfindungsgemaßen Verfahrens erforderlich sind, sind für die Bestimmung von Antikörpern gegen die Sporozoiten von P.falciparum in Human-Blutproben und in Moskito-Extrakt gut geeignet.
- Beispielsweise kann ein diagnostischer Kit eine Platte enthalten, welche nur mit dem synthetischen (NANP)&sub2;&sub0;-Antigen vorbehandelt worden ist, und er kann das synthetische Peptid als kompetitven Inhibitor und möglicherweise das Puffer/Protein/Detergens-Gemisch, das Enzym-Konjugat und das spezifische Substrat enthalten. Ein Kit dieser Art oder von ähnlicher Art ermöglicht die Bestimmung von Antikörpern gegen die Sporozoiten von P.falciparum zu den niedrigstmöglichen Kosten.
- Die nachstehend angeführten, Versuche betreffenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
- Die Beispiele 7 und 9 stellen Vergleiche mit bekannten Enzym- Immun-Verfahren dar.
- Um das beste Puffersystem zum Aktivieren der vorbehandelten Platte, zum Verdünnen der Probe und des Enzym-Konjugates und für Waschzwecke zu identifizieren, wurden die Puffergemische TBS/C/TX-100 [Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, vom pH 7,8/Casein (0,5 % (Gew./Vol.))/Triton X-100 (0,1 % (Vol./Vol.))] und PBS/C/TX-100 [phosphatgepufferte Kochsalzlösung vom pH 7,8/Casein (0,5 % (Gew./Vol.))/X-100 (0,1 % (Vol./Vol.))] geprüft. Zu jeder Vertiefung einer Dynatech-M-129-A-Platte (Dynatech, Alexandria, Va, USA) mit 96 flachbödigen Vertiefungen wurden 100 ul PBS-Puffer vom pH 7,8 mit: einem Gehalt an 1 ug/ml (NANP)&sub2;&sub0; zugegeben.
- Die Platte wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºC) in einer feuchten Kammer gehalten, und dann wurde sie zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Die Platte wurde dann in einem Ofen bei 37ºC während 1 h getrocknet, und sie wurde in einem geschlossenen Behälter bei 4ºC gelagert (vorbehandelte Platte). Vor der Verwendung wurde die Platte durch Einbringen von 200 ul des TBS/C/TX-100 -Puffer-Gemisches in die eine Hälfte der Vertiefungen, und von 200 ul des PBS/C/TX-100 - Puffer-Gemisches in die restliche Hälfte der Vertiefungen, aktiviert.
- Die Platte wurde während etwa 30 min bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºC) gehalten.
- Eine Probe eines negativen Serums aus einem gesunden Spender und 10 Serumproben aus einer Zone mit endemischer Malaria wurden jeweils im Verhältnis von 1:200 in dem TBS/C/TX-100 - bzw. in dem PBS/C/TX-100 -Puffer-Gemisch verdünnt. Zu vier in vertikaler Richtung benachbarten Vertiefungen wurden aliquote Anteile von 4 x 100 ul jeder Probe hinzugefügt, welche Proben in der beschriebenen Weise verdünnt worden waren, wobei zu den letzten zweien dieser Vertiefungen (Hemmungs-Vertiefungen) jeweils 5 ul TBS/C/TX-100 oder PBS/C/TX-100 mit einem Gehalt von 2 ug (NANP)&sub2;&sub0; schon zuvor hinzugefügt worden waren. Die Platte wurde während 1 h bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºC) gehalten, und dann wurde sie (viermal, während jeweils 2 bis 3 min) je nach Zweckdienlichkeit, mit 200 ul des TBS/C/TX-100 - oder des PBS/C/TX-100 -Puffer-Gemisches gewaschen.
- Das Verfahren wurde dann dadurch fortgesetzt, daß zu jeder Vertiefung, mit Ausnahme der ersten vertikalen Kolonne, welche für das Leersubstrat reserviert war, 100 ul des enzymatischen Antikörper/Anti-Human-Immunglobulin/Peroxidase-(Bio Rad)-Konjugates, welches, je nach Zweckdienlichkeit, im Verhältnis von 1:3.000 in TBS/C/TX-100 oder in PBS/C/TX-100 verdünnt war, zugesetzt wurden.
- Die Platte wurde während 1 h bei Umgebungstemperatur gehalten, wonach die eine Hälfte der Vertiefungen (viermal, während jeweils 2 bis 3 min) mit 200 ul TBS/C/TX-100 gewaschen wurde, und die andere Hälfte mit 200 ul PBS/C/TX-100 gewaschen wurde.
- Dann wurden alle Vertiefungen 1 bis 2-mal mit TBS oder PBS gewaschen, um das restliche Casein zu entfernen.
- Dann wurden zu jeder Vertiefung 100 ul von 0,1 M Acetat-Puffer vom pH 5,0 mit einem Gehalt von 1,1 mg/ml an ABTS und an 1,3 mM H&sub2;O&sub2; zugegeben.
- Die enzymatische Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur während 45 min durchgeführt. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Ergebnisse durch Bestimmung der dekadischen Extinktion mit einem ELISA-Lesegerät bei 405 nm bewertet. Der spezifische Wert für die Probe (ΔA) war gegeben durch:
- Dekadische Extinktion ohne Hemmung (A-Inhib.) - dekadische Extinktion mit Hemmung (A + Inhib.).
- Die in der nachstehenden Tabelle 1 angeführten Ergebnisse zeigen, daß das TBS/C/TX-100 -Puffergemisch eindeutig gegenüber dem PBS/C/TX-100 -Gemisch vorzuziehen ist, und zwar sowohl wegen der besseren spezifischen Werte (ΔA) der positiven Proben als auch wegen der niedrigen Werte für den unspezifischen Untergrund (für die Kolonne A + Inhib.). TABELLE 1 Probe: Serum Negativ
- Um die optimale Inkubationszeit für die Aktivierung einer vorbehandelten Platte zu identifizieren, wurde wie im Beispiel 1 verfahren, wobei ein und dieselbe mit TBS/C/TX-100 vorbehandelte Platte vor der Zugabe der zu analysierenden Blutproben während 30 bzw. 60 min inkubiert wurde.
- Es wurden ein negatives Serum und 6 afrikanische Seren (1, 3, 4, 5, 6, 8), welche aus einer Zone mit endemischer Malaria stammten, verwendet, welche Seren jeweils im Verhältnis von 1:200 mit dem TBS/C/TX-100-Gemisch verdünnt worden waren.
- Es wurden das Peroxidase-Konjugat und das ABTS-Enzym-Substrat bei einer Dauer der enzymatischen Reaktion von 30 min verwendet.
- Die dekadische Extinktion wurde mit einem ELISA-Lesegerät bei 405 nm bestimmt. Die in der nachstehenden Tabelle 2 angeführten Ergebnisse zeigen, daß die spezifischen Werte (ΔA) und die unspezifischen Werte (A+Inhib.) für die zwei Inkubationszeiten praktisch gleich groß waren. TABELLE 2 Probe: Serum (1:200) Negativ
- Es wurde gemäß Beispiel 1 verfahren, wobei jedoch das TBS/C/TX-100-Puffergemisch und 19 Heparin-Plasmen aus gesunden Spendern verwendet wurden, welche im Verhältnis von 1:200 mit diesem Gemisch verdünnt worden waren. In der Tabelle 3 sind die dabei erhaltenen Ergebnisse angeführt. Die niedrigen Werte von ΔA (zwischen -0,026 und +0,047) zusammen mit den niedrigen Werten für den unspezifischen Untergrund (A+Inhib.) bestätigen die hohe Spezifität des Einzelplatten-ELISA-Assay mit kompetitiver Hemmung. TABELLE 3 Probe Heparin-Plasma
- Es wurde gemäß Beispiel 1 verfahren, wobei jedoch zwei Dynatech M129-A-Platten, ein negatives Serum und 20 Seren verwendet wurden, welche letztgenannten aus einer Zone mit endemischer Malaria stammten, und wobei die Seren im Verhältnis von 1:200 mit dem TBS/C/TX-100-Puffergemisch verdünnt wurden.
- Dann wurden das Peroxidase-(Bio-Rad)-Konjugat und das Substrat ABTS für die eine Platte verwendet, und das Antikörper/Anti-Human-Immunglobulin/alkalische Phosphatase-(SCLAVO S.p.A.)- Konjugat, welches im Verhältnis von 1:800 mit dem TBS/C/TX-100 verdünnt worden war, und das Enzymsubstrat NPP (Nitrophenylphosphat) wurden für die andere Platte verwendet.
- Die dekadische Extinktion wurde für die zwei Platten in einem ELISA-Lesegerät bei 405 nm nach 30 min und nach 60 min bestimmt.
- Die in der Tabelle 4 angeführten Ergebnisse zeigen Werte (ΔA) der positiven Proben für die spezifische dekadische Extinktion, welche Werte deutlich größer für die Peroxidase als für die alkalische Phosphatase sind. TABELLE 4 Probe Serum (verdünnt) Negativ
- Es wurde die Verfahrensweise des Beispiels 1 angewendet, wobei aber jeweils die doppelte Menge der in Beispiel 4 untersuchten Seren und eines negativen Heparin-Plasmas (Verdünnung 1:100 in TBS/C/TX-100), sowie Peroxidase und ABTS verwendet wurden.
- Die in der Tabelle 5 angeführten Ergebnisse zeigen, daß die spezifischen Werte (ΔA) nach 30 min für die positiven Proben größer als die für die gleichen Proben in der (zweiten Kolonne der) Tabelle 4 angeführten sind, und sie zeigen zugleich das Fehlen von Problemen hinsichtlich eines unspezfisichen Untergrundes (niedrige Werte für A+Inhib.). TABELLE 5 Probe: Serum und Plasma (Verdünnung 1:100) Negativ Negatives Plasma
- Es wurde eine wie im Beispiel 1 behandelte Platte, zusammen mit dem TBS/C/TX-100 -Puffergemisch, dem Peroxidase-(Bio- Rad)-Konjugat und dem enzymatischen TS während 30 min verwendet.
- Es wurde die Verfahrensweise des Beispiels 1 angewendet, unter Verwendung von 39 Proben von Vollblut von afrikanischem Ursprung, welche Vollblutproben auf Whatman -Papier Nr.1 getrocknet und während etwa 15 Tagen in Gegenwart von Silikagel bei Umgebungstemperatur gehalten worden waren.
- Die Proben (10 ul von Vollbut) wurden mit 1 ml TBS/C/TX- 100 -Puffer bei Umgebungstemperatur während 1 h extrahiert und dann wie im Beispiel 1 beschrieben geprüft.
- Außerdem wurden an einer negativen Vollblutprobe, einem negativen Serum und einer positiven Kontrolle, welche durch Vermischen des positiven Serums Nr.8 (Tabelle 2) mit negativem Vollblut erhalten worden war, Tests durchgeführt, wobei alle Proben auf Whatman -Papier absorbiert und dann nach einigen Tagen wie oben beschrieben extrahiert worden waren. TABELLE 6 Probe: Neg.Blut/What. Serum 8/What. Serum 8 + neg.Blut/What. Neg.Serum/What. Negatives Serum
- 20 Seren, welche aus einer Zone mit endemischer Malaria stammten, ein negatives Serum und ein positives Serum wurden sowohl nach dem Einzelplatten-ELISA-Verfahren als auch nach dem klassischen Doppelplatten-ELISA-Verfahren geprüft, wobei für dieses letztgenannte Verfahren die eine mit (NANP)&sub2;&sub0; vorbehandelte Platte verwendet wurde, während die andere Platte mit alleinigem PBS vorbehandelt worden war.
- Es wurden das TBS/C/TX-100-Puffergemisch, das Peroxidasekonjugat, das ABTS -Enzym-Substrat verwendet, und es wurde eine enzymatische Reaktionszeit von 30 min angewendet.
- Die in der Tabelle 7 angeführten Ergebnisse zeigen, daß das Doppelplattenverfahren im Vergleich zu einem Einzelplattenverfahren höhere Werte für die unspezifische Hemmung (PBS-Kolonne im Vergleich zu der A+Inhib.-Kolonne) und niedrigere Werte für (ΔA) ergibt, mit dem Ergebnis, daß einige Proben (nämlich die Nummern 4, 7, 11, 12, 13, 17 und 18), nach dem Doppelplattenverfahren "falsche Negativbewertungen" zeigen. TABELLE 7 Einzelplatte Doppelplatte Probe: Seren (Verd.1:200) Negativ Positiv
- Drei Extrakte aus Moskitos aus einer afrikanischen Zone mit endemischer Malaria, welche Extrakte durch Ausquetschen auf ein Whatman-Filterpapier Nr.1, Trocknen und Lagern in Gegenwart von Silikagel gewonnen worden waren, wurden während 60 min bei 4ºC zusammen mit 0,6 ml TBS/C/TX-100 mit einem Gehalt an dem Protease-Inhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) extrahiert. Dann wurden vier aliquote Mengen des Extraktes von 0,1 ml geprüft, wobei wie im Beispiel 1 vorgegangen wurde.
- Die nach 30 min und 60 min bestimmten, spektralphotometrischen Ergebnisse, welche in der Tabelle 8 angeführt sind, stimmen genau mit der visuellen Beobachtung des Farbunterschiedes in der positiven Diagnose der geprüften Probe überein. Dadurch wird die hohe Empfindlichkeit und Spezifität des Einzelplattenverfahrens mit Hemmung bestätigt. TABELLE 8 Enzymatische Reaktionszeit
- Die im Beispiel 7 untersuchten Seren wurden sowohl nach dem in der EP-A-0 341 767 beschriebenen P-E/PEG-Verfahren unter Verwendung des Peroxidase-Konjugates und des TMB (Tetramethylbenzidin)-Enzym-Substrates,als auch nach dem in der GB-A- 2 199 140 beschriebenen P-E/SPA-Verfahren,unter Verwendung des Peroxidase-Enzyms und des ABTS-Enzymsubstrates, analysiert.
- In der Tabelle 9:
- zeigt die Kolonne 6 die als A ausgedrückten, spektralphotometrischen Ergebnisse, welche mit dem P-E/PEG-Verfahren erhalten wurden;
- zeigt die Kolonne 7 die nach dem P-E/SPA-Verfahren erhaltenen Ergebnisse, wobei "+" positive Seren anzeigt, "-" negative Seren anzeigt, und "?" auf Ungewißheit verweist;
- zeigen die Kolonnen 2 und 3 die (ΔA)-Ergebnisse, welche mit dem "Einzelplatten-ELISA mit Hemmung" unter Verwendung des Peroxidase-Konjugates mit ABTS bzw. des Konjugates mit alkalischer Phosphatase und NPP erhalten wurden; und
- zeigen die Kolonnen 4 und 5 die Ergebnisse (ΔA), welche nach dem "Doppelplatten-ELISA" unter Verwendung von Casein, Peroxidase und ABTS (HRP/ABTS ) bzw. BSA, alkalischer Phosphatase und NPP (ALP/NPP) erhalten wurden.
- Ein Vergleich der verschiedenen Verfahren zeigt die größere Empfindlichkeit und Spezifität des Einzelplatten-ELISA-Verfahrens mit kompetitiver Hemmung und unter Verwendung von Peroxidase und ABTS .
- Die Probe 17, welche nach dem Einzelplattenverfahren positiv ist, ist nach den P-E/PEG- und P-E/SPA-Verfahren insofern ungewiß, als der hohe Wert für den unspezifischen Untergrund und der niedrige spezifische Wert (ΔA) das Ergebnis wenig verläßlich erscheinen lassen. TABELLE 9 Einzelplatten-ELISA mit Hemmung Doppel-Platten-ELISA Probe: (Seren) Negativ Positiv N.D. = "not determined" = nicht bestimmt.
Claims (4)
1. Kompetitives ELISA-Verfahren auf einer Einzelplatte zum
Nachweis von Antikörpern gegen die Sporozoiten von
Plasmodium falciparum in einer Human-Blutprobe, welches die
folgenden Stufen umfaßt:
(a) Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit dem
synthetischen Antigen (NANP)&sub2;&sub0;, worin N Asparagin ist, A
Alanin ist und P Prolin ist, durch Inkubieren der
Platte über Nacht in einer feuchten Kammer, bei einer
Temperatur von 20ºC bis 25ºC, mit 0,1 ml/Vertiefung von
1 ug/ml-(NANP)&sub2;&sub0;-Lösung in TRIS-gepufferter
Kochsalzlösung (TBS);
(b) Waschen der Platte mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung
(TBS) zum Entfernen des locker gebundenen synthetischen
Antigens;
(c) Hinzufügen von TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TBS)
mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und
von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens
zu jeder Vertiefung der Platte;
(d) Inkubieren der Platte bei einer Temperatur von 20ºC bis
37ºC während wenigstens 30 min;
(e) Hinzufügen einer aliquoten Menge einer Probe, welche
aus Vollblut, Serum, Plasma, und einem Moskito-Extrakt
ausgewählt ist, welcher letztgenannte mit
TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt an einem
Protease-Inhibitor extrahiert worden ist, und wobei
diese Probe mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung mit
einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von
0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens
verdünnt worden ist,zu jeder von vier benachbarten
Vertiefungen der Platte der Stufe (c);
(f) Einbringen des synthetischen Peptides (NANP)&sub2;&sub0;,
entweder vor der verdünnten Probe, oder zugleich mit
derselben, in einem Mindestgewichtsverhältnis von 20:1 in
bezug auf das adsorbierte synthetische Antigen, in zwei
dieser Vertiefungen;
(g) Inkubieren der Platte bei einer Temperatur von 20ºC bis
37ºC während einer Zeitspanne von 30 min bis 60 min;
(h) Waschen der Platte mit einer mit TRIS gepufferten
Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.)
an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem
nichtionischen Detergens;
(i) Hinzufügen eines
Antikörper/Anti-Human-Immunglobulin/Enzym-Konjugates, welches in einer mit TRIS gepufferten
Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt von 0,5 %
(Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an
einem nichtionischen Detergens verdünnt worden ist, zu
jeder Vertiefung der Platte;
(j) Inkubieren der Platte bei Zimmertemperatur während
einer Zeitspanne von 30 min bis 60 min;
(k) Waschen der Platte mit einer mit TRIS gepufferten
Kochsalzlösung (TBS) mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.)
an Casein und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem
nichtionischen Detergens;
(l) Waschen der Platte mit einer mit TRIS gepufferten
Kochsalzlösung (TBS);
(m) Hinzufügen einer farblosen Substratlösung, welche
spezifisch für das Enzym des in der Stufe (i) verwendeten
Konjugates ist, zu jeder Vertiefung;
(n) Inkubieren der Platte während einer Zeitspanne von 10
min bis 60 min; und
(o) Feststellen des spezifischen Wertes für jede Probe
durch den Unterschied in der dekadischen Extinktion
zwischen der nicht-gehemmten und der vollständig
gehemmten Probe.
2. ELISA-Verfahren auf einer Einzelplatte nach Anspruch 1,
worin das nichtionische Detergens aus
- Polyoxyethylenglykol-(9)-p-t-octylphenol;
- Polyoxyethylenglykol-sorbitanmonolaurat und
- Polyoxyethylenglykol-(9,10)-p-t-octylphenol
ausgewählt ist.
3. ELISA-Verfahren auf einer Einzelplatte nach Anspruch 1,
worin die TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) mit einem
Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein und von 0,1 %
(Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens zusätzlich
ein Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 6.000
enthält.
4. Diagnostischer Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen die
Sporozoiten von Plasmodium falciparum in einer
Human-Blutprobe oder in einem Moskito-Extrakt, nach dem im Anspruch 1
beanspruchten ELISA-Verfahren, welcher eine mit dem
synthetischen Antigen (NANP)&sub2;&sub0; und eine mit TRIS gepufferte
Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,5 % (Gew./Vol.) an Casein
und von 0,1 % (Vol./Vol.) an einem nichtionischen Detergens
enthält.
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