CN112798786A - 一种基于荧光素酶互补的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于荧光素酶互补的生物传感器，包括荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段，荧光素酶氨基端片段的氨基端和荧光素酶羧基端片段的羧基端中的其中一个与G蛋白连接，另一个与第一标记物连接，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶的两个互补片段；连接有第二标记物的待测物抗原，第二标记物与第一标记物互补；待测物抗体；以及荧光素酶底物。通过利用荧光素酶氨基端片段和羧基端片段互补、第一标记物和第二标记物互补、待测物/待测物抗原和待测物抗体互补以及G蛋白和待测物抗体互补的四元互补体系，实现对待测物的快速检测，检测灵敏度高、特异性强、背景噪音小，可用于复杂样品中待测物的定量分析。

Description

一种基于荧光素酶互补的生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，特别是涉及一种基于荧光素酶互补的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
目前检测化学小分子的方法中，应用比较广的是酶联免疫吸附分析法(ELISA)。以常见化学小分子污染物氯霉素为例，其二氯酰胺醇和硝基苯结构与大分子蛋白结合后均可作为完全抗原有效制备相应的抗体。在酶标板上包被待检测样品，BSA封闭后，用氯霉素抗体作为一抗孵育，再用对应的HRP标记的二抗孵育。加入HRP的底物TMB显色液显色，再用2MH2SO4终止反应，测OD450的吸光度。用标准品绘制标准曲线，根据标准曲线即可分析出样品中所含有的氯霉素浓度。ELISA检测方法应用最广，检测限可达0.02μg/kg，市场上也有ELISA测定氯霉素的试剂盒。ELISA检测方法灵敏度较高，特异性强，但是也存在一些不足之处，例如由于抗体的批次不同，检测结果会产生偏差，同时，需要包板等操作，操作复杂，检测过程中使用的仪器昂贵，并且无法在较短的时间内(2～3小时)实现样品快速检测，检测时间长，还可能存在假阳性的可能。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于荧光素酶互补的生物传感器，通过利用荧光素酶氨基端片段和羧基端片段互补、第一标记物和第二标记物互补、待测物/待测物抗原和待测物抗体互补，以及G蛋白和待测物抗体互补的四元互补体系，实现对待测物的快速检测，检测灵敏度高、特异性强、背景噪音小，可以用于复杂样品中待测物的定量分析。
第一方面，本发明提供了一种基于荧光素酶互补的生物传感器，包括：
荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段，所述荧光素酶氨基端片段的氨基端和所述荧光素酶羧基端片段的羧基端中的其中一个与G蛋白连接，另一个与第一标记物连接，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶的两个互补片段；
待测物抗原，所述待测物抗原连接有第二标记物，所述第二标记物与所述第一标记物互补；
所述待测物抗体；以及
荧光素酶底物。
在本申请中，通过利用荧光素酶互补技术，即荧光素酶在特定位点分开，分别形成不能催化发光或只能催化发出非常微弱荧光的氨基端(N端)片段和羧基端(C端)片段，这两个片段在体内共表达或体外混合时，不能自发组装成完整的荧光素酶，进而不能发出明显荧光；而这两个片段在外源相互作用下相互靠近，形成非共价互补，重新组装成完整的蛋白，恢复荧光素酶的活性，即能够催化相应底物发光。
在本申请中，G蛋白(参考文献：Purification and some properties ofstreptococcal protein G,a novel IgG-binding reagent.L
Figure BDA0002273204310000021
G Kronvall.TheJournal of Immunology August 1,1984,133(2)969-974)是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体，其能够与抗体的Fc段结合，例如可以结合IgG、IgG Fc、IgG Fab、IgGFab’、IgG F(ab’)2。
本申请提供的生物传感器中，荧光素酶氨基端片段和羧基端片段能够互补，第一标记物和第二标记物能够互补，待测物抗原和待测物抗体之间能互补，G蛋白和待测物抗体之间能够互补，形成互补闭环，进而拉进荧光素酶氨基端片段和羧基端片段在空间上的距离，使得两者可以重新组装，恢复荧光素酶活性进而使得其能够对传感器中的荧光素酶底物进行催化，产生发光；同时待测物的加入与待测物抗原竞争结合待测物抗体，使得待测物、待测物抗体、G蛋白以及荧光素酶氨基端片段和羧基端片段中的一个连接在一起，待测物抗原、第二标记物、第一标记物以及荧光素酶氨基端片段和羧基端片段中的另一个连接在一起，切断上述互补的闭环，即荧光素酶氨基端片段和羧基端片段在空间无法重新组装在一起恢复荧光素酶活性，进而无法催化底物发光。因此，根据待测物加入前后发光强度的变化，即可对样品中是否含有待测物进行定性检测分析，同时发光强度的变化与待测物的含量具有线性关系，预先对已知的不同浓度待测物进行检测分析，得到标准曲线，进而可以对含有待测物的样品中待测物的含量进行定性检测分析，结果更加精确。
在本申请中，荧光素酶可以是任意荧光素酶，只要荧光素酶可以分为氨基端片段和羧基端片段，两个片段单独存在是不发出荧光或有非常微弱的荧光，并且两个片段在空间上接近时，能够重新组装在一起恢复荧光素酶的活性即可。
可选的，所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、海萤荧光素酶、萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶中的至少一个。在本申请中，采用上述荧光素酶能够在荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段空间拉近后，产生强的荧光，更有利于检测，减小检测误差。
进一步的，所述荧光素酶为Gaussia荧光素酶，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为所述Gaussia荧光素酶在G93和E94位点之间分开形成的两个互补片段。
进一步的，所述荧光素酶为海肾荧光素酶，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为所述海肾荧光素酶在L110和P111位点之间或G229和K230位点之间分开形成的两个互补片段。
可选的，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶在loop点分成的两个互补片段。在本申请中，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段在loop点分成的两个互补片段基本不具有发光能力，需要在外源作用下相互靠近后互补，恢复荧光素酶活性，催化底物发光。
可选的，所述荧光素酶氨基端片段的氨基端和所述荧光素酶羧基端片段的羧基端，两者中的其中一个通过第一连接肽与所述G蛋白连接，另一个通过第二连接肽与所述第一标记物连接，所述第一连接肽和所述第二连接肽为柔性链。
在本申请中，通过柔性链的连接肽连接两个蛋白，以使的两个蛋白在空间上保持各自原有的空间结构和活性。可选的，所述第一连接肽和所述第二连接肽选自(GGGGS)n，2≤n≤20，n为整数。在本申请中，所述第一连接肽和所述第二连接肽序列可以相同，也可以不同。
在本申请中，第一标记物和第二标记能够进行互补。可选的，所述第一标记物和所述第二标记物中的其中一个为生物素，另一个为亲和素。进一步的，所述亲和素为链霉亲和素。
在本申请中，G蛋白与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与生物素连接，待测物抗原与亲和素连接；或生物素与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与G蛋白，待测物抗原与亲和素连接；或G蛋白与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与亲和素连接，待测物抗原与生物素连接；或亲和素与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与G蛋白，待测物抗原与生物素连接。
可选的，所述待测物抗体的效价在105以上。
在本申请中，荧光素酶底物为能够被相应荧光素酶催化产生荧光的物质。可选的，所述荧光素酶底物包括荧光素、海萤荧光素和腔肠素及其异构体中的至少一种。具体的，可以但不限于为Gaussia荧光素酶可以在无ATP的条件下，催化底物腔肠素(发射波长480nm)发光。
可选的，所述G蛋白的浓度为25nM-1000nM。进一步的，所述G蛋白的浓度为50nM-500nM。
可选的，所述待测物抗原的浓度为50nM-2000nM。进一步的，所述待测物抗原的浓度为100nM-1000nM。
可选的，所述待测物抗体的浓度为25nM-1000nM，所述待测物抗原连接有所述第二标记物。进一步的，所述待测物抗体的浓度为50nM-500nM。
可选的，所述第一标记物的浓度为25nM-1000nM。进一步的，所述第一标记物的浓度为100nM-1000nM。
可选的，所述待测物抗体和所述待测物抗原的浓度比为1：(1.2-3)。进一步的，所述待测物抗体和所述待测物抗原的浓度比为1：(1.5-2)。具体的，所述待测物抗体和所述待测物抗原的浓度比可以但不限于为1:2。
第二方面，本发明提供了一种基于荧光素酶互补的生物传感器的制备方法，包括：
构建含有荧光素酶氨基端片段基因的第一表达载体，以及构建含有荧光素酶羧基端片段基因的第二表达载体，其中，所述第一表达载体中所述荧光素酶氨基端片段基因的5’端，和所述第二表达载体中所述荧光素酶羧基端片段基因的3’端中的其中一个插入G蛋白基因，另一个插入第一标记物的基因；
将所述第一表达载体和所述第二表达载体经转化、表达和纯化，得到荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段，所述荧光素酶氨基端片段的氨基端和所述荧光素酶羧基端片段的羧基端中的其中一个与G蛋白连接，另一个与第一标记物连接，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶的两个互补片段；
提供待测物抗原、所述待测物抗体和荧光素酶底物，所述待测物抗原连接有第二标记物，所述第二标记物与所述第一标记物互补，所述待测物抗原与所述待测物抗体结合，所述待测物抗体与所述G蛋白结合，得到基于荧光素酶互补的生物传感器。
可选的，所述第一表达载体和所述第二表达载体中含有His标签基因。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的生物传感器，或第二方面所述的制备方法制得生物传感器在物质含量检测中的应用。
在本申请中，通过加入待测物，使得待测物与基于荧光素酶互补的生物传感器中的待测物抗原竞争结合待测物抗体，进而使得荧光素酶氨基端片段和羧基端片段的空间位置发生变化，继而影响荧光素酶催化底物发光强度，根据发光强度的变化对待测物进行分析，同时由于发光强度的变化与待测物含量相关，因此能够对待测物进行定量分析。整个检测过程仅需要对发光强度进行检测，可以使用酶标仪等简单的检测仪器，降低检测成本，检测过程方便快速，更有利于其应用。
可选的，所述基于荧光素酶互补的生物传感器在定量检测中的应用。
在本申请中，所述待测物可以为任意能够提供相应抗原和抗体的物质，具体的可以但不限于为化学小分子物质。
可选的，所述应用包括：
将所述荧光素酶氨基端片段、所述荧光素酶羧基端片段、所述待测物抗原、所述待测物抗体和已知浓度的所述待测物混合均匀，再加入所述荧光素酶底物混合后，检测发光强度，绘制待测物浓度与发光强度关系的标准曲线；
将所述荧光素酶氨基端片段、所述荧光素酶羧基端片段、所述待测物抗原、所述待测物抗体和所述荧光素酶底物混合后，检测发光强度为第一发光强度；
将所述荧光素酶氨基端片段、所述荧光素酶羧基端片段、所述待测物抗原、所述待测物抗体和不同浓度的所述待测物混合均匀，再加入所述荧光素酶底物混合后，检测发光强度为第二发光强度；
根据所述标准曲线、所述第一发光强度和所述第二发光强度，计算得到所述待测物的含量。
本申请的有益效果：
本发明提供的基于荧光素酶互补的生物传感器及其制备方法，通过利用荧光素酶氨基端片段和羧基端片段互补、第一标记物和第二标记物互补、待测物/待测物抗原和待测物抗体互补以及G蛋白和待测物抗体互补的四元互补体系，通过比较待测物加入前后发光强度的变化，实现对待测物的快速检测，同时整个过程仅需要简单检测仪器，检测方便，成本低，同时检测灵敏度高、特异性强、背景噪音小，可以用于复杂样品中待测物的定量分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1是本发明实施例1中制得的蛋白的SDS-PAGE图，其中图1中(a)为G蛋白和荧光素酶氨基端片段融合蛋白的SDS-PAGE图，图1中(b)为荧光素酶羧基端片段和单体链霉亲和素融合蛋白的SDS-PAGE图。
图2是本发明效果实施例1中G蛋白与待测物抗体结合的SDS-PAGE图。
图3是本发明效果实施例2的ELISA检测结果图。
图4是本发明效果实施例3提供的基于荧光素酶互补的生物传感器的发光信号强度检测结果图。
图5是本发明效果实施例3提供的基于荧光素酶互补的生物传感器的原理示意图。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
本发明提供了一种基于荧光素酶互补的生物传感器，包括：
荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段，荧光素酶氨基端片段的氨基端和荧光素酶羧基端片段的羧基端中的其中一个与G蛋白连接，另一个与第一标记物连接，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶的两个互补片段；待测物抗原，所述待测物抗原连接有第二标记物，第二标记物与第一标记物互补；待测物抗体；以及荧光素酶底物。
在本申请中，通过利用荧光素酶互补技术，即荧光素酶在特定位点分开，分别形成不能催化发光或只能催化发出非常微弱荧光的氨基端(N端)片段和羧基端(C端)片段，这两个片段在体内共表达或体外混合时，不能自发组装成完整的荧光素酶，进而不能发出明显荧光；而这两个片段在外源相互作用下相互靠近，形成非共价互补，重新组装成完整的蛋白，恢复荧光素酶的活性，即能够催化相应底物发光。
在本申请中，G蛋白(参考文献：Purification and some properties ofstreptococcal protein G,a novel IgG-binding reagent.L
Figure BDA0002273204310000071
G Kronvall.TheJournal of Immunology August 1,1984,133(2)969-974)是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体，其能够与抗体的Fc段结合，例如可以结合IgG、IgG Fc、IgG Fab、IgGFab’、IgG F(ab’)2。
本申请提供的生物传感器中，荧光素酶氨基端片段和羧基端片段能够互补，第一标记物和第二标记物能够互补，待测物抗原和待测物抗体之间能互补，G蛋白和待测物抗体之间能够互补，形成互补闭环，进而拉进荧光素酶氨基端片段和羧基端片段在空间上的距离，使得两者可以重新组装，恢复荧光素酶活性进而使得其能够对传感器中的荧光素酶底物进行催化，产生发光；同时待测物的加入与待测物抗原竞争结合待测物抗体，使得待测物、待测物抗体、G蛋白以及荧光素酶氨基端片段和羧基端片段中的一个连接在一起，待测物抗原、第二标记物、第一标记物以及荧光素酶氨基端片段和羧基端片段中的另一个连接在一起，切断上述互补的闭环，即荧光素酶氨基端片段和羧基端片段在空间无法重新组装在一起恢复荧光素酶活性，进而无法催化底物发光。因此，根据待测物加入前后发光强度的变化，即可对样品中是否含有待测物进行定性检测分析，同时发光强度的变化与待测物的含量具有线性关系，预先对已知的不同浓度待测物进行检测分析，得到标准曲线，进而可以对含有待测物的样品中待测物的含量进行定性检测分析，结果更加精确。
相比与ELISA检测，本申请提供的基于荧光素酶互补的生物传感器中，通过四元互补体系，大幅度提高了检测的灵敏度和特异性，避免了假阳性的问题，背景噪声小，可以用于复杂样品中待测物的检测，检测线低；同时仅需要对发光强度进行检测，操作简单，检测成本低；发光过程快速，检测时间短；可以但不限于利于酶标仪进行检测，可以同时进行多个样品的检测，检测效率高。
在本申请中，荧光素酶可以是任意荧光素酶，只要荧光素酶可以分为氨基端片段和羧基端片段，两个片段单独存在是不发出荧光或有非常微弱的荧光，并且两个片段在空间上接近时，能够重新组装在一起恢复荧光素酶的活性即可。
在本申请一实施方式中，荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、海萤荧光素酶、萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶中的至少一个。在本申请中，采用上述荧光素酶能够在荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段空间拉近后，产生强的荧光，更有利于检测，减小检测误差。
在本申请一实施方式中，荧光素酶为Gaussia荧光素酶，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段为Gaussia荧光素酶在G93和E94位点之间分开形成的两个互补片段。
在本申请一实施方式中，荧光素酶为海肾荧光素酶，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段为海肾荧光素酶在L110和P111位点之间或G229和K230位点之间分开形成的两个互补片段。
在本申请一实施方式中，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶在loop点分成的两个互补片段。在本申请中，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段在loop点分成的两个互补片段基本不具有发光能力，需要在外源作用下相互靠近后互补，恢复荧光素酶活性，催化底物发光。
在本申请一实施方式中，荧光素酶氨基端片段的氨基端和荧光素酶羧基端片段的羧基端，两者中的其中一个通过第一连接肽与G蛋白连接，另一个通过第二连接肽与第一标记物连接，第一连接肽和第二连接肽为柔性链。
在本申请中，通过柔性链的连接肽连接两个蛋白，以使的两个蛋白在空间上保持各自原有的空间结构和活性。可选的，第一连接肽和第二连接肽选自(GGGGS)n，2≤n≤20，n为整数。在本申请中，第一连接肽和第二连接肽的序列可以相同，也可以不同。具体的，n可以但不限于为2、3、4、5、6、10、15、18、20。
在本申请中，第一标记物和第二标记能够进行互补。具体的可以但不限于为，第一标记物和第二标记物中的其中一个为生物素，另一个为亲和素。进一步的，亲和素为链霉亲和素。
在一实施例中，G蛋白与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与生物素连接，待测物抗原与亲和素连接。在另一实施例中，生物素与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与G蛋白，待测物抗原与亲和素连接。在另一实施例中，G蛋白与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与亲和素连接，待测物抗原与生物素连接。在另一实施例中，亲和素与荧光素酶氨基酸片段连接，荧光素酶羧基端片段与G蛋白，待测物抗原与生物素连接。
在本申请一实施方式中，待测物抗体的效价在105以上。
在本申请一实施方式中，G蛋白的浓度为25nM-1000nM。进一步的，G蛋白的浓度为50nM-500nM。
在本申请一实施方式中，待测物抗原的浓度为50nM-2000nM。进一步的，待测物抗原的浓度为100nM-1000nM。
在本申请一实施方式中，待测物抗体的浓度为25nM-1000nM，此时待测物抗原连接有第二标记物。进一步的，待测物抗体的浓度为50nM-500nM。
在本申请一实施方式中，第一标记物的浓度为25nM-1000nM。进一步的，第一标记物的浓度为100nM-1000nM。可以理解的，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段为一个连接了G蛋白，一个连接了第一标记物，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段的浓度根据所连接的G蛋白和第一标记物有关。在一实施例中，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段的浓度与其连接的G蛋白和第一标记物浓度相等。
在本申请一实施方式中，待测物抗体和待测物抗原的浓度比为1：(1.2-3)。进一步的，待测物抗体和待测物抗原的浓度比为1：(1.5-2)。具体的，待测物抗体和待测物抗原的浓度比可以但不限于为1:2，更有利于生物传感器的检测分析。
在本申请中，荧光素酶底物为能够被相应荧光素酶催化产生荧光的物质。可选的，荧光素酶底物包括荧光素、海萤荧光素和腔肠素及其异构体中的至少一种。具体的，可以但不限于为Gaussia荧光素酶可以在无ATP的条件下，催化底物腔肠素(发射波长480nm)发光。
本发明还提供了上述基于荧光素酶互补的生物传感器的制备方法，包括：
构建含有荧光素酶氨基端片段基因的第一表达载体，以及构建含有荧光素酶羧基端片段基因的第二表达载体，其中，第一表达载体中荧光素酶氨基端片段基因的5’端，和第二表达载体中荧光素酶羧基端片段基因的3’端中的其中一个插入G蛋白基因，另一个插入第一标记物的基因；
将第一表达载体和第二表达载体经转化、表达和纯化，得到荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段，荧光素酶氨基端片段的氨基端和荧光素酶羧基端片段的羧基端中的其中一个与G蛋白连接，另一个与第一标记物连接，荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶的两个互补片段；
提供待测物抗原、待测物抗体和荧光素酶底物，待测物抗原连接有第二标记物，第二标记物与第一标记物互补，待测物抗原与待测物抗体结合，待测物抗体与G蛋白结合，得到基于荧光素酶互补的生物传感器。
在本申请一实施方式中，第一表达载体和第二表达载体中含有His标签基因。
在本申请中，连接有第二标记物的待测物的抗原可以但不限于通过化学合成的方法使得待测物抗原连接第二标记物。
在本申请中，待测物抗体可以市售现有的抗体，可以通过现有抗体制备方法制得，对此不作限定。
本发明还提供了上述基于荧光素酶互补的生物传感器在物质含量检测中的应用。
在本申请中，通过加入待测物，使得待测物与基于荧光素酶互补的生物传感器中的待测物抗原竞争结合待测物抗体，进而使得荧光素酶氨基端片段和羧基端片段的空间位置发生变化，继而影响荧光素酶催化底物发光强度，根据发光强度的变化对待测物进行分析，同时由于发光强度的变化与待测物含量相关，因此能够对待测物进行定量分析。整个检测过程仅需要对发光强度进行检测，可以使用酶标仪等简单的检测仪器，降低检测成本，检测过程方便快速，更有利于其应用。
在本申请一实施方式中，基于荧光素酶互补的生物传感器在定量检测中的应用。具体的，可以但不限于对化学小分子，例如氯霉素、蛋白、多肽等的定量检测中。
在本申请中，待测物可以为任意能够提供相应抗原和抗体的物质，具体的可以但不限于为化学小分子物质。
在本申请一实施方式中，应用包括：
将荧光素酶氨基端片段、荧光素酶羧基端片段、待测物抗原、待测物抗体和已知浓度的待测物混合均匀，再加入荧光素酶底物混合后，检测发光强度，绘制待测物浓度与发光强度关系的标准曲线；
将荧光素酶氨基端片段、荧光素酶羧基端片段、待测物抗原、待测物抗体和荧光素酶底物混合后，检测发光强度为第一发光强度；
将荧光素酶氨基端片段、荧光素酶羧基端片段、待测物抗原、待测物抗体和不同浓度的待测物混合均匀，再加入荧光素酶底物混合后，检测发光强度为第二发光强度；
根据标准曲线、第一发光强度和第二发光强度，计算得到待测物的含量。
在一实施例中，标准曲线是待测物浓度与发光强度之间的关系曲线，可以但不限于通过计算第一发光强度与第二发光强度的差值，代入标准曲线计算待测物浓度。
在一实施例中，基于荧光素酶互补的生物传感器的应用采用如下步骤进行：构建基于荧光素酶互补的生物传感器；利用基于荧光素酶互补的生物传感器，绘制已知的待测物浓度与发光强度关系的标准曲线；将含有待测物的样品加入基于荧光素酶互补的生物传感器中，检测发光强度；根据标准曲线和发光强度计算得到样品中待测物含量。
在本申请中，基于荧光素酶互补的生物传感器可以提前制好，低温保存备用。基于荧光素酶互补的生物传感器应用时，只需将待测物加入后检测发光强度的变化即可，操作简单快速，耗时短。由于发光信号来自荧光素酶催化底物发光，没有其他光源，因此背景噪声小，具有更好灵敏度。
实施例1
一种基于荧光素酶互补的生物传感器的制备方法
(1)融合蛋白的表达和纯化
将Gaussia荧光素酶(Gluc)在G93和E94位点之间分开形成的两个互补的N端片段和C端片段，合成N端片段和C端片段的编码序列。将N端片段的编码序列的5’端通过(GGGGS)2的编码序列连接G蛋白的编码序列和His标签的编码序列；将C端片段的编码序列的3’端通过(GGGGS)2的编码序列连接单体链霉亲和素(mSA)的编码序列和His标签的编码序列，并分别插入pET21a表达载体中。
将上述pET21a表达载体在42℃热处理45s后转化到感受态细胞BL21中，经37℃培养复苏并涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，37℃过夜培养。第二天挑取单菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定阳性克隆。从阳性克隆菌株按1:1000加入4mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃，200rpm培养过夜，第二天按1:100加入400mL培养基中于37℃，200rpm进行扩大培养，检测OD600为0.4-0.6时，加入0.5mg/mL的IPTG，于15℃诱导表达24h后，于10000rpm，2min离心，收集菌体。
用PBS将菌体重悬，然后使用超声破碎仪(功率600W*37％)将菌体破碎，释放出菌体内的可溶性蛋白，至溶液澄清，11000rpm，4℃，离心15min，取上清。使用AKTA蛋白纯化仪和GE health的Ni柱进行纯化。利用Ni柱中的填料硫酸镍与His标签能特异性结合的原理去除杂蛋白，再用咪唑溶液的竞争性结合到Ni柱填料，将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来。先用水冲洗柱子，将柱子中的乙醇冲掉，然后用PBS平衡柱子。待仪器上的UV线(指示蛋白)和cout线(指示盐粒子浓度)至水平，然后上样(上一步中收集的上清)。上样完成后，用PBS冲洗柱子，洗去未与柱子结合的蛋白，待UV线水平，用咪唑进行梯度浓度洗脱(25mM、75mM、100mM、150mM、200mM、300mM)，洗脱时实时监测UV线，UV线出现变化就收集洗脱液。
将收集下来的洗脱液通过SDS-PAGE分管进行电泳，并进行考马斯亮蓝染色。观察对应分子量位置的条带，选取表达量高、纯度高的洗脱液，使用10kD的超滤管除去咪唑，更换为PBS为储存体系，-80℃保存。纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳表征见图1，其中，图1中(a)为荧光素酶氨基端片段的大小，图1中(b)为荧光素酶羧基端片段的大小，泳道M为蛋白分子量标准(M)。可以看出，荧光素酶氨基端片段(potein G-NGluc)约38kDa，荧光素酶羧基端片段(CGluc-mSA)约25kDa，荧光素酶氨基端片段为G蛋白通过连接肽连接N端片段，荧光素酶羧基端片段为C端片段通过连接肽连接单体链霉亲和素。
(2)生物素标记待测物抗原
在N2氛围下，向圆底烧瓶里加入R,R-氨二醇(62mg，0.29mmol)，三乙胺(0.12mL，0.87mmol)及干DMF(2mL)混匀。随后加入生物素(100mg，0.29mmol)的干DMF(3mL)溶液。室温搅拌过夜，然后加入15mL水，于4℃低温搅拌15min。过滤，除去析出的白色固体，用50％的异丙醇溶液洗涤，干燥得到粗产品。重结晶得到生物素标记的R,R-氨二醇，其中，R,R-氨二醇为氯霉素类抗原，反应过程如下：
Figure BDA0002273204310000131
提供氯霉素抗体和腔肠素(CTZ)，即可得到基于荧光素酶互补的生物传感器。
实施例2
一种基于荧光素酶互补的生物传感器的制备方法
将海肾荧光素酶(Rluc)在L110和P111位点之间分开形成的两个互补的N端片段和C端片段，合成N端片段和C端片段的编码序列。将N端片段的编码序列的5’端通过(GGGGS)3的编码序列连接单体链霉亲和素(mSA)的编码序列；将C端片段的编码序列的3’端通过(GGGGS)3的编码序列连接G蛋白的编码序列。将上述基因序列的3’端连接His标签的编码基因，并分别插入pET21a表达载体中。根据实施例1相同的方法制备得到荧光素酶氨基端片段(mSA-NRluc)和荧光素酶羧基端片段(CRluc-potein G)，荧光素酶氨基端片段为单体链霉亲和素通过连接肽连接N端片段，荧光素酶羧基端片段为C端片段通过连接肽连接G蛋白。
根据实施例1相同的方法制备生物素标记的R,R-氨二醇，并提供氯霉素抗体和腔肠素，即可得到基于荧光素酶互补的生物传感器。
效果实施例1
下拉法检测抗氯霉素抗体与荧光素酶氨基端片段的结合能力
准备A、B两个1.5mL离心管，加入50μL Ni柱柱材，洗去保存液后用PBS平衡，再用PBS定体积到200μL。在A管中加入1μL浓度为1.8mg/ml的抗氯霉素抗体(anti-氯霉素)，B管中加入1μL浓度为2mg/ml的实施例1制得的荧光素酶氨基端片段(protein G-NGluc)，室温孵育30min。用PBS洗去未挂柱的蛋白，收集到编号3、4的两个样品。每管加入过量的anti-氯霉素，室温孵育10min。用PBS洗去多余的抗体，收集到编号5、6的两个样品。每管加入100μL含200mM咪唑的PBS洗脱液，收集到编号7、8的两个样品。SDS-PAGE电泳检测收集到的样品，结果如图2所示，其中泳道M为蛋白分子量标准(M)，泳道1为anti-氯霉素，泳道2为实施例1制得的荧光素酶氨基端片段；泳道3为A管中anti-氯霉素与Ni柱孵育后洗涤液，泳道4为B管中protein G-NGluc与Ni柱孵育后洗涤液，anti-氯霉素不挂柱，会全部洗脱，protein G-NGluc由于具有His标签与Ni结合挂柱，饱和后随洗脱液洗脱下来；泳道5为A管中anti-氯霉素过柱后的洗涤液，泳道6为B管中anti-氯霉素过柱后的洗涤液，A管中抗体不挂柱直接全部洗脱，B管中抗体与protein G-NGluc中的G蛋白结合，仅未结合部分洗脱下来；泳道7为A管中加入200mM咪唑后的洗脱液，泳道8为B管中加入200mM咪唑后的洗脱液，A管抗体不挂柱，在前面步骤全部洗涤干净，故无任何条带，B管因protein G-NGluc挂柱，抗体与proteinG-NGluc中的G蛋白结合也挂柱，所以洗脱液中包含两种蛋白，且浓度很高，也表明了抗体与protein G-NGluc结合，而不直接与柱材结合，同时也表明了protein G-NGluc保持了protein G与抗体结合的特性，确保在后续互补体系中这部分的结合是有效的。
效果实施例2
ELISA法检测抗氯霉素抗体与R,R-氨二醇的结合能力
用化学方法将牛血清白蛋白(BSA)偶联到R,R氨二醇上，得到BSA-R,R-氨二醇。将BSA(阴性对照)和BSA-R,R-氨二醇按1μg/ml铺板在ELISA吸附板上，4℃包被过夜。第二天吸弃包被液，洗板，拍干，加入200μL封闭液(1％BSA)，37℃封闭1h。吸弃封闭液，洗板拍干，加入100μL一抗(anti-氯霉素，鼠抗，1：5000稀释)，37℃孵育30min。吸弃一抗，洗板，拍干，加入100μL一抗(羊抗鼠，1：1000稀释)，37℃孵育30min。吸弃二抗，洗板，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃孵育15min后每孔加入50μL 2M的H2SO4终止反应，并于酶标仪上测OD450值，进行三组平行实验，结果如图3所示，包被BSA-R,R-氨二醇组的OD450显著高于阴性对照组，证实anti-氯霉素可以与R,R-氨二醇结合。
效果实施例3
基于荧光素酶互补的生物传感器对氯霉素进行定量检测
在A1管中加入1μM potein G-NGluc和1μM anti-氯霉素，终体积100μL。在A2管中加入1μM potein G-NGluc、1μM anti-氯霉素和20μM氯霉素，终体积100μL。在B管中加入2μMCGluc-mSA、2μM生物素标记的R,R-氨二醇(氯霉素类似物)，终体积200μL。A1、A2、B管于37℃孵育30min后，取100μL A1和100μL A2分别与100μL B混合形成C1管和C2管，并在37℃继续孵育1h。C1管中potein G-NGluc和anti-氯霉素终浓度为0.5μM，C2管中CGluc-mSA和生物素标记的R,R-氨二醇终浓度为1μM，氯霉素终浓度为10μM。
取C1管和C2管孵育后的混合液200μL，分别加入0.5μg腔肠素(储存液0.5mg/ml)，立即于酶标仪中测480±20nm通道的生物发光强度，同时将含有potein G-NGluc和CGluc-mSA混合液作为空白对照组C0，结果如图4所示，根据C2与C0的发光信号强度差值a，与C1与C0的发光信号强度差值b，即可得到a和b之间的差值与氯霉素的浓度相关，即能够对含有氯霉素的样品中的氯霉素进行定量分析。同时，请参阅图5，为基于荧光素酶互补的生物传感器的原理示意图，可以看出，A1和B混合形成C1管，其中CGluc-mSA、生物素标记的R,R-氨二醇、anti-氯霉素、potein G-NGluc相互互补，形成环路，拉近了NGluc和CGluc空间距离，使其重新组合恢复荧光素酶活性，可以催化底物CTZ产生发光信号强度；A2和B混合形成C2管，其中氯霉素的加入打破了上述闭合环路，使得C2管中既出现上述闭合环路，又存在单独的氯霉素、anti-氯霉素、potein G-NGluc之间的互补，以及单独的potein G-NGluc，NGluc和CGluc存在空间距离，无法重新组装恢复荧光素酶活性，因此催化底物CTZ产生发光信号强度降低，并与氯霉素加入的量成线性相关，即能够对氯霉素进行定量检测。
因此，本发明提供的基于荧光素酶互补的生物传感器及其制备方法，通过利用荧光素酶氨基端片段和羧基端片段互补、第一标记物和第二标记物互补、待测物/待测物抗原和待测物抗体互补以及G蛋白和待测物抗体互补的四元互补体系，通过比较待测物加入前后发光强度的变化，实现对待测物的快速检测，同时整个过程仅需要简单检测仪器，检测方便，成本低，同时检测灵敏度高、特异性强、背景噪音小，可以用于复杂样品中待测物的定量分析。
需要说明的是，根据上述说明书的揭示和阐述，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些等同修改和变更也应当在本发明的权利要求的保护范围之内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种基于荧光素酶互补的生物传感器，其特征在于，包括：
荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段，所述荧光素酶氨基端片段的氨基端和所述荧光素酶羧基端片段的羧基端中的其中一个与G蛋白连接，另一个与第一标记物连接，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶的两个互补片段；
待测物抗原，所述待测物抗原连接有第二标记物，所述第二标记物与所述第一标记物互补；
待测物抗体；以及
荧光素酶底物。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述第一标记物和所述第二标记物中的其中一个为生物素，另一个为亲和素。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述荧光素酶氨基端片段的氨基端和所述荧光素酶羧基端片段的羧基端，两者中的其中一个通过第一连接肽与所述G蛋白连接，另一个通过第二连接肽与所述第一标记物连接，所述第一连接肽和所述第二连接肽为柔性链。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述荧光素酶底物包括荧光素、海萤荧光素和腔肠素及其异构体中的至少一种。
5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶、海萤荧光素酶、萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶中的至少一个。
6.如权利要求5所述的生物传感器，其特征在于，所述荧光素酶为Gaussia荧光素酶，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为所述Gaussia荧光素酶在G93和E94位点之间分开形成的两个互补片段。
7.一种基于荧光素酶互补的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：
构建含有荧光素酶氨基端片段基因的第一表达载体，以及构建含有荧光素酶羧基端片段基因的第二表达载体，其中，所述第一表达载体中所述荧光素酶氨基端片段基因的5’端，和所述第二表达载体中所述荧光素酶羧基端片段基因的3’端中的其中一个插入G蛋白基因，另一个插入第一标记物的基因；
将所述第一表达载体和所述第二表达载体经转化、表达和纯化，得到荧光素酶氨基端片段和荧光素酶羧基端片段，所述荧光素酶氨基端片段的氨基端和所述荧光素酶羧基端片段的羧基端中的其中一个与G蛋白连接，另一个与第一标记物连接，所述荧光素酶氨基端片段和所述荧光素酶羧基端片段为同一荧光素酶的两个互补片段；
提供待测物抗原、所述待测物抗体和荧光素酶底物，所述待测物抗原连接有第二标记物，所述第二标记物与所述第一标记物互补，所述待测物抗原与所述待测物抗体结合，所述待测物抗体与所述G蛋白结合，得到基于荧光素酶互补的生物传感器。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第一表达载体和所述第二表达载体中含有His标签基因。
9.如权利要求1-6任一项所述的生物传感器，或权利要求7-8任一项所述的制备方法制得生物传感器在物质含量检测中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：
将所述荧光素酶氨基端片段、所述荧光素酶羧基端片段、所述待测物抗原、所述待测物抗体和已知浓度的所述待测物混合均匀，再加入所述荧光素酶底物混合后，检测发光强度，绘制待测物浓度与发光强度关系的标准曲线；
将所述荧光素酶氨基端片段、所述荧光素酶羧基端片段、所述待测物抗原、所述待测物抗体和所述荧光素酶底物混合后，检测发光强度为第一发光强度；
将所述荧光素酶氨基端片段、所述荧光素酶羧基端片段、所述待测物抗原、所述待测物抗体和不同浓度的所述待测物混合均匀，再加入所述荧光素酶底物混合后，检测发光强度为第二发光强度；
根据所述标准曲线、所述第一发光强度和所述第二发光强度，计算得到所述待测物的含量。
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