TW201818958A - 製造和使用可溶性主要組織相容性複合體(mhc)分子類之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供新穎之結合速率(Kon-速率)分析及改善之TCR配體解離速率(Koff-速率)分析,該分析透過與UV肽交換技術之新穎組合而使得應用更廣。本發明能以高通量方式製備Koff-速率MHC單體,該Koff-速率MHC單體隨後可用於在先前無法實行之分析(諸如TCR配體Koff-速率分析)中篩選TCR候選物以擴充肽集合庫。此外,該UV肽與Koff-速率MHC單體交換可允許分析能識別攜帶半胱胺酸胺基酸之特定肽的TCR候選物,該攜帶半胱胺酸胺基酸之特定肽先前可能干擾或甚至破壞Koff-速率之測量。
Description
本申請案主張2016年8月11日提出申請之美國臨時專利申請案號62/373,695之優先權;其全部內容以引用方式併入本文。
本申請案含有序列表,該序列表已經以ASC Ⅱ格式之電子方式提出且其全部內容以引用方式併入本文。該在2017年8月8日創建之ASC Ⅱ副本稱為K-1035_02_SL.txt且大小為538個字節。
本發明關於可溶性MHC分子和用於製備該等MHC分子之方法,該MHC分子可與該所欲之肽(諸如可裂解之肽)聯結;本發明亦提供該等分子之用途,包括鑑定T細胞受體及表現該等T細胞受體之T細胞。
MHC分子為調節T細胞反應之高度多態性蛋白質(參見,例如Owen et al.,Kuby Immunology 7thed.W.H.Freeman,2012)。可在人體中顯示肽抗原之MHC分子被稱為人類白血球抗原(“HLA”)。HLA I類分子可根據其與類似之肽庫結合的能力被分成幾個家族或“超類型”。HLA超類型包括A2、A3和B7。對欲被T細胞受體(TCR)識別,從而活化細胞毒性T淋巴細胞(CTL)並誘導效應子功能(諸如溶解靶細胞,例如腫瘤細胞)的肽而言,其必須與主要組織相容性複合體(MHC)聯結或由主要組織相容性複合體(MHC)“呈現”。MHC以二種類別存在,第1類MHC和第2類MHC。第1類MHC包含一多態性α鏈(亦稱為重鏈)和一非多態性β微球蛋白鏈(亦稱為輕鏈)。該二條鏈彼此經非共價方式聯結。第2類MHC含有彼此聯結之α和β鏈。二種類別之MHC均呈現肽予TCR。因此,為了鑑定可被指定之TCR識別之肽,必須令肽與MHC分子聯結。
在MHC之背景下鑑定特異性識別該所欲之肽抗原的T細胞受體(TCR)可能是有利的。該等肽可源自表現在被感染(例如HPV)之細胞或癌細胞上之蛋白質,因此,鑑定與該等肽結合之T細胞的能力可用於過繼細胞療法中。然而,鑑定用於指定之肽抗原的最佳T細胞候選者已被證明是具有挑戰性的。
為了鑑定與該所欲之肽抗原結合之TCR,已 研發各種方法來篩選TCR集合庫以鑑定可識別指定之測試肽的TCR,該TCR集合庫包含具有不同特異性之T細胞或未與細胞聯結之TCR。這些方法或是基於分析T細胞對靶細胞刺激之反應(Vigano et al.,(2012)Clin Dev Immunol 2012:153863)、測量分離出之經重組表現的TCR與MHC單體配體在溶液中聯結之結合動力學(Khilko et al.,(1995)J Immunol Methods 183(1):77-94;Bridgeman et al.,(2012)Immunology 135(1):9-18)的功能性讀出資料,或依賴裝填經重組表現之肽的MHC多聚體(Campanelli et al.,(2002)Int Immunol 14(1):39-44;Wang and Altman,(2003)J Immunol Methods 280(1-2):25-35;Stone et al.,(2011)J Immunol 187(12):6281-6290)。於其他分析中,TCR及MHC配體二者均被固定在將三維攪動還原成二維攪動的接觸位點,以模擬生理學之細胞-細胞交互作用(Huang et al.,(2010)Nature 464(7290):932-936;Huppa et al.,(2010)Nature 463(7283):963-967;Puech et al.,(2011)PLoS One 6(7):e22344)。
基於不可逆之MHC多聚體的測量可允許簡單且可重複地定量TCR配體Koff速率,此Koff速率為存活細胞上之TCR和T細胞功能品質的主要參數(Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10;Hebeisen et al.,(2015)Cancer Res 75(10):1983-91)。例如,Nauerth等人描述藉由實時顯微鏡術監測之方法,該方法可監測與表面表現之TCR結合的肽-主要組織相容性複合體(pMHC)分子的解離,此可允許計算koff速率。參見,例 如Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10;Weissbrich et al.,(2013)OncoImmunology 2(10):e26199。具有所需特性之TCR可藉由,例如Dössinger et al.,(2013)PLoS One 8:e61384;Linnemann et al.,(2013)Nat Med 19(11):1534-1541;Hamana et al.,(2016)Biochem Biophys Res Commun 474(4):709-714;及Zhang et al.,(2016)Sci Transl Med 8(341):341ra377中所描述之單細胞PCR或TCR基因捕獲法選擇及萃取。
這些方法,特別是Huppa et al.,(2010)Nature 463(7283):963-967、Hebeisen et al.(2015)Cancer Res 75(10):1983-91)及Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10中所描述之方法的挑戰為事實上許多方法並無法與高通量操作兼容,因為該經標記之MHC單體配體的生成工作很複雜。這些方法侷限在先前定義之肽特異性,不允許篩選源自新穎且多樣之靶抗原(諸如患者特異性新肽)的肽集合庫。重要的是,這些方法面臨的另一個挑戰為它們無法以包含用於結合TCR之半胱胺酸殘基的肽類(以下稱為“半胱胺酸肽”)查詢T細胞/TCR集合庫。無法使用包含半胱胺酸殘基(其與基於經由巰基連接之標記方法的化學不兼容)之測試肽進行篩選,這使得該整個類別之肽抗原被實際從當前的篩選活性和分析範圍移除。本發明解決這些及其他問題。
於一態樣中,提供產生經可檢測標記且裝載 可裂解之肽的可溶性MHC單體之方法。於一實施態樣中,該方法包含(a)形成標記混合物,該標記混合物包含:(1)TCEP;(2)與馬來醯亞胺共軛之可檢測標記物;及(3)包含α鏈和β鏈之可溶性MHC,該可溶性MHC進一步包含非天然產生之半胱胺酸殘基,其中該MHC係裝載可裂解之肽;(b)將該標記混合物在所需之培育溫度下培育一段所需之培育期;及(c)從該標記混合物移除未經結合之與馬來醯亞胺共軛的可檢測標記物。於各種實施態樣中,該標記物係選自由下列所組成之群組:放射性標記、螢光劑、顯色劑、化學發光劑及磁性顆粒,且於一特定之實施態樣中,該標記物為螢光染料且可選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素(coumarin)、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍(Cascade blue)、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(Phycoerythrin)(PE)、PE-Cy5共軛物、PE-Cy7共軛物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明(Rhodamine)、麗絲胺羅丹明B(Lissamine Rhodamine B)、德克薩斯紅(Texas Red)、別藻藍蛋白(Allophycocyanin)(APC)、APC-Cy7共軛物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦(Azurite)、GFPuv、T-藍寶石(T-Sapphire)、蔚藍(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、 GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midoriishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星(Venus)、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(Peridinin Chlorophyll)(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。於進一步之實施態樣中,該培育期為約2.5小時或低於2.5小時且該培育溫度為約20至24℃,而於另一實施態樣中,該培育期為約12小時且該培育溫度為約4℃。再者,於另外之實施態樣中,該MHC為MHC I。再於其他實施態樣中,該非天然產生之半胱胺酸係被引入下列一或二者:(a)MHCIβ鏈之位置67或88;和(b)MHCIα鏈之C端。於其他實施態樣中,該MHC複合體為MHC Ⅱ。再於進一步之實施態樣中,該非天然產生之半胱胺酸係被引入下列一或二者:(a)MHC Ⅱ β鏈之C端;和(b)MHC Ⅱ α鏈之C端。於一些實施態樣中,該可裂解之肽可被UV光裂解。亦提供藉由該方法產生之經可檢測標記的可溶性MHC單體。
於另一態樣中,提供鑑定與MHC-肽複合體聯結之TCR之方法。於一實施態樣中,該方法包含:(a)提供多聚體複合體,該多聚體複合體包含一主鏈,該主鏈以可逆方式與多個經可檢測標記之可溶性MHC單體聯結,每個經可檢測標記之可溶性MHC單體各自裝載該所欲之肽;(b)將該多聚體複合體與TCR在允許形成MHC-肽-TCR複合體之條件下接觸;(c)破壞該多聚體複合體;及(d)測定該MHC-肽-TCR Koff,其中該Koff指示TCR與該MHC-肽複合體聯結之程度。
於一些實施態樣中,該方法進一步包含藉由實施下列步驟首先形成該多聚體複合體:提供裝載可裂解之肽的如本文所描述之經可檢測標記之可溶性MHC單體;將該可裂解之肽與該所欲之肽交換,從而產生裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體;令該主鏈以可逆方式與多個經可檢測標記之各自裝載該所欲之肽的可溶性MHC單體聯結以形成多聚體複合體。
於一實施態樣中,該所欲之肽包含半胱胺酸殘基。於其他實施態樣中,該Koff為約20秒或超過20秒且表示該TCR與該MHC-肽複合體聯結,而於其他實施態樣中,Koff為約15至約500秒或超過500秒且表示該TCR與MHC-肽複合體聯結。再於其他實施態樣中,該TCR集合庫包含多個T細胞,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子和CD8分子中一或二者。於其他實施態樣中,該方法進一步包含以編碼TCR之α和β鏈的核酸轉導T細胞。於一些實施 態樣中,該方法係在約4℃至約37℃之溫度下實施,而於其他實施態樣中,該溫度為約20℃。於一實施態樣中,該所欲之肽包含新抗原。再於另一實施態樣中,該方法進一步包含基於本文所描述之動力學性質(例如Kon、Koff,等)從該選定之T細胞分離出TCR基因。
於另一態樣中,提供選擇適合用於過繼轉移之T細胞之方法。於一實施態樣中,該方法包含(a)提供多聚體複合體,該多聚體複合體包含與多個裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體以可逆方式聯結之主鏈;(b)令該多聚體複合體與TCR集合庫在允許形成MHC-肽-TCR複合體之條件下接觸,該TCR集合庫包含多個表現多個TCR之T細胞;(c)破壞該多聚體複合體;(d)測定MHC-肽-TCR複合體之Koff;及(e)選擇用於過繼療法之T細胞,其中該T細胞所表現之TCR與MHC-肽複合體之間的Koff為15秒至約500秒。
於一些實施態樣中,其中該方法進一步包含藉由實施下列步驟首先形成該多聚體複合體:提供裝載該可裂解之肽的如本文所描述之經可檢測標記的可溶性MHC單體;令該可裂解之肽與該所欲之肽交換,藉此產生裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體;並藉由將主鏈與多個裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體以可逆方式聯結形成多聚體複合體。
於各種實施態樣中,該TCR集合庫包含多個T細胞,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子和CD8分子中一 者。於一些實施態樣中,該方法進一步包含:(h)將在(g)中選擇之T細胞擴增成具有至少約1×102個T細胞之群體;及(i)對個體投予所需數目之T細胞。於一些實施態樣中,對個體投予至少約1×106個T細胞。於一些實施態樣中,對個體投予至少約1×106個T細胞/kg體重、約1×107個T細胞/kg體重、約1×108個T細胞/kg體重、或約1×109個T細胞/kg體重。
再於另一態樣中,提供鑑定所欲之結合對之成員之方法。於一實施態樣中,該方法包含(a)形成標記混合物,該標記混合物包含:(1)TCEP;(2)與馬來醯亞胺共軛之可檢測標記;和(3)結合對之第一成員;(b)將該標記混合物在所需之培育溫度下培育所需之培育期;(c)從該標記混合物移除未經結合之與馬來醯亞胺共軛的可檢測標記物;(d)令結合對的一個成員與包含該結合對之已知或被懷疑的第二成員之篩選集合庫在允許形成聯結複合體的條件下接觸;及(e)檢測形成之聯結複合體。於各種實施態樣中,該標記物係選自由下列所組成之群組:放射性標記、螢光劑、顯色劑、化學發光劑及磁性顆粒,且於一實施態樣中,該標記物為螢光染料。於各種實施態樣中,該螢光染料係選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5共軛物、PE-Cy7共軛物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、 Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7共軛物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midoriishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星(Venus)、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(Peridinin Chlorophyll)(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。於其他實施態樣中,該第一結合伴包含半胱胺酸殘基,且於其他實施態樣中,該結合對係選自由下列所組成之群組:(i)包含Fab片段和表現在腫瘤細胞表面上之蛋白質的抗原結合分子;(ii)scFv和表現在腫瘤細胞表面上之蛋白質;(iii)DNA結合蛋白和DNA;(iv)重組蛋白和嵌合抗原受體;及(v)跨膜黏附分子和其同源 配體。於一特定之實施態樣中,該結合對為重組蛋白且該細胞表面受體為嵌合抗原受體。於其他實施態樣中,該篩選集合庫包含多個T細胞,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子和CD8分子中一或二者。於再進一步之實施態樣中,該方法係在約4℃至約37℃之間的溫度下進行。再於進一步之實施態樣中,該方法進一步包含測定包含該結合對之第一和第二成員的聯結複合體之動力學性質的步驟,該動力學性質係選自由Koff和Kon所組成之群體,其中該動力學性質表示配體與聯結複合體聯結之程度。於一些實施態樣中,Koff為約15秒或超過15秒且表示該結合伴形成聯結複合體,而於其他實施態樣中,Koff為約15至約500秒或超過500秒且表示該結合伴形成聯結複合體。
於一態樣中,本發明提供鑑定與MHC-肽複合體聯結之TCR之方法,該方法包含:(a)令表現一或多個TCR之細胞與多個經可檢測標記之多聚體複合體接觸,各個經可檢測標記之多聚體複合體包含一主鏈,該主鏈與多個裝載該所欲之肽的MHC單體以不可逆方式聯結,其中與該多聚體複合體聯結之細胞(多聚體陽性細胞)表現特異於裝載該所欲之肽的MHC單體之TCR,而不與該多聚體複合體聯結之細胞(多聚體陰性細胞)則不表現特異於裝載該所欲之肽的MHC單體之TCR;(b)在允許形成MHC單體-肽-TCR複合體之條件下引入多個經區別性標記之可溶性MHC單體,每一可溶性MHC單體各自裝載該所欲之肽;(c)從MHC單體之總信號減去與多聚體陰性細胞聯結之MHC單 體的信號以檢測形成之特定MHC單體-肽-TCR複合體;(d)測定呈時間函數的步驟(c)所檢測之特定MHC單體-肽-TCR複合體的形成速率,從而測定該MHC單體-肽-TCR Kon,其中該Kon表示TCR與該MHC單體-肽複合體之聯結程度。
於一些實施態樣中,該經可檢測標記之多聚體複合體係藉由將裝載該所欲之肽的生物素化之MHC單體在鏈親和素上進行多聚化形成,其中生物素或鏈親和素係經可檢測標記。
於一些實施態樣中,其中該方法進一步包含首先提供裝載可裂解之肽的如本文所描述之經區別標記的可溶性MHC單體;及令該可裂解之肽與該所欲之肽交換,從而產生裝載該所欲之肽的經區別標記之可溶性MHC單體。
於一些實施態樣中,該裝載該所欲之肽的經區別標記之可溶性MHC單體係保持固定濃度。於一些實施態樣中,該經區別標記之可溶性MHC單體的固定濃度係在10至50μM之範圍內。
於一些實施態樣中,該Kon為約50秒或低於50秒且表示該TCR與該MHC單體-肽複合體聯結之所欲程度。於一些實施態樣中,該Kon為約10至約30秒表明該TCR與該MHC單體-肽複合體之理想聯結程度。
於一些實施態樣中,該TCR係提供在包含多個T細胞之集合庫中,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子 和CD8分子中一或二者。
於一些實施態樣中,本發明之方法進一步包含以編碼該TCR之α和β鏈的核酸轉導T細胞之步驟。
於一些實施態樣中,該MHC單體-肽-TCR複合體之形成係藉由流式細胞術檢測。
於一些實施態樣中,該方法係在約4℃至約37℃之間的溫度下進行。於一些實施態樣中,該方法係在約20℃-25℃之間的溫度下進行。在於一些實施態樣中,該方法進一步包含以抗-CD4及/或抗-CD8抗體標記細胞之步驟。
於一些實施態樣中,該所欲之肽包含新抗原。
於一些實施態樣中,本發明提供測定TCR與MHC-肽複合體之間的解離常數(KD)之方法,該方法包含:(a)根據本文所描述之方法測定TCR與MHC-肽複合體之間的Koff;(b)根據本文所描述之方法測定TCR與MHC-肽複合體之間的Kon;(c)將步驟(a)測定之Koff除以步驟(b)測定之Kon以計算解離常數(KD)。於一些實施態樣中,該Koff和Kon係使用表現TCR和共受體之T細胞測定,其中該計算之KD表示TCR與共受體和MHC-肽複合體之間結合的解離常數。於一些實施態樣中,該共受體為CD4或CD8受體。於一些實施態樣中,該方法進一步包含基於該計算之KD測定結合常數(KA)的步驟。
第1圖之圖形描繪本發明方法之一種實施態樣的步驟。
第2圖之漫畫描繪用於高通量產生具有不同特異性之MHC單體之一般UV-肽交換的步驟和策略。
第3圖之一系列三個漫畫描繪使用pMHC複合體來鑑定TCR之代表性TCR配體Koff速率分析,該pMHC複合體係使用本發明方法產生;第3A圖顯示複合體,該複合體包含表現在T細胞表面上之TCR,其與pMHC複合體結合,該pMHC係在Strep-Tactin®上多聚化,而第3B圖顯示出透過生物素之作用釋出該Strep-Tactin®,且第3C圖顯示出由TCR親留力介導從TCR釋出pMHC。
第4圖之一系列漫畫和圖形顯示觀察到裝載半胱胺酸肽類及使用先前已知之方法標記的MHC單體破壞表現TCR之T細胞的染色;第4A圖描繪半胱胺酸肽可能發生之非特異性標記,而第4B圖描繪非特異性結合如何可防止pMHC與TCR之間交互作用,第4C和4D圖定量顯示T細胞染色如何可被非特異性標記。
第5圖之一系列繪圖顯示當使用已知之方法標記該肽類時出現之SEC結果,其突顯在不同肽類之存在下使用已知方法標記之前正確之pMHC折疊;含有半胱胺酸殘基(第5A圖;具半胱胺酸之肽)、不含有半胱胺酸殘基之肽(第5B圖;不具有半胱胺酸之肽)和非典型之UV不穩定肽(第5C圖)。
第6圖之漫畫顯示出本文所提供之標記過程的示意圖。
第7A至7E圖之一系列漫畫和圖形描繪如本文所揭示之雙染料標記過程。
第8A至8D圖之一系列繪圖顯示依本文之描述標記的pMHC單體對TCR配體Koff速率測量具有功能。
第9圖之條形圖顯示與標準MHC單體相比較,pMHC單體從TCR解離的情形,該pMHC單體係使用本文提供之方法標記。
第10A至10D圖之漫畫和6個繪圖顯示本發明之標記方法允許在TCR配體Koff速率分析中分析特異於含有半胱胺酸之肽的TCR。
第11圖之一系列四個漫畫描繪採用本發明方法,使用經可檢測標記之可溶性配體產生的可能之細胞表面受體-配體交互作用;第11A圖顯示用於分析表現在靶細胞(諸如腫瘤細胞或健康組織細胞)上之pMHC表現的經可檢測標記的重組表現之TCR,第11B圖顯示該經可檢測標記之重組表現的抗原性靶蛋白或其片段於測量嵌合抗原受體結合強度之用途,而第11C圖顯示該經可檢測標記之scFv片段於測量其與表面表現之靶蛋白的結合強度之用途,最後,第11D圖顯示該經可檢測標記之不變的MHC單體於鑑定NK細胞之用途。
第12圖之一系列二個漫畫描繪藉由本文所描述之方法產生的經可檢測標記之MHC單體的多聚化和固定 策略;第12A圖顯示該pMHC以不可逆或可逆方式固定在表面上(諸如平面脂質雙層),且在該圖形中,經標記之MHC單體被限制在側面移動,而第12B圖顯示固定在相對靶的(諸如紅血球或小珠)上之pMHC單體。
第13圖之一系列二個漫畫描繪實驗裝置以分析介於TCR和pMHC之間的單體交互作用,而無預先將pMHC多聚化以允許結合特定之T細胞;第13A圖顯示固定在微流體裝置上之T細胞、重組TCR或重組pMHC,而第13B圖顯示該被捕捉在脂質雙層囊泡中表現TCR之T細胞在可溶性pMHC配體的存在下,以本文所描述之方法標記。
第14圖之漫畫描繪用於鑑定與MHC單體結合之抗原肽的高通量方法;該圖形顯示固定在孔中,裝載UV不穩定肽之MHC以本文所描述之方法在輕鏈上標記。
第15圖之漫畫描繪同時測量TCR配體結合和T細胞活化之策略;該圖形顯示表現在T細胞之表面上的TCR與經標記之可溶性pMHC配體結合和被招募到該經活化之TCR的經標記之胞內信號傳導蛋白,及在T細胞活化時引發之鈣流入。
第16A圖說明包含經TCR轉導之T細胞之混合物的細胞懸浮液。特異性表面所表現之所欲TCR係以與螢光標記物共軛之MHC多聚體複合體標記。非特異性T細胞缺乏MHC多聚體標記物。將以本發明之方法標記之可溶性MHC單體加入該細胞懸浮液中。1-經標記之可溶性pMHC;2-經非特異性結合之經標記的pMHC;3-非特異性 T細胞;4-表面表現之TCR;5-經特異性結合,經標記之pMHC;6-以7-可檢測之pMHC多聚體染色之特異性T細胞。第16B圖之一系列繪圖顯示門控策略和監測與特定T細胞聯結之pMHC單體。第16C圖之繪圖為pMHC單體聯結之經校正的螢光值。第16D圖比較特異於同一肽-MHC單體的二個TCR的聯結時間。
本發明提供改善之TCR配體Koff速率分析以透過新穎之組合而應用更廣,其可輕易地被修改成適合協助目前之肽交換方法成功運作(參見,例如Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10;Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 1(3):1120-1132;Gannon et al.,(2015)J Immunol 195(1):356-366;Hebeisen et al.,(2015)Cancer Res 75(10):1983-1991;US專利案第7,776,562號)。本發明之方法能以高通量的方式製備pMHC單體,這在以前是不可行的,因此能夠快速篩選用於與pMHC結合之TCR候選物。此外,本發明之方法允許分析可識別特定pMHC複合體之TCR候選物,其中該肽包含半胱胺酸胺基酸;由於半胱胺酸殘基之存在可干擾或甚至破壞測定正確之Koff速率測量值的能力,從而防礙包含可能有意義之用於TCR結合的候選物的整個肽類別之研究,因此該類別之肽不能使用先前已知之方法研究。
用於本文所描述之MHC單體的標記程序可與 肽交換技術和方法結合。使用本發明之方法可以高通量之方式產生經標記之MHC單體並可裝載含有半胱胺酸之肽類(其先前干擾已知之分析),因此可協助分析更廣譜之特異性T細胞。
如本文所指出者,先前之研究證明許多特異於半胱胺酸肽類之TCR不能利用先前可用之方法(包括那些包含標記可溶性MHC者)在TCR配體Koff速率分析中分析其結構TCR結合親留力。先前描述之標記程序可能不合理想地修飾在該肽中之半胱胺酸殘基,因此干擾該肽與表現在T細胞上之特異性TCR交互作用並抑制染色(參見第4圖)。
半胱胺酸肽特異性TCR與免疫療法有關。例如,HLA-A*02:01 NY-ESO-1157-165特異性、親和力增強之TCR 1G4識別肽SLLMWITQC(SEQ ID NO:1)並顯示促進在轉移性滑膜肉瘤、黑色素瘤和多發性骨髓瘤中之臨床反應(Robbins et al.,(2015)Clin Cancer Res 21(5):1019-27;Rapoport et al.,(2015)Nat Med 21(8):914-2)。分析這些TCR之一種策略為將肽中之半胱胺酸殘基與其他胺基酸交換/突變。例如,已可將多個半胱胺酸殘基以等價胺基酸替換以產生MHC多聚體(Schepers et al.,(2002)J Immunol 169(6):3191-9)。特異於NY-ESO-1157-165 SLLMWITQC(SEQ ID NO:1)肽之TCR已使用肽類似物SLLMWITQA(SEQ ID NO:2)分析TCR結合親留力(Hebeisen et al.,Cancer Res 75(10):1983-91)。
雖然該MHC多聚體允許與特異性TCR結合,對該經修飾之肽的結合動力學及功能性反應是可被改變的(Chen et al.,(2005)J Exp Med 201(8):1243-55;Romero et al.,(2001)Clin Cancer Res 7(3 Suppl):766s-772s;Wang et al.,(2002)J Immunol 169(6):3137-45;Aleksic et al.,(2010)Immunity 32(2):163-74)。與特異於同一肽之其他TCR相比較,個別TCR與經修飾之肽MHC的結合親和力可能受到不同的影響。此外,對特異於其他非半胱胺酸和未經修之肽類的TCR之動力學的比較是受到限制的。
本發明揭示可規避先前研究半胱胺酸肽類之方法的大略限制之方法及裝載半胱胺酸肽類之MHC。在MHC單體之標記程序之後藉由UV肽交換來裝載半胱胺酸肽可防止該半胱胺酸之任何修飾;產生用於TCR配體Koff速率測量之功能性MHC單體並呈現於下列實施例中。因此,於一態樣中,本發明提供經修飾之標記程序,該經修飾之標記程序係基於以三(2-羧乙基)膦(TCEP)替換還原劑二硫蘇糖醇(DTT)。這些化合物為藥劑,添加該藥劑以減少在MHC單體上之非天然產生的半胱胺酸殘基以與本發明方法之馬來醯亞胺染料共價共軛。
先前已知之標記程序係基於長期以DTT預處理和緩衝液交換並允許在測試肽之存在下標記重新折疊之MHC單體(Nauerth et al.,(2013)Sci Transl Med 5(192):192ra87)。DTT預處理和馬來醯亞胺標記經裝載UV不穩定肽之MHC單體(其係用於先前方法(Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 1(3):1120-32)中之生物素化的,未經標記之MHC單體)導致非功能性MHC單體(Weissbrich,(2015)“T cell Receptor Binding Avidity of Antigen-specific CD8+ Cytotoxic T cells in Chronic Infection,”PhD Dissertation,Technical University of Munich)。令人驚訝地,以TCEP代替DTT並在不預處理及以反應性馬來醯亞胺標記時使用它,有可能產生功能性UV-肽交換之MHC單體。在以所欲之測試的半胱胺酸肽交換肽時,該染色和解離與使用先前之方法製備之MHC單體相當(參見第7、8和9圖)。藉由UV-肽交換將半胱胺酸肽裝載在經標記之MHC單體上並將其在Strep-Tactin®上多聚化可允許將特異性T細胞染色,並測定MHC單體之解離速率(第10圖)。
本文提供之方法大體上針對UV-肽交換之MHC單體的標記,因此可拓寬TCR配體Koff-速率分析之應用範圍。值得注意的是,現在可分析半胱胺酸肽-特異性TCR,而不需修飾該肽,開啟受先前方法限制之肽類別的研究。此外,高通量產生具不同肽類之經標記的MHC單體可降低成本和時間。本發明方法所需之特定測試肽的量降低超過12倍。使用本發明之方法現在可合成小規模之肽集合庫並用於篩選TCR集合庫。以此方式,可測試新穎之先前未曾描述過之肽類,諸如患者-特異性新型抗原決定部位及/或選定之TCR可針對野生型肽之變體查詢,以鑑定交叉反應性肽變體,例如鑑定脫靶毒性或分析病毒性突變之逃脫變體。
因此,本發明之方法擴大鑑定與特定pMHC複合體結合之TCR的能力。例如,使用本發明之方法可研究半胱胺酸肽特異性TCR候選物,這在以前是不可能的;包含新穎特異性之肽集合庫可藉由不同TCR快速查詢;再者,可使用肽模擬抗原決定部位(mimotope)集合庫以高通量的方式研究那些被發現與pMHC複合體結合之TCR以測定該TCR是否與該被發現與該TCR結合之pMHC的肽不同之肽交叉反應。
I.定義
為了使本發明可更容易地被理解,首先定義某些術語。除非本文中另有明確說明,如本申請案中所使用之下列各術語應具有下文中所闡明之含義。另外之定義闡述於本申請案之全文中。
本文中之單位、前置代號和符號係以其國際單位制(SI)接受之形式表示。數值範圍包括界定該範圍之數目。本文所提供之標題並非用來限制本揭示內容之各種態樣,其可藉由整體參考本專利說明書來理解。因此,緊接在下文中定義之術語可藉由參考本專利說明書之全文被更充分地定義。
除非另有定義,本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明相關之技藝中的一般技術人士所通常理解者相同的含義。例如,The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,CRC Press(2002);The Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,Academic Press(1999);及The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修訂版,Oxford University Press(2000)提供本技藝中之技術熟習人士本發明所使用之許多術語的一般字典。
應理解的是,每當本文中以語言“包含”描述態樣時,亦提供以“由...組成”及/或“基本上由......組成”之術語描述的其他類似態樣。
如本文所使用之術語“約”係指在由本技藝之一般技術人士所測定之特定數值或組成之可接受的誤差範圍內的數值或組成,其將部分取決於該數值或組成是如何測量或測定的,即,該測量系統之限制。例如,“約”或“基本上包含...”可意指依照本技藝實行時在一或一個以上之標準偏差內。或者,“約”或“基本上包含...”可意指高達10%之範圍(即±10%)。例如約3mg可包括介於2.7mg至3.3mg(高達10%)之間的任何數值。再者,尤其當與生物系統或處理程序相關時,該術語可意指至多一個數量級或至多為數值之5倍。除非另外表示,當本申請案和申請專利範圍中提供特定之數值或組成時,“約”或“基本上包含...”的含義應當被假定為在該特定數值或組成之可接受的誤差範圍內。
除非另外表示,如本文所描述之任何濃度範圍、百分比範圍、比例範圍或整數範圍應被理解為包括在該列舉之範圍內的任何整數之數值,且當適當時,包括該 整數之分數(諸如整數的十分之一和百分之一)。
如本文所使用之術語“及/或”被認為係具體揭示該二個特定之特性或組分的各個特性或組分,加上或不加上另一特性或組分。因此,本文之短語,諸如“A及/或B”中所使用之術語“及/或”意圖包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨)和“B”(單獨)。同樣地,短語,諸如“A、B及/或C”中所使用之術語“及/或”意圖包含下列各態樣:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(單獨);B(單獨);和C(單獨)。
如本文所使用者,使用二中擇一之術語(例如“或”)應被理解為意指該可供選擇之選項的其中一者、二者或彼等之任何組合。
除非上下文另有規定,如本文所使用之術語“一(a和an)”係依循標準慣例使用且意指一或多項。
如本文所使用之術語“結合親留力”意指介於分子(例如TCR)之結合部位與其結合伴(例如裝載在MHC上之抗原肽)之間的非共價交互作用之總和強度。除非另外表示,如本文所使用之“結合親留力”係指內在結合親留力,其反映三元結合對之成員(例如與pMHC單體結合之TCR與CD8共受體的組合)之間的1:1:1交互作用或二元結合對之成員(例如表現在CD8陰性細胞上之TCR和pMHC;與CD8之結合被破壞的TCR和pMHC;CAR與抗原)之成員間的1:1交互作用。分子X(與分子Y組合)對其伴侶Z之結構結合親留力通常可由解離常數(KD)表示或相反地,由結合常 數(KA)表示。KD係從koff/kon之商數計算得到,而KA係從kon/koff之商數計算得到。kon係指,例如pMHC與CD8共受體和TCR之結合速率常數,而koff係指,例如pMHC從TCR和CD8共受體解離。
如本文所使用之術語“可裂解之肽”意指與MHC單體共價或非共價聯結之肽,其可藉由打斷在該可裂解之肽中之一或多個非天然產生之胺基酸而與MHC單體分開。於各種實施態樣中,該可裂解之肽包含促進該肽與MHC連結之非天然產生的胺基酸。從MHC裂解出可裂解之肽的示例性方法包括UV光、由化學試劑介導和氧化裂解(Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 1(3):1120-1132、Rodenko et al.,(2009)J Am Chem Soc 131(34):12305-12313、Amore et al.,(2013)Chembiochem 14(1):123-131)。
如本文中所使用之術語“可檢測之標記物”意指與所欲分子(諸如MHC單體)聯結且用於協助測定是否存有所欲分子的化學或生化部分。當標記物與所欲分子聯結時,該分子被稱為經可檢測地標記。因此,經可檢測地標記之MHC單體意指與可檢測之標記物相聯結的MHC單體。可檢測之標記物之實例包括,但不限於螢光劑、顯色劑、化學發光劑、磁性顆粒,等。本文中提供這些標記物類型之各標記物的具體實例。
如本文所使用之術語“經分離的”係指並非在其天然環境中之分子(諸如肽或核酸,或其衍生物)。對於欲分離之分子而言並不需要特殊之純化程度。例如,經分 離之多肽(諸如TCR或MHC)可單純從其天生或天然的環境中移出。考慮分離出表現在宿主細胞中或表面上之經重組產生的多肽和蛋白質以用於本發明之目的,如同已藉由任何合適之技術分離、分餾、或部分或實質上純化之天然或重組多肽。
如本文所使用之術語Koff係指結合複合體與其組分結合伴(其本身可包含含有二或多個結合伴之複合體)解離之速率。舉例而言,當在pMHC-TCR交互作用之背景下使用時,Koff意指pMHC複合體從指定之TCR解離的速率。該TCR可重組表現並配置在表面上,或者其可表現在細胞表面上,諸如表現共受體CD4或CD8之細胞,該共受體CD4或CD8有助於pMHC-TCR解離和Koff速率,且在此情況中,Koff係指K3D,因為該聯結複合體包含三個成員,TCR、pMHC和CD4或CD8。若CD4或CD8不存在,或者CD4或CD8存在但為突變形式,從而使其不能與pMHC-TCR複合體聯結種,Koff僅代表該二元pMHC-TCR複合體之解離。因此,除非另有說明,術語Koff代表包含二或更多個結合伴之聯結複合體解離並反映在該複合體中之結合伴的數目。
如在本發明所有方法之情況中,於其他實施態樣中,該TCR及/或pMHC可被配置在非天然產生之環境中,諸如與表面聯結(諸如孔槽盤)之雙層,或在通常不表現TCR及/或MHC之細胞上。其可藉由記錄經標記之pMHC的檢測信號(例如螢光信號)從TCR呈時間函數衰變計算。 pMHC-TCR交互作用之半衰期時間(t1/2)可從Koff速率計算(=ln2/Koff)。本文中報導(例如在實施例中)之半衰期時間均使用此關係來計算。參見,例如Nauerth et al.,(2013)Sci.Trans.Med.5(192):1-10)。
如本文所使用之術語Kon係指結合複合體與其組分結合伴(其本身可包含含有二或多個結合伴之複合體)結合之速率。舉例而言,當在pMHC-TCR交互作用之背景下使用時,Kon意指pMHC複合體與指定之TCR聯結的速率。其可藉由記錄經標記之pMHC與TCR聯結時呈時間函數之信號增加計算。同樣地,於其他實施態樣中,該TCR及/或pMHC可被配置在非天然產生之環境中,諸如與表面(諸如孔槽盤)聯結之雙層,或在通常不表現TCR及/或MHC之細胞上。
該結合複合體之動力學性質Koff和Kon提供動力學性質KD之資訊。KD可基於Koff和Kon之觀測值來計算。如本文所使用之KD被定義為Koff對Kon之比率(KD=Koff/Kon)。
如本文所使用之術語“MHC單體”係指包含二個非共價聯結之鏈,α鏈和β鏈的蛋白質複合體,其係由參與控制負責生理性免疫反應之細胞交互作用的基因簇編碼。在人體中,MHC複合體亦稱為人類白血球抗原(HLA)複合體。參見,例如Owen et al.,Kuby Immunology 7th ed.W.H.Freeman,2012,Murphy et al.,(2016)Janeway’s Immunobiology,9th ed.,Garland Science,其全文被併入本 文用於任何目的。術語“MHC單體”同時包含第I類MHC(包含重(α)鏈和輕(β或β微球蛋白)鏈)及第Ⅱ類MHC(包括α和β鏈)複合體。
如本文所使用之術語“蛋白質”和“多肽”可互換使用,且係指具有二或更多個胺基酸或胺基酸類似物(包括非天然產生之胺基酸)的鏈,其中之相鄰胺基酸係藉由肽鍵(--NHCO--)連結。
如本文所使用之術語“還原劑”意指在適合由還原劑捐贈電子並由接收元素或化合物接收之條件下捐贈電子給不同元素或化合物之元素或化合物。
如本文所使用之術語“殘基”係指藉由醯胺鍵或醯胺鍵模擬物被併入肽或蛋白質之胺基酸殘基、模擬物或模擬物。如本文所使用之術語“胺基酸”係指二十種習知(例如,天然產生)胺基酸且其縮寫遵循習知用法。參見,例如Immunology:A Synthesis,2nd ed.,Golub and Green(eds.),Sinauer Assoc.,(1991),其以引用方式併入本文用於任何目的。
該二十種習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸,諸如α-,α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸、正亮胺酸和其他非習知和非天然產生之胺基酸亦可為用於本發明化合物之多肽及方法的合適組分。非習知胺基酸之實例包括:γ-羧基麩胺酸化物、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基 離胺酸、σ-N-甲基精胺酸、高離胺酸、高精胺酸、高絲胺酸、氮雜環丁烷羧酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2,4-二胺基異丁酸、鎖鏈素(desmosine)、2,2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天門冬醯酸、高脯胺酸、羥基離胺酸、別-羥基離胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、異鎖鏈素、別異亮胺酸、N-甲基丙胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異亮胺酸、N-甲基戊基甘胺酸、N-甲基纈胺酸、萘丙胺酸、正纈胺酸、正亮胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸、戊基甘胺酸、哌可酸、硫脯胺酸及類似之胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文所使用之多肽表示法中,根據標準用法和慣例,左手方向為胺基端方向而右手方向為羧基端方向。
本文所使用之術語“個體”和“患者”可互換使用且係指正接受治療異常生理狀況(諸如癌症)或已被正式診斷患有病症者、無被正式識別之病症者、接受醫療護理者、處於發展出病症之風險中者,等。術語“個體”和“患者”包括人類和非人類動物個體。
如本文所使用之術語“T細胞”或“T淋巴細胞”可互換使用且係指源於胸腺(或活體外人工胸腺器官樣系統)且具有異二聚體受體之淋巴細胞子集,該異二聚體受體通常與CD3複合體之一或多個蛋白質(例如重排之T細胞 受體、在T細胞表面上負責細胞之抗原/MHC特異性的異二聚體蛋白)相聯結。
另外的定義可在本發明之下文中找到。
Ⅱ.示例性實施態樣
現行方法允許大的肽集合庫裝載在其各自之MHC單體上,藉此創建各種組別之裝載肽的MHC單體,該MHC單體可用來分離、鑑定和表徵來自各種來源材料的T細胞,該T細胞表現特異性識別指定之肽抗原的TCR。參見,例如Rodenko et al.,(2006)Nature Protocols 1(3):1120-32;Hadrup & Schumacher(2010);Cancer Immunol Immunother 59(9):1425-1433;Hombrink et al.,(2011).PLoS One 6(8):e22523;Andersen et al.,(2012)Nat Protoc 7(5):891-902;Hombrink et al.,(2013)Eur J Immunol 43(11):3038-3050;Linnemann et al.,(2013)Nat Med 19(11):1534-1541;Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10;Knabel et al.,(2002)Nat Med 8(6):631-637;Hebeisen et al.,(2015)Cancer Res 75(10):1983-1991;Weissbrich et al.,(2013)OncoImmunology;Zhang et al.,(2016)Sci Transl Med 8(341):341ra377,這些文獻全部以引用方式明確併入本文。其他可使用之方法描述於Stronen et al.,(2016)Science 352(6291):1337-1341中。
這些方法具有一些限制,包括觀察到產生攜帶可逆Strep標籤®和螢光染料之koff速率MHC單體,其無法與這些方法所需要之UV肽交換策略組合。參見,例如 Weissbrich,(2015)“T cell Receptor Binding Avidity of Antigen-specific CD8+ Cytotoxic T cells in Chronic Infection”慕尼黑科技大學博士論文。具體而言,現已發現在先前提供之方案中,用於與染料共軛之koff速率MHC單體的UV可裂解肽導致非功能性試劑。儘管對這些方法進行各種修改和替代策略,產生裝載UV肽之與染料共軛的MHC單體是不可能的。
在本發明之前,由於消耗大量的試劑和,重要的是,時間,產生這些koff速率MHC單體的僅限於選定之肽類。使用較早之方法,用於標準產生一個選定之肽MHC組合的持續期間可能需要數天,合成大量該所欲之肽需要數週。
在本發明之方法中,koff速率MHC單體與染料共軛係使用將染料與游離,還原之半胱胺酸共價偶聯的馬來醯亞胺反應達成。在馬來醯亞胺染料共軛之前,將經再折疊和純化之MHC單體暴露於還原劑,以防止肽抗原之半胱胺酸殘基與被引入MHC單體之一或多個點的非天然產生之半胱胺酸的巰基(--SH)基團之間形成二硫鍵橋(例如在MHC重鏈的末端或MHC 1單體之輕鏈位置67或88;參見Hebeisen et al.,(2015)Cancer Res 75(10):1983-1991;Walter et al.,(1998)J Immunol Methods 214(1-2):41-50)。
在先前使用習知肽類之方法中,該通常存在於MHC序列中的四個半胱胺酸未暴露於表面,因此不會被還原條件影響。現已觀察到,在UV可裂解肽之存在下, 該還原和染料共軛之程序影響MHC單體之穩定性。因此,依賴巰基化學來連接MHC的標記物是不可能使用早期之標記方法。確實,在本發明之前,實施這些步驟所產生之MHC單體並無法與抗原特異性T細胞聯結。因此,需要能在染料共軛步驟期間增加裝載UV不穩定肽之MHC單體的穩定性,從而提供裝載UV不穩定肽之經可檢測標記的可溶性MHC單體,此裝載UV不穩定肽之經可檢測標記的可溶性MHC單體隨時可與該所欲之肽進行交換。然後,該pMHC複合體將可隨時用於查詢TCR/T細胞集合庫;相反地,TCR/T細胞隨時可用於查詢使用該方法創建之pMHC複合體集合庫。
Ⅱ.a.產生裝載可裂解之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體之方法
提供產生裝載可裂解之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體之方法。該方法可用於產生隨後可用於查詢TCR集合庫之pMHC,該TCR可被配置在,例如活體外T細胞、TIL、T細胞系、以TCR基因轉導之細胞(在此情況中,該T細胞亦可為CD4和CD8陰性)上。
於本發明之方法中,首先形成標記混合物。該標記混合物協助可檢測之標記物與MHC單體聯結。該標記混合物包含還原劑,該還原劑係用於防止pMHC單體之間形成不欲有的二硫鍵,從而提供可溶性且非多聚體之pMHC,具有可讓馬來醯亞胺標籤接近之半胱胺酸殘基。 較佳之還原劑為三(2-羧乙基)膦(TCEP)。TCEP較佳,因其不含有可在標記反應期間與該pMHC單體之任何硫醇基團競爭的硫醇基,且較其他還原劑更穩定和有效。確實,該常用之還原劑二硫蘇糖醇(DTT)所牽涉的已知標記反應的問題為反應性硫醇的存在可使該pMHC標記反應複雜化;TCEP可避免此問題。
再者,當使用TCEP時,不需要像使用其他還原劑(諸如DTT)般必須將其從反應混合物中除去。確實,本發明方法之優點為不需要從該方法之染料共軛步驟除去TCEP。同樣地,這是由於其缺乏反應性巰基。包含TCEP可大幅縮短該標記程序之培育期,且該TCEP反應可與馬來醯亞胺反應在相同溫度和時點同時進行。這對MHC複合體之穩定性具有有利的影響。
該標記混合物亦包含與馬來醯亞胺共軛之可檢測標記物。由於馬來醯亞胺之已知化學、染料共軛形式容易取得及其高度特異性和有效之標記能力,馬來醯亞胺為本發明之方法中的特佳者。
本發明之方法中可使用任何可檢測之標記。可檢測標記物之類型的實例包括放射性標記、螢光劑、顯色劑、化學發光劑和磁性顆粒。其他類型之可檢測標記將在考量本發明時變得顯明。
由於螢光染料容易檢測及共軛,螢光染料為特佳之可檢測標記物。代表性之螢光染料包括Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素(coumarin)、胺基 香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍(cascade blue)、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(R-Phycoerythrin)(PE)、PE-Cy5共軛物、PE-Cy7共軛物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明(Rhodamine)、麗絲胺羅丹明B(Lissamine Rhodamine B)、德克薩斯紅(Texas Red)、別藻藍蛋白(Allophycocyanin)(APC)、APC-Cy7共軛物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦(Azurite)、GFPuv、T-藍寶石(T-Sapphire)、蔚藍(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midoriishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星(Venus)、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(Peridinin Chlorophyll)(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。當選擇螢光染料時, 尺寸可能為要考量的且可能需要避免尺寸比較大之染料,由於較大之染料可能需考慮立體空間,這對TCR聯結至T細胞造成挑戰。
接著,該標記混合物包含可溶性MHC單體(其包含α鏈和β鏈),進一步包括非天然產生之半胱胺酸殘基,其中該MHC裝載可裂解之肽。在本發明所有之方法中,可使用任何類別之MHC單體。當使用MHC I時,該α鏈對應於包含三個結構域之多態形重鏈,而該β鏈對應於較輕之不變β微球蛋白鏈,此不變的β微球蛋白鏈與α鏈之結構域3非共價性聯結。當使用MHC Ⅱ時,該α和β鏈保持其傳統命名,如文獻中所使用者。參見,例如Bjorkman et al.,(1987)Nature 329:506-12。
該方法中所使用之MHC為可溶的,意指其並非與膜結合的且係以包含α和β鏈之離散單體形式存在於該標記混合物中。還原劑TCEP之存在確保MHC為單體的且不經由二硫鍵彼此結合。術語“可溶的”包含其中該MHC不在其天然環境(即,APC細胞膜)中,但可能與一表面(諸如孔槽盤)聯結的情況。於本實施態樣中,雖然該MHC不游離在溶液中且係與一表面聯結,但它們並非與膜結合的,因此為可溶的(如本文中所使用之該術語般)。
該方法之MHC亦包括含非天然產生之半胱胺酸殘基。此殘基之功能為提供用於該可檢測標記物之已知附著點。因此,半胱胺酸殘基可被引入MHC中任何將提供適合與該可檢測之染料反應及共軛,而不干擾MHC構象之 位點。
當在該方法中使用MHC I時,併入非天然產生之半胱胺酸的較佳位點包括下列之一或二者(a)MHC Iβ鏈之位置67或88;和(b)MHC Iα鏈之C端。其他MHC I併入位點可輕易地測定並形成本發明之一個態樣。當在該方法中使用MHC Ⅱ時,併入非天然產生之半胱胺酸的較佳位點包括下列之一或二者(a)該MHC Ⅱ β鏈之C端;和(b)MHC Ⅱ α鏈之C端。類似地,其他MHC Ⅱ併入位點可輕易地測定並形成本發明之一個態樣。
本發明方法之可溶性MHC包含可裂解之肽。可裂解之肽的存在可用於穩定該可溶性MHC,由於該MHC包含二個不同的鏈,沒有該可裂解之肽的穩定作用,該二個不同的鏈將解離。可裂解之肽的組成或長度沒有限制,除了該肽應配適與其聯結之MHC的結合溝之外(適用於MHC 2者為15-24個殘基,適用於MHC 1者為8-10個殘基)。
該可裂解之肽可包含一或多個非天然產生之胺基酸,該非天然產生之胺基酸可協助該肽與MHC結合。例如,正亮胺酸和該20種天然產生之胺基酸的其他類似物可被併入可裂解之肽並可根據反應性側基團之存在和特性選擇。例如,可裂解之肽具有羥基或其他反應性側鏈可能較佳。
根據定義,可裂解之肽為可從其MHC裂解及分離的。採用之裂解方法將取決於該非天然產生之可裂解 的胺基酸之化學,且裂解肽之方法的實例包括化學方法、氧化pH值改變、酶裂解,且最佳地,由UV光介導之裂解。
接續該方法,然後將該包含TCEP、與馬來醯亞胺共軛之可檢測標記和可溶性pMHC之標記混合物在所需之培育溫度下培育一段所需之培育期間。指定之成分組的培育溫度和時間可憑經驗優化。於特定之實施態樣中及如下列實施例所顯示的,該培育期少於約2.5小時,該培育溫度為約室溫(約20-24℃)。於其他實施態樣中,該培育溫度為4℃,該培育時間為約12小時。
最後,從該標記混合物移除任何未經結合之與馬來醯亞胺共軛的可檢測之標記物。藉由除去未經結合之標記物,當在隨後之應用(諸如本文中所揭示者)中使用該經標記之MHC時可將背景信號最小化。當該反應係在基質上進行時(諸如凝膠過濾柱、孔槽盤、通過膜過濾(例如為透析型之方法)、沉澱,等),移除可藉由,例如透析掉未結合之標記物、洗去未結合之標記物完成。
該方法結束時,產生經可檢測標記之可溶性MHC單體。使用本發明之方法產生的MHC形成本發明之一態樣。該等MHC可在該裂解之肽與該所欲之肽交換後用於,例如查詢具有該所欲之肽的TCR集合庫。
Ⅱ b.鑑定與MHC肽複合體聯結之TCR之方法
於另一態樣中,提供鑑定與MHC肽複合體聯 結之所欲之TCR之方法。該方法依賴依上述章節Ⅱ a和實施例中之描述製備的裝載可裂解之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體,並提供用於鑑定能識別具有所需親留力之特定pMHC的TCR之有效方法。在本發明之所有方法中,本發明方法的一個優點為可用於本方法中之與MHC非共價聯結的肽可包含半胱胺酸殘基。
依本文之描述產生之經標記的pMHC將具有與MHC聯結之可裂解的肽。該可裂解之肽僅作為結構輔助而不是作為用來查詢TCR之肽。已知沒有肽(即,可裂解之肽)存在時,該MHC複合體不穩定且將解離。因此,當研究MHC單體時,他們採用肽或其他分子以在實驗過程中穩定該複合體。於本發明之方法中,該可裂解之肽提供此功能。
接著,令該可裂解之肽與該所欲之肽交換。如本文所指出者,該所欲之肽可為半胱胺酸肽並包含半胱胺酸殘基,且可源自任何來源。例如,該所欲之肽可源自腫瘤抗原。於其他實例中,該所欲之肽可包含尚不知是否為相關抗原之肽且可經設計以測試用於與T細胞結合之肽。於其他實施態樣中,該所欲之肽可包含已知或被懷疑包含新型抗原之肽。在經鑑定之特定TCR方面,該所欲之肽可調和該肽之變體以查詢TCR之交叉反應。在本發明方法之背景下,該所欲之肽係作為TCR結合查詢之對象。
使用該肽可適用之任何方法從MHC破壞並釋出該可裂解之肽。例如,如本文和文獻中之描述,裂解肽 之常見和較佳方法為使用UV光。根據在該肽之可裂解的胺基酸中之鍵的性質,用於啟動交換肽類之UV光的範圍較佳為約350nm至約400nm,約366nm之UV光為更佳者。亦可採用其他方法來協助交換,諸如化學或氧化裂解、pH中之變化和酶裂解。
可裂解之肽與該所欲之肽交換後,測定該選自由Koff、Kon和KD所組成之群組的MHC-肽-TCR複合體之動力學性質,其中該動力學性質表明TCR與MHC-肽複合體聯結之程度。
該經標記之pMHC可以單體形式使用及/或形成MHC多聚體複合體。該多聚體將包含多個pMHC分子。在本發明所有方法中,於各種實施態樣中,該MHC可以高局部濃度使用、配置在非天然產生之環境中(諸如脂質雙層)、與表面(諸如孔槽盤)聯結或在通常不表現MHC之細胞或小珠上。不形成包含pMHC分子之多聚體時,可溶性pMHC與表現在T細胞上之TCR的聯結會受限於低親和力交互作用,且該TCR-pMHC複合體將不穩定。因此,藉由形成多聚體可在該複合體和TCR之間產生穩定之聯結。
一種用於形成可逆之多聚體複合體之方法涉及將MHC與骨架分子(諸如Strep-Tactin®)的聯結。參見,例如Knabel et al.,(2002)Nat Med 8(6):631-637和第3A圖。於此實施態樣中,該pMHC將以Strep-tag®標籤,允許MHC與該Strep-Tactin®骨架相聯結。當該經Strep標籤之MHC與Strep-Tactin®骨架(其具有多個用於該Strep-tag®之 聯結位點)接觸時,在Strep-Tactin®骨架上之各種不同連接位點形成pMHC之多聚體。已知其他形成pMHC多聚體之方法且可用於本發明方法之步驟中(參見,例如Tischer et al.,(2012)Int Immunol 24(9):561-572;美國專利申請案US 2013/0289253)。
於該方法之此點將存有pMHC單體及/或pMHC複合體之多聚體,可能與骨架或支撐結構聯結。然後,令多聚體與TCR集合庫在允許形成MHC-肽-TCR複合體之條件下接觸。該TCR集合庫可包含,例如活體外T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、在玻管內擴增之T細胞、以TCR基因轉導之細胞,等。在該T細胞集合庫包含以TCR基因轉導之T細胞的情況中,該T細胞可視需要地亦為CD4和CD8陰性。本質上,TCR集合庫將包含有需要鑑定以較佳之親留度與所欲之pMHC複合體結合的TCR。在本發明方法之pMHC的情況中,TCR亦可以經重組表現之鏈的形式配置在結構上,諸如在膜上,該膜本身可與非生物結構,例如孔槽盤、培養支持物或類似之結構聯結,甚至只與該結構本身聯結(即,經重組表現之鏈與結構聯結,但無膜存在)。
該pMHC係在允許且有利於形成TCR-pMHC複合體之條件下與TCR集合庫接觸。合適之條件已為人知且描述於文獻中(參見,例如Nauerth et al.,(2013)Expert Rev Clin Immunol 9(12):1151-1153;Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 1(3):1120-1132;Khilko et al.,(1995)J Immunol Methods 183(1):77- 94;Knabel et al.,(2002)Nat Med 8(6):631-637;Wooldridge et al.,(2009)Immunology 126(2):147-164;Huppa et al.,(2010)Nature 463(7283):963-967;Andersen et al.,(2012)Nat Protoc 7(5):891-902;Dolton et al.,(2015)Immunology 146(1):11-22;Hebeisen et al.,(2015).Cancer Res 75(10):1983-1991;Zhang et al.,(2016)Sci Transl Med 8(341):341ra377)並可包含,例如在pMHC之存在下之懸浮於約50μl小體積的生理、無毒緩衝液(PBS pH7.4,包含10%Fcs和1mM EDTA)中之T細胞上的TCR。
在該方法之先前步驟的接觸期間,由於由該MHC呈現之肽可被TCR識別,可形成包含TCR和pMHC之複合體。未結合之pMHC可視需要地從該TCR集合庫之局部環境中除去,僅留下那些與TCR聯結之pMHC。若需要時,該除去步驟可藉由洗滌掉未聯結之pMHC來完成(例如,從T細胞集合庫之TCR洗滌掉未結合之pMHC)。
在本發明方法之此點,僅存在與TCR有一定程度聯結之pMHC複合體。為了鑑定那些具有較佳之結合能力的pMHC(反之,TCR),破壞該多聚體複合體。當使用Strep-Tactin®作為多聚化骨架時,可使用生物素破壞該多聚體並從與TCR聯結之pMHC釋出該多聚化骨架。這留下任何可被TCR識別之pMHC暫時與該TCR聯結。
最後,測定該MHC-肽-TCR Koff(Koff為Koff或K3D,代表該三元複合體之動力學)且可藉由監測該經標記之pMHC從TCR解離時呈時間函數之信號變化計算。參見,例如Nauerth,Weissbrich,Knall et al.,(2013)Sci.Trans.Med. 5(192):1-10;Hebeisen et al.,(2015)Cancer Res 75(10):1983-1991。該信號之變化率可使用任何方便之方法測量且將為該被選定之用於標記該MHC的可檢測標記之性質的函數。例如,當使用螢光標記來標記MHC時,可使用實時顯微鏡或流式細胞術來測定該動力學性質(這些技術之實例描述於Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10;Hebeisen et al.,(2015)Cancer Res 75(10):1983-91中)並可監測該螢光信號呈時間函數之衰變速率。此衰變速率(Koff)與該經標記之pMHC從TCR解離直接相關。
或者,亦可監測螢光信號(Kon)之積聚並反映pMHC與TCR之聯結。用於監測螢光信號積聚之方法為已知之方法(參見,例如Li et al.,(2006)J Biol Chem 282(9):6210-21)且可用於該方法中。然後可根據Koff和Kon之數值計算該KD(KD=Koff/Kon)。
用於測量pMHC單體與TCR集合庫之聯結時間(Kon-速率)之方法係基於高局部濃度之經標記的MHC單體和TCR(例如,表現在T細胞表面上)。於一實施態樣中,可在測量之前純化(例如,FACS或MACS純化)特定之T細胞。於另一實施態樣中,特定之T細胞(例如在細胞混合物中之經活體外分離的、在玻管內擴增的或以TCR轉導之T細胞)被特異性標記。特異性標記之實例包括不可逆之MHC多聚體、特異於TCR恆定或TCR可變區之抗體。然後,將該pMHC單體與TCR集合庫在允許形成MHC-肽-TCR複合體的條件下接觸。該TCR集合庫可包含,例如活體外 T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、以TCR基因轉導之細胞,等。在該T細胞集合庫包含以TCR基因轉導之T細胞的情況中,該T細胞可視需要地亦為CD4和CD8陰性。本質上,TCR集合庫將包含有需要找出那些以較佳之親留度與pMHC複合體結合的TCR。TCR亦可以經重組表現之鏈的形式配置在結構上,諸如膜,該膜本身可與非生物結構,諸如孔槽盤或類似結構聯結,或甚至僅與結構本身(即,經重組表現之鏈,但無膜存在)聯結。
該pMHC係在允許且有利於形成TCR-pMHC複合體之條件下與TCR集合庫接觸。合適之條件已為人知且描述於文獻中(參見,例如Nauerth et al.,(2013)Expert Rev Clin Immunol 9(12):1151-1153;Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 1(3):1120-1132;Khilko et al.,(1995)J Immunol Methods 183(1):77-94;Knabel et al.,(2002)Nat Med 8(6):631-637;Wooldridge et al.,(2009)Immunology 126(2):147-164;Huppa et al.,(2010)Nature 463(7283):963-967;Andersen et al.,(2012)Nat Protoc 7(5):891-902;Dolton et al.,(2015)Immunology 146(1):11-22;Hebeisen et al.,(2015).Cancer Res 75(10):1983-1991;Zhang et al.,(2016)Sci Transl Med 8(341):341ra377)並可包含,例如在懸浮於約100μl小體積之生理、無毒緩衝液(PBS pH7.4,包含10%Fcs和1mM EDTA)中的T細胞上之TCR。通常,Kon為在指定之pMHC濃度下觀察到的Kon。pMHC之合適濃度的範圍可為約1-50μM、5-40μM、10-30μM、12-25μM或14-20μM。於一些實施態樣中,pMHC之合適濃度可為或高於 約2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM、或20μM。
為了鑑定具有較佳之結合能力的那些pMHC(反之,TCR),pMHC單體之MHC-肽-TCR Kon-速率(在此情況中Kon為Kon或K3D,代表該三元複合體之動力學)可藉由監測該經標記之pMHC與特定之TCR聯結時呈時間函數的信號變化計算。該信號之變化速率可使用任何方便之方法測量且將為該被選來用於標記該MHC的可檢測標記之性質的函數。例如,當使用螢光標記來標記MHC時,可使用實時顯微鏡或流式細胞術來測定該動力學性質。
最後,該動力學參數將為指定之pMHC對指定之TCR的親留力之指標。可選擇一個截止值,低於該截止值時,指定之TCR可被認為未與與指定之pMHC強烈聯結。於較佳之實施態樣中,半衰期(t1/2=ln(2)/Koff)約15秒或超過15秒可作為pMHC和TCR強烈聯結之指示。於更佳之實施態樣中,約15至約500秒之半衰期時間表示pMHC與TCR強烈聯結。可選擇落在該選定之Koff範圍內的TCR-pMHC對(即,那些其中TCR與pMHC,及可選擇地CD4或CD8聯結者)表示該對之TCR具有進一步研究或使用之重要性。其他較佳之Koff速率包括15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300和400秒。TCR-pMHC-CD4/CD8複合體之較佳Koff(K3D)速率包括15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、350和400秒。此外或另外,Kon-速率可作為pMHC與TCR之間結合 的指標。通常,根據本發明使用本文所描述之合適的pMHC濃度(例如16μM)所測量之pMHC單體的Kon-速率(或K3D)為約50秒或低於50秒時可作為pMHC與TCR強烈聯結的指示(例如約10、20、30、40、45、46、47、48、49、50秒)。
使用本發明之方法鑑定的TCR有很多種應用。例如,可選殖被發現與pMHC之聯結達到介於約20至約500秒之間的所需程度(例如半衰期時間(t1/2=ln(2)/Koff)及/或觀察到之Kon-速率少於50秒、或與MHC單體穩定結合)之TCR,而接受之細胞可以鑑定出之編碼TCR α、β或同時編碼α和β序列之核酸轉導。該等細胞可為表現內源性TCR基因之T細胞、不表現內源性TCR基因之T細胞(諸如編碼序列可能已被剔除或表現被抑制)或不表現內源性TCR基因之T細胞以外的細胞,諸如樹突細胞或其他免疫細胞(即,已經以TCR α及/或β編碼序列轉導之細胞)。細胞之實例包括中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞、來自外周血之初始T細胞、來自淋巴結之T細胞,或來自骨髓之T淋巴細胞祖細胞。當選擇T細胞用於此應用時,根據所選擇之T細胞的性質(例如輔助T細胞、細胞毒性T細胞,等),該T細胞可表現CD4分子或CD8分子。可經工程處理以表現所欲之TCR的細胞包括從人工胸腺類器官(ATOS)和其他用於產生同種異體細胞之系統生成的細胞。
該方法對鑑定可與所欲之抗原肽(諸如已經從生物樣品(例如腫瘤樣品)中萃取之新抗原)結合的TCR特別 有用。再者,該方法可在約4℃至約37℃(例如約20℃)之溫度下進行,使得該方法方便在室溫下進行。
Ⅱ.c.選擇適合用於過繼轉移之T細胞之方法
於另一態樣中,本發明之方法可用於選擇適合用於過繼療法之T細胞。於過繼療法中,投予患者針對由腫瘤細胞表現之抗原的T細胞。適合用於過繼轉移之T細胞將為表現TCR之細胞,該TCR可與由MHC呈現之指定的所欲抗原肽聯結,因此將具有抗腫瘤活性。所欲之抗原肽包括新型抗原。為了選擇適合用於過繼轉移之T細胞,提供實現此目的之方法。
首先,該方法涉及進行上述章節Ⅱ.b中所概述之步驟,該步驟將提供表現用於過繼療法之所需動力學性質的所欲TCR。這些TCR可基於一組預定之標準選擇。用於過繼療法之指導原則為在該選定之複合體方面,TCR通常需要對pMHC複合體具有稍高之親留力及/或較慢之解離速率及/或較快之結合速率(例如腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL))。
於本發明之本實施態樣中,該TCR將配置在T細胞上,該T細胞可在懸浮液中或與基質(諸如孔槽盤、細胞培養支持物,等)聯結。
為了過繼轉移,所欲之TCR將與源自腫瘤細胞之肽聯結並以pMHC複合體之組分形式存在且藉由章節Ⅱ.b中所描述之方法(t1/2=ln(2)/Koff)測定時,在16μM時 Koff將為約15秒至約500秒,且觀察到之Kon-速率少於50秒。
於一態樣中,本發明之方法可用於鑑定表現所欲TCR之T細胞,該T細胞可以過繼性T細胞療法形式本身被投予有需要之個體。該個體將具有匹配之HLA等位基因和表現可被表現TCR之T細胞識別之抗原蛋白的腫瘤細胞(如使用本文所描述之方法選定者)。為此,該方法可包含如下述之額外的步驟。
在選擇合適之T細胞後,將該T細胞擴增為具有至少1×102個T細胞之群體。T細胞之擴增可藉由使用任何理想之活化方法活化它們來達成。例如,擴增可藉由採用OKT3抗體,以抗CD3和抗CD28抗體將Dynabeads®塗層、與IL2、IL4、ConA、PHA、PMA接觸或彼等之組合、或任何其他已知之方法達成。
T細胞已被擴增成具有至少1×102個細胞數後,可投予個體所需之細胞數。細胞之確切數目可能有變化,但不會少於1×102個細胞。於實施態樣中,可投予個體1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010,或更多個細胞。
Ⅱ.d.鑑定所欲之結合對的成員之方法
本發明之方法具有廣泛及一般之應用性,且可用於研究介於任何二個結合伴之間的交互作用。該結合伴可包含受體和配體對、或已知或被懷疑彼此聯結之蛋白 質對。於另一態樣中,該結合伴可包含蛋白質和核酸,諸如DNA或RNA。因此,再於另一實施態樣中,提供鑑定所欲之結合對的成員之方法。
於本發明之方法中,首先形成標記混合物。該標記混合物協助可檢測標記與結合對之第一成員聯結。該標記混合物包含還原劑,該還原劑用於防止不欲有之二硫鍵形成。較佳之還原劑為三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
如本文所指出,TCEP為較佳的,因為它較其他還原劑更穩定且有效並解決涉及共同還原劑二硫蘇糖醇(DTT)之已知標記反應的問題,即,反應性硫醇之存在可能使標記反應複雜化。再者,當使用TCEP時,不需要像使用其他還原劑(諸如DTT)般必須將它從反應混合物中除去。實際上,本發明方法的優點是不需要從該方法之染料共軛步驟除去TCEP。同樣地,這是由於其缺乏反應性巰基。TCEP的的加入大大地縮減用於標記程序之培育期,且該TCEP反應可與馬來醯亞胺反應在相同溫度和時點下同時進行。
該標記混合物亦包含與馬來醯亞胺共軛之可檢測的標記物。本發明之方法中,馬來醯亞胺為特佳的,因為其化學已知、容易取得染料共軛形式且其具有高度特異性和有效之標記能力。本發明之方法中可使用任何可檢測之標記物。可檢測之標記物之類型的實例包括放射性標記、螢光劑、顯色劑、化學發光劑和磁性顆粒。其他類型之可檢測之標記物將在考慮本發明時顯而易見。由於螢光 染料容易檢測及共軛,螢光染料為特佳之可檢測標記物。代表性之螢光染料包括Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5共軛物、PE-Cy7共軛物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7共軛物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midoriishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星(Venus)、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(Peridinin Chlorophyll)(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。當選擇螢光染料時, 尺寸可能為考慮因素;可能需要避免尺寸比較大的,因為較大之染料可能引入空間考量的事實,這對該標記過程造成挑戰。
該標記混合物包含結合對之第一成員。如本文所表示的,結合對可包含任何二個已知或被懷疑交互作用和相聯結這分子。例如,結合對可包含傳統之受體-配體對,諸如介於表現在表面之黏附分子ICAM-1和LFA-1或L-選擇素和其配體PSGL-1之間的交互作用。或者,結合對可包含蛋白質和核酸,諸如DNA和DNA結合蛋白。結合對亦可包含RNA和RNA結合蛋白。再於另一實施態樣中,結合對可包含二種蛋白質,這二者無一為傳統受體。可包含結合對之蛋白質的實例包括抗體和抗原、肽類和MHC,及scFv(例如為CAR之組分)和細胞表面蛋白(例如CAR之配體)。於一較佳之實施態樣中,結合對包含受體和配體,且該配體係藉由所描述之標記過程標記。接著,再將該包含TCEP,與馬來醯亞胺共軛之可檢測標記和結合對之第一成員的標記混合物在所需之培育溫度下培育所需之培育期。指定之成分組的培育溫度和時間可憑經驗優化。於特定之實施態樣中,該培育期少於約2.5小時且該培育溫度為約室溫(約20至約24℃)。於其他實施態樣中,該培育溫度為4℃且該培育時間為約12小時。
最後,從該標記混合物中除去任何未經結合之與馬來醯亞胺共軛的可檢測標記。當在隨後之應用中使用該經標記之結合伴時(諸如本文所揭示者),藉由除去未 經結合之標記物可將背景信號最小化。移除可藉由下列方式實現:例如透析掉未經結合之標記,當該反應係在基質上進行時(諸如凝膠過濾柱、孔槽盤、通過膜過濾(例如在透析型之方法中)、沉澱,等),可藉由洗滌掉來完成移除。方法結束時,可產生經可檢測標記之結合對的第一成員。
令結合對之一個現在已標記的成員與包含已知或被懷疑為該結合對之第二成員的篩選集合庫在允許形成聯結複合體之條件下接觸。該篩選集合庫包含多個已知或被懷疑與該經標記之第一結合對成員相聯結的分子。該篩選集合庫之性質將由該結合對之經標記的成員之性質支配。例如,若配體被標記,該篩選集合庫可包含多個已知或被懷疑與該配體結合之受體,諸如TCR或pMHC之集合庫。或者,若蛋白質-蛋白質交互作用是值得注意的,該篩選庫可包含抗體或抗原,等。篩選集合庫之其他實例包括DNA或RNA的集合。
允許形成聯結複合體之條件亦將隨著該結合對之成員的性質而變化。考量因素包括pH值、是否存有離子物質、該集合庫成員之局部環境的疏水性、接觸進行之溫度、接觸之持續時間、結合對之濃度、總體積,等。
最後,檢測是否存有聯結複合體。該檢測將取決於所使用之標記物的性質。例如,當使用螢光標記物時(其為較佳之實施態樣),可檢測螢光信號。其他檢測是否存有聯結複合體之方法將為本技藝之技術熟習人士所已 知。
可選擇地,可進一步分析藉由實施本發明之方法所形成之任何聯結複合體。因此,該方法可進一步包含測定聯結複合體之動力學性質的步驟,該聯結複合體包含已測定之結合對的第一和第二成員,該動力學性質係選自由下列所組成之群組:Koff和Kon,其中該動力學性質表示該結合對(其可為二元pMHC複合體,這使得Koff代表K3D)之第一成員與該結合對之第二成員的聯結之程度。Koff和Kon描述於本文中,且可以該檢測方法之函數計算(例如聯結複合體形成或解離,等之時間)。
本專利說明書中所提及之所有出版物、專利案及專利申請案以引用方式併入本文,其程度如同個別出版物、專利案或專利申請案被具體且個別表示以引用方式併入。然而,本文引用參考資料不應被解釋為承認該等參考文為本發明之先前技。以引用方式併入之參考文獻中所提供之任何定義或術語與本文所提供之術語和討論有不同時,以本發明之術語和定義為主。
上述內容被認為足以使本技藝之技術熟習人士有能力實行本發明。前述內容和接下去之實施例詳細描述本發明之某些較佳實施態樣並描述本發明者所考量之最佳模式。然而,應理解的是,無論前述內容可能多麼詳細地出現在文本中,本發明可以許多方式實行,且本發明應 當根據所附之申請專利範圍及其任何等效物來解釋。
本發明進一步藉由下列實施例說明,其不應被解釋為進一步限制。本申請案全文中所列舉之所有參考文獻的內容以引用方式明確併入本文中。
下列實施例進一步說明本發明,但不應被解釋為在任何方面限制本發明之範圍。諸如構建載體和質粒、將編碼多肽之基因插入該等載體和質粒、將質粒引入宿主細胞及表現和測定其基因和基因產物時所採用之習知方法的詳細描述可從許多出版物取得,包括Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)及Coligan et al.,Current Protocols in Immunology,Wiley & Sons,Incorporated(2007)。
實施例1
經標記之MHC I單體
依(Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10)中之描述產生習知之經螢光標記的MHC單體。簡單地說,將具有與甘胺酸-絲胺酸連接子和半胱胺酸融合之Strep-tag® Ⅲ序列之人MHCβ鏈和MHC αHLA-A*02:01鏈表現在大腸桿菌菌株中,純化二並在肽之存在下,在高度稀釋下重新折疊。藉由凝膠過濾(Enrich 之SEC 650,BioRad)純化裝載肽之MHC單體,並與0.1mM二硫蘇糖醇(DTT)一起培育過夜以減少可用於與馬來醯亞胺共軛之半胱胺酸殘基。在室溫下,將緩衝液交換為PBS pH值7.3以與馬來醯亞胺-染料以10:1之莫耳比共軛2小時。藉由重力流柱(illustra NAP-25柱,GE Healthcare)將經標記之pMHC單體從未結合之標記純化。
藉由重新折疊MHCβ鏈和MHC HLA-A*02:01α鏈及UV-不穩定肽(可裂解的肽)之存在下來產生裝載UV交換肽之MHC單體,接著進行凝膠過濾純化。為了標記,在室溫下,在10:1之莫耳比的馬來醯亞胺標記之存在下,將裝載肽之MHC單體與0.1mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)一起培育2小時以減少可接觸到之半胱胺酸殘基。藉由重力流柱(illustra NAP-25柱,GE Healthcare)將經標記之pMHC單體從未結合之標記純化。依(Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 2006.1(3):1120-32)中之用於生物素化,未經標記之MHC單體的描述,在4℃,在50μM測試肽之存在下將50μl之0.1mg/ml重新折疊之UV交換肽MHC單體暴露於366nm UV光(CAMAG UV Cabinet)1小時。
實施例2
T細胞之染色
依先前之描述(Andersen et al.,(2012)Nat Protoc 7(5):891-902),使用裝載相同之肽並在鏈親和素APC或PE上多聚化的經UV交換,生物素化之HLA-A*02: 01分子進行組合的,不可逆之MHC多聚體染色。
為了形成可逆之MHC Streptamer複合體,將約1μg的習知的重新折疊,經標記之MHC單體或針對測試肽交換之3-4μg的UV-交換肽的MHC單體與5μl(0.75μg)之IBA Strep-Tactin APC(在50μlPBS中)一起培育約45分鐘。
將T細胞在4℃,含有10%BSA、EDTA和0.09%疊氮化物之PBS中洗滌,在冰上冷卻約20分鐘且隨後將約1×106至5×106個細胞懸浮於由20μl之習知MHC單體或50μl之UV-肽交換的MHC Streptamer所組成之MHC Streptamer溶液中。在洗滌前之前的最後20分鐘期間,在抗CD4及/或抗CD8螢光共軛之抗體及活死染色試劑的存在下將細胞染色45分鐘並在流式細胞儀(BD Fortessa)上分析。
實施例3
藉由流式細胞儀測量TCR配體koff速率
將約1×104至1×105個經MHC Streptamer和抗體染色之T細胞在安裝在溫度控制裝置(qutools)上之FACS管中之約20℃的0.5ml冷PBS中稀釋,該冷PBS含有10%BSA、EDTA、0.09%疊氮化物。開始擷取30秒,將0.5ml之2mM d-生物素加入試管之樣品中以破壞MHC Streptamer並起始該MHC單體解離,在約20℃下進行10分鐘。使用FlowJo®軟體,藉由隨著時間將MHC單體標記物之平均螢光強度輸出到GraphPad Prism®軟體以擬合至指數衰減曲線並計算koff-速率和半衰期時間來分析FACS數據 繪圖。
實施例4
裝載在MHC上之測試肽中的半胱胺酸殘基終止TCR配體Koff-速率測量
在用於TCR配體Koff-速率測量之標記MHC單體程序的期間,將可自由接近之半胱胺酸殘基與馬來醯亞胺標記物共價結合。若所欲之抗原肽含有暴露於表面之半胱胺酸,其將如第4A圖中所描繪般與馬來醯亞胺標記物共軛。暴露於表面之肽中的殘基亦可能被特定之TCR識別。因此,MHC上之肽中之半胱胺酸的修飾(諸如馬來醯亞胺標記物)可干擾TCR與pMHC複合體聯結(諸如第4B圖中所描繪者)。
測試二種不同之特異於9聚體HLA-A*02:01肽的TCR(TCR # 1和TCR # 2),該9聚體HLA-A*02:01肽在位置8含有半胱胺酸。以MHC多聚體將高比例之經TCR # 1和TCR # 2轉導的T細胞染色,該MHC多聚體係由生物素化之未經標記的MHC單體及鏈親和素骨架(分別具有35%和44%之活CD8+淋巴細胞,如第4C圖所示)所組成。相反地,由於裝載在MHC單體上之肽的半胱胺酸修飾,使得經MHC Streptamers轉導之T細胞無染色,該MHC Streptamers係由可逆之經標記的MHC單體和StrepTactin ®(IBA生命科學)骨架所組成(如第4D圖所示)。
在用於此裝載含有半胱胺酸之肽的非功能性MHC單體的指定肽之存在下,令該經純化之MHC αHLA- A*02:01鏈和β鏈重新折疊後,該尺寸排阻色層分析法中之變化形廓(如第5A圖所示)與裝載不含半胱胺酸之肽的功能性,經標記之MHC單體的變化形廓(如第5B圖所示)及裝載UV不穩定肽之MHC單體的變化形廓(如第5C圖所示)相當,這表明該重新折疊後之MHC單體在尺寸排阻後為具有功能,但經修飾的。
實施例5
用於裝載穩定及功能性UV不穩定肽之MHC單體的標記程序之發展
受已知方法中之限制所驅動而成功研發一種方法,藉由該方法,該在MHC單體上之含有半胱胺酸之肽在標記後可被替代,防止該半胱胺酸之任何修飾。具體地說,由於用於TCR配體koff-速率測量之習知的裝載肽之MHC單體的標準馬來醯亞胺標記程予會受該裝載UV-不穩定肽之MHC單體的穩定性和功能干擾,研發可允許標記裝載UV-不穩定肽之MHC單體的程序。為此,以TCEP替代先前使用之還原劑DTT以準備用於馬來醯亞胺共軛之MHC單體上的半胱胺酸殘基之SH基團。相對於DTT,使用TCEP不需預先培育,而是在具有非天然半胱胺酸殘基之MHC單體的標記過程中,在馬來醯亞胺標記物之存在下(如第6圖所描繪者)。與先前之基於DTT的程序相比較,裝載UV-肽之MHC與還原劑之培育時間減少六倍。
為了測試使用本文中及本實施例中所描述之 改善之方法標記之裝載UV不穩定肽的MHC單體是否仍能識別TCR,在生物素化之未經標記的MHC單體上以及經Strep標籤之經標記的MHC單體上進行UV-肽交換。
使用標準程序((Andersen et al.,(2012)Nat Protoc 7(5):891-902)產生具有二種不同螢光染料# 1和染料# 2之不可逆的MHC多聚體並用於將肽特異性T細胞染色(描繪於第7A和7D圖中)。根據標準程序(Knabel et al.,(2002)Nat Med 8(6):631-637;Nauerth et al.,(2013)Science Translational Medicine 5(192):1-10)將以習知方式重新折疊(在該所欲之肽的存在下,以形成pMHC)之經標記的MHC單體多聚化並將該染色與藉由使用該經肽交換之經標記的MHC單體形成之多聚體的染色相比鞍(結果顯示於第7B、7C和7E圖中)。或是在暴露於UV光期間或是在UV肽交換後,當使用三倍可用之經UV-肽交換之經標記的MHC單體以在Strep-Tactin®骨架上多聚化時,該MHC Streptamer®染色(第7E圖,右側)類似於根據標準方案使用習知之經標記的MHC單體的MHC Streptamer染色(第7E圖,左側)。以MHC Streptamer進行染色時,經TCR轉導之T細胞的染色頻率與使用經生物素化之MHC多聚體的染色相當(第7D圖)。用於經標記之MHC單體的UV-肽交換之標準濃度太低以致於無法形成功能性MHC Streptamer複合體且未檢測到染色。在用於特異性T細胞之染色的HLA-A*02:01之背景下,使用其他二種肽類得到之結果類似。
測試該使用本發明方法製備之經標記的UV-肽 交換的MHC單體之功能性的下一個步驟為藉由流式細胞術測試當以生物素破壞該多聚體複合體時MHC單體之解離情形,這些結果顯示於第8圖中。將與該MHC單體共軛之染料的強度對使用習知之經標記的MHC單體(第8A圖)或經標記的,UV交換之MHC單體(第8B圖)的擷取時間作圖。最初的30秒顯示出在Streptamer複合體中之MHC單體的昏暗染色。30秒後,在樣品管中加入d-生物素,由於Strep-Tactin®解離不再將MHC染料淬滅,而使得MHC單體強度增加。
習知之經重新折疊和標記之MHC單體和UV-肽交換之MHC單體的二個解離曲線在點圖中彼此相當(第8A-B圖),而在萃取該平均螢光強度並擬合至指數衰減曲線以計算具有各別pMHC配體之TCR的半衰期時間(t1/2)時亦彼此相(顯示於第8C和8D圖)。
除了第8圖中分析之肽“A”特異性TCR外,使用習知或二種表現在PBMC上之分別特異於肽“X”和“Y”的其他TCR之經UV-肽交換,標記之MHC單體來測定該TCR配體Koff-速率。使用用於所有三種TCR之具有不同的肽特異性之新型UV-肽交換之MHC單體所測得之半衰期時間與以習知之經重新折疊且標記之MHC單體所測量的數值相當(如第9圖之條形圖所示),這表示以本發明之方法產生的MHC單體具有功能性。
實施例6
UV-肽交換之經標記的MHC單體促成在TCR配體koff速率分析中表徵特異於含有半胱胺酸肽類之T細胞
為了規避該用於產生第4圖中所示之數據的包含半胱胺酸之肽接觸到該標記混合物,在UV肽交換反應中於標記程序後替換該UV不穩定肽(如第10A圖中之圖示)。因此,預期該肽中之半胱胺酸為未經修飾的。
使用MHC單體在Strep-Tactin®上多聚化並標記經TCR # 1和TCR # 2轉導之T細胞,可觀察到具有高MHC多聚體強度和暗淡之MHC單體強度之明亮Streptamer®染色(如通常所觀察到的,由於在Streptamer複合體中之淬滅;參見第10B圖)。使用這些Streptamer,可在TCR配體Koff分析中藉由流式細胞術分析半胱胺酸肽特異性TCR # 1和TCR # 2;結果顯示於第10C圖中。從擬合在平均螢光強度之指數衰減曲線所計算的解離半衰期(顯示於第10D圖中)透露出與TCR # 1之51秒相比較,TCR # 2之21秒解離更快,表示對相同之靶的肽MHC配體具有不同的TCR親留力。
實施例7
研發用於穩定和功能性配體之標記程序以分析細胞表面受體-配體交互作用
本文提供之方法允許產生用於具有強可檢測標記之TCR的穩定之功能性MHC配體,這在先前之標記方法中是不可能的。為了改善其他配體在標記時的穩定性, 該方法可經修改以適用各種其他配體,該配體係在不會干擾其結構和功能之位置處以非天然產生之半胱胺酸殘基修飾的。
於一實施態樣中,可研究之配體為可使用本發明之方法標記的黏附分子;然後,可使用該可溶性經重組表現之TCR來測量該黏附分子與其pMHC配體之結合。於另一實施態樣中,該經標記之黏附分子可用於鑑定特定之pMHC在靶細胞表面上的表現水準,再於另一實施態樣中,該經標記之黏附分子可用於查詢對表現在細胞(諸如健康組織之細胞)上之類似pMHC的結合及可能的交叉反應性(第11A圖)。
表現在T細胞上之嵌合抗原受體的親和力介導其功能性之差異(Hudecek et al.,(2013)Clin Cancer Res 19(12):3153-64)。因此,於進一步之實施態樣中,該經重組表現之可溶性抗原蛋白或該蛋白之免疫原性片段將藉由本文所描述之方法標記以鑑定表面表現之嵌合抗原受體(CAR),該表面表現之嵌合抗原受體與其介導最佳之靶的細胞識別的抗原具有最佳結合(第11B圖,如Nauerth et al.,(2013)Expert Rev Clin Immunol 9(12):1151-53中之描述)。此外,經標記之CAR的scFv鏈將用於分析與靶的細胞之表面上或組織細胞上之抗原的結合以查詢瞄準和脫靶的交叉反應性(第11C圖)。標記無變化之MHC單體以鑑定表面表現之NK細胞受體將使用本發明之方法進行(第11D圖)。
實施例8
單體受體-配體交叉反應之測量
TCR和pMHC在結合時之共定位可使用另一與表現在所分析之細胞表面上的分子(較佳為TCR本身、CD3或共受體CD4/CD8)結合的配體(諸如特異性scFv)分析,該配體以本文所描述之方法標記。在該pMHC和scFv上之標記之間的螢光共振能量轉移可分析作為共定位之量度。
根據表面表現的受體和使用本發明方法標記之配體之間的交互作用強度,可調整擷取過程中之溫度以適應不同的條件,諸如在緩衝液之存在下,提高溫度至約20℃至約37℃以用於高親和力配體,但仍允許結合事件並抑制該與受體結合之配體內化。可研究結合交互作用之代表性條件包括,例如含有10%FCS、1mM EDTA、0.01%疊氮化物或其他內化抑制劑之PBS。低親和力配體可能需要固定、多聚化、高局部濃度、藉由多聚甲醛(PFA)固定經結合之配體及/或敏感性檢測系統,諸如單分子光譜;對其受體/靶的具較高親和力之配體,諸如CAR配體或Fab片段在滴定之非飽和和飽和濃度中可以單體形式使用。
經標記之pMHC配體可藉由,例如可逆之Strep-Tag®-Strep-Tactin®、His6-標籤Ni2+及不可逆之生物素-鏈親和素交互作用共價或非共價地固定在該實驗系統之表面。此外,該經標記之pMHC配體可依,例如Ma et al.,(2008)PLoS Biol 6(2):e43和Huppa et al.,(2010)Nature 463(7283):963-7之描述被固定在其他分子,諸如在脂質雙層中之磷脂。藉此,經標記之pMHC分子類將能在脂質層中側移(第12A圖)。
合適之表面的另一實例為可與表現TCR之T細胞緊密靠近之小珠或紅血球(第12B圖),例如藉由微量移液管黏附及/或光學鑷子將它們靠近,這些方法描述於,例如下列文獻中:Huang et al.,(2010)Nature 464(7290):932-6;Zhang et al.,(2016)Sci Transl Med 8(341):341ra77;Jiang et al.,(2011)Immunity 34(1):13-23;Jeorrett et al.,(2014)Opt Express 22(2):1372-80;Sabatino et al.,(2011)J Exp Med 208(1):81-90;Pryshchep et al.,(2014)J Immunol 193(1):68-76;Liu et al.,(2015)Eur J Immunol 45(7):2099-110;Adams et al.,(2011)Immunity 35(5):681-93;Liu et al.,(2014)Cell 157(2):357-68;Liu et al.,(2014)J Immunol 44(1):239-50;Hong et al.,(2015)J Immunol 195(8):3557-64;Casas et al.,(2014)Nat Commun 5:5624。其他分析二維動力學之實例為生物力探針、原子力顯微鏡(AFM)、流動室、微懸臂針、離心、花結法(rosetting)、錐板式黏度計、表面力儀和光脫色螢光恢復技術(FRAP)(Long et al.,(2006)Cell Mol Immunol 3(2):79-86;Bongrand(1999)Rep Prog Phys 62:921-68)。
該以本文所描述之方法標記之可溶性經重組表現的配體可透過裝置施放在生理緩衝液。當與表現在該表面上或是固定在該裝置上之受體結合時可檢測到增加之信號,諸如由螢光染料發射之光子發射。為了分析TCR和 pMHC在結合時之共定位,可使用藉由本文所描述之方法標記之另一配體,諸如scFv。
因此,可測試,例如固定在微流體裝置上之表現該受體的T細胞或其他細胞(第13A圖)。雖然測試黏附細胞是很直接的,可用於固定懸浮細胞(例如T細胞)之材料的實例為使用黏附分子(例如LFA)、經聚-L-離胺酸處理之表面、經DNA低聚物處理之表面(參見,例如Hennig et al.,(2009)Cytometry A:75(4):362-70)、捕捉在二電泳籠(參見,例如Muller et al.,(2003)IEEE Eng Med Biol Mag 22(6):51-61;Forslund et al.,(2012)Front Immunol 3:300),等。
藉由類比,無論是經重組表現之TCR,或經重組表現之pMHC分子皆可共價或非共價地固定在表面上,並測試與彼等之可溶性配體或表現在細胞表面上之配體的結合(第13B和C圖)。用於檢測螢光標記之實例為不同種類之顯微鏡檢查,例如螢光顯微鏡檢查、共聚焦顯微鏡檢查、全內反射顯微鏡檢查(total internal reflection microscopy)。為了定量受體和經標記之配體的共定位,可使用以本發明方法標記之FRET伴侶,諸如scFv。
另一實例為T細胞,該T細胞約其經標記之pMHC配體被捕捉在由脂質雙層所組成之囊泡內(如Ratzke et al.,(2012)J Mol Biol 423(3):462-71中所描述之單一分子之間的交互作用)。為了分析TCR與其配體(使用以本發明方法標記,但無預先在,例如Strept-Tactin®上可逆地多聚化、高局部濃度(例如在小體積中)之MHC單體)之間的 微弱交互作用,可使用,藉由,諸如多聚甲醛(PFA)之物質固定之結合的pMHC配體,以類似於先前之方法使用MHC多聚體來測量kon速率動力學(Campanelli et al.,(2002)Int Immunol 14(1):39-44;Dutoit et al.,(2003)J Immunol 170(10):5110-7)。為了評估該平衡常數(KD),可類似於該基於MHC多聚體之分析,將在非飽和濃度至飽和濃度之範圍內的滴定量之MHC單體與T細胞一起培育(Campanelli et al.,(2002)Int Immunol 14(1):39-44;Dutoit et al.,(2003)J Immunol 170(10):5110-7)。基於該標記強度(經校正最大強度及/或TCR表面表現)可鑑定和分離出表現最佳TCR之T細胞。
實施例9
研發用於鑑定與MHC分子類聯結之肽的高通量分析
除了鑑定和表徵T細胞之外,以本文所描述之方法標記且裝載UV不穩定肽之MHC單體可用來篩選源自抗原蛋白之肽集合庫與MHC結合之能力。可使用算法,諸如SYFPEITHI(Rammensee et al.,(1999)Immunogenetics 50:213-219(access via www.syfpeithi.de))、NetMHC(Nielsen et al.,(2003)Protein Sci.12:1007-17;Andreatta & Nielsen,(2016)Bioinformatics 32(4):511-7(access via www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC))及BIMAS(Parker et al.(1994)J.Immunol.152:163)來鑑定與特定之MHC亞型結合之肽。該算法係藉由實驗數據修整且根據該數據集之大小可能會增加假陽性及/或假陰性率。UV-肽交換技術允許在 色層分析法或ELISA讀出系統中快速篩選肽集合庫與特定之MHC亞型的結合,測量在交換之後,與肽親和力相關之MHC所裝載的肽量。(Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 1(3):1120-32)。
藉由使用裝載UV-交換肽之MHC單體(以本發明之方法標記在輕鏈上),該裝載該測試肽之整合的MHC之量可藉由測量該標記之信號而很容易地定量(第14圖)。
於一實施態樣中,在多孔槽盤的每一個孔中測試一測試肽,並在該測試肽之存在下令裝載可裂解(UV不穩定)肽之MHC暴露於UV光。與不相結合之肽一起培育之MHC將崩解成非聯結之重鏈和輕鏈;該經標記之輕鏈和肽將被洗掉。該標記物之信號將與組裝之經標記的pMHC之量相關,並因此與該肽與MHC之結合強度有關。
除了該基於定量UV-肽交換之後的MHC單體量之分析(Rodenko et al.,(2006)Nat Protoc 1(3):1120-32)外,已使用其他分析來計算該MHC穩定性,此為肽與MHC結合之讀出值,其可能與pMHC對T細胞之免疫原性相關(Harndahl et al.,(2011)J Immunol Methods 374(1-2):5-12;Stronen et al.,(2016)Science 352(6291):1337-41;Schmidt et al.,(2017)J Biol Chem 292(28):11840-11849)。
實施例10
平行測量TCR配體結合及下游活化信號
要解決TCR和其配體之間的結構交互作用與 其起始下游信號傳導來活化T細胞之效力的相關性是有挑戰性的。使用本發明之方法產生的MHC單體可用於分析表面表現之TCR。該測量(例如MHC單體聯結或解離)可與信號傳導讀出組合。此可藉由修改在具有報告子系統之信號傳導分子中所分析之T細胞來達成。例如,T細胞可表現NFAT報告子系統(參見,例如Hamana et al.,(2016)Biochem Biophys Res Commun 474(4):709-14)或以可檢測分子標籤之信號傳導分子,該可檢測分子與接近細胞表面之經活化的TCR之CD3胞內組分聯結(經GFP標籤之Zap70,在O'Donoghue et al.,(2013)Elife 2:e00778中)。為了分析未經修飾之T細胞,可使用其他功能性讀出值並加上測量TCR配體交互作用。例如,細胞表面上之活化標記物的上調可藉由下列者分析:在緩衝液中之經標記的抗體或Fab;或產生效應分子;或在T細胞活化時被快速介導之鈣流入,此可藉由,例如Fura-2-乙醯氧基甲酯測量。結構TCR結合與功能讀出值之關聯的實例描述於Liu et al.,(2014)Cell 157(2):357-68中。
實施例11
用於測量MHC-肽-TCR k
on
-速率之T細胞染色
依前述,使用裝載相同肽並在鏈親和素BV421上多聚化之經UV-交換,生物素化的HLA-A*02:01分子類進行組合的不可逆之MHC多聚體染色(Andersen et al.,(2012)Nat Protoc 7(5):891-902)。依實施例1中揭示之 方法的描述產生該裝載該所欲之肽的經標記的,UV交換肽之MHC單體。
在4℃下,以含有10%BSA、EDTA和0.09%疊氮化物之PBS洗滌T細胞,隨後在抗CD4及/或抗CD8螢光共軛之抗體、活死染色試劑和不可逆之MHC多聚體BV421的存在下將約1×106至5×106個細胞染色30分鐘,洗滌後再在流式細胞儀(BD Fortessa)上進行分析。
實施例12
藉由流式細胞術測量TCR配體k
on
-速率
在每個樣品方面,將1×104至1×105個經MHC多聚體和抗體染色之T細胞在FACS微管中,在約20-25℃,含10%BSA、EDTA、0.09%疊氮化物的冷PBS中稀釋。在樣品管中加入20μl之裝載該所欲之肽的UV交換肽MHC單體(20μl相當於~16uM)後立即開始擷取數據,接著在室溫下(20-25℃)令MHC單體聯結2分鐘(第16A圖)。藉由在CD4陰性,活淋巴細胞上之門控及進一步在特異性(不可逆之MHC多聚體陽性)或非特異性(不可逆之MHC多聚體陰性)T細胞上的門控,使用FlowJo分析FACS數據繪圖。該經標記之pMHC單體的平均螢光強度隨著時間輸出(第16B圖)。藉由減去非特異性T細胞(不可逆之MHC多聚體陰性)之平均螢光強度計算特異性pMHC單體聯結並使用Graph Pad Prism軟體將校正後之數據繪製成圖形,以擬合單相,非線性聯結曲線並計算聯結半衰期(第16C圖)。監測該二個 特異於同一肽-MHC之TCR的聯結時間,並與裝載非特異性,對照肽之MHC單體的聯結相比較(第16D圖)。二個TCR具有不同的聯結時間,與TCR B(48秒)相比較,TCR A(16秒)之聯結時間較快。相反地,該裝載對照肽之MHC單體與TCR的聯結微弱。
<110> WEISSBRICH,BIANCA
<120> 製造和使用可溶性主要組織相容性複合體(MHC)分子類之方法
<130> K-1035.02
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<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Claims (58)
- 一種產生裝載可裂解之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體之方法,該方法包含:(a)形成標記混合物,該標記混合物包含:(1)TCEP;(2)與馬來醯亞胺共軛之可檢測標記;及(3)包含α鏈和β鏈之可溶性MHC,該可溶性MHC進一步包含非天然產生之半胱胺酸殘基,其中該MHC係裝載可裂解之肽;(b)將該標記混合物在所需之培育溫度下培育所需之培育期;及(c)從該標記混合物移除未經結合之與馬來醯亞胺共軛的可檢測標記。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該標記物係選自由下列所組成之群組:放射性標記、螢光劑、顯色劑、化學發光劑及磁性顆粒。
- 如申請專利範圍第2項之方法,其中該標記物為螢光染料。
- 如申請專利範圍第3項之方法,其中該螢光染料係選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量 子點、羥基香豆素(coumarin)、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍(Cascade blue)、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(Phycoerythrin)(PE)、PE-Cy5共軛物、PE-Cy7共軛物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明(Rhodamine)、麗絲胺羅丹明B(Lissamine Rhodamine B)、德克薩斯紅(Texas Red)、別藻藍蛋白(Allophycocyanin)(APC)、APC-Cy7共軛物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、EBFP2、藍銅礦(Azurite)、GFPuv、T-藍寶石(T-Sapphire)、蔚藍(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midoriishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星(Venus)、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(Peridinin Chlorophyll)(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、 mPlum及mRaspberry。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該培育期為約2.5小時或低於2.5小時且該培育溫度為約20至24℃。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該培育期為約12小時且該培育溫度為約4℃。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該MHC為MHC I。
- 如申請專利範圍第7項之方法,其中該非天然產生之半胱胺酸係被引入下列一或二者:(a)MHCIβ鏈之位置67或88;和(b)MHCIα鏈之C端。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該MHC複合體為MHC Ⅱ。
- 如申請專利範圍第9項之方法,其中該非天然產生之半胱胺酸係引入下列一或二者:(a)MHC Ⅱ β鏈之C端;和(b)MHC Ⅱ α鏈之C端。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該可裂解之肽可被UV光裂解。
- 一種經可檢測標記之可溶性MHC單體,其係藉由如申請專利範圍第1項之方法產生。
- 一種鑑定與MHC-肽複合體聯結之TCR之方法,該方法包含:(a)提供多聚體複合體,該多聚體複合體包含與多個經可檢測標記之可溶性MHC單體以可逆方式聯結之主鏈,每一經可檢測標記之可溶性MHC單體各自裝載該所欲之肽;(b)令該多聚體複合體與TCR在允許形成MHC-肽-TCR複合體的條件下接觸;(c)破壞該多聚體複合體;及(d)測定該MHC-肽-TCR K off,其中該K off表示TCR與MHC-肽複合體聯結之程度。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中該方法進一步包含藉由實施下列步驟首先形成該多聚體複合體:提供裝載可裂解之肽的如申請專利範圍第12項之經可檢測標記之可溶性MHC單體;令該可裂解之肽與該所欲之肽交換,從而產生裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體;及藉由將該主鏈與多個各自裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體以可逆方式聯結以形成多聚體複合 體。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中該所欲之肽包含半胱胺酸殘基。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中K off為約20秒或超過20秒且表示該TCR與MHC-肽複合體聯結。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中K off為約15至約500秒或超過500秒且表示該TCR與MHC-肽複合體聯結。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中該TCR係在集合庫中,該集合庫包含多個T細胞,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子和CD8分子中一或二者。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其進一步包含以編碼TCR之α和β鏈的核酸轉導T細胞。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中該方法係在約4℃至約37℃之溫度下實施。
- 如申請專利範圍第20項之方法,其中該溫度為約20℃。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中該所欲之肽包含新抗原。
- 一種選擇適合用於過繼轉移之T細胞之方法,該方法包含:(a)提供多聚體複合體,該多聚體複合體包含主鏈,該主鏈與多個裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體以可逆方式聯結;(b)令該多聚體複合體與TCR集合庫在允許形成MHC-肽-TCR複合體之條件下接觸,該TCR集合庫包含多個T細胞,該等T細胞表現多個TCR;(c)破壞該多聚體複合體;(d)測定MHC-肽-TCR複合體之K off,及(e)選擇用於過繼療法之T細胞,其中該T細胞表現TCR,該TCR對於MHC-肽複合體之K off為15秒至約500秒。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該方法進一步包含藉由實施下列步驟首先形成該多聚體複合體:提供裝載可裂解之肽的如申請專利範圍第12項之經可檢測標記之可溶性MHC單體;令該可裂解之肽與該所欲之肽交換,從而產生裝載該所欲之肽的經可檢測標記之可溶性MHC單體;及藉由將該主鏈與多個裝載該所欲之肽的經可檢測標記 之可溶性MHC單體以可逆方式聯結以形成多聚體複合體。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該TCR集合庫包含多個T細胞,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子和CD8分子中一者。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其進一步包含:(f)將在(e)中選擇之T細胞擴增成具有至少約1×10 2個T細胞之群體;及(g)對個體投予所需數目之T細胞。
- 如申請專利範圍第24項之方法,其中對該個體投予至少約1×10 6個T細胞。
- 如申請專利範圍第22項之方法,其進一步包含從(e)中所選擇之T細胞分離出TCR基因。
- 一種鑑定所欲之結合對之成員之方法,該方法包含:(a)形成標記混合物,該標記混合物包含:(1)TCEP;(2)與馬來醯亞胺共軛之可檢測標記;和(3)結合對之第一成員;(b)將該標記混合物在所需之培育溫度下培育所需之培育期; (c)從該標記混合物移除未經結合之與馬來醯亞胺共軛的可檢測標記;(d)令該結合對的一個成員與包含該結合對之已知或被懷疑的第二成員的篩選集合庫在允許形成聯結複合體的條件下接觸;及(e)檢測形成之聯結複合體。
- 如申請專利範圍第25項之方法,其中該標記物係選自由下列所組成之群組:放射性標記、螢光劑、顯色劑、化學發光劑及磁性顆粒。
- 如申請專利範圍第30項之方法,其中該標記物為螢光染料。
- 如申請專利範圍第31項之方法,其中該螢光染料係選自由下列所組成之群組:Atto染料、AlexaFluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、瀑布藍、太平洋藍、太平洋橙、螢光黃、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5共軛物、PE-Cy7共軛物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B、德克薩斯紅、別藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7共軛物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP(Y66H突變)、GFP(Y66F突變)、EBFP、 EBFP2、藍銅礦、GFPuv、T-藍寶石、蔚藍(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP(Y66W突變)、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP(S65A突變)、Midoriishi Cyan、野生型GFP、GFP(S65C突變)、TurboGFP、TagGFP、GFP(S65L突變)、翠綠(Emerald)、GFP(S65T突變)、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、金星(Venus)、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira橙、mOrange、別藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2(“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(Peridinin Chlorophyll)(PerCP)、mKate(TagFP635)、TurboFP635、mPlum及mRaspberry。
- 如申請專利範圍第25項之方法,其中該第一結合伴包含半胱胺酸殘基。
- 如申請專利範圍第25項之方法,其中該結合對係選自由下列所組成之群組:(i)包含Fab片段和表現在腫瘤細胞表面上之蛋白質的抗原結合分子;(ii)scFv和表現在腫瘤細胞表面上之蛋白質;(iii)DNA結合蛋白和DNA;(iv)重組蛋白和嵌合抗原受體;及(v)跨膜黏附分子和其同源配體。
- 如申請專利範圍第34項之方法,其中該結合對為重組蛋白且該細胞表面受體為嵌合抗原受體。
- 如申請專利範圍第25項之方法,其中該篩選集合庫包含多個T細胞,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子和CD8分子中一或二者。
- 如申請專利範圍第25項之方法,其中該方法係在約4℃至約37℃之間的溫度下進行。
- 如申請專利範圍第25項之方法,其進一步包含測定包含該結合對之第一和第二成員的聯結複合體之動力學性質的步驟,該動力學性質係選自由K off和K on所組成之群體,其中該動力學性質表示配體與聯結複合體聯結之程度。
- 如申請專利範圍第36項之方法,其中該動力學性質為K off且其中K off為約15秒或超過15秒且表示該結合伴形成聯結複合體。
- 如申請專利範圍第39項之方法,其中該動力學性質為K off且其中K off為約15至約500秒或超過500秒且表示該結合伴形成聯結複合體。
- 一種鑑定與MHC-肽複合體聯結之TCR之方法,該方法包含:(a)令表現一或多個TCR之細胞與多個經可檢測標記之多聚體複合體接觸,各經可檢測標記之多聚體複合體包含與多個裝載該所欲之肽的MHC單體以不可逆方式聯結之主鏈,其中與該多聚體複合體聯結之細胞(多聚體陽性細胞)表現特異於裝載該所欲之肽的MHC單體之TCR,且不與該多聚體複合體聯結之細胞(多聚體陰性細胞)不表現特異於裝載該所欲之肽的MHC單體之TCR;(d)在允許形成MHC單體-肽-TCR複合體之條件下引入多個經區別性標記之可溶性MHC單體,每一可溶性MHC單體各自裝載該所欲之肽;(e)藉由從MHC單體之總信號減去與多聚體陰性細胞聯結之MHC單體的信號以檢測形成之特定MHC單體-肽-TCR複合體;(f)測定呈時間函數的步驟(e)所檢測之特定MHC單體-肽-TCR複合體的形成速率,從而測定該MHC單體-肽-TCR K on,其中該K on表示TCR與該MHC單體-肽複合體之聯結程度。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該經可檢測標記之多聚體複合體係藉由將裝載該所欲之肽的生物素化之MHC單體在鏈親和素上多聚化形成,其中生物素或鏈親和素係經可檢測標記。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該方法進一步包含首先提供裝載可裂解之肽的經區別標記之如申請專利範圍第12項之可溶性MHC單體;及令該可裂解之肽與該所欲之肽交換,從而產生裝載該所欲之肽的經區別標記之可溶性MHC單體。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該裝載該所欲之肽的經區別標記之可溶性MHC單體係保持固定濃度。
- 如申請專利範圍第44項之方法,其中該經區別標記之可溶性MHC單體的固定濃度係在10至50μM之範圍內。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該K on為約50秒或低於50秒且表示該TCR與該MHC單體-肽複合體聯結之所欲程度。
- 如申請專利範圍第46項之方法,其中該K on為約10至30秒且表示該TCR與該MHC單體-肽複合體聯結之所欲程度。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該TCR係提供在包含多個T細胞之集合庫中,各T細胞呈現完整之TCR及CD4分子和CD8分子中一或二者。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其進一步包含以編碼該TCR之α和β鏈的核酸轉導T細胞之步驟。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該MHC單體-肽-TCR複合體之形成係藉由流式細胞術檢測。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該方法係在約4℃至約37℃之間的溫度下進行。
- 如申請專利範圍第46項之方法,其中該溫度為約20至25℃。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該方法進一步包含以抗CD4及/或抗-CD8抗體標記該細胞之步驟。
- 如申請專利範圍第41項之方法,其中該所欲之肽包含新抗原。
- 一種測定TCR與MHC-肽複合體之間的解離常數(K D)之方法,其包含:(a)根據如申請專利範圍第13項之方法測定TCR與MHC-肽複合體之間的K off;(b)根據如申請專利範圍第41項之方法測定TCR與 MHC-肽複合體之間的K on;及(c)藉由將步驟(a)所測定之K off除以步驟(b)所測定之K on以計算解離常數(K D)。
- 如申請專利範圍第55項之方法,其中該K off和K on係使用表現TCR和共受體之T細胞測定,其中該經計算之K D表示TCR與共受體和MHC-肽複合體之間結合的解離常數。
- 如申請專利範圍第56項之方法,其中該共受體為CD4或CD8受體。
- 如申請專利範圍第55項之方法,其中該方法進一步包含基於所計算之K D測定結合常數(K A)之步驟。
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