JP2023511770A - 抗Ｇタンパク質α抗体 - Google Patents

抗Ｇタンパク質α抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP2023511770A
JP2023511770A JP2022546606A JP2022546606A JP2023511770A JP 2023511770 A JP2023511770 A JP 2023511770A JP 2022546606 A JP2022546606 A JP 2022546606A JP 2022546606 A JP2022546606 A JP 2022546606A JP 2023511770 A JP2023511770 A JP 2023511770A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
acid sequence
amino acid
gtp
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022546606A
Other languages
English (en)
Inventor
エロディ デュピュイ，
トマ ルー，
エリック トリンケ，
Original Assignee
シスビオ バイオアッセイズ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シスビオ バイオアッセイズ filed Critical シスビオ バイオアッセイズ
Publication of JP2023511770A publication Critical patent/JP2023511770A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G01N33/5735—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4719—G-proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、Ｇタンパク質αに結合する能力を有する抗体もしくは抗体断片、該抗体をコードする核酸配列、該核酸配列を含むベクター、該ベクターもしくは該核酸配列を含む細胞、ならびに（ｉ）該抗体もしくは抗体断片、または該組成物、および（ｉｉ）ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰ源を含むパーツキットに関する。

Description

本発明は、Ｇタンパク質αに結合する能力を有する新規抗体もしくは抗体断片に関する。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、哺乳類および動物界全体における膜受容体ファミリーである。Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲにより活性化されるヘテロ三量体タンパク質（α、β、およびγの３つのサブユニット）である。ＧＰＣＲを介して、Ｇタンパク質は、細胞外から細胞内にシグナルを伝達する役割（すなわち、外的刺激に対する細胞応答）を果たす。一般的に説明されるその作用機序を以下に要約する。
・休止している不活性状態では、Ｇタンパク質のαサブユニットはヌクレオチドＧＤＰに結合している（ＧＤＰに結合した完全型Ｇタンパク質）；
・ＧＰＣＲの活性化後、ＧＰＣＲはＧタンパク質のαサブユニットに結合し、以下の２段階からなるＧタンパク質の活性化プロセスを誘発する：１）Ｇタンパク質からＧＤＰが放出されて空のＧタンパク質となり、不活性なＧＰＣＲ／空のＧタンパク質複合体が形成される；２）ＧＴＰが固定されてＧＴＰ型の活性なＧタンパク質（ＧＴＰに結合した完全型Ｇタンパク質）が形成される。第一段階では、受容体に結合したＧタンパク質は「空（から）型」と呼ばれる形態にある。ヌクレオチドＧＴＰはＧタンパク質のαサブユニットにすみやかに結合すると説明されているので、この状態は文献では一過性として説明されている。また、活性化Ｇタンパク質のβ／γサブユニットがαサブユニットから解離する；
・次に、ＧＴＰに結合した完全型Ｇタンパク質のαサブユニットは、エフェクターに結合してそれを活性化させる。すると、該エフェクターがシグナル伝達経路を活性化して、細胞応答を引き起こす；
・次に、ＧＴＰは、Ｇタンパク質のαサブユニットにより加水分解されてＧＤＰとなり、αサブユニットはβ／γサブユニットと再び組み合わさって、ＧＤＰに結合した完全型Ｇタンパク質を再形成する（不活性状態）。
ＧＰＣＲが非常に多くのシグナル伝達経路に関与していることから、その活性を試験するためのツールが先行技術において生み出されているが、その多くは、潜在的治療活性を有する該受容体の新たなリガンドを同定するのが目的である。これらのツールの例として、ＧＴＰの非加水分解性もしくは徐加水分解性の放射性誘導体、特に受容体が活性化されるとＧタンパク質αと結合するＧＴＰ－γ－Ｓの使用について挙げることができる。酵素活性、例えばルシフェラーゼ等の測定に基づく組換え系も存在し、その発現は、受容体の活性化により生成される二次情報伝達物質によって制御される。また、細胞表面レベルにおいてＧＰＣＲの活性化を検出するための抗体も合成されている［１］。Ｇタンパク質αとＧタンパク質β／γとの界面に結合して、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質複合体を安定化できるナノ抗体を提案する特許文献１について言及することもできる。
しかしながら、先行技術は、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識され、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰと共に使用したときに、ＲＥＴシグナルを生成する能力を有する抗体もしくは抗体断片について記載していない。
本発明者らは、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰを使用するＲＥＴ法を実施することにより、ＧＰＣＲの活性化を検出するための抗体もしくは抗体断片を開発した。また、本発明者らは、これらの抗体または抗体断片が、非常に特殊なゾーンにおいてＧタンパク質αと結合する能力を有するので、このような特性を示すことも示した。
欧州特許第２７２３７６４号明細書（Ｂ１）
本発明の第１の目的は、Ｇタンパク質αに結合する能力を有する抗体もしくは抗体断片であって、
・配列番号１のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列のＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、
・配列番号４のアミノ酸配列のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳ（すなわち、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒの３つのアミノ酸）のＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインと
を含む抗体もしくは抗体断片に関する。
本発明の第２の目的は、Ｇタンパク質αへの結合について、本発明の第１の目的の抗体もしくは抗体断片と競合する抗体もしくは抗体断片に関する。
本発明の第３の目的は、本発明による抗体もしくは抗体断片を含む組成物に関する。
本発明の第４の目的は、（ｉ）本発明による抗体もしくは抗体断片、または本発明による組成物、および（ｉｉ）ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰ源を含むパーツキット（ｋｉｔ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）に関する。
本発明の第５の目的は、本発明による抗体もしくは抗体断片をコードする核酸配列に関する。
本発明の第６の目的は、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。
本発明の第７の目的は、本発明によるベクターまたは本発明による核酸配列を含む細胞に関する。
定義
用語「抗Ｇタンパク質α抗体」、「抗Ｇα抗体」、または「Ｇタンパク質αに結合する能力を有する抗体」（または抗体断片）は交換可能であり、十分な親和性を有してＧタンパク質αと結合することから、Ｇタンパク質αを標的とすることによる検出（例えば、ＲＥＴの実施）、診断、および／または治療のための薬剤として使用される抗体（または抗体断片）を表す。
用語「抗体」は、「免疫グロブリン」とも呼ばれ、それぞれ約５０～７０ｋＤａの２本の重鎖（重鎖についてＨ鎖と呼ぶ）、およびそれぞれ約２５ｋＤａの２本の軽鎖（軽鎖についてＬ鎖と呼ぶ）からなり、それらが鎖内および鎖間ジスルフィド結合により互いに結合しているヘテロ四量体を意味する。各鎖は、Ｎ末端位では、軽鎖の場合はＶＬ、重鎖の場合はＶＨと呼ばれる可変領域またはドメイン、およびＣ末端位では、軽鎖の場合はＣＬと呼ばれる単一ドメイン、重鎖の場合はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４と呼ばれる３～４つのドメインからなる定常領域からなる。各可変ドメインは、４つの「ヒンジ領域」（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と呼ばれる）、および抗原との結合に直接関与する「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と表される）を一般に含む。抗体は、例えば哺乳類抗体、例えばマウス抗体等、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。
「キメラ抗体」とは、軽鎖および重鎖の可変領域の配列が、軽鎖および重鎖の定常領域の配列とは異なる種に属する抗体を意味する。本発明の目的において、重鎖および軽鎖の可変領域の配列が好ましくはマウス起源である一方、重鎖および軽鎖の定常領域の配列がマウス以外の種に属する。この点について、定常領域の場合、マウス以外の哺乳類の種であればいずれも使用可能であり、特にヒト、サル、旧世界ブタ（イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ））、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、またはトリが挙げられるが、この列挙は網羅的ではない。本発明によるキメラ抗体は、ヒト起源である重鎖および軽鎖の定常領域の配列、ならびにマウス起源である重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含有することが好ましい。
「ヒト化抗体」とは、抗原認識に関与する領域（超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ））の配列の一部または全部、および場合によっては、フレームワーク領域（ＦＲ領域）の特定のアミノ酸が非ヒト起源である一方、抗原認識に関与しない定常領域および可変領域の配列がヒト起源である抗体を意味する。
「ヒト抗体」とは、軽鎖の可変領域および定常領域、ならびに重鎖の可変領域および定常領域の両方について、ヒト配列のみを含有する抗体を意味する。
「抗体断片」とは、酵素消化または生物学的生産によって得られる免疫グロブリンの任意の一部分であって、少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、抗体全体によって認識される抗原に結合する能力を有するもの、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’－ＳＨを意味する。パパインによる免疫グロブリンの酵素消化によって、Ｆａｂ断片（抗原結合断片）と呼ばれる２つの同一の断片、およびＦｃ断片（結晶化可能断片）が生成される。ペプシンによる免疫グロブリンの酵素消化によって、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびいくつかのペプチドに分割されたＦｃ断片が生成される。Ｆ（ａｂ’）２は、鎖間ジスルフィド結合により結合した２つのＦａｂ’断片から形成される。Ｆａｂ部分は、可変領域とＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインとからなる。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ領域とヒンジ領域とからなる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、ヒンジ領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片を指す。
用語「親和性」とは、分子、例えば抗体もしくは抗体断片と、認識対象抗原、例えばＧタンパク質α等の抗原との非共有結合的なあらゆる相互作用の強さを指す。親和性は、解離定数（Ｋｄ）により一般的に表される。解離定数（Ｋｄ）は、周知の方法、例えばＦＲＥＴまたはＳＰＲにより測定可能である。
本発明の意味合いにおいて、「同一性」または「相同性」は、比較ウィンドウ内でアラインメントされた２つの配列を比較することにより算出される。配列をアラインメントすることによって、比較ウィンドウ内の２つの配列で共通する位置（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を決定することができる。従って、共通する位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の合計数で割算し、１００を掛けることにより、同一性の割合（％）が得られる。配列同一性の割合（％）の決定は、手作業により、または周知のソフトウェアを使用して実施可能である。
本発明の具体的な実施形態では、同一性または相同性は、アミノ酸残基の少なくとも１個の置換、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の置換に対応し、好ましくは、アミノ酸残基の少なくとも１個の置換が保存的に実施される。「保存的に実施されたアミノ酸残基の置換」は、あるアミノ酸残基を、類似した特性を有する側鎖を持つ別のアミノ酸残基と置き換えることからなる。類似した特性を備える側鎖を有するアミノ酸のファミリーは周知であり、例えば、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を挙げることができる。
従って、相同的な抗体もしくは抗体断片、または「抗体もしくは抗体断片の変異体」（すなわち、同じ機能を有する抗体もしくは抗体断片）は、抗原結合能を失うことなく、定常領域および／または可変領域のレベルでその他のアミノ酸と置換可能である特定のアミノ酸を有する。この置換は、抗体もしくは抗体断片をコードするＤＮＡ配列内で実施されることが好ましく、すなわち、置換は本質的に保存的である。当業者は、抗体もしくは抗体断片の機能を保存するために実施可能な置換の数およびその位置を決定するのに、自身の一般的な知識を応用する。抗体もしくは抗体断片の１つ以上の変異体が抗原に特異的に結合する能力を決定するために、当業者にとってなじみ深く、先行技術に記載されているいくつかの好適な方法が使用され得る。従って、抗体もしくは抗体断片は、結合技術、例えばＥＬＩＳＡ法、アフィニティークロマトグラフィーの技術等によりアッセイ可能である。抗体もしくは抗体断片の変異体は、例えば「ファージディスプレイ」法により生成可能であり、これによってファージライブラリーを生成できる。「ファージディスプレイ」ライブラリーを生成し、必要とされる機能特性を有する抗体もしくは抗体断片の変異体を標的化するための多くの方法が知られている。
「精製された」および「単離された」とは、本発明による抗体もしくは抗体断片を参照する場合、抗体が、同じ種類のその他の生物学的マクロ分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。用語「精製された」とは、本明細書で使用される場合、存在するすべてのマクロ分子に対して、好ましくは、少なくとも７５ｗｔ％、より好ましくは少なくとも８５ｗｔ％、いっそうより好ましくは少なくとも９５ｗｔ％、最も好ましくは少なくとも９８ｗｔ％を占める抗体を意味する。
用語「Ｇタンパク質」は、Ｇタンパク質α、Ｇタンパク質β、およびＧタンパク質γと呼ばれる３つのサブユニットからなるヘテロ三量体タンパク質を表す。
用語「Ｇタンパク質α」または「Ｇα」は、Ｇタンパク質のαサブユニットを表す。Ｇタンパク質αは、ＧＴＰアーゼドメインおよびアルファへリックスドメインの２つのドメインを有する。少なくとも２０種の異なるＧタンパク質αが存在しており、以下の主要なタンパク質ファミリー：Ｇαｓ（アデニル酸シクラーゼを活性化してｃＡＭＰの合成を増加させることが公知）、Ｇαｉ（アデニル酸シクラーゼを阻害することが公知）、Ｇαｏｌｆ（嗅覚受容体に関係する）、Ｇαｔ（ロドプシンと連携して網膜で視覚信号を伝達することが公知）、Ｇαｑ（ホスホリパーゼＣを刺激することが公知）、またはＧα１２／１３ファミリー（細胞骨格、細胞結合、およびその他の細胞運動に関連するプロセスを制御することが公知）に分類され得る。Ｇタンパク質αは、Ｇタンパク質αｉ、Ｇタンパク質αｏ、および／またはＧタンパク質αｚから選択され得る。Ｇタンパク質αｉは、Ｇタンパク質αｉ１、Ｇタンパク質αｉ２、およびＧタンパク質αｉ３から選択され得る。Ｇタンパク質αｉは、ヒト起源または動物起源であり得る。
有利には、本発明による抗体もしくは抗体断片は、Ｇタンパク質αｉ、Ｇタンパク質αｏ、および／またはＧタンパク質αｚと結合し、例えば、Ｇタンパク質αｉ１、Ｇタンパク質αｉ２、および／またはＧタンパク質αｉ３と結合する。ヒト起源のＧタンパク質αｉ１は、アイソフォーム１については識別子ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６３０９６－１、アイソフォーム２については識別子ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６３０９６－２を有する。ヒト起源のＧタンパク質αｉ１をコードする遺伝子は、名称「ＧＮＡＩ１」（遺伝子ＩＤ：２７７０、ＮＣＢＩ）により公知である。
用語「ＧＴＰ」は、グアノシントリホスフェートを表す。
用語「非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ」は、ＧＤＰへと加水分解されない、またはほとんど加水分解されないＧＴＰ類似体を表す。例えば、ＧＴＰγＳ（ＣＡＳ Ｎｏ．３７５８９－８０－３）、ＧｐｐＮＨｐ（ＣＡＳ Ｎｏ．１４８８９２－９１－５）、またはＧｐｐＣｐ（ＣＡＳ Ｎｏ．１０４７０－５７－２）が挙げられる。
用語「ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ」、または「標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ」は交換可能であり、ＲＥＴパートナー対の供与体メンバーで標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ（「ＧＴＰ－供与体」または「供与体ＧＴＰ」）、またはＲＥＴパートナー対の受容体メンバーで標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ（「ＧＴＰ－受容体」または「受容体ＧＴＰ」）を表す。
用語「ＲＥＴ」（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（共鳴エネルギー移動）に対する略号）は、ＦＲＥＴやＢＲＥＴを含むエネルギー移動技術を表す。
用語「ＦＲＥＴ」（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（蛍光共鳴エネルギー移動）に対する略号）は、２つの蛍光分子間のエネルギー移動を表す。ＦＲＥＴは、エネルギー供与体とエネルギー受容体との双極子間相互作用に起因する非放射性エネルギー移動として定義される。この物理現象は、当該分子間のエネルギー互換性を必要とする。これは、供与体の発光スペクトルが受容体の吸収スペクトルと少なくとも部分的に重なっていなければならないことを意味する。フェルスターの理論によると、ＦＲＥＴは、２つの分子、すなわち供与体と受容体とを隔てる距離に依存するプロセスであり、これらの分子が互いに接近しているとＦＲＥＴシグナルが放出される。例えば、抗体とその標的との間の解離定数（Ｋｄ）が、例えば実施例に記載されるように、ＦＲＥＴにより測定可能である。
用語「ＢＲＥＴ」（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（生物発光共鳴エネルギー移動）の略号）は、生物発光分子と蛍光分子との間のエネルギー移動を表す。
本発明による抗体もしくは抗体断片
本発明の第１の目的は、
・配列番号１のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列のＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、
・配列番号４のアミノ酸配列のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳ（すなわち、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒの３つのアミノ酸、すなわち、アスパラギン酸、スレオニンおよびセリンの３つのアミノ酸）のＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインと
を含む、Ｇタンパク質αに結合する能力を有する抗体もしくは抗体断片に関する。
重鎖可変ドメインは、
・配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ１、
・配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ２、
・配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ３、および／または
・配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ４
を含み得る。
軽鎖可変ドメインは、
・配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ１、
・配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ２、
・配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ３、および／または
・配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくはさらに１００％の相同性を有するＦＲ４
を含み得る。
本発明による抗体の具体的な実施形態では、
●重鎖可変ドメインは、
・配列番号６のアミノ酸配列のＦＲ１（すなわち、配列番号６のアミノ酸配列と１００％の相同性）、
・配列番号７のアミノ酸配列のＦＲ２、
・配列番号８のアミノ酸配列のＦＲ３、および
・配列番号９のアミノ酸配列のＦＲ４
を含み、かつ
●軽鎖可変ドメインは、
・配列番号１０のアミノ酸配列のＦＲ１、
・配列番号１１のアミノ酸配列のＦＲ２、
・配列番号１２のアミノ酸配列のＦＲ３、および
・配列番号１３のアミノ酸配列のＦＲ４
を含む。
本発明による抗体の具体的な実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有し得るが、軽鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有し得る。
従って、本発明は、
・重鎖可変ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有し、
・軽鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有し、
・重鎖可変ドメインのＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列からなり、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列からなり、重鎖可変ドメインのＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ２はアミノ酸配列ＤＴＳからなり、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３は配列番号５のアミノ酸配列からなる
抗体もしくは抗体断片に関する。
有利には、重鎖可変ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列からなり（すなわち、重鎖可変ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と１００％の相同性を有し）、軽鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列からなる。
実施例においてＤＳＶ３６Ｓとして説明される抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインとを含む。
上記第１の目的による抗体もしくは抗体断片は、以後、「参照抗体もしくは抗体断片」と呼ばれる。
本発明の第２の目的は、Ｇタンパク質αへの結合について、参照抗体もしくは抗体断片と競合する抗体もしくは抗体断片（以後、「競合抗体もしくは抗体断片」）に関する。
参照抗体もしくは抗体断片と競合してＧタンパク質αと結合する抗体もしくは抗体断片の能力は、競合法によりアッセイされ得る。「競合法」は、抗体（もしくは抗体断片）を、参照抗体もしくは抗体断片と抗原との結合をブロックするか、または抗原への結合について参照抗体もしくは抗体断片と競合する能力についてテストすることから構成される。換言すれば、参照抗体もしくは抗体断片と競合する抗体は、参照抗体もしくは抗体断片と同一のエピトープに結合するか、または参照抗体もしくは抗体断片により認識されるエピトープに十分に近接しているエピトープに結合することで、立体障害を理由として参照抗体もしくは抗体断片の結合を阻止する。
抗体もしくは抗体断片が参照抗体もしくは抗体断片と競合するか否かを決定するために、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイ法、免疫蛍光法、例えばＦＲＥＴまたはＨＴＲＦ（「ホモジニアス時間分解蛍光（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」）アッセイ法、免疫発光法、直接または間接サンドイッチ法、直接または間接固相放射免疫測定法（ＲＩＡ）、直接または間接固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、表面プラズモン共鳴技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）、フローサイトメトリー、蛍光分極法（例えば、蛍光ペプチドとテスト対象抗体との間）等による多種類の競合法が使用され得る。例えば、競合ＥＬＩＳＡ法では、固体表面または細胞に結合した精製抗原、未標識抗原に結合する試験対象抗体、および標識した参照抗体もしくは抗体断片の使用が含まれる。通常、参照抗体もしくは抗体断片は不飽和濃度（Ｇタンパク質αに対するその解離定数Ｋｄに対して）で存在し、シグナルは試験対象の抗体もしくは抗体断片の濃度を増加させつつ測定される。抗体が過剰に存在する場合、該抗体は、参照抗体もしくは抗体断片と抗原との特異的結合を、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、または７５％以上ブロックまたは阻害（例えば低減）し得る。いくつかのケースでは、結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上阻害される。
特に、Ｇタンパク質αへの結合について、参照抗体もしくは抗体断片と競合する抗体もしくは抗体断片は、ＨＴＲＦアッセイを実施することにより、または蛍光分極アッセイ、好ましくはＨＴＲＦアッセイを実施することにより特定される。抗体もしくは抗体断片が、Ｇタンパク質αへの結合について参照抗体もしくは抗体断片と競合する場合、該抗体もしくは抗体断片は、参照抗体もしくは抗体断片により生成されるＨＴＲＦシグナルを阻害する能力を有する。反対に、Ｇタンパク質αへの結合について参照抗体もしくは抗体断片と競合しない抗体もしくは抗体断片は、参照抗体もしくは抗体断片により生成されるＨＴＲＦシグナルを阻害する能力を有さない。
本発明による競合抗体もしくは抗体断片は、例えば、実施例１に記載されるプロトコールを実施することにより、参照抗体もしくは抗体断片を用いて取得され得る。抗体ＤＳＶ３８Ｓは、本発明による競合抗体である。
具体的な実施形態では、抗体ＤＳＶ３８Ｓおよび／または抗体ＤＳＶ３６Ｓは、本発明による競合抗体もしくは抗体断片から除外される。
参照抗体もしくは抗体断片、および上記で定義したような競合抗体もしくは抗体断片は、以後、共に「本発明による抗体もしくは抗体断片」と呼ばれる。
本発明による抗体もしくは抗体断片は、単離された形態のＧタンパク質αおよび／または膜環境中に存在するＧタンパク質αと結合することができ、例えば、１つ以上のＧＰＣＲ、および１つ以上のＧタンパク質αを有する膜標本中に存在するＧタンパク質αに結合することができる。本発明による抗体がＧタンパク質αと結合できるようにするために、Ｇタンパク質αがＧＰＣＲと複合体を形成する必要はない。
本発明による抗体もしくは抗体断片は、ＦＲＥＴにより測定したときに２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）でＧタンパク質αと結合し得る。ＲＥＴを適切に実行するために、解離定数が２０ｎＭ未満であることが好ましい。有利には、本発明による抗体もしくは抗体断片は、ＦＲＥＴで測定したときに２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）、例えば１０ｎＭ以下、さもなければ５ｎＭ以下、例えば０～２０ｎＭ（０を除く）、０～１０ｎＭ（０を除く）、０～５ｎＭ（０を除く）の親和定数でＧタンパク質αと結合し得る。本発明による抗体もしくは抗体断片のＫｄをＦＲＥＴにより測定する方法を、実施例２に記載する。
本発明による抗体もしくは抗体断片は、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰと共にＲＥＴの方法で使用され得る。
本発明による抗体もしくは抗体断片は、特にＧタンパク質αの活性化を検出するために、ＲＥＴ、特にＦＲＥＴを実施する際に特に有利である。従って、本発明による抗体もしくは抗体断片は、その検出を可能にする分子とカップリングし得る。有利には、本発明による抗体もしくは抗体断片は、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識され得る。
例えば、本発明による抗体もしくは抗体断片は、実施例１に記載するプロトコールを実施することにより取得され得る。
本発明者らは、本発明による抗体もしくは抗体断片は、Ｇタンパク質αのスイッチＩＩドメイン、より具体的にはＧタンパク質αのペプチド２１５～２９４に結合することも示した。
本発明による抗体もしくは抗体断片の標識
本発明による抗体もしくは抗体断片は、例えば以下に記載されるような当業者にとってなじみ深い方法により、直接的または間接的に標識され得るが、好ましくは、抗体はＲＥＴパートナー対のメンバーへの共有結合により直接標識される。
用語「ＲＥＴパートナー対」とは、エネルギー供与化合物（以後、「供与体化合物」）とエネルギー受容化合物（以後、「受容体化合物」）とからなる対を表し、これらが互いに接近しているとき、およびこれらを供与体化合物の励起波長で励起したとき、これらの化合物はＲＥＴシグナルを放出する。両化合物がＲＥＴパートナーとなるためには、供与体化合物の発光スペクトルが受容体化合物の励起スペクトルと部分的に重なっていなければならないことが公知である。例えば、蛍光性供与体化合物および受容体化合物を使用する場合、「ＦＲＥＴパートナー対」と呼ばれ、生物発光性供与体化合物および受容体化合物を使用する場合、「ＢＲＥＴパートナー対」と呼ばれる。
ＲＥＴパートナー対のメンバー、例えば蛍光化合物（ＦＲＥＴを利用する場合）を用いた抗体もしくは抗体断片の直接標識は、抗体もしくは抗体断片上の反応性基の存在に基づき、当業者に公知の従来法により実施され得る。例えば、下記の反応性基：末端アミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシレート基、リジンのアミン基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、ヒスチジンのイミダゾール基が使用され得る。
反応性基は、抗体もしくは抗体断片が保持する反応性基と共有結合を形成し得る。抗体もしくは抗体断片が保持する好適な反応性基は当業者により周知であり、例えばマレイミド基で官能化された供与体化合物または受容体化合物は、例えば、抗体もしくは抗体断片が保持するシステインが保持するチオール基に共有結合する能力を有することになる。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドのエステルを有する供与体／受容体化合物は、抗体もしくは抗体断片上に存在するアミンに共有結合する能力を有することになる。
本発明による抗体もしくは抗体断片は、例えば、それ自体が受容体／供与体化合物と共有結合している抗体もしくは抗体断片を測定媒体中に導入し、この第２の抗体もしくは抗体断片が、本発明による抗体もしくは抗体断片を特異的に認識することにより、蛍光性または生物発光性化合物で間接的に標識されることもある。
間接標識の別の極めて伝統的な手段は、ビオチンを、標識する抗体もしくは抗体断片に固定化し、次にこのビオチン化抗体もしくは抗体断片を、受容体／供与体化合物で標識したストレプトアビジンの存在下でインキュベートすることから構成される。好適なビオチン化抗体もしくは抗体断片は、当業者にとってなじみ深い技術により調製することができ、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社は、例えばフルオロフォアで標識したストレプトアビジンを「ｄ２」（ｒｅｆ．６１０ＳＡＤＬＡ）という商品名で市販している。
本発明の文脈において、抗体もしくは抗体断片は、（ｉ）蛍光供与体化合物もしくは発光供与体化合物、または（ｉｉ）蛍光受容体化合物もしくは非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識される。抗体もしくは抗体断片は、蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識されることが好ましい。
本発明の１つの実施形態によれば、抗体もしくは抗体断片は、例えば、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロン－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、および量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、およびＤｓＲｅｄから選択される蛍光受容体化合物で標識される。
本発明の別の実施形態によれば、抗体もしくは抗体断片は、例えば、ユーロピウムクリプテート、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロン－ジピロメテン誘導体、およびニトロベンゾオキサジアゾールから、好ましくは、ユーロピウムクリプテート；ユーロピウムキレート；テルビウムキレート；テルビウムクリプテート；ルテニウムキレート；および量子ドットから選択される蛍光供与体化合物で標識されるが、ユーロピウムおよびテルビウムのキレートおよびクリプテートが特に好ましい。
本発明の別の実施形態によれば、抗体もしくは抗体断片は、例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、およびホタルルシフェラーゼから選択される発光供与体化合物で標識される。
本発明の文脈において使用され得る標識方法および標識は、２０１９年１月３０日出願の仏国特許出願公開第１９００８８０号明細書に記載されており、参照により本明細書に組み込まれている。
抗体もしくは抗体断片の組成物
本発明の第３の目的は、上述した抗体もしくは抗体断片を含む組成物に関する。本発明による組成物は、ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰ源を更に含み得る。
ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰは、以後、「パーツキット」セクションで説明される。
パーツキット
本発明の第４の目的は、（ｉ）本発明による抗体もしくは抗体断片（上記で定義したような参照または競合抗体もしくは抗体断片）、および（ｉｉ）ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰ源（以後、「標識したＧＴＰ」）を含む試薬のキット（パーツキット）に関する。
ＧＴＰは、非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ、例えばＧＴＰガンマＳ（ＧＴＰγＳまたはＧＴＰｇＳ）、ＧｐｐＮＨｐ、およびＧｐｐＣｐ等であり得る。
ＧＴＰは、直接的または間接的に標識され得る。ＧＴＰは直接標識されることが好ましい。ＲＥＴパートナー対のメンバーによる、例えばＦＲＥＴを利用する場合には蛍光化合物によるＧＴＰの直接標識は、ＧＴＰ上の反応性基の存在に基づく方法により実施され得る。
反応性基は、ＲＥＴパートナー対のメンバーが保持する反応性基と共有結合を形成し得る。ＲＥＴパートナー対のメンバーが保持する好適な反応性基は当業者に周知であり、例えばマレイミド基で官能化された供与体化合物または受容体化合物は、例えば、チオール基と共有結合する能力を有することになる。同様に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドのエステルを有する供与体／受容体化合物は、アミンと共有結合する能力を有することになる。
本発明の文脈において、ＧＴＰは、（ｉ）蛍光供与体化合物、または（ｉｉ）蛍光受容体化合物もしくは非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識される。ＧＴＰは、蛍光供与体化合物で標識されることが好ましい。
具体的な実施形態では、標識したＧＴＰは、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｎ－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３（ＧＴＰ－γ－Ｎ－Ｃ３）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－Ｃ１１）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－Ｃ３）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（ＧＴＰ－γ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ３）、またはＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２）、好ましくはＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２から選択される蛍光供与体化合物で標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰである。
本発明によれば、標識したＧＴＰは、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５、ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８、ＧＴＰｇＮ－Ｌ１５－フルオレセイン、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）、またはＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）から選択される蛍光受容体化合物で標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰである。ＧＴＰは、非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識されていてもよい。
ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２を下記に示す。
Figure 2023511770000001
本発明の具体的な実施形態では、ＧＴＰは、蛍光供与体化合物で標識され、抗体もしくは抗体断片は、蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識される。別の具体的な実施形態では、ＧＴＰは、蛍光受容体化合物または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）で標識され、抗体もしくは抗体断片は、蛍光供与体化合物または発光供与体化合物で標識される。
上記したその他の標識したＧＴＰおよびその調製方法は、２０１９年１月３０日出願の仏国特許出願公開第１９００８５６号明細書に記載されており、本明細書において参照により組み込まれている。
有利には、（ｉ）は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン、および配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む抗体であり、（ｉｉ）は、ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２である。
その他の目的
本発明の第５の目的は、本発明による（参照または競合）抗体もしくは抗体断片をコードする核酸配列に関する。
本発明の第６の目的は、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。抗体の製造に適する任意の種類のベクターが、本発明の文脈において使用され得る。特に、ベクターは組換えベクターである。ベクターは、本発明による抗体を製造するために必要な核酸配列、例えばプロモーター配列、制御配列等を含むことになる。好適なベクターの調製は幅広く文献に記載されている。
本発明の第７の目的は、本発明によるベクターまたは本発明による核酸配列を含む細胞に関する。本発明による細胞は、幅広く文献に記載されている方法により、例えば細胞クローンに本発明によるベクターまたは核酸配列をトランスフェクトすることにより取得され得る。本発明は特定の細胞型に限定されない。抗体産生能を有する任意の細胞が、本発明の文脈において使用され得る。該細胞は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞もしくはマウス細胞、または原核細胞、例えば細菌もしくは酵母であり得る。
本発明は、以下に示す図および実施例により更に例証される。しかしながら、これらの実施例およびこれらの図は、いかなる場合においても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
抗Ｇタンパク質αｉ１抗体のＫｄを測定するためのＦＲＥＴの反応スキームを示す。 ヒトＧタンパク質αｉ１（またはタンパク質Ｇａｉ１）に対する、ｄ２で標識したＳＣ１３５３３、ＤＳＶ３６Ｓ、およびＤＳＶ３８Ｓの各抗体の親和性を例証する曲線を示す。Ｇタンパク質αｉ１が存在する場合、きわめて顕著なＨＴＲＦシグナルが、ヌクレオチド（ＧＴＰｇＳまたはＧＤＰ）の存在下および非存在下においてすべての抗体について得られる。結果は、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体が、Ｇタンパク質αｉ１に結合する能力を有することを示す。曲線は、タンパク質Ｇαｉ１に対するこれら各種抗体の親和性（Ｋｄ）の計算を可能にする（表１）。 ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各未標識抗体が、ヒトＧタンパク質ｉ１において抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２の結合を阻害する能力を例証する曲線である。論理的に言って、未標識抗体ＳＣ１３５３３は、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。反対に、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＶ３８Ｓは、ＳＣ１３５３３－ｄ２により生成されるシグナルを阻害する能力を有さなかった。これは、これら両抗体が、抗体ＳＣ１３５３３と同じＧタンパク質αｉ１の領域に結合しないことを実証する。結論として、ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓの各抗体は、抗体ＳＣ１３５３３とは異なるエピトープを認識する。 ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各市販抗体が、ヒトＧタンパク質ｉ１において抗体ＤＳＶ ＳＣ１３５３３－ｄ２の結合を阻害する能力を示す。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ ＳＣ１３５３３は、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。また、抗体ｓｃ－５６５３６およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎは、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。結論として、ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各市販抗体は、いずれも抗体ＤＳＶ３６Ｓの非競合的抗体である。従って、これらの抗体すべてが、抗体ＤＳＶ３６Ｓとは異なるエピトープを認識する。 ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各市販抗体が、ヒトＧタンパク質ｉ１において抗体ＤＳＶ３Ｓ－ｄ２（研究室にて作製）の結合を阻害する能力を示す。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ３Ｓは、抗体ＤＳＶ３Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。また、ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各抗体は、抗体ＤＳＶ３Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。結論として、これらの結果は、ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各市販抗体が、いずれも抗体ＤＳＶ３６Ｓの非競合的抗体であることを実証する。従って、同じことが研究室で作製された抗体ＤＳＶ３Ｓにも当てはまる。従って、これらの抗体すべてが、抗体ＤＳＶ３６Ｓとは異なるエピトープを認識する。 未標識抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓが、Ｇタンパク質αｉ１において抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２の結合を阻害する能力を例証する曲線である。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ３６Ｓは、抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。抗体ＤＳＶ３８Ｓも、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２により生成されるシグナルを完全に阻害した。これは、これら両抗体がＧタンパク質αｉ１の同じ領域に結合することを実証する。結論として、抗体ＤＳＶ３８Ｓは、Ｇタンパク質αｉへの結合について抗体ＤＳＶ３６Ｓと競合する。 ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各市販抗体が、ヒトＧタンパク質ｉ１において抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２の結合を阻害する能力を示す。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ３６Ｓは、抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。反対に、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各抗体は、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２により生成されるシグナルを阻害する能力を有さなかった。これは、これら３つの抗体は、抗体ＤＳＶ３６Ｓと同じヒトＧタンパク質αｉ１の領域に結合しないことを実証する。結論として、これらの抗体は、抗体ＤＳＶ３６Ｓとは異なるエピトープを認識する。 図８Ａおよび８Ｂは、異なる種類のＧタンパク質αに対する、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体の選択性を測定するためのＦＲＥＴの反応スキームを示す。 異なる種類のＧタンパク質αについて、抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ／抗ＦＬＡＧ－ｄ２からなる抗体の対を用いて得られるＦＲＥＴシグナルを示す図であり、プラスミドによりコードされるＧタンパク質αが、いずれもＨＥＫ２９３において確かに過剰発現されたことを検証することができる。実際、各々を用いて得られたＨＴＲＦシグナルは、タグ化タンパク質ＦＬＡＧ＋Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇを一切コードしない対照プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３に対応する陰性条件（「ＭＯＣＫ」）で得られたＨＴＲＦシグナルよりもかなり高かった。 異なる種類のＧタンパク質αに対する、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体の選択性を例証する図である。抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓは、Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚの各タンパク質が過剰発現された場合に、陽性ＨＴＲＦシグナルを示したが、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１２、およびＧα１３の各タンパク質が過剰発現された場合には、ＨＴＲＦシグナルを示さなかった。抗体ＳＣ１３５３３は、タンパク質Ｇαｉ１およびＧαｉ３が過剰発現された場合に、陽性ＨＴＲＦシグナルを示したが、Ｇαｉ２、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１２、およびＧα１３の各タンパク質が過剰発現された場合には、ＨＴＲＦシグナルを示さなかった。これらの結果より、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓは、Ｇタンパク質α上の同じエピトープを認識する（同じ選択性プロファイルを有し、競合的である）ことが確認される。このエピトープは、より少数のＧタンパク質αを認識する抗体ＳＣ１３５３３が認識するエピトープとは異なる。 ＧＰＣＲを過剰発現する膜標本上で蛍光ＧＴＰ類似体（ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテート）と組み合わせた場合に、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体がＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を例証する図である。「ＧＴＰｇＳ」条件は、過剰量の未標識ＧＴＰｇＳ（１００μＭ）が、Ｇタンパク質αにおけるＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートの結合を阻害し、従ってＦＲＥＴシグナルの出現を妨げたアッセイの非特異的シグナル（ＮＳ）を表す。「バッファ」条件は、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートと、ｄ２で標識した抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓとの間で中程度であるが顕著なＦＲＥＴシグナルを得ることが可能であることを示した。ＳＮＣ１６２を添加すると、膜内で過剰発現したＤＯＲ受容体の活性化が引き起こされ、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓにより認識されるタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚの一部または全部における蛍光ＧＴＰ類似体の結合の増加と関連して、このＦＲＥＴシグナルの増加が観察された。反対に、ＨＥＫ２９３細胞において内因的に発現されるタンパク質Ｇαｉ１およびＧαｉ３に結合するその能力にもかかわらず［２］、抗体ＳＣ１３５３３は、ＳＮＣ１６２の有無にかかわらず、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートと組み合わせた場合に、ＦＲＥＴシグナルを一切示さなかった。これらの結果より、本発明による抗体のみがＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有したことが確認される。 ＧＰＣＲを過剰発現する非活性化膜標本上で蛍光ＧＴＰ類似体（ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテート）と組み合わせた場合に、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各抗体がＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を示す。「非特異的シグナル」条件は、蛍光ＧＴＰ類似体とｄ２で標識した抗体との間で弱いベースラインＦＲＥＴシグナルが検出されることを示した。「陰性対照」条件は、過剰量の未標識ＧＴＰｇＳ（１００μＭ）が、Ｇタンパク質αにおける蛍光ＧＴＰ類似体の結合を阻害し、従ってＦＲＥＴシグナルの出現を妨げたアッセイの非特異的シグナルを表す。測定された阻害は、「非特異的シグナル」条件および「陰性対照」条件について測定されたＨＴＲＦシグナルのレベルがほぼ同一であることから、合計であった。蛍光ＧＴＰ類似体および抗体を添加すると、抗体ＤＳＶ３６Ｓにより認識されるタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚの一部または全部におけるＧＴＰの蛍光類似体の結合の増加と関連したＦＲＥＴシグナルの増加が測定された。反対に、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧタンパク質αｉに結合するその能力にもかかわらず、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各抗体は、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートと組み合わせた場合に、ＦＲＥＴシグナルを一切示さなかった。結論として、これらの結果より、本発明により記載される抗体のみがＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有したことが確認される。 ＧＰＣＲを過剰発現する非活性化膜標本上で蛍光ＧＴＰ類似体（ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ））と組み合わせた場合に、抗体ＤＳＶ３６Ｓおよびｓｃ－１３５３３がＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を示す。「非特異的シグナル」条件は、蛍光ＧＴＰ類似体と、テルビウムクリプテートで標識した抗体との間で弱いベースラインＦＲＥＴシグナルが検出されることを示した。「陰性対照」条件は、過剰量の未標識ＧＴＰｇＳ（１００μＭ）が、Ｇタンパク質αにおける蛍光ＧＴＰ類似体の結合を阻害し、従ってＦＲＥＴシグナルの出現を妨げたアッセイの非特異的シグナルを表す。測定された阻害は、「非特異的シグナル」条件および「陰性対照」条件について測定されたＨＴＲＦシグナルのレベルがほぼ同一であることから、合計であった。蛍光ＧＴＰ類似体および抗体を添加すると、抗体ＤＳＶ３６Ｓにより認識されるタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚの一部または全部における蛍光ＧＴＰ類似体の結合の増加と関連したＦＲＥＴシグナルの増加が測定された。反対に、ＨＥＫ２９３細胞において内因的に発現されるタンパク質Ｇαｉ１およびＧαｉ３に結合するその能力にもかかわらず、抗体ｓｃ－１３５３３は、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）と組み合わせた場合に、ＦＲＥＴシグナルを一切示さなかった。結論として、本発明により記載される抗体のみがＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有した。 図１４Ａおよび１４Ｂは、本発明による抗体と共に使用可能であるＦＲＥＴの２つのフォーマット（フォーマット２Ａおよび２Ｂ）を例証する。 図１５Ａおよび１５Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図１６Ａおよび１６Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図１７Ａおよび１７Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図１８Ａおよび１８Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図１９Ａおよび１９Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図２０Ａおよび２０Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図２１Ａおよび２１Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図２２Ａおよび２２Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図２３Ａおよび２３Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。 図２４Ａおよび２４Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５＋ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ｂによる活性化アッセイを例証する。 図２５Ａおよび２５Ｂは、検出ペア：ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８＋ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂを用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ｂによる活性化アッセイを例証する。 図２６Ａおよび２６Ｂは、検出ペア：ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２＋ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いたデルタオピオイドＧＰＣＲにおけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイを例証する。
材料
デルタオピオイド受容体（ＤＯＲ）を発現する細胞膜標本を、Ｅｕｒｏｃｒｅｅｎ社からサービス提供を介して購入した。
ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各抗体は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社が作製したが、要望に応じてＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から入手可能である（それぞれ参照番号ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓとして）。抗体ＤＳＶ３６Ｓは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン、および配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む。抗体を、ＴＲ－ＦＲＥＴ検出のための適合性蛍光プローブで標識した（赤色受容体－ｄ２または供与体Ｌｕｍｉ４Ｔｂ）。
抗体ＳＣ１３５３３およびＳＣ５６５３６を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社からを購入した（参照番号ＳＣ１３５３３および参照番号ＳＣ５６５３６）。抗体ＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎを、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社から購入した（参照番号ＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎ）。
抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ抗体を、ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入し（参照番号２－１５１７－００１）、ＴＲ－ＦＲＥＴ検出に適合する蛍光プローブで標識した（供与体Ｌｕｍｉ４Ｔｂ）。
抗ＦＬＡＧ－ｄ２抗体は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から入手可能である（参照番号６１ＦＧ２ＤＬＦ）。
ヌクレオチドＧＤＰおよびＧＴＰγＳを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社からを購入した（それぞれ、カタログ参照番号Ｇ７１２７およびＧ８６３４）。
デルタオピオイドＧＰＣＲのアゴニスト（ＳＮＣ１６２）を、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した（参照番号１５２９）。
細胞培養に適する、白色底部を備えた３８４ウェル低容量白色プレートおよび９６ウェル黒色プレート（黒色底部を備える）を、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ社からを購入した（それぞれ、カタログ参照番号７８４０７５および６６５０８６）。
供与体フルオロフォア（ユーロピウムクリプテート）で標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体（ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２）は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社が合成した。受容体フルオロフォア（Ｃｙ５）で標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体（ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ））は、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した（参照番号ＮＵ－８３４－Ｃｙ５）。
Ｎ末端にタグＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇが融合したヒト組換えＧタンパク質αｉ１は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社が作製および精製した。
Ｎ末端部分にタグＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇおよびＦＬＡＧが融合した様々なヒトＧタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１２、およびＧα１３をコードするプラスミドは、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ社（サービス提供）が合成および増幅した。
ＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから購入した。
細胞実験で使用される試薬および培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地、リポフェクタミン２０００、およびポリオルニチン）を、それぞれＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（参照番号５１９８５－０２６および１１６６８－０１９）およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（参照番号Ｐ４９５７）から購入した。
方法
ＦＲＥＴシグナルの読み取り（ＨＴＲＦ技術）
ＨＴＲＦシグナルを、ＰＨＥＲＡｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社）において下記構成で測定した。
●モジュール：ＨＴＲＦ（励起３３７ｎｍ、発光６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ）
●励起：レーザーの場合４０フラッシュまたはランプの場合１００フラッシュ
●読み取りウィンドウ：遅延：６０μｓ－積分：４００μｓ
ＨＴＲＦシグナルの処理
下記式：ＨＴＲＦ比＝６６５ｎｍにおけるシグナル／６２０ｎｍにおけるシグナル＊１０，０００に従い、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍにおける生シグナルからＨＴＲＦ比を計算した。
実施例１：本発明による抗タンパク質Ｇαｉ１抗体を取得するためのプロトコール
マウスの免疫化
組換えＴＳＴ－Ｇタンパク質αｉ１（Ｎ末端において、リンカーＴＥＶを介して、タグＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）（ＩＢＡ）でタグ化された配列ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６３０９６－１のＧタンパク質αｉ１）を、Ｓｆ９昆虫細胞（当該タンパク質をコードするバキュロウイルスに感染）において生成し、次にタグＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）を介して親和性カラムで精製した（Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ高容量樹脂（ＩＢＡ、カタログ番号：２－１２０８－００２））。
ＧＴＰｇＳを含有するバッファ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１１ｍＭのＣＨＡＰＳ、１００μＭのＧＴＰｇＳ）中であらかじめ希釈したＴＳＴ－Ｇタンパク質αｉ１を注射することにより、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。最初の注射後に、３回のブースターを１ヶ月間隔で行った。
各注射後の１５日間、血液サンプルをマウスから採取することで、免疫応答の有無について検証することができた。
このために、ＥＬＩＳＡタイプのアッセイをセットアップした。ＧＴＰｇＳを含有するバッファ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、１μＭのＧＴＰｇＳ）中であらかじめ２０μｇ／ｍＬまで希釈したＴＳＴ－Ｇタンパク質αｉ１を、タグＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇを介して、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ（ＩＢＡ、カタログ番号：２－４１０１－００１）を含む９６ウェルプレートに吸着させた。このために、１００μｌのタンパク質を各ウェルに添加し、次に３７℃で２時間インキュベートし、その後、１×ＰＢＳバッファ／０．０５％ツイーン２０中で３回洗浄した。
次に、血液サンプルを１０～１億倍に段階希釈したものを、１００μＬ／ウェルのレベルまで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。タンパク質に固定化されない抗体を、１×ＰＢＳバッファ／０．０５％ツイーン２０中での３回の洗浄ステップにより除去し、次に固定された抗体の検出を、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合した二次抗マウスＦｃ抗体（ＰＢＳ（０．１％のＢＳＡ）で１／１００００希釈したＳｉｇｍａ社＃Ａ０１６８）を使用して実施した。３７℃で１時間インキュベートし、次に１×ＰＢＳバッファ／０．０５％ツイーン２０中で３回洗浄した後、ＨＲＰの検出を、その基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、Ｓｉｇｍａ社＃Ｔ０４４０）を撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした後、４５０ｎｍにおける比色分析アッセイにより実施した。
ＥＬＩＳＡアッセイにより検出された抗体が、実際にＧタンパク質αｉ１に対するものであり、タグＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇに対するものではないことを確認するために、同じ血液サンプルを、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇでタグ化した過剰量の別の直交性タンパク質（ＳＮＡＰＴａｇ－ＴｗｉｎＳｔｒｅｐＴａｇ）と共にプレインキュベートした後、ＥＬＩＳＡアッセイでテストした。よって、抗タグ抗体は、タグ化された直交性タンパク質上に固定化され、従ってウェルの底部に結合したＧタンパク質αｉ１上には固定化されない。この場合、ＨＲＰシグナルは検出されないか、またはＨＲＰシグナルの減少が検出される。
抗体価が最も高く、かつ抗タグ対照例においてシグナルの減少が最も小さいマウスを、次ステップのリンパ球ハイブリダイゼーション（融合とも呼ばれる）のために選択した。マウス脾臓を回収し、この脾臓から得られたリンパ球および形質細胞の混合物を、ポリエチレングリコールタイプの細胞融合触媒の存在下でミエローマ細胞株とｉｎ ｖｉｔｒｏで融合させた。酵素ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチングアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を欠いている変異ミエローマ細胞株を使用して、ハイブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞の選択を可能にした。この細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリン（メトトレキサート）、およびチアミン（ｔｈｙａｍｉｎｅ）を含有する培地（ＨＡＴ培地）中で培養して、非融合ミエローマ細胞の除去、従って目的とするハイブリドーマの選択を可能にした。非融合脾臓細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは増殖することができないので死滅する。従って、ハイブリドーマのみが生き残った。
次に、このハイブリドーマを培養皿内で培養した。次に、このハイブリドーマの上清を、抗Ｇタンパク質αｉ１抗体を産生する能力を評価するためにテストした。このために、上記したようなＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
異なる形態のＧタンパク質αｉ１（ＧＤＰに結合した完全型ｖｓＧＴＰｇＳに結合した完全型ｖｓ空型）間で抗体の選択性を評価するために、１μＭのＧＤＰもしくは１μＭのＧＴＰｇＳを含有するか、またはヌクレオチドを含まないバッファ中でＴＳＴ－Ｇタンパク質αｉ１をプレインキュベートするという条件で並行してアッセイを実施した。次に、ハイブリドーマクローンを取得するために、最良のハイブリドーマを限界希釈ステップを用いてクローン化した。
次いで、腹水中で大量の抗体の産生を可能にするために、目的とするハイブリドーマのクローンをマウスに注射した（腹腔内注射）。
次に、抗体を、プロテインＡを有する樹脂を含むカラムでアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
上記精製抗体がＧタンパク質αへの結合について抗体ＤＳＶ３６Ｓと競合する能力
すべての試薬を、バッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ）中で希釈する。ウェル内最終濃度２．５ｎＭを得るために、Ｇタンパク質αｉ１を２×で調製する。ウェル内最終濃度１０μＭを得るために、ヌクレオチドＧＴＰｇＳを２×で調製する。これら両試薬を全く同一の溶液中で調製し、室温で３０分間プレインキュベートした後、ウェル内に分配する。ウェル内最終濃度０．０１～１μＭとなるように、上記精製抗体を４×で調製する。最終濃度１０ｎＭとなるように、抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を４×で調製する。ウェル内最終濃度０．５ｎＭを得るために、抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体を４×で調製する。
試薬を以下のように３８４ウェルプレート内に分配する。
１．プレインキュベートしたＧタンパク質αｉ１＋ＧＴＰｇＳの混合物１０μｌを各ウェル内に入れる。
２．精製抗体５μｌを各ウェルに添加する。
３．プレートを室温で３０分間インキュベートする。
４．抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体と抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２との混合物５μｌを各ウェルに添加する。
プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルを読み取る。
本発明による抗体は、抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを阻害する能力を有する。反対に、本発明によらない抗体は、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２により生成されるシグナルを阻害する能力を有さない。
実施例２：ｄ２で標識した抗体ＳＣ１３５３３、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８ＳのＧタンパク質αｉ１に対する親和性の決定
実験プロトコール
すべての試薬をバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ）中で希釈した。ウェル内最終濃度２．５ｎＭを得るために、Ｇタンパク質αｉ１を２×で調製した。ウェル内最終濃度１００μＭを得るために、ヌクレオチドＧＴＰｇＳを２×で調製した。これら両試薬を全く同一の溶液中で調製し、室温で３０分間プレインキュベートした後、ウェル内に分配した。抗体に応じてウェル内最終濃度０．０１～１０ｎＭとなるように、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２、ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２、およびＳＣ１３５３３－ｄ２の各抗体を４×で調製した。ウェル内最終濃度０．２５ｎＭを得るために、抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体を４×で調製した。
試薬を以下のように３８４ウェルプレート内に分配した。
１）プレインキュベートしたＧタンパク質αｉ１＋バッファのみまたはＧＴＰｇＳもしくはＧＤＰの混合物１０μｌを各ウェル内に入れた。
２）ｄ２で標識したＤＳＶ３６ＳまたはＤＳＶ３８ＳまたはＳＣ１３５３３抗体５μｌを各ウェルに添加した。
３）抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体５μｌを各ウェルに添加した。
プレートを室温で２４時間インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルを読み取った。
反応スキームを図１において例証する。
結果
図２は、ｄ２で標識したＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体を用いて得た結果を示す。Ｇタンパク質αｉ１が存在する場合、非常に顕著なＨＴＲＦシグナルが、ヌクレオチド（ＧＴＰｇＳまたはＧＤＰ）の存在下および非存在下、これらすべての抗体について得られる。これらの結果は、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体が、Ｇタンパク質αｉ１に結合する能力を有することを示す。
また、得られた抗体価曲線よって、Ｇタンパク質αｉ１に対するこれら各種抗体の親和性（Ｋｄ）を計算することが可能になる。これは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、ＨＴＲＦデータに対して「一部位特異的結合」モデルを適用することにより実施した。得られたＫｄの値を表１に示す。
Figure 2023511770000002
Ｋｄの値は、３つの抗体がＧタンパク質αｉ１に対して優れた親和性を有することを示しており、Ｋｄの値は、タンパク質の状態を問わず、０．１～１ｎＭであった。
しかしながら、Ｇタンパク質αｉ１がヌクレオチド（特にＧＴＰｇＳ）に結合しているとき、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓはより高いシグナルおよびより高い親和性を示したことが指摘され得る。反対に、抗体ＳＣ１３５３３は、Ｇタンパク質αｉ１の状態を問わず、類似したシグナルおよび類似した親和性を示した。これは、抗体ＳＣ１３５３３が、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓと同様な方法でＧタンパク質αｉ１に結合しないことを示唆する。
実施例３：ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、ＳＣ１３５３３、ＳＣ５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各未標識抗体がＧタンパク質ｉ１において抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２の結合を阻害する能力
実験プロトコール
すべての試薬をバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ）中で希釈した。ウェル内最終濃度２．５ｎＭを得るために、Ｇタンパク質αｉ１を２×で調製した。ウェル内最終濃度１０μＭを得るために、ヌクレオチドＧＴＰｇＳを２×で調製した。これら両試薬を全く同一の溶液中で調製し、室温で３０分間プレインキュベートした後、ウェル内に分配した。ウェル内最終濃度０．０１～１００ｎＭとなるように、ＤＳＶ３６、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各冷式抗体を４×で調製した。最終濃度１０ｎＭとなるように、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を４×で調製した。ウェル内最終濃度０．５ｎＭを得るために、抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体を４×で調製した。
試薬を以下のように３８４ウェルプレート内に分配した。
１）プレインキュベートしたＧタンパク質αｉ１＋ＧＴＰｇＳの混合物１０μｌを各ウェルに入れた。
２）ＤＳＶ３６ＳまたはＤＳＶ３８ＳまたはＳＣ５６５３６またはＡＭ０５３０２ＰＵ－ＮまたはＳＣ１３５３３の各未標識抗体５μｌを各ウェルに添加した。
３）プレートを室温で３０分間インキュベートした。
４）抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体およびＳＣ１３５３３－ｄ２抗体５μｌを各ウェルに添加した。
プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルを読み取った。
結果
図３は、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体を用いて得た結果を示す。論理的に言って、未標識抗体ＳＣ１３５３３は、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。反対に、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＶ３８Ｓは、ＳＣ１３５３３－ｄ２により生成されるシグナルを阻害する能力を有さなかった。これは、これら両抗体が、抗体ＳＣ１３５３３と同じＧタンパク質αｉ１の領域に結合しないことを実証する。結論として、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓは、抗体ＳＣ１３５３３とは異なるエピトープを認識する。
図４は、ＳＣ１３５３３、ＳＣ５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各抗体を用いて得た結果を示す。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ ＳＣ１３５３３は、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。また、抗体ｓｃ－５６５３６およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎは、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。抗体ＳＣ１３５３３は抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓと競合せず、抗体ＳＣ５６５３６およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎは、抗体ＳＣ１３５３３－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを阻害する能力を有するので、従って抗体ｓｃ－５６５３６およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎは、抗体ＤＳＶ３６Ｓの非競合抗体でもある。
結論として、図３および図４に提示する結果は、ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各市販抗体は、いずれも抗体ＤＳＶ３６Ｓの非競合抗体であることを実証する。従って、これらの抗体は、いずれも抗体ＤＳＶ３６Ｓとは異なるエピトープを認識する。
実施例４：ＤＳＶ３Ｓ、ＳＣ５６５３６、ＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎ、およびＳＣ１３５３３の各未標識抗体がＧタンパク質ｉ１において抗体ＤＳＶ３Ｓ－ｄ２の結合を阻害する能力
実験プロトコール
すべての試薬をバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ）中で希釈した。ウェル内最終濃度２．５ｎＭを得るために、Ｇタンパク質αｉ１を２×で調製した。ウェル内最終濃度１０μＭを得るために、ヌクレオチドＧＴＰｇＳを２×で調製した。これら両試薬を全く同一の溶液中で調製し、室温で３０分間プレインキュベートした後、ウェル内に分配した。ウェル内最終濃度０．０３～３００ｎＭとなるように、ＤＳＶ３Ｓ、ＳＣ５６５３６、ＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎ、およびＳＣ１３５３３の各冷式抗体を４×で調製した。最終濃度１０ｎＭとなるように、抗体ＤＳＶ３Ｓ－ｄ２を４×で調製した。ウェル内最終濃度０．２５ｎＭを得るために、抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体を４×で調製した。
試薬を以下のように３８４ウェルプレート内に分配した。
１）プレインキュベートしたＧタンパク質αｉ１＋ＧＴＰｇＳの混合物１０μｌを各ウェルに入れた。
２）ＤＳＶ３ＳまたはＳＣ５６５３６またはＳＣ１３５３３またはＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各未標識抗体５μｌを各ウェルに添加した。
３）プレートを室温で３０分間インキュベートした。
４）抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体およびＤＳＶ３Ｓ－ｄ２抗体５μｌを各ウェルに添加した。
プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルを読み取った。
結果
図５は得られた結果を示す。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ３Ｓは、抗体ＤＳＶ３Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。また、ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各抗体は、抗体ＤＳＶ３Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。結論として、これらの結果は、実施例３に提示する結果と組み合わせると、ｓｃ－１３５３３、ｓｃ－５６５３６、およびＡＭ０５３０２ＰＵ－Ｎの各市販抗体が、いずれも抗体ＤＳＶ３６Ｓの非競合抗体であることを実証する。従って、同じことが研究室で作製された抗体ＤＳＶ３Ｓにも当てはまる。従って、これらの抗体は、いずれも抗体ＤＳＶ３６Ｓとは異なるエピトープを認識する。
実施例５：ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各未標識抗体がＧタンパク質αｉ１における抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２の結合を阻害する能力
実験プロトコール
すべての試薬をバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ）中で希釈した。ウェル内最終濃度２．５ｎＭを得るために、Ｇタンパク質αｉ１を２×で調製した。ウェル内最終濃度１００μＭを得るために、ヌクレオチドＧＴＰｇＳを２×で調製した。これら両試薬を全く同一の溶液中で調製し、室温で３０分間プレインキュベートした後、ウェル内に分配した。ウェル内最終濃度０．００１～１μＭとなるように、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各冷式抗体を４×で調製した。最終濃度１０ｎＭとなるように、抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を４×で調製した。ウェル内最終濃度０．２５ｎＭを得るために、抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体を４×で調製した。
試薬を以下のように３８４ウェルプレート内に分配した。
１）プレインキュベートしたＧタンパク質αｉ１＋ＧＴＰｇＳの混合物１０μｌを各ウェルに入れた。
２）ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各未標識抗体５μｌを各ウェルに添加した。
３）プレートを室温で３０分間インキュベートした。
４）抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体およびＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２抗体５μｌを各ウェルに添加した。
プレートを室温で１時間インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルを読み取った。
結果
図６は、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓを用いて得た結果を示す。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ３６Ｓは、抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。抗体ＤＳＶ３８Ｓも、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２により生成されるシグナルを完全に阻害した。これは、これら両抗体が同じＧタンパク質αｉ１の領域に結合することを実証する。図７は、ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各抗体を用いて得た結果を示す。論理的に言って、未標識抗体ＤＳＶ３６Ｓは、抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２を用いて得られるＨＴＲＦシグナルを完全に阻害した。反対に、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各抗体は、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２により生成されるシグナルを阻害する能力を有さなかった。これは、これら３つの抗体は、抗体ＤＳＶ３６Ｓと同じヒトＧタンパク質αｉ１の領域に結合しないことを実証する。
結論として、抗体ＤＳＶ３８Ｓのみが、Ｇタンパク質αｉへの結合について抗体ＤＳＶ３６Ｓと競合し、従って同一のエピトープを共有する。
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞で過剰発現された場合の各種のＧタンパク質αに対するＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体の選択性
１日目：各種のヒトタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１２、およびＧα１３をコードするプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ細胞１百万個／ｍｌを含む溶液をＯｐｔｉＭＥＭ培地中で調製した。１５０ｎｇ／ウェルのプラスミドおよび０．３７５μｌのリポフェクタミンを含むプラスミド／リポフェクタミン混合物を、黒色底部のウェルを有する９６ウェルプレートに添加する３０分前にＯｐｔｉＭＥＭ培地中で調製した。
細胞培養に適する黒色マイクロプレートの各ウェル内への試薬の分配：
１）１ウェル当たり５０μｌのポリオルニチンを室温で３０分間インキュベートし、次に溶液を吸引により各ウェルから取り除いた。
２）ＨＥＫ２９３の標本５０μｌ（１ウェル当たり細胞５００００個の細胞密度）を各ウェルに添加した。
３）Ｇタンパク質をコードするプラスミド＋リポフェクタミンの混合物５０μｌを各ウェルに添加した。
マイクロプレートを３７℃および５％ＣＯ２（制御された保温器）で２４時間インキュベートした。
２日目：ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体の選択性を測定するためのＨＴＲＦアッセイ
すべての試薬をバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、０．０２％のトリトンＸ１００）中で希釈した。ウェル内最終濃度１０ｎＭとなるように、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２、ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２、およびＳＣ１３５３３－ｄ２の各抗体を４×で調製した。ウェル内最終濃度０．５ｎＭを得るために、抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体を４×で調製した。ウェル内最終濃度１０μＭを得るために、ヌクレオチドＧＤＰおよびＧＴＰｇＳを４×で調製した。
試薬を以下のように３８４ウェルプレートに分配した。
１）ＯｐｔｉＭＥＭ培養培地をアスピレートした。
２）バッファまたはＧＤＰまたはＧＴＰ２５μｌを各ウェルに添加した。
３）バッファ２５μｌを各ウェルに添加した。
４）ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２またはＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２またはＳＣ１３５３３－ｄ２または抗ＦＬＡＧ－ｄ２の各抗体２５μｌを各ウェルに添加した。
５）抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体２５μｌを各ウェルに添加した。
マイクロプレートを室温で２０時間インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルを読み取った。
反応スキームを図８Ａおよび図８Ｂにおいて例証する。
結果
図９および図１０は、この実験で得られた結果を示す。
抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ／抗ＦＬＡＧ－ｄ２の抗体対を使用することで、プラスミドによりコードされるＧタンパク質αが、いずれもＨＥＫ２９３において確かに過剰発現されたことを検証することができる。実際、各々を用いて得られたＨＴＲＦシグナルは、タグ化タンパク質ＦＬＡＧ＋Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇを一切コードしない対照プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に対応する陰性条件（「ＭＯＣＫ」）で得られたＨＴＲＦシグナルよりもかなり大きかった。
すべてのＧタンパク質αの過剰発現が確認されたので、従ってＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、およびＳＣ１３５３３の各抗体の選択性プロファイルは、ｄ２で標識したこれらの抗体と抗Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ－Ｌｕｍｉ４ Ｔｂ抗体との間で生じ得るＦＲＥＴを測定することにより決定することができた。抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓは、タンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚが過剰発現された場合に、陽性のＨＴＲＦシグナルを示したが、タンパク質Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１２、およびＧα１３が過剰発現された場合に、ＨＴＲＦシグナルを示さなかった。抗体ＳＣ１３５３３は、タンパク質Ｇαｉ１およびＧαｉ３が過剰発現された場合に、陽性のＨＴＲＦシグナルを示したが、タンパク質Ｇαｉ２、Ｇαｏ、Ｇαｚ、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１２、およびＧα１３が過剰発現された場合に、ＨＴＲＦシグナルを示さなかった。これらの結果から、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓは、Ｇタンパク質α上の同じエピトープを認識する（同一の選択性プロファイルを有し、競合的である）ことが確認される。このエピトープは、より少数のＧタンパク質αを認識する抗体ＳＣ１３５３３により認識されるエピトープとは異なる。
実施例７：ＧＰＣＲを過剰発現する膜標本において蛍光ＧＴＰ類似体と組み合わせた場合に抗体ＤＳＶ３６Ｓ、ＤＳＶ３８Ｓ、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３９Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＳＣ１３５３３がＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力
すべての試薬をバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、３００ｍＭのＮａＣｌ、および０．５μＭのＧＤＰ）中で希釈した。ウェル内最終量１０μｇとなるように、ＤＯＲ受容体を発現するＨＥＫ２９３膜を４×で調製した。ウェル内最終濃度１０ｎＭとなるように、ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２、ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２、ＳＣ１３５３３－ｄ２、および抗ＦＬＡＧ－ｄ２の各抗体を４×で調製した。ウェル内最終濃度６ｎＭを得るために、ユーロピウムクリプテートで標識したＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２を４×で調製した。ウェル内最終濃度５０ｎＭを得るために、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５を４×で調製した。ウェル内最終濃度１００μＭを得るために、ヌクレオチドＧＴＰｇＳおよびＧＤＰを４×で調製した。ウェル内最終濃度１０μＭを得るために、ＳＮＣ１６２を４×で調製した。
試薬を以下のように３８４ウェルプレート内に分配した。
１）ＤＯＲ膜５μｌを各ウェルに入れた。
２）ユーロピウムクリプテートで標識したＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２またはＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５を５μｌで各ウェルに添加した。
３）ｄ２で標識したＤＳＶ３６ＳもしくはＤＳＶ３８ＳもしくはＳＣ１３５３３もしくはＤＳＶ２６ＳもしくはＤＳＶ３ＳもしくはＤＳＶ３９Ｓ、またはテルビウムクリプテートで標識したＤＳＶ３６ＳもしくはＳＣ１３５３３抗体５μｌを各ウェルに添加した。
４）バッファまたはＳＮＣ１６２またはＧＴＰｇＳを５μｌで各ウェルに添加した。
プレートを室温で２０時間インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルを読み取った。
反応スキームを図８Ａにおいて例証する。
結果
図１１は、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートをＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２、ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２、およびＳＣ１３５３３－ｄ２の各抗体と組み合わせた場合に得た結果を示す。「ＧＴＰｇＳ」条件は、過剰量の未標識ＧＴＰｇＳ（１００μＭ）がＧタンパク質αにおけるＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートの結合を阻害し、従ってＦＲＥＴシグナルの出現を妨げたアッセイの非特異的シグナル（ＮＳ）を表す。「バッファ」条件は、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートとｄ２で標識した抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓとの間で中程度であるが顕著なＦＲＥＴシグナルを得ることが可能であることを示した。ＳＮＣ１６２を添加すると、膜内で過剰発現したＤＯＲ受容体の活性化が引き起こされ、抗体ＤＳＶ３６ＳおよびＤＳＶ３８Ｓにより認識されるタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚの一部または全部における蛍光ＧＴＰ類似体の結合の増加と関連して、このＦＲＥＴシグナルの増加が観察された。反対に、ＨＥＫ２９３細胞において内因的に発現されるタンパク質Ｇαｉ１およびＧαｉ３に結合するその能力にもかかわらず［２］、抗体ＳＣ１３５３３は、ＳＮＣ１６２の有無にかかわらず、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートと組み合わせた場合に、ＦＲＥＴシグナルを一切示さなかった。
同様に、図１２は、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテート類似体を、ＧＰＣＲを過剰発現する非活性化膜標本においてＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２、ＤＳＶ２６Ｓ－ｄ２、ＤＳＶ３９Ｓ－ｄ２、およびＤＳＶ３Ｓ－ｄ２の各抗体と組み合わせた場合に得た結果を示す。「非特異的シグナル」条件は、蛍光ＧＴＰ類似体とｄ２で標識した抗体との間で弱いベースラインＦＲＥＴシグナルが検出されることを示した。「陰性対照」条件は、過剰量の未標識ＧＴＰｇＳ（１００μＭ）がＧタンパク質αにおける蛍光ＧＴＰ類似体の結合を阻害し、従ってＦＲＥＴシグナルの出現を妨げたアッセイの非特異的シグナルを表す。測定された阻害は、「非特異的シグナル」条件および「陰性対照」条件について測定されたＨＴＲＦシグナルのレベルがほぼ同一であることから、合計であった。蛍光ＧＴＰ類似体および抗体を添加すると、抗体ＤＳＶ３６Ｓにより認識されるタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚの一部または全部におけるＧＴＰの蛍光類似体の結合の増加と関連したＦＲＥＴシグナルの増加が測定された。反対に、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧタンパク質αｉに結合するその能力にもかかわらず、ＤＳＶ２６Ｓ、ＤＳＶ３Ｓ、およびＤＳＶ３９Ｓの各抗体は、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２－ユーロピウムクリプテートと組み合わせた場合に、ＦＲＥＴシグナルを一切示さなかった。
図１３は、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５類似体を、ＧＰＣＲを過剰発現する非活性化膜標本においてＤＳＶ３６Ｓ－ＴｂおよびＳＣ１３５３３－Ｔｂの各抗体と組み合わせた場合に得た結果を示す。「非特異的シグナル」条件は、ＧＴＰの蛍光類似体と、テルビウムクリプテートで標識した抗体との間で弱いベースラインＦＲＥＴシグナルが検出されることを示した。「陰性対照」条件は、過剰量の未標識ＧＴＰｇＳ（１００μＭ）がＧタンパク質αにおける蛍光ＧＴＰ類似体の結合を阻害し、従ってＦＲＥＴシグナルの出現を妨げたアッセイの非特異的シグナルを表す。測定された阻害は、「非特異的シグナル」条件および「陰性対照」条件について測定されたＨＴＲＦシグナルのレベルがほぼ同一であることから、合計であった。蛍光ＧＴＰ類似体および抗体を添加すると、抗体ＤＳＶ３６Ｓにより認識されるタンパク質Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ、およびＧαｚの一部または全部における蛍光ＧＴＰ類似体の結合の増加と関連したＦＲＥＴシグナルの増加が測定された。反対に、ＨＥＫ２９３細胞において内因的に発現されるタンパク質Ｇαｉ１およびＧαｉ３に結合するその能力にもかかわらず［２］、抗体ｓｃ－１３５３３は、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）と組み合わせた場合に、ＦＲＥＴシグナルを一切示さなかった。
まとめると、これらの結果から、本発明による抗体のみがＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有したことが確認される。
実施例８：本発明による標識抗体を用いてＦＲＥＴを実施することによるＧＰＣＲの活性化の測定
材料
調査中の受容体およびＧタンパク質αｉを発現する細胞膜標本をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社またはＥｕｒｏｃｒｅｅｎ社からを購入した。下記表は、使用した各種のサンプルのベース細胞および参照番号をリスト化する。
Figure 2023511770000003
抗体ＤＳＶ３６Ｓを、ＴＲ－ＦＲＥＴ検出に適合する蛍光プローブで標識した（赤色受容体－ｄ２、または供与体Ｌｕｍｉ４Ｔｂ）。
ＧＴＰ、ＧＤＰ、およびＧＴＰγＳの各ヌクレオチドをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した（それぞれカタログ参照番号Ｇ８８７７、Ｇ７１２７およびＧ８６３４）。
デルタオピオイドＧＰＣＲのアゴニスト（ＳＮＣ１６２）およびドーパミンＤ２Ｓのアゴニスト（ＰＰＨＴ）、ならびにデルタオピオイドＧＰＣＲのアンタゴニスト（ナルトリンドール）をＴｏｃｒｉｓ社から購入した（それぞれカタログ参照番号１５２９および０７４０）。
白色底部を備えた３８４ウェル低容量白色プレートをＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ社から購入した（カタログ参照番号７８４０７５）。
供与体または受容体フルオロフォアで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体（ＧＴＰｇＮ－Ｃ２；ＧＴＰｇＮ－Ｃ３；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３；ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２；ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３；ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２；ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５；ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８）は、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社が合成した。
受容体フルオロフォアで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）およびＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）を、それぞれ参照番号ＮＵ－８３４－ＣＹ５およびＮＵ－１６１０－ＣＹ５としてＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
方法
試薬の調製
すべての試薬をバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭまたは１００ｍＭまたは３００ｍＭまたは５００ｍＭのＮａＣｌ（濃度は各図の凡例で特定される）、０または０．５または１μＭのＧＤＰ（濃度は各図の凡例で特定される））中で希釈した。１または１０μｇ／ウェル（量は各図の凡例で特定される）を分配するように、膜を４×で調製した。ウェル内最終濃度１００μＭを得るために、ヌクレオチドＧＴＰｇＳ（条件：非特異的シグナル）を６．６７×で調製した。図に記載されたウェル内最終濃度を取得するために、テスト化合物（アゴニストまたはアンタゴニスト）を１０×で調製した。以下のウェル内最終濃度：抗体ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（１０ｎＭ）；抗体ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（０．５または１ｎＭ）；抗体ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２（１０ｎＭ）となるように、検出に使用される抗Ｇαｉ抗体を４×で調製した。各図の凡例に記載されたウェル内最終濃度となるように、供与体または受容体蛍光プローブで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体を４×で調製した。
３８４ウェルプレート内への試薬の分配：
●ＧＰＣＲおよびＧタンパク質αｉを発現する膜：５μＬ
●バッファまたはヌクレオチドＧＴＰｇＳ（非特異的シグナル条件の場合）：３μＬ
●非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体－供与体または受容体：５μＬ
●抗Ｇαｉ抗体－供与体または受容体：５μＬ
●バッファまたはテスト化合物（アゴニストおよび／またはアンタゴニスト）：２μＬ。
非特異的シグナル（蛍光バックグラウンドノイズ）を、過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）を含むウェルを用いて測定した。
ＨＴＲＦシグナルの読み取り
プレートを２１℃で２０時間インキュベートし（図において別途規定されない限り）、次にＨＴＲＦシグナルを、ＰＨＥＲＡｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社）において下記構成で測定した。
●モジュール：ＨＴＲＦ（励起３３７ｎｍ、発光６６５ｎｍおよび６２０ｎｍ）
●励起：レーザーの場合４０フラッシュ、またはランプの場合１００フラッシュ
●読み取りウィンドウ：遅延：６０μｓ－積分：４００μｓ。
シグナルの処理
ＨＴＲＦ比を、６６５ｎｍ（赤色受容体－Ｃｙ５の場合）または５２０ｎｍ（緑色受容体－ＡＦ４８８またはフルオレセインの場合）および６２０ｎｍにおける生シグナルから、下記式に従って計算した。
ＨＴＲＦ比＝６６５ｎｍにおけるシグナルまたは５２０ｎｍにおけるシグナル／６２０ｎｍにおけるシグナル＊１０，０００
アッセイフォーマット
図１４Ａは、供与体ＲＥＴパートナーで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体、および受容体ＲＥＴパートナーで標識した抗Ｇタンパク質α抗体を使用するアッセイ原理（アゴニスト化合物によるＧＰＣＲの活性化が、Ｇタンパク質へのＧＴＰ類似体－供与体の結合の増加、従ってＲＥＴシグナルの増加を誘発する）について例証する（フォーマット２Ａ）。
図１４Ｂは、受容体ＲＥＴパートナーで標識した非加水分解性／徐加水分解性ＧＴＰ類似体、および供与体ＲＥＴパートナーで標識した抗Ｇタンパク質α抗体を使用するアッセイ原理（アゴニスト化合物によるＧＰＣＲの活性化が、Ｇタンパク質への受容体ＧＴＰ類似体の結合の増加、従ってＲＥＴシグナルの増加を誘発する）について例証する（フォーマット２Ｂ）。
デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）におけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイ：アゴニスト刺激下のＧＴＰ－供与体と抗Ｇ－タンパク質αｉ抗体－受容体との間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加
第１に、供与体ＧＴＰ／受容体抗Ｇαｉ抗体の対が、Ｇタンパク質に結合することにより特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧタンパク質αｉを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を使用して実証した。下記実験条件を使用した。
・図１５Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；５００ｍＭのＮａＣｌ；０．１％のＢＳＡ。
・図１６Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；３００ｍＭのＮａＣｌ；０．５μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。
・図１７Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３８Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；３００ｍＭのＮａＣｌ；０．５μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。
・図１８Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；３００ｍＭのＮａＣｌ；０．５μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。
・図１９Ａ：ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；３００ｍＭのＮａＣｌ；０．５μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。
・図２０Ａ：ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；３００ｍＭのＮａＣｌ；０．５μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら両条件間で観察されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差異は、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２の各類似体が、Ｇタンパク質αｉと結合し、受容体抗Ｇαｉ抗体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有することを示す（図１６Ａ～図２０Ａ）。
第２に、ＧＰＣＲのアゴニストが供与体ＧＴＰに結合したＧタンパク質αの割合を変化させる能力を、上記と同じ膜および実験条件を用いてテストした。アゴニストによる刺激により生成されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加は、供与体ＧＴＰに結合したＧタンパク質α形態の割合が増加する（すなわち、空型のＧタンパク質αが減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストにより活性化されたＧＰＣＲ受容体は、Ｇタンパク質への供与体ＧＴＰの結合をもたらし、そして供与体ＧＴＰ形態に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加をもたらす。これらの結果を、図１５Ｂ、図１６Ｂ、図１７Ｂ、図１８Ｂ、図１９Ｂ、および図２０Ｂに示す。また、図１６Ｂは、一定濃度のＧＰＣＲ ＳＮＣ１６２のアゴニスト（２００ｎＭ）による活性化が、ＧＰＣＲのアンタゴニスト（ナルトリンドール）の濃度を増加させることにより阻害される第２の条件を示す。この活性化の阻害は、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の減少から観察される。
ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲ（Ｄ２Ｓ）におけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイ：アゴニスト刺激下のＧＴＰ－供与体と抗Ｇタンパク質αｉ抗体－受容体との間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加
第１に、供与体ＧＴＰ／受容体抗Ｇαｉ抗体の対が、Ｇタンパク質に結合することにより特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を、ドーパミンＤ２Ｓ ＧＰＣＲおよびＧタンパク質αｉを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を使用して実証した。下記実験条件を使用した。
・図２１Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのＮａＣｌ；１μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。
・図２２Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１００ｍＭのＮａＣｌ；０．１％のＢＳＡ。
・図２３Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ウェル内最終６ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－Ｄ２Ｓ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１００ｍＭのＮａＣｌ；１μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら両条件間で観察されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差異は、類似体ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２が、Ｇタンパク質αｉと結合し、受容体抗Ｇαｉ抗体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有することを示す（図２１Ａ～図２３Ａ）。
第２に、ＧＰＣＲのアゴニストが供与体ＧＴＰに結合したＧタンパク質αの割合を変化させる能力を、上記と同じ膜および実験条件を用いてテストした。アゴニストによる刺激により生成されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加は、供与体ＧＴＰに結合したＧタンパク質α形態の割合が増加する（すなわち、空型のＧタンパク質αが減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストにより活性化されたＧＰＣＲ受容体は、Ｇタンパク質への供与体ＧＴＰの結合をもたらし、そして供与体ＧＴＰ形態に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加をもたらす。これらの結果を図２１Ｂ、図２２Ｂ、および図２３Ｂに示す。
デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）におけるフォーマット２Ｂによる活性化アッセイ：アゴニスト刺激下のＧＴＰ－受容体と抗Ｇタンパク質αｉ抗体－供与体との間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加
第１に、受容体ＧＴＰ／供与体抗Ｇαｉ抗体の対が、Ｇタンパク質に結合することにより特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧタンパク質αｉを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を使用して実証した。下記実験条件を使用した。
・図２４Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５（ウェル内最終５０ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（ウェル内最終１ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；３００ｍＭのＮａＣｌ；０．５μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。２１℃で３時間インキュベーションした後に読み取る。
・図２５Ａ：ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８（ウェル内最終５０ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（ウェル内最終１ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；３００ｍＭのＮａＣｌ；０．５μＭのＧＤＰ；０．１％のＢＳＡ。２１℃で３時間インキュベーションした後に読み取る。
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら両条件間で観察されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差異は、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５およびＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８の各類似体が、Ｇタンパク質αｉと結合し、供与体抗Ｇαｉ抗体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有することを示す（図２４Ａ～図２５Ａ）。
第２に、ＧＰＣＲのアゴニストが受容体ＧＴＰに結合したＧタンパク質αの割合を変化させる能力を、上記と同じ膜および実験条件を用いてテストした。アゴニストによる刺激により生成されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加は、受容体ＧＴＰに結合したＧタンパク質α形態の割合が増加する（すなわち、空型のＧタンパク質αが減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストにより活性化されたＧＰＣＲ受容体は、Ｇタンパク質への受容体ＧＴＰの結合をもたらし、そして受容体ＧＴＰ形態に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加をもたらす。これらの結果を図２４Ｂおよび図２５Ｂに示す。
デルタオピオイドＧＰＣＲ（ＤＯＲ）におけるフォーマット２Ａによる活性化アッセイ：アゴニスト刺激下のＧＴＰ－供与体と抗Ｇタンパク質αｉ抗体－受容体との間のＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加
第１に、供与体ＧＴＰ／受容体抗Ｇαｉ抗体の対が、Ｇタンパク質に結合することにより特異的ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を、デルタオピオイドＧＰＣＲおよびＧタンパク質αｉを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞膜標本を使用して実証した。下記実験条件を使用した。
・図２６Ａ：ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（ウェル内最終７．５ｎＭ）；ＤＳＶ３６Ｓ－ｄ２（ウェル内最終１０ｎＭ）；１０μｇのＣＨＯ－ＤＯＲ膜／ウェル；バッファ：５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）；６０ｍＭのＭｇＣｌ２；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．１％のＢＳＡ。
大過剰量のＧＴＰｇＳ（１００μＭ）の非存在下または存在下で膜をインキュベートした。これら両条件間で観察されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の差異は、類似体ＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２が、Ｇタンパク質αｉと結合し、受容体抗Ｇαｉ抗体と共にＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを生成する能力を有することを示す（図２６Ａ）。
第２に、ＧＰＣＲのアゴニストが供与体ＧＴＰに結合したＧタンパク質αの割合を変化させる能力を、上記と同じ膜および実験条件を用いてテストした。アゴニストによる刺激により生成されたＴＲ－ＦＲＥＴシグナル（ＨＴＲＦ比）の増加は、供与体ＧＴＰに結合したＧタンパク質α形態の割合が増加する（すなわち、空型のＧタンパク質αが減少する）ことを示す。従って、そのアゴニストにより活性化されたＧＰＣＲ受容体は、Ｇタンパク質への供与体ＧＴＰの結合をもたらし、そして供与体ＧＴＰ形態に変化し、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルの増加をもたらす。これらの結果を図２６Ｂに示す。
配列表
Figure 2023511770000004
引用した参考文献
［１］Ｄａｍｉｅｎ Ｍａｕｒｅｌ，Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｄｅｓ ｒｅｃｅｐｔｅｕｒｓ ｃｏｕｐｌｅｓ ａｕｘ ｐｒｏｔｅｉｎｅｓ Ｇ：ｄｅｕｘ ｏｕ ｐｌｕｓ？Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｄｅ ＦＲＥＴ ｅｎ ｔｅｍｐｓ ｒｅｓｏｌｕ ａｕ ｃａｓ ｄｕ ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ＧＡＢＡＢ．Ｂｉｏｌｏｇｉｅ ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ Ｉ，２００６．
［２］Ａｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，１２：１４

Claims (15)

  1. Ｇタンパク質αに結合する能力を有する抗体もしくは抗体断片であって、
    配列番号１のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列のＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインと、
    配列番号４のアミノ酸配列のＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳのＣＤＲ２、および配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインと
    を含む抗体もしくは抗体断片。
  2. 上記重鎖可変ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ１、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ２、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ３、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ４を含み、
    上記軽鎖可変ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ２、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ３、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するＦＲ４を含む、請求項１に記載の抗体もしくは抗体断片。
  3. 上記重鎖可変ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、
    上記軽鎖可変ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、
    上記重鎖可変ドメインのＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸配列からなり、上記重鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、配列番号２のアミノ酸配列からなり、上記重鎖可変ドメインのＣＤＲ３が、配列番号３のアミノ酸配列からなり、上記軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１が、配列番号４のアミノ酸配列からなり、上記軽鎖可変ドメインのＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＤＴＳからなり、上記軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３が、配列番号５のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の抗体もしくは抗体断片。
  4. 上記重鎖可変ドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列からなり、上記軽鎖可変ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列からなる、請求項１または３に記載の抗体もしくは抗体断片。
  5. Ｇタンパク質αへの結合について、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片と競合する抗体もしくは抗体断片。
  6. 上記抗体もしくは抗体断片がＲＥＴパートナー対のメンバーで標識される、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片。
  7. 上記ＲＥＴパートナー対のメンバーが、（ｉ）蛍光供与体化合物もしくは発光供与体化合物、または（ｉｉ）蛍光受容体化合物もしくは非蛍光受容体化合物（クエンチャー）である、請求項６に記載の抗体もしくは抗体断片。
  8. 上記ＲＥＴパートナー対のメンバーが、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロン－ジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾール、および量子ドット、ＧＦＰ、ＧＦＰ１０、ＧＦＰ２、およびｅＧＦＰから選択されるＧＦＰ変異体、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＹＦＰ ｔｏｐａｚ、ＹＦＰ ｃｉｔｒｉｎｅ、ＹＦＰ ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔから選択されるＹＦＰ変異体、ｍＯｒａｎｇｅ、およびＤｓＲｅｄから選択される蛍光受容体化合物であるか、または
    上記ＲＥＴパートナー対のメンバーが、ユーロピウムクリプテート、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、量子ドット、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロン－ジピロメテン誘導体、およびニトロベンゾオキサジアゾールから選択される蛍光供与体化合物であるか、または
    上記ＲＥＴパートナー対のメンバーが、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体（Ｒｌｕｃ８）、およびホタルルシフェラーゼから選択される発光供与体化合物である、請求項６または７に記載の抗体もしくは抗体断片。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片を含む組成物。
  10. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片をコードする核酸配列。
  11. 請求項１０に記載の核酸配列を含むベクター。
  12. 請求項１１に記載のベクター、または請求項１０に記載の核酸配列を含む細胞。
  13. （ｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項９に記載の組成物と、（ｉｉ）ＲＥＴパートナー対のメンバーで標識したＧＴＰ源とを含むパーツキット。
  14. 上記ＧＴＰが、非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰ、例えばＧＴＰガンマＳ（ＧＴＰγＳまたはＧＴＰｇＳ）、ＧｐｐＮＨｐ、およびＧｐｐＣｐ等である、請求項１３に記載のパーツキット、または請求項９に記載の組成物。
  15. 上記標識したＧＴＰが、
    例えば、ＧＴＰｇＮ－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｎ－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－Ｃ３（ＧＴＰ－γ－Ｎ－Ｃ３）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ１１（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－Ｃ１１）、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃ３（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－Ｃ３）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ２）、ＧＴＰｇＯ－ヘキシル－Ｃ３（ＧＴＰ－γ－Ｏ－ヘキシル－Ｃ３）、もしくはＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２（ＧＴＰ－γ－Ｎ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２）、好ましくはＧＴＰ－ｇＮ－オクチル－チオスクシンイミジル－Ｃ２、から選択される蛍光供与体化合物、または
    例えば、ＧＴＰｇＮ－オクチル－Ｃｙ５、ＧＴＰｇＮ－オクチル－ＡＦ４８８、ＧＴＰｇＮ－Ｌ１５－フルオレセイン、ＧＴＰｇＯ－リンカー－Ｃｙ５（Ｐ）、もしくはＧＴＰｇＳ－リンカー－Ｃｙ５（Ｒ）から選択される蛍光受容体化合物、または非蛍光受容体化合物（クエンチャー）
    で標識した非加水分解性もしくは徐加水分解性ＧＴＰである、請求項１３もしくは１４に記載のパーツキット、または請求項９に記載の組成物。
JP2022546606A 2020-01-30 2021-01-29 抗Ｇタンパク質α抗体 Pending JP2023511770A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR2000923 2020-01-30
FR2000923A FR3106830B1 (fr) 2020-01-30 2020-01-30 Anticorps anti-protéine G alpha
PCT/FR2021/050164 WO2021152266A1 (fr) 2020-01-30 2021-01-29 Anticorps anti-proteine g alpha

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023511770A true JP2023511770A (ja) 2023-03-22

Family

ID=70918550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022546606A Pending JP2023511770A (ja) 2020-01-30 2021-01-29 抗Ｇタンパク質α抗体

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230091315A1 (ja)
EP (1) EP4097133A1 (ja)
JP (1) JP2023511770A (ja)
CN (1) CN115397858A (ja)
CA (1) CA3166591A1 (ja)
FR (1) FR3106830B1 (ja)
WO (1) WO2021152266A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3069644A1 (fr) * 2017-07-28 2019-02-01 Cisbio Bioassays Methode pour mesurer la modulation de l'activation d'un recepteur couple a une proteine g

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4282882A3 (en) 2011-06-21 2024-03-06 Vib Vzw Binding domains directed against gpcr:g protein complexes and uses derived thereof
CN105378476B (zh) * 2013-06-17 2019-05-10 圣-贾斯汀大学中心医院 检测Gi蛋白磷酸化的配体在制备检测脊柱侧凸和脊柱侧凸进展的试剂盒中的用途
FR3069644A1 (fr) * 2017-07-28 2019-02-01 Cisbio Bioassays Methode pour mesurer la modulation de l'activation d'un recepteur couple a une proteine g

Also Published As

Publication number Publication date
FR3106830B1 (fr) 2022-02-11
FR3106830A1 (fr) 2021-08-06
CN115397858A (zh) 2022-11-25
WO2021152266A1 (fr) 2021-08-05
US20230091315A1 (en) 2023-03-23
CA3166591A1 (fr) 2021-08-05
EP4097133A1 (fr) 2022-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Evans et al. Visualizing differences in ligand‐induced β‐arrestin–GFP interactions and trafficking between three recently characterized G protein‐coupled receptors
JP6654580B2 (ja) Ｔｓｈ受容体に対する自己抗体の検出
JP6371703B2 (ja) 抗体のグリコシル化の測定方法
US20230032690A1 (en) New tau species
CN111164427B (zh) 用于测量对g蛋白偶联受体活性的调控的方法
US20220099669A1 (en) Method for measuring the modulation of the activation of a g protein-coupled receptor with gtp analogues
JP6251252B2 (ja) アッセイ
JP2023511770A (ja) 抗Ｇタンパク質α抗体
JP4683572B2 (ja) 組換え蛋白質の定量法
CN112739719B (zh) 结合G蛋白α的单域抗体
US9528994B2 (en) Target of the phosphoinositide 3-kinase pathway
WO2006095654A1 (ja) レポータ遺伝子アッセイ法
JP7498720B2 (ja) Ｇｔｐ類似体を用いてｇタンパク質共役受容体の活性化の変化を測定する方法
KR102644096B1 (ko) 대칭적으로 디메틸화된 아르기닌 분석물에 대한 항체 및 그의 용도
US20110165592A1 (en) Antibodies against human epo receptor
EP2329268B1 (en) Methods and compounds for testing binding of a ligand to a g protein-coupled receptor
WO2021093787A1 (zh) 一种基于荧光素酶互补的生物传感器及其制备方法和应用
WO2023073205A1 (en) Antibodies targeting phosphorylated seven-transmembrane receptors
US20230314450A1 (en) METHOD FOR DETECTING A ß-SHEET AGGREGATE FORM OF A PROTEIN FORMING ß-SHEET AGGREGATES
US20070141665A1 (en) Chimeric protein for the screening of agonists and antagonists of cell signalling pathways that are dependent on g-protein-coupled receptors
Lam Development and Validation of a Novel Quantitative Assay for Cell Surface expression of GPCRs using a Receptor beta-lactamase Fusion Protein and the Colourometric Substrate Nitrocefin

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231207