CN112739719B - 结合G蛋白α的单域抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合G蛋白α的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由具有下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4(I)，并且有利地具有小于100nM的解离常数(Kd)(用FRET测量)。

Description

结合G蛋白α的单域抗体
技术领域
本发明涉及抗体领域，尤其涉及结合G蛋白α的单域抗体(sdAb)领域。根据本发明的sdAb特别适用于在FRET中使用，例如以与能够对其进行检测的分子偶联的重链抗体(HcAb)的形式。
背景技术
“G蛋白偶联受体”或“GPCR”是哺乳动物中最具代表性的膜受体。它们是与各种生理过程(例如视觉，嗅觉，多种神经肽、激素的作用的介导等)相关的多种多样细胞反应的开端。它们可被性质非常多样的配体(例如，如光子、离子、嗅觉分子、味觉分子、氨基酸、核酸、脂质、外源性分子(例如大麻素类)、趋化因子或激素)激活。
这些受体具有七个处于α-螺旋形式的跨膜区域，各自包含22至24个氨基酸。在人中，GPCR可分为5个主要家族，称为视紫红质、黏附、分泌素、谷氨酸、Frizzled/Taste 2(Fredriksson等，2003)。相对于基础构象状态，GPCR根据配体激活水平来改变其功能构象状态。当通过特异性配体的结合激活GPCR时，激动剂-受体复合物构象的改变使得异源三聚体G蛋白得以激活。
G蛋白是异源三聚体蛋白，其通过启动生化反应级联来转导来自GPCR的激活信号，其目的是将信号从细胞外部转导至细胞内部。G蛋白位于质膜的内表面，由三个亚基(α、β、γ)形成。α亚基能够结合鸟嘌呤核苷酸，GDP或GTP。
所述的GPCR和G蛋白的一般作用机理示于图1中，并总结如下：
-在其非活化的静止状态中，G蛋白的α亚基与GDP核苷酸结合(与GDP结合的全G蛋白(full G protein))；
-GPCR活化后，GPCR与G蛋白的α亚基结合并触发G蛋白的激活过程，包括两个步骤：1)GDP从G蛋白释放产生空G蛋白(empty G protein)，并形成非活化的GPCR/空G蛋白复合体；以及2)GTP附着，从而导致形成活化的G蛋白(呈GTP形式，与GTP结合的全G蛋白)。在第一步中，与受体结合的G蛋白处于所谓的“空形式”。该状态在文献中被描述为暂时的，因为据描述GTP核苷酸迅速结合至G蛋白的α亚基。另外，活化的G蛋白的β/γ亚基与α亚基解离。
-与GTP结合的全G蛋白的α亚基随后结合至效应物以激活它们。效应物转而激活信号传导通路，从而引起细胞反应。
-然后，GTP被G蛋白的α亚基水解为GDP，并且该α亚基与β/γ亚基重新结合，以重新形成与GDP结合的全G蛋白(非活化状态)。
至少有17种不同的α亚基：Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo1、Gαo2、Gαq、Gα12、Gα13、Gαs、Gαz、Gαt1、Gαt2、Gα11、Gα14、Gα15、Gα16或Gαgus。
考虑到GPCR参与许多信号传导通路，现有技术中已经开发了用于研究其活性的工具，其目的通常是为这些具有潜在治疗活性的受体鉴别新的配体。以这些工具为例，可以提及使用GTP的不可水解或缓慢水解的放射性衍生物，特别是GTP-γ-S，其在受体被激活时结合至G蛋白α。也有基于酶活性测定的重组系统(例如荧光素酶)，其表达受受体活化产生的第二信使控制。还合成了抗体来检测GPCR在细胞表面水平的激活(Damien Maurel.Oligomérisation des récepteurs couplés aux protéines G:deux ou plus？Application destechnologies de FRET en temps résolu au cas du récepteur GABAB.Biologiecellulaire.UniversitéMontpellier I,2006，法国)。还可以参考专利EP2723764 B1，该专利提出了纳米抗体，该纳米抗体结合至G蛋白α和G蛋白β/γ之间的界面，从而使得能够稳定GPCR/G蛋白复合体。
然而，没有一种现有技术的工具能够特异性地检测G蛋白的α亚基，更不用说结合G蛋白α的sdAb，特别是在FRET中使用的sdAb。因此，本发明有利地提出了单域抗体(sdAb)，例如结合G蛋白α(G蛋白α)的重链抗体(HcAb)。
发明内容
本发明涉及结合G蛋白α的单域抗体(sdAb)。
本发明的第一主题涉及结合G蛋白α的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
所述抗体关于全G蛋白α具有小于100nM的解离常数(Kd)(在FRET中测量)。
本发明的第二主题涉及结合G蛋白α的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
其中：
-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQ ID NO：1、SEQID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQID NO：57和SEQ ID NO：65；
-CDR2与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQ ID NO：2、SEQID NO：10、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：50、SEQID NO：58和SEQ ID NO：66；以及
-CDR3与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQ ID NO：3、SEQID NO：11、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：51、SEQID NO：59和SEQ ID NO：67。
本发明的第三主题涉及编码根据本发明的单域抗体(sdAb)的核酸序列。
本发明的第四主题涉及包含根据本发明的核酸序列的重组载体。
本发明的第五主题涉及包含根据本发明的载体或根据本发明的核酸序列的细胞。
除非另有说明，术语“根据本发明的抗体”、“本发明的抗体”、“根据本发明的sdAb”或“本发明的sdAb”既指本发明的第一主题，又指本发明的第二主题。
下面更精确地描述本发明的主题。
附图说明
图1：代表了GPCR的激活机制和G蛋白α激活的不同阶段，即非活化形式(与GDP结合的G蛋白α)和活化形式(与GTP结合的G蛋白α)。
图2：图3-图11中实施的用于确定重链可变结构域(VH)的亲和力(Kd)的HTRF(TR-FRET)测定原理。
图3：通过TR-FRET测定确定VH F9的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于VH F9/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为32nM。
图4：通过TR-FRET测定确定VH F11的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于VH F11/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为3nM。
图5：通过TR-FRET测定确定VH B11的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于VH B11/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为1nM。
图6：通过TR-FRET测定确定VH F4的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于VH F4/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为31nM。
图7：通过TR-FRET测定确定VH G6的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于VH G6/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为95nM。
图8：通过TR-FRET测定确定VH A10的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GDP(10μM)。对于VH A10/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为15nM。
图9：通过TR-FRET测定确定VH G7的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GDP(10μM)。对于VH G7/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为31nM。
图10：通过TR-FRET测定确定VH F2的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GDP(10μM)。对于VH F2/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为14nM。
图11：通过TR-FRET测定确定VH E2的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GDP(10μM)。对于VH E2/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为72nM。
图12：图13至图16实施的用于确定VH型HcAb(VH HcAb)的亲和力(Kd)的TR-FRET(HTRF)测定原理。
图13：通过TR-FRET测定确定HcAb-B11的亲和力(Kd)。使用图12中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于HcAb-B11/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为1nM。
图14：通过TR-FRET测定确定HcAb-F9的亲和力(Kd)。使用图12中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于HcAb-F9/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为3nM。
图15：通过TR-FRET测定确定HcAb-G7的亲和力(Kd)。使用图12中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GDP(10μM)。对于HcAb-G7/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为5nM。
图16：通过TR-FRET测定确定HcAb-A10的亲和力(Kd)。使用图12中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GDP(10μM)。对于HcAb-A10/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为3nM。
图17：根据本发明的sdAb抗体的各种可能形式的图表。
具体实施方式
本申请人开发了单域抗体(sdAb)，该单域抗体结合G蛋白α，对于全G蛋白α具有良好的亲和力。这些sdAb作为治疗试剂、作为诊断试剂和/或作为G蛋白α检测试剂而构成了特别强有力的工具，特别是作为FRET型方法中的G蛋白α检测试剂。
定义
术语“抗G蛋白α抗体”、“结合G蛋白α的抗体”和“特异性结合G蛋白α的抗体”可互换，并表示以足够的亲和力与G蛋白α结合的抗体，通过靶向G蛋白α，该抗体可用作检测试剂(例如用于进行FRET测定)、诊断试剂和/或治疗试剂。
“抗体”应理解为是指由免疫球蛋白基因编码并且能够结合抗原的多肽。术语“抗体”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包括具有所需抗原结合活性的各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。“常规”抗体为四聚体形式(例如人中的G型免疫球蛋白(IgG)就是这种情况)，包含两对被称为轻链的相同多肽链和两条被称为重链的相同多肽链。可变结构域位于每条链的N-末端(对于重链为“VH”，对于轻链为“VL”)，并且两个可变结构域VH和VL能够识别抗原。每个可变结构域通常包含4个“铰链区”(称为FR1、FR2、FR3和FR4)和直接负责与抗原结合的3个区域，称为“CDR”(称为CDR1、CDR2和CDR3)。通常，每个可变结构域具有以下形式：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。通常，与抗原的结合通过成对的两个可变结构域(即轻链可变结构域VL和重链可变结构域VH)完成(例如人的IgG就是这种情况)，也就是说6个CDR参与一个抗原结合位点的形成。
相反，对于单域抗体，只有3个CDR参与抗原结合位点的形成。因此，单域抗体的抗原结合位点由3个CDR形成。因此，术语“单域抗体”和“sdAb”可互换，并且是指其中通过单个可变结构域完成与抗原结合的抗体。sdAb可为：i)包含重链可变结构域(VH)或其片段的能够结合抗原的抗体或者由重链可变结构域(VH)或其片段组成的能够结合抗原的抗体，其独立于任何其它可变结构域而与抗原结合；ii)包含轻链可变结构域(VL)或其片段的能够结合抗原的抗体或由轻链可变结构域(VL)或其片段组成的能够结合抗原的抗体，其独立于任何其它可变结构域而与抗原结合；或iii)包含VHH型重链可变结构域(VHH)或其片段的能够结合抗原的抗体或者由VHH型重链可变结构域(VHH)或其片段组成的能够结合抗原的抗体，其独立于任何其它可变结构域而与抗原结合。
“VH型重链抗体”或“VH HcAb”应理解为意指由两条重链组成的抗体，每条重链均包含VH型可变结构域。特别是，每条重链由CH2和CH3片段以及所述VH型可变结构域组成。
“VHH型重链抗体”或“VHH HcAb”应理解为意指由两条重链组成的抗体，每条重链均包含VHH型可变结构域。特别是，每条重链由CH2和CH3片段以及所述VHH型可变结构域组成。
对于本发明的目的，术语“全G蛋白α”或“完全形式的G蛋白α”表示与GTP、GDP或与其类似物(例如不可水解或缓慢水解的GTP)结合的G蛋白α。因此，这些术语表示与GDP或GDP类似物结合的G蛋白α(“与GDP结合的G蛋白α”)或者与GTP或GTP类似物(例如不可水解或缓慢水解的GTP)结合的G蛋白α(“与GTP结合的G蛋白α”)。全G蛋白α(与GDP结合的G蛋白α或与GTP结合的G蛋白α)在图1中描述。
术语“GDP”表示鸟苷二磷酸。
术语“GTP”表示鸟苷三磷酸。
术语“不可水解或缓慢水解的GTP”是指不水解或仅略微水解为GDP的GTP类似物。例如，可以提及GTPγS(也以首字母缩写为“GTPgS”和“GTPγS”)(CAS号37589-80-3)、GppNHp(CAS号148892-91-5)或GppCp(CAS号10470-57-2)。
对于本发明的目的，术语“空G蛋白α”或“空形式的G蛋白α”表示未与GTP或GDP结合的G蛋白α。空G蛋白α在文献中被描述为与GDP结合的G蛋白α和与GTP结合的G蛋白α之间的过渡状态。空G蛋白α在图1中描述。
术语“亲和力”是指分子(例如sdAb)与其伴侣(例如诸如全G蛋白α之类的抗原)之间的所有非共价相互作用的力。亲和力通常由解离常数(Kd)表示。解离常数(Kd)可通过公知的方法(例如通过FRET或SPR)进行测量。
术语“FRET”(“荧光共振能量转移”)表示两个荧光分子之间的能量转移。FRET被定义为由能量供体和能量受体之间的偶极-偶极相互作用产生的能量的非辐射转移。这种物理现象要求这些分子之间具有能量相容性。这意味着供体的发射谱必须至少部分地与受体的吸收谱重叠。根据的理论，FRET是取决于两个分子(供体和受体)之间距离的过程：当这些分子彼此靠近时，将发出FRET信号。例如，在本发明的上下文中，如实施例中所述，解离常数(Kd)通过FRET测量。
对于本发明的目的，通过比较在比较窗口中比对的两个序列来计算“同源性”。序列的比对使得能够确定比较窗口中两个序列共有的位置(核苷酸或氨基酸)的数目。然后，将共有位置的数目除以比较窗口中的位置总数，然后乘以100，以获得同源性百分比。序列同源性百分比的确定可手动进行或使用众所周知的计算机程序进行。
涉及根据本发明的抗体的“纯化的”和“分离的”应理解为是指该抗体在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的情况下存在。如本文所用，术语“纯化的”是指相对于所有存在的大分子，所述抗体优选为至少75wt％、更优选为至少85wt％、还更优选为至少95wt％、最优选为至少98wt％。
sdAb抗体
本发明的第一主题涉及结合G蛋白α的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个互补决定区“CDR”(CDR1至CDR3)和4个铰链区“FR”(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
如在FRET中测量的，所述单域抗体关于全G蛋白α的解离常数(Kd)小于100nM。
根据第一主题，sdAb以FRET中测量的小于100nM的解离常数(Kd)与全G蛋白α(与GTP或其类似物之一结合的G蛋白α或者与GDP或其类似物之一结合的G蛋白α)结合，例如亲和常数小于75nM、小于50nM、小于25nM或小于10nM(例如在1nM和10nM之间、在10nM和100nM之间、在10nM和75nM之间或者在10nM和50nM之间)。
根据第一主题，可通过对骆驼科动物进行免疫来获得sdAb，其包括单独或与佐剂(例如铝盐、弗氏佐剂或矿物油)组合给予全G蛋白α。可以以10μg到10mg之间的剂量通过皮下、静脉内、肌内或腹膜内途径(优选通过皮下途径)进行给予。所述给予可重复数次，每次给予可以间隔一天或数天以获得最佳的免疫应答。然后可通过本领域技术人员已知的常规纯化技术从外周血单个核细胞中回收产生的抗体，例如通过对编码该抗体的mRNA进行逆转录(RT-PCR)以获得cDNA，然后将其克隆在载体中，随后使用固定在ELISA板上的全G蛋白α通过“噬菌体展示文库”进行选择。
特别是，可通过实施实施例1中描述的方案来获得根据本发明的抗体。
在本发明的第一主题的特定实施方式中：
-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性、优选至少90％的同源性(例如，至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：65；
-CDR2与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性、优选至少90％的同源性(例如，至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：66；以及
-CDR3与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性、优选至少90％的同源性(例如，至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：67。
CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列可容易地彼此组合以符合式(I)。本领域技术人员知道如何毫不费力地确定这些序列可进行组合的程度，以获得具有所需解离常数(Kd)的本发明的sdAb。
本发明的第二主题涉及结合G蛋白α的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
其中：
-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性、优选至少90％的同源性(例如，至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：65；
-CDR2与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性、优选至少90％的同源性(例如，至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：66；以及
-CDR3与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性、优选至少90％的同源性(例如，至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：67。
G蛋白α可为人或动物来源的。有利地，根据本发明的sdAb结合Gαi蛋白(Gαi)，例如Gαi1蛋白、Gαi2蛋白或Gαi3蛋白。人来源的Gαi1蛋白带有同种型1的UniProt标识符P63096-1和同种型2的UniProt标识符P63096-2。编码人来源的Gαi1蛋白的基因被称为“GNAI1”(基因ID：2770，NCBI)。
根据本发明的sdAb可以以不同的形式存在。例如，其可为重链可变结构域(VH)、VHH型重链可变结构域(VHH)、VH型重链抗体(VH HcAb)、VHH型重链抗体(VHH HcAb)、软骨鱼类来源的抗免疫球蛋白新抗原受体IgG重链抗体(Ig NAR)或Ig NAR可变结构域(V-NAR)。本发明的抗体结构的实例在图17中给出。
在根据本发明的抗体的优选实施方式中：
-CDR1与SEQ ID NO：1具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：2具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：3具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-CDR1与SEQ ID NO：9具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：10具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：11具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-CDR1与SEQ ID NO：17具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：18具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：19具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-CDR1与SEQ ID NO：25具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：26具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：27具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQ ID NO：33具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：34具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：35具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-CDR1与SEQ ID NO：41具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：42具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：43具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-CDR1与SEQ ID NO：49具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：50具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：51具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-CDR1与SEQ ID NO：57具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：58具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：59具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；或者
-CDR1与SEQ ID NO：65具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；CDR2与SEQID NO：66具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；并且CDR3与SEQ ID NO：67具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；。
在根据本发明的抗体的优选实施方式中：
-FR1与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：68；
-FR2与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：45、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：69；以及
-FR3与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：70；以及
-FR4与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：71。
有利地，在根据本发明的抗体的优选实施方式中：
-FR1与SEQ ID NO：5具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：6具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：7具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：8具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-FR1与SEQ ID NO：12具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：13具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：14具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：15具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-FR1与SEQ ID NO：20具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：21具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：22具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：23具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-FR1与SEQ ID NO：28具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：29具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：30具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：31具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-FR1与SEQ ID NO：36具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：37具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：38具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：39具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-FR1与SEQ ID NO：44具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：45具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：46具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：47具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-FR1与SEQ ID NO：52具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：53具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：54具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：55具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；
-FR1与SEQ ID NO：60具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：61具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：62具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：63具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；或者
-FR1与SEQ ID NO：68具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR2与SEQID NO：69具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；FR3与SEQ ID NO：70具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性；以及，FR4与SEQ ID NO：71具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性，例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性。
在根据本发明的抗体的特别优选的实施方式中，式(I)的氨基酸序列与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：56、SEQ IDNO：64和SEQ ID NO：72。
根据本发明的抗体可与分离形式的和/或存在于膜环境中的G蛋白α结合，例如，其可与存在于携带一种或多种GPCR以及一种或多种G蛋白α的膜的制剂中的G蛋白α结合。
考虑到根据本发明的抗体与蛋白结合，为了根据本发明的抗体能够结合G蛋白，G蛋白α不必与GPCR复合。
在第一特定实施方式中，与空G蛋白α相比，根据本发明的抗体对全G蛋白α具有更好的亲和力，特别是对与GTPγS结合的G蛋白α具有更好的亲和力。因此，对于本发明的抗体，在FRET中测量的“空G蛋白α的Kd/全G蛋白α的Kd”的比至少等于2，例如至少等于2.5、至少等于5或至少等于10，并且：
-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列中的一个具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33；
-CDR2与如下氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：34；以及
-CDR3与如下氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：35。
在第二特定实施方式中，与全G蛋白α相比，根据本发明的抗体对空G蛋白α具有更好的亲和力。因此，对于本发明的抗体，在FRET中测量的“全G蛋白α的Kd/空G蛋白α的Kd”的比至少等于5，例如至少等于10、至少等于20、或者至少等于50，并且：
-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列中的一个具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：65；
-CDR2与如下氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ IDNO：42、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66；以及
-CDR3与如下氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选至少90％的同源性(例如至少95％的同源性、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％的同源性)：SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：67。
根据本发明的抗体在进行FRET测定中特别有利，特别是用于检测全G蛋白α或空G蛋白α。
因此，根据本发明的抗体可与能够被检测的分子偶联。可为肽标签，例如6XHis标签。当存在其底物时，也可为能够产生信号的酶(例如β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，所述信号可通过比色法、荧光或发光进行检测。其也可为放射性核素、荧光化合物、发光化合物或染料。有利地，根据本发明的抗体与FRET伴侣对的成员偶联。
FRET伴侣对
FRET伴侣对优选由能量供体荧光化合物和能量受体荧光化合物组成。
FRET被定义为由能量供体和能量受体之间的偶极-偶极相互作用产生的能量的非辐射转移。这种物理现象要求这些分子之间具有能量相容性。这意味着供体的发射谱必须至少部分地与受体的吸收谱重叠。根据的理论，FRET是取决于两个分子(供体和受体)分隔的距离的过程：当这些分子彼此靠近，并且供体化合物在对应于其吸收峰之一的波长处激发时，将存在能量的转移，导致在供体的发射波长处发射的发光减少，而在受体的发射波长处发射的发光增加。
选择供体/受体荧光团对以获得FRET信号在本领域技术人员的能力范围内。在Joseph R.Lakowicz的著作(Principles of fluorescence spectroscopy，第二版，KluwerAcademic/Plenum Publishers，NY(1999))中特别描述了可用于研究FRET现象的供体-受体对，本领域技术人员将能够参考所述著作。
具有长寿命(＞0.1ms，优选在0.5ms-6ms范围内)的能量供体荧光化合物、特别是稀土螯合物(chelates)或穴状化合物(cryptates)是有利的，因为它们使得可以进行时间分辨的测量(即测量TR-FRET信号)，同时排除测量介质发出的自发荧光现象。由于这个原因并且通常，它们对于实施根据本发明的方法是优选的。
镝(Dy3+)、钐(Sm3+)、钕(Nd3+)、镱(Yb3+)或铒(Er3+)的配合物也是适用于本发明目的的稀土配合物，但铕(Eu3+)和铽(Tb3+)的螯合物和穴状化合物是特别优选的。
已描述了大量稀土配合物，并且许多稀土配合物目前由PerkinElmer、Invitrogen和Cisbio Bioassays公司出售。
适用于本发明目的的稀土螯合物或穴状化合物的实例为：
·包含一个或多个吡啶单元的镧系元素穴状化合物。此类稀土穴状化合物描述于例如专利EP 0 180 492、EP 0 321 353、EP 0 601 113以及国际申请WO 01/96 877中。铽(Tb3+)穴状化合物和铕(Eu3+)穴状化合物特别适用于本发明的目的。镧系元素穴状化合物由Cisbio Bioassays公司销售。作为非限制性实例，可提及下式的铕穴状化合物(其可通过反应基团与待标记的化合物偶联，在此处反应基团例如为NH2基团)：
·镧系元素螯合物，其特别描述于专利US 4 761 481、US 5 032 677、US 5 055578、US 5 106 957、US 5 116 989、US 4 761 481、US 4 801 722、US 4 794 191、US 4 637988、US 4 670 572、US 4 837 169和US 4 859 777中。专利EP 0 403 593、US 5 324 825、US 5 202 423和US 5 316 909描述了由九齿(nonadentate)配体(例如三联吡啶)组成的螯合物。镧系元素螯合物由PerkinElmer公司销售。
·也可使用由螯合剂(如四氮杂环十二烷)组成的镧系元素配合物，所述配合物被包含芳环的发色团取代，如Poole R.等在Biomol.Chem，2005，3，1013-1024“Synthesis andcharacterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanidecomplexes suitable for usage in cellulo”中所述的配合物。还可使用在申请WO 2009/010580中描述的配合物。
·还可使用专利EP 1 154 991和EP 1 154 990中描述的镧系元素穴状化合物。
·下式的铽穴状化合物(其可通过反应基团与待标记的化合物偶联，在此处反应基团例如为NH2基团)：
其合成描述于国际申请WO 2008/063721中(第89页的化合物6a)。
·来自于Lumiphore公司的铽穴状化合物Lumi4-Tb，由Cisbio Bioassays销售。
·具有下式的来自Research Organics公司的的量子染料(其可通过反应基团与待标记的化合物偶联，在此处反应基团为NCS基团)：
·钌螯合物，特别是由钌离子和若干个联吡啶组成的配合物，例如三(2,2'-联吡啶)钌(II)。
·具有下式的铽螯合物DTPA-cs124 Tb，由Life Technologies公司销售(其可通过反应基团R与待标记的化合物偶联)，其合成在美国专利US 5 622 821中进行了描述。
·下式的铽螯合物，其由Latva等描述(Journal of Luminescence 1997，75：149-169)：
特别有利的是，荧光供体化合物选自：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物、以及量子染料；并且特别优选铕螯合物和铕穴状化合物以及铽螯合物和铽穴状化合物。
荧光受体化合物必须具有与供体的发射谱重叠的吸收谱(Mathis G，Clin.Chem.1993，39(9)：1953-1959)，并且可选自以下组：别藻蓝蛋白，特别是以商品名XL665已知的别藻蓝蛋白；发光有机分子，例如罗丹明、花青素(例如Cy5)、方酸菁(squaraines)、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物(以名称“Bodipy”销售)、被称为“Atto”的荧光团、被称为“DY”的荧光团、被称为“Alexa”的化合物、硝基苯并噁二唑。有利地，荧光受体化合物选自别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物、硝基苯并噁二唑。
表述“花青素”和“罗丹明”应分别理解为指“花青素衍生物”和“罗丹明衍生物”。本领域技术人员知晓可商购的这些各种荧光团。
“Alexa”化合物由Invitrogen公司出售；“Atto”化合物由Atto-tec公司出售；“DY”化合物由Dyomics公司出售；“Cy”化合物由Amersham Biosciences公司出售；其它化合物由多个化学试剂供应商(例如Sigma、Aldrich或Acros公司)出售。
为了本发明的目的，优选花青素或荧光素的衍生物作为荧光受体化合物。
用能量受体或供体化合物标记抗体
可直接(共价)或间接地用荧光团标记根据本发明的抗体。优选地，FRET伴侣中的至少一个与第一抗体或第二抗体共价键合，甚至更优选地，两个FRET伴侣分别与第一抗体和第二抗体共价键合。
用荧光供体或受体化合物直接标记根据本发明的抗体通过涉及使用反应基团的常规缀合技术进行。荧光供体或受体化合物通常以“官能化”形式出售，也就是说，它们带有能够与存在于待标记化合物(在这种情况下为根据本发明的抗体)上的官能团反应的反应基团。
通常，存在于荧光供体或受体化合物上的反应基团是亲电子基团或亲核基团，当将其分别放置于存在适当的亲核基团或亲电子基团的的情况中时，它们可以形成共价键。举例来说，下面列出了亲电子/亲核基团对以及它们在一起时形成的共价键类型：
*：活化酯应理解为表示分子式COY的基团，其中，Y为：
·离去基团，其选自琥珀酰亚胺基氧基基团(-OC4H4NO2)和磺基-琥珀酰亚胺基氧基基团(-OC4H3NO2-SO3H)；
·芳氧基基团，其未被取代或者被至少一个亲电子取代基(如硝基、氟、氯、氰基和三氟甲基基团)取代，从而形成活化芳基酯；
·由碳二亚胺基团活化的羧酸，形成酸酐-OCORa或-OCNRaNHRb，其中，Ra和Rb相同或不同，并且选自C1-C6烷基基团、C1-C6全氟烷基基团、C1-C6烷氧基基团和环己基基团；
·3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基。
可商购的荧光供体和受体化合物通常包括马来酰亚胺官能团或活化酯，最常见的是由NHS(N-羟基琥珀酰亚胺基)基团活化的酯，其分别与硫醇基团和胺基基团反应，因此可用于标记抗体。标记的抗体通过最终摩尔比(FMR)表征，所述FMR代表接枝至根据本发明的抗体的标记分子的平均数量。
使用根据本发明的抗体中天然存在的官能团之一可能是有利的：末端氨基基团、末端羧酸基团、天冬氨酸和谷氨酸的羧基基团、赖氨酸的胺基基团、精氨酸的胍基基团、半胱氨酸的硫醇基团、酪氨酸的酚基基团、色氨酸的吲哚环、蛋氨酸的硫醚基团和组氨酸的咪唑基团。
用荧光化合物标记根据本发明的抗体的另一方法包括将反应基团(例如NHS基团或马来酰亚胺基团)引入抗体中，并将其置于带有官能团的荧光团存在的情况中，所述官能团将与反应基团反应以形成共价键。
重要的是验证根据本发明的标记的抗体对G蛋白α保持足够的亲和力，这可以通过常规的结合实验以简单的方式进行检查，所述常规的结合实验可以计算出根据本发明的标记的抗体对G蛋白α的亲和常数。
也可以用荧光化合物间接标记根据本发明的抗体，例如通过将“第二”抗体引入孵育介质中，所述第二抗体自身与荧光化合物共价结合，该第二抗体特异性识别本发明的抗体或存在于根据本发明的抗体上的半抗原(例如二硝基苯基基团，地高辛(dogoxigénine)基团，荧光素，或FLAG、c-myc或6-HIS标签)。第二抗体可以是抗物种抗体。
间接标记的另一非常常规的手段包括将生物素附接至待标记的本发明的抗体，然后在标记有荧光团的链霉亲和素存在下对该生物素化的配体进行孵育。用生物素标记根据本发明的抗体属于本领域技术人员的常识，Cisbio Bioassays公司出售例如标记有荧光团的链霉亲和素，其商品名为“d2”(参考610SADLA)。
TR-FRET信号测量
TR-FRET信号的测量在用脉冲源在供体化合物的激发波段中激发测量介质后进行，优选在1-500微秒(μs)的延迟后进行10至2000μs的时段。甚至更优选地，延迟为50μs(时间分辨的)。
TR-FRET信号可由所测量的发光强度或其寿命组成。
根据本发明的抗体可以以多肽存在。也可以将其固定在固体支持物上。
本发明的另一方面涉及包含根据本发明的抗体的复合物，例如包含根据本发明的抗体和G蛋白α的复合物。
根据本发明的抗体可为通过例如用在常规人四聚体抗体中的相应位置上出现的一个或多个氨基酸替换所述抗体的氨基酸序列中(以及特别是FR中)的一个或多个氨基酸而获得的“人源化”版本。文献中描述了若干种人源化技术，并且本领域技术人员在实施它们以制备根据本发明的抗体方面将没有任何困难。
可以通过本领域已知的任何技术(例如但不限于，单独或组合使用的任何化学、生物学、遗传或酶促技术)来产生根据本发明的抗体。
当所需抗体的氨基酸序列已知时，本领域技术人员可通过用于产生多肽的常规技术容易地生产所述抗体。例如，可以使用众所周知的固相方法，优选使用可商购的多肽合成装置(例如由Applied Biosystems，福斯特市，加利福尼亚制造的多肽合成装置)，并按照制造商的说明书合成本发明的抗体。作为变体，可通过文献中已知的重组DNA技术合成根据本发明的抗体。例如，根据本发明的抗体可以通过以下方式获得：在将编码所述抗体的核酸序列掺入一种或多种表达载体中，并将这种载体引入将表达所期望的抗体的合适宿主细胞中后，使得所述核酸序列得以表达。
有利地，例如通过执行已知的纯化技术(例如在色谱和/或亲和柱上纯化)，从表达所期望的抗体的宿主细胞的培养上清液中纯化(或分离)本发明的抗体。
其它主题
本发明的第三主题涉及编码根据本发明的抗体的核酸序列。
本发明的第四主题涉及包含根据本发明的核酸序列的重组载体。在本发明的情况中，可使用适合于产生抗体的任何类型的载体。载体将包含产生根据本发明的抗体所必需的核酸序列，例如启动子序列、调节序列等。合适的载体的制备在文献中广泛描述。
本发明的第五主题涉及包含根据本发明的载体或根据本发明的核酸序列的细胞。可通过文献中广泛描述的方法(例如通过用根据本发明的载体或核酸序列转染细胞克隆)来获得本发明的细胞。本发明不限于特定的细胞类型。能够产生抗体的任何细胞均可用于本发明。其可为真核细胞(例如哺乳动物细胞(例如人或小鼠细胞))，或原核细胞(例如细菌，或酵母)。
下面的附图和实施例将进一步说明本发明。然而，这些实施例和这些附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
序列表
实施例
实施例1：美洲鸵免疫和sdAb文库的构建
用与GDP或GTPgS结合的重组人蛋白TST-Gαi1(UniProt序列为P63096-1的Gαi1蛋白，在N端通过TEV接头附有TwinStreptag(TST)标签(IBA))皮下免疫两只美洲驼(Lamaglama)。如先前在Alvarez-Rueda，Behar等，2007；Behar Chames等，2009中所述，在大肠杆菌菌株TG1中进行VH/VHH文库的构建。获得的文库的多样性大于108个克隆。
噬菌体-VH/VHH颗粒的生产
用50μl的细菌文库接种50ml的2YTA(含有100μg/ml氨苄青霉素的2YT)，并在37℃下振荡(250rpm)孵育至OD600为0.4-0.6之间。用噬菌体KM13以20的感染复数感染细菌，在37℃下不进行振荡并持续30分钟。将培养物以3000g离心10分钟，并将细菌沉淀重悬于250ml含有50μg/ml卡那霉素的2YTA中，以在30℃下振荡过夜产生VH-噬菌体。将培养物分成10个管，并在3000g和4℃下离心20分钟。对于每个管，在新的干净管中将5ml的20％PEG 8000、2.5mM NaCl添加到上清液中，并在冰上孵育1h，以诱导噬菌体颗粒沉淀。将该溶液在3000g和4℃下离心15min，并将含有噬菌体的沉淀重悬于1ml PBS中。进行另一离心步骤(2min，16000g)以去除细菌污染物，并在新的管中将200μl PEG 8000NaCl添加到上清液中。在冰上30min并进行最终离心(5min，16000g)后，将含有噬菌体的沉淀重悬于1ml PBS中，以获得准备用于选择的噬菌体VH。
通过噬菌体展示进行VH/VHH选择
在包含固定化Strep-Tactin(IBA#2-4101-001)的平板上耗竭噬菌体文库以避免选择抗Strep-Tactin VH的步骤之后，在包含与Twin-Strep-标签融合的重组人Gαi1的Strep-Tactin平板上进行了第一个选择周期，并在37℃下预载10μM GDP 2h，并在室温下用处于PBS中的2％BSA饱和1h。在室温下孵育2小时后，用0.1％Tween PBS和PBS洗涤平板。在室温下使用1mg/ml胰蛋白酶溶液(Sigma)振荡洗脱结合的噬菌体30分钟。回收噬菌体并通过感染TG1细菌菌株进行扩增。以类似的方式对预载有10μM GTP的Gαi1进行第二个选择循环。第二种策略包括在不存在核苷酸的情况下针对Gαi1进行两轮选择。第三种旨在促进对Gαi活性构象(GTP)特异的VH的选择的策略包括在预载有10μM GTPgS的Gαi1 Twin-Strep-标签上进行两个选择周期，然后在涂有预载10μM GDP的Gαi1 Twin-Strep-标签的平板上进行耗竭步骤。将各个TG1菌落在96孔深孔板中的400μl含2％葡萄糖的2YTA中培养。过夜生长后，将培养物在-80℃下在20％甘油中冷冻，并将剩余的培养物用于在2YTA中进行异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导的可溶性VH生产。含有VH的上清液用于筛选测定。
VH的生产和纯化
为了大规模生产VH，将阳性噬菌粒转化到大肠杆菌菌株BL21 DE3中。将转化的细菌在400ml的2YTA中培养至OD600值为0.7，并用100μM IPTG诱导使其在30℃下振荡过夜生长。通过离心回收细菌，并使用BugbusterTM试剂(Novagen)进行裂解。以3000g离心20分钟后，根据制造商的说明使用SuperflowTM(GE Healthcare)亲和色谱从上清液中纯化VH。
VH-HcAb的生产
通过基因合成(Genecust)将VH基因与编码人IgG1的CH2和CH3结构域的基因以及6个组氨酸的标签融合，将VH基因克隆到pHLsec载体中(Aricescu AR，Lu W，Jones EY.ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.2006年10月；62(Pt 10)：1243-50)。相应的质粒用于转染适应悬浮的HEK293系，并根据制造商的说明(FreeStyle 293Expression System，Thermofisher)搅动孵育细胞。5天后，回收上清液，并根据制造商的说明直接用于通过SuperflowTM亲和色谱纯化HcAb。
实施例2：在FRET(HTRF)中测定根据本发明的单域抗体(sdAb)的亲和常数(Kd)
材料：
在Sf9昆虫细胞中生产重组TST-Gαi1蛋白(UniProt序列为P63096-1的Gαi1蛋白，通过TEV接头在N端附有TwinStreptag(TST)标签(IBA))(通过杆状病毒感染)，然后通过TwinStreptag(TST)标签在亲和柱上进行纯化(Strep-Tactin Superflow高容量树脂(IBA，目录：2-1208-002))。
用供体荧光探针标记抗TST抗体(抗Twin-Strep-标签，目录参考2-1517-001，来自IBA)，可与使用受体d2的TR-FRET检测兼容。由此获得的抗体称为“抗TST抗体-Lumi4-Tb”。
对于九个重链可变结构域(VH)的大规模生产(F9：SEQ ID No：24，F4：SEQ ID No：40，B11：SEQ ID No：16，F11：SEQ ID No：4，G6：SEQ ID No：32，A10：SEQ ID No：48，E2：SEQID No：64，F2：SEQ ID No：56，以及G7：SEQ ID No：72)，将编码所述VH的噬菌粒转化入大肠杆菌菌株BL21 DE3。将转化的细菌在400ml的2YTA中培养至OD600值为0.7，并用100μM IPTG诱导使其在30℃下搅动过夜生长。通过离心回收细菌，并使用BugbusterTM试剂(Novagen)进行裂解。以3000g离心20分钟后，根据制造商的说明使用SuperflowTM(GEHealthcare)亲和色谱从上清液中纯化VH。
为了生产VH型重链抗体(VH-HcAb)，通过基因合成(Genecust)将VH基因与编码人IgG1的CH2和CH3结构域的基因以及6个组氨酸的标签融合，将VH基因克隆到pHLsec载体中(Aricescu AR，Lu W，Jones EY.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2006年10月；62(Pt 10)：1243-50)。相应的质粒用于转染适应悬浮的HEK293系，并根据制造商的说明(FreeStyle 293Expression System，Thermofisher)振荡孵育细胞。5天后，回收上清液，并根据制造商的说明直接用于通过SuperflowTM亲和色谱纯化VH-HcAb。
用受体荧光探针d2标记获得的sdAb(VH或VH-HcAb)，与使用供体Lumi4-Tb(用于标记抗TST抗体)的TR-FRET检测兼容。标记的抗体称为“抗Gαi抗体-d2”。
GDP和GTPγS核苷酸购自Sigma Aldrich(目录参考分别为G7127和G8634)。
白色的、384孔低容量的、白色底的平板购自Greiner Bio One(目录参考784075)。
方法：
1)试剂的制备：
将所有试剂在pH 7.4的50mM Tris-HCl缓冲液、10mM MgCl2、10mM NaCl、0.1％BSA中稀释。制备4×的重组TST-Gαi1蛋白，以1nM的最终浓度在孔中使用(除非另有指定)。制备4×的GDP或GTPγS核苷酸，以10μM的最终浓度在孔中使用。制备4×的抗TST抗体-Lumi4-Tb，以0.25nM的终浓度在孔中使用。制备4×的各种抗Gαi-d2抗体，以达到图表中指示的孔中的最终浓度，可高达200nM。
2)384孔板中试剂的分配：
-TST-Gαi1蛋白：5μl
-核苷酸(GDP或GTPgS)：5μl
-抗TST抗体-Lumi4-Tb(供体)：5μl
-抗Gαi抗体-d2(受体)：5μl
使用仅包含两种检测试剂(标记有供体和受体)(即抗TST抗体-Lumi4Tb(供体)和抗Gαi抗体-d2(受体))的孔测量非特异性信号(荧光背景噪声)，其它组分由其稀释缓冲液代替。
3)读取HTRF信号：
将平板在21℃孵育20h，然后以如下配置在BMG Labtech的PHERAstar阅读器上测量HTRF信号：
-模块：HTRF(激发337nm，发射665nm和620nm)
-激发：激光，闪烁40次
-读取窗口：延迟：60μs-整体：400μs
4)信号处理：
根据以下公式从665nm和620nm处的原始信号计算HTRF比：
HTRF比＝665nm处的信号/620nm处的信号*10000
5)用于确定重链可变结构域VH的亲和力(Kd)的TR-FRET(HTRF)测定的原理
TR-FRET(HTRF)测试使得能够确定各种抗体对Gαi1蛋白的亲和力(Kd)；图2说明了此测试的原理。在存在过量核苷酸(GDP或GTPgS)(10μM)、固定浓度(0.5nM)的标记有供体Lumi4-Tb的抗TST抗体(抗TST抗体-Lumi4-Tb)、以及浓度逐渐增加的标记有受体d2的VH型单域抗体(抗Gαi VH抗体-d2)时，放置纯化的并以TST为标签的固定浓度(1nM)的重组Gαi1蛋白(TST-Gαi1蛋白)。然后获得总HTRF信号。
平行地，进行没有Gαi1蛋白的状况以确定非特异性HTRF信号。
然后通过从总信号中减去非特异性信号，计算出抗体与Gαi1蛋白之间相互作用的特异性HTRF信号。然后使用“一个位点特异性结合”拟合在GraphPad Prism7软件上分析特异性HTRF信号的数据。然后确定抗体对Gαi1蛋白的解离常数(Kd)。在表1和表2中示出了用抗体获得的结果：与结合至GTPγS的G蛋白α结合的抗体，以及与结合至GDP的G蛋白α结合的抗体。
6)用于确定VH型重链抗体(VH HcAb)的亲和力(Kd)的HTRF(TR-FRET)测定的原理
图12示出了用于确定各种VH-HcAb对Gαi1蛋白的亲和力(Kd)进行的TR-FRET(HTRF)测定的原理。在存在过量核苷酸(GDP或GTPgS)(10μM)、固定浓度(0.5nM)的标记有供体Lumi4-Tb的抗TST抗体(抗-Tag Ab-供体)、固定浓度的标记有受体d2的抗6HIS抗体(抗6HIS-受体抗体，Cisbio Bioassays#61HISDLF)、以及浓度逐渐增加的标签有6HIS的VH-HcAb(6HIS-Fc-sdAb)时，放置纯化的并以TST为标签的固定浓度(1nM)的重组Gαi1蛋白(TST-Gαi1蛋白)。然后获得总HTRF信号。
平行地，进行没有Gαi1蛋白的状况以确定非特异性HTRF信号。
然后，通过从总信号中减去非特异性信号，计算出VH-HcAb与Gαi1蛋白之间相互作用的特异性HTRF信号。然后使用“一个位点特异性结合”拟合在GraphPad Prism7软件上分析特异性HTRF信号的数据。然后确定VH-HcAb对Gαi1蛋白的解离常数(Kd)。用抗体HcAb-B11、HcAb-F9、HcAb-G7、HcAb-A10获得的结果示于下表3中。
结果：
图3-图11显示了关于VH获得的饱和曲线。
关于与GTPγS结合的G蛋白α，VH(F9、F11、B11、F4和G6)具有升高的亲和力，解离常数(Kd)小于100nM，范围低至1nM(例如与抗体B11)。
表1：关于与GTPγS结合的Gαi1蛋白和空Gαi1蛋白，VH的亲和力(Kd，以nM计)
关于与GDP结合的G蛋白α，VH(A10、G7、F2和E2)具有升高的亲和力，解离常数(Kd)小于100nM，范围低至14nM(例如关于抗体F2)。
表2：关于与GDP结合的Gαi1蛋白和空Gαi1蛋白，VH的亲和力(Kd，以nM计)
图13-图16显示了关于VH HcAb获得的饱和曲线。
抗体HcAb-B11、HcAb-F9、HcAb-G7和HcAb-A10对于与GDP结合或者与GTPγS结合的G蛋白α具有升高的亲和力，解离常数(Kd)小于10nM，范围低至1nM(例如关于抗体HcAb-B11，与结合了GTPγS的G蛋白α结合)。
表3：关于与GDP或GTPγS结合的Gαi1蛋白，VH-HcAb的亲和力(Kd，以nM计)。
序列表
<110> CISBIO BIOASSAY
INSERM
CNRS
<120> 结合G α蛋白的单域抗体
<130> 1H305110 0018
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F11 CDR1
<400> 1
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F11 CDR2
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<212> PRT
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<220>
<223> F11 CDR3
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F11 FR1
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20 25
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<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F11
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Thr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Arg Gly Asp Gln Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Pro Ile Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
115 120 125
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His Gly Ser
130 135 140
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F11 FR2
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Thr
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Tyr Tyr Thr Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<220>
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<220>
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<220>
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Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
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35
<210> 16
<211> 143
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B11
<400> 16
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
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Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Pro Val Gly Pro Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
115 120 125
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His Gly Ser
130 135 140
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9 CDR1
<400> 17
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9 CDR2
<400> 18
Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9 CDR3
<400> 19
Ala Thr Asp Pro Ser Thr Trp Tyr Arg Gly Thr Ala His
1 5 10
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9 FR1
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9 FR2
<400> 21
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 22
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9 FR3
<400> 22
Asp Tyr Ala His Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp
20 25 30
Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9 FR4
<400> 23
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His Gly Ser
35
<210> 24
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F9
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr Asp Tyr Ala His Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Pro Ser Thr Trp Tyr Arg Gly Thr Ala His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
115 120 125
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His Gly
130 135 140
Ser
145
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6 CDR1
<400> 25
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Arg
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6 CDR2
<400> 26
Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr
1 5
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6 CDR3
<400> 27
Ala Thr Asp Pro Ser Thr Trp Tyr Arg Gly Thr Ala His
1 5 10
<210> 28
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6 FR1
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6 FR2
<400> 29
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 30
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6 FR3
<400> 30
Asp Tyr Ala His Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp
20 25 30
Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 31
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6 FR4
<400> 31
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His Gly Ser
35
<210> 32
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G6
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Arg Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr Asp Tyr Ala His Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Pro Ser Thr Trp Tyr Arg Gly Thr Ala His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
115 120 125
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His Gly
130 135 140
Ser
145
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4 CDR1
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4 CDR2
<400> 34
Ile Tyr Asn Gly Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4 CDR3
<400> 35
Asn Ala Tyr Asp Gly Thr Leu Leu Arg Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4 FR1
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4 FR2
<400> 37
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 38
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4 FR3
<400> 38
Asp Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Ser Asp Leu Lys Val Gln Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 39
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4 FR4
<400> 39
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His Gly Ser
35
<210> 40
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F4
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Asn Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Asp Leu Lys Val Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Tyr Asp Gly Thr Leu Leu Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
115 120 125
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His Gly Ser
130 135 140
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10 CDR1
<400> 41
Gly Leu Thr Tyr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10 CDR2
<400> 42
Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10 CDR3
<400> 43
Thr Thr Val Ser Tyr Trp Arg Tyr Glu Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10 FR1
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10 FR2
<400> 45
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 46
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10 FR3
<400> 46
Asp Tyr Ala His Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 47
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10 FR4
<400> 47
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His Gly Ser
35
<210> 48
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> A10
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Tyr Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr Asp Tyr Ala His Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Val Ser Tyr Trp Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
115 120 125
Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His Gly Ser
130 135 140
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2 CDR1
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2 CDR2
<400> 50
Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2 CDR3
<400> 51
Val Lys Gly Trp Met Pro Thr Gly
1 5
<210> 52
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2 FR1
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2 FR2
<400> 53
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 54
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2 FR3
<400> 54
Asp Tyr Ala His Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 55
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2 FR4
<400> 55
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His Gly Ser
35
<210> 56
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Ala Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr Asp Tyr Ala His Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Gly Trp Met Pro Thr Gly Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
115 120 125
Asn Gly Ala Ala His His His His His His Gly Ser
130 135 140
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2 CDR1
<400> 57
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2 CDR2
<400> 58
Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr
1 5
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2 CDR3
<400> 59
Thr Arg Val Leu Trp Tyr Glu Asn Gly Leu Tyr Ser Leu Asn Asp Phe
1 5 10 15
<210> 60
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2 FR1
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Gly Ser
20 25
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2 FR2
<400> 61
Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 62
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2 FR3
<400> 62
Asp Tyr Ala His Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu His Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 63
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2 FR4
<400> 63
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His Gly Ser
35
<210> 64
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr Asp Tyr Ala His Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Val Leu Trp Tyr Glu Asn Gly Leu Tyr Ser Leu Asn Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
115 120 125
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
130 135 140
His His Gly Ser
145
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7 CDR1
<400> 65
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Gly
1 5
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7 CDR2
<400> 66
Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr
1 5
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7 CDR3
<400> 67
Thr Arg Val Leu Trp Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Leu Asn Asp Phe
1 5 10 15
<210> 68
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7 FR1
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7 FR2
<400> 69
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 70
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7 FR3
<400> 70
Asp Tyr Ala His Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Thr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 71
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7 FR4
<400> 71
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
1 5 10 15
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
20 25 30
His His Gly Ser
35
<210> 72
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G7
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Thr Asp Tyr Ala His Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Val Leu Trp Tyr Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Leu Asn Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
115 120 125
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
130 135 140
His His Gly Ser
145

Claims (12)

1.一种单域抗体(sdAb)，所述单域抗体结合G蛋白α，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)以及FR1至FR4组成的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)
其中，CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO：9示出，CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO：10示出，并且CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO：11示出；FR1的氨基酸序列由SEQ ID NO：12示出，FR2的氨基酸序列由SEQ ID NO：13示出，FR3的氨基酸序列由SEQ ID NO：14示出，并且FR4的氨基酸序列由SEQ ID NO：15示出。
2.如权利要求1所述的抗体，其中，关于全G蛋白α，所述抗体具有小于100nM的解离常数(Kd)，所述解离常数在FRET中测量。
3.如权利要求1或2所述的抗体，所述式(I)的氨基酸序列与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有100％的同源性。
4.如权利要求1或2所述的抗体，所述抗体选自重链可变结构域(VH)或VH型重链抗体(VH HcAb)。
5.如权利要求1或2所述的抗体，所述抗体选自VHH型重链可变结构域(VHH)或VHH型重链抗体(VHH HcAb)。
6.如权利要求1或2所述的抗体，所述抗体与能够检测所述抗体的分子偶联。
7.如权利要求6所述的抗体，所述分子选自肽标签、酶、放射性核素、发光化合物、染料。
8.如权利要求7所述的抗体，所述发光化合物为荧光化合物。
9.如权利要求8所述的抗体，所述荧光化合物为FRET伴侣对的成员。
10.编码如权利要求1-9中任一项所述的单域抗体(sdAb)的核酸。
11.包含如权利要求10所述的核酸的重组载体。
12.一种细胞，所述细胞包含如权利要求11所述的载体或如权利要求10所述的核酸。
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