EP3830126A1 - Anticorps a domaine unique qui se lient a la proteine g alpha - Google Patents

Anticorps a domaine unique qui se lient a la proteine g alpha

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EP3830126A1
EP3830126A1 EP19762192.3A EP19762192A EP3830126A1 EP 3830126 A1 EP3830126 A1 EP 3830126A1 EP 19762192 A EP19762192 A EP 19762192A EP 3830126 A1 EP3830126 A1 EP 3830126A1
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EP
European Patent Office
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seq
homology
antibody
acid sequence
protein
Prior art date
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Pending
Application number
EP19762192.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Thomas Fabien Michel ROUX
Elodie Julie DUPUIS
Eric Jacques Christian TRINQUET
Mélanie DA SILVA
Camille S MAILHAC
Patrick JM CHAMES
Daniel Baty
Julien Jean-Marius SOULE
Philippe RONDARD
Jean-Philippe R. PIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Cisbio Bioassays SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Cisbio Bioassays SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Cisbio Bioassays SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3830126A1 publication Critical patent/EP3830126A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
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    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to the field of antibodies and in particular the field of single domain antibodies (sdAb) which bind to the G alpha protein.
  • sdAb single domain antibodies
  • the sdAbs according to the invention are particularly suitable for use in FRET, for example in the form of heavy chain antibodies (HcAbs) coupled to a molecule allowing their detection.
  • HcAbs heavy chain antibodies
  • G protein-coupled receptors are the most widely represented membrane receptors in mammals. They are responsible for a wide variety of cellular responses linked to various physiological processes (e.g. vision, olfaction, mediating the action of many hormones, neuropeptides, etc.). They can be activated by ligands of very diverse natures such as, for example, photons, ions, olfactory molecules, taste molecules, amino acids, nucleic acids, lipids, exogenous molecules such as cannabinoids, chemokines, or hormones.
  • ligands of very diverse natures such as, for example, photons, ions, olfactory molecules, taste molecules, amino acids, nucleic acids, lipids, exogenous molecules such as cannabinoids, chemokines, or hormones.
  • GPCRs can be classified in humans into 5 main families called rhodopsin, adhesion, secretin, glutamate, Frizzled / Taste2 (Fredriksson et al., 2003).
  • the RCPGs change their functional conformation state according to their level of activation by a ligand compared to a basal conformational state. When the RCPG is activated by the binding of a specific ligand, the change in conformation of the agonist-receptor complex allows activation of the heterotimeric G protein.
  • the G proteins are heterotrimeric proteins which transduce an activation signal of the GPCR by initiating cascades of biochemical reactions whose purpose is the transduction of the signal from the outside of the cell to the inside of the cell.
  • the G proteins are located on the inner face of the plasma membrane and are formed of three subunits (a, b, y).
  • the alpha subunit is capable of binding to guanylic nucleotides, either the GDP or the GTP.
  • the alpha subunit of protein G is linked to the nucleotide GDP (full protein G linked to GDP);
  • the latter binds to the alpha subunit of protein G and triggers a process of activation of protein G consisting of two stages: 1) the output of GDP from protein G to give a protein Empty G, and the formation of an inactive RCPG / protein-G-vacuum complex, and 2) the binding of GTP which leads to the formation of an active G protein, in GTP form (full G protein linked to GTP).
  • the G protein bound to the receptor is in a form called "empty form". This state is described in the literature as being transient since it is described that the nucleotide GTP binds quickly to the alpha subunit of protein G.
  • the beta / gamma subunits of activated protein G dissociate from the alpha subunit;
  • the alpha subunit of the full G protein linked to GTP then attaches to the effectors to activate them.
  • the effectors in turn activate signaling pathways causing a cellular response;
  • the GTP is then hydrolyzed to GDP by the alpha subunit of the G protein and the alpha subunit is reassociated with the beta / gamma subunits to reform the full G protein linked to the GDP (inactive state).
  • Galpha il Galpha i2, Galpha i3, Galpha ol, Galpha o2, Galpha q, Galpha 12, Galpha 13, Galpha s, Galpha z, Galpha tl, Galpha t2, Galpha 11, Galpha 14, Galpha 15, Galpha 16 or even Galpha gus.
  • GPCRs Given the involvement of GPCRs in numerous signaling pathways, tools have been generated in the prior art to study their activity, often with the aim of identifying new ligands for these receptors having potential therapeutic activity.
  • a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable radioactive derivative of GTP in particular GTP-gamma-S, which binds to the protein G alpha when the receptor is activated.
  • GTP-gamma-S binds to the protein G alpha when the receptor is activated.
  • enzymatic activity such as luciferase whose expression is controlled by the second messengers produced by the activation of the receptor.
  • Antibodies have also been synthesized to detect activation of GPCRs at the level of the cell surface (Damien Maurel.
  • the present invention advantageously provides antibodies with a single domain (sdAb), for example heavy chain antibodies (HcAb) which bind to the G alpha protein (G alpha protein).
  • sdAb single domain
  • HcAb heavy chain antibodies
  • the present invention relates to a single domain antibody (sdAb) which binds to protein G alpha.
  • sdAb single domain antibody
  • a first object of the present invention relates to a single domain antibody (sdAb) which binds to the G alpha protein comprising an amino acid sequence consisting of 3 CDR regions (CDR1 to CDR3) and 4 hinge regions (FRI to FR4 ) according to the following formula (I):
  • said antibody exhibiting a dissociation constant (Kd) for the full alpha G protein measured in FRET of less than 100 nM.
  • a second object of the present invention relates to a single domain antibody (sdAb) which binds to the G alpha protein comprising an amino acid sequence consisting of 3 CDR regions (CDR1 to CDR3) and 4 hinge regions (FRI to FR4 ) according to the following formula (I):
  • - CDR1 has at least 80% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 65;
  • - CDR2 has at least 80% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 66;
  • - CDR3 has at least 80% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 67.
  • a third object of the present invention relates to a nucleic acid sequence coding for the single domain antibody (sdAb) according to the invention.
  • a fourth object of the present invention relates to a recombinant vector comprising the nucleic acid sequence according to the invention.
  • a fifth object of the present invention relates to a cell comprising the vector according to the invention or the nucleic acid sequence according to the invention.
  • antibody according to the invention refers both to the first object according to the invention and to the second object according to the invention.
  • Figure 1 Shows the activation mechanism of a GPCR and the different stages of activation of the G alpha protein, namely the inactivated form (G alpha protein linked to GDP) and the activated form (Galpha protein linked to GTP) .
  • FIG. 2 Principle of the HTRF test (TR-FRET) for the determination of the affinity (Kd) of the heavy chain variable domains (VH), implemented in Figures 3 to 11.
  • FIG. 3 Determination of the affinity (Kd) of VH F9 by TR-FRET test. The principle of the test detailed in Figure 2 is used. The Galphail protein is loaded with an excess of GTPgS (10mM). A 32dM Kd is obtained for the VH F9 / Galphail protein interaction.
  • FIG 4 Determination of the affinity (Kd) of the VH Fil by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 2 is used.
  • the Galphail protein is loaded with an excess of GTPgS (10mM).
  • a 3dM Kd is obtained for the VH Fil / Galphail protein interaction.
  • FIG. 5 Determination of the affinity (Kd) of VH Bll by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 2 is used.
  • the Galphail protein is loaded with an excess of GTPgS (10pM).
  • a Kd of lnM is obtained for the interaction VH Bll / Galphail protein.
  • FIG. 6 Determination of the affinity (Kd) of VH F4 by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 2 is used.
  • the Galphail protein is loaded with an excess of GTPgS (10mM).
  • a 31dM Kd is obtained for the VH F4 / Galphail protein interaction.
  • Figure 7 Determination of the affinity (Kd) of VH G6 by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 2 is used.
  • the Galphail protein is loaded with an excess of GTPgS (10pM).
  • a 95dM Kd is obtained for the VH G6 / Galphail protein interaction.
  • Figure 8 Determination of the affinity (Kd) of VH A10 by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 2 is used.
  • the Galphail protein is loaded with an excess of GDP (10mM).
  • a Kd of 15nM is obtained for the interaction VH A10 / Galphail protein.
  • Figure 9 Determination of the affinity (Kd) of VH G7 by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 2 is used.
  • the Galphail protein is loaded with excess GDP (10pM).
  • a 31dM Kd is obtained for the VH G7 / Galphail protein interaction.
  • Figure 10 Determination of the affinity (Kd) of VH F2 by TR-FRET test. The test principle detailed in Figure 2 is used. The Galphail protein is loaded with an excess of GDP (IOmM). A 14dM Kd is obtained for the VH F2 / Galphail protein interaction.
  • Figure 11 Determination of the affinity (Kd) of VH E2 by TR-FRET test. The test principle detailed in Figure 2 is used. The Galphail protein is loaded with an excess of GDP (IOmM). A 72dM Kd is obtained for the VH E2 / Galphail protein interaction.
  • FIG. 12 Principle of the TR-FRET test (HTRF) for determining the affinity (Kd) of HcAb of VH type (HcAb VH), implemented for Figures 13 to 16.
  • HTRF TR-FRET test
  • Figure 13 Determination of the affinity (Kd) of HcAb-Bll by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 12 is used.
  • the Galphail protein is loaded with an excess of GTPgS (IOmM).
  • An Kn of lnM is obtained for the HcAb-Bll / Galphail protein interaction.
  • Figure 14 Determination of the affinity (Kd) of HCAb-F9 by TR-FRET test.
  • the test principle detailed in Figure 12 is used.
  • the Galphail protein is loaded with an excess of GTPgS (IOmM).
  • a 3dM Kd is obtained for the HcAb-F9 / Galphail protein interaction.
  • Figure 15 Determination of the affinity (Kd) of HcAb-G7 by TR-FRET test. The test principle detailed in Figure 12 is used. The Galphail protein is loaded with excess GDP (10pM). A 5dM Kd is obtained for the HcAb-G7 / Galphail protein interaction.
  • Figure 16 Determination of the affinity (Kd) of HcAb-A10 by TR-FRET test. The test principle detailed in Figure 12 is used. The Galphail protein is loaded with an excess of GDP (IOmM). A 3dM Kd is obtained for the HcAb-A10 / Galphail protein interaction.
  • Figure 17 Diagram of different possible forms of sdAb antibodies according to the invention.
  • sdAb single domain antibodies
  • anti-G protein alpha antibody refers to an antibody that binds protein G alpha with a sufficient affinity for the antibody to be useful as a detection (eg for the implementation of a FRET), diagnostic and / or therapeutic agent by targeting the G alpha protein.
  • Antibody is understood to mean a polypeptide encoded by an immunoglobulin gene capable of binding to an antigen.
  • the term “antibody” is used here in its broadest sense and encompasses various antibody structures which exhibit binding activity to the desired antigen, including, but not limited to, monoclonal antibodies, antibodies polyclonal, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) and antibody fragments.
  • “Conventional” antibodies, such as, for example, immunoglobulins of type G (IgG) in humans, are in the form of a tetramer comprising two pairs of identical polypeptide chains called light chains and two identical polypeptide chains say heavy chains.
  • variable domain is located at the N-terminal end of each chain (“VH” for heavy chains and “VL” for light chains) and the two variable domains VH and VL allow the recognition of the antigen .
  • Each variable domain generally includes 4 “hinge regions” (called FRI, FR2, FR3, FR4) and 3 regions directly responsible for the binding with the antigen, called “CDR” (called CDR1, CDR2, CDR3).
  • FRI, FR2, FR3, FR4 4 “hinge regions”
  • CDR 3 regions directly responsible for the binding with the antigen
  • each variable domain takes the following form: FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
  • the binding to the antigen is effected by a couple of two variable domains (ie a variable domain of light chain VL and a variable domain of heavy chain VH), that is, 6 CDRs are involved in the formation of an antigen binding site.
  • 6 CDRs are involved in the formation of an antigen binding site.
  • single domain antibodies only 3 CDRs are involved in the formation of an antigen binding site.
  • the antigen binding site of a single domain antibody is formed by 3 CDRs.
  • the terms “single domain antibody”, “Single domain Antibody” and “sdAb” are interchangeable and refer to an antibody in which the binding to the antigen is effected by a single variable domain.
  • An sdAb can be i) an antibody comprising or consisting of a heavy chain variable domain (VH) or a fragment thereof capable of binding to the antigen, which binds to the antigen independently of any other variable domain , ii) an antibody comprising or consisting of a light chain variable domain (VL) or a fragment thereof capable of binding to the antigen, which binds to the antigen independently of any other variable domain, or ii ) an antibody comprising or consisting of a V h H (V H H) type heavy chain variable domain OR a fragment thereof capable of binding to the antigen, which binds to the antigen independently of any other variable domain.
  • VH heavy chain variable domain
  • VL light chain variable domain
  • heavy chain type VH antibody or "HcAb VH” means an antibody consisting of two heavy chains each comprising a variable domain type VH.
  • each heavy chain consists of the CH2 and CH3 fragments, and of said variable domain of VH type.
  • heavy chain antibody type V h H or “HcAb V h H” is understood to mean an antibody consisting of two heavy chains each comprising a variable domain of type VHH.
  • each heavy chain consists of the CH2 and CH3 fragments, and of the said variable domain of type V H H.
  • full Galpha protein or “full form of the G alpha protein” denote a Galpha protein linked to GTP, to GDP or to an analog thereof, for example to non-hydrolyzable GTP or slowly hydrolyzable. These terms therefore designate the Galpha protein linked to GDP or to a GDP analog (“Galpha protein linked to GDP”) or the Galpha protein linked to GTP or to a GTP analog, for example to non-hydrolysable or slowly hydrolyzable GTP (“ Galpha protein linked to GTP ”).
  • the full Galpha protein (Galpha protein linked to GDP or Galpha protein linked to GTP) is shown in Figure 1.
  • GDP refers to guanosine diphosphate.
  • GTP refers to guanosine triphosphate.
  • non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP denotes a GTP analog which is not hydrolyzed or poorly hydrolyzed to GDP. Examples include GTPgammaS (also known by the acronyms “GTPgS” and “GTPyS”) (CAS no. 37589-80-3), GppNHp (CAS no. 148892-91-5) or GppCp (CAS no . 10470-57-2).
  • empty Galpha protein or “empty form of the G alpha protein” denote a Galpha protein which is not linked to GTP or to GDP.
  • the empty Galpha protein is described in the literature as a transient state between the Galpha protein linked to GDP and the Galpha protein linked to GTP.
  • the empty Galpha protein is shown in Figure 1.
  • affinity refers to the strength of the set of non-covalent interactions between a molecule, for example an sdAb and its partner, for example an antigen such as the full G alpha protein. Affinity is generally represented by the dissociation constant (Kd).
  • Kd dissociation constant
  • the dissociation constant (Kd) can be measured by well-known methods, for example in FRET or SPR.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FRET is defined as a non-radiative energy transfer resulting from a dipole-dipole interaction between a donor and an energy acceptor. This physical phenomenon requires energy compatibility between these molecules. This means that the emission spectrum of the donor must cover, at least partially, the absorption spectrum of the acceptor.
  • FRET is a process which depends on the distance separating the two molecules, donor and acceptor: when these molecules are close to each other, a FRET signal will be emitted.
  • the dissociation constant (Kd) is measured by FRET, for example as described in the examples.
  • the “homology” is calculated by comparing two aligned sequences in a comparison window.
  • the alignment of the sequences makes it possible to determine the number of positions (nucleotides or amino acids) common to the two sequences in the comparison window.
  • the number of common positions is then divided by the total number of positions in the comparison window and multiplied by 100 to obtain the percentage of homology.
  • the determination of the percentage of sequence homology can be done manually or using well known computer programs.
  • purified and “isolated” is meant, with reference to an antibody according to the invention, that the antibody is present in the substantial absence of other biological macromolecules of the same type.
  • purified preferably means at least 75% by weight, more preferably at least 85% by weight, even more preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 98% by weight. 'antibody, compared to all the macromolecules present.
  • a first subject of the invention relates to a single domain antibody (sdAb) which binds to the protein G alpha comprising an amino acid sequence consisting of 3 complementary determining regions called “CDRs” (CDR1 to CDR3) and 4 regions so-called “FRs” hinges (FRI to FR4) according to the following formula (I):
  • FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) whose dissociation constant (Kd) for the full protein alpha G measured in FRET is less than 100 nM.
  • the sdAb binds to the full G alpha protein (either the G protein alpha linked to GTP or one of its analogs or the G protein alpha linked to GDP or one of its analogs) with a dissociation constant (Kd ) measured in FRET less than 100 nM, for example an affinity constant less than 75 nM, less than 50 nM, less than 25 nM or even less than 10 nM, for example between 1 and 10 nM, between 10 and 100 nM , between 10 and 75 nM or between 10 and 50 nM.
  • Kd dissociation constant
  • sdAb can be obtained by immunization of a camelid comprising the administration of a full alpha G protein, alone or in combination with an adjuvant such as for example, an aluminum salt, the adjuvant of Freund or mineral oil.
  • the administration can be made by subcutaneous, intravenous, intramuscular or intraperitoneal route, preferably by subcutaneous route at a dose of between 10 pg and 10 mg. Said administration can be repeated several times, each administration being able to be spaced by one or more days in order to obtain an optimal immune response.
  • the antibodies generated can then be recovered from mononuclear peripheral blood cells via conventional purification techniques known to those skilled in the art, for example by reverse transcription (RT-PCR) of the MRNA coding for this antibody in order to obtain cDNAs which will then be cloned within a vector before being selected by "phage display linear” using the full alpha G protein fixed on an ELISA plate.
  • RT-PCR reverse transcription
  • the antibodies according to the invention can be obtained by implementing the protocol described in Example 1.
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 65;
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42 , SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 66; and
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 , SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 67.
  • amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 can easily be combined with each other to meet formula (I). Those skilled in the art can easily determine to what extent these sequences can be combined so as to obtain sdAbs according to the invention having the desired dissociation constant (Kd).
  • a second object of the present invention relates to a single domain antibody (sdAb) which binds to the G alpha protein comprising an amino acid sequence consisting of 3 CDR regions (CDR1 to CDR3) and 4 hinge regions (FRI to FR4 ) according to the following formula (I): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 65;
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42 , SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 66; and
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 , SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 67.
  • Protein G alpha can be of human or animal origin.
  • the sdAb according to the invention binds to the Galphai protein (Gai), for example the Galphail protein, the Galphai2 protein or the GalphaB protein.
  • the Galphail protein of human origin has the identifier UniProt P63096-1 for isoform 1 and the identifier UniProt P63096-2 for isoform 2.
  • the gene coding for the protein Galphail of human origin is known as from "GNAI1" (Gene ID: 2770, NCBI).
  • the sdAb according to the invention can be in different forms. It can be, for example, a heavy chain variable domain (VH), a heavy chain variable domain of type V h H (V H H), a heavy chain antibody of type VH (HcAb VH), a heavy chain antibody type V h H (HcAb V H H), a heavy chain antibody IgG anti-new receptors for immunoglobulin antigen derived from cartilaginous fish (Ig NAR) or else a variable domain dlg NAR (V-NAR).
  • VH heavy chain variable domain
  • V H H H heavy chain variable domain of type V h H
  • HcAb VH heavy chain antibody of type V h H
  • V-NAR variable domain dlg NAR
  • - CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90%
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% of homology with SEQ ID NO: 2
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 3;
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 9
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 10
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 11;
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 17,
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 18 and
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 19;
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 25,
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 26 and
  • CDR3 has at least 80% homology with SEQ ID NO : 27;
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 33
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 34
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 35;
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 41
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 42
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 43;
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 49
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 50
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 51;
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 57
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 58
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 59; or
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 65
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 66
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 67.
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 68;
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 69; and
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 70; and
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47 , SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 71.
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 5
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 6
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 7
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 8;
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 12
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO : 13, FR3, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology has at least 80% homology with SEQ ID NO: 14 and FR4 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 15;
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 20
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 21
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 22
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 23;
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 28
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 29
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 30
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 31;
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 36
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 37
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 38
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100 % homology with SEQ ID NO: 39;
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 44
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 45
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 46 and FR4 has at least 80% homology, preferably at at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 47;
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 52
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 53
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 54
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 55;
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 60
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 61
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 62
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 63; or
  • - FRI has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with a SEQ ID NO: 68
  • FR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 69
  • FR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 70
  • FR4 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with SEQ ID NO: 71.
  • the amino acid sequence of formula (I) has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 72.
  • the antibody according to the invention can bind to the Galpha protein in an isolated form and / or present in a membrane environment, for example it can bind to a Galpha protein present in a preparation of membranes carrying one or more GPCRs and a or more G alpha proteins.
  • the antibody according to the invention binds to the protein, it is not necessary for the protein alpha G to be complexed with the RCPG so that the antibody according to the invention can bind to the protein G.
  • the antibody according to the invention has a better affinity for the full Galpha protein compared to the empty Galpha protein, in particular a better affinity for the Galpha protein linked to GTP gamma S.
  • the “Kd for the empty Galpha protein / Kd for the full Galpha protein” ratio measured in FRET of the antibody of the invention is at least equal to 2, for example at least equal to 2.5, at least equal to 5, at least equal to 10, and:
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with one of the amino acid sequences chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33;
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34; and
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35.
  • the antibody according to the invention has a better affinity for the empty Galpha protein compared to the full Galpha protein.
  • the ratio "Kd for the Galpha protein p!êt / Kd for the empty Galpha protein" measured in FRET of the antibody of the invention is at least equal to 5, for example at least equal to 10, at least equal to 20, at least equal to 50, and:
  • CDR1 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with one of the amino acid sequences chosen from SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65;
  • CDR2 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66; and
  • CDR3 has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 67.
  • the antibody according to the invention is particularly advantageous in the implementation of a FRET, in particular for detecting a full Galpha protein or an empty Galpha protein.
  • the antibody according to the invention can thus be coupled to a molecule allowing its detection. It can be a peptide tag, for example the 6XHis tag. It may also be an enzyme capable of generating a signal detectable by colorimetry, fluorescence or luminescence when it is in the presence of its substrate, for example b-galactosidase, alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. It can also be a radionuclide, a fluorescent compound, a luminescent compound or a dye.
  • the antibody according to the invention is coupled to a member of a couple of FRET partners. FRET partner couples
  • the FRET partner pairs preferably consist of a fluorescent donor compound and a fluorescent energy acceptor compound.
  • FRET is defined as a non-radiative energy transfer resulting from a dipole-dipole interaction between a donor and an energy acceptor. This physical phenomenon requires energy compatibility between these molecules. This means that the donor emission spectrum must cover, at least partially, the absorption spectrum of the acceptor. In agreement with Forster's theory, FRET is a process which depends on the distance separating the two molecules, donor and acceptor: when these molecules are close to each other, and the donor compound is excited at a wavelength corresponding to one of its absorption peaks, an energy transfer will take place, causing a decrease in the luminescence emitted at the donor emission wavelength, and an increase in the luminescence emitted at the emission wavelength of the acceptor.
  • Donor-acceptor pairs that can be used to study FRET phenomena are described in particular in the work by Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition, Kluwer academic / plenum publishers, NY (1999)), to which the man of trade can refer to.
  • Energy-giving fluorescent compounds with a long lifespan (> 0.1 ms, preferably in the range 0.5-6 ms), in particular chelates or rare earth cryptates are advantageous since they allow carry out measurements in time resolved, that is to say to measure TR-FRET signals while being freed from the phenomenon of autofluorescence emitted by the measurement medium. They are for this reason and generally preferred for implementing the method according to the invention.
  • Dy3 + dysprosium
  • Sm3 + samarium
  • Nd3 + neodymium
  • Yb3 + ytterbium
  • Er3 + erbium
  • rare earth chelates or cryptates suitable for the purposes of the invention are:
  • Lanthanide cryptâtes comprising one or more pyridine units. Such rare earth cryptates are described, for example, in patents EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 and in international application WO 01/96 877. The terbium (Tb3 +) and europium ( Eu3 +) are particularly suitable for the purposes of the present invention. Lanthanide cryptates are sold by the company Cisbio Bioassays. Mention may be made, by way of nonlimiting example, of the europium cryptates of formulas below (which can be coupled to the compound to be labeled via a reactive group, here for example an NH 2 group):
  • EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 describe chelates composed of a nonadentent ligand such as terpyridine.
  • Lanthanide chelates are sold by the company PerkinElmer.
  • Lanthanide complexes consisting of a chelating agent, such as tetraazacyclododecane, substituted by a chromophore comprising aromatic rings, such as those described by Poole R. et al. in Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterization of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo ", can also be used.
  • the complexes described in application WO 2009/010580 can also be used.
  • Lumi4-Tb terbium cryptate from Lumiphore marketed by Cisbio
  • Ruthenium chelates in particular complexes consisting of a ruthenium ion and several bipyridines such as ruthenium (II) tris (2,2'-bipyridine).
  • the donor fluorescent compound is chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate; a ruthenium chelate; and a quantum dye; chelates and cryptates of europium and terbium being particularly preferred.
  • the fluorescent acceptor compound must have an absorption spectrum which covers the emission spectrum of the donor (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39 (9): 1953-1959) and can be chosen from the following group: allophycocyanins , especially those known as trade name XL665; organic luminescent molecules, such as rhodamines, cyanines (such as Cy5 for example), squaraines, coumarines, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives (sold under the name "Bodipy”), fluorophores known under the name "Atto”, fluorophores known under the name "DY”, compounds known under the name "Alexa”, nitrobenzoxadiazole.
  • allophycocyanins especially those known as trade name XL665
  • organic luminescent molecules such as rhodamines, cyanines (such as Cy5 for example), squaraines, coumarine
  • the fluorescent acceptor compounds are chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole.
  • cyanines and “rhodamines” are to be understood respectively as “cyanine derivatives” and “rhodamine derivatives”. Those skilled in the art know these different commercially available fluorophores.
  • the “Alexa” compounds are sold by the company Invitrogen; the “Atto” compounds are sold by the company Atto-tec; the “DY” compounds are sold by the company Dyomics; the “Cy” compounds are sold by the company Amersham Biosciences; the other compounds are sold by various suppliers of chemical reagents, such as the companies Sigma, Aldrich or Acros.
  • the cyanine or fluorescein derivatives are preferred as fluorescent acceptor compounds.
  • the antibodies according to the invention can be labeled with the fluorophores directly (covalently) or indirectly.
  • at least one of the FRET partners is covalently linked to the first or the second antibody, and even more preferably, the two FRET partners are respectively covalently linked to the first and to the second antibody.
  • the direct labeling of an antibody according to the invention with a donor compound or fluorescent acceptor is carried out by conventional conjugation techniques using the use of reactive groups.
  • the fluorescent donor or acceptor compounds are generally marketed in “functionalized” form, that is to say that they carry a reactive group capable of reacting with a functional group present on the compound to be labeled, in this case, the antibody according to the invention.
  • the reactive group present on the fluorescent donor or acceptor compound is an electrophilic or nucleophilic group which can form a covalent bond when brought into contact with an appropriate nucleophilic or electrophilic group, respectively.
  • electrophilic or nucleophilic groups which can form a covalent bond when brought into contact with an appropriate nucleophilic or electrophilic group, respectively.
  • couples of electrophilic / nucleophilic groups and the type of covalent bond formed when they are brought into contact are listed below:
  • a leaving group chosen from the succinimidyloxy (-OC4H4NO2), sulfosuccinimidyloxy (-OC4H3NO2-SO3H) groups;
  • the commercially available fluorescent donor and acceptor compounds generally have a maleimide function or an activated ester, most often with an NHS (N-hydroxysuccinimidyl) group, which react with the thiol and amine groups respectively and can therefore be used for labeling antibody.
  • the labeled antibodies are characterized by the final molar ratio (RMF) which represents the average number of marker molecules grafted to the antibody according to the invention.
  • the terminal amino group the terminal carboxylate group, the carboxylate groups of aspartic and glutamic acids, the amine groups of the lysines, the groups guanidines of arginines, thiol groups of cysteines, phenol groups of tyrosines, indole rings of tryptophans, thioether groups of methionines, imidazole groups of histidines.
  • Another approach for labeling an antibody according to the invention with a fluorescent compound consists in introducing a reactive group into the antibody, for example an NHS group or a maleimide group, and putting it in the presence of a fluorophore carrying a functional group which will react with the reactive group to form a covalent bond.
  • a reactive group for example an NHS group or a maleimide group
  • the antibody according to the invention can also be labeled with a fluorescent compound indirectly, for example by introducing into the incubation medium a so-called “secondary” antibody, itself covalently linked to a fluorescent compound, this antibody specifically recognizing the antibody according to the invention or a hapten present on this antibody according to the invention (such as a dinitrophenyl group, dogoxigenin, fluorescein, FLAG labels, c-myc, 6-HIS).
  • the secondary antibody can be an anti-species antibody.
  • Another very conventional indirect labeling means consists in attaching biotin to the antibody according to the invention to be labeled, then incubating this biotinylated ligand in the presence of streptavidin labeled with a fluorophore.
  • the labeling of the antibody according to the invention with biotin falls within the general knowledge of a person skilled in the art, and the company Cisbio Bioassays markets, for example, streptavidin labeled with the fluorophore, the commercial name of which is "d2" (ref 610SADLA).
  • the measurement of the TR-FRET signal is carried out after excitation of the measurement medium by a pulsed source in an excitation band of the donor compound, preferably after a delay of 1 to 500 microseconds (ps) and for a period of 10 to 2000 ps. Even more preferably, the delay is 50 ps (time resolved).
  • the TR-FRET signal can be constituted by the intensity of the luminescence measured, or by its lifetime.
  • the antibody according to the invention can be included in a polypeptide. It can also be immobilized on a solid support.
  • Another aspect of the invention relates to a complex comprising an antibody according to the invention, for example a complex comprising an antibody according to the invention and a G alpha protein.
  • the antibody according to the invention can be a “humanized” version, obtained for example by replacing one or more amino acid (s) in the amino acid sequence of the antibody (and in particular in the FRs) by one or more amino acids appearing at the corresponding position (s) in a conventional human tetrameric antibody.
  • Several humanization techniques are described in the literature and those skilled in the art will have no difficulty in using them to prepare the antibodies according to the invention.
  • the antibody according to the invention can be produced by any technique known in the art, such as, without limitation, any chemical, biological, genetic or enzymatic technique, alone or in combination.
  • the antibody according to the invention can be synthesized using a well known solid phase method, preferably using a commercially available polypeptide synthesizer (such as that manufactured by Applied Biosystems, Foster City, California ) and following the manufacturer's instructions.
  • the antibody according to the invention can be synthesized by recombinant DNA techniques known in the literature.
  • the antibody according to the invention can be obtained by expressing a nucleic acid sequence encoding said antibody after incorporation of said nucleic sequence into one or more expression vectors and introduction of such vectors into an appropriate host cell which will express the desired antibody.
  • the antibody according to the invention is purified (or isolated), for example from the culture supernatant of host cells expressing the desired antibody, using known purification techniques, such as purification on a column of chromatography and / or affinity.
  • a third object of the present invention relates to a nucleic acid sequence coding for an antibody according to the invention.
  • a fourth object of the present invention relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence according to the invention.
  • Any type of vector suitable for the production of antibodies can be used in the context of the invention.
  • the vector will comprise the nucleic sequences necessary to produce the antibody according to the invention, for example promoter sequences, regulatory sequences, etc. The preparation of an appropriate vector is widely described in the literature.
  • a fifth object of the invention relates to a cell comprising a vector according to the invention or a nucleic acid sequence according to the invention.
  • the cell according to the invention can be obtained by methods widely described in the literature, for example by transfecting a cell clone with a vector according to the invention or a nucleic acid sequence.
  • the invention is not limited to a particular cell type. Any cell capable of producing antibodies can be used in the context of the invention. They may be eukaryotic cells, such as mammalian cells, for example human or mouse cells or prokaryotic cells, for example bacteria or even yeasts.
  • Example 1 Immunization of llamas and construction of a library of sdAb
  • Two lamas (Lama glama) were immunized subcutaneously with the recombinant human TST-Galphail protein (Galphail protein of sequence UniProt P63096-1 tagged in N-terminal with the TwinStreptag (TST) tag (IBA) via a TEV linker ) linked to GDP or GTPgS.
  • TST TwinStreptag
  • the construction of a VH / VHH library was carried out in the E. coli TGI strain as described previously in (Alvarez-Rueda, Behar et al., 2007, Behar Chames et al. 2009). The diversity of libraries obtained was greater than 10 8 clones.
  • the culture was divided into 10 tubes and centrifuged for 20 minutes at 3000 g at 4 ° C. For each tube, 5 mL of 20% PEG 8000, 2.5 mM NaCl was added to the supernatant in a new clean tube and incubated for 1 h on ice to induce the precipitation of phage particles. The solution was centrifuged for 15 min at 3000 g at 4 ° C and the pellet containing the phages was resuspended in 1 ml of PBS. Another centrifugation step (2 min, 16,000 g) was carried out to remove the bacterial contaminants and 200 ⁇ L of PEG 8000 NaCl were added to the supernatants in a new tube. After 30 min on ice and a final centrifugation (5 min, 16000 g), the pellet containing the phage was resuspended in 1 ml of PBS to obtain a phage-VH ready for use for the selections.
  • a first selection cycle was carried out on a Strep-Tactin plate containing the recombinant human Galphail fused to a Twin-Strep-tag and preloaded with 10 mM GDP for 2 h at 37 ° C and saturated with 2% BSA in PBS for 1 h at room temperature. After 2 hours of incubation at room temperature, the plates were washed with 0.1% Tween PBS and PBS.
  • the bound phages were eluted using a 1 mg / ml trypsin solution (Sigma) for 30 minutes at room temperature with stirring.
  • the phages were recovered and amplified by infection of the bacterial strain TGI.
  • a second selection cycle was carried out in a similar manner on Galphail preloaded with 10 mM GTP.
  • a second strategy consisted of two rounds of selection against Galphail in the absence of nucleotides.
  • a third strategy to promote the selection of VH specific for the active conformation (GTP) of Galphai consisted of two selection cycles on Galphail Twin-Strep-tag preloaded with 10 mM GTPgS, following a depletion step performed on a covered plate of Galphail Twin-Strep-tag preloaded with 10 pM GDP.
  • Individual colonies of TGI were grown in 96 well plates in 400 ⁇ l of 2YTA containing 2% glucose. After overnight growth, the culture was frozen at -80 ° C in 20% glycerol and the rest of the culture was used for the production of soluble VH induced by isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside ( IPTG) in 2YTA. The supernatants containing the VH were used for the screening tests.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the positive phagemids were transformed into the E. coli BL21 DE3 strain.
  • the transformed bacteria were cultivated in 400 ml of 2YTA to a DO value of 6 oo 0.7 and induced with 100 ⁇ M dlPTG for growth overnight at 30 ° C. with stirring.
  • the bacteria were collected by centrifugation and lysed using the Bugbuster TM reagent (Novagen). After centrifugation for 20 minutes at 3000 g, the VHs were purified from the supernatant using TALON® SuperflowTM affinity chromatography (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions.
  • the genes of the VH were cloned into the vector pHLsec (Aricescu AR, Lu W, Jones EY. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Oct; 62 (Pt 10): 1243-50) in fusion with the gene coding for the CH2 domains and CH3 of a human IgG1, followed by a 6histidines label, by gene synthesis (Genecust).
  • the corresponding plasmid was used to transfect the HEK293 line suitable for the suspension, and the cells were incubated with shaking according to the manufacturer's instructions (FreeStyle 293 Expression System, Thermofisher).
  • Example 2 Determination of the affinity constant fKdl of antibodies with a single domain (sdA l according to the invention in FRET fHTRR
  • TST-Galphail protein (Galphail protein of sequence UniProt P63096-1 tagged in N-terminal with the TwinStreptag (TST) tag (IBA) via a TEV linker) was produced in Sf9 insect cells (infection by Baculovirus) then purified on an affinity column via the TwinStreptag (TST) tag (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalog: 2-1208-002)).
  • anti-TST antibody (anti Twin-Strep-Tag, catalog reference 2-1517-001 at IBA) was labeled with the fluorescent donor probe Lumi4®Tb, compatible for TR-FRET detection with the d2 acceptor.
  • the antibody thus obtained was called “anti-TST-Lumi4Tb antibody”.
  • VH variable chains of heavy chain
  • F9 SEQ ID No: 24, F4: SEQ ID No: 40, Bll: SEQ ID No: 16, Thread: SEQ ID No: 4, G6: SEQ ID No: 32, A10: SEQ ID No: 48, E2: SEQ ID No: 64, F2: SEQ ID No: 56 and G7: SEQ ID No: 72
  • the transformed bacteria were cultivated in 400 ml of 2YTA to a DO 6 OO value of 0.7 and induced with 100 mM dlPTG for growth overnight at 30 ° C. with stirring.
  • the bacteria were collected by centrifugation and lysed using the Bugbuster TM reagent (Novagen). After centrifugation for 20 minutes at 3000g, the VHs were purified from the supernatant using TALON® SuperflowTM affinity chromatography (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions.
  • VH genes were cloned into the vector pHLsec (Aricescu AR, Lu W, Jones EY. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Oct; 62 (Pt 10): 1243-50) in fusion with the gene coding for the CH2 and CH3 domains of a human IgGl, followed by a label idhistidines, by gene synthesis (Genecust).
  • the corresponding plasmid was used to transfect the HEK293 line suitable for the suspension, and the cells were incubated with shaking according to the manufacturer's instructions (FreeStyle 293 Expression System, Thermofisher).
  • the supernatants were collected and used directly to purify the HcAb-VH by TALON® SuperflowTM affinity chromatography according to the manufacturer's instructions.
  • the sdAb obtained (VH or HcAb-VH) were labeled with the d2 acceptor fluorescent probe, compatible for TR-FRET detection with the donor Lumi4Tb which was used to label the anti-TST antibody.
  • the labeled antibodies were called "anti-Galphai-d2 antibodies”.
  • the nucleotides GDP and GTPYS were purchased from Sigma Aldrich (respective catalog references G7127 and G8634).
  • the 384-well Low volume, white with white background plates were purchased from Greiner Bio One (Catalog reference 784075).
  • TST-Galphail recombinant protein was prepared 4X for use at 1nM in final concentration in the well (except for other specifications).
  • the GDP or GTPyS nucleotides were prepared 4X for use at 10 mM in final concentration in the well.
  • the anti-TST-Lumi4Tb antibody was prepared 4X for use at 0.25nM in final concentration in the well.
  • the various anti-Galphai-d2 antibodies were prepared 4X to target the final concentrations in the wells indicated in the graphs, up to 200 nM.
  • the non-specific signal (fluorescence background noise) was measured with wells containing only the two detection reagents (labeled with the donor and the acceptor), ie the anti-TST-Lumi4Tb antibody. (donor) and the anti-Galphai-d2 antibody (acceptor), the other components having been replaced by their dilution buffer. 3) Reading the HTRF signal:
  • the plates were incubated at 21 ° C. for 20 h and then the HTRF signal was measured on the PHERAstar reader from BMG Labtech, with the following configuration:
  • the HTRF ratio was calculated according to the following formula:
  • Ratio HTRF Signal at 665nm / Signal at 620nm * 10,000
  • FIG. 2 illustrates the principle of this test.
  • a fixed concentration (1nM) of the purified recombinant Galphail protein tagged with TST (TST-Galphail Protein) was put in the presence of an excess of nucleotide (GDP or GTPgS) (10mM), of a fixed concentration (0.5nM ) of anti-TST antibodies labeled with the donor Lumi4Tb (anti-TST-Lumi4Tb antibodies) and of increasing concentrations of single-domain antibodies of the VH type labeled with the d2 acceptor (anti-Galphai-d2 VH antibodies).
  • GDP or GTPgS nucleotide
  • anti-TST-Lumi4Tb antibodies anti-TST-Lumi4Tb antibodies
  • the total HTRF signal was then obtained.
  • the HTRF signal specific for the interaction between the antibody and the Galphail protein was then calculated by subtracting the non-specific signal from the total signal.
  • the specific HTRF signal data was then analyzed on the GraphPad Prism7 software by the use of a “One site specifies binding” fit.
  • the dissociation constant (Kd) of the antibody for the Galphail protein was then determined.
  • the results which have been obtained with the antibodies which bind to the Galpha protein linked to GTP gamma S and with the antibodies which bind to the Galpha protein linked to GDP are shown in Tables 1 and 2 below. 6) Principle of the HTRF test (TR-FRETi for the determination of the fKcO affinity of heavy chain antibodies of the VH type (HcAb VH)
  • FIG 12 illustrates the principle of the TR-FRET assay (HTRF) which was implemented to determine the affinity (Kd) of the different HcAb-VH for the Galphail protein.
  • a fixed concentration (1nM) of the purified recombinant Galphail protein tagged with TST (TST-Galphail Protein) is brought into contact with an excess of nucleotide (GDP or GTPgS) (10mM), of a fixed concentration (0.5nM) of anti TST antibodies labeled with the donor Lumi4Tb (Ac anti Tag-Donor), of a fixed concentration (50nM) of anti 6HIS antibody labeled with the d2 acceptor (Anti 6HIS-acceptor antibodies, Cisbio Bioassays # 61HISDLF and increasing concentrations of an HcAb-VH antibody tagged with 6HIS (6HIS-Fc-sdAb) The total HTRF signal was then obtained.
  • GDP or GTPgS nucleotide
  • 10mM nucle
  • a condition without Galphail protein is performed to determine the non-specific HTRF signal.
  • the HTRF signal specific for the interaction between HcAb-VH and the Galphail protein was then calculated by subtracting the non-specific signal from the total signal.
  • the specific HTRF signal data was then analyzed on the GraphPad Prism7 software by the use of a “One site specifies binding” fit.
  • the dissociation constant (Kd) of HcAb-VH for the Galphail protein was then determined.
  • the results obtained with the antibodies HCAb-B11, HCAb-F9, HCAb-G7, HCAb-A10 are indicated in Table 3 below.
  • FIGS 3 to 11 show the saturation curves obtained for VH.
  • VH (F9, Fil, Bll, F4 and G6) have a high affinity for the G alpha protein linked to GTP gamma S, with a dissociation constant (Kd) of less than 100 nM going up to lnM for example for B11 antibody.
  • Kd dissociation constant
  • VH GTPgammaS and for empty alphail G protein
  • the VH (A10, G7, F2 and E2) have a high affinity for the protein G alpha linked to the GDP, with a dissociation constant (Kd) of less than 100 nM going up to 14nM for example for the antibody F2.
  • FIGS 13 to 16 show the saturation curves obtained for HcAb VH.
  • the antibodies HcAb-Bll, HcAb-F9, HcAb-G7 and HcAb-A10 have a high affinity for the G protein alpha linked to GDP or GTP gamma S, with a dissociation constant (Kd) of less than 10 nM up to at lnM for example for the antibody HCAb-Bll which binds to the Galpha protein linked to GTP gamma S.
  • Kd dissociation constant

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Abstract

La présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante : FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) et présentant avantageusement une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure à 100 nM.

Description

Anticorps à domaine unique qui se lient à la protéine G alpha
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine des anticorps et notamment le domaine des anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lient à la protéine G alpha. Les sdAb selon l'invention sont particulièrement adaptés pour une utilisation en FRET, par exemple sous la forme d'anticorps à chaîne lourde (HcAbs) couplés à une molécule permettant leur détection.
ARRIERE-PLAN TECHNIQUE
Les "récepteurs couplés aux protéines G", ou "RCPG", sont les récepteurs membranaires les plus représentés chez les mammifères. Ils sont à l'origine d'une grande variété de réponses cellulaires liées à divers processus physiologiques (ex. vision, olfaction, médiation de l'action de nombreuses hormones, de neuropeptides, etc.). Ils peuvent être activés par des ligands de natures très diverses comme par exemple les photons, les ions, les molécules olfactives, les molécules gustatives, les acides aminés, les acides nucléiques, les lipides, les molécules exogènes telles que les cannabinoïdes, les chimiokines, ou encore les hormones.
Ces récepteurs, possèdent sept régions transmembranaires en forme d'hélices alpha comprenant chacune entre 22 et 24 acides aminés. Les RCPG peuvent être classés chez l'homme en 5 familles principales appelées rhodopsine, adhérence, sécrétine, glutamate, Frizzled / Taste2 (Fredriksson et al., 2003). Les RCPG changent d'état de conformation fonctionnelle selon leur niveau d'activation par un ligand par rapport à un état conformationnel basal. Lorsque le RCPG est activé par la liaison d'un ligand spécifique, le changement de conformation du complexe agoniste-récepteur, permet l'activation de la protéine G hétérotrimérique.
Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques qui transduisent un signal d'activation du RCPG en initiant des cascades de réactions biochimiques ayant pour finalité la transduction du signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule. Les protéines G sont situées sur la face interne de la membrane plasmique et sont formées de trois sous- unités (a, b, y). La sous-unité alpha est capable de se lier aux nucléotides guanyliques, soit le GDP, soit le GTP. Le mécanisme d'action du RCPG et de la protéine G communément décrit est présenté dans la Figure 1 et résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous-unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ;
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous-unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes : 1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée « forme vide ». Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous-unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous unité alpha ;
- la sous unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire ;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous unité bêta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif).
Il existe au moins 17 différentes sous-unités alpha : Galpha il, Galpha i2, Galpha i3, Galpha ol, Galpha o2, Galpha q, Galpha 12, Galpha 13, Galpha s, Galpha z, Galpha tl, Galpha t2, Galpha 11, Galpha 14, Galpha 15, Galpha 16 ou encore Galpha gus.
Etant donné l'implication des RCPG dans de nombreuses voies de signalisation des outils ont été générés dans l'art antérieur pour étudier leur activité, avec souvent pour objectif l'identification de nouveaux ligands de ces récepteurs ayant une potentielle activité thérapeutique. On peut citer à titre d'exemple de ces outils, l'utilisation d'un dérivé radioactif non hydrolysable ou lentement hydrolysable du GTP, notamment le GTP-gamma-S, qui se fixe sur la protéine G alpha lorsque le récepteur est activé. Il existe également des systèmes recombinants basés sur la mesure d'une activité enzymatique telle que la luciférase dont l'expression est contrôlée par les seconds messagers produits par l'activation du récepteur. Des anticorps ont également étés synthétisés pour détecter l'activation des RCPG au niveau de la surface cellulaire (Damien Maurel. Oligomérisation des récepteurs couplés aux protéines G: deux ou plus? Application des technologies de FRET en temps résolu au cas du récepteur GABAB. Biologie cellulaire. Université Montpellier I, 2006. Français). On peut également faire référence au brevet EP2723764 B1 qui propose des nano-anticorps qui se lient à l'interface entre la protéine G alpha et la protéine G bêta/gamma, permettant de stabiliser le complexe RCPG/protéine G.
En revanche aucun des outils de l'art antérieur ne permet de détecter de façon spécifique la sous-unité alpha de la protéine G, et encore moins un sdAb qui se lie à la protéine G alpha, en particulier pour une utilisation en FRET. Ainsi, la présente invention propose avantageusement, des anticorps à domaine unique (sdAb), par exemple des anticorps à chaîne lourde (HcAb) qui se lient à la protéine G alpha (protéine G alpha).
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha.
Un premier objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
ledit anticorps présentant une constante de dissociation (Kd) pour la protéine G alpha pleine mesurée en FRET inférieure à 100 nM.
Un deuxième objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
dans laquelle :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ; - CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et - CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
Un troisième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant pour l'anticorps à domaine unique (sdAb) selon l'invention.
Un quatrième objet de la présente invention concerne un vecteur recombinant comprenant la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
Un cinquième objet de la présente invention concerne une cellule comprenant le vecteur selon l'invention ou la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
Sans indication contraire, les termes « anticorps selon l'invention », « anticorps de l'invention », « sdAb selon l'invention » ou « sdAb de l'invention » font référence à la fois au au premier objet selon l'invention et au deuxième objet selon l'invention.
Les objets de la présente invention sont décrits plus précisément ci-après.
FIGURES
Figure 1 : Représente le mécanisme d'activation d'un RCPG et les différents stades d'activation de la protéine G alpha, à savoir la forme inactivée (protéine G alpha liée au GDP) et la forme activée (protéine Galpha liée au GTP).
Figure 2 : Principe de l'essai HTRF (TR-FRET) pour la détermination de l'affinité (Kd) des domaines variables de chaîne lourde (VH), mis en œuvre dans les figures 3 à 11.
Figure 3 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F9 par essai TR-FRET. Le principe de l'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10mM). Un Kd de 32nM est obtenu pour l'interaction VH F9 / protéine Galphail.
Figure 4 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH Fil par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10mM). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction VH Fil / protéine Galphail.
Figure 5 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH Bll par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10pM). Un Kd de lnM est obtenu pour l'interaction VH Bll / protéine Galphail.
Figure 6 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F4 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10mM). Un Kd de 31nM est obtenu pour l'interaction VH F4 / protéine Galphail.
Figure 7 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH G6 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (10pM). Un Kd de 95nM est obtenu pour l'interaction VH G6 / protéine Galphail.
Figure 8 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH A10 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (10mM). Un Kd de 15nM est obtenu pour l'interaction VH A10 / protéine Galphail.
Figure 9 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH G7 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (10pM). Un Kd de 31nM est obtenu pour l'interaction VH G7 / protéine Galphail.
Figure 10 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH F2 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (IOmM). Un Kd de 14nM est obtenu pour l'interaction VH F2 / protéine Galphail. Figure 11 : Détermination de l'affinité (Kd) du VH E2 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 2 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (IOmM). Un Kd de 72nM est obtenu pour l'interaction VH E2 / protéine Galphail.
Figure 12 : Principe de l'essai TR-FRET (HTRF) pour la détermination de l'affinité (Kd) des HcAb de type VH (HcAb VH), mis en œuvre pour les figures 13 à 16.
Figure 13 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-Bll par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (IOmM). Un Kd de lnM est obtenu pour l'interaction HcAb-Bll / protéine Galphail.
Figure 14 : Détermination de l'affinité (Kd) du HCAb-F9 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GTPgS (IOmM). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction HcAb-F9 / protéine Galphail.
Figure 15 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-G7 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (10pM). Un Kd de 5nM est obtenu pour l'interaction HcAb-G7 / protéine Galphail. Figure 16 : Détermination de l'affinité (Kd) du HcAb-A10 par essai TR-FRET. Le principe d'essai détaillé dans la Figure 12 est utilisé. La protéine Galphail est chargée avec un excès de GDP (IOmM). Un Kd de 3nM est obtenu pour l'interaction HcAb-A10 / protéine Galphail.
Figure 17 : Schéma de différentes formes possibles d'anticorps sdAb selon l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les Demandeurs ont mis au point des anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lient à la protéine G alpha avec une bonne affinité pour la protéine G alpha pleine. Ces sdAb constituent des outils particulièrement performants comme agent thérapeutique, comme agent de diagnostic et/ou comme agent de détection de la protéine G alpha, en particulier comme agent de détection de la protéine G alpha dans un procédé de type FRET.
Définitions
Les termes « anticorps anti-protéine G alpha », « anticorps qui se lie à la protéine G alpha » et « anticorps qui se lie spécifiquement à la protéine G alpha » sont interchangeables et désignent un anticorps qui se lie à la protéine G alpha avec une affinité suffisante pour que l'anticorps soit utile comme agent de détection (ex. pour la mise en œuvre d'un FRET), de diagnostic et/ou thérapeutique en ciblant la protéine G alpha.
On entend par « anticorps » un polypeptide codé par un gène d’immunoglobuline capable de se lier à un antigène. Le terme « anticorps » est utilisé ici dans son sens le plus large et englobe diverses structures d'anticorps qui présentent l'activité de liaison à l'antigène souhaité, y compris, mais sans s'y limiter, les anticorps monoclonaux, les anticorps polyclonaux, les anticorps multispécifiques (par exemple, des anticorps bispécifiques) et des fragments d'anticorps. Les anticorps « conventionnels », c'est le cas par exemple des immunoglobulines de type G (IgG) chez l'homme, se présentent sous la forme d'un tétramère comprenant deux paires de chaînes polypeptidiques identiques dites chaînes légères et deux chaînes polypeptidiques identiques dites chaînes lourdes. Un domaine variable se situe au niveau de l’extrémité N-terminale de chacune des chaînes (« VH » pour les chaînes lourdes et « VL » pour les chaînes légères) et les deux domaines variables VH et VL permettent la reconnaissance de l'antigène. Chaque domaine variable comprend généralement 4 « régions charnières » (appelées FRI, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l'antigène, dites « CDR » (appelées CDR1, CDR2, CDR3). En général, chaque domaine variable se présente sous la forme suivante: FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Généralement, c'est le cas par exemple des IgG chez l'homme, la liaison à l'antigène est effectuée par un couple de deux domaines variables (i.e. un domaine variable de chaîne légère VL et un domaine variable de chaîne lourde VH), c'est-à-dire que 6 CDRs sont impliqués dans la formation d'un site de liaison à l'antigène. A l'inverse, pour les anticorps à domaine unique, seulement 3 CDRs sont impliqués dans la formation d'un site de liaison à l'antigène. Ainsi, le site de liaison à l'antigène d'un anticorps à domaine unique est formé par 3 CDRs. Ainsi, les termes « anticorps à domaine unique », « Single domain Antibody » et « sdAb » sont interchangeables et font référence à un anticorps dans lequel la liaison à l'antigène est effectuée par un seul domaine variable. Un sdAb peut être i) un anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne lourde (VH) ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à l’antigène indépendamment de tout autre domaine variable, ii) un anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne légère (VL) ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à l’antigène indépendamment de tout autre domaine variable, ou ii) un anticorps comprenant ou consistant en un domaine variable de chaîne lourde de type VhH (VHH) OU un fragment de celui-ci capable de se lier à l'antigène, qui se lie à l’antigène indépendamment de tout autre domaine variable.
On entend par « anticorps à chaîne lourde de type VH » ou « HcAb VH », un anticorps constitué de deux chaînes lourdes comprenant chacune un domaine variable de type VH. En particulier, chaque chaîne lourde est constituée des fragments CH2 et CH3, et dudit domaine variable de type VH.
On entend par « anticorps à chaîne lourde de type VhH » ou « HcAb VhH », un anticorps constitué de deux chaînes lourdes comprenant chacune un domaine variable de type VHH. En particulier, chaque chaîne lourde est constituée des fragments CH2 et CH3, et dudit domaine variable de type VHH.
Au sens de l'invention, les termes « Protéine Galpha pleine » ou « forme pleine de la protéine G alpha » désignent une protéine Galpha liée au GTP, au GDP ou à un analogue de ceux-ci, par exemple au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable. Ces termes désignent donc la protéine Galpha liée au GDP ou à un analogue du GDP (« Protéine Galpha liée au GDP ») ou la protéine Galpha liée au GTP ou à un analogue du GTP, par exemple au GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable (« Protéine Galpha liée au GTP »). La protéine Galpha pleine (protéine Galpha liée au GDP ou protéine Galpha liée au GTP) est représentée à la Figure 1.
Le terme « GDP » désigne la guanosine diphosphate. Le terme « GTP » désigne la guanosine triphosphate. Le terme « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable » désigne un analogue du GTP qui n'est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par exemple le GTPgammaS (connu également sous les acronymes « GTPgS » et « GTPyS ») (CAS no. 37589-80-3), le GppNHp (CAS no. 148892-91-5) ou le GppCp (CAS no. 10470-57-2).
Au sens de l'invention, les termes « Protéine Galpha vide » ou « forme vide de la protéine G alpha » désignent une protéine Galpha qui n'est pas liée au GTP ou au GDP. La protéine Galpha vide est décrite dans la littérature comme un état transitoire entre la protéine Galpha liée au GDP et la protéine Galpha liée au GTP. La protéine Galpha vide est représentée à la Figure 1.
Le terme "affinité" fait référence à la force de l'ensemble des interactions non-covalentes entre une molécule, par exemple un sdAb et son partenaire, par exemple un antigène tel que la protéine G alpha pleine. L'affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET ou en SPR.
Le terme « FRET » (de l'anglais « Fluorescence Résonance Energy Transfer ») désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle— dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Forster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis. Dans le cadre de la présente invention, la constante de dissociation (Kd) est mesurée par FRET, par exemple comme décrit dans les exemples.
Au sens de la présente invention, l'« homologie » est calculée en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison. L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) communes aux deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions communes est ensuite divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage d'homologie. La détermination du pourcentage d'homologie de séquence peut être effectuée manuellement ou en utilisant des programmes informatiques bien connus. Par "purifié" et "isolé", on entend, en se référant à un anticorps selon l’invention, que l'anticorps est présent en l’absence substantielle d’autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu’utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en poids, plus préférablement au moins 85% en poids, encore plus préférablement au moins 95% en poids, et le plus préférablement au moins 98% en poids d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules présentes.
Anticorps sdAb
Un premier objet de l'invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions déterminantes complémentaires dites « CDRs » (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières dites « FRs » (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I) dont la constante de dissociation (Kd) pour la protéine G alpha pleine mesurée en FRET est inférieure à 100 nM.
Selon le premier objet, le sdAb se lie à la protéine G alpha pleine (soit la protéine G alpha liée au GTP ou un de ses analogue soit la protéine G alpha liée au GDP ou un de ses analogues) avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure à 100 nM, par exemple une constante d'affinité inférieure à 75 nM, inférieure à 50 nM, inférieure à 25 nM ou encore inférieure à 10 nM, par exemple entre 1 et 10 nM, entre 10 et 100 nM, entre 10 et 75 nM ou entre 10 et 50 nM.
Selon le premier objet, le sdAb peut être obtenu par immunisation d'un camélidé comprenant l'administration d'une protéine G alpha pleine, seule ou en combinaison avec un adjuvant tel que par exemple, un sel d'aluminium, l'adjuvant de Freund ou une huile minérale. L'administration peut être faite par voie sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire ou intra-péritonéale, de préférence par voie sous-cutanée à raison d'une dose comprise entre 10 pg et 10 mg. Ladite administration peut être renouvelée plusieurs fois, chaque administration pouvant être espacée d'un ou plusieurs jours afin d'obtenir une réponse immunitaire optimale. Les anticorps générés peuvent alors être récupérés à partir des cellules mononuclées du sang périphérique via des techniques de purification classiques connues de l'homme du métier, par exemple en procédant à une transcription inverse (RT-PCR) des ARNm codant pour cet anticorps afin d'obtenir des ADNc qui vont ensuite être clonés au sein d'un vecteur avant d'être sélectionnés par « phage display lîbrary » en utilisant la protéine G alpha pleine fixée sur une plaque d'ELISA.
En particulier, les anticorps selon l'invention peuvent être obtenus par la mise en œuvre du protocole décrit dans l'Exemple 1.
Dans un mode de réalisation particulier du premier objet de l'invention :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
Les séquences d'acides aminés des CDR1, CDR2 et CDR3 peuvent facilement être combinées les unes avec les autres pour répondre à la formule (I). L'homme du métier sait déterminer sans difficulté dans quelle mesure ces séquences peuvent être combinées de façon à obtenir des sdAb selon l'invention présentant la constante de dissociation (Kd) souhaitée.
Un second objet de la présente invention concerne un anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante : FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
dans laquelle :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
La protéine G alpha peut être d'origine humaine ou animale. Avantageusement, le sdAb selon l'invention se lie à la protéine Galphai (Gai), par exemple la protéine Galphail, la protéine Galphai2 ou la protéine GalphaB. La protéine Galphail d'origine humaine porte l'identifiant UniProt P63096-1 pour l'isoforme 1 et l'identifiant UniProt P63096-2 pour l'isoforme 2. Le gène codant pour la protéine Galphail d'origine humaine est connu sous le nom de « GNAI1 » (Gene ID : 2770, NCBI).
Le sdAb selon l'invention peut se présenter sous différentes formes. Il peut s'agir par exemple d'un domaine variable de chaîne lourde (VH), d'un domaine variable de chaîne lourde de type VhH (VHH), d'un anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH), d'un anticorps à chaîne lourde de type VhH (HcAb VHH), d'un anticorps à chaîne lourde IgG antinouveaux récepteurs d’antigène d’immunoglobuline dérivés des poissons cartilagineux (Ig NAR) ou encore d'un domaine variable dlg NAR (V-NAR). Des exemples de structures d'anticorps selon l'invention sont présentés à la Figure 17. Dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon l'invention :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90%
d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 1, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 2 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 3 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 9, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 10 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 11 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 17, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 18 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 19 ;
CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 25, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 26 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 27 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 33, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 34 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 35 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 41, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 42 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 43 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 49, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 50 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 51 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 57, CDR2 présente au moins 80% d'homoiogie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 58 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 59 ; ou
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 65, CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 66 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 67.
Dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon l'invention :
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 28 SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 60 et SEQ ID NO : 68 ;
- FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 29 SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 61 et SEQ ID NO : 69; et
- FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 30 SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 62 et SEQ ID NO : 70 ; et
- FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 63 et SEQ ID NO : 71.
Avantageusement, dans un mode de réalisation préféré de l'anticorps selon l'invention :
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 5, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 6, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 7 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 8;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 12, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 13, FR3, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 14 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 15;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 20, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 21, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 22 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 23;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 28, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 29, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 30 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 31;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 36, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 37, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 38 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 39;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 44, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 45, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 46 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 47;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 52, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 53, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 54 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 55;
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 60, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 61, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 62 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 63; ou
- FRI présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec un SEQ ID NO : 68, FR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 69, FR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 70 et FR4 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec SEQ ID NO : 71.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'anticorps selon l'invention, la séquence d'acides aminés de formule (I) présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO : 72. L'anticorps selon l'invention peut se lier à la protéine Galpha sous une forme isolée et/ou présente dans un environnement membranaire, par exemple il peut se lier à une protéine Galpha présente dans une préparation de membranes portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéines G alpha.
Etant donné que l'anticorps selon l'invention se lie à la protéine, il n'est pas nécessaire que la protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que l'anticorps selon l'invention puisse se lier à la protéine G.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'anticorps selon l'invention a une meilleure affinité pour la protéine Galpha pleine par rapport à la protéine Galpha vide, en particulier une meilleure affinité pour la protéine Galpha liée au GTP gamma S. Ainsi, le rapport « Kd pour la protéine Galpha vide/Kd pour la protéine Galpha pleine » mesuré en FRET de l'anticorps de l'invention est au moins égal à 2, par exemple au moins égal à 2,5, au moins égal à 5, au moins égal à 10, et :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une des séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34 ; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35.
Dans un second mode de réalisation particulier, l'anticorps selon l'invention a une meilleure affinité pour la la protéine Galpha vide par rapport à la protéine Galpha pleine. Ainsi, le rapport « Kd pour la protéine Galpha p!eine/Kd pour la protéine Galpha vide » mesuré en FRET de l'anticorps de l'invention est au moins égal à 5, par exemple au moins égal à 10, au moins égal à 20, au moins égal à 50, et :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec une des séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 66 ; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59, SEQ ID NO : 67.
L'anticorps selon l'invention est particulièrement avantageux dans la mise en oeuvre d'un FRET, notamment pour détecter une protéine Galpha pleine ou une protéine Galpha vide. L'anticorps selon l'invention, peut être ainsi couplé à une molécule permettant sa détection. Il peut s'agir d'un tag peptidique, par exemple le tag 6XHis. Il peut également s'agir d'une enzyme capable de générer un signal détectable par colorimétrie, fluorescence ou luminescence lorsqu'elle est en présence de son substrat, par exemple la b-galactosidase, la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort. Il peut également s'agir d'un radionucléide, d'un composé fluorescent, d'un composé luminescent ou d'un colorant. Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est couplé à un membre d'un couple de partenaires de FRET. Couples de partenaires de FRET
Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie.
Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle— dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Forster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, et que le composé donneur est excité à une longueur d'onde correspondant à un de ses pics d'absorption, un transfert d'énergie aura lieu, provoquant une diminution de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission du donneur, et une augmentation de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur.
La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l’homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l’ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd édition, Kluwer academic/plenum publishers, NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer.
Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise dans la gamme 0,5-6 ms), en particulier les chélates ou cryptâtes de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET en s'affranchissant du phénomène d'auto- fluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptâtes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés.
De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
Des exemples de chélates ou cryptâtes de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont :
• Les cryptâtes de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptâtes de terbium (Tb3+) et d’europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptâtes de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptâtes d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
T risBiPy-tetraacide-Eu Py-BiPy-tetraacide-Eu
• Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722,
US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets
EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer.
· Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/010580.
• Les cryptâtes de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables.
· Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89).
· Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio
Bioassays.
• Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
· Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine).
• Le chélate de terbium DTPA-csl24 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
• Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 1997, 75: 149-169) :
Tb-W14016
De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptâtes d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
Le composé fluorescent accepteur doit posséder un spectre d'absorption qui recouvre le spectre d'émission du donneur (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39(9):1953-1959) et peut être choisi dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Atto-tec ; les composés « DY» sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines ou de la fluorescéine sont préférés comme composés fluorescents accepteurs.
Marquage des anticorps par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie
Les anticorps selon l'invention peuvent être marqués par les fluorophores de manière directe (covalente) ou indirecte. De manière préférée, au moins un des partenaires de FRET est lié de manière covalente au premier ou au second anticorps, et de manière encore plus préférée, les deux partenaires de FRET sont respectivement liés de manière covalente au premier et au second anticorps.
Le marquage direct d'un anticorps selon l'invention par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme « fonctionnalisée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, l'anticorps selon l'invention.
Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous :
* : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est :
• un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-OC4H4NO2), sulfo- succinimidyloxy (-OC4H3NO2-SO3H) ;
• un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ;
• un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride - OCORa ou -OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyle en Ci-C6, perfluoroalkyle en Ci-C6, alkoxy en Ci-C6, cyclohexyle ;
• le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle.
Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les anticorps marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le nombre moyen de molécules de marqueur greffés à l'anticorps selon l'invention.
Il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les anticorps selon l'invention : le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
Une autre approche pour le marquage d'un anticorps selon l'invention par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans l'anticorps, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente.
Il est important de vérifier que l'anticorps selon l'invention marqué conserve une affinité suffisante pour la protéine Galpha ; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité de l'anticorps selon l'invention marqué pour la protéine Galpha.
L'anticorps selon l'invention peut également être marqué par un composé fluorescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu d'incubation un anticorps dit « secondaire », lui-même lié de manière covalente à un composé fluorescent, cet anticorps reconnaissant de manière spécifique l'anticorps selon l'invention ou bien un haptène présent sur cet anticorps selon l'invention (tel qu'un groupe dinitrophényle, dogoxigénine, la fluorescéine, les étiquettes FLAG, c-myc, 6-HIS). L'anticorps secondaire peut être un anticorps anti-espèce.
Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur l'anticorps selon l'invention à marquer, puis d'incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un fluorophore. Le marquage de l'anticorps selon l'invention par la biotine relève des connaissances générales de l'homme du métier, et la société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec le fluorophore dont la dénomination commerciale est « d2 » (réf 610SADLA).
Mesure du signa! de TR-FRET
La mesure du signal de TR-FRET est effectuée après excitation du milieu de mesure par une source pulsée dans une bande d'excitation du composé donneur, de préférence après un délai de 1 à 500 microsecondes (ps) et pendant une durée de 10 à 2000 ps. De manière encore plus préférée, le délai est de 50 ps (temps résolu).
Le signal de TR-FRET peut être constitué par l'intensité de la luminescence mesurée, soit par sa durée de vie.
L'anticorps selon l'invention peut être compris dans un polypeptide. Il peut également être immobilisé sur un support solide.
Un autre aspect de l'invention concerne un complexe comprenant un anticorps selon l'invention, par exemple un complexe comprenant un anticorps selon l'invention et une protéine G alpha.
L'anticorps selon l'invention peut être une version « humanisé », obtenue par exemple en remplaçant un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence d’acides aminés de l'anticorps (et en particulier dans les FRs) par un ou plusieurs acides aminés apparaissant à la ou aux position(s) correspondante(s) dans un anticorps conventionnel tétramérique humain. Plusieurs techniques d'humanisation sont décrites dans la littérature et l'Homme du métier n'aura aucune difficulté à les mettre en œuvre pour préparer les anticorps selon l'invention.
L'anticorps selon l’invention peut être produit par toute technique connue dans l’art, telle que, sans limitation, toute technique chimique, biologique, génétique ou enzymatique, seule ou en combinaison.
Lorsque la séquence d’acides aminés de l'anticorps désiré est connue, l’Homme de l’art peut facilement produire ledit anticorps par des techniques conventionnelles pour la production de polypeptides. Par exemple, l'anticorps selon l'invention peut être synthétisé en utilisant une méthode en phase solide bien connue, de préférence en utilisant un appareil de synthèse de polypeptides disponible dans le commerce (tel que celui fabriqué par Applied Biosystems, Foster City, Californie) et en suivant les instructions du fabricant. En variante, l'anticorps selon l'invention peut être synthétisé par des techniques d’ADN recombinant connues dans la littérature. Par exemple, l'anticorps selon l'invention peut être obtenu en exprimant une séquence d'acides nucléiques codant ledit anticorps après incorporation de ladite séquence nucléique dans un ou plusieurs vecteurs d’expression et introduction de tels vecteurs dans une cellule hôte appropriée qui exprimera l'anticorps désiré. Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est purifié (ou isolé), par exemple à partir du surnageant de culture de cellules hôtes exprimant l'anticorps désiré, en mettant en œuvre des techniques de purification connues, telle que la purification sur colonne de chromatographie et/ou d'affinité.
Autres objets
Un troisième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant pour un anticorps selon l'invention.
Un quatrième objet de la présente invention concerne un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Tout type de vecteur adapté à la production d'anticorps peut être utilisé dans le cadre de l'invention. Le vecteur comprendra les séquences nucléiques nécessaires pour produire l'anticorps selon l'invention, par exemple des séquences promotrices, des séquences régulatrices, etc. La préparation d'un vecteur approprié est largement décrite dans la littérature.
Un cinquième objet de l'invention concerne une cellule comprenant un vecteur selon l'invention ou une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. La cellule selon l'invention peut être obtenue par des méthodes largement décrites dans la littérature, par exemple en transfectant un clone cellulaire avec un vecteur selon l'invention ou une séquence d'acides nucléiques. L'invention n'est pas limitée à un type cellulaire particulier. Toute cellule capable de produire des anticorps peut être utilisée dans le cadre de l'invention. Il peut s'agir de cellules eucaryotes, telles que les cellules de mammifères, par exemple les cellules humaines ou de souris ou de cellules procaryotes, par exemple les bactéries ou encore les levures.
L'invention sera davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l'invention. LISTAGE DE SEQUENCES
EXEMPLES
Exemple 1 : Immunisation de lamas et construction d'une bibliothèque de sdAb
Deux lamas (Lama glama) ont été immunisés par voie sous-cutanée avec la protéine TST- Galphail humaine recombinante (protéine Galphail de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) liée au GDP ou au GTPgS. La construction d'une bibliothèque de VH / VHH a été réalisées dans la souche E. coli TGI comme décrit précédemment dans (Alvarez-Rueda, Behar et al., 2007, Behar Chames et al. 2009). La diversité des bibliothèques obtenue était supérieure à 108 clones.
Production de particules de phage-VH / VHH
Cinquante mL de 2YTA (2YT contenant 100 pg/mL d’ampicilline) ont été inoculés avec 50 pL de la bibliothèque de bactéries et incubés à 37°C sous agitation (250 tr/min) jusqu'à une D060O comprise entre 0,4 et 0,6. Les bactéries ont été infectées par le phage KM 13 en utilisant une multiplicité d'infection de 20, pendant 30 min à 37°C sans agitation. La culture a été centrifugée pendant 10 minutes à 3000 g, et le culot bactérien a été remis en suspension dans 250 ml de 2YTA contenant 50 pg/ml de kanamycine pour produire les phages-VH pendant une nuit à 30°C sous agitation. La culture a été divisée en 10 tubes et centrifugée pendant 20 minutes à 3000 g à 4 °C. Pour chaque tube, 5 mL de 20% de PEG 8000, 2,5 mM de NaCI ont été ajoutés au surnageant dans un nouveau tube propre et incubés pendant 1 h sur de la glace pour induire la précipitation des particules phagiques. La solution a été centrifugée pendant 15 min à 3000 g à 4°C et le culot contenant les phages a été remis en suspension dans 1 ml de PBS. Une autre étape de centrifugation (2 min, 16000 g) a été réalisée pour éliminer les contaminants bactériens et 200 pL de PEG 8000 NaCI ont été ajoutés aux surnageants dans un nouveau tube. Après 30 min sur de la glace et une dernière centrifugation (5 min, 16000 g), le culot contenant le phage a été remis en suspension dans 1 mL de PBS pour obtenir un phage-VH prêt à l'emploi pour les sélections.
Sélection de VH / VHH par phage display
Après une étape de déplétion de la bibliothèque de phage sur plaque contenant de la Strep- Tactin immobilisée (IBA #2-4101-001) pour éviter la sélection de VH anti-Strep-Tactin, un premier cycle de sélection a été effectué sur une plaque Strep-Tactin contenant la Galphail recombinante humaine fusionnée à un Twin-Strep-tag et pré-chargée avec 10 mM de GDP pendant 2h à 37 °C et saturé avec 2% de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. Après 2 heures d'incubation à température ambiante, les plaques ont été lavées avec du Tween PBS à 0,1% et du PBS. Les phages liés ont été élues en utilisant une solution de trypsine à 1 mg/ml (Sigma) pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation. Les phages ont été récupérés et amplifiés par infection de la souche bactérienne TGI. Un second cycle de sélection a été effectué de manière similaire sur Galphail pré-chargée avec 10 mM de GTP. Une seconde stratégie a consisté en deux tours de sélection contre la Galphail en absence de nucléotides. Une troisième stratégie visant à favoriser la sélection de VH spécifiques de la conformation active (GTP) de Galphai a consisté en deux cycles de sélection sur Galphail Twin-Strep-tag préchargée de GTPgS 10 mM, suite à une étape de déplétion réalisée sur plaque recouverte de Galphail Twin-Strep-tag préchargée par 10 pM de GDP. Des colonies individuelles de TGI ont été cultivées dans des plaques 96 deep well dans 400 ul de 2YTA contenant 2% de glucose. Après une croissance d'une nuit, la culture a été congelée à -80°C dans du glycérol à 20% et le reste de la culture a été utilisé pour la production de VH soluble induite par l'isopropyl^-D-thiogalactopyranoside (IPTG) dans du 2YTA. Les surnageants contenant les VH ont été utilisés pour les tests de criblage.
Production et purification de VH.
Pour la production de VH à grande échelle, les phagemides positifs ont été transformés dans la souche E. coli BL21 DE3. Les bactéries transformées ont été cultivées dans 400 ml de 2YTA jusqu'à une valeur de D06oo de 0,7 et induites avec 100 pM dlPTG pour une croissance pendant une nuit à 30°C sous agitation. Les bactéries ont été récupérées par centrifugation et lysées en utilisant le réactif Bugbuster™ (Novagen). Après centrifugation pendant 20 minutes à 3000 g, les VH ont été purifiés à partir du surnageant en utilisant une Chromatographie d'affinité TALON® SuperflowTM (GE Healthcare) selon les instructions du fabricant.
Production des HcAb-VH
Les gènes des VH ont été clonés dans le vecteur pHLsec (Aricescu AR, Lu W, Jones EY. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Oct;62(Pt 10): 1243-50) en fusion avec le gène codant pour les domaines CH2 et CH3 d'une IgGl humaine, suivi d'une étiquette 6histidines, par synthèse de gêne (Genecust). Le plasmide correspondant a été utilisé pour transfecter la lignée HEK293 adaptée à la suspension, et les cellules ont été incubées sous agitation suivant les instructions du fabricant (FreeStyle 293 Expression System, Thermofisher). Après 5 jours, les surnageants ont été récupérés et directement utilisés pour purifier les HcAb par chromatographie d'affinité TALON® SuperflowTM selon les instructions du fabricant. Exemple 2 : Détermination de la constante d'affinité fKdl d'anticorps à domaine unique (sdA l selon l'invention en FRET fHTRR
Matériel :
La protéine TST-Galphail recombinantes (protéine Galphail de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) a été produite dans des cellules d'insectes Sf9 (infection par Baculovirus) puis purifiée sur une colonne d'affinité via le tag TwinStreptag (TST) (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalogue : 2-1208-002)).
Un anticorps anti-TST (anti Twin-Strep-Tag, référence catalogue 2-1517-001 chez IBA) a été marqué avec la sonde fluorescente donneur Lumi4®Tb, compatible pour une détection TR- FRET avec l'accepteur d2. L'anticorps ainsi obtenu a été appelé « anticorps anti TST- Lumi4Tb ».
Pour la production des neuf domaines variables de chaîne lourde (VH) (F9 : SEQ ID No : 24, F4 : SEQ ID No : 40, Bll : SEQ ID No : 16, Fil : SEQ ID No : 4, G6 : SEQ ID No : 32, A10 : SEQ ID No : 48, E2 : SEQ ID No : 64, F2 : SEQ ID No : 56 et G7 : SEQ ID No : 72) à grande échelle, les phagemides codant lesdits VH ont été transformés dans la souche E. coli BL21 DE3. Les bactéries transformées ont été cultivées dans 400 ml de 2YTA jusqu'à une valeur de D06OO de 0,7 et induites avec 100 mM dlPTG pour une croissance pendant une nuit à 30°C sous agitation. Les bactéries ont été récupérées par centrifugation et lysées en utilisant le réactif Bugbuster™ (Novagen). Après centrifugation pendant 20 minutes à 3000g, les VH ont été purifiés à partir du surnageant en utilisant une Chromatographie d'affinité TALON® SuperflowTM (GE Healthcare) selon les instructions du fabricant.
Pour la production des anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb-VH), les gènes les VH ont été clonés dans le vecteur pHLsec (Aricescu AR, Lu W, Jones EY. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Oct;62(Pt 10): 1243-50) en fusion avec le gène codant pour les domaines CH2 et CH3 d'une IgGl humaine, suivi d'une étiquette ôhistidines, par synthèse de gène (Genecust). Le plasmide correspondant a été utilisé pour transfecter la lignée HEK293 adaptée à la suspension, et les cellules ont été incubées sous agitation suivant les instructions du fabricant (FreeStyle 293 Expression System, Thermofisher). Après 5 jours, les surnageants ont été récupérés et directement utilisés pour purifier les HcAb-VH par chromatographie d'affinité TALON® SuperflowTM selon les instructions du fabricant. Les sdAb obtenus (VH ou HcAb-VH) ont été marqués avec la sonde fluorescente accepteur d2, compatible pour une détection TR-FRET avec le donneur Lumi4Tb qui a été utilisé pour marquer l'anticorps anti-TST. Les anticorps marqués ont été appelés « anticorps anti Galphai-d2 ».
Les nucléotides GDP et GTPYS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G7127 et G8634).
Les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
Méthode :
1) Préparation des réactifs :
Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, NaCI lOmM, BSA 0,1%. La protéine recombinante TST-Galphail a été préparée 4X pour une utilisation à lnM en concentration finale dans le puits (hormis autres spécifications). Les nucléotides GDP ou GTPyS ont été préparés 4X pour une utilisation à 10 mM en concentration finale dans le puits. L'anticorps anti TST-Lumi4Tb a été préparé 4X pour une utilisation à 0.25nM en concentration finale dans le puits. Les différents anticorps anti Galphai-d2 ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits indiquées sur les graphiques, allant jusqu'à 200 nM.
2) Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits :
- Protéine TST-Galphail : 5pL
- Nucléotides (GDP ou GTPgS) : 5pL
- Anticorps anti TST-Lumi4Tb (donneur) : 5pL
- Anticorps anti Galphai-d2 (accepteur) : 5pL
Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits ne contenant que les deux réactifs de détection (marqués avec le donneur et l'accepteur), c'est- à-dire l'anticorps anti TST-Lumi4Tb (donneur) et l'anticorps anti Galphai-d2 (accepteur), les autres composants ayant été remplacés par leur tampon de dilution. 3) Lecture du signal HTRF :
Les plaques ont été incubées à 21°C pendant 20h puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar de chez BMG Labtech, avec la configuration suivante :
- Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm)
- Excitation : laser, 40 flashs
- Fenêtre de lecture : délais : 60ps - Intégration : 400ps
4) Traitement du signal :
A partir des signaux bruts à 665nm et 620nm, le ratio HTRF a été calculé selon la formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm / Signal à 620nm * 10,000
5) Principe de l'essai TR-FRET ('HTRF') pour la détermination de l'affinité fKd) des domaines variables de chaîne lourde VH
Le test TR-FRET (HTRF) a permis de déterminer l'affinité (Kd) des différents anticorps pour la protéine Galphail, la Figure 2 illustre le principe de ce test. Une concentration fixe (lnM) de la protéine Galphail recombinante purifiée et tagguée avec TST (Protéine TST-Galphail) a été mise en présence d'un excès de nucléotide (GDP ou GTPgS) (10mM), d'une concentration fixe (0.5nM) d'anticorps anti TST marqué avec le donneur Lumi4Tb (Anticorps anti TST-Lumi4Tb) et de concentrations croissantes d'anticorps à domaine unique de type VH marqués avec l'accepteur d2 (Anticorps VH anti Galphai-d2). Le signal HTRF total a été alors obtenu.
En parallèle, une condition sans protéine Galphail a été réalisée pour déterminer le signal HTRF non spécifique.
Le signal HTRF spécifique de l'interaction entre l'anticorps et la protéine Galphail a alors été calculé par soustraction du signal non spécifique au signal total. Les données du signal HTRF spécifique ont ensuite été analysées sur le logiciel GraphPad Prism7 par l'utilisation d'un fit « One site spécifie binding ». La constante de dissociation (Kd) de l'anticorps pour la protéine Galphail a alors été déterminée. Les résultats qui ont été obtenus avec les anticorps qui se lient à la protéine Galpha liée au GTP gamma S et avec les anticorps qui se lient à la protéine Galpha liée au GDP sont indiqués dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessous. 6) Principe de l'essai HTRF (TR-FRETi pour la détermination de l'affinité fKcO des anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH)
La Figure 12 illustre le principe de l'essai TR-FRET (HTRF) qui a été mis en œuvre pour déterminer l'affinité (Kd) des différents HcAb-VH pour la protéine Galphail. Une concentration fixe (lnM) de la protéine Galphail recombinante purifiée et tagguée avec TST (Protéine TST-Galphail) est mise en présence d'un excès de nucléotide (GDP ou GTPgS) (10mM), d'une concentration fixe (0.5nM) d'anticorps anti TST marqué avec le donneur Lumi4Tb (Ac anti Tag-Donneur), d'une concentration fixe (50nM) d'anticorps anti 6HIS marqué à l'accepteur d2 (Anticorps anti 6HIS-accepteur, Cisbio Bioassays #61HISDLF et de concentrations croissantes d'un anticorps HcAb-VH taggué au 6HIS (6HIS-Fc-sdAb). Le signal HTRF total a alors été obtenu.
En parallèle, une condition sans protéine Galphail est réalisée pour déterminer le signal HTRF non spécifique.
Le signal HTRF spécifique de l'interaction entre le HcAb-VH et la protéine Galphail a alors été calculé par soustraction du signal non spécifique au signal total. Les données du signal HTRF spécifique ont ensuite été analysées sur le logiciel GraphPad Prism7 par l'utilisation d'un fit « One site spécifie binding ». La constante de dissociation (Kd) du HcAb-VH pour la protéine Galphail a alors été déterminée. Les résultats obtenus avec les anticorps HCAb- Bll, HCAb-F9, HCAb-G7, HCAb-A10 sont indiqués dans le tableau 3 ci-dessous.
Résultats :
Les Figures 3 à 11 présentent les courbes de saturation obtenues pour les VH.
Les VH (F9, Fil, Bll, F4 et G6) ont une affinité élevée pour la protéine G alpha liée au GTP gamma S, avec une constante de dissociation (Kd) inférieure à 100 nM allant jusqu'à lnM par exemple pour l'anticorps Bll.
Tableau 1 : Affinité (Kd en nM) des VH_pour la protéine G alphail liée au
GTPgammaS et pour la protéine G alphail vide Les VH (A10, G7, F2 et E2) présentent une affinité élevée pour la protéine G alpha liée au GDP, avec une constante de dissociation (Kd) inférieure à 100 nM allant jusqu'à 14nM par exemple pour l'anticorps F2.
Tableau 2 : Affinité (Kd en nM) des VH pour la protéine G alphail liée au GDP et pour la protéine G alphail vide
Les Figures 13 à 16 présentent les courbes de saturation obtenues pour les HcAb VH.
Les anticorps HcAb-Bll, HcAb-F9, HcAb-G7 et HcAb-A10 présentent une affinité élevée pour la protéine G alpha liée au GDP ou au GTP gamma S, avec une constante de dissociation (Kd) inférieure à 10 nM allant jusqu'à lnM par exemple pour l'anticorps HCAb-Bll qui se lie à la protéine Galpha liée au GTP gamma S.
Tableau : Affinité (Kd en nM) des HcAb-VH pour la protéine G alphail liée au
GDP ou au GTPgammaS

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
ledit anticorps présentant une constante de dissociation (Kd) pour la protéine G alpha pleine mesurée en FRET inférieure à 100 nM.
2. Anticorps selon la revendication 1, dans lequel :
CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;
CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et
CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
3. Anticorps à domaine unique (sdAb) qui se lie à la protéine G alpha comprenant une séquence d'acides aminés constituée de 3 régions CDR (CDR1 à CDR3) et de 4 régions charnières (FRI à FR4) selon la formule (I) suivante :
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)
dans laquelle :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 57 et SEQ ID NO : 65 ;
- CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 66; et
- CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 67.
4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel :
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 1, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 2 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 3 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 9, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 10 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 11 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 17, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 18 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 19 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 25, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 26 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 27 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 33, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 34 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 35 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 41, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 42 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 43 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 49, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 50 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 51 ;
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 57, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 58 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 59 ; ou
- CDR1 présente au moins 80% d'homologie avec un SEQ ID NO : 65, CDR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 66 et CDR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 67.
5. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel :
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 28 SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 60 et SEQ ID NO : 68 ;
- FR2 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 29 SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 61 et SEQ ID NO : 69; et
- FR3 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 30 SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 62 et SEQ ID NO : 70 ; et
- FR4 présente au moins 80% d'homologie avec une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 63 et SEQ ID NO : 71.
6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel :
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 5, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 6 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 7 ;
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 12, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 13 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 14 ;
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 20, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 21 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 22 ;
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 28, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 29 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 30 ;
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 36, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 37 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 38 ; - FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 44, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 45 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 46 ;
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 52, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 53 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 54 ;
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 60, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 61 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 62 ; ou
- FRI présente au moins 80% d'homologie avec un SEQ ID NO : 68, FR2 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 69 et FR3 présente au moins 80% d'homologie avec SEQ ID NO : 70.
7. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ladite séquence d'acides aminés de formule (I) a au moins 80% d'homologie avec une séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID
NO : 40, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO : 72.
8. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ladite séquence d'acides aminés de formule (I) a 100% d'homologie avec une séquences d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 40,
SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 64 et SEQ ID NO : 72.
9. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ledit anticorps étant choisi parmi un domaine variable de chaîne lourde (VH), un domaine variable de chaîne lourde de type VhH (VHH), un anticorps à chaîne lourde de type VH (HcAb VH), d'un anticorps à chaîne lourde de type VhH (HcAb VHH), un anticorps à chaîne lourde IgG anti-nouveaux récepteurs d’antigène d’immunoglobuline dérivés des poissons cartilagineux (Ig NAR) ou un domaine variable dlg NAR (V-NAR).
10. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit anticorps étant couplé à une molécule permettant la détection dudit anticorps.
11. Anticorps selon la revendication 10, ladite molécule étant choisie parmi un tag peptidique, une enzyme, un radionucléide, un composé fluorescent, un composé luminescent, un colorant, avantageusement un membre d'un couple de partenaires de FRET.
12. Séquence d'acides nucléiques codant pour un anticorps à domaine unique (sdAb) selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Vecteur recombinant comprenant la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 12.
14. Cellule comprenant le vecteur selon la revendication 13 ou la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 12.
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