EP4097133A1 - Anticorps anti-proteine g alpha - Google Patents

Anticorps anti-proteine g alpha

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EP4097133A1
EP4097133A1 EP21707328.7A EP21707328A EP4097133A1 EP 4097133 A1 EP4097133 A1 EP 4097133A1 EP 21707328 A EP21707328 A EP 21707328A EP 4097133 A1 EP4097133 A1 EP 4097133A1
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EP
European Patent Office
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antibody
acid sequence
gtp
amino acid
sequence seq
Prior art date
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Pending
Application number
EP21707328.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Elodie DUPUIS
Thomas ROUX
Eric Trinquet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cisbio Bioassays SAS
Original Assignee
Cisbio Bioassays SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Cisbio Bioassays SAS filed Critical Cisbio Bioassays SAS
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Pending legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to novel antibodies or antibody fragments capable of binding to the G alpha protein.
  • G proteins are heterotrimeric proteins (3 subunits: alpha, beta and gamma) which are activated by RCPGs.
  • GPCRs Through GPCRs, the G proteins have a role of transducing a signal from outside the cell to the inside of the cell (i.e. cellular response to an external stimulus). Their commonly described mechanism of action is summarized below:
  • the alpha subunit of the G protein is bound to the nucleotide GDP (full G protein bound to GDP);
  • the latter binds to the alpha subunit of the G protein and initiates a process of activation of the G protein consisting of two steps: 1) the release of GDP from the G protein to give a G protein empty, and the formation of an inactive RCPG / protein-G-empty complex, and 2) the binding of GTP which leads to the formation of an active G protein, in the form of GTP (full G protein bound to GTP).
  • the G protein bound to the receptor is in a form called “empty form”. This state is described in the literature as being transient since it is described that the GTP nucleotide binds rapidly to the alpha subunit of the G protein.
  • the beta / gamma subunits of the activated G protein dissociate from the alpha subunit;
  • the alpha subunit of the full G protein bound to GTP then binds to the effectors to activate them.
  • the effectors in turn activate signaling pathways leading to a cellular response;
  • Antibodies have also been synthesized to detect the activation of GPCRs at the cell surface level [1]. Reference may also be made to patent EP2723764 B1 which proposes nano-antibodies which bind to the interface between the alpha G protein and the beta / gamma G protein, making it possible to stabilize the RCPG / G protein complex.
  • the inventors have developed antibodies or fragments of antibodies for detecting the activation of an RCPG by the implementation of a RET method which uses a GTP labeled by a member of a pair of partners by RET.
  • the inventors have also shown that these antibodies or antibody fragments have these properties because they are capable of binding to the G alpha protein in a very particular area.
  • a first object of the present invention relates to an antibody or an antibody fragment capable of binding to the G alpha protein, which comprises:
  • variable domain of a heavy chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 1, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO : 3, and
  • variable domain of a light chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 4, a CDR2 of DTS amino acid sequence (ie the three amino acids Asp Thr Ser), and a CDR3 of sequence d amino acids SEQ ID NO: 5.
  • a second object of the present invention relates to an antibody or an antibody fragment which competes for binding to the alpha G protein with the antibody or antibody fragment of the first object of the invention.
  • a third subject of the present invention relates to a composition comprising the antibody or the antibody fragment according to the invention.
  • a fourth object of the present invention relates to a kit-of-parts (kit of reagents in French) comprising (i) the antibody or the antibody fragment according to the invention or the composition according to the invention and ( ii) a source of GTP labeled with a member of a pair of RET partners.
  • a fifth object of the present invention relates to a nucleic acid sequence encoding the antibody or the antibody fragment according to the invention.
  • a sixth object of the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid sequence according to the invention.
  • a seventh object of the present invention relates to a cell comprising the vector according to the invention or the nucleic acid sequence according to the invention.
  • anti-G alpha protein antibody "anti-G alpha antibody” or “antibody capable of binding to the G alpha protein” (or antibody fragment) are interchangeable and denote an antibody (or a antibody fragment) which binds to the G alpha protein with sufficient affinity to be used as a detection agent (e.g. for the implementation of a RET), diagnostic and / or therapeutic by targeting the G alpha protein .
  • a detection agent e.g. for the implementation of a RET
  • antibody also called “immunoglobulin” denotes a heterotetramer consisting of two heavy chains of about 50-70 kDa each (called the H chains for Heavy) and two light chains of about 25 kDa each ( say L chains for Light), linked together by intra- and inter-chain disulfide bridges.
  • Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain, called VL for the light chain, VH for the heavy chain, and in the C-terminal position, of a constant region, consisting of a single domain called CL for the light chain and three or four domains called CH1, CH2, CH3, CH4, for the heavy chain.
  • Each variable domain generally comprises 4 “hinge regions” (called FRI, FR2, FR3, FR4) and 3 regions directly responsible for binding with the antigen, called “CDR” (called CDR1, CDR2, CDR3).
  • the antibody may be, for example, a mammalian antibody, such as a murine antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • chimeric antibody is meant an antibody in which the sequences of the variable regions of the light chains and of the heavy chains belong to a different species from that of the sequences of constant regions of the light chains and of the heavy chains.
  • the sequences of the variable regions of the heavy and light chains are preferably of murine origin while the sequences of the constant regions of the heavy and light chains belong to a non-murine species.
  • all species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular man, monkey, suidae, bovidae, equidae, felidae, canidae or even birds, this list not being exhaustive.
  • the chimeric antibodies according to the invention contain sequences of constant regions of heavy and light chains of human origin and sequences of variable regions of heavy and light chains of murine origin.
  • humanized antibody is meant an antibody of which all or part of the sequences of the regions involved in the recognition of the antigen (the hypervariable regions or CDR: Complementarity Determining Region) and sometimes certain amino acids of the FR regions (regions Framework) are of non-human origin while the sequences of constant regions and variable regions not involved in antigen recognition are of human origin.
  • human antibody is meant an antibody containing only human sequences, both for the variable and constant regions of the light chains and for the variable and constant regions of the heavy chains.
  • antibody fragment means any part of an immunoglobulin obtained by enzymatic digestion or obtained by bioproduction comprising at least one disulfide bridge and which is capable of binding to the antigen recognized by the whole antibody , for example Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fab'-SH.
  • the enzymatic digestion of immunoglobulins by papain generates two identical fragments, which are called Fab fragments (Fragment antigen binding), and an Fc fragment (Crystallizable fragment).
  • Enzymatic digestion of immunoglobulins by pepsin generates an F (ab ') 2 fragment and an Fc fragment split into several peptides.
  • F (ab ') 2 is formed from two Fab' fragments linked by inter-chain disulfide bridges.
  • the Fab parts consist of the variable regions and the CH1 and CL domains.
  • the Fab 'fragment consists of the Fab region and of a hinge region.
  • Fab'-SH refers to an Fab 'fragment in which the cysteine residue of the hinge region carries a free thiol group.
  • affinity refers to the strength of all the non-covalent interactions between a molecule, for example an antibody or an antibody fragment and the recognized antigen, for example an antigen such as the protein.
  • G alpha. Affinity is generally represented by the dissociation constant (Kd).
  • the dissociation constant (Kd) can be measured by well known methods, for example in FRET or in SPR.
  • identity is calculated by comparing two sequences aligned in a comparison window.
  • the alignment of the sequences makes it possible to determine the number of positions (nucleotides or amino acids) in common for the two sequences in the comparison window.
  • the number of positions in common is therefore divided by the total number of positions in the comparison window and multiplied by 100 to obtain the percentage of identity.
  • the determination of the percent sequence identity can be done manually or by well known computer programs.
  • the identity or the homology corresponds to at least one substitution, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substitutions , of an amino acid residue, preferably at least one substitution of an amino acid residue carried out conservatively.
  • "Conservatively accomplished amino acid residue substitution” involves replacing one amino acid residue with another amino acid residue, having a side chain having similar properties.
  • the families of amino acids possessing side chains with similar properties are well known, one can quote for example the basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), the acid side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid) , polar and uncharged side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg, glycine, cysteine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine , tryptophan), beta-branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • the basic side chains eg, lysine, arginine, histidine
  • the acid side chains eg, aspartic
  • the antibodies or fragments of homologous antibodies or "variants of antibodies or of fragments of antibodies” that is to say antibodies or fragments of antibodies having the same function
  • a person skilled in the art uses his general knowledge to determine the number of substitutions which can be made and their location in order to be able to preserve the function of the antibody or of the antibody fragment.
  • the antibodies or antibody fragments can therefore be tested by binding methods, such as, for example, the ELISA method, the affinity chromatography method, etc.
  • the antibody variants or antibody fragments can be generated, for example, by the “phage display” method making it possible to generate a phage library.
  • a large number of methods are known in order to generate a “phage display” library and target the antibody variants or antibody fragments having the desired functional characteristics.
  • purified and isolated is meant, with reference to an antibody or an antibody fragment according to the invention, that the antibody is present in the substantial absence of other biological macromolecules of the same type.
  • purified as used herein preferably means at least 75 wt%, more preferably at least 85 wt%, still more preferably at least 95 wt%, and most preferably at least 98 wt%. antibody, relative to all the macromolecules present.
  • G protein denotes a hetero-trimeric protein composed of three subunits called G alpha protein, G beta protein and G gamma protein.
  • G alpha protein designates the alpha subunit of the G protein.
  • the G alpha protein have two domains, the GTPase domain, and the alpha helix domain.
  • G alpha proteins There are at least 20 different G alpha proteins, which can be classified into the following major protein families: G alphas (known to activate adenylate cyclase to increase cAMP synthesis), G alphai (known to inhibit adenylate cyclase), G alphaolf (associated with olfactory receptors), G alphat (known to transduce visual signals in the retina in conjunction with rhodopsin), G alphaq (known to stimulate phospholipase C) or the G alpha family !
  • the G alpha protein can be chosen from the G alphai, G alphao and / or G alphaz protein.
  • the G alphai protein can be chosen from the G alphail, G alphai2 and G alphai3 protein.
  • the alphai G protein can be of human or animal origin.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention binds to the G alphai, G alphao and / or G alphaz protein, for example it binds to the G alphail protein, to the G alphai2 protein. and / or the G protein alphai3.
  • the alphail G protein of human origin carries the identifier UniProt P63096-1 for isoform 1 and the UniProt identifier P63096-2 for isoform 2.
  • the gene encoding the G alphail protein of human origin is known as the name "GNAI1" (Gene ID: 2770, NCBI).
  • GTP denotes guanosine triphosphate
  • non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP denotes an analogue of GTP which is not hydrolyzed or only slightly hydrolyzed to GDP. Mention may be made, for example, of GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), GppNHp (CAS no. 148892-91-5) or GppCp (CAS no. 10470-57-2).
  • non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a member of a RET partner pair or “labeled non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP” are interchangeable and denote either a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a member of a donor RET partner pair ("donor GTP”), either a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled by a member of an acceptor RET partner pair (“acceptor GTP”)
  • RET Resonance Energy Transfer
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • FRET is defined as a non-radiative energy transfer resulting from a dipole-dipole interaction between an energy donor and an acceptor. This physical phenomenon requires energy compatibility between these molecules. This means that the donor's emission spectrum must overlap, at least partially, the absorption spectrum of the acceptor.
  • FRET is a process which depends on the distance separating the two molecules, donor and acceptor: when these molecules are at proximity to each other, a FRET signal will be emitted.
  • the dissociation constant (Kd) between an antibody and its target can be measured by FRET, for example as described in the examples.
  • BRET (from the English “Bioluminescence Resonance Energy Transfer”) designates the transfer of energy between a bioluminescent molecule and a fluorescent molecule.
  • a first object of the invention relates to an antibody or an antibody fragment capable of binding to the G alpha protein, which comprises:
  • variable domain of a heavy chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 1, a CDR2 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO : 3, and
  • variable domain of a light chain comprising a CDR1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 4, a CDR2 of DTS amino acid sequence (ie the three amino acids "Asp Thr Ser", that is to say the three amino acids aspartic acid, threonine and serine), and a CDR3 of amino acid sequence SEQ ID NO: 5.
  • variable domain of the heavy chain can include:
  • an IRF exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 6,
  • an FR2 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 7,
  • an FR3 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 8, and / or
  • variable domain of the light chain can include:
  • an IRF exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 10,
  • an FR2 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 11,
  • an FR3 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 12, and / or
  • an FR4 exhibiting at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or even 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 13.
  • variable domain of the heavy chain includes:
  • variable domain of the light chain includes:
  • variable domain of the heavy chain can have at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95 % homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 14, and the variable domain of the chain slight can have at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99 % or 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15.
  • the invention relates to an antibody or antibody fragment in which:
  • variable domain of the heavy chain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98 %, at least 99% or 100% homology homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 14;
  • variable domain of the light chain has at least 80% homology, preferably at least 90% homology, for example at least 95% homology, at least 96%, at least 97%, at least 98 %, at least 99% or 100% homology homology with the amino acid sequence SEQ ID NO: 15; and
  • the CDR1 of the heavy chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1
  • the CDR2 of the heavy chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 2
  • the CDR3 of the heavy chain heavy chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 3
  • the CDR1 of the light chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 4
  • the CDR2 of the variable domain of the light chain consists of the amino acid sequence DTS
  • CDR3 of the light chain variable domain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 5.
  • variable domain of the heavy chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 14 (ie the variable domain of the heavy chain has 100% homology with the amino acid sequence SEQ ID NO : 14) and the variable domain of the light chain consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15.
  • the antibody described in the examples under the reference DSV36S comprises a variable domain of the heavy chain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 14 and a variable domain of the light chain which consists of the sequence d amino acid SEQ ID NO: 15.
  • antibody or antibody fragment of reference The antibody or antibody fragment according to the first object described above is called “antibody or antibody fragment of reference” below.
  • a second object of the invention relates to an antibody or an antibody fragment which competes for binding to the G alpha protein with the antibody or antibody fragment of reference, hereinafter "antibody or fragment competitor antibody ”.
  • a “competition method” consists in testing an antibody (or an antibody fragment) for its capacities to block the binding between an antibody or fragment of reference antibody and an antigen or to enter into competition with an antibody or fragment of an antibody. reference antibody for binding to the antigen.
  • an antibody that competes with the reference antibody or antibody fragment binds to the same epitope as the reference antibody or antibody fragment or to an epitope that is sufficiently close to the antibody. epitope recognized by the reference antibody or antibody fragment to prevent binding of the reference antibody or antibody fragment for reasons of steric hindrance.
  • competition methods can be used to determine whether an antibody or antibody fragment competes with a reference antibody or antibody fragment, for example: by a competitive ELISA test, by a immuno-fluorescent method eg by a FRET or HTRF test ("Homogeneous Time Resolved Fluorescence"), by an immunoluminescence method, by a direct or indirect sandwich method, by direct or indirect radio immunoassay (RIA) in solid phase, by direct or indirect solid phase enzyme immunoassay (EIA), by surface plasmon resonance technology (eg BIACORE), by flow cytometry, by fluorescence polarization (eg between a fluorescent peptide and l 'antibody to test), etc.
  • a competitive ELISA test by a immuno-fluorescent method eg by a FRET or HTRF test ("Homogeneous Time Resolved Fluorescence")
  • an immunoluminescence method eg by a direct or indirect sandwich method
  • RIA radio immunoassay
  • EIA direct or
  • the competitive ELISA method involves the use of a purified antigen bound to a solid surface or to cells, the test antibody that binds to unlabeled antigen, and an antibody or antibody fragment from marked reference.
  • the antibody or antibody fragment of reference is present in an unsaturated concentration (with respect to its dissociation constant Kd for the Galpha protein) and the signal is measured at increasing concentrations of the antibody or of the fragment of. antibody to be tested.
  • an antibody can block or inhibit (e.g. reduce) the specific binding of a reference antibody or antibody fragment to an antigen by at least 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or 75% or more.
  • binding is inhibited by at least 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, or 97% or more.
  • the antibodies or antibody fragments which compete for binding to the alpha G protein with the antibody or reference antibody fragment are identified by the implementation of an HTRF test or by carrying out a fluorescence polarization test, preferably an HTRF test.
  • an antibody or antibody fragment competes for binding to the alpha G protein with the reference antibody or antibody fragment, it is able to inhibit an HTRF signal generated by the antibody or antibody. reference antibody fragment.
  • an antibody or an antibody fragment which does not compete for binding to the alpha G protein with the antibody or the reference antibody fragment is not capable of inhibiting a signal.
  • HTRF generated by the antibody or the reference antibody fragment is identified by the implementation of an HTRF test or by carrying out a fluorescence polarization test, preferably an HTRF test.
  • the antibodies or fragments of competing antibodies according to the invention can, for example, be obtained with the antibody or fragment of the reference antibody by the implementation of the protocol described in Example 1.
  • the antibody DSV38S is a competing antibody according to the invention.
  • the DSV38S antibody and / or the DSV36S antibody is / are excluded from the antibodies or fragments of competing antibodies according to the invention.
  • antibodies or fragments of reference antibodies and the antibodies or fragments of competing antibodies as defined above are jointly called “antibodies or fragments of antibodies according to the invention” below.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can bind to the G alpha protein in an isolated form and / or present in a membrane environment, for example it can bind to a G alpha protein present in a preparation of membranes carrying one or more RCPGs and one or more G alpha proteins. It is not necessary for the alpha G protein to be complexed with the RCPG for the antibody according to the invention to be able to bind to the alpha G protein.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can bind to the G alpha protein with a dissociation constant (Kd) measured in FRET less than or equal to 20 nM.
  • Kd dissociation constant
  • a dissociation constant of less than 20 nM is preferable for the proper implementation of a RET.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can bind to the G alpha protein with a dissociation constant (Kd) measured in FRET less than or equal to 20 nM, for example an affinity constant less than or equal to 10 nM or even less than or equal to 5 nM, for example ranging from 0 to 20 nM (0 being excluded), ranging from 0 to 10 nM (0 being excluded), ranging from 0 to 5 nM (0 being excluded).
  • a method for measuring the Kd of an antibody or of an antibody fragment according to the invention in FRET is described in Example 2.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can be used in a RET process with a GTP labeled with a member of a pair of RET partners.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention is particularly advantageous in the implementation of a RET, in particular of a FRET, in particular for detecting the activation of a G alpha protein.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can be coupled to a molecule allowing its detection.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can be labeled with a member of a pair of RET partners.
  • antibodies or antibody fragments according to the invention can be obtained by implementing the protocol described in Example 1.
  • the inventors have also shown that the antibodies or antibody fragments according to the invention bind to the SwitchII domain of the G alpha protein, and more particularly to the 215-294 peptide of the G alpha protein.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can be labeled directly or indirectly according to methods well known to those skilled in the art, for example as described below, but preferably, the The antibody is labeled directly, by covalent bonding with a member of a pair of RET partners.
  • RET partners denotes a pair consisting of an energy donor compound (hereinafter “donor compound”) and an energy acceptor compound (hereinafter “acceptor compound”); when in proximity to each other and when excited at the excitation wavelength of the donor compound, these compounds emit a RET signal. It is known that for two compounds to be partners of RET, the emission spectrum of the donor compound must cover partially the excitation spectrum of the acceptor compound.
  • donor compound an energy donor compound
  • acceptor compound an energy acceptor compound
  • the direct labeling of the antibody or of the antibody fragment by a member of a pair of RET partners can be carried out by the known conventional methods of those skilled in the art, relying on the presence of reactive groups on the antibody or the antibody fragment.
  • the following reactive groups can be used: terminal amino group, carboxylate groups of aspartic and glutamic acids, amine groups of lysines, guanidine groups of arginines, thiol groups of cysteines, phenol groups of tyrosines, indole rings of tryptophanes, thioether groups of methionines, imidazole groups of histidines.
  • the reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by the antibody or the antibody fragment.
  • the appropriate reactive groups, carried by the antibody or the antibody fragment are well known to those skilled in the art, for example a donor compound or an acceptor compound functionalized by a maleimide group will for example be able to bind in such a manner. covalent with the thiol groups carried by the cysteines carried by the antibody or the antibody fragment. Likewise, a donor / acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently bind to an amine present on the antibody or antibody fragment.
  • the antibody or the antibody fragment according to the invention can also be labeled with a fluorescent or bioluminescent compound indirectly, for example by introducing into the measurement medium an antibody or an antibody fragment, itself. even covalently linked to an acceptor / donor compound, this second antibody or antibody fragment specifically recognizing the antibody or the antibody fragment according to the invention.
  • biotinylated antibody or antibody fragment can be prepared by techniques well known to those skilled in the art; the Cisbio Bioassays, for example, markets streptavidin labeled with a fluorophore, the trade name of which is “d2” (ref. 610SADLA).
  • the antibody or the antibody fragment is labeled with (i) a fluorescent donor or luminescent donor compound, or (ii) a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher ).
  • the antibody or the antibody fragment is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • the antibody or the antibody fragment is labeled with a fluorescent acceptor compound, for example chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazole and a quantum dot, GFP, GFP variants chosen from GFP10, GFP2 and eGFP, YFP, YFP variants chosen from eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus and YPet, mOrange and DsRed.
  • a fluorescent acceptor compound for example chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives, nitrobenzoxadiazol
  • the antibody or the antibody fragment is labeled with a fluorescent donor compound, for example chosen from a europium cryptate, a europium chelate, a chelate of terbium, a terbium cryptate, a ruthenium chelate, a quantum dot, allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavins, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives and nitrobenzoxadiazole, preferably chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate; a ruthenium chelate; and a quantum dot; the chelates and cryptates of europium and terbium being particularly preferred.
  • a fluorescent donor compound for example chosen from a europium cryptate, a europium
  • the antibody or the antibody fragment is labeled with a luminescent donor compound, for example chosen from Luciferase (read), Renilla Luciferase (Rluc), variants of Renilla Luciferase (Rluc8) and Firefly Luciferase.
  • a luminescent donor compound for example chosen from Luciferase (read), Renilla Luciferase (Rluc), variants of Renilla Luciferase (Rluc8) and Firefly Luciferase.
  • a third subject of the invention relates to a composition comprising the antibody or the antibody fragment described above.
  • the composition according to the invention may further comprise a source of GTP labeled with a member of a pair of RET partners.
  • the GTP marked with a member of a pair of RET partners is described below in the “kit-of-parts” section.
  • a fourth object of the invention relates to a kit of reagents (kit-of-parts) comprising (i) the antibody or the antibody fragment according to the invention (reference or competitor as defined above ) and (ii) a source of GTP labeled with a member of a RET partner pair (hereinafter “labeled GTP”).
  • kit-of-parts comprising (i) the antibody or the antibody fragment according to the invention (reference or competitor as defined above ) and (ii) a source of GTP labeled with a member of a RET partner pair (hereinafter “labeled GTP”).
  • GTP can be a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP, such as GTPgammaS (GTPyS or GTPgS), GppNHp and GppCp.
  • GTPgammaS GTPyS or GTPgS
  • GppNHp GppNHp
  • GppCp GppCp
  • GTP can be labeled directly or indirectly.
  • the GTP is directly labeled.
  • the direct labeling of GTP by a member of a pair of RET partners, for example a fluorescent compound when a FRET is used, can be carried out by the methods based on the presence of reactive groups on the GTP.
  • the reactive groups can form a covalent bond with a reactive group carried by a member of a pair of RET partners.
  • the appropriate reactive groups, carried by the member of a pair of RET partners, are well known to those skilled in the art, for example a donor compound or an acceptor compound functionalized by a maleimide group will for example be able to bind to covalently with thiol groups.
  • a donor / acceptor compound bearing an N-hydroxysuccinimide ester will be able to covalently attach to an amine.
  • the GTP is labeled with (i) a fluorescent donor compound, or (ii) a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • a fluorescent donor compound e.g., a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • the GTP is labeled with a fluorescent donor compound.
  • the labeled GTP is a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a fluorescent donor compound chosen from GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma -N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP- gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl-Cll (GTP-gamma-N-octyl-Cll), GTPgN-octyl-C3 (GTP- gamma- N-octyl-C3), GTPgO-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO-hexyl-C3 (GTP-gamma-0-hexyl-C3) or GTP-gN-octyl-thiosuccin
  • the labeled GTP is a non-hydrolyzable or slowly hydrolyzable GTP labeled with a fluorescent acceptor compound chosen from GTPgN-octyl-Cy5, GTPgN-octyl-AF488, GTPgN-L15-Fluorescein, GTPgO-Linker- Cy5 (P) or GTPgS-Linker-Cy5 (R).
  • GTP can also be labeled with a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 is shown below.
  • the GTP is labeled with a fluorescent donor compound and the antibody or the antibody fragment is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher).
  • the GTP is labeled with a fluorescent acceptor compound or a non-fluorescent acceptor compound (quencher) and the antibody or the antibody fragment is labeled with a fluorescent donor or luminescent donor compound.
  • (i) is an antibody which comprises a variable domain of the heavy chain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 14 and a variable domain of the light chain which consists of the acid sequence amino SEQ ID NO: 15 and (ii) is GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
  • a fifth object of the present invention relates to a nucleic acid sequence encoding the antibody or the antibody fragment according to the invention (reference or competitor).
  • a sixth object of the present invention relates to a vector comprising a nucleic acid sequence according to the invention.
  • a vector comprising a nucleic acid sequence according to the invention.
  • Any type of vector suitable for the production of antibodies can be used within the framework of the invention.
  • the vector is a recombinant vector.
  • the vector will comprise the nucleic sequences necessary to produce the antibody according to the invention, for example promoter sequences, regulatory sequences, etc.
  • the preparation of a suitable vector is widely described in the literature.
  • a seventh object of the invention relates to a cell comprising a vector according to the invention or a nucleic acid sequence according to the invention.
  • the cell according to the invention can be obtained by methods widely described in the literature, for example by transfecting a cell clone with a vector according to the invention or a nucleic acid sequence.
  • the invention is not limited to a particular cell type. Any cell capable of producing antibodies can be used within the framework of the invention. They may be eukaryotic cells, such as mammalian cells, for example human or mouse cells, or prokaryotic cells, for example bacteria or even yeasts.
  • FIG. 1 represents the reaction scheme of a FRET making it possible to measure the Kd of an anti-G alphail protein antibody.
  • FIG. 2 represents curves which illustrate the affinity of the antibodies SC13533, DSV36S and DSV38S labeled with d2 for the human Gail protein.
  • a very significant HTRF signal is obtained with all the antibodies in the presence and in the absence of a nucleotide (GTPgS or GDP).
  • the results indicate that the DSV36S, DSV38S and SC13533 antibodies are able to bind the Gail protein.
  • the curves make it possible to calculate the affinity (Kd) of these different antibodies for the Gail protein (Table 1).
  • Figure 3 is a curve which illustrates the ability of unlabeled DSV36S, DSV38S and SC 13533 antibodies to inhibit binding of SC13533-d2 antibody to human Gil protein.
  • the unlabeled SC 13533 antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with the SC 13533-d2 antibody.
  • the DSV36S and DV38S antibodies were not able to inhibit the signal generated by the SC 13533-d2. This demonstrates that these 2 antibodies do not bind to the same region of the Gail protein as the SC 13533 antibody.
  • the DSV36S and DSV38S antibodies recognize different epitopes from the SC 13533 antibody.
  • FIG. 4 represents the capacity of the commercial antibodies sc-13533, sc-56536 and AM05302PU-N to inhibit the binding of the DSV SC13533-d2 antibody to the human Gil protein.
  • the commercial antibodies sc-13533, sc-56536 and AM05302PU-N are all non-competing antibodies to the DSV 36S antibody. All these antibodies therefore recognize an epitope different from the DSV 36S antibody.
  • FIG. 5 represents the capacity of the commercial antibodies sc-13533, sc-56536 and AM05302PU-N to inhibit the binding of the DSV 3S-d2 antibody (generated in the laboratory) on the human Gil protein.
  • unlabeled DSV 3S antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with DSV 3S-d2 antibody.
  • the sc-13533, sc-56536 and AM05302PU-N antibodies completely inhibited the HTRF signal obtained with the DSV 3S-d2 antibody.
  • these results demonstrate that the commercial antibodies sc-13533, sc-56536 and AM05302PU-N are all antibodies non-competitors of the DSV 36S antibody. It is therefore the same for the DSV 3S antibody made in the laboratory. All these antibodies therefore recognize an epitope different from the DSV 36S antibody.
  • Figure 6 is a curve which illustrates the ability of unlabeled DSV36S and DSV38S antibodies to inhibit binding of DSV36S-d2 antibody to Gail protein.
  • unlabeled DSV36S antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with DSV36S-d2 antibody.
  • the DSV38S antibody also completely inhibited the signal generated by DSV36S-d2. This demonstrates that these 2 antibodies bind to the same region of the garlic G protein.
  • the DSV38S antibody competes for binding to the G protein alphai with the DSV36S antibody.
  • FIG. 7 represents the capacity of the commercial antibodies DSV 36S, DSV 26S, DSV 3S and DSV 39S to inhibit the binding of the antibody DSV36S-d2 on the human Gil protein.
  • DSV36S antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with DSV36S-d2 antibody.
  • DSV 26S, DSV 3S and DSV 39S antibodies were not able to inhibit the signal generated by the DSV 36S-d2. This demonstrates that these three antibodies do not bind to the same region of the human Gail protein as the DSV 36S antibody. In conclusion, these antibodies recognize different epitopes of the DSV 36S antibody.
  • FIGS. 8A and 8B represent the reaction scheme of a FRET making it possible to measure the selectivity of the DSV36S, DSV38S and SC13533 antibodies for different types of Ga proteins.
  • FIG. 9 is a diagram which represents the FRET signal for different types of Ga proteins obtained with a pair of Anti-Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb / Anti-FLAG-d2 antibodies, which makes it possible to verify that all the Ga proteins encoded by the plasmids were well over-expressed in the HEK293s. Indeed, the HTRF signal obtained with each of them was much higher than the HTRF signal obtained with the negative condition (“MOCK”) which corresponds to HEK293 transfected with a control plasmid not encoding any protein tagged FLAG + Twin-Strep- tag.
  • MOCK negative condition
  • FIG. 10 is a diagram which illustrates the selectivity of the DSV36S, DSV38S and SC13533 antibodies for the different types of Ga proteins.
  • the DSV36S and DSV38S antibodies gave a positive HTRF signal when the proteins Gail, Gai2, Gai3, Gao and Gas were overexpressed but did not give an HTRF signal when the Gas, Gaq, Gal2 and Gal3 proteins were overexpressed.
  • the SC13533 antibody gave a signal HTRF positive when the Gail and Gai3 proteins were overexpressed but did not give an HTRF signal when the Gai2, Gao, Gaz, Gas, Gaq, Gal2 and Gal3 proteins were overexpressed.
  • FIG 11 is a diagram which illustrates the ability of DSV36S, DSV38S and SC13533 antibodies to generate a TR-FRET signal when associated with a fluorescent analogue of GTP (GTPgN-octyl-C2-europium cryptate ) on membrane preparations overexpressing a GPCR.
  • GTPgS represents the non-specific signal of the assay (NS) in which the excess of unlabeled GTPgS (100mM) inhibited the binding of europium GTPgN-octyl-C2-Cryptate to the Ga and a proteins. therefore prevented the appearance of a FRET signal.
  • the “buffer” condition showed that it was possible to obtain a moderate but significant FRET signal between the europium GTPgN-octyl-C2-Cryptate and the DSV36S and DSV 38S antibodies labeled with d2.
  • SNC162 which caused the activation of the over-expressed DOR receptors in the membranes
  • an increase in this FRET signal was observed linked to an increase in the binding of the fluorescent GTP analog on all or part Gail, Gai2, Gai3, Gao and Gaz proteins recognized by the DSV36S and DSV38S antibodies.
  • FIG. 12 represents the capacity of the DSV 36S, DSV 26S, DSV 3S and DSV 39S antibodies to generate a TR-FRET signal when they are associated with a fluorescent analogue of GTP (GTPgN-octyl-C2-Cryptate d 'europium) on unactivated membrane preparations overexpressing a GPCR.
  • GTPgN-octyl-C2-Cryptate d 'europium a fluorescent analogue of GTP
  • the "Not Specify Signal" condition showed that a weak basal FRET signal between the fluorescent analog of GTP and the d2-labeled antibodies was detected.
  • the "Negative control" condition represents the nonspecific signal of the assay in which the excess of unlabeled GTPgS (IOOmM) inhibited the binding of the fluorescent analog of GTP to the Ga proteins and therefore prevented the appearance of GTPgS. 'a FRET signal.
  • the inhibition measured was total since the HTRF signal level measured for the conditions "Not specified signal” and "Negative. control ”is almost identical.
  • an increase in the FRET signal linked to an increase in the binding of the fluorescent analogs of GTP on all or part of the recognized Gail, Gai2, Gai3, Gao and Gaz proteins. by the DSV36S antibody was measured.
  • FIG. 13 represents the capacity of the DSV 36S and sc-13533 antibody to generate a TR-FRET signal when it is associated with a fluorescent analogue of GTP (GTPgO-Linker-Cy5 (P)) on unactivated membrane preparations overexpressing a GPCR.
  • GTPgO-Linker-Cy5 (P) fluorescent analogue of GTP
  • the "Not Specify Signal” condition showed that a weak basal FRET signal between the fluorescent analogue of GTP and the antibodies labeled with Terbium cryptate was detected.
  • the "Negative control” condition represents the nonspecific signal of the assay in which the excess of unlabeled GTPgS (IOOmM) inhibited the binding of the fluorescent analog of GTP to the Ga proteins and therefore prevented the appearance of GTPgS. 'a FRET signal.
  • FIGS. 14A and 14B illustrate 2 FRET formats which can be implemented with the antibodies according to the invention (Formats 2A and 2B).
  • FIGS. 15A and 15B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 16A and 16B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 17A and 17B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV38S-d2.
  • Figures 18A and 18B illustrate an activation test according to the 2A format on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgN-octyl-Cll + DSV36S-d2.
  • Figures 19A and 19B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG
  • FIGS. 20A and 20B illustrate an activation test according to the 2A format on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
  • Figures 21A, 21B illustrate an activation test according to the 2A format on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 22A and 22B illustrate an activation test according to format 2A on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • FIGS. 23A and 23B illustrate an activation test according to format 2A on RCPG Dopamine D2S with the detection pair: GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
  • Figures 24A and 24B illustrate an activation test according to the 2B format on RCPG
  • Figures 25A and 25B illustrate an activation test according to format 2B on Delta Opioid RCPG with the detection pair: GTPgN-octyl-AF488 + DSV36S-Lumi4Tb.
  • FIGS. 26A and 26B illustrate an activation test according to format 2A on RCPG Delta Opioid with the detection pair: GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 + DSV36S-d2.
  • the membrane preparations of cells expressing the Delta Opioid receptor (DOR) were purchased from Euroscreen via a service.
  • the DSV36S, DSV38S, DSV 26S, DSV 3S and DSV 39S antibodies were generated by Cisbio Bioassays and are available from Cisbio Bioassays on request (under the respective references DSV36S, DSV38S, DSV 26S, DSV 3S and DSV 39S) .
  • the DSV36S antibody comprises a heavy chain variable domain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 14 and a light chain variable domain which consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15. antibodies were labeled with compatible fluorescent probes for TR-FRET detection (red acceptor - d2 or Lumi4Tb donor).
  • the antibodies SC13533 and SC56536 were purchased from Santa Cruz Biotechnology (ref SC13533 and ref SC56536).
  • the AM05302PU-N antibody was purchased from Acris Antibodies GmbH (ref AM05302PU-N).
  • the anti Twin-Strep-tag antibody was purchased from IBA Lifesciences (ref 2-1517-001) and labeled with a fluorescent probe compatible with TR-FRET detection (donor Lumi4Tb).
  • the anti-FLAG-d2 antibody is available from Cisbio Bioassays (Ref 61FG2DLF)
  • the GDP and GTPyS nucleotides were purchased from Sigma Aldrich (respective catalog references G7127 and G8634).
  • the Delta Opioid GPCR agonist (SNC162) was purchased from Tocris Biosciences (reference 1529).
  • the 384-well, low-volume, white plates with a white background and the 96-well black plates (with a black background) suitable for cell culture were purchased from Greiner Bio One (Catalog references 784075 and 665086 respectively).
  • the non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analog (GTPgN-octyl-C2) labeled with a donor fluorophore (europium cryptate) was synthesized by Cisbio Bioassays.
  • the non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analog (GTPgO-Linker-Cy5 (P)) labeled with an acceptor fluorophore (Cy5) was purchased from Jena Bioscience (ref NU-834-Cy5).
  • the plasmids encoding the various human G proteins, Gail, Gai2, Gai3, Gao, Gas, Gas, Gaq, Gal2 and Gal3 fused in their N-terminal part to the Twin-Strep-tag and FLAG tags were synthesized and amplified by the company Genecust (service provision).
  • the HEK293 cells were purchased from the ATCC.
  • Opti-MEM medium Lipofectamine 2000 and poly-ornithine were purchased from Thermo Fisher Scientific (ref. 51985-026 and 11668-019) and Sigma Aldrich (ref. P4957, respectively). ).
  • the HTRF signal was measured on the PHERAstar reader (BMG Labtech) with the following configuration:
  • the HTRF Ratio was calculated according to the following formula:
  • HTRF Ratio Signal at 665nm / Signal at 620nm * 10,000.
  • Example 1 Protocol for obtaining anti-G alphail protein antibodies according to the invention
  • TST-G alphail protein G alphail protein of UniProt P63096-1 sequence tagged N-terminally with the TwinStreptag (TST) (IBA) tag via a TEV linker
  • TST TwinStreptag
  • TST TwinStreptag
  • mice were immunized by injection of the TST-G alphail protein previously diluted in buffer containing GTPgS (20 mM HEPES pH8, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 11 mM CHAPS, 100 mM GTPgS). The first injection was followed by three boosters at monthly intervals.
  • GTPgS 20 mM HEPES pH8, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 11 mM CHAPS, 100 mM GTPgS.
  • TST-G alphail protein previously diluted to 20 pg / mL in buffer containing GTPgS (20mM Tris HCl pH8.5, 140mM NaCl, 2mM EDTA, 10mM MgCl2, 0.1% BSA, GTPgS ImM) was adsorbed via the TwinStreptag tag on 96-well plates containing Strep-Tactin®XT (IBA, Catalog: 2-4101-001). For this, 100 mI of protein were added to each well and then incubated for 2 h at 37 ° C. followed by three washes in PBS 1 ⁇ buffer, 0.05% Tween20.
  • the same punctures were tested on the ELISA test after pre-incubation with an excess of another orthogonal protein tagged with the TwinStrepTag (SNAPTag-TwinStrepTag).
  • the anti tag antibodies bind to the tagged orthogonal protein and therefore not to the G alphail protein attached to the bottom of the wells; in which case no HRP signal or a decrease in HRP signal is detected.
  • mice exhibiting the best antibody titers and the least drop in signal in the anti tag control case were selected for the following stage of lymphocyte hybridization, also called fusion.
  • the spleen of the mice was collected and mixed lymphocytes and plasmocysts derived from this spleen was fused in vitro with a myeloma cell line in the presence of a cell fusion catalyst of the polyethylene glycol type.
  • a mutant myeloma cell line lacking the HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) enzyme was used to allow selection of hybrid cells, called hybridomas.
  • hybridomas were then cultured in culture plates. The supernatants of these hybridomas were then tested to evaluate their capacity to produce anti G alphail protein antibodies. For this, an ELISA test as described above was carried out.
  • the test was carried out in parallel on TST-protein conditions. G alphail pre-incubated in the buffer containing either ImM GDP, ImM GTPgS or nucleotide-free. The best hybridomas were then cloned with a step of limiting dilution in order to obtain hybridoma clones.
  • the hybridoma clones of interest were then injected into mice (intraperitoneal injection) in order to allow the production of antibodies in large quantities in the ascitic fluid.
  • the antibodies were then purified by affinity chromatography on columns with resins exhibiting protein A.
  • All the reagents are diluted in 50 mM TrisHCl buffer, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 0.1% BSA, 10 mM NaCl.
  • the Gail protein is prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 2.5nM.
  • the GTPgS nucleotide is prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 10 ⁇ M.
  • These 2 reagents are prepared in the same solution and pre-incubated for 30 minutes at room temperature before being distributed into the wells.
  • the above purified antibodies are prepared 4X to target final concentrations in the wells between 0.01 and ImM.
  • the DSV36S-d2 antibody is prepared 4X to aim for a final concentration of 10nM.
  • the anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody is prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.5nM.
  • the reagents are distributed in the 384-well plates as follows:
  • the plates are incubated for 1 hour at room temperature before reading the HTRF signal.
  • the antibodies according to the invention are capable of inhibiting the HTRF signal obtained with the DSV36S-d2 antibody. Conversely, the antibodies which are not according to the invention are not capable of inhibiting the signal generated by DSV36S-d2.
  • Example 2 Determination of the Affinity of the SC13533 Antibodies. DSV36S. DSV38S labeled with d2 for Gail protein
  • the Gail protein was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 2.5nM.
  • the GTPgS nucleotide was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 100mM.
  • These 2 reagents were prepared in the same solution and preincubated for 30 minutes at room temperature before being distributed into the wells.
  • the DSV36S-d2, DSV38S-d2 and SC13533-d2 antibodies were prepared 4X to target the final concentrations in the wells of between 0.01 and 10nM depending on the antibodies.
  • the anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody was prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.25nM.
  • the reagents were distributed in the 384-well plates as follows:
  • FIG. 2 shows the results obtained with the DSV36S, DSV38S and SC13533 antibodies labeled with d2.
  • a very significant HTRF signal is obtained with all these antibodies in the presence and in the absence of a nucleotide (GTPgS or GDP).
  • the antibody titration curves produced make it possible to calculate the affinity (Kd) of these various antibodies for the Gail protein. This was done through GraphPad Prism software by applying a “one site specifies binding” model to the HTRF data. The Kd values obtained are presented in Table 1.
  • the Kd values show that the 3 antibodies have an excellent affinity for the Gail protein, the Kd values being between 0.1 and lnM whatever the state of the protein.
  • Example 3 Capacity of unlabelled DSV36S antibodies. DSV38S, SC
  • the Gail protein was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 2.5nM.
  • the GTPgS nucleotide was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 10pM.
  • the cold antibodies DSV36S, DSV38S and SC13533 were prepared 4X to aim for the final concentrations in the wells of between 0.01 and 100nM.
  • SC 13533-d2 antibody was prepared 4X to aim for a final concentration of 10nM.
  • the anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody was prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.5nM.
  • the reagents were distributed in the 384-well plates as follows:
  • the plates were incubated for 1 hour at room temperature before reading the HTRF signal.
  • FIG. 3 shows the results obtained with the DSV 36S, DSV 38S and SC 13533 antibodies.
  • the unlabeled SC 13533 antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with the SC 13533-d2 antibody.
  • the DSV36S and DV38S antibodies were not able to inhibit the signal generated by the SC 13533-d2. This demonstrates that these 2 antibodies do not bind to the same region of the Gail protein as the SC 13533 antibody.
  • the DSV36S and DSV38S antibodies recognize different epitopes from the SC 13533 antibody.
  • Figure 4 shows the results obtained with the antibodies SC13533, SC56536 and AM05302PU-N.
  • Example 4 Capacity of unlabelled DSV3S antibodies. SC56536. AM05302PU-N and SC 13533 to inhibit the binding of the DSV3S-d2 antibody to the Gil protein
  • the Gail protein was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 2.5nM.
  • the GTPgS nucleotide was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 10pM.
  • These 2 reagents were prepared in the same solution and preincubated for 30 minutes at room temperature before being distributed into the wells.
  • the cold antibodies DSV3S, SC56536, AM05302PU-N and SC 13533_ were prepared 4X to target the final concentrations in the wells between 0.03 and 300nM.
  • DSV3S-d2 antibody was prepared 4X to aim for a final concentration of 10nM.
  • the anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody was prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.25nM.
  • the reagents were distributed in the 384-well plates as follows:
  • the plates were incubated for 1 hour at room temperature before reading the HTRF signal.
  • FIG. 5 shows the results obtained. Logically, unlabeled DSV 3S antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with DSV 3S-d2 antibody. Also, the sc-13533, sc-56536 and AM05302PU-N antibodies completely inhibited the HTRF signal obtained with the DSV 3S-d2 antibody. In conclusion, these results, associated with those presented in Example 3, demonstrate that the commercial antibodies sc-13533, sc-56536 and AM05302PU-N are all antibodies which are non-competitive with the DSV 36S antibody. It is therefore the same for the DSV 3S antibody made in the laboratory. All these antibodies therefore recognize an epitope different from the DSV 36S antibody.
  • Example 5 Capacity of unlabeled DSV36S antibodies. DSV38S, DSV3S, DSV26S and DSV39S to inhibit the binding of the DSV36S-d2 antibody to the Gail protein
  • the Gail protein was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 2.5nM.
  • the GTPgS nucleotide was prepared 2X to obtain a final concentration in the wells of 100mM.
  • These 2 reagents were prepared in the same solution and preincubated for 30 minutes at room temperature before being distributed into the wells.
  • the cold DSV36S, DSV38S, DSV26S, DSV3S, and DSV39S antibodies were prepared 4X to target the final concentrations in the wells between 0.001 and ImM.
  • the DSV36S-d2 antibody was prepared 4X to aim for a final concentration of 10nM.
  • the anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody was prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.25nM.
  • the reagents were distributed in the 384-well plates as follows:
  • the plates were incubated for 1 hour at room temperature before reading the HTRF signal.
  • FIG. 6 shows the results obtained with the DSV36S and DSV38S antibodies.
  • Logically, unlabeled DSV36S antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with DSV36S-d2 antibody.
  • the DSV38S antibody also completely inhibited the signal generated by DSV36S-d2. This demonstrates that these 2 antibodies bind to the same region of the Gail protein.
  • Figure 7 shows the results obtained with the DSV36S, DSV26S, DSV3S and DSV39S antibodies. Logically, unlabeled DSV36S antibody completely inhibited the HTRF signal obtained with DSV36S-d2 antibody.
  • DSV 26S, DSV 3S and DSV 39S antibodies were not able to inhibit the signal generated by the DSV 36S-d2. This demonstrates that these 3 antibodies do not bind to the same region of the human Gail protein as the DSV 36S antibody.
  • DSV38S antibody competes for binding to the alphai G protein with the DSV36S antibody and therefore shares the same epitope.
  • Day 1 transfection of the HEK293 cells with plasmids encoding the various human Gail, Gai2, Gai3, Gao, Gas, Gas, Gaq, Gal2 and Gal3 proteins
  • Plasmids / Lipofectamine mixtures containing 150 ng / well of plasmids and 0.375 ml of lipofectamine were prepared in OptiMEM medium 30 minutes before their addition to the 96-well plate with a dark background.
  • microplates were incubated for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 (controlled oven).
  • the reagents were diluted in 50 mM TrisHCl buffer pH 7.4, 10 mM MgCl2, 0.1% BSA, 0.02% Triton X100.
  • the DSV36S-d2, DSV38S-d2 and SC13533-d2 antibodies were prepared 4X to aim for a final concentration in the lOnM wells.
  • the anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb antibody was prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 0.5nM.
  • the GDP and GTPgS nucleotides were prepared 4X to obtain a final concentration in the 10mM wells.
  • the reagents were distributed on the 384-well plates as follows:
  • microplates were incubated for 20 hours at room temperature before reading the HTRF signal.
  • the overexpression of all the Ga proteins being validated it was then possible to determine the selectivity profile of the DSV36S, DSV38S and SC 13533 antibodies by measuring a possible FRET between these antibodies labeled with d2 and the Anti-Twin-Strep- antibody. tag-Lumi4 Tb.
  • the DSV36S and DSV38S antibodies gave a positive HTRF signal when the Gail, Gai2, Gai3, Gao and Gaz proteins were overexpressed but did not give an HTRF signal when the Gas, Gaq, Gal2 and Gal3 proteins were overexpressed.
  • the SC13533 antibody gave a positive HTRF signal when the Gail and Gai3 proteins were overexpressed but did not give an HTRF signal when the Gai2, Gao, Gaz, Gas, Gaq, Gal2 and Gal3 proteins were overexpressed.
  • Example 7 Capacity of DSV36S Antibodies. DSV38S. DSV 26S. DSV 39S. DSV 3S and SC13533 to generate a TR-FRET signal when combined with a fluorescent analogue of GTP on membrane preparations overexpressing a G PCR
  • HEK293 membranes expressing the DOR receptor were prepared 4X to aim for a final amount in the 10 ⁇ g wells.
  • DSV36S-d2, DSV38S-d2, SC13533-d2 and anti-FLAG-d2 antibodies were prepared 4X to aim for a final concentration in the lOnM wells.
  • Europium cryptate labeled GTPgN-octyl-C2 was prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 6nM.
  • the GTPgO-linker-Cy5 was prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 50nM.
  • the nucleotides GTPgS and GDP were prepared 4X to obtain a final concentration in the wells of 100mM.
  • SNC 162 was prepared 4X to obtain a final concentration in the 10 pM wells.
  • the reagents were distributed in the 384-well plates as follows:
  • the plates were incubated for 20 hours at room temperature before reading the HTRF signal.
  • FIG. 11 shows the results obtained when the europium analog GTPgN-octyl-C2-Cryptate is combined with the antibodies DSV36S-d2, DSV38S-d2 and SC13533-d2.
  • GTPgS represents the non-specific signal of the assay (NS) in which the excess of unlabeled GTPgS (100mM) inhibited the binding of europium GTPgN-octyl-C2-Cryptate to the Ga and a proteins. therefore prevented the appearance of a FRET signal.
  • the “buffer” condition showed that it was possible to obtain a moderate but significant FRET signal between europium GTPgN-octyl-C2-Cryptate and the DSV36S and DSV 38S antibodies labeled with d2.
  • SNC162 which caused the activation of the over-expressed DOR receptors in the membranes
  • an increase in this FRET signal was observed linked to an increase in the binding of the fluorescent GTP analog on all or part Gail, Gai2, Gai3, Gao and Gaz proteins recognized by the DSV36S and DSV38S antibodies.
  • FIG. 12 shows the results obtained when one associates the analog GTPgN-octyl-C2-Cryptate of europium with the antibodies DSV36S-d2, DSV26S-d2, DSV39S-d2 and DSV3S- d2 on membrane preparations not activated or expressing a GPCR.
  • the "Not Specify Signal” condition showed that a weak basal FRET signal between the fluorescent analog of GTP and the d2-labeled antibodies was detected.
  • the "Negative control” condition represents the nonspecific signal of the assay in which the excess of unlabeled GTPgS (100mM) inhibited the binding of the fluorescent analog of GTP to the Ga proteins and therefore prevented the appearance of 'a FRET signal.
  • the inhibition measured was total since the level of HTRF signal measured for the conditions "Not specified signal” and "Negative control" is almost identical.
  • an increase in the FRET signal linked to an increase in the binding of the fluorescent analogs of GTP on all or part of the recognized Gail, Gai2, Gai3, Gao and Gaz proteins. by the DSV36S antibody was measured.
  • the DSV 26S, DSV 3S and DSV 39S antibodies did not give any FRET signal when they were combined with GTPgN-octyl -C2-Cryptate europium.
  • FIG. 13 shows the results obtained when the GTPgO-Iinker-Cy5 analog is combined with the DSV36S-Tb and SC13533-Tb antibodies on unactivated membrane preparations over-expressing a GPCR.
  • the "Not Specify Signal” condition showed that a weak basal FRET signal between the fluorescent analogs of GTP and the antibodies labeled with Terbium cryptate was detected.
  • the "Negative control” condition represents the nonspecific signal of the assay in which the excess of unlabeled GTPgS (IOOmM) inhibited the binding of the fluorescent analog of GTP to the Ga proteins and therefore prevented the appearance of GTPgS. 'a FRET signal.
  • the inhibition measured was total since the level of HTRF signal measured for the conditions "Not specified signal” and "Negative control" is almost identical.
  • an increase in the FRET signal related to an increase in the binding of the fluorescent analog of GTP on all or part of the proteins Gail, Gai2, Gai3, Gao and Gases recognized by the DSV36S antibody was measured.
  • the sc-13533 antibody gave no FRET signal when combined with the GTPgO-Linker-Cy5 (P).
  • Example 8 measurement of the activation of a GPCR by implementing a FRET with a labeled antibody according to the invention.
  • the DSV36S antibody was labeled with fluorescent probes compatible for TR-FRET detection (red acceptor - d2 or Lumi4Tb donor).
  • nucleotides GTP, GDP and GTPyS were purchased from Sigma Aldrich (respective catalog references G8877, G7127 and G8634).
  • Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogues labeled with donor or acceptor fluorophores (GTPgN-C2; GTPgN-C3; GTPgN-octyl-C2; GTPgN-octyl-Cll; GTPgN-octyl-C3; GTPgO-hexyl- C2; GTPgO-hexyl-C3; GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2; GTPgN-octyl-Cy5; GTPgN-octyl-AF488) were synthesized by Cisbio Bioassays.
  • Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogues labeled with acceptor fluorophores GTPgO-Linker-Cy5 (P) and GTPgS-Linker-Cy5 (R) were purchased from Jena Bioscience under the respective references NU-834-CY5 and NU-1610-CY5.
  • the anti-G alphai antibodies used for the detection were prepared 4X to aim for the final concentrations in the following wells: DSV36S-d2 antibody (10nM); DSV36S-Lumi4Tb antibody (0.5 or lnM); DSV38S-d2 antibody (10nM).
  • DSV36S-d2 antibody 10nM
  • DSV36S-Lumi4Tb antibody 0.5 or lnM
  • DSV38S-d2 antibody 10nM.
  • Non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable GTP analogs labeled with fluorescent donor or acceptor probes were prepared 4X to aim for the final concentrations in the wells mentioned in the legends of each figure.
  • Anti-G alphai-donor or acceptor antibody 5 pL
  • Buffer or Compounds to be tested (agonists and / or antagonists): 2 ⁇ l.
  • the non-specific signal (fluorescence background noise) was measured with wells containing an excess of GTPgS (100 mM).
  • the plates were incubated at 21 ° C for 20 h (except if otherwise specified in the figures) then the HTRF signal was measured on the PHERAstar reader (BMG Labtech) with the following configuration:
  • Figure 14A illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with a donor RET partner and an anti G alpha protein antibody labeled with an acceptor RET partner in which activation of RCPG with an agonist compound induces an increase in the binding of the GTP-donor analog to the G protein and therefore an increase in the RET signal (2k format).
  • Figure 14B illustrates the test principle using a non-hydrolyzable / slowly hydrolyzable analogue of GTP labeled with an acceptor RET partner and an anti G alpha protein antibody labeled with a donor RET partner in which the activation of RCPG with an agonist compound induces an increase in the binding of the GTP-acceptor analog to the G protein and therefore an increase in the RET signal (2 B format).
  • FIG. 15A GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 500mM NaCl; 0.1% BSA.
  • FIG. 16A GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA.
  • FIG. 17A GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV38S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4;
  • FIG. 18A GTPgN-octyl-Cll (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA.
  • - Figure 19A GTPgO-hexyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA.
  • - Figure 20A GTPgN-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA.
  • the membranes were incubated in the absence or in the presence of a strong excess of GTPgS (100 mM).
  • the difference in TR-FRET signal (Ratio HTRF) observed between these two conditions shows that the analogs GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-Cll, GTPgO-hexyl-C2, GTPgN-C2 are able to bind to the G protein alphai and generate a TR-FRET signal with the anti G alphai-acceptor antibody ( Figures 16A to 20A).
  • Figure 16B shows a second condition where activation by a fixed concentration of RCPG agonist SNC162 (200nM) was inhibited by an increasing concentration of RCPG antagonist (Naltrindole). This activation inhibition is observed by the decrease in the TR-FRET signal (HTRF Ratio).
  • FIG. 21A GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; GDP ImM; 0.1% BSA.
  • - Figure 22A GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10 pg CH0-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 100 mM NaCl; 0.1% BSA.
  • FIG. 23A GTPgN-octyl-C2 (6nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10 pg CH0-D2S membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 100 mM NaCl; GDP ImM; 0.1% BSA.
  • FIG. 24A GTPgN-octyl-Cy5 (50nM final in the well); DSV36S-Lumi4Tb (final lnM in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA. Reading after 3 hours of incubation at 21 ° C.
  • FIG. 25A GTPgN-octyl-AF488 (50nM final in the well); DSV36S-Lumi4Tb (final lnM in the well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50mM TrisHCI pH7.4 ; 10mM MgCl2; 300mM NaCl; GDP 0.5mM; 0.1% BSA ⁇ Reading after 3 hours of incubation at 21 ° C.
  • Activation test according to the 2A format on RCPG Delta Opioid fDOR ' increase in the TR-FRET signal between GTP-donor and anti-G alpha-acceptor protein antibody under stimulation of an agonist.
  • FIG. 26A GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (7.5nM final in the well); DSV36S-d2 (final 10nM in well); 10pg CHO-DOR membranes / well; Buffer: 50 mM TrisHCl pH 7.4; 60mM MgCl2; 150mM NaCl; 0.1% BSA.
  • the increase in the TR-FRET signal (Ratio HTRF) generated by the stimulation with the agonist means that the proportion of G alpha protein form bound to the GTP-donor increases (ie that the form of the empty G alpha protein decreases).
  • the RCPG receptor activated by its agonist causes the binding of the GTP-donor to the G protein which then passes in the GTP-donor form and causes the increase in the TR-FRET signal.

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Abstract

L'invention concerne des anticorps ou fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, des séquence d'acides nucléiques codant pour l'anticorps, des vecteurs comprenant la séquence d'acides nucléiques, des cellules comprenant le vecteur ou la séquence d'acides nucléiques et une trousse de réactifs comprenant (i) l'anticorps ou le fragment d'anticorps ou la composition et (ii) une source de GTP marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET.

Description

Anticorps anti-protéine G alpha
Domaine Technique
[0001] La présente invention concerne des nouveaux anticorps ou fragments d'anticorps, capable de se lier à la protéine G alpha.
Technique antérieure
[0002] Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG ou GPCR en anglais) sont une famille de récepteurs membranaires chez les mammifères et dans tout le règne animal. Les protéines G sont des protéines hétérotrimériques (3 sous unités : alpha, bêta et gamma) qui sont activées par les RCPG. Au travers des RCPG, les protéines G ont un rôle de transduction d'un signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur de la cellule (i.e. réponse cellulaire à un stimulus externe). Leur mécanisme d'action communément décrit est résumé ci-après :
- dans son état inactif, de repos, la sous unité alpha de la protéine G est liée au nucléotide GDP (protéine G pleine liée au GDP) ;
- après activation du RCPG, ce dernier se lie à la sous unité alpha de la protéine G et enclenche un processus d'activation de la protéine G constitué de deux étapes : 1) la sortie du GDP de la protéine G pour donner une protéine G vide, et la formation d'un complexe RCPG / protéine-G-vide inactif, et 2) la fixation du GTP qui conduit à la formation d'une protéine G active, sous forme GTP (protéine G pleine liée au GTP). Dans la première étape, la protéine G liée au récepteur est sous une forme appelée « forme vide ». Cet état est décrit dans la littérature comme étant transitoire puisqu'il est décrit que le nucléotide GTP se lie rapidement à la sous unité alpha de la protéine G. Par ailleurs, les sous unités bêta/gamma de la protéine G activée se dissocient de la sous unité alpha ;
- la sous unité alpha de la protéine G pleine liée au GTP se fixe alors aux effecteurs pour les activer. Les effecteurs activent à leur tour des voies de signalisation entraînant une réponse cellulaire ;
- le GTP est ensuite hydrolysé en GDP par la sous unité alpha de la protéine G et la sous unité alpha se réassocie aux sous unité bêta/gamma pour reformer la protéine G pleine liée au GDP (état inactif).
[0003] Etant donné l'implication des RCPG dans de nombreuses voies de signalisation des outils ont été générés dans l'art antérieur pour étudier leur activité, avec souvent pour objectif l'identification de nouveaux ligands de ces récepteurs ayant une potentielle activité thérapeutique. On peut citer à titre d'exemple de ces outils, l'utilisation d'un dérivé radioactif non hydrolysable ou lentement hydrolysable du GTP, notamment le GTP-gamma-S, qui se fixe sur la protéine G alpha lorsque le récepteur est activé. Il existe également des systèmes recombinants basés sur la mesure d'une activité enzymatique telle que la luciférase dont l'expression est contrôlée par les seconds messagers produits par l'activation du récepteur. Des anticorps ont également étés synthétisés pour détecter l'activation des RCPG au niveau de la surface cellulaire [1]. On peut également faire référence au brevet EP2723764 B1 qui propose des nano-anticorps qui se lient à l'interface entre la protéine G alpha et la protéine G bêta/gamma, permettant de stabiliser le complexe RCPG/protéine G.
[0004] Toutefois, l'art antérieur ne décrit pas d'anticorps ou de fragments d'anticorps capable de générer un signal de RET lorsqu'il est marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET et utilisés avec un GTP marqué par un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0005] Les inventeurs ont mis au point des anticorps ou fragments d'anticorps pour détecter l'activation d'un RCPG par la mise en œuvre d'un procédé de RET qui utilise un GTP marqué par un membre d'un couple de partenaires de RET. Les inventeurs ont également montré que ces anticorps ou fragments d'anticorps ont ces propriétés car ils sont capables de se lier à la protéine G alpha dans une zone très particulière.
Résumé de l'invention
[0006] Un premier objet de la présente invention concerne un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, et
- un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS (soit les trois acides aminés Asp Thr Ser), et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
[0007] Un deuxième objet de la présente invention concerne un anticorps ou un fragment d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou fragment d'anticorps du premier objet de l'invention. [0008] Un troisième objet de la présente invention concerne une composition comprenant l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention.
[0009] Un quatrième objet de la présente invention concerne un kit-of-parts (trousse de réactifs en français) comprenant (i) l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention ou la composition selon l'invention et (ii) une source de GTP marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0010] Un cinquième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention.
[0011] Un sixième objet de la présente invention concerne un vecteur comprenant la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
[0012] Un septième objet de la présente invention concerne une cellule comprenant le vecteur selon l'invention ou la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.
Description détaillée
[0013] Définitions
[0014] Les termes « anticorps anti-protéine G alpha », « anticorps anti-G alpha » ou « anticorps capables de se lier à la protéine G alpha » (ou fragment d'anticorps) sont interchangeables et désignent un anticorps (ou un fragment d'anticorps) qui se lie à la protéine G alpha avec une affinité suffisante pour être utilisé comme agent de détection (ex. pour la mise en œuvre d'un RET), de diagnostic et/ou thérapeutique en ciblant la protéine G alpha.
[0015] Le terme « anticorps », également appelé « immunoglobuline » désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. Chaque domaine variable comprend généralement 4 « régions charnières » (appelées FRI, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l'antigène, dites « CDR » (appelées CDR1, CDR2, CDR3). L'anticorps peut être, par exemple, un anticorps de mammifère, tel qu'un anticorps murin, un anticorps chimérique, un anticorps humanisé ou un anticorps humain.
[0016] Par « anticorps chimérique », on entend un anticorps dont les séquences des régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente de celle des séquences de régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Aux fins de l'invention, les séquences des régions variables des chaînes lourdes et légères sont préférentiellement d'origine murine tandis que les séquences des régions constantes des chaînes lourdes et légères appartiennent à une espèce non- murine. A cet égard, pour les régions constantes, toutes les espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés ou encore les oiseaux, cette liste n'étant pas exhaustive. De façon préférée, les anticorps chimériques selon l'invention contiennent des séquences de régions constantes des chaînes lourdes et légères d'origine humaine et les séquences de régions variables des chaînes lourdes et légères d'origine murine.
[0017] Par « anticorps humanisé », on entend un anticorps dont tout ou partie des séquences des régions impliquées dans la reconnaissance de l'antigène (les régions hypervariables ou CDR : Complementarity Determining Région) et parfois certains acides aminés des régions FR (régions Framework) sont d'origine non-humaine tandis que les séquences des régions constantes et des régions variables non-impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont d'origine humaine.
[0018] Par « anticorps humain », on entend un anticorps contenant uniquement des séquences humaines, aussi bien pour les régions variables et constantes des chaînes légères que pour les régions variables et constantes des chaînes lourdes.
[0019] On entend par « fragment d'anticorps », toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bioproduction comprenant au moins un pont disulfure et qui est capable de se lier à l'antigène reconnu par l'anticorps entier, par exemple Fab, Fab', F(ab')2, Fab'-SH. La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère deux fragments identiques, qu'on appelle les fragments Fab (Fragment antigen binding), et un fragment Fc (Fragment cristallisable). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides. F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires. Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
[0020] Le terme « affinité » fait référence à la force de l'ensemble des interactions non- covalentes entre une molécule, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps et l'antigène reconnu, par exemple un antigène tel que la protéine G alpha. L'affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET ou en SPR.
[0021] Au sens de la présente invention, « l'identité » ou « l'homologie » est calculée en comparant deux séquences alignées dans une fenêtre de comparaison. L'alignement des séquences permet de déterminer le nombre de positions (nucléotides ou acides aminés) en commun pour les deux séquences dans la fenêtre de comparaison. Le nombre de positions en commun est donc divisé par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité. La détermination du pourcentage d'identité de séquence peut être effectuée manuellement ou grâce à des programmes informatiques bien connus.
[0022] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'identité ou l'homologie correspond à au moins une substitution, par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substitutions, d'un résidu d'acide aminé, de préférence au moins une substitution d'un résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative. La « substitution d'un résidu d'acide aminé réalisée de façon conservative » consiste à remplacer un résidu d'acide aminé par un autre résidu d'acide aminé, ayant une chaîne latérale possédant des propriétés similaires. Les familles d'acides aminés possédant des chaînes latérales avec des propriétés similaires sont bien connues, on peut citer par exemple les chaînes latérales basiques (e.g., lysine, arginine, histidine), les chaînes latérales acides (e.g., aspartic acid, glutamic acid), les chaînes latérales polaires et non chargées (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), les chaînes latérales apolaires (e.g., glycine, cysteine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, méthionine, tryptophan), les chaînes latérales beta-ramifiées (e.g., threonine, valine, isoleucine) et les chaînes latérales aromatiques (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
[0023] Les anticorps ou fragments d'anticorps homologues ou « variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps » (c'est-à-dire des anticorps ou fragments d'anticorps ayant la même fonction) possèdent donc certains acides aminés qui peuvent être substitués par d'autres acides aminés au niveau des régions constantes et/ou des régions variables, sans perdre la capacité de liaison à l'antigène. Il est préférable que cette substitution soit réalisée au sein de la séquence d'ADN qui code pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps, c'est-à-dire que la substitution soit conservative en nature. L'Homme du métier utilise ses connaissances générales pour déterminer le nombre de substitutions qui peuvent être réalisés et leur localisation afin de pouvoir conserver la fonction de l'anticorps ou du fragment d'anticorps. Afin de déterminer la capacité d'un ou plusieurs variants d'anticorps ou de fragment d'anticorps à se lier spécifiquement à un antigène, plusieurs méthodes appropriées, bien connues de l'homme du métier et décrites dans l'art antérieur, peuvent être utilisées. Les anticorps ou les fragments d'anticorps peuvent donc être testés par les méthodes de liaison, comme par exemple la méthode ELISA, la méthode par chromatographie d'affinité, etc. Les variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps peuvent être générés par exemple par la méthode de « phage display » permettant de générer une librairie de phage. Un grand nombre de méthodes sont connues afin de générer une librairie de « phage display » et cibler les variants d'anticorps ou de fragments d'anticorps ayant les caractéristiques fonctionnelles recherchées.
[0024] Par « purifié » et « isolé », on entend, en se référant à un anticorps ou un fragment d'anticorps selon l'invention, que l'anticorps est présent en l'absence substantielle d'autres macromolécules biologiques du même type. Le terme "purifié" tel qu'utilisé ici signifie de préférence au moins 75% en masse, plus préférablement au moins 85% en masse, encore plus préférablement au moins 95% en masse, et le plus préférablement au moins 98% en masse d'anticorps, par rapport à l'ensemble des macromolécules présentes.
[0025] Le terme « protéine G » désigne une protéine hétéro-trimérique composée de trois sous-unités appelées protéine G alpha, protéine G bêta et protéine G gamma.
[0026] Le terme « Protéine G alpha » ou « G alpha » désigne la sous-unité alpha de la protéine G. La protéine G alpha possèdent deux domaines, le domaine GTPase, et le domaine hélice alpha. Il existe au moins 20 protéines G alpha différentes, qui peuvent se classer parmi les principales familles de protéines suivantes : G alphas (connu pour activer l'adénylate cyclase afin d'augmenter la synthèse de l'AMPc), G alphai (connu pour inhiber l'adénylate cyclase), G alphaolf (associé aux récepteurs olfactifs), G alphat (connu pour la transduction des signaux visuels dans la rétine en conjonction avec la rhodopsine), G alphaq (connu pour stimuler la phospholipase C) ou la famille G alpha!2 / 13 (connue pour réguler le cytosquelette, les jonctions cellulaires, et d'autres processus liés au mouvement de la cellule). La protéine G alpha peut être choisie parmi la protéine G alphai, G alphao et/ou G alphaz. La protéine G alphai peut être choisie parmi la protéine G alphail, G alphai2 et G alphai3. La protéine G alphai peut être d'origine humaine ou animale.
[0027] Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention se lie à la protéine G alphai, G alphao et/ou G alphaz, par exemple il se lie à la protéine G alphail, à la protéine G alphai2 et/ou à la protéine G alphai3. La protéine G alphail d'origine humaine porte l'identifiant UniProt P63096-1 pour l'isoforme 1 et l'identifiant UniProt P63096-2 pour l'isoforme 2. Le gène codant pour la protéine G alphail d'origine humaine est connu sous le nom de « GNAI1 » (Gene ID : 2770, NCBI).
[0028] Le terme « GTP » désigne la guanosine triphosphate.
[0029] Le terme « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable » désigne un analogue du GTP qui n'est pas hydrolysé ou peu hydrolysé en GDP. On peut citer par exemple le GTPgammaS (CAS no. 37589-80-3), le GppNHp (CAS no. 148892-91-5) ou le GppCp (CAS no. 10470-57-2).
[0030] Les termes « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET » ou « GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué » sont interchangeables et désignent soit un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET donneur (« GTP-donneur »), soit un GTP non hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un membre d'un couple de partenaire de RET accepteur (« GTP-accepteur »)
[0031] Le terme « RET » (de l'anglais « Résonance Energy Transfer ») désigne les techniques de transfert d'énergie, dont le FRET et le BRET.
[0032] Le terme « FRET » (de l'anglais « Fluorescence Résonance Energy Transfer ») désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Forster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis. Par exemple, la constante de dissociation (Kd) entre un anticorps et sa cible peut être mesurée par FRET, par exemple comme décrit dans les exemples.
[0033] Le terme « BRET » (de l'anglais « Bioluminescence Résonance Energy Transfer ») désigne le transfert d'énergie entre une molécule bioluminescente et une molécule fluorescente.
[0034] Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention
[0035] Un premier objet de l'invention concerne un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, et
- un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS (soit les trois acides aminés « Asp Thr Ser», c'est à dire les trois acides aminés acide aspartique, thréonine et sérine), et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
[0036] Le domaine variable de la chaîne lourde peut comprendre :
- un FRI présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6,
- un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7,
- un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, et/ou
- un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9. [0037] Le domaine variable de la chaîne légère peut comprendre :
- un FRI présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10,
- un FR2 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 11,
- un FR3 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12, et/ou
- un FR4 présentant au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou même 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13.
[0038] Dans un mode de réalisation particulier de l'anticorps selon l'invention :
• le domaine variable de la chaîne lourde comprend :
- un FRI de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 (i.e. 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6),
- un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7,
- un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, et
- un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9 ; et
• le domaine variable de la chaîne légère comprend :
- un FRI de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10,
- un FR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 11,
- un FR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12, et
- un FR4 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13.
[0039] Dans un mode de réalisation particulier de l'anticorps selon l'invention, le domaine variable de la chaîne lourde peut présenter au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et le domaine variable de la chaîne légère peut présenter d'homologie au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15.
[0040] Ainsi, l'invention concerne un anticorps ou fragment d'anticorps dans lequel :
- le domaine variable de la chaîne lourde présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 ;
- le domaine variable de la chaîne légère présente au moins 80% d'homologie, de préférence au moins 90% d'homologie, par exemple au moins 95% d'homologie, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d'homologie d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15 ; et
- le CDR1 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, le CDR2 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, le CDR3 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, le CDR1 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, le CDR2 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés DTS, et le CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
[0041] Avantageusement, le domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 (i.e. le domaine variable de la chaîne lourde présente 100% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14) et le domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 15.
[0042] L'anticorps décrit dans les exemples sous la référence DSV36S comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 15.
[0043] L'anticorps ou fragment d'anticorps selon le premier objet décrit ci-dessus est appelé « anticorps ou fragment d'anticorps de référence » ci-après. [0044] Un second objet de l'invention concerne un anticorps ou un fragment d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence, ci-après « anticorps ou fragment d'anticorps compétiteur ».
[0045] La capacité d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps à entrer en compétition avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour la liaison à la protéine G alpha peut être testée par une méthode par compétition. Une « méthode par compétition » consiste à tester un anticorps (ou un fragment d'anticorps) pour ses capacités à bloquer la liaison entre un anticorps ou fragment d'anticorps de référence et un antigène ou à entrer en compétition avec un anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour la liaison à l'antigène. En d'autres termes, un anticorps qui entre en compétition avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence se lie au même épitope que l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence ou à un épitope qui est suffisamment proches de l'épitope reconnu par l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour empêcher la liaison de l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence pour des raisons d'encombrements stériques.
[0046] De nombreux types de méthodes par compétition peuvent être utilisés pour déterminer si un anticorps ou un fragment d'anticorps entre en compétition avec un anticorps ou fragment d'anticorps de référence, par exemple: par un test ELISA par compétition, par une méthode d'immuno-fluorescente e.g. par un test FRET ou HTRF (« Homogeneous Time Resolved Fluorescence »), par une méthode d'immuno- luminescence, par une méthode du sandwich direct ou indirect, par dosage radio immunologique (RIA) direct ou indirect en phase solide, par dosage immuno enzymatique en phase solide directe ou indirecte (EIA), par une technologie de résonance plasmonique de surface (ex. BIACORE), par cytométrie de flux, par polarisation de fluorescence (par exemple entre un peptide fluorescent et l'anticorps à tester), etc. Par exemple, la méthode ELISA par compétition implique l'utilisation d'un antigène purifié lié à une surface solide ou à des cellules, l'anticorps à tester qui se lie à l'antigène non marqué et un anticorps ou fragment d'anticorps de référence marqué. Habituellement, l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence est présent en concentration non saturante (par rapport à sa constante de dissociation Kd pour la protéine Galpha) et on mesure le signal à des concentrations croissantes de l'anticorps ou du fragment d'anticorps à tester. Lorsqu'un anticorps est présent en excès, il peut bloquer ou inhiber (par exemple réduire) la liaison spécifique d'un anticorps ou fragment d'anticorps de référence à un antigène d'au moins 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou 75% ou plus. Dans certains cas, la liaison est inhibée d'au moins 80 à 85%, 85 à 90%, 90 à 95%, 95 à 97% ou 97% ou plus.
[0047] En particulier, les anticorps ou les fragments d'anticorps qui entrent en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence sont identifiés par la mise en œuvre d'un test HTRF ou par la mise en œuvre d'un test de polarisation de fluorescence, de préférence d'un test HTRF. Lorsqu'un anticorps ou un fragment d'anticorps entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou le fragment d'anticorps de référence, il est capable d'inhiber un signal HTRF généré par l'anticorps ou le fragment d'anticorps de référence. A l'inverse, un anticorps ou un fragment d'anticorps qui n'entre pas en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou le fragment d'anticorps de référence n'est pas capable d'inhiber un signal HTRF généré par l'anticorps ou le fragment d'anticorps de référence.
[0048] Les anticorps ou fragments d'anticorps compétiteurs selon l'invention peuvent, par exemple, être obtenus avec l'anticorps ou fragment d'anticorps de référence par la mise en œuvre du protocole décrit dans l'Exemple 1. L'anticorps DSV38S est un anticorps compétiteur selon l'invention.
[0049] Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps DSV38S et/ou l'anticorps DSV36S est/sont exclu(s) des anticorps ou fragments d'anticorps compétiteur(s) selon l'invention.
[0050] Les anticorps ou fragments d'anticorps de référence et les anticorps ou fragments d'anticorps compétiteurs tels que définis ci-dessus sont appelés conjointement « anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention » ci-après.
[0051] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut se lier a la protéine G alpha sous une forme isolée et/ou présente dans un environnement membranaire, par exemple il peut se lier a une protéine G alpha présente dans une préparation de membranes portant un ou plusieurs RCPG et une ou plusieurs protéines G alpha. Il n'est pas nécessaire que la protéine G alpha soit complexée avec le RCPG pour que l'anticorps selon l'invention puisse se lier à la protéine G alpha.
[0052] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM. Une constante de dissociation inférieure à 20 nM est préférable pour la bonne mise en œuvre d'un RET. Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut se lier à la protéine G alpha avec une constante de dissociation (Kd) mesurée en FRET inférieure ou égale à 20 nM, par exemple une constante d'affinité inférieure ou égale à 10 nM ou encore inférieure ou égale à 5 nM, par exemple allant de 0 à 20 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 10 nM (0 étant exclu), allant de 0 à 5 nM (0 étant exclu). Un procédé pour mesurer le Kd d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps selon l'invention en FRET est décrit à l'Exemple 2.
[0053] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut être utilisé dans un procédé de RET avec un GTP marqué par un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0054] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention est particulièrement avantageux dans la mise en œuvre d'un RET, en particulier d'un FRET, notamment pour détecter l'activation d'une protéine G alpha. Ainsi, l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut être couplé à une molécule permettant sa détection. Avantageusement, l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut être marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0055] Par exemple, des anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent être obtenus par la mise en œuvre du protocole décrit dans l'Exemple 1.
[0056] Les inventeurs ont également montrés que les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention se lient au domaine SwitchlI de la protéine G alpha, et plus particulièrement au peptide 215-294 de la protéine G alpha.
[0057] Marquage de l'anticorps ou du fragment d'anticorps selon l'invention
[0058] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut être marqué de manière directe ou indirecte selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple comme décrit ci-après, mais de manière préférée, l'anticorps est marqué de manière directe, par liaison covalente avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0059] Le terme « couple de partenaires de RET » désigne un couple constitué d'un composé donneur d'énergie (ci-après « composé donneur ») et d'un composé accepteur d'énergie (ci-après « composé accepteur »); lorsqu'ils sont à proximité l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé donneur, ces composés émettent un signal de RET. Il est connu que pour que deux composés soient partenaires de RET, le spectre d'émission du composé donneur doit recouvrir partiellement le spectre d'excitation du composé accepteur. Par exemple, on parle de « couples de partenaires de FRET » lorsqu'on utilise un composé fluorescent donneur et un composé accepteur ou de « couple de partenaires de BRET » lorsqu'on utilise un composé bioluminescent donneur et un composé accepteur.
[0060] Le marquage direct de l'anticorps ou du fragment d'anticorps par un membre d'un couple de partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met en œuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes classiques connues de l'homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur l'anticorps ou le fragment d'anticorps. Par exemple, les groupes réactifs suivants peuvent être utilisés : le groupe amino terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
[0061] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par l'anticorps ou le fragment d'anticorps. Les groupes réactifs appropriés, portés par l'anticorps ou le fragment d'anticorps, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par l'anticorps ou le fragment d'anticorps. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine présente sur l'anticorps ou le fragment d'anticorps.
[0062] L'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention peut également être marqué par un composé fluorescent ou bioluminescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu de mesure un anticorps ou un fragment d'anticorps, lui-même lié de manière covalente à un composé accepteur / donneur, ce deuxième anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant de manière spécifique l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention.
[0063] Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur l'anticorps ou le fragment d'anticorps à marquer, puis d'incuber cet anticorps ou fragment d'anticorps biotinylé en présence de streptavidine marquée par un composé accepteur / donneur. Des anticorps ou fragment d'anticorps biotinylés appropriés peuvent être préparés par des techniques bien connues de l'homme du métier ; la société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec un fluorophore dont la dénomination commerciale est « d2 » (réf. 610SADLA).
[0064] Dans le cadre de l'invention, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par (i) un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). De préférence, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher).
[0065] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé fluorescent accepteur, par exemple choisi parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole et un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange et le DsRed.
[0066] Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé fluorescent donneur, par exemple choisi parmi un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole, de préférence choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dot ; les chélates et les cryptâtes d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
[0067] Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé luminescent donneur, par exemple choisi parmi la Luciférase (lue), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase.
[0068] Les méthodes de marquage et les marqueurs qui peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention sont décrits dans la demande de brevet français déposée le 30/01/2019 sous le numéro FR1900880, incorporée ici par référence. [0069] Composition d'anticorps ou de fragment d'anticorps
[0070] Un troisième objet de l'invention concerne une composition comprenant l'anticorps ou le fragment d'anticorps décrit ci-dessus. La composition selon l'invention peut comprendre en outre une source de GTP marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0071] Le GTP marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET est décrit ci- après dans la partie « kit-of-parts ».
[0072] Trousse de réactifs ( Kit-of-parts]
[0073] Un quatrième objet de l'invention concerne une trousse de réactifs (kit-of-parts) comprenant (i) l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention (de référence ou compétiteur tels que définis ci-dessus) et (ii) une source de GTP marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET (ci-après « GTP marqué »).
[0074] Le GTP peut être un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable, tel que le GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp.
[0075] Le GTP peut être marqué de manière directe ou indirecte. De préférence, le GTP est marqué de manière directe. Le marquage direct du GTP par un membre d'un couple de partenaires de RET, par exemple un composé fluorescent quand on met en œuvre un FRET, peut être effectué par les méthodes reposant sur la présence de groupes réactifs sur le GTP.
[0076] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d'un couple de partenaires de RET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d'un couple de partenaires de RET, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols. De même, un composé donneur / accepteur portant un ester de N-hydroxysuccinimide sera capable de se fixer de manière covalente à une amine.
[0077] Dans le cadre de l'invention, le GTP est marqué par (i) un composé fluorescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). De préférence, le GTP est marqué par un composé fluorescent donneur. [0078] Dans un mode de réalisation particulier, le GTP marqué est un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un composé fluorescent donneur choisi parmi GTPgN-C2 (GTP-gamma-N-C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP- gamma-N-octyl-C2), GTPgN-octyl-Cll (GTP-gamma-N-octyl-Cll), GTPgN-octyl-C3 (GTP- gamma-N-octyl-C3), GTPgO-hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO-hexyl-C3 (GTP- gamma-0-hexyl-C3) ou GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl- thiosuccinimidyl-C2), de préférence GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
[0079] Selon l'invention, le GTP marqué est un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par un composé fluorescent accepteur choisi parmi GTPgN-octyl- Cy5, GTPgN-octyl-AF488, GTPgN-L15-Fluorescein, GTPgO-Linker-Cy5(P) ou GTPgS- Linker-Cy5(R). Le GTP peut également être marqué par un composé accepteur non fluorescent (quencher).
[0080] Le GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 est représenté ci-dessous. [0081] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le GTP est marqué par un composé fluorescent donneur et l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). Dans un autre mode de réalisation particulier, le GTP est marqué par un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher) et l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué par un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur.
[0082] Les autres GTP marqués susmentionnés et leur mode de préparation sont décrits dans la demande de brevet français déposée le 30/01/2019 sous le numéro FR1900856, incorporée ici par référence. [0083] Avantageusement, (i) est un anticorps qui comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 15 et (ii) est le GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2.
[0084] Autres objets
[0085] Un cinquième objet de la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant pour l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'invention (de référence ou compétiteur).
[0086] Un sixième objet de la présente invention concerne un vecteur comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Tout type de vecteur adapté à la production d'anticorps peut être utilisé dans le cadre de l'invention. En particulier, le vecteur est un vecteur recombinant. Le vecteur comprendra les séquences nucléiques nécessaires pour produire l'anticorps selon l'invention, par exemple des séquences promotrices, des séquences régulatrices, etc. La préparation d'un vecteur approprié est largement décrite dans la littérature.
[0087] Un septième objet de l'invention concerne une cellule comprenant un vecteur selon l'invention ou une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. La cellule selon l'invention peut être obtenue par des méthodes largement décrites dans la littérature, par exemple en transfectant un clone cellulaire avec un vecteur selon l'invention ou une séquence d'acides nucléiques. L'invention n'est pas limitée à un type cellulaire particulier. Toute cellule capable de produire des anticorps peut être utilisée dans le cadre de l'invention. Il peut s'agir de cellules eucaryotes, telles que les cellules de mammifères, par exemple les cellules humaines ou de souris ou de cellules procaryotes, par exemple les bactéries ou encore les levures.
[0088] L'invention sera davantage illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et ces figures ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l'invention. Brève description des figures
[0090] La Figure 1 représente le schéma réactionnel d'un FRET permettant de mesurer le Kd d'un anticorps anti-protéine G alphail.
[0091] La Figure 2 représente des courbes qui illustrent l'affinité des anticorps SC13533, DSV36S et DSV38S marqués au d2 pour la protéine Gail humaine. En présence de la protéine Gail, un signal HTRF très significatif est obtenu avec tous les anticorps en présence et en absence de nucléotide (GTPgS ou GDP). Les résultats indiquent que les anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 sont capables de lier la protéine Gail. Les courbes permettent de calculer l'affinité (Kd) de ces différents anticorps pour la protéine Gail (Tableau 1).
[0092] La Figure 3 est une courbe qui illustre la capacité des anticorps non marqués DSV36S, DSV38S et SC 13533 à inhiber la liaison de l'anticorps SC13533-d2 sur la protéine Gil humaine. De manière logique, l'anticorps SC 13533 non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC 13533-d2. A l'inverse, les anticorps DSV36S et DV38S n'ont pas été capables d'inhiber le signal généré par le SC 13533-d2. Ceci démontre que ces 2 anticorps ne se lient pas sur la même région de la protéine Gail que l'anticorps SC 13533. En conclusion les anticorps DSV36S et DSV38S reconnaissent des épitopes différents de l'anticorps SC 13533.
[0093] La Figure 4 représente la capacité des anticorps commerciaux sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N à inhiber la liaison de l'anticorps DSV SC13533-d2 sur la protéine Gil humaine. De manière logique, l'anticorps DSV SC13533 non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC13533-d2. Egalement, les anticorps sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC13533-d2. En conclusion, les anticorps commerciaux sc-13533, sc- 56536 et AM05302PU-N sont tous des anticorps non-compétiteurs de l'anticorps DSV 36S. Tous ces anticorps reconnaissent donc un épitope différent de l'anticorps DSV 36S.
[0094] La Figure 5 représente la capacité des anticorps commerciaux sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N à inhiber la liaison de l'anticorps DSV 3S-d2 (généré au laboratoire) sur la protéine Gil humaine. De manière logique, l'anticorps DSV 3S non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-d2. Egalement, les anticorps sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-d2. En conclusion, ces résultats démontrent que les anticorps commerciaux sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N sont tous des anticorps non-compétiteurs de l'anticorps DSV 36S. Il en est donc de même pour l'anticorps DSV 3S fait au laboratoire. Tous ces anticorps reconnaissent donc un épitope différent de l'anticorps DSV 36S.
[0095] La Figure 6 est une courbe qui illustre la capacité des anticorps non marqués DSV36S et DSV38S à inhiber la liaison de l'anticorps DSV36S-d2 sur la protéine Gail. De manière logique, l'anticorps DSV36S non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec l'anticorps DSV36S-d2. L'anticorps DSV38S a aussi inhibé complètement le signal généré par le DSV36S-d2. Ceci démontre que ces 2 anticorps se lient sur la même région de la protéine G ail. En conclusion l'anticorps DSV38S entre en compétition pour la liaison à la protéine G alphai avec l'anticorps DSV36S.
[0096] La Figure 7 représente la capacité des anticorps commerciaux DSV 36S, DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S à inhiber la liaison de l'anticorps DSV36S-d2 sur la protéine Gil humaine. De manière logique, l'anticorps DSV36S non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV36S-d2. A l'inverse, les anticorps DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S n'ont pas été capables d'inhiber le signal généré par le DSV 36S-d2. Ceci démontre que ces trois anticorps ne se lient pas sur la même région de la protéine Gail humaine que l'anticorps DSV 36S. En conclusion ces anticorps reconnaissent des épitopes différents de l'anticorps DSV 36S.
[0097] Les Figures 8A et 8B représentent le schéma réactionnel d'un FRET permettant de mesurer la sélectivité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 pour différents types de protéines Ga.
[0098] La Figure 9 est un diagramme qui représente le signal FRET pour différents types de protéines Ga obtenu avec une paire d'anticorps Anti-Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb / Anti- FLAG-d2, ce qui permet de vérifier que toutes les protéines Ga encodées par les plasmides étaient bien sur-exprimées dans les HEK293. En effet, le signal HTRF obtenu avec chacune d'entre elles était très supérieur au signal HTRF obtenu avec la condition négative (« MOCK ») qui correspond à des HEK293 transfectées avec un plasmide contrôle ne codant pour aucun protéine taggée FLAG+ Twin-Strep-tag.
[0099] La Figure 10 est un diagramme qui illustre la sélectivité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 pour les différents types de protéines Ga. Les anticorps DSV36S et DSV38S ont donné un signal HTRF positif lorsque les protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz étaient surexprimées mais n'ont pas donné de signal HTRF lorsque les protéines Gas, Gaq, Gal2 et Gal3 étaient surexprimées. L'anticorps SC13533 a donné un signal HTRF positif lorsque les protéines Gail et Gai3, étaient surexprimées mais n'a pas donné de signal HTRF lorsque les protéines Gai2, Gao, Gaz, Gas, Gaq, Gal2 et Gal3 étaient surexprimées. Ces résultats confirment que les anticorps DSV36S et DSV38S reconnaissent le même épitope sur les protéines Ga (ils ont le même profil de sélectivité et sont compétitifs). Cet épitope est différent de celui reconnu par l'anticorps SC13533 qui reconnaît un plus petit nombre de protéines Ga.
[0100] La Figure 11 est un diagramme qui illustre la capacité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 à générer un signal de TR-FRET lorsqu'ils sont associés à un analogue fluorescent du GTP (GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium) sur des préparations membranaires sur-exprimant un GPCR. La condition « GTPgS » représente le signal non spécifique de l'essai (NS) dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (IOOmM) a inhibé la liaison du GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. La condition « tampon » a montré qu'il était possible d'obtenir un signal de FRET modéré mais significatif entre le GTPgN- octyl-C2-Cryptate d'europium et les anticorps DSV36S et DSV 38S marqués au d2. Lors de l'ajout du SNC162 qui a provoqué l'activation des récepteurs DOR sur-exprimés dans les membranes, on a observé une augmentation de ce signal de FRET liée à une augmentation de la liaison de l'analogue GTP fluorescent sur tout ou partie des protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par les anticorps DSV36S et DSV38S. A l'inverse, malgré sa capacité à lier les protéines Gailet Gai3 qui sont exprimées de manière endogène dans les cellules HEK293 [2], l'anticorps SC 13533 n'a donné aucun signal de FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium que ce soit en absence ou en présence de SNC162. Ces résultats confirment que seuls les anticorps selon l'invention ont été capables de générer un signal de FRET.
[0101] La Figure 12 représente la capacité des anticorps DSV 36S, DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S à générer un signal de TR-FRET lorsqu'ils sont associés à un analogue fluorescent du GTP (GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium) sur des préparations membranaires non activées sur-exprimant un GPCR. La condition «Non spécifie signal» a montré qu'un faible signal de FRET basal entre l'analogue fluorescent de GTP et les anticorps marqués au d2 était détecté. La condition « Négative control » représente le signal non spécifique de l'essai dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (IOOmM) a inhibé la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. L'inhibition mesurée a été totale puisque le niveau de signal HTRF mesuré pour les conditions « Non spécifie signal » et « Négative control » est quasiment identique. Lors de l'ajout de l'analogue fluorescent de GTP et des anticorps, une augmentation du signal de FRET liée à une augmentation de la liaison des analogues fluorescents de GTP sur tout ou partie des protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par l'anticorps DSV36S a été mesurée. A l'inverse, malgré leur capacité à lier les protéines Gai dans les cellules HEK293, les anticorps DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S n'ont donné aucun signal de FRET lorsqu'ils ont été associés avec le GTPgN- octyl-C2-Cryptate d'europium. En conclusion, ces résultats confirment que seuls les anticorps décrits selon l'invention ont été capables de générer un signal de FRET.
[0102] La Figure 13 représente la capacité de l'anticorps DSV 36S et sc-13533 à générer un signal de TR-FRET lorsqu'il est associé à un analogue fluorescent du GTP (GTPgO- Linker-Cy5(P)) sur des préparations membranaires non activées sur-exprimant un GPCR. La condition «Non spécifie signal» a montré qu'un faible signal de FRET basal entre l'analogue fluorescent de GTP et les anticorps marqués au cryptate de Terbium était détecté. La condition « Négative control » représente le signal non spécifique de l'essai dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (IOOmM) a inhibé la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. L'inhibition mesurée a été totale puisque le niveau de signal HTRF mesuré pour les conditions « Non spécifie signal » et « Négative control » est quasiment identique. Lors de l'ajout de l'analogue fluorescent de GTP et des anticorps, une augmentation du signal de FRET liée à une augmentation de la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur tout ou partie des protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par l'anticorps DSV36S a été mesurée. A l'inverse, malgré sa capacité à lier les protéines Gailet Gai3 qui sont exprimées de manière endogène dans les cellules HEK293, l'anticorps sc-13533 n'a donné aucun signal de FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPgO-Linker-Cy5(P). En conclusion, seuls les anticorps décrits selon l'invention ont été capables de générer un signal de FRET.
[0103] Les Figures 14A et 14B illustrent 2 formats de FRET qui peuvent être mis en œuvre avec les anticorps selon l'invention (Formats 2A et 2B).
[0104] Les Figures 15A et 15B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0105] Les Figures 16A et 16B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2. [0106] Les Figures 17A et 17B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV38S-d2.
[0107] [Les Figures 18A et 18B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-Cll + DSV36S-d2. [0108] Les Figures 19A et 19B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgO-hexyl-C2 + DSV36S-d2.
[0109] Les Figures 20A et 20B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-C2 + DSV36S-d2.
[0110] Les Figures 21A, 21B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0111] Les Figures 22A et 22B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2.
[0112] Les Figures 23A et 23B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S avec le couple de détection : GTPgN-octyl-C2 + DSV36S-d2. [0113] Les Figures 24A et 24B illustrent un test d'activation selon le format 2B sur RCPG
Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-Cy5 + DSV36S-Lumi4Tb.
[0114] Les Figures 25A et 25B illustrent un test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTPgN-octyl-AF488 + DSV36S-Lumi4Tb.
[0115] Les Figures 26A et 26B illustrent un test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde avec le couple de détection : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 + DSV36S- d2.
Exemples
[0116] Matériel
[0117] Les préparations membranaires de cellules exprimant le récepteur Delta Opioïd (DOR) ont été achetées chez Euroscreen via une prestation de service.
[0118] Les anticorps DSV36S, DSV38S, DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S ont été générés par Cisbio Bioassays et sont disponibles auprès de Cisbio Bioassays sur demande (sous les références respectives DSV36S, DSV38S, DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S). L'anticorps DSV36S comprend un domaine variable de la chaîne lourde qui consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et un domaine variable de la chaîne légère qui consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 15. Les anticorps ont été marqués avec les sondes fluorescentes compatibles pour une détection TR-FRET (accepteur rouge - d2 ou donneur Lumi4Tb).
[0119] Les anticorps SC13533 et SC56536 ont été achetés chez Santa Cruz Biotechnology (ref SC13533 et ref SC56536). L'anticorps AM05302PU-N a été acheté chez Acris Antibodies GmbH (ref AM05302PU-N).
[0120] L'anticorps anti Twin-Strep-tag a été acheté chez IBA Lifesciences (ref 2-1517-001) et marqué avec une sonde fluorescente compatible avec une détection TR-FRET (donneur Lumi4Tb).
[0121] L'anticorps anti-FLAG-d2 est disponible auprès de Cisbio Bioassays (Ref 61FG2DLF)
[0122] Les nucléotides GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G7127 et G8634).
[0123] L'agoniste des RCPG Delta Opioïde (SNC162) a été acheté chez Tocris Biosciences (référence 1529).
[0124] Les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc et des plaques 96 puits noires (à fond noir) adaptées à la culture cellulaire ont été achetées chez Greiner Bio One (références Catalogue 784075 et 665086 respectivement).
[0125] L'analogue de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable (GTPgN-octyl-C2) marqué avec un fluorophore donneur (cryptate d'europium) a été synthétisé par Cisbio Bioassays. L'analogue de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable (GTPgO-Linker- Cy5(P)) marqué avec un fluorophore accepteur (Cy5) a été acheté chez Jena Bioscience (ref NU-834-Cy5). [0126] La protéine G alphail humaine recombinante fusionnée en N-terminal à un Tag Twin-Strep-tag a été produite et purifiée par Cisbio Bioassays
[0127] Les plasmides codant pour les différentes protéines G humaines, Gail, Gai2, Gai3, Gao, Gaz, Gas, Gaq, Gal2 et Gal3 fusionnées dans leur partie N-terminale aux tags Twin-Strep-tag et FLAG ont été synthétisés et amplifiés par la société Genecust (prestation de service).
[0128] Les cellules HEK293 ont été achetées à l'ATCC.
[0129] Les réactifs et milieux utilisés dans les expériences cellulaires, milieu Opti-MEM, Lipofectamine 2000 et poly-ornithine ont été achetés respectivement chez Thermo Fisher Scientific (réf. 51985-026 et 11668-019) et Sigma Aldrich (réf. P4957).
[0130] Méthode
[0131] Lecture du signal FRET (Technologie HTRF)
[0132] Le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante :
• Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm)
• Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs
• Fenêtre de lecture : délais : 60ps - Intégration : 400ps.
[0133] Traitement du signal HTRF
[0134] A partir des signaux bruts à 665nm et 620nm, le Ratio HTRF a été calculé selon la formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm / Signal à 620nm * 10,000.
[0135] Exemple 1 : Protocole pour obtenir des anticorps anti-protéine G alphail selon l'invention
[0136] Immunisation de souris
[0137] La protéine TST-G alphail recombinantes (protéine G alphail de séquence UniProt P63096-1 tagguée en N-terminal avec le tag TwinStreptag (TST) (IBA) via un linker TEV) a été produite dans des cellules d'insectes Sf9 (infection avec un baculovirus codant ladite protéine) puis purifiée sur une colonne d'affinité via le tag TwinStreptag (TST) (Strep-Tactin Superflow high capacity resin (IBA, Catalogue : 2-1208-002)). [0138] Des souris BALB/c ont été immunisées par injection de la protéine TST-G alphail préalablement diluée dans du tampon contenant du GTPgS (HEPES 20mM pH8, NaCI lOOmM, MgCI2 3mM, CHAPS llmM, GTPgS IOOmM). La primo-injection a été suivie de trois rappels à intervalle d'un mois.
[0139] Quinze jours après chaque injection, des ponctions sanguines sur les souris ont permis de vérifier la présence d'une réponse immunitaire.
[0140] Pour cela, un test de type ELISA a été mis en place. La protéine TST-G alphail préalablement diluée à 20pg/mL dans du tampon contenant du GTPgS (Tris HCl 20mM pH8.5, NaCI 140mM, EDTA 2mM, MgCI2 lOmM, BSA 0.1%, GTPgS ImM) a été adsorbée via le tag TwinStreptag sur des plaques 96 puits contenant de la Strep-Tactin®XT (IBA, Catalogue : 2-4101-001). Pour cela, IOOmI de protéine ont été ajoutés dans chaque puits puis incubées pendant 2h à 37°C suivi de trois lavages en tampon PBS IX, 0.05% Tween20.
[0141] Les dilutions sérielles d'un facteur 10 à 100 millions des ponctions sanguines ont ensuite été ajoutées à hauteur de 100pL / puits et incubées pendant 2h à 37°C. Les anticorps non fixés à la protéine ont été éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS IX, 0.05% Tween20 puis la détection des anticorps fixés a été réalisée à l'aide d'un anticorps secondaire anti-Fc de souris lié à la HRP (horseradish peroxidase) (Sigma #A0168 dilué au 1/10 000 dans du PBS, BSA 0.1%). Après lh d'incubation à 37°C puis trois lavages en tampon PBS IX, 0.05% Tween20, la révélation de la HRP a été réalisé par dosage colorimétrique à 450nm suite à l'incubation de son substrat TMB (3, 3', 5, 5'- Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20min à température ambiante sous agitation.
[0142] Afin de s'assurer que les anticorps détectés par le test ELISA étaient bien dirigés contre la protéine G alphail et non contre le tag TwinStrepTag, les mêmes ponctions ont été testés sur le test ELISA après pré-incubation avec un excès d'une autre protéine orthogonale tagguée avec le TwinStrepTag (SNAPTag-TwinStrepTag). Ainsi, les anticorps anti tag se fixent sur la protéine orthogonale taguée et donc pas sur la protéine G alphail attachée au fond des puits ; auquel cas aucun signal HRP ou une diminution du signal HRP est détecté.
[0143] Les souris présentant les meilleurs titres d'anticorps et le moins de baisse de signal dans le cas contrôle anti tag ont été sélectionnées pour l'étape suivante d'hybridation lymphocytaire, aussi appelée fusion. La rate des souris a été récupérée et un mélange des lymphocytes et plasmocystes issus de cette rate a été fusionné in vitro avec une lignée cellulaire de myélome en présence d'un catalyseur de la fusion cellulaire du type polyéthylène glycol. Une lignée cellulaire de myélome mutante, manquant l'enzyme HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) a été utilisée pour permettre une sélection des cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces cellules ont été cultivées dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminopterine (methotrexate) et de la thyamine (milieu HAT) pour permettre l'élimination des cellules de myélome non fusionnées et ainsi sélectionner les hybridomes d'intérêt. Les cellules de rate non fusionnées quant à elle meurent puisqu'elles sont incapables de proliférer in vitro. Ainsi, seuls les hybridomes ont survécu.
[0144] Ces hybridomes ont alors été cultivés dans des plaques de culture. Les surnageants de ces hybridomes ont ensuite été testés pour évaluer leur capacité à produire des anticorps anti protéine G alphail. Pour cela, un test ELISA comme décrit ci-dessus a été réalisé.
[0145] Afin d'évaluer la sélectivité des anticorps entre les différentes formes de la protéine Galpahil (forme pleine liée au GDP vs forme pleine liée au GTPgS vs forme vide), le test a été réalisé en parallèle sur des conditions de protéine TST-G alphail pré-incubée dans le tampon contenant soit du GDP à ImM, soit du GTPgS à ImM soit sans nucléotide. Les meilleurs hybridomes ont ensuite été clonés avec une étape de dilution limite afin d'obtenir des clones d'hybridome.
[0146] Les clones d'hybridomes d'intérêt ont ensuite été injectés dans des souris (injection intra péritonéale) afin de permettre la production des anticorps en grande quantité dans le liquide d'ascite.
[0147] Les anticorps ont ensuite été purifiés par chromatographie d'affinité sur des colonnes avec des résines présentant de la protéine A.
[0148] Capacité des anticorps purifiés ci-dessus à entrer en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps DSV36S
[0149] Tous les réactifs sont dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, NaCI lOmM. La protéine Gail est préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS est préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10pM. Ces 2 réactifs sont préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant d'être distribués dans les puits. Les anticorps purifiés ci-dessus sont préparés 4X pour viser des concentrations finales dans les puits comprises entre 0.01 et ImM. L'anticorps DSV36S- d2 est préparé 4X pour viser une concentration finale de lOnM. L'anticorps anti Twin- Strep-tag-Lumi4 Tb est préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.5nM.
[0150] Les réactifs sont distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1. 10pl du mélange pré-incubé de protéine G ail + GTPgS sont placés dans chaque puit,
2. 5pl de l'anticorps purifié sont rajoutés dans chaque puit
3. Les plaques sont incubées pendant 30 minutes à température ambiante
4. 5pl du mélange anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et anticorps DSV36S-d2 sont rajoutés dans chaque puit.
[0151] Les plaques sont incubées 1H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0152] Les anticorps selon l'invention sont capables d'inhiber le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV36S-d2. A l'inverse, les anticorps qui ne sont pas selon l'invention ne sont pas capables d'inhiber le signal généré par le DSV36S-d2.
[0153] Exemple 2 : Détermination de l'affinité des anticorps SC13533. DSV36S. DSV38S marqués au d2 pour la protéine Gail
[0154] Protocole expérimental
[0155] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, NaCI lOmM. La protéine Gail a été préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de IOOmM. Ces 2 réactifs ont été préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant d'être distribués dans les puits. Les anticorps DSV36S-d2, DSV38S-d2 et SC13533-d2 ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits comprises entre 0.01 et lOnM selon les anticorps. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.25nM.
[0156] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1) 10mI du mélange pré-incubé de protéine Gail + tampon seul ou GTPgS ou GDP ont été placés dans chaque puit,
2) 5mI de l'anticorps DSV36S ou DSV38S ou SC13533 marqué au d2 ont été rajoutés dans chaque puit,
3) 5mI de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb ont été rajoutés dans chaque puit.
[0157] Les plaques ont été incubées 24H à température ambiante avant de lire le signal HTRF. [0158] Le schéma réactionnel est illustré à la Figure 1.
[0159] Résultats
[0160] La Figure 2 montre les résultats obtenus avec les anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 marqués au d2. En présence de la protéine Gail, un signal HTRF très significatif est obtenu avec tous ces anticorps en présence et en absence de nucléotide (GTPgS ou GDP). Ces résultats indiquent que les anticorps DSV36S, DSV38S et SC13533 sont capables de lier la protéine Gail.
[0161] De plus les courbes de titration en anticorps réalisées permettent de calculer l'affinité (Kd) de ces différents anticorps pour la protéine Gail. Ceci a été effectué au travers du logiciel GraphPad Prism en appliquant un modèle « one site spécifie binding » aux données HTRF. Les valeurs de Kd obtenues sont présentées dans le Tableau 1.
Tableau 1 :
[0162] Les valeurs de Kd montrent que les 3 anticorps ont une excellente affinité pour la protéine Gail, les valeurs de Kd étant comprises entre 0.1 et lnM quel que soit l'état de la protéine.
[0163] On peut toutefois noter que les anticorps DSV36S et DSV38S présentaient un signal et une affinité plus élevés lorsque la protéine Gail était liée à un nucléotide (notamment GTPgS). A l'inverse, l'anticorps SC13533 présentait un signal et une affinité similaires quel que soit l'état de la protéine Gail. Ceci suggère que l'anticorps SC13533 ne se lie pas de la même manière que les anticorps DSV36S et DSV38S sur la protéine Gail. [0164] Exemple 3 : Capacité des anticorps non marqués DSV36S. DSV38S, SC
13533. SC56536 et AM05302PU-N à inhiber la liaison de l'anticorps SC13533- d2 sur la protéine Gil
[0165] Protocole expérimental
[0166] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, NaCI lOmM. La protéine Gail a été préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10pM. Ces 2 réactifs ont été préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant d'être distribués dans les puits. Les anticorps froids DSV36S, DSV38S et SC13533 ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits comprises entre 0.01 et lOOnM. L'anticorps SC 13533-d2 a été préparé 4X pour viser une concentration finale de lOnM. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.5nM.
[0167] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1) 10mI du mélange pré-incubé de protéine Gail + GTPgS ont été placés dans chaque puit,
2) 5mI de l'anticorps DSV36S ou DSV38S ou ou SC56536 ou AM05302PU-N ou SC13533 non-marqué ont été rajoutés dans chaque puits,
3) Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante,
4) 5mI de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et de l'anticorps SC13533-d2 ont été rajoutés dans chaque puits.
[0168] Les plaques ont été incubées 1H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0169] Résultats
[0170] La Figure 3 montre les résultats obtenus avec les anticorps DSV 36S, DSV 38S et SC 13533. De manière logique, l'anticorps SC 13533 non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC 13533-d2. A l'inverse, les anticorps DSV36S et DV38S n'ont pas été capables d'inhiber le signal généré par le SC 13533-d2. Ceci démontre que ces 2 anticorps ne se lient pas sur la même région de la protéine Gail que l'anticorps SC 13533. En conclusion les anticorps DSV36S et DSV38S reconnaissent des épitopes différents de l'anticorps SC 13533. [0171] La Figure 4 montre les résultats obtenus avec les anticorps SC13533, SC56536 et AM05302PU-N. De manière logique, l'anticorps DSV SC13533 non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC13533-d2. Egalement, les anticorps sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC13533-d2. L'anticorps SC 13533 n'entrant pas en compétition avec les anticorps DSV36S et DSV38S, et les anticorps SC56536 et AM05302PU-N étant capable d'inhiber le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps SC13533-d2, les anticorps sc- 56536 et AM05302PU-N sont donc également des anticorps non-compétiteurs de l'anticorps DSV 36S.
[0172] En conclusion, les résultats présentés en Figures 3 et 4 démontrent que les anticorps commerciaux sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N sont tous des anticorps non- compétiteurs de l'anticorps DSV 36S. Tous ces anticorps reconnaissent donc un épitope différent de l'anticorps DSV 36S.
[0173] Exemple 4 : Capacité des anticorps non marqués DSV3S. SC56536. AM05302PU-N et SC 13533 à inhiber la liaison de l'anticorps DSV3S-d2 sur la protéine Gil
[0174] Protocole expérimental
[0175] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, NaCI lOmM. La protéine Gail a été préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10pM. Ces 2 réactifs ont été préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant d'être distribués dans les puits. Les anticorps froids DSV3S, SC56536, AM05302PU-N et SC 13533_ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits comprises entre 0.03 et 300nM. L'anticorps DSV3S-d2 a été préparé 4X pour viser une concentration finale de lOnM. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.25nM.
[0176] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1) 10mI du mélange pré-incubé de protéine Gail + GTPgS ont été placés dans chaque puit,
2) 5mI de l'anticorps DSV 3S ou SC56536 ou SC13533 ou AM05302PU-N non-marqués ont été rajoutés dans chaque puits, 3) Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante,
4) 5pl de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et de l'anticorps DSV 3S-d2 ont été rajoutés dans chaque puits.
[0177] Les plaques ont été incubées 1H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0178] Résultats
[0179] La Figure 5 montre les résultats obtenus. De manière logique, l'anticorps DSV 3S non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-d2. Egalement, les anticorps sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N ont inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV 3S-d2. En conclusion, ces résultats associés à ceux présentés dans l'exemple 3, démontrent que les anticorps commerciaux sc-13533, sc-56536 et AM05302PU-N sont tous des anticorps non-compétiteurs de l'anticorps DSV 36S. Il en est donc de même pour l'anticorps DSV 3S fait au laboratoire. Tous ces anticorps reconnaissent donc un épitope différent de l'anticorps DSV 36S.
[0180] Exemple 5 : Capacité des anticorps non marqués DSV36S. DSV38S, DSV3S, DSV26S et DSV39S à inhiber la liaison de l'anticorps DSV36S-d2 sur la protéine Gail
[0181] Protocole expérimental
[0182] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, NaCI lOmM. La protéine Gail a été préparée 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 2.5nM. Le nucléotide GTPgS a été préparé 2X pour obtenir une concentration finale dans les puits de IOOmM. Ces 2 réactifs ont été préparés dans une même solution et pré-incubés 30 minutes à température ambiante avant d'être distribués dans les puits. Les anticorps froids DSV36S, DSV38S, DSV26S, DSV3S, et DSV39S ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits comprises entre 0.001 et ImM. L'anticorps DSV36S-d2 a été préparé 4X pour viser une concentration finale de lOnM. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.25nM.
[0183] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1) 10mI du mélange pré-incubé de protéine Gail + GTPgS ont été placés dans chaque puit, 2) 5mI de l'anticorps DSV36S, DSV38S, DSV26S, DSV3S, et DSV39S non-marqués ont été rajoutés dans chaque puit,
3) Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante,
4) 5mI de l'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb et de l'anticorps DSV36S-d2 ont été rajoutés dans chaque puit.
[0184] Les plaques ont été incubées 1H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0185] Résultats
[0186] La Figure 6 montre les résultats obtenus avec les anticorps DSV36S et DSV38S. De manière logique, l'anticorps DSV36S non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec l'anticorps DSV36S-d2. L'anticorps DSV38S a aussi inhibé complètement le signal généré par le DSV36S-d2. Ceci démontre que ces 2 anticorps se lient sur la même région de la protéine Gail. La Figure 7 montre les résultats obtenus avec les anticorps DSV36S, DSV26S, DSV3S et DSV39S. De manière logique, l'anticorps DSV36S non marqué a inhibé complètement le signal HTRF obtenu avec de l'anticorps DSV36S-d2. A l'inverse, les anticorps DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S n'ont pas été capables d'inhiber le signal généré par le DSV 36S-d2. Ceci démontre que ces 3 anticorps ne se lient pas sur la même région de la protéine Gail humaine que l'anticorps DSV 36S.
[0187] En conclusion seul l'anticorps DSV38S entre en compétition pour la liaison à la protéine G alphai avec l'anticorps DSV36S et partage donc le même épitope.
[0188] Exemple 6 : Sélectivité des anticorps DSV36S. DSV38S et SC13533 pour les différents types de protéines Ga lorsque celles-ci sont sur-exprimées dans des cellules HEK293
[0189] Jour 1 : transfection des cellules HEK293 par des plasmides codant pour les différentes protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao, Gaz, Gas, Gaq, Gal2 et Gal3 humaines
[0190] Une solution contenant 1 million de cellules HEK/ml a été préparée en milieu OptiMEM. Des mélanges plasmides / Lipofectamine contenant 150ng/puits de plasmides et 0.375mI de lipofectamine ont été préparés dans du milieu OptiMEM 30 minutes avant leur ajout dans la plaque 96 puits à fond noir.
[0191] Distribution des réactifs dans chaque puits de la microplaque noire adaptée à la culture cellulaire : 1) 50mI par puits de poly-ornithine ont été incubés 30 minutes à température ambiante puis la solution a été retirée de chaque puits par aspiration.
2) 50mI de la préparation de HEK293 (densité cellulaire de 50000 cellules par puits) ont été rajoutés dans chaque puit
3) 50mI du mélange plasmides codant pour une protéine G + lipofectamine ont été rajoutés dans chaque puit.
[0192] Les microplaques ont été incubées 24H à 37°C et 5%C02 (étuve régulée).
[0193] Jour 2 : test HTRF de mesure de la sélectivité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC 13533
[0194] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, Triton X100 0.02%. Les anticorps DSV36S-d2, DSV38S-d2 et SC13533-d2 ont été préparés 4X pour viser une concentration finale dans les puits de lOnM. L'anticorps anti Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 0.5nM. Les nucléotides GDP et GTPgS ont été préparés 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 10mM.
[0195] Les réactifs ont été distribués sur les plaques 384 puits de la manière suivante :
1) Le milieu de culture OptiMEM a été aspiré,
2) 25mI de tampon ou GDP ou GTP ont été rajoutés dans chaque puit,
3) 25mI de tampon ont été rajoutés à chaque puit,
4) 25mI d'anticorps DSV36S-d2 ou DSV38S-d2 ou SC13533-d2 ou anti-FLAG-d2 ont été rajoutés dans chaque puit,
5) 25mI d'anticorps anti Twin-Strep-tag- Lumi4 Tb ont été rajoutés dans chaque puit.
[0196] Les microplaques ont été incubées 20H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0197] Le schéma réactionnel est illustré aux Figures 8A et 8B.
[0198] Résultats
[0199] Les Figures 9 et 10 montrent les résultats obtenus lors de cette expérience.
[0200] L'utilisation d'une paire d'anticorps Anti-Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb / Anti-FLAG-d2 permet de vérifier que toutes les protéines Ga encodées par les plasmides étaient bien sur-exprimées dans les HEK293. En effet, le signal HTRF obtenu avec chacune d'entre elles était très supérieur au signal HTRF obtenu avec la condition négative (« MOCK ») qui correspond à des HEK293 transfectées avec un plasmide contrôle ne codant pour aucun protéine taggée FLAG+ Twin-Strep-tag.
[0201] La surexpression de toutes les protéines Ga étant validée on a pu alors déterminer le profil de sélectivité des anticorps DSV36S, DSV38S et SC 13533 en mesurant un éventuel FRET entre ces anticorps marqués au d2 et l'anticorps Anti-Twin-Strep-tag-Lumi4 Tb. Les anticorps DSV36S et DSV38S ont donné un signal HTRF positif lorsque les protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz étaient surexprimées mais n'ont pas donné de signal HTRF lorsque les protéines Gas, Gaq, Gal2 et Gal3 étaient surexprimées. L'anticorps SC13533 a donné un signal HTRF positif lorsque les protéines Gail et Gai3, étaient surexprimées mais n'a pas donné de signal HTRF lorsque les protéines Gai2, Gao, Gaz, Gas, Gaq, Gal2 et Gal3 étaient surexprimées. Ces résultats confirment que les anticorps DSV36S et DSV38S reconnaissent le même épitope sur les protéines Ga (ils ont le même profil de sélectivité et sont compétitifs). Cet épitope est différent de celui reconnu par l'anticorps SC13533 qui reconnaît un plus petit nombre de protéines Ga.
[0202] Exemple 7 : Capacité des anticorps DSV36S. DSV38S. DSV 26S. DSV 39S. DSV 3S et SC13533 à générer un signal de TR-FRET lorsqu'ils sont associés à un analogue fluorescent du GTP sur des préparations membranaires surexprimant un G PCR
[0203] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, NaCI 300mM et 0.5mM GDP. Des membranes HEK293 exprimant le récepteur DOR ont été préparés 4X pour viser une quantité finale dans les puits de 10pg. Les anticorps DSV36S-d2, DSV38S-d2, SC13533-d2 et anti-FLAG-d2 ont été préparés 4X pour viser une concentration finale dans les puits de lOnM. Le GTPgN-octyl-C2 marqué par un cryptate d'europium a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 6nM. Le GTPgO-linker-Cy5 a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de 50nM. Les nucléotides GTPgS et GDP ont été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de IOOmM. Le SNC 162 a été préparé 4X pour obtenir une concentration finale dans les puits de lOpM.
[0204] Les réactifs ont été distribués dans les plaques 384 puits de la manière suivante :
1) 5pl de membranes DOR ont été placé dans chaque puit,
2) 5pl de GTPgN-octyl-C2 marqué au cryptate d'europium ou de GTPgO-linker-Cy5 ont été rajoutés dans chaque puit, 3) 5mI d'anticorps DSV36S ou DSV38S ou SC13533 ou DSV 26S ou DSV3S ou DSV 39S marqués au d2 ou DSV 36S ou SC13533 marqués au cryptate de terbium ont été rajoutés dans chaque puits,
4) 5mI de tampon ou SNC 162 ou GTPgS ont été rajoutés dans chaque puits.
[0205] Les plaques ont été incubées 20H à température ambiante avant de lire le signal HTRF.
[0206] Le schéma réactionnel est illustré à la Figure 8A.
[0207] Résultats
[0208] La Figure 11 montre les résultats obtenus lorsque l'on associe l'analogue GTPgN- octyl-C2-Cryptate d'europium avec les anticorps DSV36S-d2, DSV38S-d2 et SC13533-d2. La condition « GTPgS » représente le signal non spécifique de l'essai (NS) dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (100mM) a inhibé la liaison du GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. La condition « tampon » a montré qu'il était possible d'obtenir un signal de FRET modéré mais significatif entre le GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium et les anticorps DSV36S et DSV 38S marqués au d2. Lors de l'ajout du SNC162 qui a provoqué l'activation des récepteurs DOR sur-exprimés dans les membranes, on a observé une augmentation de ce signal de FRET liée à une augmentation de la liaison de l'analogue GTP fluorescent sur tout ou partie des protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par les anticorps DSV36S et DSV38S. A l'inverse, malgré sa capacité à lier les protéines Gailet Gai3 qui sont exprimées de manière endogène dans les cellules HEK293 [2], l'anticorps SC 13533 n'a donné aucun signal de FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPgN-octyl-C2- Cryptate d'europium que ce soit en absence ou en présence de SNC162.
[0209] De la même manière, la Figure 12 montre les résultats obtenus lorsque l'on associe l'analogue GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium avec les anticorps DSV36S-d2, DSV26S- d2, DSV39S-d2 et DSV3S-d2 sur des préparations membranaires non activées sur exprimant un GPCR. La condition «Non spécifie signal» a montré qu'un faible signal de FRET basal entre l'analogue fluorescent de GTP et les anticorps marqués au d2 était détecté. La condition « Négative control » représente le signal non spécifique de l'essai dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (100mM) a inhibé la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. L'inhibition mesurée a été totale puisque le niveau de signal HTRF mesuré pour les conditions « Non spécifie signal » et « Négative control » est quasiment identique. Lors de l'ajout de l'analogue fluorescent de GTP et des anticorps, une augmentation du signal de FRET liée à une augmentation de la liaison des analogues fluorescents de GTP sur tout ou partie des protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par l'anticorps DSV36S a été mesurée. A l'inverse, malgré leur capacité à lier les protéines Gai dans les cellules HEK293 [2], les anticorps DSV 26S, DSV 3S et DSV 39S n'ont donné aucun signal de FRET lorsqu'ils ont été associés avec le GTPgN-octyl-C2-Cryptate d'europium.
[0210] La Figure 13 montre les résultats obtenus lorsque l'on associe l'analogue GTPgO- Iinker-Cy5 avec les anticorps DSV36S-Tb et SC13533-Tb sur des préparations membranaires non activées sur-exprimant un GPCR. La condition «Non spécifie signal» a montré qu'un faible signal de FRET basal entre les analogues fluorescents de GTP et les anticorps marqués au cryptate de Terbium était détecté. La condition « Négative control » représente le signal non spécifique de l'essai dans lequel l'excès de GTPgS non marqué (IOOmM) a inhibé la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur les protéines Ga et a donc empêché l'apparition d'un signal de FRET. L'inhibition mesurée a été totale puisque le niveau de signal HTRF mesuré pour les conditions « Non spécifie signal » et « Négative control » est quasiment identique. Lors de l'ajout de l'analogue fluorescent de GTP et des anticorps, une augmentation du signal de FRET liée à une augmentation de la liaison de l'analogue fluorescent de GTP sur tout ou partie des protéines Gail, Gai2, Gai3, Gao et Gaz reconnues par l'anticorps DSV36S a été mesurée. A l'inverse, malgré sa capacité à lier les protéines Gailet Gai3 qui sont exprimées de manière endogène dans les cellules HEK293 [2], l'anticorps sc-13533 n'a donné aucun signal de FRET lorsqu'il a été associé avec le GTPgO-Linker-Cy5(P).
[0211] L'ensemble de ces résultats confirme que seuls les anticorps selon l'invention ont été capables de générer un signal de FRET.
[0212] Exemple 8 : mesure de l'activation d'un GPCR par la mise en œuyre d'un FRET avec un anticorps selon l'invention marqué.
[0213] Matériel
[0214] Les préparations membranaires de cellules exprimant les récepteurs étudiés et la protéine G alphai ont été achetées chez Perkin Elmer ou Euroscreen. Le tableau ci- dessous liste les fonds cellulaires et références des différents échantillons utilisés : [0215] Tableau 2 :
[0216] L'anticorps DSV36S a été marqué avec les sondes fluorescentes compatibles pour une détection TR-FRET (accepteur rouge - d2 ou donneur Lumi4Tb).
[0217] les nucléotides GTP, GDP et GTPyS ont été achetés chez Sigma Aldrich (références catalogues respectives G8877, G7127 et G8634).
[0218] les agonistes des RCPG Delta Opioïde (SNC162) et Dopamine D2S (PPHT) et l'antagoniste du RCPG Delta Opioïde (Naltrindole) ont été achetés chez Tocris (références catalogues respectives 1529 et 0740).
[0219] les plaques 384 puits Low volume, blanches à fond blanc ont été achetées chez Greiner Bio One (référence Catalogue 784075).
[0220] Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores donneurs ou accepteurs (GTPgN-C2 ; GTPgN-C3 ; GTPgN-octyl-C2 ; GTPgN-octyl-Cll ; GTPgN-octyl-C3 ; GTPgO-hexyl-C2 ; GTPgO-hexyl-C3 ; GTP-gN-octyl- thiosuccinimidyl-C2 ; GTPgN-octyl-Cy5 ; GTPgN-octyl-AF488) ont été synthétisés par Cisbio Bioassays.
[0221] Les analogues de GTP non hydrolysable / lentement hydrolysable marqués avec des fluorophores accepteurs GTPgO-Linker-Cy5(P) et GTPgS-Linker-Cy5(R) ont été achetés chez Jena Bioscience sous les références respectives NU-834-CY5 et NU-1610-CY5.
[0222] Méthode
[0223] Préparation des réactifs
[0224] Tous les réactifs ont été dilués dans du tampon TrisHCI 50mM pH 7,4, MgCI2 lOmM, BSA 0,1%, NaCI lOmM ou lOOmM ou 300mM ou 500mM (concentration spécifiée dans la légende de chaque figure), 0 ou 0.5 ou ImM GDP (concentration spécifiée dans la légende de chaque figure). Les membranes ont été préparées 4X pour distribuer 1 ou 10pg/puits (quantité spécifiée dans la légende de chaque figure). Le nucléotide GTPgS (condition signal non spécifique) a été préparé 6.67X pour obtenir une concentration finale dans les puits de IOOmM. Les composés à tester (agonistes ou antagonistes) ont été préparés 10X pour obtenir les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les graphiques. Les anticorps anti-G alphai utilisés pour la détection ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits suivantes : anticorps DSV36S-d2 (lOnM) ; anticorps DSV36S-Lumi4Tb (0.5 ou lnM) ; anticorps DSV38S-d2 (lOnM). Les analogues GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables marqués avec des sondes fluorescentes donneur ou accepteur ont été préparés 4X pour viser les concentrations finales dans les puits mentionnées dans les légendes de chaque figure.
[0225] Distribution des réactifs dans les plaques 384 puits :
• Membranes exprimant le RCPG et la protéine G alphai : 5pL
• Tampon ou nucléotide GTPgS (pour la condition signal non spécifique) : 3pL
• Analogue GTP non hydrolisables / lentement hydrolisables - donneur ou accepteur : 5pL
• Anticorps anti G alphai-donneur ou accepteur : 5pL
• Tampon ou Composés à tester (agonistes et / ou antagonistes) : 2pL.
[0226] Le signal non spécifique (bruit de fond de fluorescence) a été mesuré avec des puits contenant un excès de GTPgS (IOOmM).
[0227] Lecture du signal HTRF
[0228] Les plaques ont été incubées à 21°C pendant 20h (hormis si autrement spécifié dans les figures) puis le signal HTRF a été mesuré sur le lecteur PHERAstar (BMG Labtech) avec la configuration suivante :
• Module : HTRF (Excitation 337nm, Emission 665nm et 620nm)
• Excitation : laser, 40 flashs ou lamp, 100 flashs
• Fenêtre de lecture : délais : 60ps - Intégration : 400ps.
[0229] Traitement du signai
[0230] A partir des signaux bruts à 665nm (pour accepteur rouge - Cy5) ou 520nm (pour accepteurs verts - AF488 ou Fluorescéine) et 620nm, le Ratio HTRF a été calculé selon la formule suivante :
Ratio HTRF = Signal à 665nm ou Signal à 520nm / Signal à 620nm * 10,000. [0231] Formats d'essais
[0232] La Figure 14A illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET donneur et un anticorps anti protéine G alpha marqué avec un partenaire de RET accepteur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l'analogue GTP-donneur à la protéine G et donc une augmentation du signal de RET (format 2k).
[0233] La Figure 14B illustre le principe d'essai utilisant un analogue non hydrolysable / lentement hydrolysable du GTP marqué avec un partenaire de RET accepteur et un anticorps anti protéine G alpha marqué avec un partenaire de RET donneur dans lequel l'activation du RCPG avec un composé agoniste induit une augmentation de la liaison de l'analogue GTP-accepteur à la protéine G et donc une augmentation du signal de RET (format 2 B). [0234] Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde (DOR) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine G alphai-accepteur sous stimulation d'un agoniste.
[0235] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-G alphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine G alphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Figure 15A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI 500mM ; BSA 0,1%.
- Figure 16A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1%.
- Figure 17A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV38S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ;
MgCI2 lOmM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1%.
- Figure 18A : GTPgN-octyl-Cll (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1%. - Figure 19A : GTPgO-hexyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1%. - Figure 20A : GTPgN-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1%.
[0236] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (IOOmM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-C2, GTPgN-octyl-Cll, GTPgO-hexyl- C2, GTPgN-C2 sont capables de se lier à la protéine G alphai et générer un signal TR- FRET avec l'anticorps anti G alphai-accepteur (Figures 16A à 20A).
[0237] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine G alpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine G alpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les Figures 15B, 16B, 17B, 18B, 19B et 20B. Par ailleurs, la Figure 16B montre une deuxième condition où l'activation par une concentration fixe d'agoniste du RCPG SNC162 (200nM) a été inhibée par une concentration croissante d'antagoniste du RCPG (Naltrindole). Cette inhibition d'activation est observée par la diminution du signal TR- FRET (Ratio HTRF).
[0238] Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Dopamine D2S (,D2S’) : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine G alphai-accepteur sous stimulation d'un agoniste.
[0239] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-G alphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Dopamine D2S et la protéine G alphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Figure 21A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI lOmM ; GDP ImM ; BSA 0,1%. - Figure 22A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CH0-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI lOOmM ; BSA 0,1%.
- Figure 23A : GTPgN-octyl-C2 (6nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CH0-D2S / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI lOOmM ; GDP ImM ; BSA 0,1%.
[0240] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (IOOmM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTPgN-octyl-C2 est capable de se lier à la protéine G alphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti G alphai-accepteur (Figures 21A à 23A).
[0241] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine G alpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine G alpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les Figures 21B, 22B et 23B.
[0242] Test d'activation selon le format 2B sur RCPG Delta Opioïde fDOR') : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-accepteur et Anticorps anti-protéine G alphai-donneur sous stimulation d'un agoniste.
[0243] Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-accepteur / Anticorps anti-G alphai donneur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine G alphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Figure 24A : GTPgN-octyl-Cy5 (50nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (lnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1%. Lecture après 3h d'incubation à 21°C.
- Figure 25A : GTPgN-octyl-AF488 (50nM final dans le puits) ; DSV36S-Lumi4Tb (lnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 lOmM ; NaCI 300mM ; GDP 0.5mM ; BSA 0,1%· Lecture après 3h d'incubation à 21°C.
[0244] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (IOOmM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que les analogues GTPgN-octyl-Cy5 et GTPgN-octyl-AF488 sont capables de se lier à la protéine G alphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti G alphai-donneur (Figures 24A à 25A).
[0245] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine G alpha liée au GTP-accepteur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine G alpha liée au GTP-accepteur augmente (i.e. que la forme de la protéine G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la liaison du GTP-accepteur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-accepteur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur les Figures 24B et 25B.
[0246] Test d'activation selon le format 2A sur RCPG Delta Opioïde fDOR') : augmentation du signal TR-FRET entre GTP-donneur et Anticorps anti-protéine G alphai-accepteur sous stimulation d'un agoniste.
Dans un premier temps, la capacité des couples GTP-donneur / Anticorps anti-G alphai accepteur à générer un signal TR-FRET spécifique en se liant sur la protéine G a été mise en évidence en utilisant des préparations membranaires de cellules CHO-K1 exprimant le RCPG Delta Opioïde et la protéine G alphai. Les conditions expérimentales suivantes ont été utilisées :
- Figure 26A : GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (7.5nM final dans le puits) ; DSV36S-d2 (lOnM final dans le puits) ; 10pg membranes CHO-DOR / puits ; Tampon : TrisHCI 50mM pH7,4 ; MgCI2 60mM ; NaCI 150mM ; BSA 0,1%.
[0247] Les membranes ont été incubées en absence ou en présence d'un fort excès de GTPgS (100mM). La différence de signal TR-FRET (Ratio HTRF) observée entre ces deux conditions montre que l'analogue GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 est capable de se lier à la protéine G alphai et générer un signal TR-FRET avec l'anticorps anti G alphai- accepteur (Figure 26A). [0248] Dans un second temps, la capacité d'un agoniste du RCPG à moduler la proportion de protéine G alpha liée au GTP-donneur a été testée avec les mêmes membranes et conditions expérimentales mentionnées ci-dessus. L'augmentation du signal TR-FRET (Ratio HTRF) engendrée par la stimulation avec l'agoniste signifie que la proportion de forme protéine G alpha liée au GTP-donneur augmente (i.e. que la forme de la protéine G alpha vide diminue). Ainsi, le récepteur RCPG activé par son agoniste entraîne la liaison du GTP-donneur à la protéine G qui passe alors sous forme GTP-donneur et entraîne l'augmentation du signal TR-FRET. Ces résultats sont représentés sur la Figure 26B.
Listage de séquences
[0250] Tableau 3 Références citées
[1] Damien Maurel, Oiigomérisation des récepteurs couplés aux protéines G: deux ou plus? Application des technologies de FRET en temps résolu au cas du récepteur GABAB. Biologie cellulaire. Université Montpellier I, 2006.
[2] Atwood et al., BMC Genomics, 2011, 12: 14

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps ou fragment d'anticorps capable de se lier à la protéine G alpha, qui comprend :
- un domaine variable d'une chaîne lourde comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, un CDR2 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et un CDR3 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3 ; et
- un domaine variable d'une chaîne légère comprenant un CDR1 de séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, un CDR2 de séquence d'acides aminés DTS, et un CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
2. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 1, dans lequel :
- le domaine variable de la chaîne lourde comprends un FRI présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6, un FR2 présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7, un FR3 présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 8, un FR4 présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 9 ; et
- le domaine variable de la chaîne légère comprends un FRI présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 10, un FR2 présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 11, un FR3 présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 12, un FR4 présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13.
3. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel :
- le domaine variable de la chaîne lourde présente au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 ;
- le domaine variable de la chaîne légère présente au moins 80% d'homologie avec la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 15 ; et
- le CDR1 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, le CDR2 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, le CDR3 du domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, le CDR1 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, le CDR2 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés DTS, et le CDR3 du domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5.
4. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, dans lequel le domaine variable de la chaîne lourde consiste en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 et le domaine variable de la chaîne légère consiste en la séquence d'acide aminé SEQ ID NO : 15.
5. Anticorps ou fragment d'anticorps qui entre en compétition pour la liaison à la protéine G alpha avec l'anticorps ou le fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'anticorps ou le fragment d'anticorps est marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
7. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 6, dans lequel le membre d'un couple de partenaires de RET est (i) un composé fluorescent donneur ou un composé luminescent donneur, ou (ii) un composé fluorescent accepteur ou un composé accepteur non fluorescent (quencher).
8. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, dans lequel :
- le membre d'un couple de partenaires de RET est un composé fluorescent accepteur choisi parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron- dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole et un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange et le DsRed ;ou
- le membre d'un couple de partenaires de RET est un composé fluorescent donneur choisi parmi : un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole ; ou
- le membre d'un couple de partenaires de RET est un composé luminescent donneur choisi parmi : la Luciférase (lue), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase.
9. Composition comprenant un anticorps ou un fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
10. Séquence d'acides nucléiques codant pour un anticorps ou un fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
11. Vecteur comprenant la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 10.
12. Cellule comprenant le vecteur selon la revendication 11 ou la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 10.
13. Trousse de réactifs comprenant (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou une composition selon la revendication 9 et (ii) une source de GTP marqué avec un membre d'un couple de partenaires de RET.
14. Trousse de réactifs selon la revendication 13 ou composition selon la revendication 9, dans lequel le GTP est un GTP non-hydrolysable ou lentement hydrolysable, tel que le GTPgammaS (GTPyS ou GTPgS), le GppNHp et le GppCp.
15. Trousse de réactifs selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, ou composition selon la revendication 9, dans lequel le GTP marqué est un GTP non- hydrolysable ou lentement hydrolysable marqué par :
- un composé fluorescent donneur, par exemple choisi parmi GTPgN-C2 (GTP-gamma-N- C2), GTPgN-C3 (GTP-gamma-N-C3), GTPgN-octyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-C2), GTPgN- octyl-Cll (GTP-gamma-N-octyl-Cll), GTPgN-octyl-C3 (GTP-gamma-N-octyl-C3), GTPgO- hexyl-C2 (GTP-gamma-0-hexyl-C2), GTPgO-hexyl-C3 (GTP-gamma-0-hexyl-C3) ou GTP- gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 (GTP-gamma-N-octyl-thiosuccinimidyl-C2), de préférence GTP-gN-octyl-thiosuccinimidyl-C2 ; ou - un composé fluorescent accepteur, par exemple choisi parmi GTPgN-octyl-Cy5, GTPgN- octyl-AF488, GTPgN-L15-Fluorescein, GTPgO-Linker-Cy5(P) ou GTPgS-Linker-Cy5(R), ou un composé accepteur non fluorescent (quencher). i
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