CN108387734A - 一种基于双分子荧光互补技术的pct检测试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于双分子荧光互补技术的PCT诊断试剂盒。所述试剂盒包括:抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段、抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段;本发明还公开了所述一种基于双分子荧光互补技术的PCT诊断试剂盒的制备方法,该方法包括:抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段的制备、抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段的制备;最后还公开了该试剂盒的使用方法;本发明试剂盒具有操作简单、特异性好、检测快速、免清洗、精密度好等优点,便于临床检测使用,其应用于感染的监测,可以提高脓毒血症诊断的准确率,具有极大的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种双分子荧光互补技术用于体外免疫诊断检测人体内PCT的含量,属于疾病诊断检测领域。
背景技术
近些年来,对全身性感染的病理、生理过程有了更多了解,支持强化治疗也获得显著改善,但在非心脏重症监护病房中患者的首位死因仍然是全身性感染及其并发症,美国每年大约有500000例全身性感染患者,约40%最终死亡。因此,需要一种标记物能更有效地反映感染导致的炎症损伤程度。降钙素原(procalcitonin,PCT)是具有高灵敏度、特异性的新指标,它在细菌或真菌感染合并严重全身系统反应或器官低灌注时显著升高,而在病毒或局灶感染时水平正常或轻度升高,这个特性使得PCT用来鉴别系统感染和非感染性炎症或局灶感染。
降钙素原是无激素活性的降钙素(calcitonin,CT)前肽物质,是由116个氨基酸组成,相对分子量为13kD的糖蛋白。正常情况下,PCT mRNA在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成含141个氨基酸残基的降钙素原前体(Pre-CT),分子量约为16KD,包括N端84 个氨基酸(含25个氨基酸的信号肽)、活性降钙素(32肽)和下钙素(katacalcin,21肽) 三部分,前两部分由2肽(-Lys-Arg-)连接,后两部分被4肽(-Gys-Lys-Lys-Arg-)隔开。 Pre-CT进入内质网膜后,经糖基化和特异性酶切除N端的信号肽,生成含116个氨基酸残基的PCT。再依次经不同的蛋白水解酶酶解,先切除含57氨基酸残基的N端肽,最后酶解生成降钙素和下钙素。
PCT是脓血症特异性的标志物,正常值是<0.1μg/L(超过95%的健康观察者的PCT水平在此范围)。以全身炎症反应为特征的细菌感染可诱导PCT释放,使血浆PCT水平升高。在0.5μg/L水平就应该考虑脓毒血症的可能。而在一般情况,脓毒血症的PCT值应该更高。若是局部细菌感染,血浆中PCT的水平一般小于0.5μg/L。在某些情况下,非细菌性因素也能使得PCT水平升高。比如部分严重的真菌感染,严重创伤初期,持续的循环性休克,多器官功能不全,重症胰腺炎,严重的肝肾疾病等等。对于病毒性感染,肿瘤,慢性炎症或者自身免疫性疾病,PCT的水平不会受到影响。
在严重感染时,PCT的生成非常快。升高的PCT值的下降取决于其在血浆中的衰减和新生成的PCT间的平衡。PCT的半衰期大约为20~24h。PCT的清除途径尚不完全清楚。它很少经肾脏排出。临床数据表明在严重肾功能衰竭的病例中,PCT并不大量升高。肾衰患者与健康受试者PCT浓度的降低无显著性差别。从尿液中测出的PCT浓度与血浆中的PCT浓度比例相对恒定。约为1∶4。血浆PCT的肾脏清除率远低于1ml/min。
PCT作为一种新的、具有创新意义的严重细菌性感染等疾病的实验指标,提高了临床诊断的准确性,为重症监护、放化疗、服用免疫抑制剂或器官移植等患者合并发热时提供了极其重要的诊断、进一步的检查和治疗的临床依据:PCT可广泛应用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科、介入诊断和治疗实验室等。
目前,检测PCT的方法主要有酶联免疫吸附试验,免疫层析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫吸附试验法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体,并催化底物产生颜色变化,具有操作简单,试剂稳定期长的特点,但酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低,目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目;免疫层析法具有操作简单,检测速度快等优点,但也存在灵敏度低,试剂不稳定,重复性较差,难以进行定量的缺点。化学发光免疫分析法具有操作简单,检测速度快、高通量检测等优点,但也存在非均相反应、检测时间长、批内批间变异大的缺点。
为解决上述问题,如果能利用PCT的抗体,以双分子荧光互补技术为平台,研发出一种针对脓毒血症诊断的PCT快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比,具有操作方便、灵敏度高、免清洗、精密度高等优点;将其应用于感染的监测,可以提高脓毒血症诊断的准确率,则会受到市场的广泛欢迎和具有极大的市场价值。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,本发明提供一种可用于定量检测PCT的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现:
一种制备基于双分子荧光互补技术PCT检测试剂盒的方法,包括如下步骤:
1)抗PCT抗体偶联荧光蛋白N端片段;
2)抗PCT抗体偶联荧光蛋白C端片段;
在上述技术方案中,所述抗PCT抗体为针对PCT不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
在上述方案中,所述抗PCT抗体偶联荧光蛋白N端片段的步骤中,荧光蛋白N端片段与抗PCT抗体的质量比为1∶1-10。
在上述方案中,所述抗PCT抗体偶联荧光蛋白C端片段的步骤中,荧光蛋白C端片段与抗PCT抗体的质量比为1∶1-10。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒。其主要组成包括:
1)抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段;
2)抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段,混合反应5-60分钟;
2)激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒原理示意图,其中,1-抗PCT抗体,2-连接剂,3-荧光蛋白N端片段,4-待测物(PCT),5-抗PCT抗体, 6-荧光蛋白C端片段,7-连接剂。
图2是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
抗PCT抗体偶联荧光蛋白N端片段,以黄色荧光蛋白(YFP)1-154氨基酸的片段YFPN为例,具体实施过程为:
1)将0.1mg YFPN蛋白加入到离心管中,用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPN蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25%的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗PCT抗体,用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体,将活化的YFPN 蛋白和抗体混合。
6)4℃,反应过夜。
7)封闭:加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液,室温封闭2h,以封闭残留的醛基,终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物,用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物,使用前稀释至所需浓度。
实施例2
抗PCT抗体偶联荧光蛋白C端片段,以黄色荧光蛋白(YFP)155-238氨基酸的片段YFPC 为例,具体实施过程为:
1)将0.1mg YFPC蛋白加入到离心管中,用0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液(CB)配制将YFPC蛋白稀释到1mg/ml。
2)在通风橱中加入终浓度为1.25%的戊二醛。
3)37℃水浴反应2h。
4)用脱盐柱Sephadex G-25或0.05mol/L pH9.5 CB透析除去过量戊二醛。
5)取0.1mg抗PCT抗体,用0.05mol/L pH9.5 CB配制1mg/ml抗体,将活化的YFPC 蛋白和抗体混合。
6)4℃,反应过夜。
7)封闭:加入50μl 0.2mol/L赖氨酸溶液,室温封闭2h,以封闭残留的醛基,终止反应。
8)4℃放置2h。
9)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱或用0.45μm滤膜除去多聚体不溶物,用0.01mol/L pH7.2 PBS透析纯化偶联物,使用前稀释至所需浓度。
实施例3
试剂盒主要组成:
1)抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段;
2)抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段。
实施例4
试剂盒使用方法,包括如下步骤:
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段,混合反应5-60分钟;
2)激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价:
1.线性
配制浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.2ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、100ng/ml的PCT标准品溶液。在反应孔中分别加入20μl标准品、加入50μl抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段,加入50μl抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段,37℃温育10分钟。温育后,激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
以荧光信号值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
回收率试验:用已知量PCT标准品加入到正常人的血浆标本中,测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较,计算PCT的回收率。检测结果如下:
样本编号 | 加入PCT浓度(ng/ml) | 测量PCT的浓度(ng/ml) | 回收率(%) |
1 | 0.1 | 0.96 | 96.0 |
2 | 0.5 | 0.51 | 102.0 |
3 | 10 | 10.4 | 104.0 |
4 | 50 | 48.7 | 97.4 |
3.精密度
选取3份不同浓度的标本,分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果,计算平均偏差CV值。
4.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为:是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点,计算其平均值(X)和标准差(SD),以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.01ng/ml。
5.抗干扰性
检测本发明的基于双分子荧光互补技术的免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液分别取适量加入到PCT阳性血浆标本中,使血浆中血红蛋白的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将甘油三酯溶液分别取适量加入到PCT阳性血浆标本中,使血浆中甘油三酯的含量分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml。将胆红素溶液分别取适量加入到PCT阳性血浆标本中,使血浆中胆红素的含量分别为25μg/ml、 50μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的PCT阳性标本进行测定。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率,回收率在95.5%-104.9%之间。表明基于双分子荧光互补技术的 PCT试剂在检测血浆样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6.相关性
如图3所示,与罗氏PCT电化学试剂盒的相关性为:y=0.985x+0.072,R2=0.998。
本发明与现有方法和产品相比,具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低,对检测仪器要求低的优点。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒、制备及使用方法,其特征在于:
1)试剂盒主要组成:抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段;
2)使用方法:在试剂盒的反应孔中加入样本、抗PCT抗体偶联的荧光蛋白N端片段和抗PCT抗体偶联的荧光蛋白C端片段,混合反应5-60分钟;
3)检测方法:激发光照射反应孔,测量每个反应孔发光量获得荧光信号值。
2.一种基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)抗PCT抗体偶联荧光蛋白N端片段的制备;
2)抗PCT抗体偶联荧光蛋白C端片段的制备。
3.根据权利要求1所述的抗PCT抗体为针对PCT不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的荧光蛋白,包括但不限于绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
5.根据权利要求2所述的一种基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒制备的方法,其特征在于,所述的抗PCT抗体偶联荧光蛋白N端片段步骤中,荧光蛋白N端片段与PCT抗体的质量比为1∶1-10。
6.根据权利要求2所述的基于双分子荧光互补技术的PCT检测试剂盒制备的方法,其特征在于,所述的抗PCT抗体偶联荧光蛋白C端片段步骤中,荧光蛋白C端片段与PCT抗体的质量比为1∶1-10。
7.根据权利要求1所述的反应孔,包括但不限于微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管。
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