CN105242047A - 黄曲霉毒素b1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用 - Google Patents

黄曲霉毒素b1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用。黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，包括层析试纸条和羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述检测线上包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)。其采用碳纳米材料做标记材料，比纳米金成本低廉，实际应用价值大。用于黄曲霉毒素B1的检测，操作方便，简单，快速。

Description

黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用
技术领域
本发明属生物检测领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉侵染农产品及食品产生的有毒次生代谢产物，从1960年人们首次发现黄曲霉毒素开始，至今已经发现的黄曲霉毒素多达20种。其中，黄曲霉毒素B1是污染植物性农产品的主要类型，且毒性最强，是氰化钾10倍，属I类致癌物。黄曲霉毒素B1污染的饲料被动物食用后，还能在动物体内转化为肉蛋奶中的M1，污染整个食物链。因此，黄曲霉毒素B1检测技术研究对于保障人类的健康和生命安全具有重要意义。
现有技术中常用的黄曲霉毒素检测技术主要有薄层色谱法、微柱筛选法、免疫亲和-高效液相色谱法、免疫亲和-液相色谱-串联质谱法、免疫亲和-荧光光度法和酶联免疫吸附法。上述方法中的薄层色谱法、微柱筛选法、免疫亲和-高效液相色谱法、免疫亲和-液相色谱-串联质谱法和免疫亲和-荧光光度法，较适合专业实验室内检测。但是随着人民对食品安全需求的不断提高，为防止黄曲霉毒素B1进入食物链，急需一种能对食品及农产品的生产、储存、加工和运输多环节快速、简单、批量的现场筛查方法。酶联免疫吸附法和免疫层析法是近年来基于上述需求发展起来的黄曲霉毒素B1检测方法。免疫层析法比酶联免疫吸附法所需时间更短，操作步骤更少，对操作人员的专业要求更低，因此，在真菌毒素等微量残留物的定性、在线、快速检测上已经得到了广泛应用。目前，市面上已经有许多针对黄曲霉毒素单一组分和多组分的纳米金免疫层析快速检测产品，但是纳米金作为贵金属，有成本高、制备条件严苛、批量产量不大的缺点，不利于黄曲霉毒素纳米金免疫层析检测试纸条的成本降低、批间均一化和市场化。随着纳米材料的不断发展，氧化石墨烯作为一种二维的碳纳米材料，经过近年来的科学研究和市场开发，具有成本低廉，可大批量生产，保存时间长的特点。因此，研究建立一种基于氧化石墨烯的黄曲霉毒素免疫层析试纸条，取代现有的纳米金试纸条，对于降低试纸条的成本，促进检测产品的市场化和监控食品和农产品中的黄曲霉毒素具有很重要的社会意义和巨大的应用价值和前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条及其应用。该试纸条用于检测黄曲霉毒素B1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高、成本低廉的特点。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：
黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，其特征在于：它包括层析试纸条和羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条(见图1和图2)包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述检测线上包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)。
按上述方案，所述的吸水垫长40～45mm，宽3～5mm；检测垫长22～28mm，宽3～5mm；样品垫长12～16mm，宽3～5mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为5～10mm，质控线和检测线的间距为8～12mm。
按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。
按上述方案，所述每厘米宽度试纸条检测垫的检测线上所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量为360～600ng；每厘米宽度试纸条质控线上所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300～420ng。
按上述方案，所述羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂中所用的羧基化氧化石墨烯的片层大小为0.5～2μm；所述每厘米宽度试纸条检测所需的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的用量为15～750ng，羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体中羧基化氧化石墨烯和抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体质量比为20:3～200:3。
如上所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
层析试纸条的制备：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：
将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物(AFB1-BSA)用包被缓冲液配制成浓度为0.6～1mg/mL的包被液；于距样品垫上沿5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物(AFB1-BSA)的包被量为360～600ng，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
质控线的包被：
将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成浓度为0.5～0.7mg/mL的包被液；于距检测线8～12mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300～420ng，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥4～6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得层析试纸条；
和羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂的制备：将羧基化氧化石墨烯的羧基基团与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体上的氨基基团经共价偶联而得。
按上述方案，所述试纸条的制备中配制黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有卵清白蛋白2g，蔗糖2.5g，辛基苯基聚氧乙烯醚(曲拉通X-100)0.1mL，聚乙烯吡咯烷酮-K300.3g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
按上述方案，所述的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂具体可按照以下方法制备得到的：取羧基化氧化石墨烯，在标记反应液中冰浴超声分散均匀，分散均匀时间一般可为5-10分钟；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，剧烈振摇，将羧基活化，活化时间一般可为15-30min；然后缓慢加入抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，继续振摇，进行氧化石墨烯的羧基和抗体上的氨基的共价偶联反应，一般所需时间可为4-8h；再加入牛血清白蛋白水溶液振摇以封闭多余活性位点；13000r/min以上转速离心，离心时间可为30-60min，弃去上清液，保留沉淀，洗涤后处理；加入标记保存液，即得羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂，冷藏备用。冷藏置4℃冰箱即可。
按上述方案，羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂中抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的质量浓度为30～300μg/mL。
按上述方案，羧基化氧化石墨烯在标记反应液中的浓度为0.5mg/mL,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液浓度至少达到10mg/mL，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液浓度不高于1mg/mL，牛血清白蛋白水溶液的浓度不低于0.08g/mL，羧基化氧化石墨烯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体和牛血清白蛋白的质量比为400:300:6～60:10000；
所述的标记反应液为：每1L中含有硼酸0.3092g,氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13；
所述的标记洗涤液为：每100mL中含有硼酸0.03092g,牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13；
所述的标记保存液为：每100mL中含有硼酸0.6184g，牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13。
按上述方案，所述的洗涤后处理为：加入标记洗涤液离心洗涤，将沉淀重悬，再以13000r/min以上转速离心30-60min，弃去上清液，重复上述操作3次；洗涤过程中羧基化氧化石墨烯在标记洗涤液的浓度不高于0.4mg/mL。
所述的羧基化氧化石墨烯是按照下述方法制备得到的：先将鳞片石墨采用化学氧化法制备氧化石墨，然后通过高强度超声处理解离成单层或少层的氧化石墨烯，再经离心选取13000rpm以上离心30min不沉淀的上清溶液，得到氧化石墨烯悬浊液，在氧化石墨烯悬浊液中加入氢氧化钠和氯乙酸，经过羧基化超声处理将氧化石墨烯片层上的羟基转变成羧酸，经过透析纯化，再经离心选取13000rpm以上离心30min不沉淀的上清溶液，得到羧基化氧化石墨烯。
按上述方案，所述的化学氧化法为在鳞片石墨中加入硫酸和磷酸组成的混酸及高锰酸钾，进行初步氧化反应，然后通过水解反应形成膨胀的氧化石墨，后用双氧水、盐酸和去离子水依次多次洗涤纯化得到氧化石墨，高锰酸钾与鳞片石墨的质量比为6:1，硫酸和磷酸的体积比为9:1；所述的石墨在初步氧化过程中的质量分数为0.7％-0.75％，水解后的最终反应体系中的质量分数为0.3％～0.375％，氧化反应条件为50℃搅拌12-48h；
所述的高强度超声处理的超声功率为800w或以上，超声时间1h
所述的羧基化超声处理中氢氧化钠、氯乙酸和氧化石墨烯的质量比为120:100:1；超声功率为800w或以上，超声时间1h；所述的氧化石墨烯悬浊液在羧基化超声过程中的浓度为2mg/mL。
如上所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的应用，方法如下：称取待测样品，加入体积浓度为60～80％的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为0.33g/mL，混匀，涡旋提取5～10分钟，在4000rmp离心10min，取上层清液，氮吹近干后用等体积的体积浓度为5～10％的甲醇水溶液复溶，0.22μm滤膜过滤得到待测样品溶液；取羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂0.2～1μL，用缓释液按体积比稀释100～500倍，混匀，得到检测液；取待测样品溶液与检测液按体积比1:1混匀，室温反应半分钟后，逐滴加入上述混合液200μL到黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取相同体积水做为阴性对照液，与检测液按体积比1:1混匀，逐滴加入另一黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，15分钟后读取结果；
检测结果：(1)阳性：当检测试纸条的质控线显示出棕黑色线条，而检测线不显色时，判为阳性，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量等于或高于2ng/mL。
或者质控线显示出棕黑色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，判为弱阳性，表明待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量高于或等于0.6ng/mL并低于2ng/mL。
(2)阴性：当检测试纸条的质控线显示出棕黑色线条，并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，判为阴性结果，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量低于0.6ng/mL；
(3)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线显示或不显示棕黑色线条，该试纸条判为无效；
最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
按上述方案，所述的缓释液为：每100mL中含有硼酸1.2368g，牛血清白蛋白2g,吐温200.1mL，聚乙二醇-60001.0g，叠氮化钠0.02g和氢氧化钠若干使溶液pH值为8.13。
按上述方案，所述的待测样品为玉米，大米或花生油，固体样品为磨细样品。
该黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的工作原理：首先将待测样品溶液和检测液混合，当样品中含有黄曲霉毒素B1时，黄曲霉毒素B1和检测液中羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体先结合，待反应半分钟后的混合溶液逐滴加入黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的样品垫上时，溶液通过毛细作用沿样品垫向吸水垫方向移动，羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1的复合物和反应剩余的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体一同向上泳动，其到达固定着抗原的检测线时，抗原将和反应剩余的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合，样品中黄曲霉毒素B1含量越高，检测线上的抗原能够结合的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体将越少，形成的显色带颜色越浅。当抗原所结合的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合物少于一定数量时，检测线处将不会有色带出现。无论样品中是否含有黄曲霉毒素B1，未被检测线上抗原截获的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体或羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1的复合物将继续移动到质控线并与质控线上的第二抗体结合并被富集显色，所以样品中不含黄曲霉毒素B1，即为阴性时，质控线和检测线均有色带；含有一定量黄曲霉毒素B1，即为阳性时有两种情况：1、只出现一条有色质控线，检测线不显色；2、一条有色质控线和一条较浅的有色检测线；而质控线没有色带出现则表明试纸条失效。
本发明的有益效果在于：
(1)检测成本低廉。本发明提供的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，采用碳纳米材料做标记材料，比纳米金成本低廉，实际应用价值大。
(2)检测过程不需要黄曲霉毒素标准溶液作为阳性对照。本发明提供的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条检测样品时不需要使用黄曲霉毒素B1标准溶液做为阳性对照，而只需用水做为阴性对照即可，从而避免了黄曲霉毒素的二次污染。
(3)操作简单。用该黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条进行检测时只需将待测样品溶液和检测液的混合溶液逐滴加到试纸条的样品垫上即可，操作简单、方便；
(4)检测快速。本发明提供的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条可用于黄曲霉毒素B1含量的定性测定，全过程15min即可，用时短。
附图说明
图1为本发明的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的正视图。
图2为本发明的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的侧视图。
图3为实施例2的结果判定图。
图4为实施例3的结果判定图。
图中：1纸板；2吸水垫；3检测垫；4样品垫；5质控线；6检测线；7对照试纸条；8检测试纸条。
具体实施方式
下述实施例中抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体可采用保藏编号为CCTCCNO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，具体根据专利申请号为CN201010245095.5的专利中报道的方法制得。
制备方法为：将杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。
羧基化氧化石墨烯溶液的制备可采用如下方法：
将3.0g鳞片石墨过325目筛后加入到400mL硫酸和磷酸体积比为9:1的混和溶液中，搅拌10分钟；然后在混合物中缓慢加入18.0g高锰酸钾，每次加入量不宜过多，避免反应温度超过20℃。待高锰酸钾全部加完后，加热到50℃搅拌反应12小时。反应结束后，让混合物自然冷却到室温，将其倒入～400mL的冰水中，持续室温搅拌0.5小时，将质量分数为30％的双氧水逐滴加入反应体系到溶液转变为亮黄色停止。静置过夜，倒掉上清，用1L质量分数为5％-10％的盐酸洗3遍，然后用1L去离子水洗5遍，以去掉金属离子、硫酸根离子和氯离子，最后将得到的固体冷冻干燥，然后置于去离子水中，配成2mg/mL的水溶液，用超声波超声1h，超声功率为800W，待氧化石墨烯解离成单层或少层的氧化石墨烯，用离心机13000rpm离心30分钟，去掉沉淀物，即得到氧化石墨烯悬浊液。在5mL氧化石墨烯悬浊液(～2mg/mL)中加入氢氧化钠1.2g和氯乙酸1.0g，用超声波超声1h，超声功率为800W，将氧化石墨烯片层上的羟基转变成羧酸，用纯水透析纯化7天，再离心选取13000rpm离心30min不沉淀的上清溶液，得到羧基化氧化石墨烯溶液。
所述的羧基化氧化石墨烯的片层大小为0.5～2μm。
实施例1-2：快速检测黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备及应用
实施例1
快速检测黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
层析试纸条的制备：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长42mm宽3mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：
将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA用包被缓冲液配制成0.7mg/mL的包被液；于距样品垫上沿8mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为420ng，然后于37℃条件下干燥45分钟；
所述的包被缓冲液为：1g牛血清白蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。
质控线的包被：
将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成0.5mg/mL的包被液；于距检测线10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300ng，然后于37℃条件下干燥45分钟；
所述的包被缓冲液为：0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。
所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3mm。
(3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽3mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
所述的封闭液为2.0g卵清白蛋白，2.5g蔗糖，0.1mL辛基苯基聚氧乙烯醚，0.3g聚乙烯吡咯烷酮-K30，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。
(4)试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得层析试纸条，见图1和图2。
羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体反应试剂的制备
取0.4mg羧基化氧化石墨烯，溶解在0.8mL标记反应液中，冰浴超声10分钟；加入20μL15mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，剧烈振摇15min后；缓慢加入6μL1mg/mL的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液，继续振摇8h；加入0.1g/mL的牛血清白蛋白水溶液100μL，继续振摇12h后；13000r/min离心30min，弃去上清液，保留沉淀；加入1mL标记洗涤液，将沉淀重悬，再以13000r/min离心30min，弃去上清液，重复操作3次；加入0.2mL标记保存液，将沉淀重悬，置4℃冰箱备用。
所述的15mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液为15mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在1mL纯水中制成；
所述的1mg/mL抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶解在1mL纯水中制成；
所述的0.1g/mL牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；
所述的标记反应液是按照下述方法配制得到的：硼酸0.3092g，在800mL水溶液中完全溶解，用氢氧化钠调节pH值到8.13，加水定容到1L，0.22μm滤膜过滤所得。
所述的标记洗涤液是按照下述方法配制得到的：硼酸0.03092g，溶解在80mL水溶液中，用氢氧化钠调节pH值到8.13，加水定容到100mL，再加入牛血清白蛋白1.0g，叠氮化钠0.02g，使之充分溶解，0.22μm滤膜过滤所得。
所述的标记保存液是按照下述方法配制得到的：硼酸0.6184g，溶解在80mL水溶液中，用氢氧化钠调节pH值到8.13，加水定容到100mL，再加入牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，使之充分溶解，0.22μm滤膜过滤所得。
上述黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条在大米样品检测中的应用：
称取已磨细的1#和2#待测玉米样品5.0g，加入体积浓度为70％的甲醇水溶液15mL，混匀，涡旋提取5分钟，在4000rmp离心10min，取上层清液1mL，氮吹近干后用1mL体积浓度为10％的甲醇水溶液复溶，0.22μm滤膜过滤得到待测样品溶液。取羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体反应试剂0.4μL，用缓释液稀释定容到100μL，混匀，得到检测液。取100μL待测样品溶液与100μL检测液混匀，室温放置半分钟后，逐滴加入一黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取200μL水做为阴性对照液，逐滴加入另一黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，15分钟后读取结果；
检测结果：1#检测试纸条的质控线显示出棕黑色线条，而检测线不显色，见图3-1，由此判定：1#待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量等于或高于2ng/mL；经换算可得1#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量等于或高于6ng/g。经液相色谱质谱(LC-MS/MS)检测，1#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量7.38ng/g。
2#检测试纸条的质控线显示出棕黑色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅，见图3-2，由此判定：2#待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量高于或等于0.6ng/mL并低于2ng/mL；经换算可得2#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量高于或等于1.8ng/g并低于6ng/g。经液相色谱质谱(LC-MS/MS)检测，2#待测样品中黄曲霉毒素B1的含量3.78ng/g。
所述的缓释液是按照下述方法配制得到的：硼酸1.2368g，溶解在80mL水溶液中，用氢氧化钠调节pH值到8.13，加水定容到100mL，再加入2.0g牛血清白蛋白，0.1mL吐温20，1.0g聚乙二醇-6000和0.02g叠氮化钠，使之充分溶解，0.22μm滤膜过滤。
实施例2
快速检测黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
层析试纸条的制备：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长40mm宽4mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：
将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物AFB1-BSA用包被缓冲液配制成0.8mg/mL的包被液；于距样品垫上沿7mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为480ng，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的包被缓冲液为：1.0g牛血清白蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；
质控线的包被：
将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成0.6mg/mL的包被液；于距检测线8mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为360ng，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的包被缓冲液为：0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；
所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽4mm。
(3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜剪裁成长14mm宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥4小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
所述的封闭液为：2.0g卵清白蛋白，2.5g蔗糖，0.1mL辛基苯基聚氧乙烯醚，0.3g聚乙烯吡咯烷酮-K30，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；
(4)试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为3mm，即得层析试纸条，见图1和图2。
羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体反应试剂的制备，基本同实施例2，只是:
取0.4mg羧基化氧化石墨烯，溶解在0.8mL标记反应液中，冰浴超声10分钟；加入20μL15mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，剧烈振摇15min后；缓慢加入40μL1mg/mL的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液，继续振摇8h；加入0.1g/mL的牛血清白蛋白水溶液100μL，继续振摇12h后；13000r/min离心30min，弃去上清液，保留沉淀；加入1mL标记洗涤液，将沉淀重悬，再以13000r/min离心30min，弃去上清液，重复操作3次；加入0.2mL标记保存液，将沉淀重悬，置4℃冰箱备用。
所述的15mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液为15mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在1mL纯水中制成；
所述的1mg/mL抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体水溶液为1mg抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体溶解在1mL纯水中制成；
所述的0.1g/mL牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；
所述的标记反应液是按照下述方法配制得到的：硼酸0.3092g，在800mL水溶液中完全溶解，用氢氧化钠调节pH值到8.13，加水定容到1L，0.22μm滤膜过滤所得。
所述的标记洗涤液是按照下述方法配制得到的：硼酸0.03092g，溶解在80mL水溶液中，用氢氧化钠调节pH值到8.13，加水定容到100mL，再加入牛血清白蛋白1.0g，叠氮化钠0.02g，使之充分溶解，0.22μm滤膜过滤所得。
所述的标记保存液是按照下述方法配制得到的：硼酸0.6184g，溶解在80mL水溶液中，用氢氧化钠调节pH值到8.13，加水定容到100mL，再加入牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，使之充分溶解，0.22μm滤膜过滤所得。
如上所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条在花生油样品检测中的应用：
称取花生油样品5.0g，加入体积浓度为80％的甲醇水溶液15mL，混匀，涡旋提取10分钟，在4000rmp离心10min，取上层清液1mL，氮吹近干后用1mL体积浓度为8％的甲醇水溶液复溶，0.22μm滤膜过滤得到待测样品溶液。取羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体反应试剂0.8μL，用缓释液稀释定容到100μL，混匀，得到检测液。取100μL待测样品溶液与100μL检测液混匀，室温放置半分钟后，逐滴加入一黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条(作检测试纸条)的样品垫，同时取200μL水做为阴性对照液，逐滴加入另一黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条(作对照试纸条)的样品垫，15分钟后读取结果；检测结果：检测试纸条的质控线显示出棕黑色线条，并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近，见图4，由此判定：待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量低于0.6ng/mL，经换算待测花生油样品中的黄曲霉毒素B1的含量低于1.8ng/g。经液相色谱质谱(LC-MS/MS)检测，花生油样品中的黄曲霉毒素B1的含量未检出。

Claims (10)

1.黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，其特征在于：它包括层析试纸条和羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述检测线上包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长40～45mm，宽3～5mm；检测垫长22～28mm，宽3～5mm；样品垫长12～16mm，宽3～5mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为5～10mm，质控线和检测线的间距为8～12mm。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，其特征在于：所述每厘米宽度试纸条检测垫的检测线上所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量为360～600ng；每厘米宽度试纸条质控线上所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300～420ng。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，其特征在于：所述羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂中所用的羧基化氧化石墨烯的片层大小为0.5～2μm；所述每厘米宽度试纸条检测所需的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的用量为15～750ng，羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体中羧基化氧化石墨烯和抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体质量比为20:3～200:3。
5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条，其特征在于：羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂中抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的质量浓度为30～300μg/mL。
6.权利要求1所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
层析试纸条的制备：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：
将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物(AFB1-BSA)用包被缓冲液配制成浓度为0.6～1mg/mL的包被液；于距样品垫上沿5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白的偶联物(AFB1-BSA)的包被量为360～600ng，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
质控线的包被：
将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成浓度为0.5～0.7mg/mL的包被液；于距检测线8～12mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为300～420ng，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥4～6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得层析试纸条；
和羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂的制备：将羧基化氧化石墨烯的羧基基团与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体上的氨基基团经共价偶联而得。
7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述的羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂的制备方法：取羧基化氧化石墨烯，在标记反应液中冰浴超声分散均匀；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液，剧烈振摇，将羧基活化；然后缓慢加入抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，继续振摇，进行氧化石墨烯的羧基和抗体上的氨基的共价偶联反应；再加入牛血清白蛋白水溶液振摇以封闭多余活性位点；13000r/min以上转速离心，弃去上清液，保留沉淀，洗涤后处理；加入标记保存液，即得羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂，冷藏备用。冷藏置4℃冰箱即可。
8.根据权利要求7所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：羧基化氧化石墨烯在标记反应液中的浓度为0.5mg/mL,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液浓度至少达到10mg/mL，抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液浓度不高于1mg/mL，牛血清白蛋白水溶液的浓度不低于0.08g/mL，羧基化氧化石墨烯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体和牛血清白蛋白的质量比为400:300:6～60:10000；
所述的标记反应液为：每1L中含有硼酸0.3092g,氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13；
所述的标记洗涤液为：每100mL中含有硼酸0.03092g,牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13；
所述的标记保存液为：每100mL中含有硼酸0.6184g，牛血清白蛋白1g，叠氮化钠0.02g，氢氧化钠若干，使终溶液pH值为8.13；
所述的洗涤后处理为：加入标记洗涤液离心洗涤，将沉淀重悬，再以13000r/min以上转速离心30-60min，弃去上清液，重复上述操作3次；洗涤过程中羧基化氧化石墨烯在标记洗涤液的浓度不高于0.4mg/mL。
9.权利要求1所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的应用，其特征在于：方法如下：称取待测样品，加入体积浓度为60～80％的甲醇水溶液，待测样品和甲醇水溶液的质量体积比为0.33g/mL，混匀，涡旋提取5～10分钟，在4000rmp离心10min，取上层清液，氮吹近干后用等体积的体积浓度为5～10％的甲醇水溶液复溶，0.22μm滤膜过滤得到待测样品溶液；取羧基化氧化石墨烯标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体反应试剂0.2～1μL，用缓释液按体积比稀释100～500倍，混匀，得到检测液；取待测样品溶液与检测液按体积比1:1混匀，室温反应半分钟后，逐滴加入上述混合液200μL到黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，同时取相同体积水做为阴性对照液，与检测液按体积比1:1混匀，逐滴加入另一黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，15分钟后读取结果；
检测结果：(1)阳性：当检测试纸条的质控线显示出棕黑色线条，而检测线不显色时，判为阳性，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量等于或高于2ng/mL。
或者质控线显示出棕黑色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，判为弱阳性，表明待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量高于或等于0.6ng/mL并低于2ng/mL。
(2)阴性：当检测试纸条的质控线显示出棕黑色线条，并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，判为阴性结果，表明待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1的含量低于0.6ng/mL；
(3)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线显示或不显示棕黑色线条，该试纸条判为无效；
最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
10.权利要求1所述的黄曲霉毒素B1氧化石墨烯免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述的缓释液为：每100mL中含有硼酸1.2368g，牛血清白蛋白2g，吐温200.1mL，聚乙二醇-60001.0g，叠氮化钠0.02g和氢氧化钠若干使溶液pH值为8.13；
所述的待测样品为玉米，大米或花生油，固体样品为磨细样品。
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