CN109476760B

CN109476760B - 人源化抗basigin抗体及其用途

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Publication number: CN109476760B
Application number: CN201780041146.2A
Authority: CN
Inventors: 陈志南; 朱平; 黄婉; 张征; 张阳; 张梦瑶; 边惠洁; 蒋建利
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2037-05-02
Also published as: CU20180129A7; JP7099709B2; WO2017186182A1; MA44777A; NI201800113A; CR20180515A; JP2019521648A; EP3448892A4; RU2755150C2; DOP2018000234A; PE20190415A1; AU2017255888A1; RU2018138053A; SG11201809473QA; CO2018011663A2; KR20190020660A; EP3448892A1; JP2022084832A; IL262588A; KR102369118B1

Abstract

本申请提供一种人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(V_H)，所述V_H包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；任选地进一步包含轻链可变区(V_L)，所述V_L包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本申请还提供组合物，其包含所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段、编码所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段的分离的核酸序列、包含所述核酸的载体、包含所述载体的宿主细胞，以及所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段的用途。

Description

人源化抗BASIGIN抗体及其用途

发明领域

本申请总体上涉及人源化抗BASIGIN抗体及其用途。

背景技术

BASIGIN(也称作EMMPRIN、Neurothelin和M6抗原)是一种分子量为50至60kD的高度糖基化的跨膜糖蛋白，也是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。人体中的BASIGIN具有269个氨基酸，其可分为胞外区、跨膜区和胞内区，其中自N-末端翻译起始点起的前21个残基构成信号肽，残基22-205构成胞外域，残基206-229构成具有典型亮氨酸拉链结构的跨膜区，在C-末端处的残基230-269构成胞内域。

已经表明BASIGIN在许多类型的人实体瘤中过表达，所述实体瘤如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌或胃癌。先前的研究表明，BASIGIN分子是肿瘤发展中重要的功能性膜蛋白，并且如下所述参与多种与癌症相关的现象：

i.BASIGIN介导肿瘤细胞的粘附和转移。肿瘤细胞表面表达的BASIGIN与vinclin相互作用，以促进肿瘤细胞的伪足的形成、铺展及粘附；与肿瘤细胞中的膜联蛋白II相互作用，以促进肿瘤细胞中MMP-2的分泌；通过刺激肿瘤细胞和肿瘤细胞周围的成纤维细胞分泌多种胞外基质金属蛋白酶(MMP)，例如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-11、MT1-MMP和MT2-MMP等，从而加速周围基质的降解，促进肿瘤细胞转移。

ii.BASIGIN参与肿瘤细胞的无氧代谢。BASIGIN是单羧酸转运体MCT-1和MCT-4的重要分子伴侣。BASIGIN可以与MCT-1和MCT-4相互作用以辅助它们在细胞膜上正确定位，并继续调节它们对乳酸代谢产物的转运功能。由于肿瘤细胞主要依靠无氧代谢产生能量，因此BASIGIN可间接通过MCT的表达调节肿瘤细胞的能量代谢和功能。

iii.BASIGIN促进肿瘤细胞耐药。BASIGIN在通过共表达调节机制影响多药耐药(MDR)基因的转录，并且促进P-g的表达，从而可诱导肿瘤的MDR。Kanekura等证明了BASIGIN通过P-g导致MDR，这表明BASIGIN可能是一个潜在的有效抑制MDR的靶点。另外，BASIGIN促进p-TFII-I的细胞核内定位，并且上调未折叠蛋白反应(UPR)中的关键因子Bip的表达，引起肿瘤细胞中的内质网应激和UPR，从而抑制凋亡并且导致对药物的不敏感性。抑制BASIGIN可促进肝癌细胞凋亡，并可增强肿瘤细胞对现有抗肿瘤药物的敏感性。

iv.BASIGIN上调VEGF表达以促进肿瘤新生血管形成。因此，抑制BASIGIN的表达可以显著抑制VEGF的分泌，从而抑制肿瘤新生血管形成。

v.BASIGIN与多种分子相互作用。BASIGIN蛋白的跨膜区具有高度保守的负电荷谷氨酸，是其与多种细胞膜蛋白相互作用的结构基础，同时也提示BASIGIN可以通过与多种蛋白的相互作用，影响细胞的多种生理活动。BASIGIN与CD98、Integrin、caveolin-1、cyclophilins(CyP)以及其他蛋白相互作用，从而通过调节如能量代谢、细胞-基质相互作用、信号传导等细胞功能，来影响肿瘤细胞的生长和转移。

此外，多项回顾性研究表明BASIGIN在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤病人的预后之间存在紧密的相关性。在非小细胞肺癌病人中，BASIGIN表达水平与病人的预后密切相关。

因此，BASIGIN已成为肿瘤治疗的新靶点，并且抗体药物“利卡汀(Licartin)”的成功研制证明了靶向BASIGIN成药的安全性和有效性。

此外，红血细胞上表达的BASIGIN与恶性疟原虫的棒状体蛋白PfRh5以配体-受体的方式发生相互作用，介导恶性疟原虫与红血细胞的远端识别，此是恶性疟原虫入侵红血细胞的关键环节。PfRh5与红血细胞上的BASIGIN分子的相互作用在不同疟虫株中均存在，表明红血细胞上的BASIGIN有望成为抗疟药物的重要靶点。抗人红血细胞上的BASIGIN的新型抗疟药物与传统的抗疟药物共同使用，以能够克服对化疗药物的耐药性。

单克隆抗体(McAb)已广泛用于许多疾病的诊断和治疗中。然而，鼠源McAb多次注入人体内可能引起患者体内的人抗鼠抗体(HAMA)反应，全身过敏性反应可能阻断抗体的功效。因此，在抗体药物研发中研究人抗体和人源化抗体，以发掘其潜在优势。

发明简述

本申请提供了具有高结合亲和力的人源化抗BASIGIN抗体，其生物活性通过实验验证。

本申请提供了人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(V_H)。

在一些实施方式中，所述V_H具有如SEQ ID NO:1

(EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)所示的氨基酸序列，其中在SEQID NO:1的位置i处的X(i＝5、23、49、79、80、89、94)被称为X_Hi，其中X_H5、X_H23、X_H49、X_H79、X_H80、X_H89、X_H94中的每一个都可以是任意氨基酸。

在一些实施方式中，X_H5是V或L。在一些实施方式中，X_H23是A或S。在一些实施方式中，X_H49是S、A或G。在一些实施方式中，X_H79是N或S。在一些实施方式中，X_H80是T或I。在一些实施方式中，X_H89是K或R。在一些实施方式中，X_H94是A或T。

在一些实施方式中，(a)X_H5是V，X_H23是A；和/或(b)X_H49是S或A；和/或(c)X_H79是N，X_H80是T，X_H89是K或R，X_H94是A。

在一些实施方式中，所述V_H包含如SEQ ID NO:9-11所示的3个重链CDR。

在一些实施方式中，所述V_H包含如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的框架区(FR)。

在一些实施方式中，所述V_H具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链可变区(V_L)。

在一些实施方式中，所述V_L具有如SEQ ID NO:2(DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)所示的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:2的位置j处的X(j＝9、10、13、21、22、42、43、60、65、80、81、83)被称为X_Lj，其中X_L9、X_L10、X_L13、X_L21、X_L22、X_L42、X_L43、X_L60、X_L65、X_L80、X_L81、X_L83中的每一个都可以是任意氨基酸。

在一些实施方式中，X_L9是S、P或A。在一些实施方式中，X_L10是T或S。在一些实施方式中，X_L13是A、L或V。在一些实施方式中，X_L21是L或I。在一些实施方式中，X_L22是S或T。在一些实施方式中，X_L42是K或Q。在一些实施方式中，X_L43是A、T或S。在一些实施方式中，X_L60是S或A。在一些实施方式中，X_L65是S或T。在一些实施方式中，X_L80是P或S。在一些实施方式中，X_L81是E或D。在一些实施方式中，X_L83是F或I。

在一些实施方式中，(a)X_L9是S或A，X_L10是T或S，X_L13是A，X_L21是L或I，X_L22是S或T；(b)X_L42是K或Q，X_L43是A或T；和/或(c)X_L60是S，X_L65是S或T，X_L80是P，X_L81是E或D，X_L83是F。

在一些实施方式中，所述V_L包含如SEQ ID NO:22-24所示的3个轻链CDR。

在一些实施方式中，所述V_L包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的FR。

在一些实施方式中，所述V_L具有如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗原结合片段是选自F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv、dAb和单链结合多肽的抗体片段。

在一些实施方式中，所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段包含人IgG重链的恒定区。在一些实施方式中，所述人IgG是人IgG2。在一些实施方式中，所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段包含人κ链的恒定区。

在一些实施方式中，所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段以约1×10^-11M到约5×10^-10M之间，或者约5×10^-11M到约1.1×10^-10M之间的K_D结合BASIGIN。

在一个方面，本申请还提供了分离的核酸序列，其编码本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方式中，所述分离的核酸序列包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。

在另一个方面，本申请还提供了一种载体，其包含编码本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段的核酸序列。

在另一个方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含本申请所述的载体。在一些实施方式中，所述宿主细胞是CHO细胞。

在又一个方面，本申请提供了一种组合物，其包含本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的运载体。

在另一个方面，本申请提供了一种治疗个体中与BASIGIN相关的病症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本申请所述的组合物。

在一些实施方式中，所述与BASIGIN相关的病症是癌症或疟疾。在一些实施方式中，所述癌症是肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌或胃癌。在一些实施方式中，所述个体是人。

在另一个方面，本申请提供了本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中与BASIGIN相关的病症的药物中的用途。

附图简述

图1示出了在人源化抗BASIGIN抗体的重链FR中特定氨基酸位点处的一些示例性的变化。

图2示出了在人源化抗BASIGIN抗体的轻链FR中特定氨基酸位点处的一些示例性的变化。

图3示出了通过ELISA分析测得的抗BASIGIN抗体(包括小鼠6H8(实心菱形)、嵌合6H8(实心倒三角)、人源化HP6H8-1(实心圆)、人源化HP6H8-2(实心三角)、人源化HP6H8-3(实心方块))与人BASIGIN的剂量依赖性结合。

图4是抗BASIGIN抗体轻链基因表达载体pcDNA3.3-LC-N-229-205的示意结构，在pcDNA3.3质粒的Xba I和Bsi WI位点之间插入编码轻链可变区的序列，随后是编码人κ链的恒定区的序列。

图5是抗BASIGIN抗体重链基因表达载体pOptivec-HC-D-229-205的示意结构，在pOptivec质粒的Xba I和Nhe I位点之间插入编码重链可变区的序列，随后是编码人IgG2重链的恒定区的序列。

图6示出了HP6H8-1抗体在中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系中的表达结果。

图7示出了HP6H8-1在结肠癌、肝癌和肺癌的恶性组织中的免疫组织化学染色结果。

图8表示人源化抗体HP6H8-1对恶性疟原虫入侵红细胞的体外抑制结果，其中结果数据以均值±S.E.M示出。

发明详述

本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式、变化和修改，应理解这样的等同实施方式包含在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包含公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入本申请。

人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段

在一个方面，本申请提供一种人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。

用于本申请的术语“抗体”包括任意免疫球蛋白、单克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含通过二硫链相互结合的两条重(H)链和两条轻(L)链。抗体的每条重链由一个可变区(V_H)以及第一、第二和第三恒定区(分别为C_H1、C_H2、C_H3)组成，而抗体的每条轻链由一个可变区(V_L)以及一个恒定区(C_L)组成。轻链和重链的可变区负责抗原结合。每条链中的可变区大致细分为3个高变区，称为互补决定区(CDR)(其中轻(L)链CDR包括LCDR1、LCDR2、LCDR3。重(H)链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本申请中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别。(Al-Lazikani,B.，Chothia,C.，Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4),927(1997)；Chothia,C等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C等，Nature.Dec 21-28；31(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。在一些实施方式中，根据Kabat数据库确定抗体的CDR边界。三个CDR由被称为框架区(FR，其中重(H)链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，轻(L)链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。因此，V_H和V_L各包含按以下顺序排布的3个CDR和4个FR(人氨基酸残基N末端到C末端)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出多种效应功能。

哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物轻链分为λ或κ。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列，根据是否分别存在α、δ、ε、γ和μ，可分为5大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类的亚类如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。

重链和/或轻链的一部分来源于一个物种、重链和/或轻链的其余部分来源于另一个物种的抗体或抗原结合片段被称作是杂合的。作为一个说明性的实例，杂合的抗体可以包含来源于人的恒定区以及来源于非人物种(如来源于小鼠)的可变区。

人源化抗体或抗原结合片段是指包含来源于非人(例如啮齿动物、兔、狗、山羊、马或鸡)抗体的CDR，以及完全或基本上来自人免疫球蛋白的可变区FR和恒定区(如果存在)的抗体或抗原结合片段。

用于本申请的“基本上”是指两个比较项(例如序列、数值)之间的高度相似，并且本领域的技术人员不会认为两项之间存在显著的差异，和/或会预期两个比较项在其性质(例如生理性质或生物活性)方面差异很小。

在一些实施方式中，改变人源化抗体或抗原结合片段的序列(例如取代、插入或缺失)，以改善抗体的一种或多种性质，如结合亲和力、稳定性、免疫原性、药代动力学半衰期、pH敏感性、对缀合的兼容性等。在一些实施方式中，改变一个或多个非人CDR和/或人FR中的一个或多个氨基酸残基，以改善抗体的一种或多种上述性质，同时保持或改善抗体的结合亲和力，其中改变的氨基酸残基对于特异性结合不是关键的，或者该改变为保守性变化，以使得人源化抗体与BASIGIN的结合不受到显著影响。

在一些实施方式中，来源于非人抗体的CDR可能包含与其相同来源的非人CDR相同的氨基酸序列，或者可能包含不超过3个、不超过2个、不超过1个氨基酸变化。在一些实施方式中，所述变化是保守取代。

“保守取代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代，或者对那些对于多肽的活性不是关键的氨基酸的取代。例如，可以在具有非极性侧链的的氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe和Trp)、在具有不带电的极性侧链的残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn、Gly和Gln)、在具有酸性侧链的残基间(例如Asp和Glu)、在具有碱性侧链的氨基酸间(例如His、Lys和Arg)、在具有β-分支侧链的氨基酸间(例如Thr、Val和Ile)、在具有含硫侧链的氨基酸间(例如Cys和Met)，或在具有芳香侧链的残基间(例如Trp、Tyr、His和Phe)进行保守替代。在一些实施方式中，不引起蛋白构象结构上的显著变化因而可保持蛋白的生物活性的取代、缺失或增加也可以被认为是“保守取代”。作为保守取代插入或缺失的氨基酸数目范围可以为约1至3。

在一些实施方式中，人源化抗BASIGIN或其抗原结合片段包含重链可变区(V_H)。在一些实施方式中，所述V_H包含如SEQ ID NO:9-11所示的CDR。在一些实施方式中，人源化抗BASIGIN或其抗原结合片段包含轻链可变区(V_L)。在一些实施方式中，所述V_L包含如SEQ IDNO:22-24所示的CDR。

在一些实施方式中，可以使用计算机软件虚拟抗体或抗原结合片段与人BASIGIN的结合，并且从而识别抗体/片段(例如FR)上对于结合不是关键的氨基酸位点。在模拟过程中可能针对上述位点测试不同的氨基酸，以识别不改变抗体或抗原结合片段的结合部分的结构/构象的氨基酸，或者可选地，以改善抗体或抗原结合片段的一种或多种性质，如结合或结合亲和力、稳定性、免疫原性、药代动力学半衰期、pH敏感性、与缀合物的兼容性等。上述计算机软件的实例包括但不限于SYBYL、Discovery Studio、MOE、AMBER、GROMACS、NAMD、CONCOORD、DynDom、Autodock、MODELER、MolMol等。

在一些实施方式中，人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段的FR区可以包含在例如不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸位点处的若干氨基酸变异。在一些实施方式中，人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段的FR区与非人FR同源。

用于本申请的“同源”和“同源的”可以互换使用，指当任选地进行比对时，氨基酸序列或核酸序列(或其互补链)具有与另一条序列至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性。

用于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性”百分比(％)是指在进行序列比对(必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多)后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。可以例如使用可公开获取的工具，如BLASTN、BLASTp、ClustalW2以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。

在一些实施方式中，所述V_H具有如SEQ ID NO:1

(EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)所示的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:1的位置i(i＝5、23、49、79、80、89、94)处的X被称为X_Hi，X_H5、X_H23、X_H49、X_H79、X_H80、X_H89、X_H94中的每一个可以是任意氨基酸。在一些实施方式中，所述V_H由如SEQ ID NO:1(EVQLXESGGGLVQPGGSLRLSCXASGFTFSNFWMNWVRQAPGKGLEWVXEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKXXLYLQMNSLXTEDTXVYYCTSYDYEYWGQGTLVTVSA)所示的氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO:1的位置i(i＝5、23、49、79、80、89、94)处的X被称为X_Hi，X_H5、X_H23、X_H49、X_H79、X_H80、X_H89、X_H94中的每一个可以是任意氨基酸。

在一些实施方式中，(a)X_H5是V，Xv_H23是A；和/或(b)Xv_H49是S或A；和/或(c)Xv_H79是N，X_H80是T，Xv_H89是K或R，Xv_H94是A。

在一些实施方式中，X_H5是V，Xv_H23是A。在一些实施方式中，X_H49是S或A。

在一些实施方式中，X_H49是S。在一些实施方式中，X_H49是A。在一些实施方式中，X_H79是N，X_H80是T，X_H89是K，X_H94是A。在一些实施方式中，X_H79是N，X_H80是T，X_H89是R，X_H94是A。

在一些实施方式中，所述V_H包含选自SEQ ID NO:12-15的一个或多个重链FR。

在一些实施方式中，所述V_H包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述V_H由如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区V_L。在一些实施方式中，所述V_L包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:24所示的CDR。

在一些实施方式中，所述V_L具有如SEQ ID NO:2

(DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)所示的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:43的位置j处的X(j＝9、10、13、21、22、42、43、60、65、80、81、83)被称为X_Lj，X_L9、X_L10、X_L13、X_L21、X_L22、X_L42、X_L43、X_L60、X_L65、X_L80、X_L81、X_L83中的每一个可以是任意氨基酸。在一些实施方式中，所述V_L由如SEQ ID NO:2(DIQMTQSPXXLSXSVGDRVTXXCKASENVGTYVSWYQQKPGXXPKLLIYGASNRYTGVPXRFTGXGSGTDFTLTISSLQXXDXATYYCGQSYSYPFTFGSGTKLEIK)所示的氨基酸序列组成，其中在SEQ ID NO:43的位置j处的X(j＝9、10、13、21、22、42、43、60、65、80、81、83)被称为X_Lj，X_L9、X_L10、X_L13、X_L21、X_L22、X_L42、X_L43、X_L60、X_L65、X_L80、X_L81、X_L83中的每一个可以是任意氨基酸。

在一些实施方式中，X_L9是S，X_L10是T，X_L13是A，X_L21是L，X_L22是S。在一些实施方式中，X_L9是A，X_L10是S，Xv_L13是A，X_L21是I，X_L22是S。在一些实施方式中，X_L9是S，X_L10是S，X_L13是A，X_L21是L，X_L22是T。

在一些实施方式中，X_L42是K，X_L43是A。在一些实施方式中，X_L42是Q，X_L43是T。在一些实施方式中，X_L42是Q，X_L43是A。

在一些实施方式中，X_L60是S，X_L65是S，X_L80是P，X_L81是E，X_L83是F。在一些实施方式中，X_L60是S，X_L65是S，X_L80是P，X_L81是D，X_L83是F。

在一些实施方式中，所述V_L包含选自SEQ ID NO:25-28的一个或多个FR。

在一些实施方式中，所述V_L包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述V_L由如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM重链的恒定区。在一些实施方式中，所述重链包含人IgG重链的恒定区。在一些实施方式中，所述人IgG是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，所述人IgG是人IgG2。在一些实施方式中，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含人λ或κ链的恒定区。在一些实施方式中，所述轻链包含人κ链的恒定区。

在一些实施方式中，本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体包含：如SEQ ID NO:9-11所示的3个重链CDR、如SEQ ID NO:12-15所示的重链框架序列HFR1、HFR2、HFR3和HFR4、如SEQ ID NO:22-24所示的轻链CDR，以及如SEQ ID NO:25-28所示的轻链框架序列LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，其中重链可变区的序列如下式所示：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4，并且轻链可变区的序列如下式所示：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

人源化抗体或抗原结合片段可用于人体治疗。在一些实施方式中，由于其与非人物种的抗体相比具有降低的免疫原性，或者引起人体中的免疫应答的可能性较低。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠、仓鼠或非人灵长类动物(例如猴，如食蟹猴(cynomolgus)或恒河猴(rhesus monkey)，或猿，例如黑猩猩(chimpanzee)、大猩猩(gorilla)、类人猿(simian)或affen)。

用于本申请的术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两个分子之间(例如抗体和抗原之间)非随机的结合反应。结合亲和力可以由K_D值表示，其计算为当抗原与抗体之间的结合达到平衡时，解离速率(k_off)与结合速率(k_on)的比率，即k_off/k_on。可以使用本领域公开的适宜方法适当地测定K_D值，包括例如使用如Biacore的仪器进行的等离子共振结合(SPR)试验(参见例如Murphy,M.等，Current protocols in protein science，第19章，19.14单元，2006)。

在一些实施方式中，本申请所述的抗BASIGIN抗体及其抗原结合片段能够以约10^- ⁷M或更低(例如10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M)的结合亲和力(K_D)与人BASIGIN特异性结合，所述K_D值通过等离子共振结合试验测定。在一些实施方式中，本申请所述的抗体或抗原结合片段与人和/或非人BASIGIN特异性结合的结合亲和力(K_D)为约1×10^-11M至约1×10^- ⁷M、约1×10^-11M至约1×10^-8M、1×10^-11M至约5×10^-9M、约1×10^-11M至约1×10^-9M、1×10^-11M至约1×10^-9M、约5×10^-11M至约5×10^-10M或约5×10^-11M至约1.1×10^-11M。在一些实施方式中，所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段以约1×10^-11M至约5×10^-10M之间，或约5×10^-11M至约1.1×10^-10M之间的K_D值与BASIGIN结合。

在一些实施方式中，所述抗BASIGIN抗体及其抗原结合片段与人BASIGIN特异性结合，但不与小鼠BASIGIN特异性结合，例如，与小鼠BASIGIN的结合亲和力比与人BASIGIN的结合亲和力低15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

用于本申请的术语“抗原结合片段”是指由含有一个或多个CDR的抗体片段或者任何其他结合抗原但不具有完整的天然抗体结构的抗体部分所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双功能抗体(dAb)、双特异性ds-双功能抗体(双特异性ds-dAb)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体、单链结合多肽、分离的CDR和多特异性抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体结合相同的抗原。

“Fab”是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)与一条重链的可变区和第一恒定区通过二硫键结合组成的抗体的单价抗原结合片段。

“Fab'”是指进一步包括铰链区部分的对应于Fab片段的单价抗原结合片段。

“F(ab')₂”是指通过二硫键结合在一起的两个Fab'片段的二聚体。

“Fv”由一条轻链的可变区与一条重链的可变区结合组成。

“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方式中，“(dsFv)₂”含有三条肽链：两个V_H部分通过肽接头相连，并通过二硫键与两个V_L部分结合。在一些实施方式中，dsFv有双特异性，其中每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。

“双功能抗体(diabody)”或“dAb”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含在同一条多肽链上用衔接物相连的V_H结构域与V_L结构域(V_H-V_L或V_L-V_H)(参见例如Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci U S A.,90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个结构域不能互相配对，从而迫使两个结构域与另一条链互补的结构域配对，形成两个抗体结合位点。

在一些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”包含V_H1-V_L2(通过肽接头连接)与V_L1-V_H2(也通过肽接头连接)经V_H1和V_L1之间的二硫链结合。

“单链Fv”或“scFv”或“单链抗体”是指包含抗体的一个V_H结构域和和一个V_L结构域的工程化的抗体片段，其中这些结构域彼此直接连接，或者经肽接头序列彼此连接以形成单多肽链(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA,85:5879(1988))。

“scFv二聚体”是指两个scFv的二聚体。

“单链结合多肽”是指能够与抗原或表位结合的任何单链多肽。

用于本申请的术语“抗原”是指能够与抗体或抗原结合片段结合、并且另外能够用于动物以产生能够结合至该抗原的抗体的分子或分子的一部分。抗原可能具有一个或多个表位。用于本申请的术语“表位”是指抗原上能够与抗体或抗原结合片段相互作用的特定原子基团(例如糖侧链、磷酰基、磺酰基)或氨基酸。

在一些实施方式中，抗原结合片段是选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、dsFv、dAb、scFv和单链结合多肽的抗体片段。

在一些实施方式中，本申请提供示例性的小鼠单克隆抗体HAb18GC2(也称为6H8)、其嵌合抗体(即c6H8)，以及人源化抗体HP6H8-1、HP6H8-2、HP6H8-3。

小鼠单克隆抗体HAb18GC2具有如SEQ ID NO:31所示的重链可变区、如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区。嵌合抗体c6H8包含与上述小鼠可变区融合的IgG1同种型的人恒定区。

在一些实施方式中，人源化抗BASIGIN抗体选自由HP6H8-1、HP6H8-2和HP6H8-3组成的组，其具有分别如SEQ ID NO:3、5和7所示的重链可变区(分别对应于编码DNA序列SEQID NO:4、6和8)，以及分别如SEQ ID NO:16、18和20所示的轻链可变区(分别对应于编码DNA序列SEQ ID NO:17、19和21)。

产生人源化抗体或抗原结合片段的分法

在一些实施方式中，使用重组方法制备所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。产生所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段的重组过程包括：

1)用人BASIGIN蛋白或产生hBASIGIN的细胞免疫合适的非人动物。所述动物可以是小鼠、大鼠、绵羊、山羊、兔或豚鼠。使用来自所述非人动物的脾或淋巴结生成产生抗体的杂交瘤，或者收集经免疫的非人动物的B细胞并且测量非人单克隆抗BASIGIN抗体滴度。通过使用常规步骤(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)将编码单克隆抗体的DNA分离并测序。

2)以合适的滴度克隆来自生成的杂交瘤或收集的B细胞克隆中的编码非人单克隆抗BASIGIN抗体的多核苷酸。分析多核苷酸编码的多肽的序列，以确定非人单克隆抗体的CDR界限。

3)通过将非人来源的抗体CDR基因移植至人免疫球蛋白基因中，获取人源化抗体或其抗原结合片段的重组基因，使得可变区框架和恒定区(如果存在)全部或基本上来自人免疫球蛋白序列。

4)可选地将重组基因并入合适的载体，并且将载体或重组基因引入宿主细胞，以产生本申请所述的人源化抗体或其抗原结合片段。

通过培养宿主细胞，随后对宿主细胞或培养液(例如上清)进行分离和纯化，可以以基本上纯净和均一的形式获取本申请所述的抗体及其抗原结合片段。对于抗体或其抗原结合片段的分离和纯化，可以采用任何多肽纯化的常规方法。

分离的核酸序列

在一个方面，本申请提供一种分离的核酸序列，其编码本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。

“分离的”物质是自其天然状态被人为改变的物质，例如从其原始环境中移出的天然存在的物质可被称为分离的物质。“分离的”核酸是这样的核酸分子：其基本上不含有其他核酸分子，并且不与伴随天然状态下的该核酸分子的天然存在的成分结合。“分离的核酸序列”是指分离的核酸分子的序列。

在一些实施方式中，所述分离的核酸序列包含一种或多种编码本申请所述的CDR序列的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列包含如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列或其同源序列。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列包含如SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19or SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列或其同源序列。

用于本申请的“同源”和“同源的”可以互换使用，指当最佳比对时核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列具有与另一条序列至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性。

“序列同一性”百分比(％)用于核酸序列(或氨基酸序列)时，是指在进行序列比对(并且必要时引入间隔使相同核酸(或氨基酸)数目达到最多)后，在候选序列中，与参比序列相同的核酸(或氨基酸)残基占所述候选序列的核酸(或氨基酸)残基的百分比。可以例如使用可公开获取的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上获取，另参见Altschul S.F等，J.Mol.Biol.,215:403–410(1990)；Stephen F等，NucleicAcids Res.,25:3389–3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所网站上获取，另参见Higgins D.G等，Methods in Enzymology,266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford,England),23(21):2947-8(2007))以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定核酸(或氨基酸)序列的百分比序列同一性。本领域的技术人员可以使用比对工具提供的默认参数，或者可以例如通过选择合适的算法，将参数自定义为适于比对。

载体

在另一个方面，本申请还提供一种包含分离的编码所述人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段的核酸序列的载体。

用于本申请的术语“载体”是指能够转化或转染细胞并且允许基因在细胞中表达的核酸媒介物。载体可以是表达载体或克隆载体。本申请提供含有本申请所述的编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸序列的载体(例如表达载体)、可操作地连接至所述核酸序列的至少一个启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标记。本申请所述的表达载体可以是病毒载体、质粒、噬菌体和柯斯质粒。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、pcDNA3.3质粒、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

宿主细胞

在另一个方面，本申请提供包含本申请所述的载体的宿主细胞。

用于本申请的“宿主细胞”是指引入外源核酸和/或载体以表达一种或多种外源蛋白的细胞。术语“宿主细胞”旨在既指特定的细胞本身又指其子代细胞。宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞或杂交瘤。不同的宿主细胞对于翻译后过程和蛋白和基因产物的修饰可能具有不同的特点和机制，因而可选取合适的细胞系作为宿主细胞，以确保对表达的人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段正确的修饰和处理(如初始转录物、糖基化和磷酸化)。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞。

可用的哺乳动物宿主细胞系的实例为SV40转化的猴肾CV1细胞系(例如COS-7)；人胚胎肾细胞系(例如用于在悬浮培养中生长而亚克隆的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中华仓鼠卵巢细胞(例如CHO/-DHFR、CHO/-GS，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:116(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 141)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；PC12；小鼠胚胎成纤维细胞系(3T3)；NSO骨髓瘤细胞(一种不内源性产生任何功能性的免疫球蛋白链的鼠源骨髓瘤细胞系)。在一些实施方式中，宿主细胞是CHO细胞。

用上述载体或重组基因转化的宿主细胞可以培养于常规的营养培养基中，或者培养于经改良以适于引入启动子、选择转化株或扩增的编码所需序列的基因的常规的营养培养基中。在一些实施方式中，宿主细胞可以用编码抗体的另一片段的第二多核苷酸共转化。在一些实施方式中，宿主细胞可含有外源核酸，但不表达理想水平的该外源核酸编码的蛋白，除非细胞中引入调节剂或者引入可操作地连接至该外源核酸的调节序列。在一些实施方式中，含有转化的载体的宿主细胞可以瞬时表达抗BASIGI抗体。

药物组合物

在一个方面，本申请提供一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。

本申请所述的药物组合物可以为本领域已知的任意常规形式，包括但不限于液体溶液、悬液、乳液、药丸、胶囊、药片、缓释制剂或粉末。在一些实施方式中，药物组合物被配制成可注射组合物。可注射组合物的实例包括可供注射用的无菌溶液；可供注射用的无菌悬液；可供注射用的无菌乳液；在使用前可在溶液中复原的无菌干燥可溶产品，如冻干粉末；等等。冻干粉末可在适宜条件下贮存，如在约4℃至室温下。用于复原的溶液可以是水性的或非水性的。在一些实施方式中，单剂量的可注射组合物预封装于安瓿、小瓶或带针头的注射器中。在一些实施方式中，多剂量的可注射组合物预封装于安瓿或小瓶中。

在一些实施方式中，药物组合物进一步包含药学上可接受的运载体。

用于本申请的术语“药学上可接受的”意指所指的运载体总体上与药物组合物中的其他成分在化学上和/或在物理上相兼容，并且在合理的医学判断的范围内适于在接收的个体(例如人类和动物)体内使用，与合理的效益/风险比率相称，不会引起过度的毒性、刺激性、过敏性反应或者其他问题或并发症。

“药学上可接受的运载体”可能包括例如可以促进活性成分储存至个体或向个体施用的药学上可接受的水性、非水性或固体媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、pH调节剂、悬浮/分散剂、掩蔽剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或非毒性辅助物质、本领域已知的其他组分，或者其任意组合。可应用于本申请中的药学上可接受的运载体包括本领域公知的那些，如《Remington Pharmaceutical Sciences》(Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)中所描述的，其通过引用并入本申请)。

为了进一步说明，药学上可接受的运载体可以包括例如无菌水、氯化钠、右旋葡萄糖(dextrose)、乳糖、果糖(fructose)、葡萄糖(glucose)、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、苯酚、甲酚、苄醇、氯丁醇、甘油(glycerol)、脯氨酸、组氨酸、精氨酸、盐酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、抗坏血酸、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸柠檬酸盐、磷酸盐、山梨酸盐、蔗糖磷酸盐、琥珀酸钠、柠檬酸钠、乙醇乙醇钠、氢氧化钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵、苄索氯铵、山梨醇酐单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、环糊精、吐温20(TWEEN-20)、吐温80(Tween-80)、玉米糖浆、甘油(glycerol)、硫酸氢钠、盐酸普鲁卡因、泊洛沙姆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、EDTA、EGTA或其他合适的试剂。

在一些实施方式中，药物组合物包含本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种其他治疗剂。在一些实施方式中，所述其他治疗剂是用于放疗、化疗、靶向疗法、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、血管新生抑制、姑息治疗、外科手术、抗疟药物或其组合的药剂。

试剂盒

本申请提供试剂盒，所述试剂盒包含本申请所述的抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，试剂盒可用于检测BASIGIN在生物样品中的存在情况或水平。生物样品可以是细胞或组织。

在一些实施方式中，试剂盒中含有的抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段与可检测标记缀合(例如荧光、放射性或酶标记)。在一些其他的实施方式中，试剂盒包含未标记的抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，并且进一步包含能够与该未标记的抗BASIGIN抗体结合的标记的二抗。试剂盒可以进一步包括检测标记的手段。试剂盒可以包括另外的用于进行特定方法的试剂和缓冲液。试剂盒可以进一步包含使用说明，以及将试剂盒中的各组分分隔开的包装。在一些实施方式中，试剂盒包含用于检测BASIGIN抗体的免疫试验。

在一些实施方式中，提供试剂盒用于检测BASIGIN蛋白水平。在一些实施方式中试剂盒用于预测、诊断、预防或治疗BASIGIN相关病症。

治疗方法

在一个方面，本申请提供一种治疗个体中与BASIGIN相关的病症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本申请所述的药物组合物。

在另一个方面，本申请提供本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中与BASIGIN相关的病症的药物中的用途。

在另一个方面，本申请提供可用于治疗个体中与BASIGIN相关的病症的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。

用于本申请的术语“个体”是指动物。所述动物通常是哺乳动物，特定的实例包括灵长类动物(例如人)、狗、猫、马、牛、猪和绵羊。在一些实施方式中，个体是人。

用于本申请的“与BASIGIN相关的病症”是指由BASIGIN(例如人BASIGIN)的表达或活性的增加或减少引起、加重或以其他方式与其存在关联的任何病症。在一些实施方式中，与BASIGIN相关的病症是癌症、炎性疾病或感染性疾病。

用于本申请的“癌症”是指以恶性细胞生长或肿瘤、异常增生、浸润或转移为特征的任何医学状况，并且包括实体肿瘤和例如白血病的非实体癌症(血液恶性肿瘤)。用于本申请的“实体瘤”是指肿瘤和/或恶性细胞的实体团块。癌症的实例包括但不限于非小细胞肺癌(鳞状/非鳞状)、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、乳腺导管内癌和乳腺小叶癌)、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿(mycoses fungoids)、梅克尔细胞癌、肝细胞癌(HCC)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤以及其他肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性肿瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、精原细胞瘤、经典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、肥大细胞源性肿瘤、EBV阳性和阴性PTLD以及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞淋巴瘤、淋巴结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、HHV8相关原发渗出淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合症、多毛细胞白血病和脊髓发育不良、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是转移性癌症，特别是BASIGIN表达转移性癌症。

在一些实施方式中，与BASIGIN相关的病症是炎性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、肠黏膜炎症、与结肠炎相关的消耗性疾病、多发性硬化、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩氏病，以及炎性肠病、牛皮癣、系统性硬皮病、自身免疫性糖尿病等。

在一些实施方式中，与BASIGIN相关的病症是感染性疾病，如真菌感染、寄生虫/原生动物感染或慢性病毒感染，例如疟疾、球孢子菌病、组织胞浆菌病、甲真菌病、曲霉病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球孢子菌病、微孢子虫病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝斯虫病、小袋虫病、贝利斯虫病、美洲锥虫病、华支睾吸虫病、锥蝇病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、象皮肿、蛲虫病、片形吸虫病、姜片吸虫病、丝虫病、贾第虫病、颌口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、钉螺热、利什曼病、莱姆病、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病、鞭虫病、锥虫病、蠕虫感染、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒、EB病毒、HIV、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人乳头瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒I、人类免疫缺陷病毒II、卡波西西肉瘤相关疱疹病毒流行病、薄环病毒(指环病毒)、人T淋巴营养性病毒I型、人T淋巴营养性病毒II型、水痘带状疱疹、JC病毒或BK病毒的感染。在一些实施方式中，病症是疟疾。

用于本申请的对病症的“治疗(Treating)”、“处理(treatment)”或“疗法”可以互换使用，并且包括治疗性的处理、预防性(prophylactic)或预防性(preventative)的措施，如预防或缓解病症、减缓病症的兴起或发展速度、减少发展出病症的风险、预防或延迟与病症相关的症状发展、减少或终止与病症相关的症状、产生病症的完全或部分的逆转、治愈病症、或者以上的组合。

用于本申请的术语“治疗有效量”是指对治疗与人BASIGIN相关联的疾病或病症有效的药物剂量或浓度。例如，对于本申请公开的人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段治疗癌症的用途，治疗有效量是抗体或抗原结合片段能够减少肿瘤体积、抑制癌症细胞的生长或增殖、抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞渗入其他器官、抑制或减缓癌细胞转移、缓解与癌症相关联的任何症状、阻止或延迟癌症的发展或其组合的剂量或浓度。或者对于本申请公开的人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段治疗疟疾的用途，治疗有效量是抗体或抗原结合片段能够抑制疟原虫的感染或增殖、缓解与疟疾病症相关联的任何症状、阻止或延迟疟疾病症的发展或其组合的剂量或浓度。

本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段的治疗有效量(当单独使用或与诸如化疗剂的其他药剂结合使用时)将取决于本领域已知的多种因素，例如待治疗的疾病的类型、抗体类型、体重、年龄、既往病史、当前用药、个体的健康状态、免疫状况和发生交叉反应、过敏、敏感和不良副作用的可能性，以及施用途径和类型、疾病的严重程度和发展情况，以及主治医师或兽医的自主裁量。在一些实施方式中，本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg，每日一次或多次(例如约0.01mg/kg、约0.3mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg，每日一次或多次)的治疗有效剂量施用。在一些实施方式中，所述人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量施用，并且在一些实施方式中，其剂量为20mg/kg或更少、10mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.3mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。在一些实施方式中，在治疗过程中施用剂量可能发生变化。例如，在一些实施方式中，初始施用剂量可能高于后续的施用剂量。在一些实施方式中，在治疗过程中施用剂量可能根据个体的反应发生变化。

可以调整给药方案以提供最佳期望反应(例如治疗反应)。在一些实施方式中，本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段一次性地向个体施用或者经一系列的治疗向个体施用。在一些实施方式中，依据疾病的类型和严重性，向个体一次或多次分别施用或者通过连续注射施用本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体或抗原结合片段。指导可见于例如美国专利号4,657,760；5,206,344；5,225,212。

本申请公开的人源化抗BASIGIN抗体和抗原结合片段可以以本领域已知的任意途径施用，例如肠外途径(例如皮下途径、腹腔途径、静脉途径，包括静脉注射、肌内或皮内注射)或非肠外途径(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)。

在一些实施方式中，本申请公开的人源化抗BASIGIN抗体和抗原结合片段可以以控释的方式施用。控释的肠外制剂可以制成移植物、油性注射物或微粒系统(例如微球、微颗粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒)(参见Banga,A.J.，Therapeutic Peptidesand Proteins:Formulation,Processing,and Delivery Systems,Technomic PublishingCompany,Inc.,Lancaster,Pa.,(1995)；Kreuter,J.，Colloidal Drug Delivery Systems，J.Kreuter编，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,pp.219-31(1994)；Tice&Tabibi，Treatise on Controlled Drug Delivery，A.Kydonieus编Marcel Dekker,Inc.New York,N.Y.,pp.315-339,(1992))。在一些实施方式中，本申请所述的人源化抗BASIGIN抗体和抗原结合片段可以在可降解或不可降解的聚合物基质中施用(参见Langer，AccountsChem.Res.26:537-51,1993)。

除非另有定义，否则用于本申请的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。

除非上下文另外指出，否则用于本申请的单数形式“一个”、“一种”和“所述”、“该”旨在同样包括复数形式。将进一步理解的是，用于本申请的术语“包含”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(have)”和/或“含有(having)”等表明所述特征、步骤或操作、元素和/或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、步骤、操作、元素、组分和/或其组群的存在或加入。用于本申请的术语“约”，当用于指特定的记载的数值时，意指数值可能与记载的数值有不超过10％的差异。

除非被明确排除或另外限制，否则本申请引用的所有文献，包括任何交叉引用的文献或相关的专利或申请在此通过引用全文并入本申请。对任何文献的引用并非承认其对于本申请公开的或本申请请求保护的任何发明是现有技术，或者其(单独或与任何其他一篇或多篇参考文件结合)教导、启示或公开上述发明。进一步地，当本申请中的术语的任何含义或定义与通过引用并入的文献中同一术语的任何含义或定义相冲突时，以本申请中赋予该术语的含义或定义为准。

实施例

以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包含在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包含在本发明的范围内。

实施例1：构建噬菌体展示载体

杂交瘤细胞系HAb18GC2在2006年生成并保藏于中国典型培养物保藏中心，登录号为CCTCC-C200636。关于该细胞系的具体信息、该细胞系产生的抗体以及制备方法记述于中国专利ZL200710007452.2中，其通过引用整体并入本申请。

通过依照试剂盒的说明书，使用总RNA提取试剂盒(Omega bio-tek)从杂交瘤细胞HAb18GC2中提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性。

cDNA的制备：取1μg总RNA，依照反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit(TaKaR)的说明书合成cDNA第一链，并且保存于-20℃下备用。

通过在PCR反应中分别使用VH和VL基因引物组，以cDNA为模板扩增VH基因片段和VL基因片段。

高保真DNA聚合酶(NEB)被用于PCR，并且依照NEB的说明书制备反应混合物。PCR反应条件设置如下：94℃，5分钟；(94℃，15秒，54℃，30秒，72℃，1分钟)×35个循环；72℃，10分钟。在1％琼脂糖凝胶电泳中测定所扩增片段的大小。

经由引物(VH反向接头-R1：SEQ ID NO:34，

CAAAGTTGGAAATAAAAGCGGCCGCAGAACAAAA；VL接头-F1：SEQ ID NO:35，TTTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATTTCCAACTTTG)，在进一步的PCR中将接头序列及其反向互补序列分别引入到VH基因片段的3’端和VL基因片段的5’端。

具有接头序列或接头序列的反向互补序列的VH基因片段和VL基因片段以1:1(mol/mol)混合，并且通过使用重叠PCR方法扩增scFv基因。反应体系配制如下：1pmol VH基因片段、1pmol VL基因片段、100pmol pFL-6H8-F1引物(SEQ ID NO:33CCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCT)、100pmol pFL-6H8-R2引物(SEQ ID NO:36TTTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATTTCCAACTTTG)、10μl10×PCR缓冲液。PCR反应条件设置如下：95℃，5分钟；(95℃，15秒，56℃，30秒，72℃，1分钟)×35个循环；72℃，10分钟。在1％琼脂糖凝胶电泳中测定所扩增片段的大小。

切下期望大小的条带，并且通过使用DNA片段纯化试剂盒(Omega bio-tek)回收以得到含有酶切位点Nco I和Not I的scFv基因片段。

用紫外分光光度计测量含有酶切位点Nco I和Not I的scFv基因片段以及载体质粒pGEM-T载体(Promega)，并随后进行限制性酶切。

反应设置如下：将3μg回收的scFv基因片段或3μg pGEM-T载体、1μl Nco I-HF、1μlNot I-HF限制性内切酶(NEB)、5μl 10×CutSmart缓冲液混合，并且加水至50μl。将酶切反应混合物在37℃下孵育1小时。在1％琼脂糖凝胶电泳中测定所得产物的大小，切下期望大小的条带，并且通过使用DNA片段纯化试剂盒(Omega bio-tek)回收以得到经酶切的scFv基因片段和经酶切的pGEM-T载体。

在酶切之后，连接回收的scFv基因片段和pGEM-T载体。连接反应混合物设置如下：0.7μg经酶切的scFv基因片段、1.4μg经酶切的pGEM-T载体、40U T4连接酶、40μl 5×连接缓冲液。连接反应混合物在16℃下孵育过夜。用连接产物转化TG1感受态细胞，然后涂布于LB琼脂平板上并且在37℃下孵育过夜。挑取分离的菌落，并且用载体通用引物筛选阳性克隆。随后针对正确插入对阳性克隆测序，将被证明含有正确插入的阳性克隆(称为重组质粒pFL-6H8)保存于-40℃下备用。重组质粒pFL-6H8含有具有完整重链和轻链可变区序列的scFv基因。

实施例2：确定小鼠单克隆抗体6H8的CDR和FR

根据Kabat数据库确定小鼠单克隆抗hBASIGIN抗体6H8(又名HAb18GC2，参见中国专利：ZL200710007452.2)轻链和重链可变区中的CDR。3个轻链CDR的氨基酸序列分别如序列表中的SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示。3个重链CDR的氨基酸序列分别如序列表中的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。

实施例3：选取合适的人免疫球蛋白框架序列

将上述CDR移植在获取自Kabat数据库的人FR序列上，用于抗体的人源化，并且筛选移植后的抗体可变区的同源性和结构。使用名为Discovery Vision(VIOVIA，版本3.5)的计算机软件，通过分子建模、同源建模和力学优化分析抗体在人源化前后的分子结构，并且验证人FR中的可能变化以确保经替换的FR不会改变VH和VL的整体骨架结构，特别是不会破坏小鼠单克隆抗体的β链二级结构，从而维持或者改善原始小鼠抗体的亲和力。选取的在特定位点具有可能变化的人重/轻链可变FR序列与小鼠FR序列在本申请的图1和图2中比对列出。

实施例4：构建和筛选噬菌体展示人源化抗hBASIGIN抗体文库

基于实施例2中确定的CDR的序列，以及实施例3中证实的FR序列，通过使用哺乳动物细胞中常用的密码子获取对应的编码人源化抗体的ScFv片段的核苷酸序列。通过重叠PCR方法获得编码基因，随后将其克隆至克隆载体并扩增，并且对阳性克隆进行测序分析。通过引物引入在重/轻链FR的编码序列中的特定氨基酸位点处的改变或变化，来进行FR的人源化。具体方案如下所述。

材料

来自实施例1的小鼠来源的scFv片段用作模板。使用以下引物用于扩增人源化重链可变区(hVH)和人源化轻链可变区(hVL)：

hVH正向引物包括：

1)6H8-L1-F1：SEQ ID NO:37

CAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTTGTGGAGTCTG

2)6H8-L1-F2：SEQ ID NO:38(6H8-L1-F2表示引物的混合物，其中R＝G或A，S＝G或C)

CGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTTGAGTGGGTTRSCGAAATTAGATTGAAATC

3)6H8-L1-F3：SEQ ID NO:39(6H8-L1-F3表示引物的混合物，其中R＝G或A)

CAGATGAACTCCTTAARGACTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTACCAG

hVH反向引物包括：

1)6H8-L1-R1：SEQ ID NO:40(6H8-L1-R1表示引物的混合物，其中M＝A或C，Y＝T或C)

GAAAGTGAATCCAGAGGCGGMACAGGAGAGCYTCAGGGATCCTCCAGG

2)6H8-L1_R2：SEQ ID NO:41

CCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTTCATCCAGAAGTTACTGAAAGTGAATCCAG

3)6H8-L1-R3：SEQ ID NO:42(6H8-L1-R3表示引物的混合物，其中R＝G或A，K＝G或T)

TAAGGAGTTCATCTGCAGGTACAGGRTGKTTTTGGAATCATCTCTTG

4)6H8-L1-R4：SEQ ID NO:43

GGGAGATTGGGTCATCTGAATGTCGCTAGCACCGCCAC

5)6H8-L1_R5：SEQ ID NO:44(6H8-L1_R5表示引物的混合物，其中R＝G或A，S＝G或C，W＝A或T，V＝G或C或A)

GGTGACCCTGTCGCCCACTGAGRSGGACAGGGWGGVGGGAGATTGGGTC

hVL正向引物包括：

1)6H8-L1_F4：SEQ ID NO:45(6H8-L1_F4表示引物的混合物，其中M＝A或C，W＝A或T)

GTGGGCGACAGGGTCACCMTCWCCTGCAAGGCCAGTGAG

2)6H8-L1_F6:SEQ ID NO:46(6H8-L1_F6表示引物的混合物，其中Y＝T或C，S＝G或C，W＝A或T)

TCAGCAGTCTGCAGYCCGASGACWTCGCAACCTATTACTGTGGACAGAGTTAC

3)6H8-L1_F5：SEQ ID NO:47

CCGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAG

hVL反向引物包括：

1)6H8-L1_R6：SEQ ID NO:48(6H8-L1_R6表示引物的混合物，其中H＝A或C或T，K＝G或T)

GTTGGATGCCCCGTATATCAGCAGTTTAGGGGHCTKGCCTGGTTTCTGTTG

2)6H8-L1_R8：SEQ ID NO:49

TTTGTTCTGCGGCCGCTTTTATTTCCAACTTTGTCCC

3)6H8-L1_R7：SEQ ID NO:50(引物6H8-L1_R7表示引物的混合物，其中W＝A或T，M＝A或C)

AGATCCACTGCCGGWGAAGCGGGMGGGGACCCCAGTGTACCGGTTGGATGCCCC

方法和结果

依照下列扩增方案扩增靶向片段：

第一步扩增：以实施例1中获取的pFL-6H8载体为模板，使用5对引物(6H8-L1-F1+6H8-L1-R1、6H8-L1-F2+6H8-L1-R3、6H8-L1-F3+6H8-L1-R4、6H8-L1_F4+6H8-L1_R6、6H8-L1_F6+6H8-L1_R8)扩增5个第一步片段。PCR反应条件设置如下：95℃，3分钟；(95℃，30秒，55℃，30秒，72℃，40秒)×40个循环；72℃，10分钟。在PCR之后，在1％琼脂糖凝胶电泳中测定所扩增的片段的大小，并将所扩增的片段连入pMD18-T载体(TaKaRa)。连接产物转化至感受态细胞中，选取克隆并且针对正确的插入进行筛选。基于测序结果，将具有正确序列的片段分别命名为6H8-L1-1、6H8-L1-2、6H8-L1-3、6H8-L1-4和6H8-L1-5。

第二步扩增：使用如上获取的5个第一步片段(6H8-L1-1、6H8-L1-2、6H8-L1-3、6H8-L1-4和6H8-L1-5)作为模板，并且使用4对引物(6H8-L1-F1+6H8-L1_R2、6H8-L1-F2+6H8-L1_R5、6H8-L1_F4+6H8-L1_R7、6H8-L1_F5+6H8-L1_R8)扩增第二步片段。PCR反应条件与第一步扩增相同。在PCR之后，通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，并将产物连入pMD18-T载体(TaKaRa)并且转化至感受态细胞中。选取阳性克隆并且针对正确的插入进行筛选。基于测序结果，将具有正确序列的片段分别命名为6H8-L1-6、6H8-L1-9、6H8-L1-7和6H8-L1-8。

第三步扩增：依照与第一步扩增相同的步骤，使用2个如上获取的第二步片段(6H8-L1-6和6H8-L1-9)作为模板，并且使用一对引物(6H8-L1-F1+6H8-L1_R5)以获取第三步片段(6H8-L1-10)；使用2个如上获取的第二步片段(6H8-L1-7和6H8-L1-8)作为模板，并且使用一对引物(6H8-L1_F4+6H8-L1_R8)以获取第三步片段(6H8-L1-11)。

第四步扩增：依照与第一步扩增相同的步骤，使用获取的第三步片段(6H8-L1-10和6H8-L1-11)作为模板，使用一对引物(6H8-L1-F1+6H8-L1_R8)以获取第四步片段(6H8-L1-12)。

将6H8-L1-12片段用限制性内切酶NcoI-HF和NotI-HF(NEB)进行酶切，随后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，并且通过胶提取试剂盒(Omega bio-tek)纯化经酶切的片段。经纯化的经酶切的片段与用同一组限制性内切酶(即NcoI-HF和NotI-HF)酶切的噬菌体载体pComb3Xss(包括预工程化至噬菌体载体的骨架的c-myc融合蛋白)经由连接酶(TaKaRa)连接。连接产物去离子化后经电穿孔转化至TG1感受态细胞。转化的TG1细胞接种至LB板上用于克隆筛选。记录6H8-L1抗体噬菌体文库的库容，并将文库保存于-80℃下备用。

通过固相淘选对6H8-L1抗体噬菌体文库进行抗原特异性淘选，步骤如下：

6H8-L1抗体噬菌体文库在60ml 2YT培养基中复苏，并且在37℃摇床中孵育，直至培养物的OD600达到0.3-0.4。加入M13KO7辅助噬菌体(Invitrogen)，并将培养物静置孵育30分钟，在37℃摇床中孵育60分钟。培养物以1500rpm离心10分钟，弃去上清液，并且用60ml50μg/ml含有卡那霉素的2YT培养基(不含葡萄糖)重悬细胞。重悬的培养物在30℃摇床中孵育过夜，以12,000rpm离心10分钟来沉淀含有细菌的噬菌体文库。将上清液转移至新的离心管中，以30ml/管分装，将7.5ml PEG/NaCl加至各离心管，混合均匀，置于冰上1小时，并且以12000rpm离心5分钟，弃去上清液，并且用2.2ml含有PBS-5％BSA的溶液重悬噬菌体。重悬噬菌体再次以12000rpm离心5分钟去除细胞碎片。

用人BASIGIN包被的板进行亲和力筛库，经过5轮的淘选(结合-洗脱-扩增)，每一轮淘选的抗原包被浓度依次递减(1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml)。信噪比(S/N)低于10时终止淘选实验。选取768个克隆，培养选取的克隆并且诱导其表达用于ELISA分析的scFv抗体。

实施例5：ELISA和测序分析

将人BASIGIN用包被缓冲液(200mM Na₂CO₃/NaHCO₃，pH 9.2)稀释至1μg/ml，96孔板的每孔中加入50μl，并且在4℃下培养过夜。弃去每孔中的包被溶液，然后用1×PBS缓冲液洗板3次，每孔用200μl封闭缓冲液(2％BSA/1×PBS缓冲液)在室温下封闭1小时，并且随后每孔用200μl 1×PBS缓冲液洗涤。将含有ScFv抗体和阴性对照的细胞培养上清液加入细胞板的各孔中，并且在室温下孵育2小时，随后用200μl 1×PBS缓冲液洗板3次。作为二抗的抗-c-Myc抗体(HRP)(Abcam Cat#ab19312，50μl/孔)用封闭缓冲液(1:2500)稀释，加入细胞板的各孔，并且在室温下孵育1小时。用200μl 1×PBS缓冲液洗板6次。将TMB底物溶液(50μl/孔)加至各孔中反应10分钟，然后加入终止溶液(2M HCl，50μl/孔)以终止反应。在ELISA读板仪上读取在450nm处的吸光度。根据ELISA的结果，选取A450>2.0的123个克隆用于测序分析。

参照人类免疫球蛋白种系数据库和http://www.bioinf.org.uk/abs/shab/网站，对DNA序列的测序结果进行人源化程度评价。选取人源化程度最好的26个scFV分子进行亲和力排序。

实施例6：通过SPR测定scFv结合活性

用ProteOn XPR36(Bio-Rad)测定抗体的亲和力。用0.04M EDC+0.01M sulfo-NHS(Bio-Rad)活化GLC芯片(Bio-Rad，1765011)。用10mM NaAc(pH 4.5)稀释人BASIGIN至10mM，然后以30μl/分种的速率注射到芯片上，使抗原与被活化的芯片通过氨基偶联。最后用1Methanolamine-HCl(Bio-Rad)灭活芯片，并且在芯片转动90度时，将其用缓冲液(PBS/0.005％Tween 20)冲洗至基线平稳。以30μl/分种的进样速率，在6个水平通道上分别注射5个含有scFv抗体的细胞上清和一个阴性对照。结合时间设为60秒，解离时间设为900秒。使用朗缪尔动力学(Kinetic-Langmuir)模型分析数据。

使用SPR实时监测人BASIGIN与含有scFv抗体的TG1上清的结合。所有筛选的抗体的结合速率常数(K_on)都是相当的，因此使用解离速率常数(K_off)而非K_D来确定结合抗体的亲和力。根据K_off预估人BASIGIN与人源化scFv抗体的结合亲和力，结果示于表1。

表1.SPR测定scFv抗体亲和力的结果

克隆号	K<sub>off</sub>(×10<sup>-5</sup>)	克隆号	K<sub>off</sub>(×10<sup>-5</sup>)	克隆号	K<sub>off</sub>(×10<sup>-5</sup>)
						11131	8.9	11205	35	11189	5.2
11135	32	11210	32	11193	5.5
						11143	10	11211	5.3	11195	5.3
11149	9.5	11214	5.2	11198	30
						11156	36	11230	39	11120	23
11182	40	11232	30	11203	9.3
						11187	6.4	11233	27	11246	41
11188	4.4	11242	3.4	11305	6.9
						11204	14	11245	4.1	小鼠6H8	11.4

考虑到其他特点，从K_off值相对较低的scFv中分别选取5个人源化scFv(即11188、11214、11242、11245和11305)用于构建完整抗体。

实施例7：构建完整的人源化抗体

根据之前的亲和力排序结果，接种5个具有选取的scFv的克隆过夜。从各过夜培养物中提取质粒，并且通过测序确认其序列。

下列引物用于扩增人源化重链可变区(VH)和人源化轻链可变区(VL)，以产生完整的人源化抗体：

VL正向引物：PCI-wbp229_F1，SEQ ID NO:51

GCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATTCAGATGACCCAATC

VL反向引物：pCI-6H8_R8,SEQ ID NO:52

GGTGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG

VH正向引物包括：

1)PCI-wbp229_F2：SEQ ID NO:53

CTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAGTGCAGCTTCTGGAGTC

2)PCI-wbp229_F3：SEQ ID NO:54

CTCTCCACAGGTGTACACTCCGAAGTGCAGCTTGTGGAGTC

3)6H8-L1_R2：SEQ ID NO:55

CCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTTCATCCAGAAGTTACTGAAAGTGAATCCAG

4)6H8-L1_R5：SEQ ID NO:56

GGTGACCCTGTCGCCCACTGAGRSGGACAGGGWGGVGGGAGATTGGGTC

VH反向引物：PCI-wbp229_R1，参见SEQ ID NO:57

GGGCCCTTGGTCGACGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC

通过依照下列扩增方案扩增靶片段：

使用来自11188的质粒作为模板，使用引物对(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8和PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1)来扩增完整的人源化抗体WBP229-201的VL和VH区。

使用来自11214的质粒作为模板，使用引物对(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8和PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1)来扩增完整的人源化抗体WBP229-202的VL和VH区。

使用来自11242的质粒作为模板，使用引物对(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8和PCI-wbp229_F3+PCI-wbp229_R1)来扩增完整的人源化抗体WBP229-203的VL和VH区。

使用来自11245的质粒作为模板，使用引物对(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8和PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1)来扩增完整的人源化抗体WBP229-204的VL和VH区。

使用来自11305的质粒作为模板，使用引物对(PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8和PCI-wbp229_F3+PCI-wbp229_R1)来扩增完整的人源化抗体WBP229-205的VL和VH区。

在PCR之后，经扩增的片段在1％琼脂糖凝胶电泳中分离，回收并纯化预期大小的条带。

经纯化的VL/VH片段用NgoMIV和SnaBI酶切，经酶切的片段用DNA纯化试剂盒纯化，随后与用相同的酶酶切并且包括(hIgG2重链恒定区或人κ链恒定区)基因的哺乳动物表达载体pCI-载体连接。连接产物转化至TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)中，并且将转化的细胞涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上。随后将阳性克隆接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中。克隆经测序验证后，通过使用Midi-Prep质粒提取试剂盒(QIAGEN)提取克隆质粒。制备的质粒分别命名为pCI-WBP229-201L和pCI-WBP229-201H、pCI-WBP229-202L和pCI-WBP229-202H、pCI-WBP229-203L和pCI-WBP229-203H、pCI-WBP229-204L和pCI-WBP229-204H、pCI-WBP229-205L和pCI-WBP229-205H，其各含有用于产生完整人源化抗体的完整的轻链基因或完整的重链基因。

实施例8：细胞的瞬时转染和抗体纯化

通过使用来自Invitrogen的Freestyle Max Reagent转染试剂，将一对含有一个轻链基因和一个对应的重链基因的质粒(例如pCI-WBP229-201L/H～205L/H)共转染入HEK293细胞(1.0×10⁶细胞/ml)。经转染的细胞在37℃，5％CO₂下摇床培养，摇床转速为120rpm。在转染7天后通过离心收集培养液上清，并且使用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中分离和纯化目的抗体。选取人源化抗体产量最高的三个培养物，其为：

1)HP6H8-1(对应于pCI-WBP229-205L/H)，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:3，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:16。

2)HP6H8-2(对应于pCI-WBP229-204L/H)，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:5，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。

3)HP6H8-3(对应于pCI-WBP229-203L/H)，其重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:7，其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:20。

实施例9：测定人源化抗hBASIGIN抗体的结合活性

200ng人BASIGIN重组蛋白包被到酶标板中，在4℃下静置过夜。包被的酶标板在室温下用0.1％BSA封闭1小时。实施例8中获取的3个抗体及其亲本小鼠单克隆抗体6H8和嵌合抗体c6H8各配制成5份浓度梯度为10、100、1,000、10,000和100,000ng/ml的溶液。每孔加入100μl各溶液，并且将酶标板在室温下静置1小时。加入100μl 1:4,000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人轻链恒定区二抗(Millipore)，室温静置1小时。随后用200μl 1×PBS缓冲液洗板3次，各孔加入TMB底物溶液(50μl/孔)反应10分钟，然后加入终止溶液(2M HCl，50μl/孔)终止反应。在ELISA读板仪上读取在450nm处的吸光度。

从结果看出，与亲本小鼠抗体6H8相比，3个人源化抗体和嵌合抗体c6H8显示出显著更高的与人BASIGIN的亲和力(图3)。

还通过SPR测定3个人源化抗体、小鼠抗体6H8和嵌合抗体c6H8的结合亲和力(详细步骤请参照实施例6中的描述)，数据示于表2。

表2.SPR测定人源化抗体的结合亲和力

如图3和表2所示，人源抗体的结合亲和力高于亲本小鼠抗体6H8的结合亲和力。人源化抗体在人体中的免疫原性低于亲本小鼠抗体6H8，并且人源化抗体的稳定性优于亲本小鼠抗体6H8。

实施例10：构建高效人源化抗hBASIGIN抗体表达载体以及筛选稳定表达细胞系

根据实施例9的结果，将HP6H8-1的基因序列用于构建高效人源化抗体表达载体。

1.构建轻链基因表达载体

合成编码HP6H8-1的VL区的基因序列，并且在序列的5’端和3’端分别引入限制性内切酶识别位点XbaI和BsiWI。用限制性内切酶XbaI和BsiWI对合成的分子以及带有轻链恒定区基因的pcDNA3.3-LC-104new-M质粒进行酶切。经酶切的产物在1％琼脂糖凝胶电泳中分离，回收并纯化预期大小的条带。通过使用T4连接酶连接经纯化的片段(来源于合成分子的416bp片段以及来源于pcDNA3.3-LC-104new-M质粒的5,712bp片段)，并且将反应混合物在16℃下存放20分钟。使用20μl连接溶液中的10μl转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(Invitrogen)。经转化的菌落通过PCR分析、酶切分析及测序证实，将一个正确的单克隆接种于200ml LB培养基中，在37℃摇床中孵育过夜，摇床转速为220rpm。提取质粒并命名为pcDNA3.3-LC-N-229-205(在图4中示出)。

2.构建重链基因表达载体

类似地，合成编码HP6H8-1的VH区的基因序列，并且在序列的5’端和3’端分别引入限制性内切酶识别位点XbaI和NheI。用限制性内切酶XbaI和NheI对合成的分子以及带有重链恒定区基因的pOptivec-HC-208-M质粒进行酶切。经酶切的产物在1％琼脂糖凝胶电泳中分离，回收并纯化预期大小的条带。通过使用T4连接酶连接经纯化的片段(来源于合成分子的434bp片段以及来源于pOptivec-HC-208-M质粒的5,364bp片段)并且将反应混合物在16℃下存放20分钟。使用20μl连接溶液中的10μl转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(Invitrogen)。经转化的菌落通过PCR分析、酶切分析及测序证实，将一个正确的单克隆接种于200ml LB培养基中，在37℃摇床中孵育过夜，摇床转速为220rpm。提取质粒并命名为pOptivec-HC-D-229-205(在图5中示出)。

3.构建和筛选CHO稳定表达细胞系

通过使用Freestyle Max Reagent(Invitrogen)将人源化抗体轻链表达载体pcDNA3.3-LC-N-229-205和人源化抗体重链表达载体pOptivec-HC-D-229-205转染至CHO/DHFR细胞。转染48个小时后，细胞首先用补充了500μg/ml G418的Opti CHO培养基筛选传代，直至细胞活率恢复到85％以上。在含有500nM MTX的筛选培养基中进行第二轮筛选。用ClonePix FL挑选单克隆。单克隆培养7-10天后，用HTRF方法检测到细胞培养上清中的HP6H8-1的表达水平为2.23±0.18g/L(在图6中示出)。

实施例11：测定人源化抗hBASIGIN抗体的特异性

用免疫组织化学方法检测抗体HP6H8-1与肿瘤组织的特异性结合，并且考察抗体的免疫组织化学交叉反应。使用3％H₂O₂阻断灭活内源性过氧化物酶，使用正常绵羊血清工作液来封闭，以HP6H8-1为一抗，以生物素标记的兔抗人Fc抗体为二抗，以辣根过氧化物酶标记的链霉素白蛋白工作液为标记试剂，DAB用于显色，苏木精用于复染。样品脱水后，将载有样品的玻片进行装片用于显微镜检验。

结果在图7中示出。抗体HP6H8-1的特异性着色可见于肺癌、肝癌、结肠癌及其他恶性肿瘤组织中，但在正常组织中很少见到，不同的着色程度标为“++”或“+++”。

以上结果显示本申请中基于CDR移植产生的人源化抗体可以特异性识别人BASIGIN。

实施例12：用HP6H8-1进行体外抗疟测试

分别用恶性疟原虫株Dd2、3D7、FCC1和Nf54感染人红细胞(O型)。当感染率≥1％且疟疾环状体≥80％时，进行抗疟试验。用单克隆抗体稀释培养物，将原虫的起始水平设置为0.5％，加入新鲜红细胞，将起始的红细胞压积设置为2％，分别以100、10、1、0.1、0.01μg/ml的浓度加入单克隆抗体HP6H8-1，每个浓度梯度进行三次试验。在37℃下培养72小时后进行薄血膜涂片，并且在100倍油镜下计数原虫率。独立重复三次实验，结果取平均值，并且用SPSS分析统计学数据。

人源化HP6H8-1单克隆抗体针对恶性疟原虫株Dd2、3D7、FCC1和Nf54的体外药效学结果在图8中示出。施用抗体72小时后，人源化单克隆抗体HP6H8-1对所有的恶性疟原虫株显示出显著的抗疟作用，其IC₅₀分别为0.04、0.02、0.04和0.05mg/ml。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 人源化抗BASIGIN抗体及其用途

<130> 022079-8006CN01

<140> 201780041146.2

<141> 2017-05-02

<160> 57

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗BASIGIN抗体或具有变异的抗原结合片段的人源化重链可变区的氨基酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(49)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(80)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (89)..(89)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (94)..(94)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 1

Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Xaa Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Thr Glu Asp Thr Xaa Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗BASIGIN抗体或具有变异的抗原结合片段的人源化轻链可变区的氨基酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(43)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(60)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(65)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(81)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(83)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Xaa Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Xaa

65 70 75 80

Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 116

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-1的重链可变区（VH）的氨基酸序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 4

<211> 348

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-1的重链可变区（VH）的核酸序列

<400> 4

gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaggctc 60

tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttgagtg ggtttccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180

cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc 240

ctgtacctgc agatgaactc cttaaagact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc 300

tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-2的重链可变区（VH）的氨基酸序列

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 6

<211> 348

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-2的重链可变区（VH）的核酸序列

<400> 6

gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaagctc 60

tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttgagtg ggttgccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180

cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc 240

ctgtacctgc aaatgaactc cttaaggact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc 300

tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-3的重链可变区（VH）的氨基酸序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 348

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-3的重链可变区（VH）的核酸序列

<400> 8

gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaagctc 60

tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggcttgagtg ggttgccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180

cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc 240

ctgtacctgc agatgaactc cttaaagact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc 300

tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> HCDR1

<222> (1)..(10)

<400> 9

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn

1 5 10

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> HCDR2

<222> (1)..(19)

<400> 10

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> HCDR3

<222> (1)..(5)

<400> 11

Tyr Asp Tyr Glu Tyr

1 5

<210> 12

<211> 25

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人重链FR1

<222> (1)..(25)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> Xaa 可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 12

Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser

20 25

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人重链 FR2

<222> (1)..(14)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> X=任意氨基酸

<400> 13

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa

1 5 10

<210> 14

<211> 32

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人重链 FR3

<222> (1)..(32)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 14

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Xaa Thr Glu Asp Thr Xaa Val Tyr Tyr Cys Thr Ser

20 25 30

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人重链 FR4

<222> (1)..(11)

<400> 15

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-1的轻链可变区（VL）的氨基酸序列

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe

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<210> 17

<211> 321

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-1的轻链可变区（VL）的核酸序列

<400> 17

gacattcaga tgacccaatc tccctccacc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc 60

ctctcctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120

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cgcttcaccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc 240

gaggacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-2的轻链可变区（VL）的氨基酸序列

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Leu Leu Ile

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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 321

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-2的轻链可变区（VL）的核酸序列

<400> 19

gacattcaga tgacccaatc tcccgcctcc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc 60

atctcctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120

ggccagaccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc 180

cgcttctccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc 240

gacgacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-3的轻链可变区（VL）的氨基酸序列

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 321

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 人源化抗体HP6H8-3的轻链可变区（VL）的核酸序列

<400> 21

gacattcaga tgacccaatc tccctcctcc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc 60

ctcacctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120

ggccaggccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc 180

cgcttcaccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc 240

gacgacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> LCDR1

<222> (1)..(11)

<400> 22

Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> LCDR2

<222> (1)..(7)

<400> 23

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> LCDR3

<222> (1)..(9)

<400> 24

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人轻链 FR1

<222> (1)..(23)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys

20

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人轻链 FR2

<222> (1)..(15)

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 26

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人轻链 FR3

<222> (1)..(32)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸

<400> 27

Gly Val Pro Xaa Arg Phe Thr Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Xaa Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人

<220>

<221> 人轻链 FR4

<222> (1)..(10)

<400> 28

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> 6H8的轻链可变区的氨基酸序列

<222> (1)..(107)

<400> 29

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> 6H8的轻链可变区的核酸序列

<222> (1)..(321)

<400> 30

aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtgggcga gagggtcacc 60

ttgagctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120

gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagaccttg cagattatca ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 31

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> 6H8的重链可变区的氨基酸序列

<222> (1)..(116)

<400> 31

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 32

<211> 348

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> 6H8的重链可变区的核酸序列

<222> (1)..(348)

<400> 32

gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca 180

cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240

gtctacctgc agatgaacaa cttaagaact gaagacactg gcatttatta ctgtaccagc 300

tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcaccg tctctgca 348

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> pFL-6H8-F1

<400> 33

cccagccggc catggccgaa gtgaagcttg aggagtct 38

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 接头-R1

<400> 34

caaagttgga aataaaagcg gccgcagaac aaaa 34

<210> 35

<211> 34

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 接头-F1

<400> 35

ttttgttctg cggccgcttt tatttccaac tttg 34

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> pFL-6H8-R2

<400> 36

ttttgttctg cggccgcttt tatttccaac tttg 34

<210> 37

<211> 37

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1-F1

<400> 37

cagccggcca tggccgaagt gcagcttgtg gagtctg 37

<210> 38

<211> 53

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1-F2

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(35)

<223> R = G 或 A, S = G 或 C

<400> 38

cgccaggctc cagggaaggg gcttgagtgg gttrscgaaa ttagattgaa atc 53

<210> 39

<211> 50

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1-F3

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> R = G 或 A

<400> 39

cagatgaact ccttaargac tgaagacact gccgtgtatt actgtaccag 50

<210> 40

<211> 48

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1-R1

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> M = A 或 C

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> Y = T 或 C

<400> 40

gaaagtgaat ccagaggcgg macaggagag cytcagggat cctccagg 48

<210> 41

<211> 53

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_R2

<400> 41

ccctggagcc tggcggaccc agttcatcca gaagttactg aaagtgaatc cag 53

<210> 42

<211> 47

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1-R3

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> R = G 或 A

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> K = G 或 T

<400> 42

taaggagttc atctgcaggt acaggrtgkt tttggaatca tctcttg 47

<210> 43

<211> 38

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1-R4

<400> 43

gggagattgg gtcatctgaa tgtcgctagc accgccac 38

<210> 44

<211> 49

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_R5

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(24)

<223> R = G 或 A, S = G 或 C

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> W = A 或 T

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> V = G 或 C 或 A

<400> 44

ggtgaccctg tcgcccactg agrsggacag ggwggvggga gattgggtc 49

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_F4

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> M = A 或 C

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> W = A 或 T

<400> 45

gtgggcgaca gggtcaccmt cwcctgcaag gccagtgag 39

<210> 46

<211> 53

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_F6

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> Y = T 或 C

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> S = G 或 C

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> W = A 或 T

<400> 46

tcagcagtct gcagyccgas gacwtcgcaa cctattactg tggacagagt tac 53

<210> 47

<211> 50

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_F5

<400> 47

ccggcagtgg atctggcaca gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag 50

<210> 48

<211> 51

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_R6

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> H = A 或 C 或 T

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> K = G 或 T

<400> 48

gttggatgcc ccgtatatca gcagtttagg gghctkgcct ggtttctgtt g 51

<210> 49

<211> 37

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_R8

<400> 49

tttgttctgc ggccgctttt atttccaact ttgtccc 37

<210> 50

<211> 54

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_R7

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> W = A 或 T

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> M = A 或 C

<400> 50

agatccactg ccggwgaagc gggmggggac cccagtgtac cggttggatg cccc 54

<210> 51

<211> 39

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> PCI-wbp229_F1

<400> 51

gctccccggg gcgcgctgtg acattcagat gacccaatc 39

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> pCI-6H8_R8

<400> 52

ggtgcagcca ccgtacgttt tatttccaac tttgtccccg ag 42

<210> 53

<211> 41

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> PCI-wbp229_F2

<400> 53

ctctccacag gtgtacactc cgaagtgcag cttctggagt c 41

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> PCI-wbp229_F3

<400> 54

ctctccacag gtgtacactc cgaagtgcag cttgtggagt c 41

<210> 55

<211> 53

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_R2

<400> 55

ccctggagcc tggcggaccc agttcatcca gaagttactg aaagtgaatc cag 53

<210> 56

<211> 49

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 6H8-L1_R5

<400> 56

ggtgaccctg tcgcccactg agrsggacag ggwggvggga gattgggtc 49

<210> 57

<211> 39

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> PCI-wbp229_R1

<400> 57

gggcccttgg tcgacgctgc agagacagtg accagagtc 39

Claims

1.一种人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的重链CDR的氨基酸序列以及如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQID NO:24所示的轻链CDR的氨基酸序列，并且包含如SEQ ID NO:16所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO:3所示的重链可变区的氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO:5所示的重链可变区的氨基酸序列、或如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO:7所示的重链可变区的氨基酸序列，以及包含人IgG重链的恒定区。

2.一种人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的重链CDR的氨基酸序列以及如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQID NO:24所示的轻链CDR的氨基酸序列，并且包含如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO:5所示的重链可变区的氨基酸序列或如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO:7所示的重链可变区的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自F(ab’)₂、Fab’、Fab、Fv、scFv、dsFv或dAb。

4.根据权利要求2所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其包含人IgG重链的恒定区。

5.根据权利要求1或4所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG是人IgG2。

6.根据权利要求1或2所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段，其包含人κ链的恒定区。

7.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1-6中任意一项所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段。

8.根据权利要求7所述的分离的核酸序列，其包含如SEQ ID NO:4所示的重链可变区编码序列和SEQ ID NO:17所示的轻链可变区编码序列、如SEQ ID NO:6所示的重链可变区编码序列和SEQ ID NO:19所示的轻链可变区编码序列、或如SEQ ID NO:8所示的重链可变区编码序列和SEQ ID NO:21所示的轻链可变区编码序列。

9.根据权利要求8所述的分离的核酸序列，其进一步包含编码人IgG重链或人κ链的恒定区的核苷酸序列。

10.一种载体，其包含根据权利要求7-9任意一项所述的核酸序列。

11.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10所述的载体。

12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

13.根据权利要求1-6中任意一项所述的人源化抗BASIGIN抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中与BASIGIN相关的疾病的药物中的用途，其中所述与BASIGIN相关的疾病是肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、胃癌或疟疾。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述个体是人。