JP6971306B2 - 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ−３を阻害する組成物および方法 - Google Patents

様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ−３を阻害する組成物および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6971306B2
JP6971306B2 JP2019505253A JP2019505253A JP6971306B2 JP 6971306 B2 JP6971306 B2 JP 6971306B2 JP 2019505253 A JP2019505253 A JP 2019505253A JP 2019505253 A JP2019505253 A JP 2019505253A JP 6971306 B2 JP6971306 B2 JP 6971306B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
masp
seq
antibody
antigen
binding fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019505253A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019533982A (ja
Inventor
ダブリュ． ジェイソン カミングス
グレゴリー エイ． デモプロス
トーマス ダドラー
ハンス−ウィルヘルム シュワエブル
ラリー ダブリュ． チョーカー
クリスティ エル． ウッド
宗久 矢吹
Original Assignee
オメロス コーポレーション
ユニバーシティー オブ レスター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オメロス コーポレーション, ユニバーシティー オブ レスター filed Critical オメロス コーポレーション
Publication of JP2019533982A publication Critical patent/JP2019533982A/ja
Priority to JP2021178522A priority Critical patent/JP7350822B2/ja
Priority to JP2021178521A priority patent/JP7350821B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6971306B2 publication Critical patent/JP6971306B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y25/00—Nanomagnetism, e.g. magnetoimpedance, anisotropic magnetoresistance, giant magnetoresistance or tunneling magnetoresistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01F—COMPOUNDS OF THE METALS BERYLLIUM, MAGNESIUM, ALUMINIUM, CALCIUM, STRONTIUM, BARIUM, RADIUM, THORIUM, OR OF THE RARE-EARTH METALS
    • C01F17/00—Compounds of rare earth metals
    • C01F17/20—Compounds containing only rare earth metals as the metal element
    • C01F17/206—Compounds containing only rare earth metals as the metal element oxide or hydroxide being the only anion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/08—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials
    • C09K11/77—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials containing rare earth metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/08—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials
    • C09K11/77—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials containing rare earth metals
    • C09K11/7728—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials containing rare earth metals containing europium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21104—Mannan-binding lectin-associated serine protease-2 (3.4.21.104)
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0054—Coated nanoparticles, e.g. nanoparticles coated with organic surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2002/00—Crystal-structural characteristics
    • C01P2002/50—Solid solutions
    • C01P2002/52—Solid solutions containing elements as dopants
    • C01P2002/54—Solid solutions containing elements as dopants one element only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2002/00—Crystal-structural characteristics
    • C01P2002/80—Crystal-structural characteristics defined by measured data other than those specified in group C01P2002/70
    • C01P2002/84—Crystal-structural characteristics defined by measured data other than those specified in group C01P2002/70 by UV- or VIS- data
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Description

関連出願の相互参照
本願は、2016年8月1日に出願された米国特許仮出願第62/369,674号の恩典を主張し、また2016年11月8日に出願された米国特許仮出願第62/419,420号の恩典を主張し、さらに2017年3月29日に出願された米国特許仮出願第62/478,336号の恩典を主張するものであり、それらの3件全てはそれらの全体が参照により組み入れられる。
配列表に関する記載
本願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名前は、MP_1_0254_US_Sequence_Listing_20170628_ST25であり、このファイルは191KBであり、2017年6月28日に作成されたものであり、また本明細書の出願と共にEFS-Webを介して提出されている。
背景
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において微生物感染および他の急性侵襲に対する免疫応答を開始、増幅、および組織化するための初期作用機構を提供する(M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York)。補体活性化は潜在的な病原体に対する有益な第一線の防御を提供するが、防御免疫応答を促進する補体の活性は宿主にとって潜在的な脅威となることもある(K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15：417-431, 1994； B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24：219-228, 1994)。例えば、C3およびC5タンパク質分解産物は好中球を動員および活性化する。活性化好中球は宿主防御に不可欠であるが見境なく破壊酵素を放出し、臓器損傷を引き起こすことがある。さらに、補体活性化によって、近くの宿主細胞ならびに微生物標的の表面に溶解性補体成分が沈着し、その結果、宿主細胞が溶解することがある。
補体系はまた、心筋梗塞、脳卒中、ARDS、再灌流障害、敗血症ショック、熱傷後の毛細血管漏出、心肺バイパス術後炎症、移植片拒絶、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、およびアルツハイマー病を含む、非常に多くの急性疾患状態および慢性疾患状態の発生に結び付けられてきた。これらの状態のほぼ全てにおいて、補体は原因でないが、発生に関与するいくつかの因子の1つである。それにもかかわらず、補体活性化は主な病理学的機構である可能性があり、これらの疾患状態の多くにおける臨床管理のための有効な点である。様々な疾患状態において補体媒介性組織損傷が重要であるという認識の高まりは、有効な補体阻害性薬物の必要性を強調する。現在に至るまで、C5に対する抗体であるエクリズマブ(Solaris(登録商標))がヒトでの使用に認可されている唯一の補体標的化薬物である。だが、C5は、補体系の「下流」に位置する、いくつかのエフェクター分子の1つであり、C5が遮断されても補体系活性化は阻害されない。従って、補体活性化の開始工程の阻害因子は「下流」補体阻害因子よりかなり優位に立っていると考えられる。
現在、補体系は3つの異なる経路：古典経路、レクチン経路、および第二経路を介して活性化され得ることが広く認められている。古典経路は、通常、外来粒子(すなわち、抗原)に結合した宿主抗体からなる複合体によって誘発され、従って、特異的抗体反応を発生させるために抗原への前曝露を必要とする。古典経路の活性化は宿主による以前の獲得免疫応答に左右されるので、古典経路は後天免疫系の一部である。対照的に、レクチン経路および第二経路はいずれも獲得免疫とは無関係であり、自然免疫系の一部である。
補体系が活性化されると、セリンプロテアーゼ酵素前駆体が連続して活性化される。古典経路活性化の第一段階は、特異的認識分子C1qと、抗原に結合したIgG分子およびIgM分子との結合である。C1qは、C1と呼ばれる複合体としてC1rおよびC1sセリンプロテアーゼプロ酵素と結合する。C1qと免疫複合体が結合すると、C1rのArg-Ile部位が自己タンパク分解によって切断された後に、C1rによって媒介されるC1sの切断および活性化が起こり、それによって、C4およびC2を切断する能力が獲得される。C4は、C4aおよびC4bと呼ばれる2つの断片に切断され、同様に、C2はC2aおよびC2bに切断される。C4b断片は、隣接するヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を結合し、活性化C2のC2a断片との非共有結合的相互作用を介してC3コンバターゼ(C4b2a)を生成することができる。C3コンバターゼ(C4b2a)は、C3aおよびC3b小成分へのタンパク質分解による切断によってC3を活性化し、それによって、C5コンバターゼ(C4b2a3b)が生成され、C5コンバターゼ(C4b2a3b)はC5を切断することによって、膜侵襲複合体(C5bとC6、C7、C8、およびC9との組み合わせで「MAC」とも呼ばれる)が形成される。膜侵襲複合体は細胞膜を破壊して細胞溶解を招き得る。C3およびC4の活性化型(C3bおよびC4b)は共有結合により外来標的表面に沈着し、複数の食細胞上にある補体受容体によって認識される。
独立して、レクチン経路を介した補体系活性化における第一段階も、特異的認識分子の結合と、それに続く、関連するセリンプロテアーゼプロ酵素の活性化である。しかしながら、C1qによる免疫複合体の結合ではなく、レクチン経路の認識分子は、総称してレクチンと呼ばれる炭水化物結合タンパク質(マンナン結合レクチン(MBL)、H-フィコリン、M-フィコリン、L-フィコリン、およびC型レクチンCL-11)の一群を含む。J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572：387-400, (2002)； Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21：547-578(2003)； Teh et al., Immunology 101：225-232(2000))を参照されたい。J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572：387-400(2002)； Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21：547-578(2003)； Teh et al., Immunology 101：225-232(2000)； Hansen et al., J, Immunol 185(10)：6096-6104(2010)も参照されたい。
Ikedaらは、C1qと同様にMBLが酵母マンナンでコーティングされた赤血球と結合すると、C4依存的に補体系を活性化できることを初めて証明した(Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262：7451-7454, (1987))。コレクチンタンパク質ファミリーのメンバーであるMBLは、3-ヒドロキシ基および4-ヒドロキシ基がピラノース環の赤道結合面に配向されている炭水化物と結合するカルシウム依存性レクチンである。従って、MBLのよく目につくリガンドはD-マンノースおよびN-アセチル-D-グルコサミンであるのに対して、この立体要件に合わない炭水化物はMBLに対して検出不可能な親和性を有する(Weis et al., Nature 360：127-134, (1992))。MBLと一価糖との相互作用は極めて弱く、解離定数は典型的に1桁のミリモル範囲である。MBLは、アビディティによって、すなわち、互いに近くに位置する複数の単糖残基と同時に相互作用することによってグリカンリガンドと緊密で特異的な結合を実現する(Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299：129-136, (1992))。MBLは、一般的に、微生物、例えば、細菌、酵母、寄生生物、およびある特定のウイルスを装飾する炭水化物パターンを認識する。対照的に、MBLは、通常、哺乳動物の血漿糖タンパク質上および細胞表面糖タンパク質上に存在する「成熟」複合糖質を装飾する最後から2番目の糖および最後の糖であるD-ガラクトースおよびシアル酸を認識しない。この結合特異性は、「外来」表面の認識を促進し、「自己活性化」からの保護を助けると考えられる。しかしながら、MBLは、哺乳動物細胞の小胞体およびゴルジの中に隔離されたN結合糖タンパク質および糖脂質上にある高マンノース「前駆」グリカンクラスターに高親和性で結合する(Maynard et al., J. Biol. Chem. 257：3788-3794, (1982))。さらに、MBLが、壊死細胞およびアポトーシス細胞に曝露され得る、ポリヌクレオチド、DNA、およびRNAを結合させることができることが示されている(Palaniyar et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1010：467-470 (2003)； Nakamura et al., J. Leuk. Biol. 86：737-748 (2009))。従って、損傷細胞は、MBL結合を介したレクチン経路活性化の潜在的な標的である。
フィコリンは、フィブリノゲン様ドメインと呼ばれる、MBLとは異なるタイプのレクチンドメインを有する。フィコリンはCa++非依存的に糖残基に結合する。ヒトでは、3種類のフィコリン(L-フィコリン、M-フィコリン、およびH-フィコリン)が同定されている。2種類の血清フィコリンであるL-フィコリンおよびH-フィコリンは共通してN-アセチル-D-グルコサミンに対する特異性を有する。しかしながら、H-フィコリンはN-アセチル-D-ガラクトサミンにも結合する。L-フィコリン、H-フィコリン、CL-11、およびMBLの糖特異性が異なることは、異なるレクチンが補い合い、重複によって異なる複合糖質を標的とし得ることを意味する。この考えは、レクチン経路にある公知のレクチンのうちL-フィコリンだけが、全てのグラム陽性細菌に見られる細胞壁複合糖質であるリポテイコ酸に特異的に結合するという最近の報告によって裏付けられている(Lynch et al., J. Immunol. 172：1198-1202, (2004))。アセチル化された糖部分に加えて、フィコリンはまた、アセチル化されたアミノ酸およびポリペプチドを結合させることもできる(Thomsen et al., Mol. Immunol. 48(4)：369-81 (2011))。コレクチン(すなわち、MBL)およびフィコリンはアミノ酸配列において有意な類似性を有さない。しかしながら、これらの2つのタンパク質グループは類似したドメイン構成を有し、C1qと同様に、集合して、多部位結合の可能性を最大にするオリゴマー構造を構築する。
MBLの血清濃度は健常集団では極めて変わりやすく、これは、MBL遺伝子のプロモーター領域およびコード領域の両方にある多型/変異によって遺伝的に制御される。急性期タンパク質として、炎症中にMBL発現はさらに上方制御される。L-フィコリンは、MBLの濃度とほぼ同じ濃度で血清中に存在する。従って、レクチン経路のL-フィコリン分岐は強さが潜在的にMBL部門に匹敵する。MBLおよびフィコリンはオプソニンとしても機能することができる。このために、食細胞は、MBLによって装飾された表面およびフィコリンによって装飾された表面を標的とすることが可能になる(Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3)：328-36(2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5)：490-7(2002), Aoyagi et al., J. Immunol, 174(1)：418-25(2005)を参照されたい)。このオプソニン化は、これらのタンパク質と食細胞受容体との相互作用を必要とする(Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169：1733, (1989)； Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271：2448-54, (1996))。食細胞受容体の正体は証明されていない。
ヒトMBLは、そのコラーゲン様ドメインを介して、MBL関連セリンプロテアーゼ(MASP)と呼ばれる独特のC1r/C1s様セリンプロテアーゼと特異的な、かつ高親和性の相互作用を形成する。現在に至るまで、3種類のMASPが述べられている。第1に、単一の酵素「MASP」が、補体カスケードの開始(すなわち、C2およびC4の切断)を担う酵素として同定され、特徴決定された(Matsushita et al., J Exp Med 176(6)：1497-1502(1992)：Ji et al., J. Immunol 150：571-578, (1993))。その後に、MASP活性は、実際には、2種類のプロテアーゼ：MASP-1およびMASP-2の混合物であることが確定された(Thiel et al., Nature 386：506-510, (1997))。しかしながら、補体活性化にはMBL-MASP-2複合体だけでも十分であることが証明された(Vorup-Jensen et al., J. Immunol 165：2093-2100, (2000))。さらに、MASP-2だけが高い割合でC2およびC4を切断した(Ambrus et al., J. Immunol, 170：1374-1382, (2003))。従って、MASP-2は、C4およびC2を活性化してC3コンバターゼであるC4b2aを生成するのを担うプロテアーゼである。これは、2種類の特異的なセリンプロテアーゼ(C1rおよびC1s)の協調作用が補体系活性化につながる古典経路のC1複合体とは大きな違いである。さらに、第三の新規プロテアーゼであるMASP-3が単離されている(Dahl, M.R. et al., Immunity 15：127-35, 2001)。MASP-1およびMASP-3は同じ遺伝子のオルタナティブスプライシング産物である。
MASPは、C1複合体の酵素成分であるC1rおよびC1sのドメイン構成と同一のドメイン構成を有する(Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28：545, (2000))。これらのドメインは、N末端C1r/C1s/ウニ(sea urchin)VEGF/骨形成タンパク質(CUB)ドメイン、上皮細胞成長因子様ドメイン、第二のCUBドメイン、補体制御タンパク質ドメインの縦列配列、およびセリンプロテアーゼドメインを含む。C1プロテアーゼと同様に、MASP-2の活性化は、セリンプロテアーゼドメインに隣接するArg-Ile結合の切断によって起こる。この切断によって、酵素はジスルフィド結合したA鎖およびB鎖に分けられる。後者はセリンプロテアーゼドメインからなる。
MBLはまた、MASP2の触媒活性を欠く、19kDaのMBL関連タンパク質(MAp19)または小MBL関連タンパク質(sMAP)として知られるオルタナティブスプライシング型MASP-2と結合することもできる(Stover, J. Immunol. 162：3481-90, (1999)； Takahashi et al., Int. Immunol. 11：859-863, (1999))。MAp19は、MASP-2の最初の2つのドメインに続いて、4個の独特のアミノ酸からなる余分な配列を含む。Map19の機能は不明である(Degn et al., J. Immunol. Methods. 2011)。MASP-1遺伝子およびMASP-2遺伝子は、それぞれ、ヒト第3染色体および第1染色体に位置する(Schwaeble et al., Immunobiology 205：455-466, (2002))。
いくつかの証拠から、異なるMBL-MASP複合体があり、血清中のMASPの大部分はMBLと複合体を形成しないことが示唆されている(Thiel. et al., J. Immunol. 165：878-887, (2000))。H-フィコリンおよびL-フィコリンはいずれもMBLと同様に全てのMASPに結合し、レクチン補体経路を活性化する(Dahl et al., Immunity 15：127-35, (2001)； Matsushita et al., J. Immunol. 168：3502-3506, (2002))。レクチン経路および古典経路はいずれも共通のC3コンバターゼ(C4b2a)を形成し、2つの経路はこの段階で1つになる。
レクチン経路は、ナイーブな宿主における感染からの宿主防御において主な役割を有すると広く考えられている。宿主防御においてMBLが関与する強力な証拠が機能的MBLの血清中レベルが低い患者の分析から得られた(Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572：401-413, (2002))。このような患者は反復性の細菌感染および真菌感染に対して感受性を示す。これらの症状は、通常、若年期に、母由来抗体価が減少している時であるが、抗体反応の全レパートリーが発達する前の見かけの脆弱期間に現れる。この症候群は、多くの場合、MBLオリゴマーの適切な形成を妨害する、MBLコラーゲン部分にある、いくつかの部位の変異に起因する。しかしながら、MBLは補体に関係なくオプソニンとして機能することができるので、感染に対する感受性の増大がどの程度まで補体活性化の障害によるものであるかは分かっていない。
古典経路およびレクチン経路とは対照的に、C1qおよびレクチンが他の2つの段階において果たす認識機能を、第二経路の開始因子が実行することはこれまで見出されていなかった。現在、第二経路は低レベルの代謝回転活性化を自発的に受けることが広く認められている。この代謝回転活性化は、自発的補体活性化を抑える適切な分子エレメントを欠く外来表面または他の異常表面(細菌、酵母、ウイルスに感染した細胞、または損傷組織)において容易に増幅することができる。第二経路活性化に直接関与する4種類の血漿タンパク質：C3、B因子およびD因子、ならびにプロペルジンがある。
非感染性ヒト疾患の発生に古典補体経路および第二補体経路を結び付ける幅広い証拠があるが、レクチン経路の役割は評価され始めたばかりである。最近の研究から、レクチン経路の活性化は虚血/再灌流障害における補体活性化および関連炎症を担っている可能性があるという証拠が得られた。Collard et al.,(2000)は、酸化ストレスに供された培養内皮細胞はMBLに結合し、ヒト血清に曝露されるとC3沈着を示すと報告した(Collard et al., Am. J. Pathol 156：1549-1556,(2000))。さらに、ヒト血清を遮断抗MBLモノクローナル抗体で処理すると、MBL結合および補体活性化が阻害された。これらの知見をラット心筋虚血-再灌流モデルに広げた。このモデルでは、ラットMBLに対する遮断抗体で処置されたラットは、冠状動脈閉塞時に対照抗体処置ラットより有意に少ない心筋損傷を示した(Jordan et al., Circulation, 104：1413-1418,(2001))。酸化ストレス後の血管内皮とのMBL結合の分子機構は不明である。最近の研究から、酸化ストレス後のレクチン経路の活性化は血管内皮サイトケラチンとのMBL 結合によって媒介されるが、複合糖質によって媒介されない可能性があることが示唆されている(Collard e al., Am. J. Pathol. 159：1045-1054,(2001))。他の研究は虚血/再灌流障害の発生に古典経路および第二経路を結び付けており、この疾患におけるレクチン経路の役割は議論の余地が残されている(Riedermann, N.C. et al., Am. J. Pathol. 162：363-367, 2003)。
最近の研究から、MASP-1およびMASP-3が、第二経路活性化酵素であるD因子を酵素前駆体型から酵素活性型に変換させることが分かっている(Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1)：29-37(2010)；Iwaki et al., J. Immunol. 187：3751-58 (2011)を参照されたい)。このプロセスの生理学的重要性は、MASP-1/3欠損マウスの血漿中に機能的な第二経路活性が存在しないことで強調される。タンパク質分解によって天然C3からC3bが生成されるには第二経路が機能することが必要である。第二経路C3コンバターゼ(C3bBb)が必須のサブユニットであるC3bを含有するので、第二経路を介した最初のC3bの起源に関する疑問は不可解な問題であり、膨大な研究を活気づけてきた。
C3は、(C4およびα-2マクログロブリンと共に)チオエステル結合として知られる稀な翻訳後修飾を含有するタンパク質のファミリーに属する。チオエステル基は、3アミノ酸離れたシステインのスルフヒドリル基とチオエステル共有結合を形成する末端カルボニル基を有するグルタミンからなる。この結合は不安定であり、求電子性グルタミル-チオエステルはヒドロキシル基またはアミノ基などの求核性部分と反応し、従って、他の分子と共有結合を形成することができる。チオエステル結合は、インタクトなC3の疎水性ポケットの中に隔離された場合にかなり安定している。しかしながら、タンパク質分解によってC3がC3aおよびC3bに切断されると、反応性の高いチオエステル結合がC3b上に露出し、ヒドロキシル基またはアミノ基を含む隣接する部分による求核攻撃後に、C3bは標的と共有結合する。C3チオエステルは、C3bと補体標的との共有結合における詳細に記録が残された役割に加えて、第二経路の誘発において中心的な役割も有すると考えられている。広く認められている「チックオーバー理論(tick-over theory)」によれば、第二経路は、加水分解チオエステルを有するC3(iC3； C3(H2O))およびB因子から形成される液相コンバターゼiC3Bbの発生によって開始される(Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7：143-162, (1984))。C3b様C3(H2O)は、天然C3から、このタンパク質にある内部チオエステルのゆっくりとした自発性的加水分解によって生成される(Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154：856-867, 1981)。C3(H2O)Bbコンバターゼの活性によってC3b分子は標的表面に沈着され、それによって、第二経路が開始される。
本明細書に記載される本発見の前には第二経路活性化の開始因子についてほとんど知られていなかった。活性化因子は、酵母細胞壁(ザイモサン)、多くの純粋多糖、ウサギ赤血球、ある特定の免疫グロブリン、ウイルス、菌類、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物、および損傷細胞を含むと考えられていた。これらの活性化因子に共通する唯一の特徴は炭水化物の存在であるが、炭水化物構造の複雑性および多様性のために、認められた共通の分子決定基を証明することは難しい。第二経路活性化は、この経路の阻害性調節成分、例えば、H因子、I因子、DAF、およびCR1、ならびに、プロペルジンの間の微妙なバランスによって制御され、後者が第二経路の唯一の正の制御因子であることが広く認められている(Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1)：17-21(1999)を参照されたい)。
前記の明らかに無秩序な活性化機構に加えて、生成されたC3bがB因子と共に、さらなる第二経路C3コンバターゼ(C3bBb)の形成に関与することができるので、第二経路はレクチン/古典経路C3コンバターゼ(C4b2a)の強力な増幅ループも提供することができる。第二経路C3コンバターゼはプロペルジン結合によって安定化される。プロペルジンは、第二経路C3コンバターゼの半減期を6〜10倍、延長する。C3bを第二経路C3コンバターゼに添加すると、第二経路C5コンバターゼが形成される。
3つ全ての経路(すなわち、古典経路、レクチン経路、および第二経路)はC5において1つになると考えられている。C5は切断されて、複数の炎症誘発作用を有する産物を形成する。1つになった経路は終末補体経路と呼ばれている。C5aは、平滑筋緊張および血管緊張の変化ならびに血管透過性を誘導する最も強力なアナフィラトキシンである。C5aはまた好中球および単球の強力なケモタキシンおよび活性化因子である。C5aを介した細胞活性化は、サイトカイン、加水分解酵素、アラキドン酸代謝産物、および活性酸素種を含む複数種のさらなる炎症メディエーターの放出を誘導することによって炎症反応を著しく増幅することができる。C5が切断されると、膜侵襲複合体(MAC)とも知られるC5b-9が形成される。現在、溶解を引き起こすのに十分でない(sublytic)MAC沈着が、溶解性ポア形成複合体としての役割に加えて炎症において重要な役割を果たし得るという強力な証拠がある。
補体系は免疫防御における必須の役割に加えて、多くの臨床状態における組織損傷の一因となる。従って、これらの副作用を阻止するために治療上有効な補体阻害因子を開発する差し迫った必要性がある。
概要
1つの局面において、本発明は、高い親和性（500pM未満のKDを有する）でヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合し、第二経路補体活性化を阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片は、以下の性質の少なくとも1つまたは複数を特徴とする：（a）プロD因子成熟を阻害すること；（b）ヒトMASP-1（SEQ ID NO:8）に結合しないこと；（c）哺乳動物対象において約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で第二経路を阻害すること；（d）古典的経路を阻害しないこと；（e）溶血および／もしくはオプソニン化を阻害すること；（f）MASP-3セリンプロテアーゼ基質特異的切断を阻害すること；（g）溶血を減少させること、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；（h）活性化表面へのB因子および／もしくはBb因子沈着を減少させること；（i）プロD因子と比べて、静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子を減少させること；（j）活性化表面に応答して、プロD因子と比べて活性D因子のレベルを減少させること；（k）静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成を減少させること；ならびに／または（l）P因子沈着を減少させること。いくつかの態様において、ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン中に位置するエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、
Figure 0006971306
の少なくとも1つまたは複数の中に位置する、項目1または2の単離された抗体またはその抗原結合断片。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、
Figure 0006971306
の少なくとも1つの中のエピトープに結合する。
別の局面においては、本発明は、（a）SEQ ID NO:209（XXDIN、1位のXはSまたはTでありかつ2位のXはNまたはDである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:210（
Figure 0006971306
、7位のXはGまたはDであり；8位のXはS、T、またはRであり；9位のXはIまたはTであり；13位のXはEまたはDであり；14位のXはKまたはEであり；かつ16位のXはTまたはKである）に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:211（XEDXY、1位のXはLまたはVでありかつ4位のXはTまたはSである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）SEQ ID NO:212（
Figure 0006971306
、8位のXはN、I、Q、またはAであり；9位のXはSまたはTであり；かつ17位のXはAまたはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:146（KQSYNLYT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:213（SYGXX、4位のXはMまたはIでありかつ5位のXはSまたはTである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:74に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:214（GGXAXDY、3位のXはEまたはDでありかつ5位のXはMまたはLである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）SEQ ID NO:215（
Figure 0006971306
、10位のXはD、E、またはAであり；11位のXはGまたはAであり；かつ16位のXはNまたはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:155に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:216（WQGTHFPXT、8位のXはWまたはYである）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:84（GKWIE）に記載されるHC-CDR1；
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:88（SEDV）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:161（KQSYNIPIT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:91（GYWIE）に記載されるHC-CDR1；
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:95（SIDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:165（KVSNRFS）に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:167（SQSTHVPPT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面において、本発明は、
（a）
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:112（GSHYFDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:184（YASESIS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（b）SEQ ID NO:125（DYYMN）に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:198（YTSRLHS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（c）SEQ ID NO:137に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:138に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:140に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:206に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:207に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:208に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（d）SEQ ID NO:98に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:99に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:101に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:169に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:171に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:173に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（e）SEQ ID NO:103に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:105に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:107に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:176に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（f）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:116に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:118に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:188に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:190に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（g）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:121に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:123に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:191に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面において、本発明は、それを必要とする哺乳動物対象に、哺乳動物における第二経路補体経路活性化を阻害するのに十分な量の、高親和性MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を投与する工程を含む、哺乳動物における第二経路補体活性化を阻害する方法を提供する。方法の1つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は500pM未満の親和性でMASP-3に結合する。方法の1つの態様において、抗体または抗原結合断片を含む組成物を投与する結果として、哺乳動物対象において以下の1つまたは複数が見られる：（a）D因子成熟の阻害；（b）約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で対象に投与された場合の、第二経路の阻害；（c）古典的経路が阻害されないこと；（d）溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；（e）溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；（f）活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；（g）プロD因子と比べた、静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；（h）活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；ならびに／または（i）静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成の減少。方法の1つの態様において、組成物は、約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で第二経路を阻害するMASP-3阻害抗体を含む。
別の局面において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、またはベーチェット病に罹患している対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害する方法を提供する。方法は、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量の高親和性MASP-3阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、MASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む。
別の局面において、本発明は、治療的に有効な量のMASP-3阻害物質を薬学的担体に組み合わせる工程を含む、それを必要とする生きている対象におけるMASP-3依存性補体活性化の効果を阻害するために使用するための医薬を製造する方法を提供する。いくつかの態様において、MASP-3阻害物質は高親和性MASP-3阻害抗体である。いくつかの態様において、本発明のこの局面の方法は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、もしくはベーチェット病からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象、またはそれを発症する危険のある対象におけるMASP-3依存性補体活性化の効果を阻害するために使用するための医薬を製造する工程を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、治療的に有効な量のMASP-2阻害物質を、MASP-3阻害物質を含む医薬にまたはそれと組み合わせる工程を含む。
別の局面において、本発明は、生理学的に許容される担体と、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する高親和性MASP-3阻害性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片とを含む薬学的組成物を提供する。1つの態様において、該高親和性MASP-3抗体またはその抗原結合断片は、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。
別の局面において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、対象におけるPNHを治療するのにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合し、かつ第二経路補体活性化を阻害する高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。1つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む（a）重鎖可変領域を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、PNHに罹患している対象における赤血球の生存率を増加させる。いくつかの態様において、PNHに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象は、（i）正常より低いレベルのヘモグロビン、（ii）正常より低いレベルの血小板、（iii）正常より高いレベルの網状赤血球、および（iv）正常より高いレベルのビリルビンからなる群より選択される1つまたは複数の症状を示す。いくつかの態様において、薬学的組成物は、PNHに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象に全身的に（たとえば皮下、筋肉内、静脈内、動脈内または吸入剤として）投与される。いくつかの態様において、PNHに罹患している対象またはその危険のある対象は、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害物質による治療を以前に受けたことがあるかまたは現在受けている。いくつかの態様において、方法はさらに、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害物質を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、終末補体阻害物質はヒト化抗C5抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、終末補体阻害物質はエクリズマブである。
別の局面において、本発明は、関節炎（炎症性および非炎症性関節炎）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、対象における関節炎を治療するのにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合し、かつ第二経路補体活性化を阻害する高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。1つの態様において、該抗体またはその抗原結合断片は、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、対象は、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、ベーチェット病、感染症関連関節炎、および乾癬性関節炎からなる群より選択される関節炎に罹患している。いくつかの態様において、薬学的組成物は、全身的に（すなわち皮下、筋肉内、静脈内、動脈内または吸入剤として）投与される。いくつかの態様において、薬学的組成物は関節に局所投与される。
本明細書に記載されるように、高親和性MASP-3阻害抗体の様々な態様を、任意でMASP-2阻害物質の様々な態様と組み合わせて、本発明の薬学的組成物において使用することができる。
本明細書に記載されるように、本発明の薬学的組成物を本発明の方法にしたがって使用することができる。
[本発明1001]
高い親和性（500pM未満のK D を有する）でヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合し、第二経路補体活性化を阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1002]
以下の性質の少なくとも1つまたは複数を特徴とする、本発明1001の単離された抗体またはその抗原結合断片：
（a）プロD因子成熟を阻害すること；
（b）ヒトMASP-1（SEQ ID NO:8）に結合しないこと；
（c）哺乳動物対象において約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で第二経路を阻害すること；
（d）古典経路を阻害しないこと；
（e）溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；
（f）MASP-3セリンプロテアーゼ基質特異的切断の阻害；
（g）溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；
（h）活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；
（i）プロD因子と比べた静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；
（j）活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；
（k）静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成の減少；ならびに／または
（l）P因子沈着の減少。
[本発明1003]
前記ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン中に位置するエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、
Figure 0006971306
の少なくとも1つまたは複数の中に位置する、本発明1001または1002の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1004]
SEQ ID NO:15の中のエピトープに結合する、本発明1003の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1005]
SEQ ID NO:10の中のエピトープに結合する、本発明1003の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1006]
SEQ ID NO:9の中のエピトープに結合する、本発明1003の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1007]
SEQ ID NO:12の中のエピトープにも結合する、本発明1005の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1008]
SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、および／またはSEQ ID NO:14の少なくとも1つの中のエピトープにも結合する、本発明1006の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1009]
前記抗体が、
Figure 0006971306
の少なくとも1つの中のエピトープに結合する、本発明1001または1002の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1010]
（a）SEQ ID NO:84（GKWIE）に記載されるHC-CDR1；
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:88（SEDV）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:161（KQSYNIPT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（b）SEQ ID NO:213（SYGXX、4位のXがMもしくはIでありかつ5位のXがSもしくはTである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:74に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:214（GGXAXDY、3位のXがEもしくはDでありかつ5位のXがMもしくはLである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:215（
Figure 0006971306
、10位のXがD、E、もしくはAであり；11位のXがGもしくはAであり；かつ16位のXがNもしくはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:155に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:216（WQGTHFPXT、8位のXがWもしくはYである）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（c）SEQ ID NO:209（XXDIN、1位のXがSもしくはTでありかつ2位のXがNもしくはDである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:210（
Figure 0006971306
、7位のXがGもしくはDであり；8位のXがS、T、もしくはRであり；9位のXがIもしくはTであり；13位のXがEもしくはDであり；14位のXがKもしくはEであり；かつ16位のXがTもしくはKである）に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:211（XEDXY、1位のXがLもしくはVでありかつ4位のXがTもしくはSである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:212（
Figure 0006971306
、8位のXがN、I、Q、もしくはAであり；9位のXがSもしくはTであり；かつ17位のXがAもしくはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:146（KQSYNLYT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1011]
前記LC-CDR1がSEQ ID NO:258を含む、本発明1010（a）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1012]
SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:254、またはSEQ ID NO:255と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:256、またはSEQ ID NO:280と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1010（a）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1013]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:72（SYGMS）を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1014]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:79（SYGIT）を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1015]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:76（GGEAMDY）を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1016]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:82（GGDALDY）を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1017]
（b）の軽鎖可変領域のLC-CDR1が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1018]
前記軽鎖可変領域のLC-CDR1がSEQ ID NO:152を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1019]
（b）の軽鎖可変領域のLC-CDR3が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1020]
（b）の軽鎖可変領域のLC-CDR3がSEQ ID NO:160（WQGTHFPYT）を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1021]
前記HC-CDR1がSEQ ID NO:72を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:74を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:76を含み、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:153、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262、またはSEQ ID NO:263を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:155を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:157を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1022]
前記HC-CDR1がSEQ ID NO:79を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:74を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:82を含み、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:159を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:155を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:160を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1023]
SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:251、またはSEQ ID NO:252と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:43、SEQ ID NO:253、またはSEQ ID NO:279と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1024]
SEQ ID NO:29と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:44と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1010（b）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1025]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:56（TDDIN）を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1026]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:62（SNDIN）を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1027]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1028]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1029]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1030]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1031]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:60（LEDTY）を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1032]
（a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:65（VEDSY）を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1033]
（b）の軽鎖可変領域のLC-CDR1が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1034]
（b）の軽鎖可変領域のLC-CDR1が、
Figure 0006971306
を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1035]
前記HC-CDR1がSEQ ID NO:56を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:58を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:60を含み、かつ、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:144を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:146を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1036]
前記HC-CDR1がSEQ ID NO:62を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:63、SEQ ID NO:67、またはSEQ ID NO:69を含み、かつ前記HC-CDR3がSEQ ID NO:65を含み、かつ、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:149を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:144を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:146を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1037]
SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:248、またはSEQ ID NO:249と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:250、またはSEQ ID NO:278と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1038]
SEQ ID NO:25と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:41と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1039]
SEQ ID NO:26と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:42と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1040]
SEQ ID NO:27と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:42と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1010（c）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1041]
（a）SEQ ID NO:91（GKWIE）に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、およびSEQ ID NO:95（SIDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:165（KVSNRFS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（b）
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:112（GSHYFDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:184（YASESIS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（c）SEQ ID NO:125（DYYMN）に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:198（YTSRLHS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（d）SEQ ID NO:132に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:133に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:135に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:203に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:165に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:204に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（e）SEQ ID NO:137に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:138に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:140に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:206に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:207に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:208に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（f）SEQ ID NO:98に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:99に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:101に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:169に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:171に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:173に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（g）SEQ ID NO:103に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:105に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:107に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:176に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（h）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:116に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:118に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:188に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:190に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（i）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:121に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:123に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:191に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1042]
SEQ ID NO:31と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:46と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（a）の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1043]
SEQ ID NO:32と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:47と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（b）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1044]
SEQ ID NO:33と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:48と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（c）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1045]
SEQ ID NO:34と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:49と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（d）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1046]
SEQ ID NO:35と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:50と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（e）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1047]
SEQ ID NO:36と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:51と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（f）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1048]
SEQ ID NO:37と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:52と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（g）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1049]
SEQ ID NO:38と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:53と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（h）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1050]
SEQ ID NO:39と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:54と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、本発明1041（i）の抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1051]
ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、本発明1001、1010、または1041のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1052]
単鎖抗体、scFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、本発明1001、1010、または1041のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1053]
免疫グロブリン定常領域をさらに含む、本発明1001、1010、または1041のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1054]
ヒト化されている、項目1〜23のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1055]
前記抗体が、500pM未満の親和性で前記ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合する、本発明1001、1010、または1041のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1056]
前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、本発明1001、1010、または1041のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1057]
本発明1001〜1056のいずれかの抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする、単離されたDNA配列。
[本発明1058]
本発明1057のDNA配列の1つまたは複数を含む、クローニングベクターまたは発現ベクター。
[本発明1059]
本発明1058のクローニングベクターまたは発現ベクターの1つまたは複数を含む、宿主細胞。
[本発明1060]
本発明1059の宿主細胞を培養する工程、および前記抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、本発明1001〜1056のいずれかの抗体または抗原結合断片を産生するための方法。
[本発明1061]
本発明1001〜1056のいずれかの抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
[本発明1062]
それを必要とする哺乳動物対象に、該哺乳動物における第二経路補体活性化を阻害するのに十分な量の、高親和性MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を含む本発明1061の組成物を投与する工程を含む、哺乳動物における第二経路補体活性化を阻害する方法。
[本発明1063]
前記抗体またはその抗原結合断片が、500pM未満の親和性でMASP-3に結合する、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記抗体が、約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：MASP-3阻害性mAb）のモル比で第二経路を阻害する、本発明1062または1063の方法。
[本発明1065]
前記抗体またはその抗原結合断片が、古典経路活性化に影響することなく、第二経路を選択的に阻害する、本発明1062の方法。
[本発明1066]
前記それを必要とする対象が、発作性夜間血色素尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、ウェット型およびドライ型AMDを含む）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、もしくは移植後TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、ならびに重症筋無力症からなる群より選択される第二経路疾患もしくは第二経路障害に罹患しているか、またはそれを発症する危険にある、本発明1062の方法。

本明細書に記載される発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになるであろう。本明細書において参照される米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物はすべて、それぞれが個々に組み入れられるごとく、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の前記局面および付随する利点の多くは、以下の詳細な説明を添付図面と合わせて参照することによってよりよく理解される場合、さらに容易に理解されよう。
レクチンおよび第二経路の新たな理解を示す。 MASP-1、MASP-3およびMAp44タンパク質ドメインならびにそれらをコードするエキソンを示す、Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002）からの図をYongqing et al., BBA 1824:253 (2012）によって改変した模式図である。 リーダ配列を下線で示したヒトMASP-3アミノ酸配列（SEQ ID NO:2）を示す。 複数の種からの完全長MASP-3タンパク質のアラインメントを示す。 複数の種からのMASP-3タンパク質のSPドメインのアラインメントを示す。 実施例1に記載されるように、感染量2.6×107cfuの髄膜炎菌（N. meningitidis）血清群A Z2491投与後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率をグラフで示すカプラン・マイヤー（Kaplan-Meyer）プロットであり、MASP-2欠損マウスが髄膜炎菌誘発死から保護されることを実証するものである。 実施例1に記載されるように、感染量6×106cfuの髄膜炎菌血清群B株MC58投与後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率をグラフで示すカプラン・マイヤープロットであり、MASP-2欠損マウスが髄膜炎菌誘発死から保護されることを実証するものである。 実施例1に記載されるように、6×106cfuの髄膜炎菌血清群B株MC58を腹腔内感染させた後、様々な時点でMASP-2 KOマウスおよびWTマウスから回収された血液1mL中の髄膜炎菌血清群B株MC58のlog cfu/mLをグラフで示し（両マウス群に関して様々な時点でn=3)、MASP-2 KOマウスにWTマウスと同量の髄膜炎菌血清群B株MC58を感染させたが、MASP-2 KOマウスはWTと比較して菌血症のクリアランスが高められることを実証する。 実施例1に記載されるように、6×106cfuの髄膜炎菌血清群B株MC58を感染させて3、6、12、および24時間後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの平均疾患スコアをグラフで示し、MASP-2欠損マウスが、WTマウスと比べて、感染後6時間、12時間および24時間で大きく低下した疾患スコアを示したことを実証する。 実施例2に記載されるように、感染量4×106cfuの髄膜炎菌血清群B株MC58を投与して3時間後、阻害性MASP-2抗体（1mg/kg)または対照アイソタイプ抗体のいずれかを投与したマウスの生存率をグラフで示すカプラン・マイヤープロットであり、MASP-2抗体が、髄膜炎菌感染した対象を治療し、かつ生存率を改善するのに有効であることを実証するものである。 実施例3に記載されるように、髄膜炎菌血清群B株MC58とのインキュベーション後の様々な時点で記録された、表6に示すヒト血清試料中に様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B株MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。 実施例3に記載されるように、表8に示すヒト血清試料中に様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示し、ヒト20％（v/v)血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3およびMBL依存性であることを示す。 実施例3に記載されるように、表10に示すマウス血清試料中に様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示し、MASP-2-/-ノックアウトマウス（「MASP-2-/-」と呼ぶ）血清が、髄膜炎菌に関して、WTマウス血清よりも高レベルの殺菌活性を有するが、対照的に、MASP-1/3-/-マウス血清は任意の殺菌活性を有しないことを示す。 実施例4に記載されるように、WT、C4-/-、MASP-1/3-/-、B因子-/-およびMASP-2-/-マウス血清中、レクチン経路特異的条件下（1％血漿）、C3活性化の動態をグラフで示す。 実施例4に記載されるように、「従来の」第二経路特異的（AP特異的）条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上の第二経路駆動型（AP駆動型）C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損およびMBL欠損ヒト対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。 実施例4に記載されるように、「従来の」AP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損およびMBL欠損ヒト対象から採取された10％ヒト血清試料中の時間の関数としてグラフで示す。 実施例4に記載されるように、「従来の」AP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路（AP)が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++)、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスから採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。 実施例4に記載されるように、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスから採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。 実施例4に記載されるように、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++）、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）D39コーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスから採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。 実施例4に記載されるように、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++)、0％〜1.25％の範囲の血清濃度を使用して、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上で実施された高希釈血清中のC3b沈着アッセイ法の結果をグラフで示す。 実施例4に記載されるように、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++)、0％〜1.25％の範囲の血清濃度を使用して、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上で実施されたC3b沈着アッセイ法の結果をグラフで示す。 実施例4に記載されるように、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++）、0％〜1.25％の範囲の血清濃度を使用して、肺炎連鎖球菌D39コーティングされたマイクロタイタープレート上で実施されたC3b沈着アッセイ法の結果をグラフで示す。 実施例5に記載されるように、生理学的条件下（すなわち、Ca++の存在下）、MASP-3-/-、熱不活化正常ヒト血清（HI NHS）、MBL-/-、NHS+MASP-2モノクローナル抗体およびNHS対照からの血清中、一定範囲の血清希釈度にわたり、ヒト血清によるマンナンコーティングされたネズミ赤血球の溶血のレベル（上清への溶解マウス赤血球（Crry/C3-/-）のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。 実施例5に記載されるように、生理学的条件下（すなわち、Ca++の存在下）、MASP-3-/-、熱不活化（HI）NHS、MBL-/-、NHS+MASP-2モノクローナル抗体およびNHS対照からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、ヒト血清によるマンナンコーティングされたネズミ赤血球の溶血のレベル（上清への溶解マウス赤血球（Crry/C3-/-）のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。 実施例5に記載されるように、生理学的条件下（すなわち、Ca++の存在下）、3MC（MASP-3-/-）、熱不活化（HI）NHS、MBL-/-、NHS+MASP-2モノクローナル抗体およびNHS対照からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、ヒト血清によるコーティングなしのネズミ赤血球の溶血のレベル（上清への溶解WTマウス赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。 実施例5に記載されるように、生理学的条件下（すなわち、Ca++の存在下）、熱不活化（HI）NHS、MBL-/-、NHS+MASP-2モノクローナル抗体およびNHS対照からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、ヒト血清によるコーティングなしのネズミ赤血球の溶血（上清への溶解マウス赤血球（CD55/59-/-）のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。 実施例6に記載されるように、生理学的条件下（すなわち、Ca++の存在下）、一定範囲の血清濃度にわたり、MASP-1/3-/-マウス血清およびWT対照マウス血清によるマンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血（上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。 図24Aは、実施例7に記載されるように、クローンM3J5に関するMASP-3抗原/抗体結合のFACSヒストグラムである。図24Bは、実施例7に記載されるように、クローンM3M1に関するMASP-3抗原/抗体結合のFACSヒストグラムである。 実施例7に記載されるように、MASP-3抗原に関するクローンM3J5（クローン5）の飽和結合曲線をグラフで示す。 実施例7に記載されるように、ニワトリのDT40 VH配列への、M3J5、M3M1、D14、および1E10のVH領域のアミノ酸配列アライメントであり、点は、DT40配列とのアミノ酸同一性を表し、ダッシュは、アライメントを最大化するために導入された空間を示す。 実施例7に記載されるように、ニワトリのDT40 VL配列への、M3J5、M3M1、D14、および1E10のVL領域のアミノ酸配列アライメントであり、点は、DT40配列とのアミノ酸同一性を表し、ダッシュは、アライメントを最大化するために導入された空間を示す。 実施例7に記載されるように、アッセイキットとともに提供される陽性血清およびアイソタイプ対照抗体と比較したWieslab Complement System Screen, MBL PathwayにおけるmAb1E10の阻害活性を示す棒グラフであり、モノクローナル抗体（mAb）1E10がLEA-2依存性活性化を部分的に阻害するが（MASP-2のMASP-1依存性活性の阻害により）、一方、アイソタイプ対照抗体はそれを阻害しないことを実証するものである。 実施例8に記載されるように、加熱殺菌された黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）上のC3b沈着のフローサイトメトリー分析の結果を提示し、レクチンおよび第二経路を不活化することが知られているEDTAの存在における正常ヒト血清においてはC3b沈着が認められず（パネル1）、Mg++/EGTAで処理された正常ヒト血清においては第二経路駆動型C3b沈着が認められ（パネル2)、パネル3、4および5に示すように、それぞれB因子枯渇血清、D因子枯渇血清およびプロパージン（P因子）枯渇血清においては第二経路駆動型C3b沈着が認められないことを実証する。 実施例8に記載されるように、加熱殺菌された黄色ブドウ球菌におけるC3b沈着のフローサイトメトリー分析の結果を提示し、EDTA処理された正常血清の場合（パネル1）と同様に、Mg++/EGTAの存在における3MC血清中ではAP駆動型C3b沈着は見られず（パネル3）、一方、パネル4および5は、活性完全長rMASP-3（パネル4）および活性rMASP-3（CCP1-CCP2-SP）（パネル5）がいずれも、3MC血清中のAP駆動型C3b沈着を、Mg++/EGTAで処理された正常ヒト血清中に認められるレベルまで回復させることを示すが（パネル2)、不活性rMASP-3（S679A)（パネル6）または野生型rMASP-1（パネル7）のいずれも3MC血清中のAP駆動型C3b沈着を回復させることができないことを実証する。 rMASP-3の存在または非存在における3MC血清中の黄色ブドウ球菌に応答したB因子切断を判定するためのウェスタンブロット分析の結果を示し、EDTAの存在における正常ヒト血清（陰性対照、レーン1）が、レーン2（陽性対照）に示されるMg++/EGTAの存在における正常ヒト血清に対して非常にわずかなB因子切断しか示さず、さらにレーン3に示すように、3MC血清がMg++/EGTAの存在において非常にわずかなB因子切断しか示さないことを実証する。しかし、実施例8に記載されるように、レーン4に示すように、B因子切断は、3MC血清への完全長組換えMASP-3タンパク質の添加およびプレインキュベーションによって回復する。 実施例8に記載されるように、B因子切断が分析されるタンパク質ゲルのクマシー染色を示し、B因子切断がC3、MASP-3およびプロD因子の存在において最適であり（レーン1）、レーン4および5に示すように、C3が存在する限り、MASP-3またはプロD因子はいずれも単独でB因子切断を媒介することができることを実証する。 実施例8に記載されるように、mAbD14（MASP-3に結合）、mAb1A5（陰性対照抗体）およびアイソタイプ対照抗体から得られた黄色ブドウ球菌のC3b染色の平均蛍光強さ（MFI）をrMASP-3の存在における3MC血清中のmAb濃度の関数としてグラフで示し、mAbD14がMASP-3依存性C3b沈着を濃度依存的に阻害することを実証する。 実施例9に記載されるように、プロD因子のみ（レーン1）または不活性完全長組換えMASP-3（S679A；レーン3）またはMASP-1（S646A；レーン4）に比較して、完全長野生型組換えMASP-3（レーン2）およびMASP-1（レーン5）がいずれもプロD因子を完全または部分的に切断して成熟D因子を生成する、プロD因子基質切断のウェスタンブロット分析を示す。 実施例9に記載されるように、MASP-3およびプロD因子のみを含む対照反応（mAbなし、レーン1)と比較し、さらに、MASP-1には結合するがMASP-3には結合しない、DTLacOライブラリーから得られたmAbを含む対照反応（レーン4）と比較した、MASP-3依存性プロD因子切断に対する、mAb D14（レーン2）およびM3M1（レーン3）に結合するMASP-3の阻害活性を示すウェスタンブロットである。 実施例10に記載されるように、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損対象（3MC）、C4欠損対象およびMBL欠損対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示し、患者2および患者3からのMASP-3欠損血清が、高い血清濃度（25％、12.5％、6.25％血清濃度）での残留AP活性を有し、ただし、有意に高いAP50（すなわち、最大C3沈着の50％を達成するために必要な血清の8.2％および12.3％）を有することを実証する。 実施例10に記載されるように、「従来の」AP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損およびMBL欠損ヒト対象から採取された10％ヒト血清試料中の時間の関数としてグラフで示す。 実施例10に記載されるように、3MC患者#2（MASP-3（-/-）、MASP-1（+/+））、3MC患者#3（MASP-3（-/-）、MASP-1（-/-））から採取された血漿および正常なドナー（W）からの血清を用いて、ヒトD因子特異的抗体によってヒトプロD因子（25,040Da）および/または成熟D因子（24,405Da）を検出したウェスタンブロットを示す。 実施例10に記載されるように、3MC患者#2、3MC患者#3から採取された血漿および正常ヒト血清を用いたWeislab古典、レクチンおよび第二経路アッセイ法の結果をグラフで示す。 実施例10に記載されるように、Ca++の非存在下で測定した、2名の正常ヒト対象（NHS）および2名の3MC患者（患者2および患者3）からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率（上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示し、MASP-3欠損が、正常ヒト血清に比べて、マンナンコーティングされた赤血球の補体媒介性溶解の割合を低下させることを実証する。 実施例10に記載されるように、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、ヒト3MC患者2（MASP-3-/-）から採取された血清試料に加えられる組換え完全長MASP-3タンパク質の濃度の関数としてグラフで示し、陰性対照不活性組換えMASP-3（MASP-3A；S679A）に比較して、活性組換えMASP-3タンパク質が、ザイモサンコーティングされたプレート上にAP駆動型C3b沈着を濃度依存的に再構成することを実証する。 実施例10に記載されるように、Ca++の非存在下で測定した、（1）正常ヒト血清（NHS)；（2）3MC患者血清；（3）3MC患者血清＋活性完全長組換えMASP-3（20μg/ml）；および（4）熱不活化ヒト血清（HIS）中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率（上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示し、rMASP-3を含有する3MC血清中のウサギ赤血球の溶解率が組換えMASP-3を有さない3MC血清中の溶解率に比べて有意に増大する（p=0.0006）ことを実証する。 実施例10に記載されるように、活性組換えMASP-3を0〜110μg/ml（BBS/Mg++/EGTA中）の濃度で含有する3MC患者2および3MC患者3からの7％ヒト血清中のウサギ赤血球溶解率をグラフで示し、ウサギ赤血球溶解率が組換えMASP-3の量とともに濃度依存的に増大することを実証する。 実施例10に記載されるように、正常ヒト対象（NHS）、2名の3MC患者（患者2および患者3）、患者3の両親およびMBL欠損対象からの血清に関して、マンナンコーティングされたELISAプレート上のLEA-2駆動型C3b沈着のレベルを、BBS緩衝液中に希釈されたヒト血清の濃度の関数としてグラフで示す。 実施例11に記載されるような、M3-1 Fab（13B1とも呼ばれる）がヒトタンパク質への約0.117nMの見かけ結合親和性（EC50）を示す、ヒトMASP-3を用いて実施された結合実験の代表例をグラフで示す。 実施例11に記載されるような、M3-1 Fab（13B1とも呼ばれる）がマウスタンパク質への約0.214nMの見かけ結合親和性（EC50）を示す、マウスMASP-3を用いて実施された結合実験の代表例をグラフで示す。 実施例11に記載されるような、CFD枯渇ヒト血清中の様々な濃度のmAb M3-1（13B1とも呼ばれる）の存在におけるザイモサン粒子への補体Bb因子沈着のレベル（MFI単位で測定されサイトメトリー検出によって決定された）をグラフで示す。 実施例11に記載されるような、野生型マウスにおけるmAb M3-1（13B1）の単回投与（10mg/kg静脈内）後の様々な時点におけるザイモサン粒子へのC3沈着のレベルをグラフで示す。 実施例12に記載されるような、mAb M3-1（13B1）で処置された（−11、04、−1、および＋6日目に10mg/kg）野生型レシピエントマウス、mAb BB5.1で処置されたマウスまたは溶媒で処置されたマウスにおける14日間にわたるドナーRBC（WTまたはCrry-）の生存率をグラフで示す。 実施例12に記載されるような、mAb M3-1（13B1）の単回投与（−6日目に20mg/kg）で処置された野生型レシピエントマウスまたは溶媒で処置されたマウスにおける16日間にわたるドナーRBC（WTまたはCrry-）の生存率をグラフで示す。 実施例13に記載されるような、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおけるmAb M3-1（13B1）（5mg/kgまたは20mg/kg）で処置されたマウスまたは溶媒で処置されたマウスの14日間の時間経過にわたる臨床スコアをグラフで示す。 実施例13に記載されるような、コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおけるmAb M3-1（13B1）（5mg/kgまたは20mg/kg）で処置されたマウスまたは溶媒で処置されたマウスの14日間の時間経過にわたる関節炎発生率をグラフで示す。 実施例15に記載されるような、高親和性（≦500pM）抗ヒトMASP-3阻害性mAbのVH領域のアミノ酸配列を示す。 実施例15に記載されるような、高親和性（≦500pM）抗ヒトMASP-3阻害性mAbのVL領域のアミノ酸配列を示す。 実施例15に記載されるような、高親和性抗ヒトMASP-3阻害性mAbのVH領域の樹状図である。 実施例15に記載されるような、高親和性抗ヒトMASP-3阻害性mAbのVL領域の樹状図である。 実施例16に記載されるような、代表的な精製した組換え抗ヒトMASP-3阻害抗体がヒトMASP-3タンパク質への500pM未満（たとえば240pM〜23pMの）の見かけ結合活性を示す結合実験の結果をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、代表的な精製した組換え抗ヒトMASP-3阻害抗体がヒトMASP-3タンパク質への500pM未満（たとえば91pM〜58pMの）の見かけ結合活性を示す結合実験の結果をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、代表的な精製した組換え高親和性抗ヒトMASP-3阻害抗体が、MASP-3への結合に選択的であり、かつヒトMASP-1には結合しないことが示される結合実験の結果をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、代表的な精製した組換え高親和性抗ヒトMASP-3阻害抗体が、MASP-3への結合に選択的であり、かつヒトMASP-2には結合しないことが示される結合実験の結果をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、代表的な精製した組換え抗ヒトMASP-3阻害抗体がマウスMASP-3タンパク質への高い結合活性も示す結合実験の結果をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、代表的な高親和性MASP-3抗体が蛍光発生性トリペプチド切断を阻害する能力を測定する実験の結果をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、インビトロアッセイ法において代表的な高親和性MASP-3阻害性mAbがプロD因子からD因子への組換えMASP-3媒介切断を遮断する能力を実証するウェスタンブロットを示す。 実施例16に記載されるような、D因子枯渇ヒト血清中、様々な濃度の高親和性MASP-3 mAb 1F3、1G4、2D7、および4B6の存在におけるザイモサン粒子への補体Bb因子沈着のレベル（MFI単位で測定されフローサイトメトリー検出によって決定された）をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、D因子枯渇ヒト血清中、様々な濃度の高親和性MASP-3 mAb 4D5、10D12、および13B1の存在におけるザイモサン粒子への補体Bb因子沈着のレベル（MFI単位で測定されフローサイトメトリー検出によって決定された）をグラフで示す。 実施例16に記載されるような、様々な濃度の高親和性MASP-3 mAb 1A10、1F3、4B6、4D5、および2F2の存在におけるウサギ赤血球溶解の阻害のレベルをグラフで示す。 実施例16に記載されるような、様々な濃度の高親和性MASP-3 mAb 1B11、1E7、1G4、2D7、および2F5の存在におけるウサギ赤血球溶解の阻害のレベルをグラフで示す。 実施例16に記載されるような、3MC患者血清（患者B）中、活性組換えMASP-3（rMASP-3）、不活性rMASP-3、および活性rMASP-3＋高親和性MASP-3 mAb 4D5の存在におけるプロD因子およびD因子のレベルを分析するウェスタンブロットを示す。 実施例17に記載されるような、野生型マウスにおける高親和性MASP-3 mAb M3-1（13B1、10mg/kg）または10D12（10mg/kg）の単回投与後の様々な時点におけるザイモサン粒子へのC3／C3b／iC3b沈着のレベルをグラフで示す。 実施例17に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb 10D12（10mg/kg）で処置されたマウスまたは溶媒対照処置マウスにおけるB因子のBa因子断片の状態を分析するウェスタンブロットを示す。 実施例17に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb 10D12（10mg/kgまたは25mg/kg）で処置されたマウスからの20％血清による溶血の阻害のレベルをグラフで示す。 実施例18に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb 4D5とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断する高親和性MASP-3 mAbを同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。 実施例18に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb 10D12とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断する高親和性MASP-3 mAbを同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。 実施例18に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb 13B1とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断する高親和性MASP-3 mAbを同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。 実施例18に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb 1F3とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断する高親和性MASP-3 mAbを同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。 実施例18に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb 1G4とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断する高親和性MASP-3 mAbを同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。 実施例18に記載されるような、Pepscan分析によって決定された、高親和性MASP-3 mAbによるヒトMASP-3上の接触領域を示す模式図を提供する。 実施例18に記載されるような、MASP-3のアミノ酸残基498〜509（SEQ ID NO:9）、アミノ酸残基544〜558（SEQ ID NO:11）、アミノ酸残基639〜649（SEQ ID NO:13）およびアミノ酸残基704〜713（SEQ ID NO:14）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 1F3、4D5、および1A10との間の接触領域を示す。 実施例18に記載されるような、MASP-3のアミノ酸残基498〜509（SEQ ID NO:9）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 10D12との間の接触領域を示す。 実施例18に記載されるような、MASP-3のアミノ酸残基494〜508（SEQ ID NO:10）およびアミノ酸残基626〜638（SEQ ID NO:12）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 13B1との間の接触領域を示す。 実施例18に記載されるような、MASP-3のアミノ酸残基435〜447（SEQ ID NO:16）、アミノ酸残基454〜464（SEQ ID NO:17）、アミノ酸残基583〜589（SEQ ID NO:21）、およびアミノ酸残基614〜623（SEQ ID NO:22）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 1B11との間の接触領域を示す。 実施例18に記載されるような、MASP-3のアミノ酸残基454〜464（SEQ ID NO:17）、アミノ酸残基514〜523（SEQ ID NO:19）、およびアミノ酸残基667〜678（SEQ ID NO:23）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 1E7、1G4、および2D7との間の接触領域を示す。 実施例18に記載されるような、MASP-3のアミノ酸残基454〜464（SEQ ID NO:17）、アミノ酸残基479〜493（SEQ ID NO:18）、アミノ酸残基562〜571（SEQ ID NO:20）、およびアミノ酸残基667〜678（SEQ ID NO:23）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 15D9および2F5との間の接触領域を示す。 実施例20に記載されるような、高親和性MASP-3阻害性mAb 13B1（10mg/kg）、B因子mAb 1379（30mg/kg）またはアイソタイプ対照mAb（10mg/kg）のいずれかで処置されたマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルの結果をグラフで示す。 実施例21に記載されるような、高親和性MASP-3 mAb h13B1Xによる処置ののち経時的に3匹のカニクイザルの群から得られた血清試料中、血清試料中にスパイクされた抗D因子抗体の存在または非存在において、ザイモサン粒子の表面上の補体Bb因子を検出するフローサイトメトリーアッセイ法において平均MFIによって測定されたAPC活性をグラフで示す。 実施例21に記載されるような、高親和性MASP-3阻害性mAb h4D5X、h10D12Xまたはh13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与で処置されたカニクイザルの群（各群3匹）から得られた血清試料中、ザイモサンへのBb沈着によって測定されたAPC活性をグラフで示す。 図71Aは、実施例21に記載されるような、mAb h4D5X、h10D12X、およびh13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与による処置ののち経時的にカニクイザルの群（各群3匹）から得られた血清試料中、液相Baによって測定されたAPC活性をグラフで示す。図71Bは、実施例21に記載されるような、mAb h4D5X、h10D12X、およびh13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与による処置ののち経時的にカニクイザルの群（各群3匹）から得られた血清試料中、液相Bbによって測定されたAPC活性をグラフで示す。図71Cは、実施例21に記載されるような、mAb h4D5X、h10D12X、およびh13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与による処置ののち経時的にカニクイザルの群（各群3匹）から得られた血清試料中、液相C3aによって測定されたAPC活性をグラフで示す。 図72Aは、実施例21に記載されるような、完全なAPC阻害の時点で液相Baによって測定された標的（MASP-3）と高親和性MASP-3阻害抗体h4D5Xとのモル比をグラフで示す。図72Bは、実施例21に記載されるような、完全なAPC阻害の時点で液相Baによって測定された標的（MASP-3）と高親和性MASP-3阻害抗体h10D12Xとのモル比をグラフで示す。図72Cは、実施例21に記載されるような、完全なAPC阻害の時点で液相Baによって測定された標的（MASP-3）と高親和性MASP-3阻害抗体h13B1Xとのモル比をグラフで示す。 実施例21に記載されるような、mAb h13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与による処置ののち経時的に（時間単位）カニクイザルから得られた血清中のプロD因子およびD因子のレベルを分析するウェスタンブロットを示す。
配列表の説明
SEQ ID NO:1 ヒトMASP-3 cDNA
SEQ ID NO:2 ヒトMASP-3タンパク質（リーダあり）
SEQ ID NO:3 マウスMASP-3タンパク質（リーダあり）
SEQ ID NO:4 ラットMASP-3タンパク質
SEQ ID NO:5 ニワトリMASP-3タンパク質
SEQ ID NO:6 ウサギMASP-3タンパク質
SEQ ID NO:7 カニクイザルMASP-3タンパク質
SEQ ID NO:8 ヒトMASP-1タンパク質（リーダあり）
ヒトMASP-3 SPドメインペプチド断片：
SEQ ID NO:9（ヒトMASP-3のアミノ酸498〜509、リーダあり）
SEQ ID NO:10（ヒトMASP-3のアミノ酸494〜508、リーダあり）
SEQ ID NO:11（ヒトMASP-3のアミノ酸544〜558、リーダあり）
SEQ ID NO:12（ヒトMASP-3のアミノ酸626〜638、リーダあり）
SEQ ID NO:13（ヒトMASP-3のアミノ酸639〜649、リーダあり）
SEQ ID NO:14（ヒトMASP-3のアミノ酸704〜713、リーダあり）
SEQ ID NO:15（ヒトMASP-3のアミノ酸498〜508、リーダあり）
SEQ ID NO:16（ヒトMASP-3のアミノ酸435〜447、リーダあり）
SEQ ID NO:17（ヒトMASP-3のアミノ酸454〜464、リーダあり）
SEQ ID NO:18（ヒトMASP-3のアミノ酸479〜493、リーダあり）
SEQ ID NO:19（ヒトMASP-3のアミノ酸514〜523、リーダあり）
SEQ ID NO:20（ヒトMASP-3のアミノ酸562〜571、リーダあり）
SEQ ID NO:21（ヒトMASP-3のアミノ酸583〜589、リーダあり）
SEQ ID NO:22（ヒトMASP-3のアミノ酸614〜623、リーダあり）
SEQ ID NO:23（ヒトMASP-3のアミノ酸667〜678、リーダあり）
SEQ ID NO:24〜39：重鎖可変領域 - マウス親
SEQ ID NO:24 4D5_VH
SEQ ID NO:25 1F3_VH
SEQ ID NO:26 4B6_VH
SEQ ID NO:27 1A10_VH
SEQ ID NO:28 10D12_VH
SEQ ID NO:29 35C1_VH
SEQ ID NO:30 13B1_VH
SEQ ID NO:31 1G4_VH
SEQ ID NO:32 1E7_VH
SEQ ID NO:33 2D7_VH
SEQ ID NO:34 49C11_VH
SEQ ID NO:35 15D9_VH
SEQ ID NO:36 2F5_VH
SEQ ID NO:37 1B11_VH
SEQ ID NO:38 2F2_VH
SEQ ID NO:39 11B6_VH
SEQ ID NO:40〜54：軽鎖可変領域 - マウス親
SEQ ID NO:40 4D5_VL
SEQ ID NO:41 1F3_VL
SEQ ID NO:42 4B6/1A10_VL
SEQ ID NO:43 10D12_VL
SEQ ID NO:44 35C1_VL
SEQ ID NO:45 13B1_VL
SEQ ID NO:46 1G4_VL
SEQ ID NO:47 1E7_VL
SEQ ID NO:48 2D7_VL
SEQ ID NO:49 49C11_VL
SEQ ID NO:50 15D9_VL
SEQ ID NO:51 2F5_VL
SEQ ID NO:52 1B11_VL
SEQ ID NO:53 2F2_VL
SEQ ID NO:54 11B6_VL
SEQ ID NO:55〜140：マウス親MASP-3 mAb由来の重鎖フレームワーク領域（FR）および相補性決定領域（CDR）
SEQ ID NO:141〜208：マウス親MASP-3 mAb由来の軽鎖FRおよびCDR
SEQ ID NO:209〜216：CDRコンセンサス配列
SEQ ID NO:217〜232：重鎖可変領域（マウス親）をコードするDNA
SEQ ID NO:233〜247：軽鎖可変領域（マウス親）をコードするDNA
SEQ ID NO:248：ヒト化4D5_VH-14（h4D5_VH-14）重鎖可変領域
SEQ ID NO:249：ヒト化4D5_VH-19（h4D5_VH-19）重鎖可変領域
SEQ ID NO:250：ヒト化4D5_VL-1（h4D5_VL-1）軽鎖可変領域
SEQ ID NO:251：ヒト化10D12_VH-45（h10D12_VH-45）重鎖可変領域
SEQ ID NO:252：ヒト化10D12_VH-49（h10D12_VH-49）重鎖可変領域
SEQ ID NO:253：ヒト化10D12_VL-21（h10D12-VL-21）軽鎖可変領域
SEQ ID NO:254：ヒト化13B1_VH-9（h13B1-VH-9）重鎖可変領域
SEQ ID NO:255：ヒト化13B1_VH-10（h13B1-VH-10）重鎖可変領域
SEQ ID NO:256：ヒト化13B1-VL-1（h13B1-VL-1）軽鎖可変領域
SEQ ID NO:257：4D5および13B1 LC-CDR1-NQ
SEQ ID NO:258：4D5および13B1 LC-CDR1-NA
SEQ ID NO:259：4D5および13B1 LC-CDR1-ST
SEQ ID NO:260：4D5、13B1親、およびバリアントのコンセンサスLC-CDR1
SEQ ID NO:261：10D12 LC-CDR1-DE
SEQ ID NO:262：10D12 LC-CDR1-DA
SEQ ID NO:263：10D12 LC-CDR1-GA
SEQ ID NO:264〜277：ヒト化4D5、10D12、および13B1のHC FRおよびCDR
SEQ ID NO:278：h4D5_VL-1-NA
SEQ ID NO:279：h10D12_VL-21-GA
SEQ ID NO:280：h13B1_VL-1-NA
SEQ ID NO:281〜287 ヒト化4D5、10D12、および13B1のLC FRおよびCDR
SEQ ID NO:288〜293：ヒト化4D5、10D12、13B1重鎖可変領域およびバリアントをコードするDNA
SEQ ID NO:294〜299：ヒト化4D5、10D12、13B1軽鎖可変領域およびバリアントをコードするDNA
SEQ ID NO:300：親DTLacO重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:301：MASP-3特異的クローンM3J5重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:302：MASP-3特異的クローンM3M1重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:303：親DTLacO軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:304：MASP-3特異性クローンM3J5軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:305：MASP-3特異性クローンM3M1軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:306：MASP-3クローンD14重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:307：MASP-3クローンD14軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:308：MASP-1クローン1E10重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:309：MASP-1クローン1E10軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
SEQ ID NO:310：ヒトIgG4定常領域
SEQ ID NO:311：ヒトIgG4定常領域、S228P変異あり
SEQ ID NO:312：ヒトIgG4定常領域、S228P変異_Xあり
SEQ ID NO:313：ヒトIgK定常領域
詳細な説明
I. 定義
本明細書において特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての用語は、本発明の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明するために明細書および特許請求の範囲において使用される用語を明確にするために、以下の定義を提供する。
本明細書で使用するレクチン経路エフェクターアーム1（「LEA-1」）は、MASP-3によるB因子およびD因子のレクチン依存性活性化を指す。
本明細書で使用するレクチン経路エフェクターアーム2（「LEA-2」）は、MASP-2依存性補体活性化を指す。
本明細書で使用する「MASP-3依存性補体活性化」という用語は、2つの部分：（i）Ca++の存在において起こり、一般にC3bBからC3bBbへの転換およびプロD因子からD因子への転換を生じさせる、LEA-1媒介性補体活性化に包含されるB因子およびD因子のレクチンMASP-3依存性活性化；および（ii）Ca++の非存在において起こることができ、一般に、C3bBからC3bBbへの転換およびプロD因子からD因子への転換を生じさせる、B因子およびD因子のレクチン非依存性転換を含む。LEA-1媒介性補体活性化ならびにB因子およびD因子のレクチン非依存性転換は、オプソニン化および/または溶解を生じさせることがわかった。任意の特定の理論によって拘束されることを望まないが、複数のC3b分子が関連し、近接して結合する場合のみ、C3bBb C3コンバターゼがその基質特異性を変化させ、かつC5を、C3bBb(C3b)nと呼ばれる第二経路C5コンバターゼとして切断すると考えられる。
本明細書ではLEA-2媒介性補体活性化とも呼ばれる、本明細書で使用する「MASP-2依存性補体活性化」という用語は、Ca++の存在において起こり、レクチン経路C3コンバターゼC4b2aの形成を生じさせ、その後、C3切断産物C3bが蓄積すると、オプソニン化および/または溶解を生じさせることがわかっているC5コンバターゼC4b2a(C3b)nを生じさせる、MASP-2レクチン依存性活性化を含む。
「従来の第二経路」とも呼ばれる、本明細書で使用する「第二経路の従来の理解」という用語は、従来は補体因子C3からのC3bの自然発生的タンパク質分解生成から生じると考えられていた、本明細書に記載される発見以前の第二経路、すなわち、例えば真菌および酵母細胞壁からのザイモサン、グラム陰性外膜からのリポ多糖（LPS)およびウサギ赤血球ならびに多くの純粋な多糖、ウイルス、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物および損傷した細胞によって誘発される補体活性化を指す。本明細書で使用する、「第二経路」とも呼ばれる「従来の第二経路」の活性化は、Mg++/EGTA緩衝液中で（すなわち、Ca++の非存在において）測定される。
本明細書で使用される「レクチン経路」という用語は、マンナン結合レクチン（MBL)、CL-11およびフィコリン（H-フィコリン、M-フィコリンまたはL-フィコリン）を含む血清および非血清糖質結合タンパク質の特異的結合を介して起こる補体活性化を指す。本明細書に記載されるように、本発明者らは、レクチン経路が2つのエフェクターアーム、すなわち、今やMASP-3依存性であることが知られているレクチン経路エフェクターアーム1（LEA-1）およびMASP-2依存性であるレクチン経路エフェクターアーム2（LEA-2）によって駆動されることを見いだした。本明細書で使用されるレクチン経路の活性化は、Ca++含有緩衝液を使用して評価される。
本明細書で使用する「古典経路」という用語は、外来粒子に結合している抗体によって誘発され、かつ認識分子C1qの結合を必要とする補体活性化を指す。
本明細書で使用する「HTRA-1」という用語は、セリンペプチダーゼ高温要件セリンプロテアーゼA1を指す。
本明細書において使用される「MASP-3阻害物質」という用語は、MASP-3抗体およびそのMASP-3結合断片、天然および合成ペプチド、競合基質、小分子、発現阻害物質、ならびに単離された天然阻害物質を含む、MASP-3に結合するまたはMASP-3と直接相互作用する作用物質を含む、MASP-3依存性補体活性化を直接阻害する任意の作用物質を指し、かつこの用語はまた、レクチン経路中の別の認識分子（たとえばMBL、CL-11、H-フィコリン、M-フィコリンまたはL-フィコリン）との結合に関してMASP-3と競合するペプチドを包含する。1つの態様において、MASP-3阻害物質はMASP-3に特異的であり、かつMASP-1またはMASP-2には結合しない。MASP-3を直接阻害する阻害物質は、直接的MASP-3阻害物質（たとえばMASP-3抗体）と呼ぶことができ、一方で、MASP-3を間接的に阻害する阻害物質は、間接的MASP-3阻害物質（たとえば、MASP-3活性化を阻害するMASP-1抗体）と呼ぶことができる。直接的MASP-3阻害物質の例が、MASP-3特異的阻害物質、たとえば、補体系中の他の成分に対する場合よりも少なくとも10倍大きい結合親和性でヒトMASP-3（SEQ ID NO:2）の一部分に特異的に結合するMASP-3阻害物質である。直接的MASP-3阻害物質の別の例が、500pM未満の親和性でヒトMASP-3（SEQ ID NO:2）のセリンプロテアーゼドメインに特異的に結合し、かつヒトMASP-1（SEQ ID NO:8）には結合しない高親和性MASP-3抗体である。1つの態様において、MASP-3阻害物質はMASP-3活性を間接的に阻害する、たとえば、MASP-1媒介MASP-3活性化の阻害物質を含む、MASP-3活性化の阻害物質（たとえば、MASP-1抗体またはそのMASP-1結合断片、天然および合成ペプチド、小分子、発現阻害物質ならびに単離された天然阻害物質、かつまた、MASP-3への結合に関してMASP-1と競合するペプチドを包含する）。好ましい態様において、MASP-3阻害物質、たとえば抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合ペプチドはD因子のMASP-3媒介成熟を阻害する。別の態様において、MASP-3阻害物質はB因子のMASP-3媒介活性化を阻害する。本発明の方法において有用なMASP-3阻害物質は、MASP-3依存性補体活性化を10％より多く、たとえば20％より多く、50％より多く、または90％より多く低下させ得る。1つの態様において、MASP-3阻害物質はMASP-3依存性補体活性化を90％より多く低下させる（すなわち、わずか10％またはそれ未満のMASP-3補体活性化しか生じさせない）。MASP-3阻害は、LEA-1関連の溶解およびオプソニン化ならびにB因子およびD因子関連の溶解およびオプソニン化のレクチン非依存性転換を完全または部分的に遮断すると予想される。
1つの態様において、高親和性MASP-3阻害抗体は、500pM未満（たとえば250pM未満、100pM未満、50pM未満または10pM未満）の親和性でMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合し、かつ哺乳動物対象の血液中、補体活性化の第二経路を少なくとも50％（たとえば少なくとも60％または少なくとも70％または少なくとも80％または少なくとも90％または少なくとも95％またはより多く）阻害する。
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域（本明細書においては可変ドメインとも呼ばれる）中に位置する少なくとも1つのエピトープ認識部位を通して標的、たとえばポリペプチドに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。
本明細書において使用される「抗体」という用語は、標的ポリペプチド、たとえばMASP-1、MASP-2、もしくはMASP-3ポリペプチドまたはそれらの部分に特異的に結合する、任意の抗体産生性哺乳動物（たとえばマウス、ラット、ウサギ、およびヒトを含む霊長類）から得られるか、またはハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、もしくはトランスジェニック動物（または抗体もしくは抗体断片を産生する他の方法）から得られる、抗体およびその抗体断片を包含する。「抗体」という用語は、抗体の供給源またはそれが作製されるやり方（たとえば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物、ペプチド合成などによる）に関して限定されることを意図しない。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナルおよび組換え抗体；汎特異性、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）；ヒト化抗体；ネズミ抗体；キメラ、マウスヒト、マウス霊長類、霊長類ヒトモノクローナル抗体；ならびに抗イディオタイプ抗体を含み、かつ任意のインタクトな抗体またはその断片であり得る。本明細書において使用される「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、それらの断片、たとえば単一可変領域抗体（dAb）または他の公知の抗体断片、たとえばFab、Fab'、F(ab')2、Fvなど、単鎖（ScFv）、その合成バリアント、天然に存在するバリアント、求められる特異性の抗原結合断片を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体および求められる特異性の抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変形態も包含する。
「モノクローナル抗体」とは、モノクローナル抗体がエピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然および非天然）で構成されている均一な抗体集団をいう。モノクローナル抗体は、標的抗原に関して高特異性である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（たとえばFab、Fab'、F(ab')2、Fv）、単鎖（ScFv）、それらのバリアント、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体ならびに求められる特異性の抗原結合断片（エピトープ認識部位）およびエピトープに結合する能力を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変形態も包含する。抗体の供給源またはそれが作製されるやり方（たとえば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定されることを意図しない。この用語は、先に「抗体」の定義の下で記載された完全な免疫グロブリンおよび断片などを含む。
本明細書において使用される「抗体断片」という用語とは、完全長抗体、たとえばMASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体に由来または関連する、一般にそれらの抗原結合または可変領域を含む部分をいう。抗体断片の代表例は、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、リニア抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
特定の態様において、本明細書に記載される抗体およびその抗原結合断片は、CDRへの支持を提供し、かつCDRの互いに対する空間的関係を定める、重鎖および軽鎖フレームワーク領域（FR）セットの間にそれぞれ挿入された、重鎖（VH）および軽鎖（VL）相補性決定領域（「CDR」）セットを含む。本明細書において使用される「CDRセット」という用語とは、重鎖または軽鎖V領域の3つの超可変領域をいう。これらの領域は、重鎖または軽鎖のN末端から順に、それぞれ「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」と指定される。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖V領域それぞれからのCDRセットを含む6つのCDRを含む。
本明細書において使用される「FRセット」という用語とは、重鎖および軽鎖V領域のCDRセットのCDRをフレーミングする側面に位置する4つのアミノ酸配列をいう。いくつかのFR残基は、結合した抗原と接触し得るが；しかし、FRは主に、V領域を抗原結合部位、特にCDRに隣接するFR残基へとフォールディングすることを担う。FR内で、特定のアミノ酸残基および特定の構造的特徴は非常に高度に保存される。これに関して、すべてのV領域配列は、約90個のアミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含有する。V領域が結合部位へとフォールディングされると、CDRは、抗原結合面を形成する突出するループモチーフとして表示される。一般に、正確なCDRアミノ酸配列にかかわらず、特定の「規範的」構造へのCDRループの折りたたみ形状に影響するFRの保存された構造領域があると認識されている。
免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services, 1987および今やインターネット上で利用可能なその最新版（immuno.bme.nwu.edu.）を参照することによって決定され得る。
本明細書において使用される「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Fvポリペプチドはさらに、scFvが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカをVHおよびVLドメインの間に含む。
本明細書において使用される「キメラ抗体」とは、非ヒト種（たとえばげっ歯類）抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、一方で、抗体分子の残りの部分がヒト抗体に由来する、組換えタンパク質である。いくつかの態様において、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Fc部分に、機能的に連結された、または他のやり方で融合したMASP-3阻害抗体の抗原結合断片で構成されている。いくつかの態様において、異種Fcドメインは、IgA（サブクラスIgA1およびIgA2を含む）、IgD、IgE、IgG（サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む）、およびIgMを含む、親抗体とは異なるIgクラスに由来し得る。
本明細書において使用される「ヒト化抗体」とは、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有し、かつ分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく、一般に組換え技術を使用して調製されるキメラ分子である。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変領域または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植されたCDRのみのいずれかを含み得る。エピトープ結合部位は、野生型であってもまたは1つもしくは複数のアミノ酸置換によって改変されていてもよい。別の手法は、ヒト由来の定常領域を提供することだけでなく、可変領域を改変して、それらを可能な限りヒト形態に近く再形成することも重視する。いくつかの態様において、ヒト化抗体はすべてのCDR配列を保存する（たとえば、ヒト化マウス抗体は、マウス抗体からの6つCDRすべてを含む）。他の態様において、ヒト化抗体は、元の抗体に対して変更された1つまたは複数のCDR（1、2、3、4、5、6つ）を有し、これらはまた、元の抗体からの1つまたは複数のCDRに「由来する」1つまたは複数のCDRとも呼ばれる。
抗体が他の物質に結合するよりも大きい親和性および／または結合活性で抗体が標的に結合する場合、抗体はその標的に「特異的に結合する」。1つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合する。1つの態様において、抗体またはその抗原結合断片は、表4に記載される、表28に記載される、または図62に示される、エピトープの1つまたは複数に特異的に結合する。
本明細書で使用する「マンナン結合レクチン」(「MBL」)という用語は、マンナン結合タンパク質(「MBP」)と同義である。
本明細書で使用する「膜侵襲複合体」(「MAC」)は、膜に入り込み、膜を破壊する、5種類の終末補体成分の複合体(C5bとC6、C7、C8、およびC9との組み合わせ)(C5b-9とも呼ばれる)を指す。
本明細書で使用する「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、およびげっ歯類を含むが、それに限定されるわけではない、全ての哺乳動物を含む。
本明細書で使用するアミノ酸残基の略語は以下の通りである：アラニン(Ala；A)、アスパラギン(Asn；N)、アスパラギン酸(Asp；D)、アルギニン(Arg；R)、システイン(Cys；C)、グルタミン酸(Glu；E)、グルタミン(Gln；Q)、グリシン(Gly；G)、ヒスチジン(His；H)、イソロイシン(Ile；I)、ロイシン(Leu；L)、リジン(Lys；K)、メチオニン(Met；M)、フェニルアラニン(Phe；F)、プロリン(Pro；P)、セリン(Ser；S)、スレオニン(Thr；T)、トリプトファン(Trp；W)、チロシン(Tyr；Y)、およびバリン(Val；V)。
最も広い意味では、天然アミノ酸は、それぞれのアミノ酸の側鎖の化学特性に基づいてグループに分けることができる。「疎水性」アミノ酸とは、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、CysまたはProを意味する。「親水性」アミノ酸とは、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg、またはHisを意味する。このアミノ酸グループは、以下のように、さらにサブグループに分けることができる。「無電荷親水性」アミノ酸とは、Ser、Thr、Asn、またはGlnを意味する。「酸性」アミノ酸とはGluまたはAspを意味する。「塩基性」アミノ酸とはLys、Arg、またはHisを意味する。
本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下のグループ：(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびスレオニン、(4)アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5)グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6)リジン、アルギニンおよびヒスチジンのそれぞれの中でのアミノ酸間の置換によって例示される。
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはその模倣物のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然のヌクレオチド、糖、およびヌクレオシド間(バックボーン)共有結合からなるオリゴヌクレオ塩基(oligonucleobase)、ならびに非天然改変を有するオリゴヌクレオチドもカバーする。
本明細書で使用する「エピトープ」は、抗体が結合する、タンパク質(例えば、ヒトMASP-3タンパク質)上の部位を指す。「重複エピトープ」は、直鎖エピトープおよび非直鎖エピトープを含む、少なくとも1個(例えば、2個、3個、4個、5個、または6個)の共通アミノ酸残基を含む。
本明細書で使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義に用いられ、長さにも翻訳後修飾に関係なく任意のペプチド結合アミノ酸鎖を意味する。本明細書に記載のMASP-3タンパク質は野生型タンパク質を含有してもよく、野生型タンパク質でもよく、50個以下(例えば、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下、6個以下、7個以下、8個以下、9個以下、10個以下、12個以下、15個以下、20個以下、25個以下、30個以下、35個以下、40個以下、または50個以下)の保存的アミノ酸置換を有するバリアントでもよい。保存的置換は、典型的には、以下のグループ；グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびスレオニン；リジン、ヒスチジン、およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンの中での置換を含む。
いくつかの態様において、ヒトMASP-3タンパク質は、SEQ ID NO：2に記載されたアミノ酸配列を有するヒトMASP-3タンパク質と70（例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100）％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有することができる。
いくつかの態様において、ペプチド断片は、長さが少なくとも6個（例えば、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、もしくは600個またはそれ以上)のアミノ酸残基（例えば、SEQ ID NO：2の少なくとも6個の連続したアミノ酸残基)であることができる。いくつかの態様において、ヒトMASP-3タンパク質の抗原性ペプチド断片は、長さが500個未満（例えば、450個未満、400個未満、350個未満、325個未満、300個未満、275個未満、250個未満、225個未満、200個未満、190個未満、180個未満、170個未満、160個未満、150個未満、140個未満、130個未満、120個未満、110個未満、100個未満、95個未満、90個未満、85個未満、80個未満、75個未満、70個未満、65個未満、60個未満、55個未満、50個未満、49個未満、48個未満、47個未満、46個未満、45個未満、44個未満、43個未満、42個未満、41個未満、40個未満、39個未満、38個未満、37個未満、36個未満、35個未満、34個未満、33個未満、32個未満、31個未満、30個未満、29個未満、28個未満、27個未満、26個未満、25個未満、24個未満、23個未満、22個未満、21個未満、20個未満、19個未満、18個未満、17個未満、16個未満、15個未満、14個未満、13個未満、12個未満、11個未満、10個未満、9個未満、8個未満、7個未満または6個未満）のアミノ酸残基（例えば、SEQ ID NO：2の500個未満の連続したアミノ酸残基）である。
いくつかの態様においては、MASP -3に結合する抗体を生成することに関して、ペプチド断片は抗原性であり、完全長タンパク質が哺乳動物において抗原応答を誘発する能力の少なくとも10％（例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または100％もしくはそれ以上）を保持する（下記の「抗体を製造するための方法」を参照されたい）。
アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最大の配列同一性％を達成するために配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸と同一である候補配列中のアミノ酸の割合と定義される。配列同一性％を決定するためのアライメントは、当技術分野における技術の範囲内の様々なやり方で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用して達成することができる。比較される配列の完全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは公知の方法によって決定することができる。
代表的な態様において、ヒトMASP-3タンパク質(SEQ ID NO:2)は、SEQ ID NO:1と表記されるcDNA配列によってコードされる。当業者は、SEQ ID NO:1に開示されたcDNA配列が、ヒトMASP-3の単一アレルを表し、アレル変異および選択的スプライシングが起こることが予想されることを認識するであろう。SEQ ID NO:1に示されるヌクレオチド配列のアレルバリアントは、沈黙変異を含むもの、および変異がアミノ酸配列変化を生じさせるもの含め、本発明の範囲内である。MASP-3配列のアレルバリアントは、標準的手法にしたがって異なる個体からのcDNAまたはゲノムライブラリーを探索することによってクローニングすることもできるし、そのような情報を含むデータベースの相同性比較サーチ（たとえばBLASTサーチ)によって同定してもよい。
本明細書において使用される「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNAに組み込まれていない核酸分子（たとえばポリヌクレオチド）である。たとえば、細胞のゲノムDNAから切り離された、成長因子をコードするDNA分子が、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例が、生物のゲノムに組み込まれていない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
本明細書において使用される「核酸分子構築物」とは、自然界には存在しない配置に組み合わされ、かつ並置された核酸のセグメントを含むように人的介入によって改変されている一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
本明細書において使用される「発現ベクター」とは、宿主細胞中に発現する遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネータを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結」しているといわれる。同様に、調節因子がコアプロモーターの活性を調整する場合、調節因子およびコアプロモーターは機能的に連結している。
本明細書において使用される「約」という用語は、提供される特定の値がある程度は変動し得ること、たとえば、±10％、好ましくは±5％、もっとも好ましくは±2％の範囲の変動が所与の範囲に含まれることを意味する。範囲が述べられる場合、終点。
範囲が述べられる場合、そうでないことが述べられない限り、またはそうでないことが文脈から明白でない限り、終点はその範囲に含まれる。
本明細書において使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、そうでないことを文脈が明らかに指示しない限り、複数の局面を含む。したがって、たとえば、「賦形剤」への言及は複数のそのような賦形剤および当業者には公知のその等価物を含み、「作用物質」への言及は1つの作用物質および2つまたはそれ以上の作用物質を含み、「抗体」への言及は複数のそのような抗体を含み、「フレームワーク領域」への言及は1つまたは複数のフレームワーク領域および当業者には公知のその等価物を含む、などである。
そうでないことが明白に述べられない限り、本明細書における各態様は、必要な変更を加えながら他の各態様に適用される。本明細書に記載される任意の態様は、本発明の任意の方法、キット、試薬または組成物に関して実現されることができ、本発明の任意の方法、キット、試薬または組成物は、本明細書に記載される任意の態様に関して実現されることができることが考えられよう。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用されることができる。
II. レクチン経路：新たな理解
i. 概略；レクチン経路は定義し直された
本明細書に記載されるように、本発明者らは、補体のレクチン経路が、いずれも糖質認識成分（MBL、CL-11、およびフィコリン）で形成されたレクチン経路活性化複合体によって駆動される、補体を活性化するための2つのエフェクターアーム：（i）「レクチン経路エフェクターアーム1」または「LEA-1」と呼ばれる、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3によって形成されたエフェクターアーム；ならびに（ii）本明細書では「レクチン経路エフェクターアーム2」または「LEA-2」と呼ばれるMASP-2駆動型活性化エフェクターアームを有するという驚くべき発見を達成した。LEA-1およびLEA-2はいずれも溶解および/またはオプソニン化を実施することができる。
また、いずれもCa++の非存在において起こることができる、MASP-3によるレクチン非依存性B因子転換ならびにHTRA-1、MASP-1およびMASP-3によるレクチン非依存性D因子転換が一般に、C3bBからC3bBbへの転換およびプロD因子からD因子への転換を生じさせるということがわかった。したがって、MASP-3を阻害することは、LEA-1ならびにレクチン非依存性B因子および/またはD因子活性化の両方を阻害することができ、それが、溶解および/またはオプソニン化の阻害を生じさせることができる。
図1は、補体活性化の経路のこの新たな理解を示す。図1に示すように、LEA-1はレクチン結合MASP-3によって駆動され、このレクチン結合MASP-3は、D因子の酵素前駆体をその活性形態へと活性化すること、および/またはC3b-もしくはC3b(H2O)結合B因子を切断して、C3bB酵素前駆体複合体をその酵素的に活性な形態C3bBbへと転換することができる。MASP-3によって生成される活性化D因子はまた、C3bBまたはC3b(H2O)酵素前駆体複合体をその酵素的に活性な形態へと転換することができる。MASP-1は迅速に自己活性化することができるが、一方、MASP-3はそれができない。多くの場合、MASP-1はMASP-3のアクチベーターである。
多くの例において、レクチン（すなわち、MBL、CL-11、またはフィコリン）は活性を細胞面に向けることができるが、図1はまた、B因子活性化および/またはD因子成熟におけるMASP-3、MASP-1およびHTRA-1のレクチン非依存性機能を概説する。LEA-1中のMASP-3のレクチン関連形態と同様に、MASP-3のレクチン非依存形態は、C3bBまたはC3b(H20)のC3bBbへの転換（図29および30も参照されたい）およびプロD因子のD因子への転換（図32を参照されたい）を媒介することができる。MASP-1（図32も参照されたい）および非MASP関連タンパク質HTRA-1はまた、レクチン成分を必要としないやり方でD因子を活性化することもできる（Stanton et al., Evidence That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration, presented at The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2011 conference on May 4, 2011）。
したがって、MASP-1（LEA-1およびレクチン非依存形態を経て）、MASP-3（LEA-1およびレクチン非依存形態を経て）およびHTRA-1（レクチン非依存性のみ）は、MASP-3-D因子-B因子軸の沿う1つまたは複数の地点における直接的または間接的のいずれかの活性化が可能である。その際、それらは、C3bBb、すなわち第二経路のC3コンバターゼを生成し、微生物表面におけるC3bの産生および沈着を刺激する。C3b沈着はオプソニン化において重要な役割を果たし、マクロファージのような宿主食細胞による破壊に備えて微生物の表面を標識する。本明細書における一例として（図28Aおよび28B）、MASP-3は、黄色ブドウ球菌のオプソニン化において重要である。C3b沈着は、ヒト血清に曝露された黄色ブドウ球菌においてMASP-3依存的に速やかに起こる（図28Aおよび28B）。
しかし、LEA-1の寄与およびMASP-3、MASP-1またはHTRA-1のレクチン非依存性機能はオプソニン化に限定されない。図1に示すように、これら3つの成分はまた、間接的または直接的なB因子活性化による細胞溶解およびC3bの産生を生じさせることができる。これらの成分は、第二経路C5コンバターゼ、すなわちC3bBb(C3b)nを生成する複合体を形成する。本明細書にさらに記載されるように、髄膜炎菌の溶解における、MASP-2ではなく（したがって、この例ではLEA-2でもない）MASP-3およびMBLの必要性（図11、12、および13を参照されたい）は、溶解におけるLEA-1の役割を実証する。要約すると、黄色ブドウ球菌研究から得られたオプソニン化結果および髄膜炎菌研究において認められた溶解結果は、両プロセスにおけるLEA-1の役割を裏付ける（図1に示すように）。さらに、これらの研究は、オプソニン化および溶解の両方がC3bBもしくはC3b(H20)の転換および/またはプロD因子のD因子への転換から生じることができることを実証する。したがって、両プロセスは、MASP-3、MASP-1またはHTRA-1のレクチン非依存性役割の結果であることができる。したがって、本発明者らによって開発された図1のモデルは、オプソニン化および/または溶解を阻止し、かつこれらのプロセスの調節不全によって生じる疾病を治療するための、主にMASP-3の阻害因子ならびにMASP-1および/またはHTRA-1の阻害因子の使用を裏付ける。
1. レクチン経路エフェクターアーム（LEA-1）
レクチン経路の第一のエフェクターアーム、すなわちLEA-1は、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3によって形成される。本明細書に記載されるように、本発明者らはこれまでのところ、MASP-3の非存在かつMASP-1の存在において、第二経路が面構造上で実質的に活性化されないことを示した。これらの結果は、MASP-3が、第二経路を開始させる上で、これまで開示されたことがない役割を果たすことを実証し、これは、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にする突然変異を有する珍しい3MC常染色体劣性障害の患者から採取されたMASP-3欠損3MC血清を使用して確認されている（Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3)：197-203 (2011)）。これらの新規な発見に基づき、従来から定義されるような第二経路を伴う補体活性化はMASP-3依存性であると予想される。事実、MASP-3、およびそのLEA-1活性化は、これまでわかりにくかった第二経路のイニシエーターということになり得る。
本明細書において実施例1〜4にさらに記載されるように、本発明者らは、MASP-2欠損血清中、髄膜炎菌に対してより高い殺菌活性（すなわち溶解活性）を生じさせるレクチン依存性第二経路活性化のより高い活性を認めた。任意の特定の理論によって拘束されることを望まないが、MASP-2の非存在において、MASP-1を有する糖質認識複合体は、MASP-3を有する糖質認識複合体と密に結合して、MASP-3を活性化する可能性が高いと考えられる。多くの場合、MASP-3は自己活性化酵素ではなく、非常に多くの場合、その酵素前駆体形態からその酵素的に活性な形態へと転換されるためにMASP-1の活性を必要とするため、MASP-3の活性化はMASP-1活性に依存することが知られている。MASP-1は（MASP-2と同様）自己活性化酵素であるが、MASP-3は自己活性化せず、多くの場合、その酵素的に活性な形態へと転換されるためにはMASP-1の酵素活性を必要とする。Zundel S, et al., J. Immunol., 172(7)：4342-50 (2004)を参照されたい。MASP-2の非存在において、すべてのレクチン経路認識複合体はMASP-1またはMASP-3のいずれかを付加される。したがって、MASP-2の非存在は、MASP-3からその酵素的に活性な形態へのMASP-1媒介性転換を促進する。MASP-3が活性化されると、活性化されたMASP-3は、C3bBからC3bBbへのおよび/またはプロD因子からD因子へのMASP-3媒介性転換を介して、今や「LEA-1」活性化と呼ばれる第二経路活性化を開始する。第二経路C3コンバターゼとも呼ばれるC3bBbは、さらなるC3分子を切断して、オプソニンC3b分子の沈着を生じさせる。いくつかのC3b断片がC3bBbコンバターゼ複合体に近接して結合する場合、これにより、第二経路C5コンバターゼC3bBb(C3b)nが形成され、それがMACの形成が促進される。加えて、表面に沈着したC3b分子がB因子結合のための新たな部位を形成し、それが今度はD因子および/またはMASP-3によって切断されて、第二経路C3およびC5コンバターゼ複合体が形成することができるさらなる部位を形成する。この後者のプロセスは、効果的な溶解のために必要であり、初期のC3b沈着が起こったらレクチンを必要としない。近年の刊行物（Iwaki D. et al., J Immunol 187(7)：3751-8 (2011)）および本発明者らから生成されたデータ（図30）は、活性化されたMASP-3によって第二経路C3コンバターゼ酵素前駆体複合体C3bBがその酵素的に活性な形態へと転換されることを実証する。本発明者らはこれまでのところ、B因子のMASP-3媒介性切断が、第二経路C3コンバターゼC3bBbのレクチン依存性形成を促進する、新たに記載されたLEA-1のサブコンポーネントを表すことを見いだした。
2. レクチン経路エフェクターアーム（LEA-2)
レクチン経路の第二のエフェクターアーム、すなわちLEA-2は、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-2によって形成される。MASP-2は、認識成分がそれぞれのパターンに結合した場合に活性化され、かつ、またMASP-1によっても活性化され得、その後、補体成分C4をC4aおよびC4bへと切断する。切断産物C4bが血漿C2に結合したのち、C4b結合C2は、C4b結合C2を酵素的に活性な複合体C4bC2aおよび小さなC2b切断断片へと転換する第二のMASP-2媒介性切断工程の基質になる。C4b2aは、豊富な血漿成分C3をC3aおよびC3bへと転換する、レクチン経路のC3転換C3コンバターゼである。C3bは、チオエステル結合を介して、近接する任意の面に結合する。いくつかのC3b断片がC3コンバターゼ複合体C4b2aに近接して結合する場合、このコンバターゼは、C5をC5bおよびC5aへと転換するようにその特異性を変化させて、C5コンバターゼ複合体C4b2a(C3b)nを形成する。このC5コンバターゼはMACの形成を開始することができるが、このプロセスは、それだけで溶解を促進するのには効果が不十分であると考えられる。むしろ、LEA-2によって産生される初期のC3bオプソニンが新たな第二経路C3コンバターゼおよびC5コンバターゼ部位の形成のための核を形成し、それが最終的に豊富なMAC形成および溶解を生じさせる。後者の事象は、LEA-2形成C3bと関連するB因子のD因子活性化によって媒介され、したがって、D因子の成熟におけるMASP-1の本質的役割のおかげでLEA-1に依存する。また、C4欠損マウスは虚血再灌流障害から保護されないが、一方、MASP-2欠損マウスは保護されることから（前記Schwaeble et al., PNAS, 2011）、虚血再灌流障害の病態生理学において重要な役割を果たす、C4の非存在においてC3を活性化するためのMASP-2依存性C4バイパス活性化経路がある。LEA-2はまた、プロトロンビンからトロンビンへの切断（共通経路）およびXII因子（ハーゲマン因子）をその酵素的に活性な形態XIIaへと転換するための切断を含む凝固経路に結び付いている。XIIa因子は他方でXI因子をXIaに切断する（内因性経路）。凝固カスケードの内因性経路活性化は、血栓形成にとってきわめて重要であるフィブリン形成を生じさせる。
図1は、本明細書に提供される結果に基づくレクチン経路および第二経路の新たな理解を示す。図1は、オプソニン化および溶解の両方におけるLEA-2の役割を詳細に記載する。MASP-2は、生理学的に、複数のレクチン依存性状況における「下流側」C3b沈着（および結果的なオプソニン化）のイニシエーターであるが（図18A、18B、18C）、また、血清感受性菌の溶解においても役割を果たす。図1に示すように、髄膜炎菌のような血清感受性病原体に関するMASP-2欠損またはMASP-2枯渇血清/血漿の殺菌活性の増大を担う提案される分子機構は、細菌の溶解の場合、MASP-1およびMASP-3と関連したレクチン経路認識複合体が互いに近接した状態で細菌表面に結合し、それにより、MASP-1がMASP-3を切断することを可能にしなければならないということである。MASP-1およびMASP-2とは対照的に、MASP-3は自己活性化酵素ではないが、多くの場合、その酵素的に活性な形態へと転換されるためにはMASP-1による活性化/切断を必要とする。
図1にさらに示すように、その後、活性化されたMASP-3は、病原体表面上のC3b結合B因子を切断して、酵素的に活性な第二経路C3およびC5コンバターゼそれぞれC3bBbおよびC3bBb(C3b)nの形成により、第二活性化カスケードを開始させることができる。MASP-2を有するレクチン経路活性化複合体はMASP-3の活性化には役割を果たし、MASP-2の非存在において、またはMASP-2の枯渇ののち、すべてのレクチン経路活性化複合体はMASP-1またはMASP-3のいずれかを付加される。したがって、MASP-2の非存在において、微生物表面上でMASP-1およびMASP-3を有するレクチン経路活性化複合体が互いに近接して位置するようになり、より多くのMASP-3が活性化され、それにより、より高速のC3b結合B因子のMASP-3媒介性切断を生じさせて、微生物表面上に第二経路C3およびC5コンバターゼC3bBbおよびC3bBb(C3b)nを形成する可能性が顕著に増大する。これが、C6と関連した表面結合C5b、C7と関連したC5bC6、C8と関連したC5bC6C7およびC5bC6C7C8で構成され、C9の重合を生じさせる、膜侵襲複合体を形成する終末活性化カスケードC5b〜C9の活性化を生じさせ、このC9が細菌表面構造に入り込み、かつ細菌壁中に孔を形成し、それが、補体標的化細菌の浸透圧性死滅を生じさせる。
この新規な概念の核は、本明細書に提供されるデータが、レクチン経路活性化複合体が、図1に示すような、以下の2つの別個の活性化経路を駆動することを明らかに示すということである。
(i）LEA-1：アクチベーター表面上のB因子の初期切断および活性化を通して第二経路コンバターゼC3bBbを生成することによって補体の活性化を開始し、かつ駆動し、次いで、それがC3b沈着および第二経路コンバターゼC3bBbの形成を触媒するMASP-3依存性活性化経路。MASP-3駆動型活性化経路は、微生物のオプソニン化および溶解において本質的な役割を果たし、細菌の表面上で第二経路を駆動して、膜侵襲複合体を生成するのに最適な活性化速度を生じさせる。
(ii）LEA-2：レクチン経路C3コンバターゼC4b2aの形成を生じさせ、C3切断産物C3bが蓄積すると、その後、C5コンバターゼC4b2a(C3b)nを生じさせるMASP-2依存性活性化経路。補体C4の非存在において、MASP-2は、C2および凝固因子XIを含む第二C3コンバターゼ複合体を形成することができる。
溶解におけるその役割に加えて、MASP-2駆動型活性化ルートは、微生物が共有結合C3bおよびその切断産物（すなわちiC3bおよびC3dg）でコーティングされることにつながる細菌オプソニン化において重要な役割を果たし、それは、C3レセプターを有する食細胞、例えば顆粒球、マクロファージ、単球、小グリア細胞および細網内皮系による取込みおよび死滅のために標的化される。これは、補体溶解に耐性である細菌および微生物のクリアランスに最も効果的なルートである。これらはグラム陽性細菌の大部分を含む。
LEA-1およびLEA-2に加えて、MASP-3、MASP-1および/またはHTRA-1によるD因子のレクチン非依存性活性化の可能性があり、また、MASP-3によるB因子のレクチン非依存性活性化の可能性がある。
任意の特定の理論によって拘束されることを望まないが、（i）LEA-1、（ii）LEA-2、ならびに（iii）レクチン非依存性B因子および/またはD因子活性化のそれぞれが、オプソニン化および/またはMACの形成、ならびにその結果としての溶解を生じさせると考えられる。
ii. MASP-1、MASP-2、およびMASP-3の背景
現在、3つのマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ（MASP-1、MASP-2、およびMASP-3）がヒト血清中でマンナン結合レクチン（MBL）と関連していることが公知である。マンナン結合レクチンはまた、最近の文献においては、「マンノース結合タンパク質」または「マンノース結合レクチン」とも呼ばれている。MBL-MASP複合体は、多様な微生物上に存在する糖質構造へのMBLの結合のおかげで、先天性免疫において重要な役割を果たす。MBLと糖質構造の特定のアレイとの相互作用がMASP酵素前駆体の活性化を生じさせ、それが他方で、補体成分C4およびC2を切断してC3コンバターゼC4b2bを形成することによって補体を活性化する（Kawasaki et al., J. Biochem 106：483-489 (1989)； Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176：1497-1502 (1992)； Ji et al., J. Immunol. 150：571-578 (1993)）。
MBL-MASP酵素前駆体複合体は、最近まで、1つのタイプのプロテアーゼ（MASP-1）しか含まないと考えられていたが、今や、MBLと関連する他2つの別々のプロテアーゼ（すなわち、MASP-2およびMASP-3）（Thiel et al., Nature 386：506-510 (1997)； Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)）および「MAp19」または「sMAP」と呼ばれる19kDaのさらなる血清タンパク質（Stover et al., J. Immunol. 162：3481-3490 (1999)； Stover et al., J. Immunol. 163：6848-6859 (1999)； Takahashi et al., Int. Immunol 11：859-63 (1999)）があることが明らかである。
MAp19は、MASP-2の構造遺伝子の選択的スプライシングされた遺伝子産物であり、かつセリンエンドペプチダーゼドメインを含むMASP-2の4つのC末端ドメインを欠く。MAp19をコードする豊富に発現した切断型mRNA転写物は、MASP-2遺伝子の選択的スプライシング/ポリアデニル化事象によって生成される。類似した機構により、MASP-1/3遺伝子は、3つの主要な遺伝子産物、すなわち2つのセリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3ならびに「MAp44」と呼ばれる44kDaの切断型遺伝子産物を生じさせる（Degn et al., J. Immunol 183(11)：7371-8 (2009)； Skjoedt et al., J Biol Chem 285：8234-43 (2010)）。
MASP-1は、当初、血清Ra反応性因子のP-100プロテアーゼ成分と記載されていたが、それが今や、MBLに加えてMASPで構成された複合体であると認識されている（Matsushita et al., Collectins and Innate Immunity, (1996)； Ji et al., J Immunol 150：571-578 (1993)。補体の古典経路のC1q-(C1r)2-(C1s)2複合体内のC1s酵素と明らかに同一のやり方で補体成分C4およびC2に作用するMBL-MASP複合体内のMBL関連エンドペプチダーゼの能力は、C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体に機能的に類似するMBL-MASP複合体が存在することを示唆する。C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体は、C1qと免疫複合体中に存在する抗体IgGまたはIgMのFc領域との相互作用によって活性化される。これがC1r酵素前駆体の自己活性化を生じさせ、それが他方でC1s酵素前駆体を活性化し、次いでC1s酵素前駆体が補体成分C4およびC2に作用する。
MBL-MASP複合体の化学量論は、様々なMBLオリゴマーがMASP-1/MAp19またはMASP-2/MASP-3の様々な割合と関連するように見える点で、C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体に見られる化学量論とは異なる（Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)。血清中に見られるMASPおよびMAp19の大部分は、MBLとは複合化しておらず（Thiel et al., J Immunol 165：878-887 (2000)）、かつ部分的に、微生物面上のN-アセチルグルコサミン残基に結合することができるフィブリノゲン様ドメインを有する最近記載されたレクチンの群であるフィコリンと関連し得る（Le et al., FEBS Lett 425：367 (1998)； Sugimoto et al., J. Biol Chem 273：20721 (1998)）。これらのうち、ヒトL-フィコリン、H-フィコリンおよびM-フィコリンはMASPおよびMAp19と関連し、かつフィコリンによって認識される特定の糖質構造に結合すると、レクチン経路を活性化し得る（Matsushita et al., J Immunol 164：2281-2284 (2000)； Matsushita et al., J Immunol 168：3502-3506 (2002)）。フィコリンおよびMBLに加えて、CL-11と呼ばれるMBL様レクチンであるコレクチンがレクチン経路認識分子として同定されている（Hansen et al. J Immunol 185：6096-6104 (2010)； Schwaeble et al. PNAS 108：7523-7528 (2011)）。これらの代替糖質認識分子の生理学的重要性を強調する圧倒的な証拠があり、したがって、MBLがレクチン活性化経路の唯一の認識成分ではなく、MBL欠損がレクチン経路欠損と誤解されてはならないことを理解することが重要である。おそらくは、MBLに構造的に関連した代替糖質認識複合体のアレイの存在は、補体の活性化によって先天性免疫系の直接応答を開始させる微生物構造のスペクトルを広げ得る。
すべてのレクチン経路認識分子は、それらのコラーゲン相同性茎領域内の特定のMASP結合モチーフを特徴とする（Wallis et al. J. Biol Chem 279：14065-14073 (2004)）。MBL、CL-11およびフィコリン中のMASP結合部位は、このドメイン中の別個のモチーフ：Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Proを特徴とし、Hypはヒドロキシプロリンであり、Xaaは概して脂肪族残基である。この配列中の点突然変異がMASP結合を分断する。
1. MASP-1およびMASP-3のそれぞれの構造、配列、染色体上の位置確認、およびスプライスバリアント
図2は、ヒトMASP-1ポリペプチド（SEQ ID NO：8）、ヒトMASP-3ポリペプチド（SEQ ID NO：2）、およびヒトMAp44ポリペプチドならびにそれらをコードするエキソンのドメイン構造を示す略図である。図2に示すように、セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3は、C1rおよびC1sに見られるように配置された6つの別々ドメイン；すなわち、（I）N末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形成タンパク質（またはCUBI）ドメイン；（II）上皮成長因子（EGF)様ドメイン；（III）第二のCUBドメイン（CUBII）；（IVおよびV）2つの補体制御タンパク質（CCP1およびCCP2）ドメイン；および（VI）セリンプロテアーゼ（SP）ドメインからなる。
ヒトおよびマウスMASP-1（Sato et al., Int Immunol 6：665-669 (1994)； Takada et al., Biochem Biophys Res Commun 196：1003-1009 (1993)； Takayama et al., J. Immunol. 152：2308-2316 (1994)）、ヒト、マウス、およびラットMASP-2（Thiel et al., Nature 386：506-510 (1997)； Endo et al., J Immunol 161：4924-30 (1998)； Stover et al., J. Immunol. 162：3481-3490 (1999)； Stover et al., J. Immunol. 163：6848-6859 (1999)）ならびにヒトMASP-3（Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)）のcDNA由来アミノ酸配列は、これらのプロテアーゼが、それらの推定触媒ドメイン中にHis、Asp、およびSer残基の特徴的な三連構造を有するセリンペプチダーゼであることを示す（Genbankアクセッション番号：ヒトMASP-1：BAA04477.1（SEQ ID NO：8）；マウスMASP-1：BAA03944；ラットMASP-1：AJ457084；ヒトMASP-3：AAK84071（SEQ ID NO：2）；マウスMASP-3：2012年2月15日にGenbankにアクセスした場合のAB049755（SEQ ID NO：3）；ラットMASP-3（SEQ ID NO：4）；ニワトリMASP-3（SEQ ID NO：5）；ウサギMASP-3（SEQ ID NO：6）；およびカニクイザル（SEQ ID NO：7）。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。
図2にさらに示すように、酵素前駆体が活性形態へと転換されると、重鎖（αまたはA鎖）および軽鎖（βまたはB鎖）が分割されて、ジスルフィド結合したA鎖と、セリンプロテアーゼドメインに相当するより小さなB鎖とを生じさせる。第二のCCPドメイン（ドメインV)とセリンプロテアーゼドメイン（ドメインVI）との間に位置するArg-Ile結合の切断により、単鎖酵素前駆体MASP-1が活性化される（酵素前駆体C1rおよびC1sのように）。酵素前駆体MASP-2およびMASP-3は、MASP-1と同様なやり方で活性化されると考えられる。各MASPタンパク質がホモ二量体を形成し、かつCa++依存的にMBLおよびフィコリンと個々に関連する。
ヒトMASP-1ポリペプチド（SEQ ID NO：8）およびMASP-3ポリペプチド（SEQ ID NO：2）は1つの構造遺伝子から生じ（Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)、その遺伝子は3番染色体の長腕の3q27〜28領域にマッピングされている（Takada et al., Genomics 25：757-759 (1995)）。MASP-3およびMASP-1 mRNA転写物は一次転写物から選択的スプライシング/ポリアデニル化プロセスによって生成される。MASP-3翻訳産物は、MASP-1およびMASP-3の両方に共通であるα鎖と、MASP-3に固有であるβ鎖（セリンプロテアーゼドメイン）と構成される。図2に示すように、ヒトMASP-1遺伝子は18個のエキソンを包含する。ヒトMASP-1 cDNAはエキソン2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、16、17、および18によってコードされる。図2にさらに示すように、ヒトMASP 3遺伝子は12個のエキソンを包含する。ヒトMASP-3 cDNA（SEQ ID NO：1と表記される）はエキソン2、3、4、5、6、7、8、10、11、および12によってコードされる。選択的スプライシングが、エキソン2、3、4、5、6、7、8、および9から生じる、MBL関連タンパク質44（「MAp44」)と呼ばれるタンパク質を生じさせる。
ヒトMASP-1ポリペプチド（SEQ ID NO：8、Genbank BAA04477.1より）は699のアミノ酸残基を有し、それが19の残基のリーダーペプチドを含む。リーダーペプチドを除くと、MASP-1の算出上の分子量は76,976Daである。図2に示すように、MASP-1アミノ酸配列は4つのN結合グリコシル化部位を含む。ヒトMASP-1タンパク質（SEQ ID NO：8を参照されたい）のドメインは、図2に示され、かつ、N末端C1r/C1s/ウニVEFG/骨形成タンパク質（CUBI）ドメイン（SEQ ID NO：8のaa25〜137）、上皮成長因子様ドメイン（SEQ ID NO：8のaa139〜181）、第二のCUBドメイン（CUBII）（SEQ ID NO：8のaa185〜296)ならびに補体制御タンパク質ドメインのタンデム（SEQ ID NO：8のCCP1 aa301〜363およびCCP2 aa367〜432）、ならびにセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO：8のaa449〜694）を含む。
ヒトMASP-3ポリペプチド（Genbank AAK84071からのSEQ ID NO：2）は、（図3に示すように）728個のアミノ酸残基を有し、（下線を引いたアミノ酸残基として図3に示すように）19個の残基のリーダーペプチドを含む。
リーダーペプチドを除くと、MASP-3の算出上の分子量は81,873Daである。図2に示すように、MASP-3中には7つのN結合グリコシル化部位がある。ヒトMASP-3タンパク質（SEQ ID NO：2を参照されたい）のドメインが図2に示され、N末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形成タンパク質（CUBI）ドメイン（SEQ ID NO：2のaa25〜137）、上皮成長因子様ドメイン（SEQ ID NO：2のaa139〜181）、第二のCUBドメイン（CUBII）（SEQ ID NO：2のaa185〜296）ならびに補体制御タンパク質ドメインのタンデム（SEQ ID NO：2のCCP1 aa299〜363およびCCP2 aa367〜432)およびセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO：2のaa450〜728）を含む。
MASP-3翻訳産物は、MASP-1およびMASP-3の両方に共通である、CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2ドメインを含むα鎖（重鎖）（α鎖：SEQ ID NO：2のaa1〜448）と、MASP-3およびMASP-1に固有である、セリンプロテアーゼドメインを含む軽鎖（β鎖：SEQ ID NO：2のaa449〜728）と構成される。
2. 様々な種由来のMASP-3アミノ酸配列の比較
図4は、ヒト（SEQ ID NO:2）、カニクイザル（SEQ ID NO:7）、ラット（SEQ ID NO:4）、ネズミ（SEQ ID NO:3）、ニワトリ（SEQ ID NO:5）およびウサギ（SEQ ID NO:6）からの完全長MASP-3タンパク質の比較を示すMASP-3の多種間アラインメントを提供する。図5は、ヒトのセリンプロテアーゼ（SP）ドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸450〜728）；ウサギのSPドメイン（SEQ ID NO:6のアミノ酸450〜728）；ネズミのSPドメイン（SEQ ID NO:3のアミノ酸455〜733)；ラットのSPドメイン（SEQ ID NO:4のアミノ酸455〜733）およびニワトリのSPドメイン（SEQ ID NO:5のアミノ酸448〜730）の多種間アラインメントを提供する。
図4に示すように、異なる種の間で、特にSPドメイン中に、MASP-3ポリペプチドの高レベルのアミノ酸配列保存がある（図5）。さらに図5に示すように、種間で触媒三残基（完全長ヒトMASP-3（SEQ ID NO:2）に関して残基497のH；残基553のDおよび残基664のS）が保存されている。表1は、種間でのMASP-3 SPドメインの同一性％をまとめる。
（表１）種間でのMASP-3 SPドメインの同一性％
Figure 0006971306
MASP-3は、C4、C2またはC3基質に対してタンパク質分解活性を有しない。逆に、MASP-3は最初に、レクチン経路の阻害因子として作用することが報告された（Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)）。この結論は、MASP-3が、MASP-1およびMASP-2とは対照的に、自己活性化酵素ではないことから生まれ得たものである（Zundel S. et al., J Immunol 172：4342-4350 (2004)； Megyeri et al., J. Biol. Chem. 288：8922-8934 (2013)。
最近、MASP-1欠損およびMASP-3欠損を併せ持つマウス系統を使用するトランスジェニックマウス研究から、MASP-1およびMASP-3の可能な生理学的機能の証拠が出た。MASP-1/3ノックアウトマウスは機能的レクチン経路を有するが（Schwaeble et al., PNAS 108：7523-7528 (2011)）、それらは第二経路活性を欠くと考えられる（Takahashi et al., JEM 207(1)：29-37 (2010)）。第二経路活性の欠如は、第二経路活性に必要である補体D因子の処理欠陥によるものと考えられる。MASP-1/3ノックアウトマウスにおいて、すべてのD因子はタンパク質分解的に不活性な前駆形態として循環しているが、一方、正常なマウスの血清中では、D因子の実質すべては活性形態にある。生化学的分析は、MASP-1が補体D因子をその酵素前駆体形態からその酵素的に活性な形態へと転換することができることを示唆する（図32；Takahashi et al., JEM 207(1)：29-37 (2010)）。MASP-3はまた、インビトロでプロD因子酵素前駆体を切断し、活性D因子を産生する（図32；Takahashi et al., JEM 207(1)：29-37 (2010)）。D因子は、正常な個体中で循環しながら活性酵素として存在し、MASP-1およびMASP-3ならびにHTRA-1がこの活性化を担い得る。さらに、MBL欠損とフィコリン欠損とを併せ持つマウスは、それでも、正常レベルのD因子を産生し、かつ十分に機能的な第二経路を有する。したがって、MASP-1およびMASP-3のこれらの生理学的機能は必ずしもレクチンを伴わず、したがってレクチン経路とは無関係である。組換えマウスおよびヒトMASP-3はまた、インビトロでB因子を切断し、黄色ブドウ球菌へのC3沈着を支持すると考えられる（図29；Iwaki D. et al., J Immunol 187(7)：3751-8 (2011)）。
3MC症候群（以前はCarnevale、Mingarelli、Malpuech、およびMichels症候群と呼ばれていた。OMIM #257920）の患者の最近の研究から、MASP-3の予想外の生理学的役割が明らかになった。これらの患者は、口蓋裂、口唇裂、頭蓋奇形および精神遅滞を含む重篤な発達異常を示す。遺伝分析が、機能不全MASP-3遺伝子に関してホモ接合性である3MC患者を特定した（Rooryck et al., Nat. Genet. 43(3)：197-203 (2011)）。別の3MC患者群が、機能的MASP-1およびMASP-3タンパク質の非存在を生じさせるMASP-1遺伝子における突然変異に関してホモ接合性であることがわかった。さらに別の3MC患者群が機能的CL-11遺伝子を欠損していた（Rooryck et al., Nat. Genet. 43(3)：197-203 (2011)）。したがって、CL-11 MASP-3軸が胚発生中に役割を果たすと考えられる。この発生経路の分子機構は不明確である。しかし、共通の補体成分C3の欠損を有する個体はこの症候群を発症しないため、従来の補体駆動型プロセスによって媒介される可能性は低い。したがって、本明細書に記載される、本発明者らの発見よりも前に、レクチン依存性補体活性化におけるMASP-3の機能的役割は予め確立されていなかった。
MASP-1およびMASP-2の触媒断片の構造はX線結晶構造解析法によって決定されている。MASP-1プロテアーゼドメインと他の補体プロテアーゼのドメインとの構造比較が、その弛緩した基質特異性の基礎を明らかにした（Dobo et al., J. Immunol. 183：1207-1214 (2009)）。MASP-2の基質結合溝のアクセス可能性は表面ループによって制限されるが（Harmat et al., J Mol Biol 342：1533-1546 (2004)）、MASP-1は、他の補体プロテアーゼのものよりもトリプシンのそれに似ている開口した基質結合ポケットを有する。MASP-1構造のトロンビン様性質が、基質と相互作用し得る異常に大きな60アミノ酸ループ（ループB）である。MASP-1構造の別の興味深い特徴が、S1 Asp189とArg224との間の内部塩橋である。D因子の基質結合ポケット中にも、そのプロテアーゼ活性を調節することができる類似した塩橋を見いだすことができる。C1sとMASP-2とはほぼ同一の基質特異性を有する。驚くことに、基質特異性を決定するMASP-2の8つの表面ループのいくつかは、C1sの立体配座に比べて全く異なる立体配座を有する。これは、2つの機能的に関連する酵素が同じ基質と異なるやり方で相互作用することを意味する。酵素前駆体MASP-2の構造は、分断されたオキシアニオンホールおよび基質結合ポケットを有する不活性プロテアーゼドメインを示す（Gal et al., J Biol Chem 280：33435-33444 (2005)）。驚くことに、酵素前駆体MASP-2は、大きなタンパク質基質C4に対してかなりの活性を示す。酵素前駆体MASP-2の構造は非常フレキシブルであり、不活性形態と活性形態との間の遷移を可能にする可能性が高い。構造中に反映されるこのフレキシビリティが自己活性化プロセスにおいて役割を果たし得る。
ノーザンブロット分析が、肝臓がMASP-1およびMASP-2 mRNAの主要な供給源であることを示す。MASP-1の場合に5'特異性cDNAプローブを使用すると、大きなMASP-1転写物が4.8kbで見られ、小さなものが約3.4kbで見られ、いずれもヒトおよびマウス肝臓中に存在した（Stover et al., Genes Immunity 4：374-84 (2003)）。MASP-2 mRNA（2.6kb）およびMAp19 mRNA（1.0kb）は肝組織中に豊富に発現する。MASP-3は、肝臓および、神経組織を含む他の多くの組織中に発現する（Lynch N. J. et al., J Immunol 174：4998-5006 (2005)）。
感染症および慢性炎症性疾患の病歴を有する患者が、活性MBL-MASP複合体を形成することができない突然変異形態のMASP-2を有することがわかった（Stengaard-Pedersen et al., N Engl J Med 349：554-560 (2003)）。一部の研究者は、MBLの欠損が、幼少期における頻繁な感染症の傾向（Super et al., Lancet 2：1236-1239 (1989)； Garred et al., Lancet 346：941-943 (1995)およびHIV感染に対する抵抗力の低下（Nielsen et al., Clin Exp Immunol 100：219-222 (1995)； Garred et al., Mol Immunol 33 (suppl 1)：8 (1996)）につながると判定している。しかし、他の研究は、低いMBLレベルと感染症の増大との有意な相関関係を実証していない（Egli et al., PLoS One. 8(1)：e51983 (2013)； Ruskamp et al., J Infect Dis. 198(11)：1707-13 (2008)； Israels et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 95(6)：F452-61 (2010)）。文献は意見がさまざまであるが、MASPの欠損、すなわち非利用性は、特定の病原体に対して速やかな非抗体依存性の防御を展開する個体の能力に悪影響を及ぼし得る。
Ca ++ を欠く従来のアッセイ条件を強調する新たな理解のための裏付けデータ、およびCa ++ を含むより生理学的な条件セットを使用して得られた結果
補体のレクチン経路活性化ルートが、2つの独立したエフェクター機構：(i）LEA-2：補体駆動型オプソニン化、走化性（Schwaeble et al., PNAS 108：7523-7528 (2011)）、および細胞溶解を媒介するMASP-2駆動型経路、ならびに(ii）LEA-1：アクチベーター表面上のB因子の切断および活性化によって第二経路コンバターゼC3bBbを生成することによって補体活性化を開始し、次いでそれがC3b沈着および第二経路コンバターゼC3bBbの形成を触媒し、それが結果として細胞溶解および微生物オプソニン化を生じさせることができる新規なMASP-3依存性活性化ルートを介して、補体を活性化するという結論を指摘する、いくつかの独立した線の強力な実験的証拠が本明細書に提供される。加えて、本明細書に記載されるように、MASP-1、MASP-3もしくはHTRA-1またはこれら3つのいずれかの組み合わせによるB因子および/またはD因子の別々のレクチン非依存性活性化が、第二経路を介する補体活性化を生じさせることもできる。
第二経路のレクチン経路依存性MASP-3駆動型活性化は、十分に確立されたD因子媒介性C3b結合B因子切断に寄与して、細胞表面上のC5b-9膜侵襲複合体（MAC）の形成によって細菌細胞を溶解するための終末活性化カスケードによる補体依存性溶解の最適な活性化速度を達成すると考えられる（図12〜13）。この律速事象は、MASP-3機能活性の非存在およびD因子機能活性の非存在においては不完全であるため、最適な協調を必要とするように考えられる。本明細書の実施例1〜4に記載されるように、本発明者らは、髄膜炎菌感染の実験マウスモデルにおいてMASP-2欠損およびMASP-2阻害の表現型を研究している場合、このMASP-3依存性レクチン経路機能を見いだした。遺伝子標的化MASP-2欠損マウスおよび抗体ベースのMASP-2阻害因子で処理された野生型マウスは実験的髄膜炎菌感染に対して対抗力が高かった（図6〜10を参照されたい）。野生型同腹子中で約60％の死亡率が得られるように感染量を調節した場合、MASP-2欠損またはMASP-2枯渇マウスのすべては感染をクリアし、生き延びた（図6および図10を参照されたい）。このきわめて高度な抵抗力は、MASP-2欠損またはMASP-2枯渇マウス血清中の血清殺菌活性の有意な増大に反映された。さらなる実験が、この殺菌活性が第二経路駆動型溶菌に依存することを示した。B因子もしくはD因子またはC3を欠損したマウス血清は髄膜炎菌に対して殺菌活性を示さず、第二経路が終末活性化カスケードの駆動にとって不可欠であることを示した。驚くべき結果は、MBL-AおよびMBL-C（いずれも髄膜炎菌を認識するレクチン経路認識分子である）を欠損しているマウス血清ならびにレクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3を欠損しているマウス血清が髄膜炎菌に対するすべての溶菌活性を失ったことである（図13）。最近の論文（Takahashi M. et al., JEM 207：29-37 (2010)）およびその中に提示された研究（図32）が、MASP-1が酵素前駆体形態のD因子をその酵素的に活性な形態へと転換することができ、かつこれらの血清中の酵素的に活性なD因子の非存在による溶解活性の損失を部分的に説明し得ることを実証している。これは、MBL欠損マウスにおける殺菌活性の欠如を説明しない。理由は、これらのマウスが正常な酵素的に活性なD因子を有するからである（Banda et al., Mol Immunol 49(1-2)：281-9 (2011)）。驚いたことに、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にする突然変異を有する珍しい3MC常染色体劣性障害の患者からのヒト血清を試験した場合（Rooryck C, et al., Nat. Genet. 43(3)：197-203）、髄膜炎菌に対する殺菌活性は検出されなかった（注：これらの血清はMASP-1およびD因子を有するが、MASP-3を有しない）。
ヒト血清が細菌活性を発現するためにはレクチン経路媒介MASP-3依存性活性を必要とするという仮説は、MBL欠損ヒト血清が髄膜炎菌を溶解することもできないという観測によってさらに裏付けられる(図11〜12)。MBLは、この病原体に結合する唯一のヒトレクチン経路認識分子である。MASP-3は自己活性化しないため、本発明者らは、MASP-2欠損血清中のより高い溶菌活性は、MASP-1を通してのMASP-3の好都合な活性化によって説明することもできると仮説を立てる。理由は、MASP-2の非存在においては、細菌面に接合するすべてのレクチン経路活性化複合体がMASP-1またはMASP-3のいずれかを付加されるからである。活性化されたMASP-3はインビトロでD因子（図32）およびB因子の両方を切断して、それぞれの酵素的に活性な形態を生成するため（図30およびIwaki D., et al., J. Immunol. 187(7)：3751-3758 (2011)）、MASP-3の最も可能性の高い機能は、第二経路C3コンバターゼ（すなわちC3bBb）の形成を促進することである。
レクチン依存性役割についてのデータは説得力があるが、複数の実験が、MASP-3およびMASP-1は必ずしもレクチン分子との複合体において機能することを強いられるわけではないことを示唆する。図28Bに示すような実験が、レクチンとの複合体が存在しない条件下（すなわちEGTAの存在下）、第二経路を活性化するMASP-3の能力を実証する（黄色ブドウ球菌に対するC3b沈着によって実証されるように）。図28Aは、これらの条件下での沈着が、いずれも第二経路の重要成分であるB因子、D因子およびP因子に依存することを実証する。加えて、MASP-3およびMASP-1によるD因子活性化（図32）ならびにMASP-3によるB因子活性化（図30）がレクチンの非存在においてインビトロで起こることができる。最後に、ヒト血清の存在におけるマウス赤血球の溶血研究が、細胞溶解に関するMBLおよびMASP-3の明らかな役割を実証する。しかし、MBLの欠損は、すべての機能的MASP-3がMBLと複合した場合に予想されるものとは対照的に、MASP-3の欠損の重篤さを完全には再現しない。したがって、本発明者らは、本明細書に実証されるMASP-3（およびMASP-1）の役割のすべてが、レクチンと関連した機能にのみ帰されることができるという概念によって制約されることを望まない。
レクチン経路の2つのエフェクターアームの同定ならびにMASP-1、MASP-3、およびHTRA-1の可能なレクチン非依存性機能は、微生物病原体または変化した宿主細胞もしくは代謝沈着物の存在における過度な補体活性化によって生じる特定のヒト疾病を効果的に治療するための治療的介入の新規な機会を表す。本明細書に記載されるように、本発明者らはこれまでのところ、MASP-3の非存在かつMASP-1の存在において、表面構造上で第二経路が活性化されないことを見いだした（図15〜16、28B、34〜35A、B、38〜39を参照されたい）。第二経路は、溶菌および細胞溶解を生じさせる律速事象を駆動するのに重要であるため（Mathieson P W, et al., J Exp Med 177(6)：1827-3 (1993)）、本発明者らの結果は、活性化されたMASP-3が補体の溶解活性において重要な役割を果たすことを実証する。図12〜13、19〜21、36〜37、および39〜40に示すように、MASP-3を欠損しているが、MASP-1を欠損していない3MC患者の血清中、補体の溶解終末活性化カスケードは不完全である。図12および13に示すデータは、MASP-3および/またはMASP-1/MASP-3機能活性の非存在における溶菌活性の損失を実証する。同様に、MASP-3欠損ヒト血清における溶血活性の損失（図19〜21、36〜37、および39〜40）が、組換えMASP-3を加えることによって溶血を再構成する能力（図39〜40）と合わさって、標的面上の第二経路の活性化(補体媒介性溶解を駆動するのに不可欠)が、活性化されたMASP-3存在に依存するという結論を強く支持する。したがって、上に詳述したレクチン経路の新たな理解に基づき、標的面の第二経路活性化は、LEA-1および/または、同じくMASP-3によって媒介されるレクチン非依存性B因子および/またはD因子活性化に依存し、したがって、MASP-3依存性補体活性化を阻止する作用物質は標的面上の第二経路活性化を防ぐ。
第二経路活性化のMASP-3依存性開始の不可欠な役割の開示は、本質的にすべての現在の医学書および補体に関する最近の評論記事に記載されているように、第二経路が独立型の補体活性化経路ではないことを暗示する。広く支持されている現在の科学的見解は、第二経路が特定の粒子状標的(微生物、ザイモサンおよびウサギ赤血球)の表面上で自発的な「チックオーバー」C3活性化の増幅によって活性化されるということである。しかし、ザイモサンコーティングされたプレートおよび2つの異なる細菌（髄膜炎菌および黄色ブドウ球菌）上のMASP-1およびMASP-3二重欠損マウスの血清およびヒト3MC患者血清中の任意の第二経路活性化の非存在ならびにヒトおよびマウスからのMASP-3欠損血清中の赤血球の溶血の減少は、これらの面上の第二経路活性化の開始が機能的MASP-3を必要とすることを示す。MASP-3に求められる役割は、レクチン依存性かレクチン非依存性であり得、第二経路C3コンバターゼおよびC5コンバターゼ複合体、すなわちそれぞれC3bBbおよびC3bBb(C3b)nの形成を生じさせる。したがって、本発明者らは、本明細書において、以前はわかりにくかった第二経路の開始ルートの存在を開示する。この開始ルートは、（i）新たに発見されたレクチン経路活性化アームであるLEA-1、および/または（ii）タンパク質MASP-3、MASP-1およびHTRA-1のレクチン非依存性役割に依存する。
3. 第二経路関連の疾患および状態の治療のためのMASP-3阻害物質の使用
本明細書に記載されるように、高親和性MASP-3阻害抗体（たとえば、500pM未満の結合親和性を有する）は、MASP-3標的の濃度よりも低いモル濃度で（たとえば約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で）哺乳動物対象、たとえばげっ歯類および非霊長類において第二経路を完全に阻害することが示されている（実施例11〜21を参照されたい）。実施例11に記載されるように、マウスへの高親和性MASP-3阻害抗体mAb 13B1の単回投与が、少なくとも14日間、全身性第二経路補体活性のほぼ完全な消失を生じさせた。さらに実施例12に記載されるように、PNHと関連する十分に確立された動物モデルにおいて実施された実験において、mAb 13B1がPNH様赤血球の生存率を有意に改善し、かつC5阻害よりも有意に良好にPNH様赤血球を保護するということが実証された。さらに、実施例13に記載されるように、関節炎のマウスモデルにおいて、mAb 13B1が疾患の発生率および重症度を下げることが実証された。この実施例における結果は、代表的な高親和性MASP-3阻害性mAb 13B1、10D12、および4D5が、霊長類において第二経路を遮断するのに非常に有効であることを実証する。カニクイザルへのmAb 13B1、10D12または4D5の単回投与は、およそ16日間持続する全身性第二経路活性の持続的消失を生じさせた。高親和性MASP-3阻害抗体で処置されたカニクイザルにおける第二経路消失の程度は、インビトロおよびインビボでD因子遮断によって達成される程度に匹敵し、このことはMASP-3阻害抗体によるD因子転換の完全な遮断を示した。したがって、高親和性MASP-3阻害性mAbは、第二経路活動亢進に関連する疾患に罹患している患者の治療において治療的有用性を有する。
したがって、1つの局面において、本発明は、高い親和性（500pM未満のKDを有する）でヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、対象における第二経路補体活性化を阻害するのに有効な量で対象に投与する工程を含む、それを必要とする哺乳動物対象における第二経路を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、以下にさらに記載するような、第二経路関連の疾患または障害（すなわち、第二経路活動亢進に関連する疾患または障害）、たとえば発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、ウェット型およびドライ型AMDを含む）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植後TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、ならびに重症筋無力症に罹患している。
A. 発作性夜間ヘモグロビン尿症におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
PNHの概略
発作性夜間血色素尿症(PNH)は、時としてマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれるか、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。症例の大半は一次PNHである。PNHは、補体誘導性の赤血球破壊(溶血)、少ない赤血球数(貧血)、血栓症、および骨髄機能不全を特徴とする。実験室におけるPNHの所見は、考えられる原因として自己反応性RBC結合抗体の非存在下で、血管内溶血性貧血：低ヘモグロビン、多量の乳酸デヒドロゲナーゼ、多数の網状赤血球数(破壊された細胞を交換するために未熟血球が骨髄によって放出される)、高ビリルビン(ヘモグロビンの破壊産物)と一致する変化を示す。
PNHの顕著な特徴は、循環RBC表面上での、膜侵襲複合体を含む終末補体成分の無秩序な活性化によって引き起こされる慢性的な補体媒介性溶血である。PNH RBCは、その表面上に補体制御因子CD55およびCD59が存在しないために、制御されていない補体活性化および溶血を受ける(Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11)：2283-91(2010)、Risitano, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11：528-535(2011))。CD55およびCD59は正常RBCにおいて豊富に発現しており、補体活性化を制御する。CD55は第二経路の負の制御因子として作用し、第二経路C3コンバターゼ(C3bBb)複合体の集合を阻害し、予め形成されたコンバターゼの崩壊を促進し、従って、膜侵襲複合体(MAC)の形成を遮断する。CD59は、C5b678複合体に直接結合し、C9が結合し、重合しないようにすることによって補体膜侵襲複合体を阻害する。
溶血および貧血はPNHの主な臨床特徴であるが、この疾患は、臨床所見の一部として血栓症および骨髄機能不全をさらに含む複雑な血液学的障害である(Risitano et al., Mini Reviews in Med Chem, 11：528-535(2011))。分子レベルでは、PNHは、機能的PIG A 遺伝子を欠く造血幹細胞の異常なクローン増殖によって引き起こされる。PIG Aは、CD55およびCD59を含むGPIアンカー型クラスA糖タンパク質の安定な表面発現に必要とされるグリコシル-ホスファチジルイノシトールトランスフェラーゼをコードするX連鎖遺伝子である。現在、調査中の理由で、自然体細胞変異の結果として生じた機能不全PIG A遺伝子を有する造血幹細胞は、その子孫が末梢造血細胞プールのかなりの部分を構成する点までクローン増殖することができる。変異幹細胞クローンの赤血球子孫およびリンパ球子孫はいずれもCD55およびCD59を欠くが、循環に入った後にRBCだけが明らかな溶解を受ける。
PNHの現行の治療法には、貧血の場合は輸血、血栓症の場合は血液凝固阻止、および補体系を阻害することによって免疫破壊から血球を守るモノクローナル抗体エクリズマブ(Soliris(登録商標))の使用が含まれる(Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6)：552-559(2004))。エクリズマブ(Soliris(登録商標))は、補体成分C5を標的とするヒト化モノクローナル抗体であり、C5コンバターゼによるC5切断を遮断し、それによって、C5aの産生およびMACの集合を阻止する。エクリズマブによるPNH患者の治療は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって測定された場合に血管内溶血を減少させ、患者の約半分におけるヘモグロビン安定化および輸血非依存性につながった(Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11(6)(2011))。エクリズマブ療法を受けたほぼ全員の患者においてLDHレベルが正常またはほぼ正常になったが(血管内溶血の管理のため)、患者の約1/3しか約11gr/dLのヘモグロビン値に達せず、エクリズマブを服用した残りの患者は中程度から重度の(すなわち、輸血依存性)貧血をほぼ同じ割合で示し続ける(Risitano A.M. et al., Blood 113：4094-100(2009))。Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11：528-535(2011)に記載のように、エクリズマブを服用したPNH患者は、多量のPNH赤血球に結合したC3断片を含有する(が、未治療患者は含有しなかった)ことが証明された。この所見は、Solirisで治療されたPNH患者では、C5遮断のためにもはや溶血されなくなったPNH RBCが今や多量の膜結合C3断片を蓄積でき、この膜結合C3断片が、オプソニンとして働き、その結果、特異的C3受容体を介して細網内皮細胞の中に捕捉され、その後に、血管外溶血が生じるという認識につながっている。従って、エクリズマブ療法は血管内溶血および結果として生じる後遺症を阻止するが、これらのRBCの性質を単に血管内溶血から血管外溶血に変えるだけであり、その結果、多くの患者において未治療の貧血がかなり残る(Risitano A.M. et al., Blood 113：4094-100(2009))。従って、C3断片を介した血管外溶血を発症している患者は赤血球輸血を必要とし続けるので、これらの患者には、エクリズマブの使用の他に治療方針が必要とされる。このようなC3断片を標的とするアプローチは実験システムにおいて有用性を証明している(Lindorfer et al., Blood 115：2283-91, 2010)。
PNHにおける補体開始機構
PNHにおける負の補体制御因子CD55およびCD59の不完全な表面発現の間の因果関係と、血管内溶血の阻止におけるエクリズマブの有効性の組み合わせから、PNHは、補体系によって媒介される状態であるとはっきりと定義される。このパラダイムは広く受け入れられているが、補体活性化を開始する事象、および関与する補体活性化経路がどういったものであるかは未解決のままである。CD55およびCD59は、全ての補体開始経路に共通する補体カスケード中の終末増幅段階を負に調節するので、補体活性化がレクチン経路によって開始されるか、古典経路によって開始されるか、第二経路の自発的代謝回転によって開始されるかに関係なく、これらの分子が欠損すると膜侵襲複合体の形成と膜組込みが悪化する。従って、PNH患者では、RBC表面上でのC3b沈着につながる、全ての補体活性化事象が、その後の増幅ならびに病理学的溶血(血管内溶血および/または血管外溶血)を誘発し、溶血発作を突然引き起こすことができる。PNH患者における溶血発作を誘発する分子事象のはっきりとした機構理解はまだなされていない。溶血発作を起こしているPNH患者における補体開始事象はまったく明らになってないので、PNHにおける補体活性化は低レベルの第二経路「チックオーバー」活性化により自然発生する可能性があり、その後に、CD55およびCD59の欠如による不適切な終末補体活性化制御によって増大するというのが主流となっている見解である。
しかしながら、その自然経過においてPNHは通常、補体活性化を誘発することが示されてきたある特定の事象、例えば、感染または損傷の後に発症または悪化することに注目することが重要である(Risitano, Biologics 2：205-222(2008))。この補体活性化反応は、刺激性の病原体に対する以前の宿主免疫に依存せず、従って、古典経路が関与しない可能性が高い。もっと正確に言うと、この補体活性化反応は、微生物作用物質または損傷宿主組織の表面に発現している外来炭水化物パターンまたは「変化した自己(altered self)」炭水化物パターンとのレクチン結合によって開始すると考えられる。従って、PNHにおいて溶血発作を突然引き起こす事象は、レクチンを介して開始する補体活性化と密接に関連している。このため、レクチン活性化経路は、最終的にPNH患者における溶血につながる開始トリガーを提供する可能性が非常に高い。
活性化カスケードを分子レベルで詳細に分析するために、本発明者らは、レクチンを介して補体を活性化する十分に明確な病原体を実験モデルとして使用して、誘因微生物に依存して、LEA-2またはLEA-1のいずれかによって補体活性化を開始させ、オプソニン化および/または溶解を生じさせることができることを十分に実証する。レクチン開始事象に対するこの同じ二重応答(すなわち、オプソニン化および/または溶解)の原理は、他のタイプの感染病原体または宿主への組織損傷後のレクチンによる補体活性化またはPNHを引き起こし得る他のレクチン駆動型補体活性化事象にも当てはまる可能性が高い。レクチン経路におけるこの二重性に基づいて、本発明者らは、PNH患者におけるLEA-2および/またはLEA-1開始補体活性化が、C3bによるRBCのオプソニン化および/または溶解ならびにその後の血管外および血管内溶血を促進すると推定する。したがって、PNHの状況において、LEA-1およびLEA-2両方の阻害は、血管外溶血および血管内溶血の両方に対処し、C5阻害因子エクリズマブに対する有意な利点を提供すると期待され得る。
肺炎連鎖球菌への曝露がレクチン依存性LEA-2活性化を優先的に発動させ、それが、C3bによるこの微生物のオプソニン化を生じさせることがわかった。肺炎連鎖球菌はMAC媒介性溶解に耐性であるため、循環からのクリアランスはC3bによるオプソニン化を通して起こる。このオプソニン化およびその後の循環からの除去は、MASP-2欠損マウスおよびMASP-2モノクローナル抗体で処理されたマウスにおける損なわれた細菌抑制によって示されるように、LEA-2依存性である（PLOS Pathog., 8：e1002793. (2012)）。
微生物に対する生得的宿主反応におけるLEA-2の役割を調査する際、本発明者らはさらなる病原体を試験した。髄膜炎菌をモデル生物として研究した場合、劇的に異なる結果が認められた。髄膜炎菌もまた、レクチンを介して補体を活性化し、髄膜炎菌感染をナイーブな宿主中に封じ込めるためには、補体活性化が必要である。しかし、LEA-2はこの反応において宿主保護的機能的役割を果たさない。図6および7に示すように、MASP-2の遺伝的除去によるLEA-2の遮断は髄膜炎菌感染後の生存率を低下させない。逆に、これらの研究において、MASP-2除去によるLEA-2遮断は生存率（図6および7）および疾患スコア（図9）を有意に改善した。MASP-2抗体の投与によるLEA-2遮断が同じ結果を出し（図10）、可能な原因としてのノックアウトマウス系統における二次的または代償的効果を排除した。LEA-2除去動物におけるこれらの好ましい結果は、血液からの髄膜炎菌のより迅速な除去と関連するものであった（図8）。また、本明細書に記載されるように、正常ヒト血清との髄膜炎菌のインキュベーションが髄膜炎菌を死滅させた（図11）。LEA-2を遮断するヒトMASP-2に特異的な機能的モノクローナル抗体の添加がこの死滅応答を増強し得るが、アイソタイプ対照モノクローナル抗体の投与はそれをし得ない。それにもかかわらず、MBL欠損ヒト血清または熱不活化ヒト血清は髄膜炎菌を死滅させることができなかったため、このプロセスは、レクチンおよび少なくとも部分的に機能的補体系に依存する（図11）。総合的に、これら新規な発見は、機能的補体系の存在における髄膜炎菌感染が、レクチン依存性であるがLEA-2非依存性である補体活性化経路によって抑制されることを示唆する。
3MC患者からの血清標本を使用して、LEA-1がレクチン依存性の髄膜炎菌死滅を担う補体経路であり得るという仮説を試験した。この患者は、MASP-1/3遺伝子のエキソン12中のナンセンス突然変異に関してホモ接合性であった。その結果、この患者は、機能的MASP-3タンパク質を欠損していたが、他の点では補体充分であった（エキソン12はMASP-3転写物に特異的であり、突然変異はMASP-1機能または発現レベルに対して影響を及ぼさない）（Nat Genet. 43(3)：197-203 (2011)を参照されたい）。正常ヒト血清は髄膜炎菌を効率的に死滅させるが、MBL（レクチン経路の認識分子の1つ）を欠損している熱不活化血清およびMASP-3欠損血清は髄膜炎菌を死滅させることができなかった（図12）。したがって、LEA-1は髄膜炎菌死滅を媒介すると考えられる。この発見は、ノックアウトマウス系統からの血清試料を使用して確認された。正常マウス血清を含む補体は髄膜炎菌を容易に死滅させたが、MBL欠損またはMASP-1/3欠損マウス血清は、機能的補体を欠損している熱不活化血清と同じくらい無効であった（図13）。逆に、MASP-2欠損血清は髄膜炎菌の効率的な死滅を示した。
これらの発見は、レクチン依存性補体活性化の別々のLEA-2およびLEA-1経路の存在を明らかにすることにより、これまで知られていなかったレクチン経路の二重性の証拠を提供する。上述した例において、LEA-2およびLEA-1は非重複性であり、別々の機能的結果を媒介する。データは、特定のタイプのレクチン経路アクチベーター（肺炎連鎖球菌を含むが、これに限定されない）は、LEA-2を介して補体活性化を優先的に開始させてオプソニン化を生じさせるが、一方、他のもの（例えば髄膜炎菌）は、LEA-1を介して補体活性化を優先的に開始させ、かつ細胞溶解プロセスを促進することを示唆する。しかし、他の状況においては両経路がオプソニン化および/または溶解を媒介することができるため、データは必ずしも、LEA-2をオプソニン化に限定し、かつLEA-1を細胞溶解プロセスに限定するものではない。
髄膜炎菌によるレクチン依存性補体活性化という状況では、LEA-2の遮断がインビトロで生物のLEA-1依存性溶解的破壊を増強したため、LEA-2およびLEA-1アームは互いに競合すると考えられる（図13）。上述したように、この発見は、MASP-2の非存在においてレクチンMASP-1複合体がレクチンMASP-3複合体に近接して存在し、それがLEA-1活性化を増強し、ひいてはより効果的な髄膜炎菌の溶解を促進する可能性の増大によって説明することができる。髄膜炎菌の溶解はナイーブな宿主における主要な保護機構であるため、インビボでのLEA-2の遮断は髄膜炎菌クリアランスを増大し、かつ死滅の増強を生じさせる。
上述した例は、髄膜炎菌感染後の転帰に関してLEA-2とLEA-1とで反対の効果を示すが、LEA-2とLEA-1とが共に相乗効果を発揮して特定の転帰を生じさせ得る他の状況があり得る。以下に詳述するように、PNHにおいて存在するような、レクチンを介する病理学的補体活性の他の状況において、LEA-2およびLEA-1駆動型補体活性化は相乗的に協働してPNHの病態全体に寄与し得る。加えて、本明細書に記載されるように、MASP-3もまた、B因子およびD因子のレクチン非依存性転換に寄与し、それはCa++の非存在において起こることができ、一般に、C3bBからC3bBbへの転換およびプロD因子からD因子への転換を生じさせ、それがさらにPNHの病態に寄与し得る。
PNHにおける生物学および予想される機能活性
このセクションは、PNHのインビトロモデルにおける溶血に対するLEA-2およびLEA-1遮断の阻害効果を記載する。この発見は、PNHの1つまたは複数の局面に罹患している患者を治療するためのLEA-2遮断物質（MASP-2に結合し、かつその機能を遮断する抗体を含むが、それに限定されない）およびLEA-1遮断物質（MASP-3、MASP-3または両方に結合し、かつそのMASP-1媒介性活性化の機能を遮断する抗体を含むが、それに限定されない）の有用性、ならびにエクリズマブのようなC5阻害因子による治療を受けるPNH患者においてC3断片媒介性血管外溶血の効果を緩和するためのLEA-2および/またはLEA-1および/またはMASP-3依存性レクチン非依存性補体活性化の阻害因子（MASP-2阻害因子、MASP-3阻害因子、およびMASP-2/MASP-3またはMASP-1/MASP-2二重または二重特異性阻害因子、ならびに、汎特異性MASP-1/MASP-2/MASP-3阻害因子を含む）の使用を裏付ける。
細網内皮系を介するPNH RBCのオプソニン化および血管外溶血を遮断するためのMASP-2阻害因子
上に詳述したように、PNH患者は、循環からのRBCクリアランスの2つの別々の機構：膜侵襲複合体（MAC）の活性化による血管内溶血、ならびにC3bによるオプソニン化後の血管外溶血およびその後の細網内皮系による補体レセプター結合および取込み後のクリアランスにより、貧血になる。血管内溶血は、患者がエクリズマブで治療された場合に概ね予防される。エクリズマブは、補体開始活性化事象およびその後のオプソニン化の両方よりも下流で起こる終末溶解エフェクター機構を遮断するため、エクリズマブは血管外溶血を遮断しない（Risitano A.M. et. al., Blood 113：4094-100(2009)）。その代わり、未治療PNH患者においては溶血を起こしたと考えられるRBCが、今や、活性化されたC3bタンパク質をその表面に蓄積できることができ、それが、細網内皮系による取込みを増強し、その血管外溶血を増強する。したがって、エクリズマブ治療は、実質的に、RBCの性質を血管内溶血から潜在的な血管外溶血に変える。結果として、エクリズマブで治療される一部のPNH患者は依然として貧血のままである。したがって、上流で補体活性化を遮断し、かつPNH RBCのオプソニン化を阻止する作用物質は、エクリズマブを用いてときおり見られる血管外溶血を遮断するのに特に適していることができるということになる。
本明細書に提示される微生物データは、LEA-2が、多くの場合、レクチン依存性オプソニン化の支配的なルートであることを示唆する。さらに、レクチン依存性オプソニン化(C3b沈着として測定)を3つのプロトタイプレクチン活性化面（マンナン、図17A；ザイモサン、図17Bおよび肺炎連鎖球菌、図17C）上で評価すると、LEA-2が、生理学的条件下(すなわち、すべての補体経路が作動可能であるCa++の存在において）、レクチン依存性オプソニン化の支配的なルートであると考えられる。これらの実験条件下、MASP-2欠損血清（LEA-2を欠く）は、試験面をオプソニン化する効果がWT血清よりも実質的に低い。MASP-1/3欠損血清（LEA-1を欠く）もまた損なわれているが、この効果は、LEA-2を欠く血清に比較してはるかに目立たない。レクチン駆動型オプソニン化へのLEA-2およびLEA-1の寄与の相対的大きさが図18A〜18Cにさらに示されている。レクチン経路または古典経路の非存在において補体の第二経路がレクチン活性化面のオプソニン化を支持することが報告されているが（Selander et al., J Clin Invest 116(5)：1425-1434 (2006)）、単離された第二経路(Ca++フリーのアッセイ条件下で測定)は、本明細書に記載されるLEA-2およびLEA-1開始プロセスよりも実質的に効果が低いと考えられる。補外法により、これらのデータは、PNH RBCのオプソニン化が、LEA-2によって優先的に開始され得、LEA-1によっては、レクチン非依存性第二経路活性化の結果よりも低い程度にしか開始され得ないことを示唆する（おそらくは第二経路増幅ループによって増幅される）。したがって、LEA-2阻害因子は、PNHにおいてオプソニン化を抑制し、かつ血管外溶血を防止するのに最も効果的であると予想され得る。しかし、MBL以外のレクチン、例えばフィコリンが非糖質構造、例えばアセチル化タンパク質に結合し、MASP-3がH-フィコリンと優先的に関連する（Skjoedt et al., Immunobiol. 215：921-931, 2010）という事実の認識は、PNH関連のRBCオプソニン化におけるLEA-1の有意な役割の可能性を残す。したがって、LEA-1阻害因子は、さらなる抗オプソニン効果を有すると予想され、LEA-1阻害因子とLEA-2阻害因子との組み合わせが最適であり、かつPNH患者におけるオプソニン化および血管外溶血を抑制する中で最も強い治療有益性を媒介すると予想される。したがって、LEA-2およびLEA-1は、付加的または相乗的に作用してオプソニン化を促進し、交差反応性または二重特異性LEA-1/LEA-2阻害因子は、PNHにおけるオプソニン化および血管外溶血を阻止するのに最も効果的であると予想される。
PNHにおけるMASP-3阻害因子の役割
PNHのインビトロモデルを使用して、本発明者らは、PNHにおける補体活性化および結果的な溶血が実際にLEA-2および/またはLEA-1活性化によって開始され、それが、第二経路の独立した機能ではないことを実証した。これらの研究は、Crry欠損マウスからのRBC（マウスにおける終末補体経路の重要な負の調節物質）およびPNH患者には存在しない同じ補体調節物質を欠くCD55/CD59欠損マウスからのRBCをはじめとする様々なマウス系統のマンナン感作RBCを使用した。マンナン感作Crry欠損RBCを補体充分なヒト血清に曝露すると、RBCは、3％の血清濃度で実質的に溶血したが（図19および20）、一方、補体欠損血清（HI：熱不活化）は溶血性ではなかった。驚いたことに、MASP-2抗体の添加によってLEA-2が遮断された補体充分な血清は溶血活性が低下しており、効果的な溶血のためには6％血清が必要であった。CD55/CD59欠損RBCを試験した場合にも同様な観察結果が得られた（図22）。MASP-2モノクローナル抗体で補充された補体充分なヒト血清(すなわち、LEA-2が抑制された血清)は、溶血の支持において未処理の血清よりも効果が約2倍の低さであった。さらに、未処理の血清に比べて未処理のWT RBCの効果的な溶血を促進するためには、より高濃度のLEA-2遮断血清（すなわち、抗MASP-2モノクローナル抗体で処理された）が必要であった（図21）。
さらに驚くことに、機能不全MASP-3タンパク質に関してホモ接合性の3MC患者からの血清(したがって、LEA-1を欠く)は、マンナン感作Crry欠損RBCを溶血することが全くできなかった（図20および図21）。非感作正常RBCを使用した場合にも同様な結果が観察された。図21に示すように、3MC患者から単離したLEA-1欠損血清は、溶血を媒介する効果を全く有しなかった。要約すると、これらのデータは、LEA-2は血管内溶血応答に有意に寄与するが、LEA-1が、溶血を生じさせる支配的な補体開始経路であることを示す。したがって、LEA-2遮断物質は、PNH患者におけるRBCの血管内溶血を有意に減少させると予想されるが、LEA-1遮断物質は、より深い効果を有し、補体駆動型溶血を概ね排除すると予想される。
この研究に使用されたLEA-1欠損3MC患者の血清は、従来の第二経路アッセイ条件下で試験した場合、減退しているが機能的である第二経路を有していたことが留意されるべきである（図15）。この発見は、LEA-1が、溶血に対し、このPNH実験状況において従来から定められている第二経路活性よりも大きな寄与を達成することを示唆する。推論すると、PNH患者における血管内溶血を予防または治療する際に、LEA-1遮断物質は、第二経路の他の局面を遮断する作用物質と少なくとも同じくらい有効であることが暗示される。
PNHにおけるMASP-2阻害因子の役割
本明細書に提示されるデータは、PNHにおける貧血に関して以下の病原性機構を示唆する。主としてであるがただし排他的でなくLEA-1によって開始される、終末補体成分の調節されない活性化およびMACの形成によるRBCの溶解による血管内溶血、ならびに、主としてLEA-2によって開始されると考えられる、C3bによるRBCのオプソニン化によって生じる血管外溶血。補体活性化を開始し、MAC形成および溶血を促進することにおけるLEA-2の認められる役割は明らかであるが、このプロセスは、溶血を生じさせるLEA-1開始補体活性化よりも効果が実質的に低いと考えられる。したがって、LEA-2遮断物質は、PNH患者における血管内溶血を有意に減少させると予想されるが、この治療活性は部分的でしかないと予想される。比較により、LEA-1遮断物質の場合に、PNH患者における血管内溶血のより実質的な減少が予想される。
PNHにおいて貧血を生じさせる、それほど劇的ではないが等しく重要なRBC破壊機構である血管外溶血は、主として、主にLEA-2によって媒介されると考えられるC3bによるオプソニン化の結果である。したがって、LEA-2遮断物質は、PNHにおけるRBCオプソニン化およびその後に起こる血管外溶血を優先的に阻止すると予想され得る。この病原プロセスを体験するPNH患者のための治療は今のところ存在しないため、LEA-2遮断物質のこの特有の治療活性は、すべてのPNH患者に有意な治療有益性を提供すると予想される。
LEA-1阻害因子または終末補体遮断物質に対する補助治療としてのLEA-2阻害因子
本明細書に提示されるデータは、別々のクラスの治療剤によって別々に、または組み合わせて標的化することができる、PNHにおけるRBCクリアランスおよび貧血の以下の2つの病原性機構を明示する：主としてであるがただし排他的でなくLEA-1によって開始され、したがって、LEA-1遮断物質によって効果的に予防されると予想される血管内溶血；および、主としてLEA-2によって駆動され、したがってLEA-2遮断物質によって効果的に予防されるC3bオプソニン化による血管外溶血。
溶血の血管内機構および血管外機構の両方がPNH患者における貧血を生じさせることは十分に文献で立証されている（Risitano et al., Blood 113：4094-4100 (2009)）。したがって、血管内溶血を防ぐLEA-1遮断物質が、主に血管外溶血を防ぐLEA-2遮断物質と組み合わさると、PNH患者において発症する貧血を防ぐのにいずれかの作用物質単独よりも効果的であると予想される。事実、LEA-1遮断物質とLEA-2遮断物質との組み合わせは、PNHにおける補体開始の関連するすべての機構を防ぎ、ひいてはPNHにおける貧血のすべての症候を阻止すると予想される。
また、C5遮断物質（例えばエクリズマブ）は、血管内溶血を効果的に阻止するが、オプソニン化を妨害しないことも公知である。これは、一部の抗C5治療PNH患者を、治療されないままであるLEA-2によって媒介される血管外溶血による実質的な残留貧血を抱える状態に放置する。したがって、血管内溶血を防ぐC5遮断物質（例えばエクリズマブ）が、血管外溶血を減少させるLEA-2遮断物質と組み合わさると、PNH患者において発症する貧血を防ぐのにいずれかの作用物質単独よりも効果的であると予想される。
C5活性化およびMAC沈着を生じさせる補体系の終末増幅ループを遮断する他の作用物質（プロパージン、B因子、もしくはD因子を遮断するかまたはI因子、H因子もしくは他の補体阻害因子の阻害活性を増強する、作用物質を含むが、これらに限定されない）もまた、血管内溶血を阻害すると予想される。しかし、これらの作用物質は、PNH患者におけるLEA-2媒介性オプソニン化を妨害するとは予想されない。これは、そのような作用物質で治療される一部のPNH患者を、治療されないままであるLEA-2によって媒介される血管外溶血による実質的な残留貧血を抱える状態に放置する。したがって、血管内溶血を防ぐそのような作用物質による治療が、血管外溶血を最小限にするLEA-2遮断物質と組み合わさると、PNH患者において発症する貧血を防ぐのにいずれかの作用物質単独よりも効果的であると予想される。事実、そのような作用物質とLEA-2遮断物質との組み合わせは、PNHにおけるRBC破壊の関連するすべての機構を防ぎ、ひいてはPNHにおける貧血のすべての症候を阻止すると予想される。
PNHを治療するためのLEA-1およびLEA-2多重特異性、二重特異性、または汎特異性抗体の使用
上に詳述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断し、ひいては組み合わさって、血管内溶血および血管外溶血を媒介するすべての補体活性化事象を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、PNH患者にとって最良の臨床転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、LEA-1およびLEA-2複合遮断活性を有するそのような実体は、血管内溶血および血管外溶血を効果的に阻止し、PNHにおける貧血を予防する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、LEA-1を遮断し、LEA-2を減少させ、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、さらにLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいは、そのような実体は二重特異性モノクローナル抗体からなり得、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、LEA-2を遮断する。そのような実体は最適には二重特異性モノクローナル抗体からなり得、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、LEA-2を減少させ、その上、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、さらにLEA-2を遮断する。また、タンパク質配列およびアーキテクチャ全体の類似性に基づき、機能的にMASP-1、MASP-2、およびMASP-3に特異的に結合し、ひいてはLEA-1およびLEA-2の機能的遮断を達成する、2つの同一の結合部位を有する従来の抗体を開発することができると考えることができる。汎MASP阻害活性を有するそのような抗体は、血管内溶血および血管外溶血の両方を阻止し、ひいてはPNH患者における貧血を効果的に治療すると予想される。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえばPNHにおける第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、PNHに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するため方法であって、対象におけるPNHを治療するのにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するため方法であって、対象におけるPNHを治療するのにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、薬学的組成物を対象に投与する工程を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、薬学的組成物は、PNHに罹患している対象における赤血球の生存率を増加させる。いくつかの態様において、PNHに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象は、（i）正常より低いレベルのヘモグロビン、（ii）正常より低いレベルの血小板；（iii）正常より高いレベルの網状赤血球、および（iv）正常より高いレベルのビリルビンからなる群より選択される1つまたは複数の症状を示す。いくつかの態様において、薬学的組成物は、PNHに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象に全身的に（たとえば皮下、筋肉内、静脈内、動脈内または吸入剤として）投与される。いくつかの態様において、PNHに罹患している対象またはその危険のある対象は、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害物質による治療を以前に受けたことがあるか、または現在受けている。いくつかの態様において、方法はさらに、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害物質を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、終末補体阻害物質はヒト化抗C5抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、終末補体阻害物質はエクリズマブである。
B. 加齢黄斑変性症におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
加齢黄斑変性症（AMD）は、高齢者における視力損傷および失明の主要な原因であり、先進国における失明症例の50％までを占める。成人におけるAMD罹患率は約3％であり、年齢とともに増加して、80歳超の人口のほぼ2/3が何らかの徴候を有する。米国においては175万超の個人が進行AMDを有し、人口高齢化とともに罹患率は高まり、2020年までにはほぼ300万に達すると予想されている（Friedman, D.S., et al., Arch. Ophthalmol. 122:564-572, 2004）。AMDは、表面を覆う中央網膜、すなわち黄斑の光受容体の変性および中心視力の損失を生じさせる網膜色素上皮（RPE）の異常である。AMDの早期および中期形態は、RPEに隣接する網膜下空間中のドルーゼン、すなわち脂質、タンパク質、リポタンパク質および壊死細胞片を含む黄色を帯びた物質の漸増的沈着ならびに網膜中の色素不規則性を特徴とする。進行AMDは、2つの臨床サブタイプ；非新生血管形成性地理的萎縮性（「ドライ型」）AMDおよび新生血管形成性滲出性（「ウェット型」）AMDからなる。ドライ型AMDが進行AMDの80〜90％を占めるが、突然かつ重篤な視覚損失の大部分はウェット型AMDの患者に起こる。2つのタイプのAMDが、類似した病態から生じる異なる表現型を表すのか、または2つの異なる状態を表すのかは不明である。現在、ドライ型AMDを治療するための治療法は米国薬品医薬品局（United States Food and Drug Administraion）（FDA）によって承認されていない。ウェット型AMDのためのFDA承認治療選択肢は、抗血管形成薬（ラニビズマブ、ペガプタニブナトリウム、アフリベルセプト）の硝子体内注射、レーザー療法、光力学的レーザー療法および埋め込み型望遠鏡を含む。
AMDの病因および病態生理は複雑であり、完全には理解されていない。いくつかの証拠がAMDの病原における補体系の調節不全の役割を裏付けている。遺伝子関連研究が、一定範囲の補体タンパク質、因子および調節物質をコードする遺伝子を含む、AMDと関連する複数の遺伝子座を同定した。最も強い関連は補体因子H（CFH）遺伝子中の多型との関連であり、非リスク遺伝子型に比べ、Y402Hバリアントホモ接合体が約6倍増のAMD発症リスクを有し、ヘテロ接合体が約2.5倍増のAMD発症リスクを有する（Khandhadia, S., et al., Immunobiol. 217:127-146, 2012）。また、補体因子B（CFB）、C2、C3、I因子ならびにCFH関連タンパク質1および3を含む他の補体経路コード性遺伝子における突然変異がAMDリスクの増大または減少と関連付けられている（Khandhadia et al.）。AMD患者からのドナーの眼における免疫組織化学的およびプロテオミクス研究が、補体カスケードのタンパク質がドルーゼン中で増大し、限局化することを示した（Issa, P.C., et al., Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249:163-174, 2011）。さらには、AMD患者は、末梢血中で測定される、増大した全身性補体活性化を有する（前記Issa et al., 2011）。
AMDの病原においては、補体の第二経路が古典経路よりも関連性があると考えられる。古典経路の活性化のための必須認識成分C1qが免疫組織化学的分析によってドルーゼン中に検出されなかった（Mullins et al., FASEB J. 14:835-846, 2000; Johnson et al., Exp. Eye Res. 70:441-449, 2000）。遺伝関連研究がCFHおよびCFB遺伝子の関与を示唆した。これらのタンパク質は第二経路増幅ループに関与しており、CFHが流体相阻害因子であり、CFBが第二経路の活性化性プロテアーゼ成分である。CFHのY402Hバリアントは、C反応性タンパク質、ヘパリン、Mタンパク質およびグリコサミノグリカンとの結合を含む、配位子結合との相互作用に影響する。この変化した配位子への結合が細胞表面への結合を減少させ得、それが他方で、C3b活性化断片のI因子媒介性変性の減少および第二C3コンバターゼの調節の減損を招き、第二経路の過剰活性化を生じさせ得る（前記Khandhadia et al., 2012）。CFB遺伝子の変化がAMD発現に対する保護効果と関連している。機能バリアントfB32Qは、リスクバリアントfB32Rよりも4倍の低さのC3bへの結合親和性を有し、結果としてC3コンバターゼ形成の減少を生じさせた（Montes, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:4366-4371, 2009）。
AMDにおける補体開始機構
上述したヒトの遺伝的連鎖研究はAMD病原における補体系の重要な役割を示唆する。さらに、補体活性化産物は、ウェット型およびドライ型の両AMDにおける特徴的な病理学的病変であるドルーゼン中に豊富に存在する（Issa, P.C., et al., Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249:163-174, 2011）。しかし、補体活性化を開始する事象の性質および関与する補体活性化経路は不完全にしか理解されないままである。
ドルーゼン沈着物は、眼の老化とともにRPEの下に蓄積する、網膜由来の壊死細胞片および酸化老廃物で構成されていることに留意することが重要である。加えて、酸化ストレスが重要な役割を果たすと考えられ（Cai et al; Front Biosci., 17:1976-95, 2012）、RPEにおいて補体活性化を生じさせることが示されている（J Biol. Chem., 284(25):16939-47, 2009）。酸化ストレスおよび細胞または組織損傷の両方が補体系レクチンを活性化することが広く理解されている。例えば、Collardらは、酸化ストレスに曝露された内皮細胞が、レクチンによって媒介される豊富な補体沈着を誘発すること（Collard CD et al., Mol Immunol., 36(13-14):941-8, 1999; Collard C.D. et al., Am J Pathol., 156(5):1549-56, 2000）およびレクチン結合性およびレクチン依存補体活性化の遮断が酸化ストレス損傷の実験モデルにおいて転帰を改善すること（Collard C.D. et al., Am J Pathol., 156(5):1549-56, 2000）を実証した。したがって、ドルーゼン中に存在する酸化老廃物もまた、レクチンを介して補体を活性化する可能性が高いと考えられる。推論により、レクチン依存性補体活性化はAMD病原において中枢的な役割を果たし得る。
補体系の役割はAMDのマウスモデルにおいて評価されている。酸化ストレス媒介性光受容体変性の実験モデルである光損傷マウスモデルにおいて、古典経路を排除したノックアウトマウス（C57BL/6バックグラウンド上のC1qα-/-）が、野生型同腹子と比較して、光損傷に対する同じ感受性を有したが、第二経路の補体D因子の排除（CFD-/-）は光損傷からの保護を生じさせた（Rohrer, B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:5282-5289, 2007）。ブルック膜のレーザー光凝固によって誘発された脈絡膜新生血管（CNV）のマウスモデルにおいて、補体因子Bなしノックアウトマウス（CFB-/-）が、野生型マウスと比較して、CNVに対して保護された（Rohrer, B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50:3056-3064, 2009）。同じモデルにおいて、補体活性化の部位に標的化した補体H因子の組換え形態（CR2-fH）の静脈内投与がCNVの範囲を減少させた。この保護効果は、CR2-fHがレーザー損傷時に投与された場合でも、または治療的に（レーザー損傷後に）投与された場合でも認められた。また、CR2-fHのヒト治療バージョン（TT30）がネズミCNVモデルにおいて有効であった（Rohrer, B. et al. J. Ocul. Pharmacol. Ther., 28:402-409, 2012）。fBはLEA-1によって活性化されるため、また、MASP-1およびMASP-3はD因子の成熟に寄与するため、これらの発見は、LEA-1阻害因子がAMD患者において治療上の有益性を有し得ることを暗示する。加えて、フェーズ2実験から報告された最近の結果が、ランパリズマブ（以前はFCFD4514Sおよび抗D因子と呼ばれていた、D因子に対するヒト化モノクローナル抗体の抗原結合断片である）の毎月の硝子体内注射が、AMDに続発する地図状萎縮を示す患者において地図状萎縮区域の進行を軽減することを示した（Yaspan B.L. et al., Sci Transl. Med. 9, Issue 395, June 21, 2017）。
MBL欠損マウスを使用するAMDのげっ歯類モデルにおける初期実験研究は病原性補体活性化におけるレクチン経路の重要な役割を裏付けなかった（Rohrer et al., Mol. Immunol. 48:e1-8, 2011）。しかし、MBLはいくつかのレクチンの1つに過ぎず、MBL以外のレクチンがAMDにおいて補体活性化を誘発する場合がある。事実、本発明者らの以前の研究は、レクチン経路機能のために決定的に必要とされる律速性セリンプロテアーゼであるMASP-2がAMDにおいて重要な役割を果たすことを示した。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,919,094号（Omeros Corporationに譲渡）に記載されているように、MASP-2欠損マウスおよびMASP-2抗体で処置されたマウスは、ウェット型AMDの確証済み前臨床モデルであるレーザー誘発CNVのマウスモデルにおいて保護された（Ryan et al., Tr Am Opth Soc LXXVII:707-745, 1979）。したがって、LEA-2の阻害因子は、AMD患者においてCNVを効果的に予防し、転帰を改善すると予想される。
したがって、上記を考慮して、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、AMDにおいて独立した治療上の有益性を有すると予想される。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、治療有効量のMASP1阻害物質、MASP3阻害物質、またはMASP1/3阻害物質の組み合わせを薬学的担体中に含む組成物を、そのような状態に罹患している対象に投与する工程により、加齢黄斑変性症（ウェット形態およびドライ形態）を治療するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP1、MASP3、またはMASP1/3阻害組成物は、潅注、硝子体内投与、またはゲル、軟膏もしくはドロップの形態にある組成物の適用によって眼に局所投与され得る。または、MASP1、MASP3、またはMASP1/3阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって、対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
一態様において、本発明のこの局面の方法は、加齢黄斑変性症に罹患している対象におけるLEA-2依存性補体活性化を阻害する工程をさらに含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP1/3阻害物質を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、AMD患者において改善された臨床転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP2阻害組成物は、潅注、硝子体内注射またはゲル、軟膏もしくはドロップの形態にある組成物の局所適用などによって眼に局所投与され得る。または、MASP2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および任意のMASP2阻害組成物の適用は、AMD治療の場合、組成物（例えば、MASP-2およびMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、AMD治療の場合、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえばAMDにおける第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、対象におけるAMDを治療するのにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、AMDに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法を提供する。1つの態様において、本発明は、AMDに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するため方法であって、対象におけるAMDを治療するのにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、薬学的組成物を対象に投与する工程を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
C. 虚血再灌流障害におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
組織虚血は広範囲の臨床障害の基礎である。血流の適時回復が虚血組織の保存に不可欠であるが、自然発生的に、または治療的介入によって起こることができる再灌流が、虚血再灌流（I/R）障害と呼ばれる現象である、さらなる組織損傷を招き得ることが長らく認識されている（Eltzschig, H. K. and Tobias, E., Nat. Med. 17:1391-1401, 2011）。I/R障害は、心臓（急性冠症候群）、腎臓（急性腎損傷）、腸（腸I/R）および脳（卒中）のように、単一の臓器を侵襲し得る。I/R障害はまた、大きな外傷および蘇生（多臓器不全）、循環停止（低酸素性脳障害、急性腎損傷）、末梢血管疾患および鎌状赤血球症（急性胸部症候群、急性腎損傷）ののちなど、複数の臓器を冒す場合もある。心臓手術（心肺バイパス後の急性心不全）、胸部手術（急性肺損傷）、末梢血管手術（コンパートメント症候群）、血管手術（急性腎損傷）および固形臓器移植（急性移植片不全）を含む大きな手術がI/R障害と関連する場合もある。現在、I/R障害を標的化する具体的な治療法は存在せず、虚血ゾーンにおける組織のサルベージを最大化し、これらの一般的状況における機能的転帰を改善するために有効な治療の必要性がある。
I/R障害の病態生理は複雑であり、再灌流後の強い炎症反応を特徴とする。補体系の活性化がI/R障害の重要な成分として関与を示唆されており、補体活性の阻害が多様な動物モデルにおいて有効であった（Diepenhorst, G.M.P., et al., Ann. Surg. 249:889-899, 2009）。I/R障害における古典経路、レクチン経路および第二経路の相対的重要性は概ね未決着であり、冒される臓器に依存して異なり得る。最近、特定の補体タンパク質を欠くノックアウトマウスおよび経路特異的阻害因子の可用性が、I/R障害におけるレクチン経路および第二経路の関与を示唆するデータを生成した。
D因子欠損（-/-）マウスおよびヘテロ接合性（+/-）マウスを使用して、胃腸I/R障害における第二経路の役割が研究されている（Stahl, G.L., et al. Am. J. Pathol. 162:449-455, 2003）。一過性胃腸虚血ののち、腸および肺の損傷は、ヘテロ接合性マウスと比較して、D因子欠損マウスにおいて減少したが、予防はされず、D因子（-/-）マウスへのヒトD因子の添加がI/R損傷を回復させた。同じモデルをC1q欠損マウスおよびMBL-A/C欠損マウスにおいて評価すると、結果は、胃腸I/R障害がC1qおよび古典経路の活性化からは独立しているが、腸損傷にはMBLおよびレクチン経路活性化が必要とされることを示した（Hart, M.L., et al. J. Immunol. 174:6373-6380, 2005）。逆に、古典経路のC1q認識分子は腸I/R後の肺損傷の原因であった（Hart, M.L., et al. J. Immunol. 174:6373-6380, 2005）。1つの仮説は、I/R障害中の補体の活性化が、虚血（ただし正常ではない）組織の表面に存在する自己抗原、例えば非筋肉ミオシン重鎖II型への自然なIgM結合を通して起こるということである。マウス胃腸I/R障害モデルにおいて、腸組織からの免疫複合体が、古典（C1q）経路、レクチン（MBL）経路または第二（B因子）経路中の開始因子の存在に関して評価されている（Lee, H., et al., Mol. Immunol. 47:972-981, 2010）。結果は、これらの免疫複合体中、C1qおよびMBLは検出されるが、B因子は検出されないことを示し、古典経路およびレクチン経路の関与を示したが、第二経路の関与を示さなかった。同じモデルにおいて、B因子欠損マウスは局所的組織損傷から保護されず、第二経路の関与の欠如のさらなる裏付けを提供した。胃腸I/R障害におけるレクチン経路の役割がMASP-2欠損マウスにおいて直接評価され、結果は、野生型対照と比較して、これらのマウスにおいて胃腸損傷が減少することを示した。MASP-2モノクローナル抗体による処置も同様に保護的であった（Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011）。要約すると、これらの結果は、胃腸I/R障害におけるレクチン経路の関与の裏付けを提供するが、第二経路の関与に関しては矛盾するデータがある。
マウス心筋I/R障害モデルにおいて、MBL欠損マウスが心筋損傷から保護されるが、C1q欠損およびC2/fB欠損マウスは保護されなかった場合、レクチン経路の病原的役割が実証された（Walsh, M.C. et al., J. Immunol. 175:541-546, 2005）。また、MASP-2欠損マウスにおいても心筋I/R障害からの保護が認められた（Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011）。ラットMBLに対するモノクローナル抗体による心筋I/Rモデルにおけるラットの処置が虚血後再灌流障害の減少を生じさせた（Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413-18, 2001）。血管形成術によって治療された心筋梗塞患者の研究においては、MBL欠損が、MBL充分な対応例と比較して低下した90日死亡率と関連づけられている（M Trendelenburg et al., Eur Heart J. 31:1181, 2010）。さらに、血管形成術後に心機能不全を発症する心筋梗塞患者は、機能回復した患者に比べ、約3倍の高さのMBLレベルを有する（Haahr-Pedersen S., et al., J Inv Cardiology, 21:13, 2009）。また、MBL抗体が、酸化ストレス後、インビトロで内皮細胞上の補体沈着を減少させ、心筋I/R障害におけるレクチン経路の役割を示した（Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-56, 2000）。I/R障害のマウス異所性同系心臓移植モデルにおいては、経路特異的融合タンパク質CR2-fHを使用して第二経路の役割が研究されている（Atkinson, C., et al., J. Immunol. 185:7007-7013, 2010）。移植直後のCR2-fHの全身投与が、心筋I/R障害を、全補体経路を阻害するCR2-Crryによる処置に匹敵し得る程度にまで減少させ、このモデルにおいて第二経路が決定的に重要であることを示した。
腎I/R障害のマウスモデルにおいて、野生型マウスと比較してB因子欠損マウスが腎機能の低下および尿細管損傷から保護された場合、第二経路の関与が示唆された（Thurman, J.M., et al., J. Immunol. 170:1517-1523, 2003）。B因子に対する阻害性モノクローナル抗体による処置が補体活性化を防ぎ、ネズミ腎I/R障害を低下させた（Thurman, J.M., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:707-715, 2006）。両側性腎I/R障害モデルにおいては、MBL-A/C欠損マウスが野生型マウスと比較して腎損傷から保護され、組換えヒトMBLがMBL-A/C欠損マウスにおける保護効果を逆転させ、このモデルにおけるMBLの役割の関与を示唆した（Moller-Kristensen, M., et al., Scand. J. Immunol. 61:426-434, 2005）。ラット一側性腎I/R障害モデルにおいては、MBL-Aに対するモノクローナル抗体によるMBLの阻害がI/R後の腎機能を保存した（van der Pol, P., et al., Am. J. Transplant. 12:877-887, 2010）。興味深いことに、C5抗体による処置は腎損傷を防ぐ効果を示さなかったため、このモデルにおけるMBLの役割は終末補体成分の活性化を伴うとは考えられなかった。むしろ、インビトロでMBLとともにインキュベートされたヒト近位尿細管細胞がMBLを内在化し、その後、細胞死が起こったため、MBLは、尿細管細胞に対して直接的な毒性効果を有すると考えられた。Castellano G.ら（Am J Pathol, 176（4）:1648-59, 2010）は、腎I/R障害のブタモデルにおいて、古典経路中のC1rおよびC1sプロテアーゼならびにレクチン経路のMBL複合体中のMASP-1およびMASP-2プロテアーゼを不可逆的に不活化するC1阻害因子を試験し、C1阻害因子が管周囲毛管および糸球体中の補体沈着を減少させ、尿細管損傷を減少させることを見いだした。
B因子欠損マウスが、野生型マウスと比較して、血清C5aレベルによって測定された全身性補体活性化の低下および外傷後神経細胞死の減少を示したため、第二経路は実験的外傷性脳損傷に関与すると考えられる（Leinhase, I., et al., BMC Neurosci. 7:55-67, 2006）。ヒト卒中において、虚血病変における免疫組織化学的染色によって補体成分C1q、C3cおよびC4dが検出され、古典経路を介する活性化を示唆した（Pedersen, E.D., et al., Scand. J. Immunol. 69:555-562, 2009）。脳虚血の動物モデルにおける古典経路の標的化は入り交じった結果を出し、一部の研究は保護を実証したが、他の研究は有益性を示さなかった（Arumugam, T.V., et al., Neuroscience 158:1074-1089, 2009）。実験および治験がレクチン経路関与の強力な証拠を提供した。実験的卒中モデルにおいて、MBLまたはMASP-2いずれかの欠損が、野生型マウスに比べて梗塞サイズの減少を生じさせる（Cervera A, et al.; PLoS One 3;5(2):e8433, 2010; Osthoff M. et al., PLoS One, 6(6):e21338, 2011）。さらに、MBLレベルが低い卒中患者は、MBL充分な対応患者に比べ、より良好な予後を示す（Osthoff M. et al., PLoS One, 6(6):e21338, 2011）。
心肺バイパスのヒヒモデルにおいて、D因子モノクローナル抗体による処置は、C3a、sC5b-9およびIL-6の血漿レベルによって測定される全身性炎症を阻害し、心筋組織損傷を減少させ、このモデルにおける第二経路の関与を示した（Undar, A., et al., Ann. Thorac. Surg. 74:355-362, 2002）。
したがって、I/Rによって冒される臓器に依存して、3つの補体経路すべてが病原および有害な転帰に寄与することができる。上述の実験および臨床所見に基づき、LEA-2阻害因子は、大部分のI/R状況において保護的であると予想される。LEA-1のレクチン依存性活性化は、少なくともいくつかの状況において第二経路を介する補体活性化を生じさせ得る。加えて、LEA-2開始補体活性化は第二経路増幅ループによってさらに増幅され得、ひいてはI/R関連組織損傷を悪化させ得る。したがって、LEA-1阻害因子は、虚血関連状態に罹患している患者においてさらなるまたは補足的な治療上の有益性を提供すると予想される。
上記を考慮して、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、虚血-再灌流関連状態を治療する際に、虚血-再灌流関連状態を予防する際に、または虚血-再灌流関連状態の重篤度を軽減する際に独立した治療上の有益性を有すると予想される。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べてさらなる治療上の有益性を達成し得る。したがって、I/R関連状態のための最適に有効な治療は、単独で、または組み合わされてLEA-1およびLEA-2の両方を遮断する薬学的有効成分を含む。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質とLEA-2遮断物質との同時投与によって達成され得る。優先的に、LEA-1およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異性結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP1阻害物質、MASP3阻害物質、またはMASP1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、虚血再灌流を経験している対象に投与する工程により、虚血再灌流障害を治療するために、虚血再灌流障害を予防するために、または虚血再灌流障害の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP1、MASP3、またはMASP1/3阻害組成物は、動脈内、静脈内、頭蓋内、筋肉内、皮下、または他の非経口投与によって、また、非ペプチド作動性阻害因子の場合には潜在的に経口的に、最も好適には動脈内または静脈内投与によって対象に投与され得る。本発明のLEA-1阻害組成物の投与は、好適には、虚血再灌流事象の直後またはその後できる限り速やかに開始される。制御された環境内で再灌流が起こる場合（例えば、大動脈瘤修復、臓器移植または切断もしくは損傷した四肢もしくは指の再付着ののち）、LEA-1阻害物質は再灌流の前および/または最中および/または後で投与され得る。投与は、最適な治療効果を得るために、医師による決定に従って定期的に繰り返されてもよい。
いくつかの態様において、方法は、大動脈瘤修復、心肺バイパス、臓器移植および/または四肢/指再移植に関連する血管再吻合、卒中、心筋梗塞ならびにショックおよび/または外科的処置後の血行力学的蘇生の少なくとも1つと関連する虚血-再灌流障害を治療または予防するために使用される。
いくつかの態様において、方法は、臓器移植を受ける予定であるか、受けているか、または受けた対象における虚血-再灌流障害を治療または予防するために使用される。いくつかの態様において、方法は、臓器移植が腎臓移植ではないという条件で、臓器移植を受ける予定であるか、受けているか、または受けた対象における虚血-再灌流障害を治療または予防するために使用される。
一態様において、本発明のこの局面の方法は、虚血再灌流障害を経験している対象におけるLEA-2依存性補体活性化を阻害する工程をさらに含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を対象に投与する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、虚血再灌流障害を治療する際、虚血再灌流障害を予防する際、または虚血再灌流障害の重篤度を軽減する際に、改善された臨床転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP2阻害組成物は、動脈内、静脈内、頭蓋内、筋肉内、皮下、または他の非経口投与によって、および、非ペプチド作動性阻害因子の場合には潜在的に経口的に、最も好適には動脈内または静脈内投与によって、それを必要とする対象に投与され得る。本発明のMASP-2阻害組成物の投与は、好適には、虚血再灌流事象の直後またはその後できる限り速やかに開始される。制御された環境内で再灌流が起こる場合（例えば、大動脈瘤修復、臓器移植または切断もしくは損傷した四肢もしくは指の再付着ののち）、MASP-2阻害物質は再灌流の前および/または最中および/または後で投与され得る。投与は、最適な治療効果を得るために、医師による決定に従って定期的に繰り返されてもよい。
本発明のMASP-3阻害組成物および任意のMASP2阻害組成物の適用は、虚血再灌流障害の治療または予防の場合、組成物（例えば、MASP-2およびMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、虚血再灌流障害を経験している対象の治療の場合、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば虚血再灌流を経験している対象における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、虚血再灌流に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、対象における虚血再灌流と関連する組織損傷を治療するにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、方法を提供する。
D. 炎症性および非炎症性関節炎におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
関節リウマチ（RA）は、全身的な症状発現も有し得る滑膜関節の慢性炎症性疾患である。RAは全世界人口の約1％を冒し、女性の方が2〜3倍かかりやすい。関節の炎症は、腫れ、痛みおよびこわばりとして現れる。疾患が進行するにつれ、関節の侵食および破壊が起こり得、その結果、可動域の障害および変形が生じる。RAの治療目標は、関節損傷の予防および抑制、関節機能損失および疾病進行の予防、症候の軽減および生活の質の改善ならびにドラッグフリー寛解の達成を含む。RAの薬理学的治療は、疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）、鎮痛薬および抗炎症剤（糖質コルチコイドおよび非ステロイド系抗炎症薬）を含む。DMARDは、長期寛解を誘発し、不可逆性である関節破壊の進行を遅延または停止させることができるため、最も重要な治療である。旧来のDMARDの例は、小分子、例えばメトトレキサート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金塩、レフルノミド、D-ペニシラミン、シクロスポリンおよびアザチオプリンを含む。旧来のDMARDが疾病を抑制するのに不十分である場合は、腫瘍壊死因子阻害因子（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴルおよびゴリムマブ）、サイトカインアンタゴニスト（アナキンラおよびトシリズマブ）、リツキシマブおよびアバタセプトのような、炎症細胞または媒介物を標的化するいくつかの生物学的剤が利用可能な治療選択肢である。
T細胞活性化遺伝子との遺伝的関連および自己抗体の存在によって証明されるように、適応免疫がRA病原の中心にあることは明らかであるが、先天免疫機序の関与が示唆されている（McInnes, I.B. and Schett, G. New Engl. J. Med. 365:2205-2219, 2011）。ヒトRAにおいて、第二経路切断断片Bbの滑液レベルは、結晶誘発性関節炎または変形性関節症の患者からの試料の数倍の高さであり、RA患者における第二経路の優先的活性化の関与を示唆した（Brodeur, J.P., et al., Arthritis Rheum. 34:1531-1537, 1991）。関節炎の実験的抗II型コラーゲン抗体受動伝達モデルにおいて、B因子欠損マウスは、野生型マウスと比較して減少した炎症および関節損傷を示したが、一方、C4欠損マウスは、野生型マウスと類似した疾患活性を有し、このモデルにおける、古典経路ではなく第二経路の必要性を示した（Banda, N.K. et al., J. Immunol. 177:1904-1912, 2006）。コラーゲン抗体誘発性関節炎（CAIA）の同じ実験モデルにおいて、古典経路のみが活性またはレクチン経路のみが活性であるマウスは関節炎を発症することができなかった（Banda, N.K. et al., Clin. Exp. Immunol. 159:100-108, 2010）。この研究からのデータは、古典経路またはレクチン経路のいずれかがインビトロで低いレベルのC3を活性化することができることを示唆した。しかし、第二経路増幅ループの非存在において、C3の関節沈着のレベルは、臨床疾患を生じさせるには不十分であった。第二経路の活性化における重要な工程は、MASP-1および/またはMASP-3（Takahashi, M., et al., J. Exp. Med. 207:29-37, 2010）および/またはHTRA1（Stanton et al., Evidence That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration、The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2011 conference on May 4, 2011において発表）によって媒介される、D因子のチモーゲン（プロ因子D）の成熟因子Dへの転換である。MASP-1/3の役割はネズミCAIAにおいて評価され、結果は、MASP-1/3欠損マウスが、野生型マウスと比較して、関節炎から保護されることを示した（Banda, N.K., et al., J. Immunol. 185:5598-5606, 2010）。MASP-1/3欠損マウスにおいて、CAIAの進化中、血清中にプロD因子は検出されたが、成熟D因子は検出されず、ヒトD因子の添加が、これらのマウスからの血清を使用するC3活性化およびC5a生成をインビトロで再構成した。対照的に、関節炎のエフェクター相のネズミモデルにおいて、C3欠損マウスは、WTマウスに比べて非常に軽度の関節炎を発症したが、一方、B因子欠損マウスはなおも関節炎を発症し、古典/レクチン経路および第二経路両方の独立した寄与を示した（Hietala, M.A. et al., Eur. J. Immunol. 34:1208-1216, 2004）。炎症性関節炎のK/BxN T細胞受容体トランスジェニックマウスモデルにおいて、C4またはC1qを欠くマウスは、野生型マウスと同様に関節炎を発症したが、一方、B因子を欠くマウスは、関節炎を発症しなかった、または軽度の関節炎を示し、このモデルにおける、古典経路ではなく第二経路の必要性を実証した（Ji H. et al., Immunity 16:157-168, 2002）。K/BxNモデルにおいて、MBL-Aを欠くマウスは血清誘発性関節炎から保護されなかったが、MBL-Cの役割を研究しなかったため、レクチン経路の潜在的な役割を排除することはできなかった（前記Ji et al., 2002）。
2つの研究グループが、独立して、レクチン依存性補体活性化が、MBLと特異的IgGグリコフォームとの相互作用を介してRA患者における炎症を促進すると提唱している（Malhotra et al., Nat. Med. 1:237-243, 1995; Cuchacovich et al., J. Rheumatol. 23:44-51, 1996）。リウマチ状態が、分子のFc領域における、ガラクトースを欠くIgGグリコフォーム（IgG0グリコフォームと呼ばれる）の顕著な増大と関連することが記されている（Rudd et al., Trends Biotechnology 22:524-30, 2004）。IgG0グリコフォームの割合は、リウマチ状態の疾病進行とともに増加し、患者が寛解に入ると正常に戻る。インビボで、IgG0は滑膜組織に沈着し、MBLはRAの個体中の滑液中に増大したレベルで存在する。RAと関連する凝集アガラクトシルIgG（IgG0）がMBLと結合することができ、したがって、LEA-1および/またはLEA-2を介してレクチン依存性補体活性化を開始させることができる。さらには、RA患者におけるMBLのアレルバリアントを調べた臨床研究からの結果が、MBLはこの疾患において炎症増強的役割を有し得ることを示唆する（Garred et al., J. Rheumatol. 27:26-34, 2000）。したがって、LEA-1および/またはLEA-2を介するレクチン依存性補体活性化はRAの病原において重要な役割を果たし得る。
補体活性化はまた、若年性関節リウマチにおいても重要な役割を果たす（Mollnes, T.E., et al., Arthritis Rheum. 29:1359-64, 1986）。成人RAと同様に、若年性関節リウマチにおいて、C4d（古典またはLEA-2活性化のマーカー）に比べて上昇した、第二経路補体活性化産物Bbの血清および滑液レベルは、補体活性化が主にLEA-1によって媒介されることを示す（El-Ghobarey, A.F. et al., J. Rheumatology 7:453-460, 1980; Agarwal, A., et al., Rheumatology 39:189-192, 2000）。
同様に、補体活性化は、乾癬性関節炎においても重要な役割を果たす。この状態を有する患者は、循環中に増大した補体活性化産物を有し、患者の赤血球は、より低いレベルの補体調節物質CD59を有すると考えられる（Triolo., Clin Exp Rheumatol., 21(2):225-8, 2003）。補体レベルは、疾患活性と関連し、かつ治療転帰を決定するための高い予測値を有する（Chimenti at al., Clin Exp Rheumatol., 30(1):23-30, 2012）。事実、最近の研究が、この状態のための抗TNF療法の効果が補体モジュレーションに起因することを示唆している（Ballanti et al., Autoimmun Rev., 10(10):617-23, 2011）。乾癬性関節炎における補体の正確な役割は決定されていないが、これらの患者の循環中のC4dおよびBb補体活性化産物の存在が病原における重要な役割を示唆する。観察された産物に基づくと、LEA-1およびおそらくはまたLEA-2がこれらの患者における病理的補体活性化の原因であると考えられる。
変形性関節症（OA）は、米国において2500万を超える人々を冒す、最も一般的な形態の関節炎である。OAは、関節軟骨の破壊および最終的な損失を特徴とし、新たな骨形成および滑膜増殖を伴い、痛み、こわばり、関節機能の損失および身体障害を招く。OAによって冒されることが多い関節は、手、首、腰、膝および股関節である。この疾患は進行性であり、現在の治療は症候性疼痛の緩和のための治療であり、疾患の自然経過を変化させるものではない。OAの病原は不明であるが、補体の役割の関与が示唆されている。OA患者からの滑液のプロテオームおよびトランスクリプトーム解析においては、健康な個体からの試料に比べて、古典（C1sおよびC4A）および第二（B因子）経路ならびにC3、C5、C7およびC9を含む補体のいくつかの成分が異常に発現した（Wang, Q., et al., Nat. Med. 17:1674-1679, 2011）。そのうえ、内側半月板切除によって誘発させたOAのマウスモデルにおいては、C5欠損マウスがC5陽性マウスよりも少ない軟骨損失、骨棘形成および滑膜炎を示し、第二経路を阻害する融合タンパク質CR2-fHによる野生型マウスの処置がOAの発症を減らした（前記Wang et al., 2011）。
ロスリバーウイルス（RRV）およびチクングニヤウイルス（CHIKV）は、ヒトにおける急性および持続性関節炎および筋炎を引き起こすことができる蚊媒介性ウイルスの群に属する。風土病を引き起こすことに加えて、これらのウイルスは、何百万もの感染個体を伴う伝染病を引き起こすことができる。関節炎は、関節におけるウイルス複製および宿主炎症反応の誘発によって開始されると考えられ、補体系がこのプロセスにおける重要な成分として起動されている。RRV誘発性多発性関節炎のヒトからの滑液は、OAのヒトからの滑液よりも高いレベルのC3aを含有する（Morrison, T.E., et al., J. Virol. 81:5132-5143, 2007）。RRV感染のマウスモデルにおいて、C3欠損マウスは、野生型マウスと比較して低い重篤度の関節炎を発症し、補体の役割の関与を示唆した（前記Morrison et al., 2007）。関与する特定の補体経路が研究され、不活化レクチン経路を有するマウス（MBL-A-/-およびMBL-C-/-）が、野生型マウスと比較して関節炎を減らした。対照的に、不活化古典経路（C1q-/-）または第二経路（B因子-/-）を有するマウスは重篤な関節炎を発症し、MBLによって開始されたレクチン経路がこのモデルにおいて不可欠な役割を有することを示した（Gunn, B.M., et al., PLoS Pathog. 8:e1002586, 2012）。関節炎は関節への損傷を伴うため、様々な病因によって生じる初期関節損傷がLEA-2を介する補体活性化の二次波を誘発し得る。この概念の裏付けとして、本発明者らの研究は、MASP-2 KOマウスが、RAのコラーゲン誘発モデルにおいて、WTマウスに比べて減少した関節損傷を有することを実証した。
上述した証拠の主体を考慮して、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、単独で、または組み合わされて、関節炎の治療に治療的に有用であると予想される。したがって、関節炎に最適に有効な治療は、単独で、または組み合わされてLEA-1およびLEA-2の両方を遮断することができる薬学的有効成分を含み得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2の阻害は、LEA-1遮断物質とLEA2遮断物質との同時投与によって達成され得る。優先的に、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎に罹患している対象または炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎を発症する危険のある対象に投与する工程により、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、および乾癬性関節炎を含む炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎を治療するために、炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎を予防するために、または炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3、またはMASP1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、皮下、もしくは他の非経口投与または経口投与によって対象に投与され得る。または、投与は、例えば関節内注射による局所送達による投与であってもよい。LEA-1阻害物質は、慢性状態の治療もしくは抑制のために長期間にわたって定期的に投与されてもよいか、あるいは関節に対して実施される外科的処置を含む急性外傷または傷害の前、最中、および/または後の期間に単回または反復投与によって投与されてもよい。
一態様において、本発明のこの局面の方法は、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP1/3阻害物質を対象に投与することにより、炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎（変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、および乾癬性関節炎を含む）に罹患している対象または炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎を発症する危険のある対象におけるLEA-2依存性補体活性化を阻害する工程をさらに含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、関節炎を治療または予防する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性阻害因子の場合には潜在的に経口投与によって、それを必要とする対象に投与され得る。または、投与は、関節内注射などによる局所送達による投与であってもよい。MASP-2阻害物質は、慢性状態の治療もしくは抑制のために長期間にわたって定期的に投与されてもよいか、あるいは関節に対して実施される外科的処置を含む急性外傷または傷害の前、最中、および/または後の期間に単回または反復投与によって投与されてもよい。
本発明のMASP-3阻害組成物および任意のMASP2阻害組成物の適用は、炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎を治療するために、炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎を予防するために、または炎症性関節炎もしくは非炎症性関節炎の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2およびMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、炎症性または非炎症性関節炎に罹患している対象の治療の場合、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば関節炎における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、関節炎（炎症性および非炎症性関節炎）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、対象における関節炎を治療するのにまたはその危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む、薬学的組成物を対象に投与する工程を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、ベーチェット病、感染症関連関節炎、および乾癬性関節炎からなる群より選択される関節炎に罹患している。いくつかの態様において、薬学的組成物は、全身的に（すなわち皮下、筋肉内、静脈内、動脈内または吸入剤として）投与される。いくつかの態様において、薬学的組成物は関節に局所投与される。
E. 播種性血管内凝固（DIC）におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
播種性血管内凝固（DIC）は、出血および/または血栓症として臨床的に現れることができる凝固系の病理的過剰刺激の症候群である。DICは原発性状態としては起こらず、むしろ、組織損傷（外傷、火傷、熱中症、輸血反応、急性移植拒絶反応）、新生物、感染症、産科的状態（前置胎盤、羊水塞栓症、妊娠中毒症）ならびに雑多な状態、例えば心原性ショック、溺水、脂肪塞栓症、大動脈瘤を含む多様な疾患プロセスと関連して起こる。血小板減少症は、集中治療室中の患者において35％〜44％の発生率で頻繁に起こる異常であるが、DICはこれらの症例の約25％の病因である。すなわち、DICは重症患者の約10％において発症する（Levi, M. and Opal, S.M. Crit. Care 10:222-231, 2006）。DICの病態生理は、基礎にある疾患プロセスが生理学的凝固反応を開始させるということである。しかし、血栓症形成促進物質が正常な反対平衡機序を圧倒すると、微小循環中にフィブリンおよび血小板の不適切な沈着が起こり、臓器虚血、低フィブリノゲン血症および血小板減少を招くようになる。DICの診断は、検査値（プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間、フィブリン分解産物、Dダイマーまたは血小板数）の異常と共に、適切な基礎疾患またはプロセスにおける臨床所見に基づく。DICの一次治療は、誘因である基礎疾患に対処することである。臨床合併症を治療または予防するために、赤血球、血小板、新鮮な凍結血漿およびクリオプレシピテートの形態の血液製剤サポートが必要になる場合もある。
DICにおける補体経路の役割がいくつかの研究において研究されている。補体活性化が、髄膜炎菌感染の小児患者において、臨床経過をMBL遺伝子型に関して比較することで評価されている（Sprong, T. et al., Clin. Infect. Dis. 49:1380-1386, 2009）。入院時、MBL欠損患者は、MBL充分な患者よりも低いC3bc、終末補体複合体、C4bcおよびC3bBbPの循環レベルを示し、より低い程度の通常補体、終末補体および第二経路活性化を示した。さらに、DICおよびMBL欠損患者の疾患重篤度およびパラメータと相関させた全身補体活性化の程度がMBL十分な患者よりも緩やか臨床経過を示した。したがって、MBL欠損は感染に対する感受性の危険因子であるが、敗血症性ショック時のMBL欠損はより低い疾患重篤度と関連し得る。
本明細書の実施例1〜4に実証されるように、実験的研究が、髄膜炎菌感染症の病因物質である髄膜炎菌に対する先天免疫反応におけるMBLおよびMASP-1/3の重要な寄与を強調している。マウスまたはヒトからのMBL欠損血清、MASP-3欠損ヒト血清またはMASP-1/3ノックアウトマウスからの血清は、野生型血清に比べて、インビトロで補体を活性化し、髄膜炎菌を溶解する効果が劣る。同様に、ナイーブなMASP-1/3ノックアウトマウスは、その野生型対応種よりもナイセリア感染を受けやすい。したがって、適応免疫の非存在において、LEA-1経路はナイセリア感染に対する先天宿主耐性に寄与する。逆に、LEA-1は、DICを含む有害な宿主反応を誘発する病理的補体活性化を増強する。
動脈血栓症のネズミモデルにおいて、MBLヌルおよびMASP-1/-3ノックアウトマウスは、野生型またはC2/B因子ヌルマウスと比較して減少したFeCl3誘発性血栓形成を示し、欠損は組換えヒトMBLによって再構成された（La Bonte, L.R., et al., J. Immunol. 188:885-891, 2012）。インビトロで、MBLヌルまたはMASP-1/-3ノックアウトマウス血清は、野生型またはC2/B因子ヌルマウス血清と比較して減少したトロンビン基質切断を示した。組換えヒトMASP-1の添加がMASP-1/-3ノックアウトマウス血清中のトロンビン基質切断を回復させた（前記La Bonte et al., 2012）。これらの結果は、MBL/MASP複合体、特にMASP-1が血栓形成において重要な役割を果たし得ることを示す。したがって、LEA-1は、DICを含む病理的血栓症において重要な役割を果たし得る。
実験的研究は、病理的血栓症におけるLEA-2の同等に重要な役割を立証した。インビトロ研究はさらに、LEA-2が補体系と凝固系との間の分子リンクを提供することを実証する。MASP-2は、第Xa因子様活性を有し、切断によってプロトロンビンを活性化してトロンビンを形成し、それがその後、フィブリノゲンを掃去し、フィブリン血餅形成を促進することができる（Krarup et al., PLoS One, 18:2(7):e623, 2007も参照されたい）。
別々の研究によって、レクチン-MASP複合体がMASP-2依存性プロセスにおいて血餅形成、フィブリン沈着、およびフィブリノペプチド放出を促進することができることが示された（Gulla et al., Immunology, 129(4):482-95, 2010）。したがって、LEA-2は、補体系および凝固系のレクチン依存性活性化を同時に促進する。
さらに、インビトロ研究は、MASP-1がトロンビン様活性を有し（Presanis J. S., et al., Mol Immunol, 40(13):921-9, 2004）、フィブリノゲンおよび第XIII因子を切断する（Gulla K. C. et la., Immunology, 129(4):482-95, 2010）ことを示し、LEA-1が、LEA-2から独立して、またはそれと同調して、凝固経路を活性化し得ることを示唆している。
上述したデータは、LEA-1およびLEA-2が、レクチン依存性補体活性化と凝固との間に独立したリンクを提供することを示唆する。したがって、上記を考慮すると、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、播種性血管内凝固に罹患している対象を治療する際に、独立した治療上の有益性を有すると予想される。いくつかの態様において、対象は、敗血症、外傷、感染症（細菌、ウイルス、真菌、寄生虫）、悪性腫瘍、移植拒絶反応、輸血反応、分娩合併症、血管動脈瘤、肝不全、熱射病、熱傷、放射線被曝、ショックまたは重篤な中毒反応（例えばヘビ咬傷、虫刺され、輸血反応）に続発する播種性血管内凝固に罹患している。いくつかの態様において、外傷は神経学的外傷である。いくつかの態様において、感染症は、髄膜炎菌感染のような細菌感染である。
加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得る。LEA-1およびLEA-2はいずれも、DICを生じさせる状態（例えば感染症または外傷など）によって活性化されることが知られているため、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、別々に、または組み合わせのいずれかで、DICの治療において治療有用性を有すると予想される。LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、補体と凝固との間で異なるクロストーク機序を予防し得る。したがって、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、DICおよび他の血栓性障害を予防する際に、相補的、付加的、または相乗的効果を有し得る。
加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断する、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、それを必要とする対象における播種性血管内凝固を治療するために、播種性血管内凝固を予防するために、または播種性血管内凝固の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法であって、MASP-1阻害物質、MASP3阻害物質またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、播種性血管内凝固を経験している対象または播種性血管内凝固を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、方法を提供する。MASP-1、MASP-3またはMASP-1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。外傷または他の急性事象に続発するDICの治療または予防の場合、LEA-1阻害組成物は、DICの危険にあると考えられる患者において、外傷性障害の直後に、または予防的に、外傷誘発性傷害もしくは手術のような状況の前、その最中、その直後、もしくはその1〜7日もしくはそれより長い日数内に、例えば24時間〜72時間以内に投与されてもよい。いくつかの態様において、LEA-1阻害組成物は、好適には、即効性剤形で、例えばLEA-1阻害物質組成物を含有する溶液のボーラスの静脈内または動脈内送達によって投与され得る。
一態様において、本発明のこの局面の方法は、それを必要とする対象における播種性血管内凝固を治療するために、播種性血管内凝固を予防するために、または播種性血管内凝固の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害する工程をさらに含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を対象に投与する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、播種性血管内凝固を治療または予防する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって、それを必要とする対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。外傷または他の急性事象に続発するDICの場合、MASP-2阻害組成物は、DICの危険にあると考えられる患者において、外傷性障害の直後に、または予防的に、外傷誘発性傷害もしくは手術のような状況の前、その最中、その直後、もしくはその1〜7日もしくはそれより長い日数内に、例えば24時間〜72時間以内に投与されてもよい。いくつかの態様において、MASP-2阻害組成物は、好適には、即効性剤形で、例えばMASP-2阻害物質組成物を含有する溶液のボーラスの静脈内または動脈内送達によって投与され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および任意のMASP-2阻害組成物の適用は、それを必要とする対象における播種性血管内凝固を治療するために、播種性血管内凝固を予防するために、または播種性血管内凝固の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2およびMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、播種性血管内凝固を経験している対象または播種性血管内凝固を発症する危険のある対象の治療の場合、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば播種性血管内凝固における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、播種性血管内凝固に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、播種性血管内凝固を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
F. 溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、および血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む血栓性微小血管症（TMA）におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
血栓性微小血管症（TMA）とは、血小板減少症、微小血管症性溶血性貧血および可変性臓器虚血を臨床的特徴とする障害の群をいう。TMAの特徴的な病理学的特徴は、血小板活性化ならびに小細動脈および細静脈中の微小血栓の形成である。古典的TMAは、溶血性尿毒症症候群（HUS）および血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）である。HUSは、急性腎不全の存在によってTTPから区別される。HUSは、2つの形態:下痢関連（D+）または典型HUSおよび下痢を伴わない（D-）または非定型HUS（aHUS）で起こる。
HUS
D+HUSは、通常は大腸菌O157または別の志賀毒素産生性細菌株によって生じる前駆的下痢性疾患を伴い、子供におけるHUS症例の90％超を占め、子供における急性腎不全の最も一般的な原因である。大腸菌（Escherichia coli）O157によるヒト感染は相対的によくあるが、D+HUSまで進行する血性下痢の割合は、散発的症例においては3％〜7％の範囲であり、いくつかの大発生においては20％〜30％であった（Zheng, X.L. and Sadler, J. E., Annu. Rev. Pathol. 3:249-277, 2008）。HUSは通常、下痢発症後4〜6日で発症し、子供の約2/3は疾患の急性期において透析を必要とする。有効であることが示されている特定の治療法がないため、D+HUSの治療は支持的である。D+HUSの予後は良好であり、大多数の患者が腎機能を取り戻す。
D+HUSの病原は、微小血管内皮細胞、単球および血小板上の膜に結合する細菌生産志賀毒素を含む。腎臓の微小血管系が最も頻繁に冒される。結合後、毒素は内在化されて、炎症誘発性媒介物の放出および最終的な細胞死を招く。内皮細胞損傷が、凝固カスケードの活性化を促進することにより、腎微小血管血栓症を誘発すると考えられている。D+HUSにおける補体系の活性化の証拠がある。D+HUSの子供において、BbおよびSC5b-9の血漿レベルが、入院時、正常な対照と比較して増大しており、退院後28日で正常化していた（Thurman, J.M. et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 4:1920-1924, 2009）。古典経路を遮断するエチレングリコール四酢酸の存在において活性化が進行する場合、志賀毒素2（Stx2）がインビトロで主に第二経路を介して流体相中のヒト補体を活性化することが見いだされた（Orth, D. et al., J. Immunol. 182:6394-6400, 2009）。さらには、Stx2は、結合H因子を結合させ、I因子を結合させず、かつ、細胞表面上のH因子の補因子活性を遅延させた（前記Orth, D. et al, 2009）。これらの結果は、志賀毒素が、直接的な毒性効果を含む複数の潜在的機序を通して、また、補体の活性化または補体調節物質の阻害を通して間接的に、腎障害を生じさせ得ることを示唆する。Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011に記載されるように、様々な血管床における補体媒介性再灌流障害の予防におけるMASP-2遮断の有効性によって証明されるように、血管内皮細胞に対する毒性効果がLEA-2を介して補体を活性化すると予想される。
志賀毒素およびリポ多糖の同時注射によって誘発したHUSのネズミモデルにおいて、B因子欠損マウスは、野生型マウスと比較して少ない血小板減少を示し、かつ、腎機能障害から保護され、微小血管血栓症における第二経路のLEA-1依存性活性化の関与を示唆した（Morigi, M. et al., J. Immunol. 187:172-180, 2011）。本明細書に記載されるように、同じモデルにおいて、MASP-2抗体の投与が同じく有効であり、STXチャレンジ後の生存率を増加させて、微小血管血栓症におけるLEA-2依存性補体経路の関与を示唆した。
前記に基づいて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、HUSの治療または予防において独立した治療上の有益性を有すると予想される。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
aHUS
非定型HUSは希少病であり、米国においては100万人あたり2人の推定発生率である（Loirat, C. and Fremeaux-Bacchi, V. Orphanet J. Rare Dis. 6:60-90, 2011）。非定型HUSは任意の年齢で発症することができるが、大多数の患者は小児期に発症を示す。非定型HUSは不均一である。いくつかの症例は家族性であり、いくつかは再発性であり、いくつかは感染症、一般的に上気道または胃腸炎によって誘発される。通常、aHUSの発症は突然であり、大部分の患者は入院時に透析を必要とする。さらなる腎症状発現が患者の約20％に見られ、中枢神経系、心筋梗塞、虚血性遠位壊疽または多臓器不全を含み得る。aHUSの治療は、臓器不全の場合の支持療法、血漿注入または血漿交換、および、エクリズマブ、最近米国および欧州連合において使用を承認された、C5を標的化するヒト化モノクローナル抗体、を含む。aHUSにおける予後はD+HUSにおける予後ほど良くなく、約25％が急性期に死亡し、大部分の生存者は末期腎疾患を発症する。
非定型HUSは、患者の約50％が補体調節タンパク質をコードする遺伝子中に突然変異を有するという点で、補体調節不全の疾患として特徴決定されている（前記Zheng and Sadler, 2008）。大部分の突然変異はH因子（FH）に見られる。他の突然変異は、膜補因子タンパク質（MCP）、I因子（FI）、B因子、およびC3を含む。機能研究が、FH、MCPおよびFIの突然変異は機能の損失、ひいてはより多くの補体活性化を招くが、一方、B因子の突然変異は機能獲得型であることを示した。これらの突然変異の効果は主として第二経路に影響する。突然変異を有する家族の約50％が45歳までに疾患を呈しないため、これらの遺伝的異常は、疾患の唯一の原因というよりも危険因子である（前記Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011）。
H因子は、第二経路補体攻撃から宿主組織を保護する補体制御タンパク質である。FHは第二経路増幅ループを3つの方法で調節する。FHは、C3bを切断するFIの補因子であり、第二経路のC3コンバターゼC3bBbの形成を阻害し、細胞表面および組織マトリックス上のポリアニオンに結合し、C3bの沈着を遮断する（Atkinson, J.P. and Goodship, T. H. J., J. Exp. Med. 6:1245-1248, 2007）。aHUS患者におけるFH突然変異の大多数は、タンパク質のC末端ショートコンセンサスリピートドメインで起こり、ヘパリン、C3bおよび内皮へのFHの不完全な結合を生じさせるが、N末端ドメイン間に存在する血漿C3調節を変化させない（Pickering, M.C. et al., J. Exp. Med. 204:1249-1256, 2007）。FH欠損マウスは、制御されない血漿C3活性化を示し、かつ膜性増殖性糸球体腎炎II型を自然発症するが、aHUSを自然発症しない。しかし、aHUS関連ヒトFH突然変異体に機能的に等しいマウスFHタンパク質を遺伝子導入で発現させたFH欠損マウスはHUSを自然発症するが、膜性増殖性糸球体腎炎II型を自然発症せず、腎臓内皮における第二経路活性化の不完全な制御がFH関連aHUSの病原における重要な事象であるこというインビボ証拠を提供した（前記Pickering et al., 2007）。別の形態のFH関連aHUSが、抗FH自己抗体を有する患者において生じて、FH機能活性の損失を生じさせる。これらの患者の大部分は、5つのFH関連タンパク質をコードする遺伝子に欠失を有する（前記Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011）。
FHと同様に、MCPは、標的細胞上のC3b沈着を調節することにより、補体活性化を阻害する。MCP突然変異は、低いC3b結合および補因子活性を有するタンパク質を生じさせ、したより、調節不全の第二経路活性化を可能にする。FIは、FHおよびMCPのような補因子の存在においてC3bおよびC4bを切断し、それにより、C3およびC5コンバターゼの形成を防ぎ、第二補体経路および古典補体経路の両方を阻害するセリンプロテアーゼである。FI関連aHUS突然変異の大部分は、C3bおよびC4bの分解のための低下したFI活性を生じさせる（前記Zheng and Stadler, 2008）。FBは、第二経路コンバターゼC3bBbの触媒部位を有するチモーゲンである。機能分析は、aHUS関連FB突然変異が第二経路活性化の増大を招くことを示した（前記Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011）。C3におけるヘテロ接合性突然変異がaHUSと関連している。大部分のC3突然変異は、MCPに結合するためのC3の欠損を誘発して、C3bに結合するFBの能力の増大およびC3転換コンバターゼ形成の増大を招く（前記Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011）。したがって、aHUSは、第二経路増幅ループの不十分な制御を招く補体遺伝子における突然変異と密接に関連する疾患である。第二経路増幅ループはB因子タンパク質分解活性に依存するため、かつB因子活性化（MASP-3依存性切断またはMASP-1がD因子の成熟に寄与するD因子媒介性切断のいずれかによる）にはLEA-1が必要であるため、LEA-1遮断物質は、感受性個体における制御されない補体活性化を防ぐと予想される。その結果、LEA-1遮断物質はaHUSを効果的に治療すると予想される。
aHUSにおける調節解除された第二経路増幅ループの中心的役割は広く受け入れられているが、補体活性化を開始するトリガーおよび関与する分子経路は未解明である。上記突然変異を有するすべての個体がaHUSを発症するわけではない。事実、家族研究が、aHUSの浸透率は約50％でしかないことを示唆した（Sullivan M. et al., Ann Hum Genet 74:17-26 2010）。疾患の自然経過は、aHUSが、感染エピソードまたは傷害のような開始事象の後で最も頻繁に発症することを示唆する。感染物質が補体系を活性化することは周知である。既存の適応免疫の非存在において、感染物質による補体活性化は主としてLEA-1またはLEA-2を介して開始され得る。したがって、感染によって誘発されるレクチン依存性補体活性化は、aHUSの素因を有する個体におけるその後の補体活性化の病理的増幅の開始トリガーとなり得、それが最終的に疾患進行を招き得る。したがって、本発明の別の局面は、有効量のLEA-1またはLEA-2阻害物質を投与することにより、感染症に続発するaHUSに罹患している患者を治療することを含む。
宿主組織への損傷の他の形態、特に血管内皮の損傷が、LEA-2を介して補体を活性化する。酸化ストレスを受けたヒト血管内皮細胞は、例えば、レクチンに結合し、かつ補体のLEA-2経路を活性化する表面部分を発現することによって応答する（Collard et al., Am J. Pathol 156（5）:1549-56, 2000）。虚血/再灌流後の血管損傷もまた、インビボでLEA-2を介して補体を活性化する（Moller-Kristensen et al., Scand J Immunol 61（5）:426-34, 2005）。この状況におけるレクチン経路活性化は、宿主にとって病理的な結果を有し、実施例22および23に示されるように、MASP-2を遮断することによるLEA-2の阻害がさらなる宿主組織損傷および有害な転帰を防ぐ（また、前記Schwaeble PNAS, 2011を参照されたい）。
したがって、aHUSを引き起こす他のプロセスもまた、LEA-1またはLEA-2を活性化することが公知である。したがって、LEA-1および/またはLEA-2経路が、遺伝的にaHUSの素因を有する個体において調節解除的に不適切に増幅される初期補体活性化機序となり得、それによってaHUS病原を開始させる可能性が高い。推論により、LEA-1および/またはLEA-2を介して補体の活性化を遮断する作用物質は、aHUS感受性個体における疾患進行を防ぐ、または悪化を軽減すると予想される。
この概念のさらなる裏付けとして、最近の研究は、aHUSの小児症例において肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）を重大な病因物質と同定した（Lee, C. S. et al, Nephrology, 17（1）:48-52 （2012）; Banerjee R. et al., Pediatr Infect Dis J., 30（9）:736-9 （2011））。この特定の病因は、有意な死亡率および長期罹患率をはじめとして、好ましくない予後を有するように考えられる。注目すべきことに、これらの症例は、aHUSの素因をつくることが知られる補体遺伝子における同時発生的突然変異の証拠なしに、微小血管症、尿毒症および溶血の症状発現を招く非腸管感染症を伴った。肺炎連鎖球菌が補体を活性化し、しかも主としてLEA-2を介して補体を活性化するのに特に有効であることに注目することが重要である。したがって、肺炎連鎖球菌感染と関連する非腸管HUSの症例においては、微小血管症、尿毒症および溶血の症状発現は主としてLEA-2の活性化によって駆動されると予想され、MASP-2抗体を含む、LEA-2を遮断する作用物質は、これらの患者におけるaHUSの進行を防ぐ、または疾患重篤度を低下させると予想される。したがって、本発明の別の局面は、有効量のMASP-2阻害物質を投与することにより、肺炎連鎖球菌感染と関連する非腸管aHUSに罹患している患者を治療することを含む。
TTP
血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）は、凝固カスケードまたは補体系を活性化する自己免疫または遺伝性機能不全によって生じる、生命を脅かす血液凝固系の障害である（George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35, 2006）。これは体中の小さな血管中に多数の微細な血餅、すなわち血栓を生じさせ、これがTMAの特徴である。赤血球が剪断応力を受け、それが膜を損傷し、血管内溶血を招く。その結果として生じる血流の減少および内皮損傷が、脳、心臓および腎臓を含む臓器の損傷を生じさせる。TTPは、臨床的には血小板減少症、微小血管症性溶血性貧血、神経学的変化、腎不全および発熱を特徴とする。血漿交換の前の時代には、急性エピソード時の致死率は90％であった。血漿交換を実施してさえ、6ヶ月生存率は約80％である。
TTPは、酵素ADAMTS-13、フォンヴィルブランド因子（vWF）の大きな多量体をより小さな単位に切断する役割を負うメタロプロテアーゼの遺伝的または後天的阻害から生じ得る。ADAMTS-13阻害または欠損は最終的に凝固の増大を生じさせる（Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14:1072-1081, 2003）。ADAMTS-13はvWFの活性を調節する。ADAMTS-13の非存在において、vWFは、より血小板と結合しやすい大きな多量体を形成し、微小血管系中の血小板凝集および血栓症への患者の素因をつくる。
TTPの個体においては、ADAMTS13の突然変異が数多く同定されている。この疾患はまた、ADAMTS-13に対する自己抗体によって発症することができる。加えて、TTPは、乳房、胃腸管または前立腺の癌中（George JN., Oncology （Williston Park）. 25:908-14, 2011）、妊娠（第二期または分娩後）中（George JN., Curr Opin Hematol 10:339-344, 2003）に発症することができるか、またはHIVもしくは全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患と関連している（Hamasaki K, et al., Clin Rheumatol. 22:355-8, 2003）。TTPはまた、ヘパリン、キニーネ、免疫媒介性成分、癌化学療法剤（ブレオマイシン、シスプラチン、シトシンアラビノシド、ダウノマイシンゲムシタビン、マイトマイシンCおよびタモキシフェン）、シクロスポリンA、経口避妊薬、ペニシリン、リファンピンならびにチクロピジンおよびクロピドグレルを含む抗血小板薬を含む特定の薬物療法によって生じることもできる（Azarm, T. et al., J Res Med. Sci., 16:353-357, 2011）。TTPと関連する他の因子または条件は、毒素、例えばハチ毒、敗血症、脾臓隔離、移植、血管炎、血管手術ならびに肺炎連鎖球菌およびサイトメガロウイルスなどの感染症である（Moake JL., N Engl J. Med., 347:589-600, 2002）。肺炎連鎖球菌感染に関連する内皮細胞損傷の結果として一過性の機能的ADAMTS-13欠損によるTTPが起こることができる（Pediatr Nephrol, 26:631-5, 2011）。
血漿交換がTTPの標準的治療である（Rock GA, et al., N Engl J Med 325:393-397, 1991）。血漿交換は、遺伝的欠陥を有する患者におけるADAMTS-13活性を交換し、後天性自己免疫性TTP患者中のADAMTS-13自己抗体を除去する（Tsai, H-M, Hematol Oncol Clin North Am., 21（4）:609-v, 2007）。免疫抑制薬のようなさらなる剤が日常的に治療に追加される（George, JN, N Engl J Med, 354:1927-35, 2006）。しかし、血漿交換は患者の約20％では成功せず、患者の1/3超で再発が起こり、プラズマフェレーシスは費用を要し、かつ技術的に要求が厳しい。さらに、多くの患者は血漿交換に耐えることができない。その結果、TTPのためのさらなるより良い治療の危急の必要性が残る。
TTPは血液凝固カスケードの障害であるため、補体系のアンタゴニストによる処置が、疾病を安定化して治すことを支援し得る。第二補体経路の病理的活性化がaHUSに関連しているが、TTPにおける補体活性化の役割はそれほど明確ではない。ADAMTS13の機能欠損がTTPへの感受性にとって重要であるが、それは急性エピソードを生じさせるのに十分ではない。環境要因および/または他の遺伝的変異がTTPの症状発現に寄与し得る。例えば、凝固カスケードの調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子、vWF、血小板機能、内皮血管表面の成分または補体系が、急性血栓性微小血管症の発症に関与し得る（Galbusera, M. et al., Haematologica, 94:166-170, 2009）。特に、補体活性化が重要な役割を果たすことが示されている。ADAMTS-13欠損に関連した血栓性微小血管症からの血清が、C3およびMAC沈着ならびにその後の好中球活性化を生じさせることが示されており、それを補体不活性化によって抑止することができた（Ruiz-Torres MP, et al., Thromb Haemost, 93:443-52, 2005）。加えて、最近、TTPの急性エピソードの間、古典、レクチンおよび第二経路の活性化と合致する、C4d、C3bBbP、およびC3aのレベルの増大があることが示された（M. Reti et al., J Thromb Haemost. 10(5):791-798, 2012）。急性エピソードにおける補体活性化のこの増量が、終末経路活性化を開始し得、かつTTPのさらなる悪化の原因であり得る。
TTPにおけるADAMTS-13およびvWFの役割が、明らかに、血小板の活性化および凝集ならびに微小血管症における剪断応力および沈着におけるそれらのその後の役割の原因である。活性化された血小板は、補体の古典経路および第二経路の両方と相互作用し、それらを誘発する。血小板媒介性補体活性化が炎症媒介物C3aおよびC5aを増大させる（Peerschke E. et al., Mol Immunol, 47:2170-5 (2010)）。したがって、血小板は、遺伝性または自己免疫性TTPにおける古典補体活性化の標的として働き得る。
上記のように、MASP-1のトロンビン様活性およびLEA-2媒介性プロトロンビン活性化のせいで起こる補体のレクチン依存性活性化が、HUSにおいて起こる凝固および微小血管血栓症に内皮損傷を関連させる支配的な分子経路である。同様に、LEA-1およびLEA-2の活性化がTTPにおいて凝固系を直接駆動し得る。LEA-1およびLEA-2経路活性化は、TTPにおけるADAMTS-13欠損によって生じる初期内皮損傷に応答して開始され得る。したがって、MASP-2機能、MASP-1機能、MASP-3機能またはMASP-1およびMASP-3機能を遮断する抗体を含むがこれらに限定されることがないLEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子が、TTPに罹患している患者における微小血管凝固、血栓症および溶血と関連する微小血管症を緩和すると予想される。
TTPに罹患している患者は通常、緊急治療室中、紫斑病、腎不全、低血小板、貧血および/または卒中を含む血栓症の1つまたは複数を呈する。TTPの現在の標準治療は、2週間またはそれより長い期間の、一般的には週3回であるが最大毎日の交換プラズマフェレーシスのカテーテル内送達（例えば、静脈内または他の形態のカテーテル）を含む。対象がADAMTS13の阻害因子（すなわち、ADAMTS13に対する内在性抗体）の存在に関する検査で陽性の場合は、プラズマフェレーシスは、免疫抑制療法（例えばコルチコステロイド、リツキサンまたはシクロスポリン）と組み合わせて実施されてもよい。難治性TTP（TTP患者の約20％）の対象は、少なくとも2週間はプラズマフェレーシス治療に応答しない。
前記に従って、一態様において、TTPの初期診断の状況において、またはTTPの診断と合致する1つまたは複数の症候（例えば、中枢神経系合併症、重篤な血小板減少（アスピリンオフの場合は5000個/μL未満または5000個/μL、アスピリンオンの場合は20,000個/μL未満または20,000個/μLの血小板計数値）、重篤な心臓合併症、重篤な肺合併症、胃腸梗塞または壊疽）を示す対象において、プラズマフェレーシスの非存在における、またはプラズマフェレーシスと併用される第一の療法として、有効量のLEA-2阻害物質（例えばMASP-2抗体）またはLEA-1阻害物質（例えばMASP-1またはMASP-3抗体）によって対象を治療するための方法が提供される。第一の療法として、LEA-1阻害物質および/またはLEA-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下または他の非経口投与によって対象に投与され得る。いくつかの態様において、LEA-1阻害物質および/またはLEA-2阻害物質は、プラズマフェレーシスの潜在的な合併症、例えば出血、感染症ならびに血漿ドナーに固有の障害および/またはアレルギーへの曝露を避けるために、または他の点でプラズマフェレーシスを嫌がる対象において、またはプラズマフェレーシスが利用できない状況において、プラズマフェレーシスの非存在における第一の療法として対象に投与され得る。いくつかの態様において、LEA-1阻害物質および/またはLEA-2阻害物質は、免疫抑制剤（例えばコルチコステロイド、リツキサンまたはシクロスポリン）と組み合わせて（同時投与を含む）および/または濃縮ADAMTS-13と組み合わせて、TTPに罹患している対象に投与される。
いくつかの態様において、方法は、第一の期間（例えば、少なくとも1日〜1週または2週にわたる急性期）中、LEA-1および/またはLEA-2阻害物質をカテーテルによって（例えば静脈内で）TTPに罹患している対象に投与したのち、第二の期間（例えば少なくとも2週またはそれより長い慢性期）中、LEA-1および/またはLEA-2阻害物質を対象に皮下に投与する工程を含む。いくつかの態様において、第一および/または第二の期間の投与はプラズマフェレーシスの非存在において実施される。いくつかの態様において、方法は、対象がTTPに関連する1つまたは複数の症候に罹患していることを防ぐように維持するために使用される。
別の態様において、TTPの1つまたは複数の症候を軽減するのに有効な量のLEA-1および/またはLEA-2阻害因子を投与する工程により、難治性TTPに罹患している対象（すなわち、少なくとも2週間のプラズマフェレーシス治療に応答していない対象）を治療するための方法が提供される。一態様において、LEA-1および/またはLEA-2阻害因子は、少なくとも2週間またはそれより長い期間にわたり長期的に、皮下投与または他の非経口投与によって難治性TTPの対象に投与される。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
いくつかの態様において、方法はさらに、治療の前および任意で治療中に対象において少なくとも1つの補体因子（例えばC3、C5）のレベルを測定する工程を含み、基準値または健康な対照対象に比べた場合の少なくとも1つの補体因子のレベルの低下の測定がLEA-1および/またはLEA-2阻害物質による治療継続の必要性を示す。
いくつかの態様において、方法は、TTPに罹患している対象またはTTPを発症する危険のある対象にLEA-1および/またはLEA-2阻害物質を皮下にまたは静脈に投与する工程を含む。治療は、好ましくは毎日であるが、月1回の頻度であることもできる。治療は、少なくとも連続2日間、対象の血小板計数値が150,000個/mlを超えるまで継続される。
要約すると、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、HUS、aHUSおよびTTPを含むTMAの治療において独立した治療上の有益性を有すると予想される。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成するか、またはバリアント型のTMAに罹患しているより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得ると予想される。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3またはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP1阻害物質、MASP3阻害物質またはMASP1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、血栓性微小血管症に罹患している対象または血栓性微小血管症を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、溶血性尿毒症症候群（HUS）、非定型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、もしくは血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）などの血栓性微小血管症を治療するために、該血栓性微小血管症を予防するために、または該血栓性微小血管症の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP1、MASP3またはMASP1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
一態様において、本発明のこの局面の方法は、溶血性尿毒症症候群（HUS）、非定型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、もしくは血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）などの血栓性微小血管症を治療するために、該血栓性微小血管症を予防するために、または該血栓性微小血管症の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害する工程をさらに含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、血栓性微小血管症に罹患している対象または血栓性微小血管症を発症する危険のある対象に投与する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、血栓性微小血管症を治療する際に、血栓性微小血管症を予防する際に、または血栓性微小血管症の重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および任意のMASP-2阻害組成物の適用は、血栓性微小血管症に罹患している対象または血栓性微小血管症を発症する危険のある対象における血栓性微小血管症を治療するために、血栓性微小血管症を予防するために、または血栓性微小血管症の重篤度を軽減するために、組成物の単回投与（例えば、MASP-2およびMASP-3阻害物質または二重特異性阻害物質もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物、または別々の組成物の同時投与）または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回などの定期的間隔で投与され得る。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば血栓性微小血管症（たとえば溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、血栓性微小血管症（たとえば溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、血栓性微小血管症（たとえば溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植後TMA（TA-TMA）を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
G. 喘息におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
喘息は一般的な慢性炎症性気道疾患である。米国においては、18歳未満の子供700万人を含む約2500万人が喘息を有し、半分超が年に少なくとも一度は喘息発作を経験し、毎年170万を超える救急外来訪問数および450,000件の入院をもたらしている（ワールドワイドウェブ、gov/health/prof/lung/asthma/naci/asthma-info/index.htm.、2012年5月4日アクセス時点）。この疾患は不均一であり、複数の臨床表現型を有する。最も一般的な表現型はアレルギー性喘息である。他の表現型は、非アレルギー性喘息、アスピリン悪化呼吸器疾患、感染後喘息、職業性喘息、空気中の刺激物誘発性喘息および運動誘発性喘息を含む。アレルギー性喘息の主要な特徴は、多様な特定および不特定刺激への気道過敏性（AHR）、過度の気道粘液産生、肺好酸球増大および血清IgE濃度上昇を含む。喘息の症候は、咳、喘鳴、胸苦しさおよび息切れを含む。喘息治療の目標は、疾患を制御し、悪化、日常的な症候を最小限にし、患者が肉体的に活動的であることを可能にすることである。現在の治療指針は、喘息抑制が達成されるまでの段階的治療を奨励している。最初の治療ステップは、必要に応じて、速効性吸入β2アゴニストののち、長期管理薬、例えば吸入コルチコステロイド、長時間作用性吸入β2アゴニスト、ロイコトリエン修飾薬、テオフィリン、経口糖質コルチコステロイド、および抗IgEモノクローナル抗体である。
喘息は、病原的に多因子性であるが、概して、遺伝的に感受性の個体における一般的な環境抗原に対する不適切な免疫反応の結果として生じることが認められている。喘息は補体活性化と関連し、アナフィラトキシン（AT）C3aおよびC5aが、アレルギー反応の発生およびモジュレーションに関連する炎症誘発性および免疫調節性を有する（Zhang, X. and Kohl, J. Expert. Rev. Clin. Immunol., 6:269-277, 2010）。しかし、喘息における補体の古典、第二およびレクチン経路の相対的関与は十分には理解されていない。第二経路はアレルゲンの表面上で活性化され得、レクチン経路はアレルゲンの多糖構造の認識によって活性化され得、両プロセスがATの生成を招く。補体は、関与する原因アレルゲンに依存して異なる経路によって活性化され得る。例えばヒカゲミズ（Parietaria）科の高度にアレルギー性の花粉は、C4のMBL依存性活性化を促進するのに非常に有効であり、LEA-2の関与が示唆される。逆に、チリダニアレルゲンは補体活性化のためにMBLを必要としない（Varga et al. Mol Immunol., 39(14):839-46, 2003）。
喘息の環境トリガーが第二経路によって補体を活性化し得る。例えば、タバコの煙またはディーゼル排気粒子へのヒト血清のインビトロ曝露が補体の活性化をもたらし、その効果はEDTAの存在によって影響を受けず、活性化が、古典経路を介するものではなく、第二経路を介するものであることを示唆した（Robbins, R.A. et al, Am. J. Physiol. 260:L254-L259, 1991; Kanemitsu, H., et al., Biol. Pharm. Bull. 21:129-132, 1998）。アレルギー性気道炎症における補体経路の役割が、マウスオボアルブミン感作およびチャレンジモデルにおいて評価された。野生型マウスは、空気アレルゲンチャレンジに応答してAHRおよび気道炎症を発症した。補体活性化のすべての経路を阻害するCrry-Ig融合タンパク質が、アレルギー性肺炎症のマウスオボアルブミンモデルにおいて吸入によって全身または局所投与された場合、AHRおよび肺炎症を防ぐのに有効であった（Taube et al., Am J Respir Crit Care Med., 168(11):1333-41, 2003）。
B因子欠損マウスは、野生型マウスに比べて少ないAHRおよび気道炎症を示したが、一方、C4欠損マウスは野生型マウスと同様な効果を示した（Taube, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:8084-8089, 2006）。これらの結果は、ネズミ空気アレルゲンチャレンジモデルにおける、古典経路関与ではなく第二経路関与の役割を裏付ける。第二経路の重要性のさらなる証拠が、同じマウスモデルを使用するH因子（FH）の研究において提供された（Takeda, K., et al., J. Immunol. 188:661-667, 2012）。FHは、第二経路の負の調節物質であり、自己組織の自家性損傷を防ぐように働く。内在性FHは、アレルゲンチャレンジ中に気道中に存在することが見いだされ、組換え競合的アンタゴニストによるFHの阻害がAHRおよび気道炎症の程度を増大させた（前記Takeda et al., 2012）。CR2-fH、fHの補体調節活性を既存の補体活性化の部位に標的化するFHの補体調節領域にCR2のiC3b/C3d結合領域をリンクするキメラタンパク質の治療的送達が、アレルゲンチャレンジ後、AHRの発症および気道への好酸球浸潤を防いだ（前記Takeda et al., 2012）。保護効果は、オボアルブミンと、ヒトにおける関連アレルゲンであるブタクサアレルゲンとを使用して実証された。
喘息におけるレクチン依存性補体活性化の役割が真菌喘息のマウスモデルにおいて評価された（Hogaboam et al., J. Leukocyte Biol. 75:805-814, 2004）。これらの研究は、レクチン補体経路の活性化のための認識成分として機能する糖質結合タンパク質であるマンナン結合レクチンA（MBL-A）を遺伝的に欠くマウスを使用した。MBL-A（+/+）およびMBL-A（-/-）アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）感作マウスが、A.フミガーツス分生子によるi.t.チャレンジののち4日目および28日目に試験された。感作MBL-A（-/-）マウスにおけるAHRは、感作MBL-A（+/+）群と比較して、分生子チャレンジ後の両時点で有意に減衰していた。分生子後4日目、肺TH2サイトカインレベル（IL-4、IL-5、およびIL-13）は、野生型群と比較して、A.フミガーツス感作MBL-A（-/-）において有意に低かった。これらの結果は、MBL-Aおよびレクチン経路が慢性真菌喘息中のAHRの発症および維持において重要な役割を有することを示す。
上述された発見は、喘息の病原におけるレクチン依存性補体活性化の関与を示唆する。実験データは、B因子活性化が中枢的役割を果たすことを示唆する。レクチン依存性B因子活性化およびその後の第二経路活性化におけるLEA-1の基本的な役割を鑑みると、LEA-1遮断物質が、第二経路によって媒介される特定の形態の喘息の治療に有益であると予想される。したがって、このような処置は、チリダニ誘発性喘息またはタバコの煙もしくはディーゼル排気のような環境トリガーによって生じる喘息において特に有用であり得る。他方、花粉によって誘発される喘息反応は、LEA-2依存性補体活性化を生じさせる可能性が高い。したがって、LEA-2遮断物質は、患者のこのサブセットにおける喘息状態を治療するのに特に有用であると予想される。
上述されたデータを考慮して、本発明者らは、LEA-1およびLEA-2が喘息における病理的補体活性化を媒介すると考える。誘因性アレルギー物質に依存して、LEA-1またはLEA-2が優先的に関与し得る。したがって、LEA-2遮断物質と組み合わせたLEA-1遮断物質は、基礎にある病因にかかわらず、複数の形態の喘息の治療に有用性を有し得る。LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、肺の炎症および喘息の症候を予防する際、治療する際、または好転させる際に、相補的、付加的、または相乗的効果を有し得る。
組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、喘息に罹患している対象または喘息を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、喘息を治療するために、喘息を予防するために、または喘息の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3またはMASP-1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
一態様において、本発明のこの局面の方法は、喘息を治療するために、喘息を予防するために、または喘息の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害する工程をさらに含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、喘息に罹患している対象または喘息を発症する危険のある対象に投与する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、喘息を治療する際、または喘息を予防する際、または喘息の重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、かつ第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、かつ、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および任意のMASP-2阻害組成物の適用は、喘息に罹患している対象または喘息を発症する危険のある対象における喘息を治療するために、喘息を予防するために、または喘息の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2およびMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば喘息における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、喘息に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、喘息を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
H. デンスデポジット病におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）は、メサンギウム細胞増殖と、メサンギウムの内皮下延長による糸球体毛細血管壁の肥厚とを形態学的特徴とする腎障害である。MPGNは原発性（特発性とも呼ばれる）または続発性に分類され、感染症、全身性免疫複合体疾患、新生物、慢性肝疾患などのような基礎疾患を有する。特発性MPGNは3つの形態学的タイプを含む。I型、すなわち古典的MPGNは、免疫複合体の内皮下沈着物および古典補体経路の活性化を特徴とする。II型、すなわちデンスデポジット病（DDD）は、さらなる膜内高密度沈着物を特徴とする。III型はさらなる上皮下沈着物を特徴とする。特発性MPGNは希であり、ネフローゼ症候群の原発性腎原因の約4〜7％しか占めない（Alchi, B. and Jayne, D. Pediatr. Nephrol. 25:1409-1418, 2010）。MPGNは、主として子供および若年成人を冒し、ネフローゼ症候群、急性腎炎症候群、無症候性タンパク尿および血尿または再発性肉眼的血尿として現れ得る。腎機能不全が大多数の患者において起こり、疾患は、ゆっくり進行する経過をたどり、患者の約40％が診断から10年以内に末期腎疾患を発症する（前記Alchi and Jayne, 2010）。現在の治療選択肢は、コルチコステロイド、免疫抑制剤、抗血小板レジメンおよび血漿交換を含む。
DDDは、腎生検材料の免疫蛍光染色により、免疫グロブリンの非存在およびC3の存在によって診断され、電子顕微鏡検査が、糸球体基底膜に沿って特徴的な高密度オスミン酸親和性沈着物を示す。DDDは、多くの異なる機序から生じることができる補体の第二経路の調節不全によって生じる（Sethi et al, Clin J Am Soc Nephrol. 6（5）:1009-17, 2011）。DDDにおける最も一般的な補体系異常は、その半減期、ひいては経路の活性化を増大させる第二経路C3コンバターゼ（C3bBb）に対する自己抗体であるC3腎炎因子の存在である（Smith, R.J.H. et al., Mol. Immunol. 48:1604-1610, 2011）。他の第二経路異常は、H因子の機能を遮断するH因子自己抗体、機能C3突然変異の増大およびH因子の遺伝的欠損を含む（前記Smith et al., 2011）。最近の症例報告が、エクリズマブ（抗C5モノクローナル抗体）治療が2名のDDD患者における腎機能の改善と関連したことを示し（Daina, E. et al., New Engl. J. Med. 366:1161-1163, 2012; Vivarelli, M. et al., New Engl. J. Med. 366:1163-1165, 2012）、腎転帰における補体活性化の原因的役割を示唆している。
上記の遺伝的、機能的および免疫組織化学的および逸話的臨床データを考慮すると、DDDの病原における補体の中心的役割は十分に立証される。したがって、補体活性化の疾患原因機序またはその後の補体活性化産物を遮断する処置がこの状態を治療するのに治療的に有用であると予想される。
ヒト遺伝データが、第二経路増幅ループの不適切な制御または過度の活性化が重要な役割を果たすことを示唆するが、補体開始事象は特定されていない。腎生検材料の免疫組織化学的研究が患部組織におけるMBL沈着の証拠を示し、DDDにおける病理的補体活性化の開始におけるレクチン経路の関与を示唆している（Lhotta et al, Nephrol Dial Transplant., 14(4):881-6, 1999）。第二経路の重要性はさらに実験モデルにおいて確証されている。H因子欠損マウスは、進行性の蛋白尿と、ヒト状態に特徴的な腎病理的病変とを発症する（Pickering et al., Nat Genet., 31(4):424, 2002）。Pickeringらはさらに、第二経路のLEA-1依存性活性化を媒介するB因子の消失がH因子欠損マウスをDDDから完全に保護することを実証した（Pickering et al., Nat Genet., 31(4):424, 2002）。
したがって、LEA-1を遮断する作用物質は第二経路のレクチン依存性活性化を効果的に遮断し、それにより、DDDのための有効な治療を提供すると予想される。第二経路増幅ループがDDD患者において調節不全であることを考慮すると、増幅ループを遮断する作用物質が有効であるとさらに予想することができる。MASP-1またはMASP-1およびMASP-3を遮断するLEA-1標的化作用物質はD因子の成熟を阻害するため、そのような作用物質は第二経路増幅ループを効果的に遮断すると予測される。
上述したように、顕著なMBL沈着が患部腎標本中に発見されて、DDD病原におけるレクチン駆動型活性化事象の考えられる関与を強調した。ひとたび糸球体毛細血管の初期組織損傷が立証されると、損傷した糸球体内皮および下層にあるメサンギウム構造へのさらなるMBL結合が起こる可能性は高い。このような組織損傷がLEA-2の活性化を招き、それがひいてはさらなる補体活性化を生じさせることができることは周知である。したがって、LEA-2遮断物質はまた、損傷した糸球体構造におけるさらなる補体活性化を防ぐのに有用性を有し、ひいては、末期腎不全に向かうさらなる疾病進行を阻止すると予想される。
上述したデータは、LEA-1およびLEA-2がDDDにおいて別々の病理的補体活性化プロセスを促進することを示唆する。したがって、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、単独で、または組み合わされてのいずれかで、DDDを治療するのに有用であると予想される。
併用されると、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、いずれか単独の場合よりも高い有効性を示す、または様々な病期の疾患を治療するのに有用であると予想される。したがって、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、DDD関連腎機能不全を予防する際、治療する際、または好転させる際に、相補的、付加的、または相乗的効果を有し得る。
組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、阻害機能を有するLEA-1およびLEA-2遮断物質は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP1阻害物質、MASP3阻害物質、またはMASP1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、デンスデポジット病に罹患している対象またはデンスデポジット病を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、デンスデポジット病を治療するために、デンスデポジット病を予防するために、またはデンスデポジット病の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
別の局面において、治療有効量のMASP-2阻害物質を、デンスデポジット病に罹患している対象またはデンスデポジット病を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、デンスデポジット病を治療するために、デンスデポジット病を予防するために、またはデンスデポジット病の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害するための方法が提供される。別の局面において、デンスデポジット病を治療するために、デンスデポジット病を予防するために、またはデンスデポジット病の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、デンスデポジット病に罹患している対象またはデンスデポジット病を発症する危険のある対象に投与する工程を含む方法が提供される。
いくつかの態様において、方法は、LEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、デンスデポジット病を治療する際、デンスデポジット病を予防する際、またはデンスデポジット病の重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
LEA-1阻害物質および/またはLEA-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および/またはMASP-2阻害組成物の適用は、それを必要とする対象におけるデンスデポジット病を治療するために、デンスデポジット病を予防するために、またはデンスデポジット病の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2および/またはMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえばデンスデポジット病における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、デンスデポジット病に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、デンスデポジット病を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
I. 微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎（NCGN）は、糸球体毛細血管壁が炎症の徴候を示すが、糸球体基底膜に対する微量の検出可能な免疫複合体沈着または抗体を有する急速進行性糸球体腎炎の一形態である。状態は腎機能の急速な低下を伴う。大部分のNCGN患者が、抗好中球細胞質自己抗体（ANCA）を有することがわかっており、したがって、ANCA関連血管炎と呼ばれる疾患の群に属する。血管炎は、血管壁の炎症およびフィブリノイド壊死を特徴とする血管の障害である。全身性血管炎は、血管サイズ:大、中、小に基づいて分類される。小血管血管炎のいくつかの形態は、ANCAの存在、すなわちヴェーゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群および腎限定的血管炎（NCGN）を伴う。それらはまた、全身性エリテマトーデスのような基礎疾患の症状発現であることもできる。ANCAの標的抗原はプロテイナーゼ-3（PR3）およびミエロペルオキシダーゼ（MPO）を含む。微量免疫型NCGNは珍しく、英国ウェセックス（Wessex）において100万人あたり約4人の発生率が報告されている（Hedger, N. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 15:1593-1599, 2000）。微量免疫型NCGN患者128名のウェセックス群においては、73％がANCA陽性であり、患者の59％が初期透析を必要とし、36％が長期透析を必要とした。微量免疫型NCGNの治療は、コルチコステロイドならびにシクロホスファミドおよびアザチオプリンのような免疫抑制剤を含む。ANCA関連血管炎のさらなる治療選択肢はリツキシマブおよび血漿交換を含む（Chen, M. and Kallenberg, C.G.M. Nat. Rev. Rheumatol. 6:653-664, 2010）。
NCGNは微量の補体沈着を特徴とするが、補体の第二経路がその病原における関与を示唆されている。MPO-ANCA関連微量免疫型NCGN患者7名の腎生検材料評価が、膜攻撃複合体、C3d、B因子およびP因子の存在を検出したが（正常な対照または微小変化疾患の患者からの生検材料中には検出されなかった）、一方、C4dおよびマンノース結合レクチンは検出されず、第二経路の選択的活性化を示唆した（Xing, G. Q. et al. J. Clin. Immunol. 29:282-291, 2009）。実験的NCGNは、抗MPO IgGを野生型マウスに移入すること、または抗MPO脾細胞を免疫欠損マウスに移入することによって誘発することができる（Xiao, H. et al. J. Clin. Invest. 110:955-963, 2002）。NCGNのこのマウスモデルにおいては、ノックアウトマウスを使用して特定の補体活性化経路の役割が研究されている。抗MPO IgGの注射後、C4-/-マウスは、野生型マウスに匹敵する腎疾患を発症したが、一方、C5-/-およびB因子-/-マウスは腎疾患を発症せず、第二経路がこのモデルに関与していたが、古典およびレクチン経路は関与していなかったことを示した（Xiao, H. et al. Am. J. Pathol. 170:52-64, 2007）。そのうえ、TNFでプライミングされたヒト好中球を有する患者からのMPO-ANCAまたはPR3-ANCA IgGのインキュベーションが、C3aの生成によって検出されるような正常ヒト血清中の補体活性化を生じさせる因子の放出を生じさせた。この効果は、健康な対象からのIgGでは観察されず、好中球および補体活性化におけるANCAの潜在的な病原的役割を示唆した（前記Xiao et al., 2007）。
この状態における第二経路に関して上記に概説した役割に基づくと、第二経路の活性化を遮断することがANCA陽性NCGNの治療において有用性を有すると予想される。病原のためのfB活性化の要件を考慮すると、LEA-1の阻害因子は、この症状を治療し、これらの患者における腎機能のさらなる低下を防ぐのに特に有用であると予想される。
さらに別の患者サブセットが、ANCAの非存在において腎機能の急速な低下を伴う半月体形成を示す進行性腎血管炎を発症する。この形態の状態はANCA陰性NCGNと呼ばれ、微量免疫型NCGNの全患者の約1/3を構成する（Chen et al, JASN 18（2）:599-605, 2007）。これらの患者は比較的若い傾向にあり、腎転帰は特に重篤になる傾向にある（Chen et al., Nat Rev Nephrol., 5(6):313-8, 2009）。これらの患者の弁別的な病理学的特徴は腎病変中のMBLおよびC4dの沈着である（Xing et al., J Clin Immunol. 30(1):144-56, 2010）。腎生検材料におけるMBLおよびC4d染色強度は腎機能と負に相関した（前記Xing et al., 2010）。これらの発見は、病原におけるレクチン依存性補体活性化の重要な役割を示唆している。患部組織標本中にB因子ではなくC4dが一般に見いだされるという事実がLEA-2関与を示す。
上記のANCA陰性NCGNにおけるレクチン依存性補体活性化の役割に基づくと、LEA-2経路の活性化を遮断することがANCA陰性NCGNの治療において有用性を有するとが予想される。
上記に詳述されたデータは、LEA-1およびLEA-2が、それぞれANCA陽性NCGNおよびANCA陰性NCGNにおいて病理的補体活性化を媒介することを示唆する。したがって、LEA-2遮断物質と組み合わせたLEA-1遮断物質は、基礎にある病因にかかわらず、すべての形態の微量免疫型NCGNの治療に有用性を有すると予想される。したがって、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質は、NCGN関連腎機能不全を予防する際、治療する際、または好転させる際に、相補的、付加的、または相乗的効果を有し得る。
LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎に罹患している対象または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を治療するために、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を予防するために、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3またはMASP-1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
別の局面において、治療有効量のMASP-2阻害物質を、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎に罹患している対象または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を治療するために、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を予防するために、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害するための方法が提供される。別の局面において、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を治療するために、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を予防するために、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法が提供される。
いくつかの態様において、方法は、LEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を治療する際、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を予防する際、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎の重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および/またはMASP-2阻害組成物の適用は、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を治療するために、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎を予防するために、または微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2および/またはMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎（NCGN）における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎（NCGN）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎（NCGN）を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
J. 外傷性脳損傷におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
外傷性脳損傷（TBI）は、毎年少なくとも1000万人の死亡または入院をもたらす主要な全世界的健康問題である（Langlois, J.A. et al., J. Head Trauma Rehabil. 21:375-378, 2006）。2003年、米国においては、120万件の救急外来訪問、29万件の入院および51,000件の死亡を含め、推定160万件のTBIがあった（Rutland-Brown, W. et al., J. Head Trauma Rehabil. 21:544-548, 2006）。米国におけるTBIの大多数は転倒および交通事故によって生じる。TBIは長期または一生涯の身体的、認知的、行動的および情動的後遺症をもたらす可能性がある。500万を超える米国人がTBI関連の長期または一生涯の身体障害とともに生きている（前記Langlois et al., 2006）。
TBIは、脳実質の穿通（「穿通性」損傷）または脳を穿通しない損傷（「閉鎖性」損傷）を含み得る。損傷プロファイルおよび関連する神経行動的後遺症は、穿通性TBIと閉鎖性TBIとの間でかなり異なることができる。各損傷が独特であるが、前頭葉および前頭蓋底白質、大脳基底核および間脳、吻側脳幹ならびに海馬を含む側頭葉を含む特定の脳領域が外傷誘発性損傷に対して特に脆弱である（McAllister, T. W. Dialogues Clin. Neurosci. 13:287-300, 2011）。TBIは、神経行動的障害を伴い得る、急性期におけるグルタミン酸および他の興奮性アミノ酸の放出ならびにカテコールアミン作動系およびコリン作動系における慢性的変化を含む、いくつかの神経伝達物質系の変化を招くことができる（前記McAllister, 2011）。重大なTBIからの生存者は、多くの場合、認知障害、人格変化および精神障害の増大、特にうつ、不安、心的外傷後ストレス障害に罹患している。熱心な研究にもかかわらず、死亡率および罹患率を低下させ、かつ機能的転帰を改善することができる、TBIのための臨床的に有効な治療は未だ見いだされていない。
補体因子およびTBI
多くの研究が、補体タンパク質と、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、脳ループスおよび卒中を含む神経学的障害との関係を特定している（Wagner, E., et al., Nature Rev Drug Disc. 9:43-56, 2010において概説されている）。最近、シナプス除去におけるC1qおよびC3の役割が実証され、したがって、補体因子が正常なCNS機能および神経変性疾患の両方に関与する可能性が高い（Stevens, B. et al., Cell 131:1164-1178, 2007）。MASP-1およびMASP-3の遺伝子は脳および神経膠腫細胞株T98G中で広く発現し（Kuraya, M. et al., Int Immunol., 15:109-17, 2003）、CNSにおけるレクチン経路の役割と合致している。
MASP-1およびMASP-3は、病原体および変化した自己細胞に対する即座の防御への鍵であるが、レクチン経路はまた、卒中、心臓発作、および他の虚血再灌流障害後の重篤な組織損傷の原因である。同様に、MASP-1およびMASP-3は、TBIによって生じる組織損傷における考えられる媒介物である。2つのマウスモデルにおいて第二経路中のB因子の阻害がTBIを軽減することが示された。B因子ノックアウトマウスは、TBI後の補体媒介性神経炎症および神経病理から保護される（Leinhase I, et al., BMC Neurosci. 7:55, 2006）。加えて、抗B因子抗体が、TBI誘発マウスにおける脳組織損傷および神経細胞死を減少させた（Leinhase I, et al., J Neuroinflammation 4:13, 2007）。MASP-3はB因子を直接活性化し（Iwaki, D. et al., J. Immunol. 187:3751-8, 2011）、したがって、同じくTBIにおける考えられる媒介物である。B因子の阻害と同様に、MASP-3に対する抗体のようなLEA-1阻害因子は、TBIにおける組織損傷および後遺症を治療するための有望な戦略を提供すると予想される。
したがって、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、TBIにおいて独立した治療上の有益性を有し得る。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断することができる、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、外傷性脳損傷に罹患している対象に投与する工程を含む、外傷性脳損傷を治療するために、または外傷性脳損傷の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3またはMASP-1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
別の局面において、治療有効量のMASP-2阻害物質を、外傷性脳損傷に罹患している対象に投与する工程を含む、外傷性脳損傷を治療するためにまたは外傷性脳損傷の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害するための方法が提供される。別の局面において、外傷性脳損傷を治療するためまたはその重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、外傷性脳損傷に罹患している対象に投与する工程を含む方法が提供される。
いくつかの態様において、方法は、LEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、外傷性脳損傷を治療する際、または外傷性脳損傷の重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および/またはMASP-2阻害組成物の適用は、外傷性脳損傷を治療するために、または外傷性脳損傷の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2および/またはMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば外傷性脳損傷における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、外傷性脳損傷に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、外傷性脳損傷を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
K. 誤嚥性肺炎におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
誤嚥とは、口咽頭または胃いずれかの内容物の下気道への吸入と定義される。誤嚥は、誤嚥性（化学性）肺炎、原発性細菌性誤嚥性肺炎または化学性肺炎の続発性細菌感染の合併症を生じさせ得る。誤嚥の危険因子は、意識レベルの低下（例えば、頭部外傷、感覚中枢におけるアルコールまたは薬物誘発性の変化、卒中）、様々な胃腸および食道の異常ならびに神経筋疾患を含む。450万の市中肺炎症例の5〜15％が誤嚥性肺炎によるものであると推定される（Marik, P.E. New Engl. J. Med. 344:665-671, 2001）。化学性肺炎の治療は主として支持的であり、経験的抗生物質使用は議論の余地がある。細菌性誤嚥性肺炎の治療は、適切な抗生物質による治療であり、細菌性誤嚥性肺炎の治療は、誤嚥が市中で起こったのかまたは院内で起こったのかに基づき、というのはこれらの状況の間では考えられる原因生物が異なるからである。高リスク患者、例えば咽頭反射障害を有する介護施設中の高齢患者における誤嚥を防ぐための措置が講じられるべきである。有効な予防法であることが示されている措置は、摂食中にベッドの頭部を高くすること、歯科予防および良好な口腔衛生を含む。予防的抗生物質は有効性が示されておらず、耐性菌の出現を招き得ることから、推奨されない。
補体成分のモジュレーションが、感染症-敗血症、ウイルス、細菌、および真菌感染、ならびに、肺状態-呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、および嚢胞性線維症を含む多数の臨床適応のために提案されている（Wagner, E., et al., Nature Rev Drug Disc. 9:43-56, 2010において概説されている）。この提案の裏付けが数多くの臨床的および遺伝的研究によって提供されている。例えば、低いMBLレベルの患者には臨床結核の頻度の有意な低下が見られ（Soborg et al., Journal of Infectious Diseases 188:777-82, 2003）、低いMBLレベルが疾患からの保護と関連することを示唆する。
Weiser MRら、J. Appl. Physiol. 83（4）:1090-1095, 1997は、酸誤嚥傷害のネズミモデルにおいて、C3ノックアウトマウスが深刻な傷害から保護されるが、一方、C4ノックアウトマウスは保護されないことを実証して、補体の活性化が第二経路によって媒介されることを示した。その結果、LEA-1阻害因子によって第二代替経路を遮断することが、誤嚥性肺炎において治療上の有益性を提供すると予想される。
したがって、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、誤嚥性肺炎において独立した治療上の有益性を有し得る。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えばMASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断する、二重特異性の抗体に包含され得る。
したがって、本発明の局面は、治療有効量のMASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを薬学的担体中に含む組成物を、そのような状態または他の補体媒介性肺炎に罹患している対象に投与する工程により、誤嚥性肺炎を治療するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害組成物は、吸入器などによって肺に局所投与され得る。あるいは、MASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与または潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、誤嚥性肺炎に罹患している対象または誤嚥性肺炎を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、誤嚥性肺炎を治療するために、誤嚥性肺炎を予防するために、または誤嚥性肺炎の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3またはMASP-1/3阻害組成物は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
別の局面において、治療有効量のMASP-2阻害物質を、誤嚥性肺炎に罹患している対象または誤嚥性肺炎を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、誤嚥性肺炎を治療するために、誤嚥性肺炎を予防するために、または誤嚥性肺炎の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害するための方法が提供される。別の局面において、誤嚥性肺炎を治療するためまたは誤嚥性肺炎の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、誤嚥性肺炎に罹患している対象に投与する工程を含む方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、LEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、誤嚥性肺炎を治療する際、または誤嚥性肺炎の重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および/またはMASP-2阻害組成物の適用は、それを必要とする対象における誤嚥性肺炎を治療するために、誤嚥性肺炎を予防するために、または誤嚥性肺炎の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2および/またはMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば誤嚥性肺炎における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、誤嚥性肺炎に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、誤嚥性肺炎を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
L. 眼内炎におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
眼内炎は、眼窩洞の炎症状態であり、通常、感染によって生じる。眼内炎は、遠い感染源（例えば心内膜炎）からの生物の血行性伝播から生じる内因性眼内炎でもあり得るし、または眼科手術、異物および/もしくは鈍的もしくは穿通性眼部外傷の合併症として外部からの生物の直接接種から生じる外因性眼内炎でもあり得る。外因性眼内炎は内因性眼内炎よりもはるかに一般的であり、外因性眼内炎の大部分の症例は眼科手術ののち起こる。米国においては、白内障手術が眼内炎の主要な原因であり、この処置の0.1〜0.3％において発生し、過去10年間、発生率の明らかな増加が見られる（Taban, M. et al., Arch. Ophthalmol. 123:613-620, 2005）。術後眼内炎は、手術から2週間以内に急性に出る場合もあるし、または手術から数ヶ月後に遅発的に出る場合もある。急性眼内炎は一般に痛み、発赤、眼瞼の腫れおよび視力低下を呈する。遅発性眼内炎は急性型ほど一般的ではなく、患者は軽度の痛みおよびまぶしさしか訴えない場合もある。眼内炎の治療は、基礎にある原因に依存し、全身的および/または硝子体内抗生物質を含み得る。眼内炎は視力低下または失明を招く場合もある。
AMDに関して先に記載したように、複数の補体経路遺伝子が眼科障害と関連しており、これらの遺伝子は具体的にはレクチン経路の遺伝子を含む。例えば、MBL2がAMDのサブタイプで同定されている（Dinu V, et al., Genet Epidemiol 31:224-37, 2007）。LEA-1およびLEA-2経路は眼内炎のような眼の炎症状態に関与している可能性が高い（Chow SP et al., Clin Experiment Ophthalmol. 39:871-7, 2011）。Chowらは、眼内炎患者のMBLレベルを検査し、MBLレベルおよび機能的レクチン経路活性の両方が、炎症のある人の眼において有意に上昇するが、炎症のない対照眼においては実質的に検出不可能であることを実証した。これは、視力を脅かす眼の炎症状態、特に眼内炎におけるMBLおよびレクチン経路の役割を示唆する。さらに、真菌性角膜炎のネズミモデルにおいて、MBL-A遺伝子が、5つの上方制御される炎症経路遺伝子の1つであった（Wang Y., et al., Mol Vis 13:1226-33, 2007）。
したがって、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、眼内炎治療において独立した治療上の有益性を有すると予想される。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断する、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、眼内炎に罹患している対象、または眼内炎を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、眼内炎を治療するために、眼内炎を予防するために、または眼内炎の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害組成物は、局所ゲル、軟膏、もしくはドロップの形態にある組成物の灌注もしくは適用または硝子体内投与などによって眼に局所投与され得る。または、MASP-1、MASP-3またはMASP-1/3阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
別の局面において、治療有効量のMASP-2阻害物質を、眼内炎に罹患している対象または眼内炎を発症する危険のある対象に投与する工程を含む、眼内炎を治療するために、眼内炎を予防するために、または眼内炎の重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害するための方法が提供される。別の局面において、眼内炎を治療するためまたは眼内炎の重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、眼内炎に罹患している対象に投与する工程を含む方法が提供される。
いくつかの態様において、方法は、LEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、眼内炎を治療する際、または眼内炎を予防する際、または眼内炎の重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、一方、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害組成物は、局所ゲル、軟膏もしくはドロップの形態にある組成物の灌注もしくは適用または硝子体内投与などによって眼に局所投与され得る。または、MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および/またはMASP-2阻害組成物の適用は、それを必要とする対象における眼内炎を治療するために、眼内炎を予防するために、または眼内炎の重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2および/またはMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば眼内炎における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、眼内炎に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、眼内炎を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
M. 視神経脊髄炎におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
視神経脊髄炎（NMO）は、視神経および脊髄を標的化する自己免疫疾患である。これは、視神経炎として知られる視神経の炎症および脊髄炎として知られる脊髄の炎症をもたらす。NMOにおける脊髄病変は、脚または腕の衰弱または麻痺、失明、膀胱および腸の機能不全ならびに感覚機能不全を招き得る。
NMOは多発性硬化症（MS）といくつかの類似点を共有する。理由は、いずれもCNS標的の免疫攻撃によるものであり、いずれも結果的に脱髄を生じさせるからである（Papadopoulos and Verkman, Lancet Neurol., 11(6):535-44, 2013）。しかし、NMOの分子標的、治療および病変はMSのそれらとは異なる。MSは主にT細胞によって媒介されるが、NMO患者は一般に、血液脳関門を包囲する星状細胞中に見られるタンパク質である水チャネルタンパク質アクアポリン4（AQP4）を標的化する抗体を有する。インターフェロンβがMSに最も一般的に使用される治療法であるが、NMOにおいては有害であることが概して認められている。NMOの炎症病変は脊髄および視神経に見られ、白質および白灰質を含む脳に進行し得る。NMO病変において起こる脱髄は補体によって媒介される（Papadopoulos and Verkman, Lancet Neurol., 11(6):535-44, 2013）。
補体依存性細胞毒性が、NMO発症を生じさせる主要な機序であると考えられる。NMO患者の90％超がAQP4に対するIgG抗体を有する（Jarius and Wildemann, Jarius S, Wildemann B., Nat Rev Neurol. 2010 Jul;6(7):383-92）。これらの抗体は血液脳関門における病変の形成を開始させる。星状細胞表面上の初期抗原-抗体複合体、AQP4/AQP4-IgGが補体の古典経路を活性化する。これが、星状細胞表面上の膜攻撃複合体の形成を生じさせ、顆粒球浸潤、脱髄ならびに最終的には星状細胞、乏突起膠細胞および神経細胞の壊死を招く（Misu et al., Acta Neuropathol 125(6):815-27, 2013）。これらの細胞事象は組織破壊および嚢胞性壊死性病変の形成に反映される。
補体の古典経路がNMO病原に決定的であることは明らかである。NMO病変は、免疫グロブリンの血管中心性沈着および活性化された補体成分を示す（Jarius et al., Nat Clin Pract Neurol. 4(4):202-14, 2008）。加えて、C5aのような補体タンパク質がNMO患者の脳脊髄液から単離されている（Kuroda et al., J. Neuroimmunol., 254(1-2):178-82, 2013）。さらに、NMO患者から採取された血清IgGは、マウスNMOモデルにおいて補体依存性細胞毒性を生じさせることができる（Saadoun et al., Brain, 133(Pt 2):349-61, 2010）。C1qに対するモノクローナル抗体がNMOのマウスモデルにおいて補体媒介性星状細胞破壊および病変を防ぐ（Phuan et al., Acta Neuropathol, 125(6):829-40, 2013）。
補体の第二経路は、全体的補体活性を増幅させるように働く。Harboeら（2004）は、第二経路の選択的遮断が、古典経路によって誘発される膜攻撃複合体形成の80％超を阻害することを実証した（Harboe et al., Clin Exp Immunol 138(3):439-46, 2004）。Tuzunら（2013）はNMO患者において古典経路産物および第二経路産物の両方を検査した（Tuzun E, et al., J. Neuroimmunol. 233(1-2):211-5, 2011）。古典経路活性を評価するためにC4の分解産物C4dを測定すると、対照に比べてNMO患者血清中で増加していた（2.14倍増）。加えて、第二経路B因子の分解産物Bb因子の増加が、MS患者または正常な対照個体に比べてNMO患者において認められた（1.33倍増）。これは、第二経路機能がNMOにおいても増大することを示唆する。この活性化は、全体的補体活性化を増大させると予想され、事実、補体カスケードの最終産物sC5b-9が有意に増加した（4.14倍増）。
MASP-3の特異的阻害因子は、NMOに罹患している患者の治療において有益性を提供すると予想される。本明細書において実証されるように、MASP-3を欠く血清は、C5コンバターゼの必須成分であるB因子または第二経路の中心的アクチベーターであるD因子を活性化することができない。したがって、抗体または小分子のような阻害物質によってMASP-3活性を遮断することはまた、B因子およびD因子の活性化を阻害すると予想されよう。これら2つの因子の阻害は、第二経路の増幅を阻止して、結果として全体的補体活性の低下を生じさせる。したがって、MASP-3阻害はNMOにおける治療転帰を有意に改善するはずである。
したがって、LEA-1阻害因子および/またはLEA-2阻害因子は、NMOの治療において独立した治療上の有益性を有すると予想される。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断する、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、NMOに罹患している対象またはNMOを発症する危険のある対象に投与する工程を含む、NMOを治療するために、NMOを予防するために、またはNMOの重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害組成物は、局所ゲル、軟膏もしくはドロップの形態にある組成物の灌注もしくは適用または硝子体内投与などによって眼に局所投与され得る。または、MASP-1、MASP-、3またはMASP-1/3阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
別の局面において、治療有効量のMASP-2阻害物質を、NMOに罹患している対象またはNMOを発症する危険のある対象に投与する工程を含む、NMOを治療するために、NMOを予防するために、またはNMOの重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害するための方法が提供される。別の局面において、NMOを治療するためまたはNMOの重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含み、治療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、NMOに罹患している対象に投与する工程を含むむ方法が提供される。
いくつかの態様において、方法は、LEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、NMOを治療する際、またはNMOを予防する際、またはNMOの重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害組成物は、局所ゲル、軟膏もしくはドロップの形態にある組成物の灌注もしくは適用または硝子体内注射などによって眼に局所投与され得る。または、MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および/またはMASP2阻害組成物の適用は、それを必要とする対象におけるNMOを治療するために、NMOを予防するために、またはNMOの重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2および/またはMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえば視神経脊髄炎（NMO）における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、視神経脊髄炎（NMO）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、視神経脊髄炎（NMO）を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合しかつ第二経路補体活性化を阻害する本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
N. ベーチェット病におけるMASP-3の役割、およびMASP-3阻害抗体を任意でMASP-2阻害物質と組み合わせて使用する治療法
ベーチェット病またはベーチェット症候群は、しばしば粘膜潰瘍および眼の障害を呈する稀な免疫媒介性小血管全身性血管炎である。ベーチェット病（BD）は、再発性口腔潰瘍、性器潰瘍およびブドウ膜炎の三症候複合体を最初に記載したトルコ人皮膚科医Hulusi Behcetの名をとって1937年に命名された。BDは原因不明の全身性再発性炎症障害である。BDの炎症性血管周囲炎は、胃腸管系、肺系、筋骨格系、心血管系、および神経系を巻き込み得る。BDは、血管動脈瘤の破裂または重篤な神経学的合併症のせいで致命的になる可能性がある。視神経に血液を供給する血管の血管炎および閉塞から視神経症および萎縮が生じる場合もある。Al-Araji A, et al., Lancet Neurol., 8(2):192-204, 2009を参照されたい。
BDの最高発生率は中東および極東地域であり、ヨーロッパおよび北米においては稀である。BDは、多くの場合、はじめにコルチコステロイドおよび免疫抑制剤を使用して抑制されるが、多くの場合、難治性であり、深刻な罹患率および死亡率を伴う。インターフェロンα、IVIG、抗TNF、抗IL-6、および抗CD20を含む生物学的剤が場合によっては有益性を示しているが、最良の治療に関する意見の一致はない。
BDは明らかに炎症性障害であるが、その病理生物学は明らかではない。HLA抗原との遺伝的関連があり、全ゲノム的な関連研究が数多くのサイトカイン遺伝子の関与を示唆している（Kirino et al., Nat Genet, 45(2):202-7, 2013）。免疫系の機能亢進が補体系によって調節されると考えられる。C3レベルの増大がBD患者の血清中で認められ（Bardak and Aridogan, Ocul Immunol Inflamm 12(1):53-8, 2004）、脳脊髄液中のC3およびC4の上昇が疾患と相関する（Jongen et al., Arch Neurol, 49(10):1075-8, 1992）。
Tuzunら（2013）は、BD患者の血清中の古典経路産物および第二経路産物の両方を検査した（Tuzun E, et al., J Neuroimmunol, 233(1-2):211-5, 2011）。C4の分解産物4dが第二経路よりも上流で生成され、それを測定して初期古典経路活性を評価した。C4dは、対照に比べて、BD患者の血清中で増加していた（2.18倍増）。Bb因子はB因子の分解産物であり、それを測定して第二経路活性を測定した。BD患者は、正常対照個体と比較してBb因子の増加を示し（2.19倍増）、BD第二経路機能の増大と合致していた。補体の第二経路は全体的補体活性を増幅するように働くため、この活性化は、全体的補体活性化を増大させると予想されよう。Harboeら（2004）は、第二経路の選択的遮断が、古典経路によって誘発される膜攻撃複合体形成の80％超を阻害することを実証した（Harboe M, et al., Clin Exp Immunol, 138(3):439-46, 2004）。事実、補体カスケードの最終産物sC5b-9はBD患者において有意に増加した（5.46倍増）。MASP-3の特異的阻害因子がBDにおいて有益性を提供するはずである。MASP-3を遮断することはB因子およびD因子の活性化を阻害するはずである。これは、第二経路の増幅を停止させて、結果として全体的補体活性の応答低下を生じさせる。したがって、MASP-3阻害はBDにおける治療転帰を有意に改善するはずである。したがって、LEA-1阻害因子および/またはLEA-2阻害因子は、BDの治療において独立した治療上の有益性を有すると予想される。加えて、LEA-1阻害因子およびLEA-2阻害因子は、併用されると、いずれか単独の場合に比べて、さらなる治療上の有益性を達成し得るか、またはより広い範囲の患者サブセットに有効な治療を提供し得る。組み合わせLEA-1およびLEA-2阻害は、LEA-1遮断物質およびLEA-2遮断物質の同時投与によって達成され得る。最適には、LEA-1阻害機能およびLEA-2阻害機能は、単一の分子実体に、例えば、MASP-1/3およびMASP-2特異的結合部位で構成された二重特異性抗体、または、各結合部位がMASP-1/3もしくはMASP-2に結合してそれを遮断する、二重特異性の抗体に包含され得る。
このように、前記に従って、本発明の局面は、MASP-1阻害物質、MASP-3阻害物質、またはMASP-1/3阻害物質の組み合わせを含む治療有効量のLEA-1阻害物質を薬学的担体中に含む組成物を、BDに罹患している対象またはBDを発症する危険のある対象に投与する工程を含む、BDを治療するために、BDを予防するために、またはBDの重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化を阻害するための方法を提供する。MASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害組成物は、局所ゲル、軟膏、もしくはドロップの形態にある組成物の灌注もしくは適用または硝子体内投与などによって眼に局所投与され得る。または、MASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
別の局面において、治療有効量のMASP-2阻害物質を、BDに罹患している対象またはBDを発症する危険のある対象に投与する工程を含む、BDを治療するために、BDを予防するために、またはBDの重篤度を軽減するためにLEA-2依存性補体活性化を阻害するための方法が提供される。別の局面において、治BDを治療するためにまたはその重篤度を軽減するためにLEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含み、療有効量のMASP-2阻害物質およびMASP-1、MASP-3、またはMASP-1/3阻害物質を、BDに罹患している対象に投与する工程を含む方法が提供される。
いくつかの態様において、方法は、LEA-1依存性補体活性化およびLEA-2依存性補体活性化の両方を阻害する工程を含む。上述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、LEA-1単独の阻害に比べて、BDを治療する際、またはBDを予防する際、またはBDの重篤度を軽減する際に、改善された治療転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。いくつかの態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、そのような実体は組み合わせLEA-1およびLEA-2遮断活性を有する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、かつLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。または、そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、および第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、かつLEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。そのような実体は、最適には、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、LEA-2を遮断する二重特異性モノクローナル抗体からなり得る。
MASP-2阻害物質は、局所ゲル、軟膏もしくはドロップの形態にある組成物の灌注もしくは適用または硝子体内注射などによって眼に局所投与され得る。または、MASP-2阻害物質は、全身的に、例えば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下もしくは他の非経口投与によって、または非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって対象に投与され得る。投与は、状態が解消するかまたは抑制されるまで、医師による決定に従って繰り返され得る。
本発明のMASP-3阻害組成物および/またはMASP-2阻害組成物の適用は、それを必要とする対象におけるBDを治療するために、BDを予防するために、またはBDの重篤度を軽減するために、組成物（例えば、MASP-2および/またはMASP-3阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。または、組成物は、それを必要とする対象の治療のために、長期間にわたり、1日1回、週2回、週1回、2週に1回、1か月1回、または2か月に1回のような定期的間隔で投与されてもよい。
本明細書における実施例11〜21に記載されるように、AP関連の疾患または状態、たとえばベーチェット病（BD）における第二経路の阻害のための治療的有用性を有する高親和性MASP-3阻害抗体を生成した。
したがって、1つの態様において、本発明は、ベーチェット病（BD）に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象を治療するための方法であって、ベーチェット病（BD）を治療するのにまたはそれを発症する危険を減らすのに有効な量の、ヒトMASP-3に結合し、かつ第二経路補体活性化を阻害する、本明細書に開示される高親和性モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含み、たとえば、該抗体またはその抗原結合断片が、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86またはSEQ ID NO:275を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
MASP-3阻害物質
補体のレクチン経路が2つの主要な補体活性化アームLEA-1およびLEA-2で構成され、およびまた、レクチン非依存性補体活性化アームがあるという認識をもって、補体の免疫防御能力を完全に停止させることなく（すなわち、古典的経路を完全なままにしておく）、第二経路補体活性化と関連する病状、たとえば発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、ウェット型およびドライ型AMDを含む）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）または移植後TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症（MS）、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、ならびに重症筋無力症の、少なくとも1つを生じさせるこれらのエフェクタアームの1つまたは複数を特異的に阻害することが非常に望ましいということが理解されよう。これは、免疫複合体プロセシングを取り扱い、感染に対する宿主防御を支援するために、C1q依存性補体活性化系を完全なままにしておくと考えられる。
LEA-1媒介性補体活性化を阻害するための組成物
本明細書に記載されるように、本発明者らは、溶解を生じさせるLEA-1の活性化がMASP-3依存性であることを予想外に見いだした。さらに本明細書に記載されるように、生理学的条件下、MASP-3依存性LEA-1活性化はオプソニン化にも寄与し、それにより、LEA-2媒介補体活性化と共に付加的効果を提供する。本明細書において実証されるように、Ca++の存在においては、MASP-3がD因子-/-血清中でLEA-1の活性化を駆動することができるため、D因子は不要である。MASP-3、MASP-1およびHTRA-1はまた、プロD因子を活性D因子へと転換することができる。同様に、MASP-3（MASP-1およびMASP-2とは対照的に）は自己活性化酵素ではなく、MASP-1の支援なしにはその活性形態へと転換されることができないため、MASP-3活性化は、多くの場合、MASP-1に依存するように考えられる（Zundel, S. et al., J. Immunol. 172:4342-4350 (2004)；Megyeri et al., J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013)。MASP-3は自己活性化せず、多くの場合、MASP-1の活性がその酵素的に活性な形態へと転換されることを必要とするため、第二経路C3コンバターゼC3BbのMASP-3媒介活性化は、MASP-3チモーゲンまたはすでに活性化されたMASP-3を標的とすることによって、またはMASP-1媒介MASP-3活性化を標的とすることによって、またはその両方によって阻害することができる。理由は、多くの場合、MASP-1機能活性の非存在においては、MASP-3はそのチモーゲン形態にとどまり、第二経路C3コンバターゼ（C3bBb）の直接形成を通してLEA-1を駆動することができないからである。
したがって、本発明の1つの局面において、LEA-1を特異的に阻害するための治療物質の開発において標的とするのに好ましいタンパク質成分は、MASP-3の阻害物質である（MASP-1媒介MASP-3活性化の阻害物質（たとえばMASP-3活性化を阻害するMASP-1阻害物質）を含む）。
前記にしたがって、1つの局面において、本発明は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）および血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される疾患もしくは障害に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象にMASP-3阻害物質、たとえばMASP-3阻害抗体を投与することによってLEA-1の有害作用（すなわち溶血およびオプソニン化）を阻害する方法であって、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
MASP-3阻害物質は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）もしくは血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症に罹患している対象またはそれを発症する危険のある生きている対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量で投与される。本発明のこの局面の実施において、代表的なMASP-3阻害物質は、MASP-3の生物学的活性を阻害する分子、たとえば、以下を含む：B因子のレクチンMASP-3依存性活性化、プロD因子のレクチンMASP-3依存性活性化、B因子のMASP-3依存性レクチン非依存性活性化およびプロD因子のMASP-3依存性レクチン非依存性活性化の少なくとも1つまたは複数を阻害する分子（たとえば、MASP-3と相互作用するまたはタンパク質間相互作用を妨害する小分子阻害物質、MASP-3抗体もしくはその断片または遮断ペプチド）ならびにMASP-3の発現を低下させる分子（たとえばMASP-3アンチセンス核酸分子、MASP-3特異的RNAi分子およびMASP-3リボザイム）。MASP-3阻害物質は、MASP-3タンパク質間相互作用を効果的に遮断して、MASP-3二量体化またはアセンブリを妨害して、Ca++結合を遮断して、MASP-3セリンプロテアーゼ活性部位を妨害して、またはMASP-3タンパク質発現を低下させて、それにより、MASP-3がLEA-1媒介またはレクチン非依存性補体活性化を活性化することを防ぎ得る。MASP-3阻害物質は、一次療法として単独で使用されることもできるし、さらに本明細書に記載されるように、他の医学的治療の治療有益性を高めるための補助療法として他の治療と併用されることもできる。
高親和性モノクローナルMASP-3阻害抗体
本明細書における実施例11〜21に記載され、かつ以下の表2A、2Bおよび表3にまとめられるように、本発明者らは、ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン中のエピトープに結合する驚くほど高親和性（すなわち≦500pM）のMASP-3阻害抗体を生成した。本明細書に記載されるように、本発明者らは、これらの高親和性MASP-3抗体が、ヒト血清、げっ歯類および非ヒト霊長類中で第二経路補体活性化を阻害することができることを実証した。これらの抗体の可変軽鎖および重鎖領域を配列決定し、単離し、Fabフォーマットおよび完全長IgGフォーマットの両方で分析した。実施例15に記載され、図50Aおよび50Bに示す樹状図に示されるように、抗体は、配列類似性にしたがって分類することができる。これらの抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の概要が図49Aおよび49Bに示され、かつ以下の表2Aおよび2Bに提供されている。代表的な高親和性MASP-3阻害抗体のヒト化バージョンが実施例19に記載されるように生成され、表3にまとめられている。
（表２Ａ）MASP-3高親和性阻害抗体配列：マウス親
Figure 0006971306
注：「SIN」は「SEQ ID NO:」を指す。
（表２Ｂ）MASP-3高親和性阻害抗体：CDR
Figure 0006971306
（表３）代表的な高親和性MASP-3阻害抗体：翻訳後修飾部位を除去するためにヒト化および改変されている
Figure 0006971306
したがって、1つの局面において、本発明は、高い親和性（500pM未満のKDを有する）でヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、該抗体またはその抗原結合断片が第二経路補体活性化を阻害する。いくつかの態様において、高親和性MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、哺乳動物対象において約1：1〜約2.5：1の標的MASP-3：mAbのモル比で第二経路を阻害する。
第二経路補体活性化の阻害は、本発明の様々な態様の高親和性MASP-3阻害抗体の投与の結果として生じる、補体系の成分における以下の変化の少なくとも1つまたは複数を特徴とする：溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；B因子のレクチン非依存性転換の阻害；D因子のレクチン非依存性転換の阻害；MASP-3セリンプロテアーゼ基質特異的切断の阻害；溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；プロD因子と比べた、静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；ならびに／または静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成。
たとえば、本明細書に記載されるように、高親和性MASP-3阻害抗体は、哺乳動物対象におけるD因子成熟（すなわちプロD因子からD因子への切断）を阻害することができる抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、高親和性MASP-3阻害抗体は、全血清中のD因子成熟を、未処置対照血清中に見られるレベルの50％未満（たとえば、MASP-3阻害抗体と接触しない未処置対照血清の40％未満、たとえば30％未満、たとえば25％未満、たとえば20％未満、たとえば15％未満、たとえば10％未満、たとえば5％未満）のレベルまで阻害することができる。
好ましい態様において、高親和性MASP-3阻害抗体は、第二経路を選択的に阻害して、C1q依存性補体活性化系を機能的に完全な状態にしておく。
別の局面において、本開示は、本明細書に開示されるMASP-3阻害抗体または抗原結合断片のいずれかの重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸分子を特徴とする。また、核酸を含むベクター（たとえばクローニングベクターまたは発現ベクター）およびベクターを含む細胞（たとえば昆虫細胞、細菌細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞）が特徴とされる。本開示はさらに、本明細書に開示されるMASP-3阻害抗体または抗原結合断片のいずれかを産生するための方法を提供する。方法は、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかの重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方ををコードする核酸を含有する発現ベクターを含有する細胞を提供する工程を含む。細胞または細胞培養物を、核酸によってコードされる抗体またはその抗原結合断片の細胞（または細胞培養物）による発現を可能にする条件下、かつそれに十分な時間、培養する。方法はまた、抗体またはその抗原結合断片を、細胞（または細胞培養物）または細胞が培養された培地から単離する工程を含むことができる。
MASP-3エピトープおよびペプチド
実施例18に記載され、図62に示され、かつ以下の表4にまとめられるように、本発明の高親和性MASP-3阻害抗体およびその抗原結合断片は、ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）内の1つまたは複数のエピトープを特異的に認識することがわかった。「特異的に認識する」とは、抗体が、任意の他の分子またはその一部に対するよりも有意に高い親和性で該エピトープに結合することをいう。
（表４）代表的な高親和性MASP-3阻害抗体：MASP-3のエピトープ結合領域（図62も参照されたい）
Figure 0006971306
したがって、いくつかの態様において、高親和性MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン中に位置するエピトープに特異的に結合し、該エピトープは、
Figure 0006971306
の少なくとも1つまたは複数の中に位置する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片はSEQ ID NO:15の中のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片はSEQ ID NO:9の中のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片はSEQ ID NO:10の中のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片はSEQ ID NO:12の中のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片はSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:12の中のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合断片はSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13および／またはSEQ ID NO:14の少なくとも1つの中のエピトープに結合する。
他の態様において、高親和性MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン中に位置するエピトープに特異的に結合し、該エピトープは、
Figure 0006971306
の少なくとも1つまたは複数の中に位置する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片はSEQ ID NO:17の中のエピトープに結合する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、
Figure 0006971306
の中のエピトープに結合する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片はSEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20および／またはSEQ ID NO:23の中のエピトープに結合する。1つの態様において、抗体または抗原結合断片はSEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21および／またはSEQ ID NO:22の少なくとも1つの中のエピトープに結合する。
CDR領域
本発明の1つの局面において、抗体またはその機能的等価物は、CDRと指定される特定の超可変領域を含む。好ましくは、CDRは、Kabat CDR定義によるCDRである。CDRまたは超可変領域は、たとえば、他の抗体への配列アラインメントによって同定され得る。高親和性MASP-3阻害抗体のCDR領域が表18〜23に示されている。
IA群mAb
1つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:209（XXDIN、1位のXはSまたはTでありかつ2位のXはNまたはDである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:210（
Figure 0006971306
、7位のXはGまたはDであり；8位のXはS、T、またはRであり；9位のXはIまたはTであり；13位のXはEまたはDであり；14位のXはKまたはEであり；かつ16位のXはTまたはKである）に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:211（XEDXY、1位のXはLまたはVでありかつ4位のXはTまたはSである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）SEQ ID NO:212（
Figure 0006971306
、8位のXはN、I、Q、またはAであり；9位のXはSまたはTであり；かつ17位のXはAまたはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:146（KQSYNLYT）に記載されるLC-CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR1はSEQ ID NO:56（TDDIN）を含む。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR1はSEQ ID NO:62（SNDIN）を含む。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR2は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR3はSEQ ID NO:60（LEDTY）を含む。1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR3はSEQ ID NO:65（VEDSY）を含む。1つの態様において、軽鎖可変領域のLC-CDR1は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、LC-CDR1は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、LC-CDR1は
Figure 0006971306
を含む。
1つの態様において、HC-CDR1はSEQ ID NO:56を含み、HC-CDR2はSEQ ID NO:58を含み、HC-CDR3はSEQ ID NO:60を含み、LC-CDR1はSEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含み；LC-CDR2はSEQ ID NO:144を含み、LC-CDR3はSEQ ID NO:146を含む。
1つの態様において、HC-CDR1はSEQ ID NO:62を含み、HC-CDR2はSEQ ID NO:63、SEQ ID NO:67、またはSEQ ID NO:69を含み、HC-CDR3はSEQ ID NO:65を含み、LC-CDR1はSEQ ID NO:149を含み、LC-CDR2はSEQ ID NO:144を含み、LC-CDR3はSEQ ID NO:146を含む。
IB群mAb
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:213（SYGXX、4位のXはMまたはIでありかつ5位のXはSまたはTである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:74に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:214（GGXAXDY、3位のXはEまたはDでありかつ5位のXはMまたはLである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）SEQ ID NO:215（
Figure 0006971306
、10位のXはD、E、またはAであり；11位のXはGまたはAでありかつ16位のXはNまたはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:155に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:216（WQGTHFPXT、8位のXはWまたはYである）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
1つの態様において、（a）の重鎖可変領域のHC-CDR1はSEQ ID NO:72（SYGMS）を含む。1つの態様において、HC-CDR1はSEQ ID NO:79（SYGIT）を含む。1つの態様において、HC-CDR3はSEQ ID NO:76（GGEAMDY）を含む。1つの態様において、HC-CDR3はSEQ ID NO:82（GGDALDY）を含む。1つの態様において、LC-CDR1は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、LC-CDR1は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、LC-CDR1はSEQ ID NO:152を含む。1つの態様において、LC-CDR3は
Figure 0006971306
を含む。
1つの態様において、LC-CDR3は
Figure 0006971306
を含む。1つの態様において、HC-CDR1はSEQ ID NO:72を含み、HC-CDR2はSEQ ID NO:74を含み、HC-CDR3はSEQ ID NO:76を含み、かつLC-CDR1はSEQ ID NO:153、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262またはSEQ ID NO:263を含み；LC-CDR2はSEQ ID NO:155を含み、かつLC-CDR3はSEQ ID NO:157を含む。
1つの態様において、HC-CDRはSEQ ID NO:72を含み、HC-CDR2はSEQ ID NO:74を含み、HC-CDR3はSEQ ID NO:76を含み、かつLC-CDR1はSEQ ID NO:153またはSEQ ID NO:263を含み、LC-CDR2はSEQ ID NO:155を含み、かつLC-CDR3はSEQ ID NO:157を含む。
1つの態様において、HC-CDR1はSEQ ID NO:79を含み、HC-CDR2はSEQ ID NO:74を含み、HC-CDR3はSEQ ID NO:82を含み、かつLC-CDR1はSEQ ID NO:159を含み、LC-CDR2はSEQ ID NO:155を含み、かつLC-CDR3はSEQ ID NO:160を含む。
IC群mAb
1つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:84（GKWIE）に記載されるHC-CDR1；
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:88（SEDV）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:161（KQSYNIPT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。1つの態様において、LC-CDR1はSEQ ID NO:258を含む。
II群mAb
1つの局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:91（GYWIE）に記載されるHC-CDR1；
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:95（SIDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:165（KVSNRFS）に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:167（SQSTHVPPT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
III群mAb
別の局面において、本発明は、
（a）
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、およびSEQ ID NO:112（GSHYFDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:184（YASESIS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（b）SEQ ID NO:125（DYYMN）に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:198（YTSRLHS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（c）SEQ ID NO:137に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:138に記載されるHC-CDR2、およびSEQ ID NO:140に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:206に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:207に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:208に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（d）SEQ ID NO:98に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:99に記載されるHC-CDR2、およびSEQ ID NO:101に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:169に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:171に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:173に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（e）SEQ ID NO:103に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:105に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:107に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:176に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
（f）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:116に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:118に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:188に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:190に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（g）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:121に記載されるHC-CDR2、およびSEQ ID NO:123に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:191に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域；または
（h）SEQ ID NO:132に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:133に記載されるHC-CDR2、およびSEQ ID NO:135に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:203に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:165に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:204に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
重鎖および軽鎖可変領域
1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO:24〜39、248〜249、251〜252、254〜255のいずれかと少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％同一である配列を含むまたはそれからなる重鎖可変領域を含むか、または、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:251、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254、またはSEQ ID NO:255を含む重鎖可変領域を含む、高親和性MASP-3阻害抗体を提供する。
1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO:40〜54、250、253、256、278、279、または280のいずれかと少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％同一である配列を含むまたはそれからなる軽鎖可変領域を含むか、または、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:253、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、またはSEQ ID NO:280を含む軽鎖可変領域を含む、高親和性MASP-3阻害抗体を提供する。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:248またはSEQ ID NO:249と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:250、またはSEQ ID NO:278と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:25と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:41と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:26と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:42と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:27と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:42と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:251またはSEQ ID NO:252と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:43、SEQ ID NO:253またはSEQ ID NO:279と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:29と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:44と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:254またはSEQ ID NO:255と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:256、またはSEQ ID NO:280と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:31と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:46と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:32と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:47と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:33と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:48と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:34と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:49と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:35と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:50と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:36と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:51と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:37と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:52と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:38と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:53と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
1つの態様において、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:39と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:54と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む。
高親和性MASP-3抗体の交差競合
本明細書に記載されるように、本明細書に開示される高親和性MASP-3阻害抗体は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン中の重複するエピトープを認識する。実施例18に記載され、図61A〜Eおよび62〜67に示され、表4および28にまとめられるように、交差競合分析およびpepscan結合分析が、高親和性MASP-3阻害抗体が交差競合し、MASP-3セリンプロテアーゼドメイン中に位置する共通のエピトープに結合することを示す。したがって、1つの態様において、本発明は、
SEQ ID NO:24に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:40に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:25に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:41に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:26に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:42に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:27に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:42に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:28に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:43に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:29に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:44に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:30に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:45に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:31に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:46に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:32に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:47に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:33に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:48に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:34に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:49に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:35に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:50に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:36に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:51に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:37に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:52に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
SEQ ID NO:38に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:53に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；および
SEQ ID NO:39に記載される重鎖可変領域およびSEQ ID NO:54に記載される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
からなる群より選択される1つまたは複数によって認識されるヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメインの中のエピトープまたはその一部を特異的に認識する高親和性MASP-3阻害抗体を提供する。
本発明にしたがって、所与の抗体が、別の所与の抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を認識する場合、それら2つの抗体は、同じエピトープまたは重複するエピトープを認識するといわれる。
当業者に使用可能な様々なアッセイ法を使用して、ある抗体（試験抗体とも呼ばれる）がある特定のモノクローナル抗体（参照抗体とも呼ばれる）と同じまたは重複するエピトープを認識するかどうかを判定し得る。好ましくは、アッセイ法は、以下の工程を含む。
・ 参照抗体によって認識されるエピトープを含むMASP-3またはその断片を提供する工程。
・ 試験抗体または参照抗体のいずれかが検出可能な標識で標識されている試験抗体および参照抗体を、該MASP-3に添加する工程。あるいは、両抗体は異なる検出可能な標識で標識されてもよい。
・ MASP-3における検出可能な標識の存在を検出する工程。
・ それにより、試験抗体が参照抗体を押し退け得るかどうかを検出する工程。
参照抗体が押し退けられる場合には、試験抗体は、参照抗体と同じまたは重複するエピトープを認識する。したがって、参照抗体が検出可能な標識で標識される場合には、MASP-3における低い検出可能なシグナルは参照抗体の押し退けを示す。試験抗体が検出可能な標識で標識される場合には、MASP-3における高い検出可能なシグナルは参照抗体の押し退けを示す。MASP-3断片は、好ましくは、容易な取り扱いを可能にする固体支持体上に固定化され得る。検出可能な標識は、任意の直接的または間接的に検出可能な標識、たとえば酵素、放射性同位体、重金属、着色化合物または蛍光化合物であり得る。本明細書中、下記の「競合結合分析」のセクションの実施例18において、試験抗体が参照抗体と同じまたは重複するエピトープを認識するかどうかを判定する例示的な方法を記載する。当業者は、前記方法を関心対象の特定の抗体に容易に適合させ得る。
本発明のこの局面において有用なMASP-3抗体は、任意の抗体産生性哺乳動物に由来するモノクローナルまたは組換み抗体を含み、かつ多重特異性抗体（すなわち二重特異性または三重特異性抗体）、キメラ、ヒト化、全ヒト、抗イディオタイプおよび抗体断片であり得る。抗体断片は、さらに本明細書に記載されるような、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv断片、scFv断片、および単鎖抗体を含む。
MASP-3抗体は、本明細書に記載されるアッセイ法を使用して、第二経路補体活性化系を阻害する能力に関してスクリーニングされることができる。第二経路補体活性化の阻害は、本発明の様々な態様の高親和性MASP-3阻害抗体の投与の結果として生じる、補体系の成分における以下の変化の少なくとも1つまたは複数を特徴とする：溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；B因子のレクチン非依存性転換の阻害；D因子のレクチン非依存性転換の阻害；MASP-3セリンプロテアーゼ基質特異的切断の阻害；溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；プロD因子と比べた静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；ならびに／または静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成。
エフェクター機能が低下したMASP-3抗体
本発明のこの局面のいくつかの態様において、古典的補体経路の活性化から生じ得る炎症を減少させるために、本明細書に記載の高親和性MASP-3阻害抗体はエフェクター機能が低下している。IgG分子が古典的補体経路を誘発する能力は、この分子のFc部分の中にあることが示されている(Duncan, A.R.. et al., Nature 332：738-740 (1988))。この分子のFc部分が酵素切断によって除去されているIgG分子には、このエフェクター機能がない(Harlow, Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。従って、エフェクター機能を最小化する遺伝子操作Fc配列を有することによって、またはヒトIgG2もしくはIgG4アイソタイプにすることによって、この分子のFc部分を欠いた結果としてエフェクター機能が低下した抗体を作製することができる。
エフェクター機能が低下した抗体は、Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10：241-250 (1993)およびRodrigues et al., J. Immunol. 151：6954-6961 (1998)に記載のように、IgG重鎖のFc部分の標準的な分子生物学的操作によって作製することができる。エフェクター機能が低下した抗体はまた、補体を活性化する、および/またはFc受容体と相互作用する能力が低下したヒトIgG2およびIgG4アイソタイプも含む(Ravetch, J. V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9：457-492 (1991)； Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148：3062-3071, 1992； van de Winkel, J.G., et al., Immunol Today 14：215-221 (1993))。IgG2またはIgG4アイソタイプからなる、ヒトMASP-1、MASP-2、またはMASP-3に特異的なヒト化抗体または完全ヒト抗体(二重抗体、汎抗体、二重特異性抗体、または三重特異性抗体を含む)は、Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16：535-539 (1998)に記載のように当業者に公知のいくつかの方法の1つによって作製することができる。
高親和性MASP-3阻害抗体の作製
例えば以下の本明細書における実施例14に記載されるように、MASP-3抗体は、MASP-3ポリペプチド(例えば、完全長MASP-3)を用いてまたは抗原性MASP-3エピトープ含有ペプチド(例えば、MASP-3ポリペプチドの一部)を用いて作製することができる。免疫原性ペプチドは5アミノ酸残基と小さくてもよい。抗体を産生させるのに用いられるMASP-3のペプチドおよびポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは組換えペプチドもしくは合成ペプチドおよび触媒的に不活性な組換えポリペプチドとして単離されてもよい。MASP-3抗体の作製において有用な抗原はまた、融合ポリペプチド、例えば、MASP-3ポリペプチドまたはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合も含む。ポリペプチド免疫原は完全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分がハプテン様であれば、このような部分は、免疫のために、都合よく、巨大分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風トキソイド)に接続または連結されてもよい。
モノクローナル抗体
本明細書で使用する「モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均一な抗体集団から得られているという特徴を示し、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈してはならない。モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技術、例えば、Kohler, G., et al., Nature 256：495 (1975)に記載のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。または、モノクローナル抗体は、組換えDNA法(例えば、Cabillyに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい)によって作られてもよい。モノクローナル抗体は、Clackson, T., et al., Nature 352：624-628 (1991)、およびMarks, J.D., et al., J. Mol Biol. 222：581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラス、およびその任意のサブクラスの抗体でよい。
例えば、モノクローナル抗体は、適切な哺乳動物(例えば、BALB/cマウス)に、MASP-3ポリペプチドまたはその一部を含む組成物を注射することによって得ることができる。予め決められた期間の後に、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞培地に懸濁する。次いで、脾臓細胞を不死細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成する。形成されたハイブリドーマを細胞培養において増殖させ、MASP-3に対するモノクローナルを産生する能力についてスクリーニングする(Current Protocols in Immunology, Vol.1., John Wiley & Sons, 2.5.1〜2.6.7頁, 1991も参照されたい)。
抗原曝露に応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスを用いて、ヒトモノクローナル抗体を得ることができる。この技術では、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の要素を、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する。このトランスジェニックマウスは、ヒト抗原、例えば、本明細書に記載のMASP-2抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、従来のケーラー・ミルステイン技術を用いて、このような動物に由来するB細胞を適切なミエローマ細胞株と融合することによってヒトMASP-2抗体分泌ハイブリドーマを作製するのに使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Green, L.L., et al., Nature Genet. 7：13, 1994； Lonberg, N., et al., Nature 368：856, 1994；およびTaylor, L.D., et al., Int. Immun. 6：579, 3994によって述べられている。
モノクローナル抗体は、十分に確立した様々な技術によってハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離法には、プロテインA Sepharoseを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる(例えば、Coliganの2.7.1〜2.7.12頁および2.9.1〜2.9.3頁； Baines et al., 「Purification of Immunoglobulin G(IgG)」, Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol.10, 79〜104頁, 1992を参照されたい)。
モノクローナル抗体は、製造されると、まず、MASP-3特異的結合、または所望の場合にはMASP-1/3、MASP-2/3、もしくはMASP-1/2二重結合に関して試験される。抗体がタンパク質抗原に結合するかどうかを判定するためおよび/またはタンパク質抗原に対する抗体の親和性を決定するための方法は当技術分野において公知である。例えば、タンパク質抗原への抗体の結合は、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIAcore system； Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)または酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を含むが、これらに限定されない多種多様な技術を使用して検出および/または定量化することができる。例えば、Harlow and Lane (1988) "Antibodies：A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering： Methods and Protocols," Humana Press (ISBN：1588290921)； Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY； Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford； Johne et al. (1993), Immunol. Meth. 160：191-198； Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51：19-26；およびJonsson et al. (1991) Biotechniques 11：620-627を参照されたい。また、米国特許第6,355,245号も参照されたい。
MASP-3モノクローナル抗体の親和性は、当業者が容易に決定することができる（たとえば、Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949を参照されたい）。1つの態様において、本発明の方法に有用なMASP-3モノクローナル抗体は、＜100nM、好ましくは＜10nM、好ましくは＜2nM、もっとも好ましくは＜500pMの結合親和性でMASP-3に結合する。
MASP-3に特異的に結合する抗体が同定されると、MASP-3抗体は、いくつかの機能アッセイ法のうちの1つにおいて第二経路阻害物質として機能する能力に関して試験され、たとえば、第二経路補体活性化の阻害は、本発明の様々な態様の高親和性MASP-3阻害抗体の投与の結果として生じる、補体系の成分における以下の変化の少なくとも1つまたは複数を特徴とする：溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；B因子のレクチン非依存性転換の阻害；D因子のレクチン非依存性転換の阻害；MASP-3セリンプロテアーゼ基質特異的切断の阻害；溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；プロD因子と比べた静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成の減少；ならびに／またはP因子の沈着の減少。
キメラ/ヒト化抗体
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体、ならびにこのような抗体の断片が含まれる(Cabillyに対する米国特許第4,816,567号；およびMorrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81：6851-6855, (1984))。
本発明において有用なキメラ抗体の一形態は、ヒト化モノクローナルMASP-3抗体である。非ヒト(例えば、ネズミ)抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖に由来する非ヒト(例えば、マウス)相補性決定領域(CDR)をヒト可変ドメインに導入することによって作製される。次いで、典型的に、非ヒト対応物のフレームワーク領域においてヒト抗体残基が代用される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能にさらに磨きをかけるためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、および典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、Fvフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFvフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones, P.T, et al., Nature 321：522-525 (1986)； Reichmann, L., et al., Nature 332：323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2：593-596 (1992)を参照されたい。
本発明において有用なヒト化抗体には、少なくともMASP-3結合CDR3領域を含むヒトモノクローナル抗体が含まれる。さらに、IgA抗体またはIgM抗体ならびにヒトIgG抗体を作製するためにFc部分が交換されてもよい。このようなヒト化抗体は、ヒトMASP-3を特異的に認識するが、ヒトにおいて抗体それ自体に対する免疫応答を惹起しないので特に臨床において有用であると考えられる。その結果、このようなヒト化抗体は、ヒトでのインビボ投与に、特に、反復投与または長期投与が必要な場合により適している。
ヒト化モノクローナル抗体を作製するための技術は、例えば、Jones, P.T, et al., Nature 321：522, (1986)； Carter, P., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89：4285, 1992； Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12：437, (1992)； Singer, I.I., et al., J. Immun. 150：2844, (1993)； Sudhir(ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995)； Kelley, 「Engineering Therapeutic Antibodies」, Protein Engineering：Principles and Practice, Cleland et al.(eds.), John Wiley & Sons, Inc., 399〜434頁, (1996)；およびQueen, (1997)に対する米国特許第5,693,762号にも記載されている。さらに、Protein Design Labs (Mountain View, CA)などの特定のネズミ抗体領域からヒト化抗体を合成する事業実体がある。
組換え抗体
MASP-3抗体は組換え法を用いて作ることもできる。例えば、ヒト抗体断片(VH、VL、Fv、D因子、Fab、またはF(ab') 2)を作製するようにヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(例えば、Stratagene, Corp., La Jolla, CAから入手可能)を用いてヒト抗体を作ることができる。次いで、キメラ抗体の作製法に類似した技術を用いて、これらの断片を用いてヒト抗体全体を構築する。
免疫グロブリン断片
本発明の方法において有用なMASP-3阻害物質は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、抗体断片から形成された、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体および三重特異性抗体)を含む周知の断片も包含する。
抗体とそのエピトープの結合には抗体分子の小さな部分であるパラトープしか関与しないことは当技術分野において周知である(例えば、Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986を参照されたい)。抗体のpFc'およびFc領域は古典的補体経路のエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。pFc'領域が酵素切断されている抗体、またはpFc'領域なしで作製されている抗体はF(ab')2断片と呼ばれ、インタクトな抗体の抗原結合部位を両方とも保持する。単離されたF(ab') 2断片は、その2つの抗原結合部位のために二価モノクローナル断片と呼ばれる。同様に、Fc領域が酵素切断されている抗体、またはFc領域なしで作製されている抗体はFab断片と呼ばれ、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの1つを保持する。
抗体断片は、従来の方法による抗体全体のタンパク質加水分解、例えば、ペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素切断して、F(ab') 2と呼ばれる5S断片を得ることによって作製することができる。この断片は、3.5S Fab'一価断片を生じるチオール還元剤を用いてさらに切断することができる。任意で、ジスルフィド結合を切断する、スルフヒドリル基のブロック基を用いて、切断反応を行うことができる。代替として、ペプシンを用いた酵素切断によって、2つの一価Fab断片および1つのFc断片が直接、生成される。これらの方法は、例えば、Goldenbergに対する米国特許第4,331,647号； Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89：230 (1960)； Porter, R.R., Biochem, J. 73：119, (1959)； Edelman, et al., Methods in Enzymology 1：422, Academic Press (1967)；ならびにColiganの2.8.1〜2.8.10頁および2.10〜2.10.4頁に記載されている。
いくつかの態様において、FcとFcγ受容体が結合すると開始する古典的補体経路の活性化を回避するためには、Fc領域の無い抗体断片を使用することが好ましい。Fcγ受容体相互作用を回避するモノクローナル抗体を作製することができる、いくつかの方法がある。例えば、モノクローナル抗体のFc領域をタンパク質分解酵素による部分消化(例えば、フィシン消化)を用いて化学的に除去し、それによって、例えば、抗原結合抗体断片、例えば、Fab断片またはF(ab) 2断片を生成することができる(Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28：69-71 (1991))。または、Fcγ受容体に結合しないヒトγ4 IgGアイソタイプを、本明細書に記載のようにヒト化抗体の構築中に使用することができる。Fcドメインの無い抗体、単鎖抗体、および抗原結合ドメインはまた、本明細書に記載の組換え法を用いて操作することもできる。
単鎖抗体断片
または、重鎖Fv領域および軽鎖Fv領域が連結されている、MASP-3に特異的なペプチド単鎖結合分子を作製することができる。Fv断片は、単鎖抗原結合タンパク質(scFv)を形成するようにペプチドリンカーで連結されてもよい。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドで連結された、VHドメインをコードするDNAおよびVLドメインをコードするDNAを含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後に、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する1本のポリペプチド 鎖を合成する。scFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow, et al.,「Methods：A Companion to Methods in Enzymology」2：97 (1991)； Bird, et al., Science 242：423 (1988)； Ladnerに対する米国特許第4,946,778号； Pack, P., et al., Bio/Technology 11：1271 (1993)に記載されている。
例示的な例として、MASP-3特異的scFvは、インビトロでリンパ球をMASP-3ポリペプチドに曝露し、(例えば、固定化または標識されたMASP-3タンパク質またはペプチドを使用することによって)ファージベクターまたは類似ベクターの中にある抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって得ることができる。潜在的なMASP-3ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージまたは細菌、例えば、大腸菌にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングによって得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、MASP-3と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするための技術は当技術分野において周知である(Lardnerに対する米国特許第5,223,409号； Ladnerに対する米国特許第4,946,778号； Ladnerに対する米国特許第5,403,484号； Ladnerに対する米国特許第5,571,698号；およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996)。このようなライブラリーをスクリーニングするためのランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto, Calif.)、Invitrogen Inc.(San Diego, Calif.)、New England Biolabs, Inc.(Beverly, Mass.)、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway, N.J.)から市販されている。
本発明のこの局面において有用なMASP-3抗体断片の別の形態は、MASP-3抗原上のエピトープに結合しかつ第二補体経路活性化を阻害する、単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。
CDRペプチド(「最小認識ユニット」)は、関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応を用いて抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される(例えば、Larrick et al., Methods； A Companion to Methods in Enzymology 2：106 (1991)； Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」, Monoclonal Antibodies：Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al., (eds.), 166頁, Cambridge University Press (1995)；およびWard et al.,「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies：Principles and Applications, Birch et al., (eds,), 137頁, Wiley-Liss, Inc., 1995を参照されたい)。
本明細書に記載される高親和性MASP-3阻害抗体は、第二経路活性化を阻害するために、それを必要とする対象に投与される。いくつかの態様において、高親和性MASP-3阻害抗体は、任意でエフェクタ機能を低下させたヒト化モノクローナルMASP-3抗体である。
二重特異性抗体
本発明の方法において有用な高親和性MASP-3阻害抗体は多重特異性（すなわち二重特異性および三重特性）抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原への結合特異性を有するモノクロナールの好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。1つの態様において、組成物および方法は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合特異性およびMASP-2への結合特異性（たとえば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つに結合する）を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合特異性およびMASP-1への結合特異性（たとえば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインへの結合）を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-3への結合特異性（たとえば、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合する）、MASP-2への結合特異性（たとえば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つに結合する）およびMASP-1への結合特異性（たとえば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインに結合する）を含む三重特異性抗体の使用を含む。
二重特異性抗体を作製するための方法は当業者の知識の範囲内である。従来、二重特異性抗体の組換え製造は、2つの重鎖が異なる特異性を有する、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein and Cuello, Nature 305：537-539 (1983)）。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。免疫グロブリン重鎖融合物および所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAが、別々の発現ベクターに挿入され、かつ適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。二重特異性抗体を生成するための現在公知の例示的方法のさらなる詳細に関しては、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology 121：210 (1986)； WO96/27011； Brennan et al., Science 229：81 (1985)； Shalaby et al., J. Exp. Med. 175：217-225 (1992)； Kostelny et al., J. Immunol. 148(5)：1547-1553 (1992)； Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448 (1993)； Gruber et al., J. Immunol. 152：5368 (1994)；およびTuft et al., J. Immunol. 147：60 (1991)を参照されたい。二重特異性抗体はまた、架橋またはヘテロコンジュゲート抗体を含む。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製し得る。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術とともに米国特許第4,676,980号に開示されている。
また組換え細胞培養から直接、二重特異性抗体断片を作製および分離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が製造されている(例えば、Kostelny et al. J. Immunol. 148(5)：1547-1553 (1992))。Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448 (1993)によって記載されている「ダイアボディ」技術が、二重特異性抗体断片を作製するための第二の機構を提供した。断片は、同じ鎖上の2つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。したがって、1つの断片のVHおよびVLドメインが別の断片の相補的VLおよびVHドメインと対合させられ、それにより、2つの抗原結合部位を形成する。二重特異性ダイアボディはまた、大腸菌（E. coli）中で容易に構築し、かつ発現させることができるため、二重特異性抗体全体とは違って、特に有用であり得る。適切な結合特異性のダイアボディ(および抗体断片のような多くの他のポリペプチド)は、ライブラリーからのファージディスプレイ（WO94/13804）を使用して容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームを例えば抗原Xに対する特異性で一定に維持する場合には、他方のアームが変化するライブラリーを作製することができ、適切な特異性の抗体を選択することができる。
また、単鎖Fv(scFv)二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略が報告されている（例えば、Gruber et al. J. Immunol., 152：5368 (1994)を参照されたい）。あるいは、抗体は、例えばZapata et al., Protein Eng. 8(10)：1057-1062 (1995)に記載されているような「リニア抗体」であることができる。簡潔に説明するならば、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムD因子セグメント（VH-CHI-VH-CHI）の対を含む。リニア抗体は二重特異性または単一特異性であることができる。本発明の方法はまた、バリアント型の二重特異性抗体、例えば、Wu et al., Nat Biotechnol 25：1290-1297 (2007)に記載されているような四価二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD-Ig)分子の使用を包含する。DVD-Ig分子は、2つの異なる親抗体からの2つの異なる軽鎖可変ドメイン（VL）が組換えDNA技術によって直接または短いリンカーを介してタンデムにリンクされたのち、軽鎖定常ドメインがリンクされるように設計されている。2つの親抗体からDVD-Ig分子を生成するための方法は、例えば、それぞれの開示内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるWO08/024188およびWO07/024715にさらに記載されている。
XVIII. 薬学的組成物および送達法
投与
別の局面において、本発明は、それを必要とする対象、たとえば第二経路関連の疾患または状態、たとえばPNHのような溶血性疾患または加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症（MS）、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される疾患または障害に罹患している対象において第二経路補体活性化の有害作用を阻害するための、高親和性MASP-3阻害抗体を含む組成物を提供する。
本発明のこの局面の方法は、第二経路補体活性化を阻害するのに有効な量の高親和性MASP-3阻害抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、MASP-2阻害物質を含む組成物を投与する工程を含む。高親和性MASP-3阻害抗体およびMASP-2阻害物質は、第二経路補体活性化および任意でMASP-2依存性補体活性化とも関連する状態を治療または緩和するための治療的に有効な用量で、それを必要とする対象に投与することができる。治療的に有効な用量とは、状態の症状の緩和を生じさせるのに十分な、MASP-3阻害抗体またはMASP-3阻害抗体とMASP-2阻害物質との組み合わせの量を指す。第二経路補外活性化の阻害は、本発明の様々な態様の高親和性MASP-3阻害抗体の投与の結果として生じる、補体系の成分における以下の変化の少なくとも1つまたは複数を特徴とする：溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；B因子のレクチン非依存性転換の阻害；D因子のレクチン非依存性転換の阻害；MASP-3セリンプロテアーゼ基質特異的切断の阻害；溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；プロD因子と比べた静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；ならびに／または静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成の減少。
MASP-3およびMASP-2阻害物質の毒性および治療有効性は、実験動物モデルを用いる標準的な薬学的手法によって決定することができる。このような動物モデルを使用して、NOAEL（無毒性量）およびMED（最小有効量）を標準的方法によって決定することができる。NOAEL効果とMED効果との用量比が治療可能比であり、これが比NOAEL/MEDとして表される。大きな治療可能比または指数を示すMASP-3阻害物質およびMASP-2阻害物質がもっとも好ましい。細胞培養アッセイ法および動物実験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための範囲の投与量を処方するのに使用することができる。MASP-3阻害物質およびMASP-2阻害物質の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないMEDを含む循環濃度の範囲に入る。投与量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。
任意の複合製剤の場合、治療的に有効な用量は、動物モデルを使用して評価することができる。たとえば、MEDを含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量を動物モデルにおいて処方し得る。また、血漿中のMASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質の定量レベルをたとえば高速液クロマトグラフィーによって測定し得る。
また、毒性研究に加えて、生きている対象中に存在する標的MASPタンパク質の量およびMASP-3またはMASP-2阻害物質の結合親和性に基づいて有効投与量を推定し得る。
正常ヒト対象におけるMASP-1レベルは、血清中1.48〜12.83μg/mLの範囲のレベルで存在することが報告されている（Terai I. et al, Clin Exp Immunol 110:317-323 (1997)；Theil et al., Clin. Exp. Immunol. 169:38 (2012)）。正常ヒト対象における平均血清MASP-3レベルは約2.0〜12.9μg/mLの範囲であると報告されている（Skjoedt M et al., Immunobiology 215(11):921-31 (2010)；Degn et al., J. Immunol. Methods, 361-37 (2010)；Csuka et al., Mol. Immunol. 54:271 (2013)。正常ヒト対象におけるMASP-2レベルは、血清中、500ng/mLの範囲の低いレベルで存在することが示され、特定の対象におけるMASP-2レベルは、Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167 (2003)およびCsuka et al., Mol. Immunol. 54:271 (2013)に記載されている、MASP-2のための定量アッセイ法を使用して測定することができる。
一般に、MASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質を含む、投与される組成物の投与量は、対象の年齢、体重、身長、性別、一般的病状および既往歴などの要因に依存して異なる。例示として、MASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質（たとえばMASP-3抗体、MASP-1抗体またはMASP-2抗体）は、対象体重1kgあたり約0.010〜100.0mg、好ましくは0.010〜10mg、好ましくは0.010〜1.0mg、より好ましくは0.010〜0.1mgの投与量範囲で投与することができる。いくつかの態様において、MASP-2阻害物質（たとえばMASP-2抗体）は、対象体重1kgあたり約0.010〜10mg、好ましくは0.010〜1.0mg、より好ましくは0.010〜0.1mgの投与量範囲で投与される。いくつかの態様において、MASP-1阻害物質（たとえばMASP-1抗体）またはMASP-3阻害物質（たとえばMASP-3抗体）は、対象体重1kgあたり約0.010〜100.0mg、好ましくは0.010〜10mg、たとえば約1mg〜約10mg、好ましくは0.010〜1.0mg、より好ましくは0.010〜0.1mgの投与量範囲で投与される。
所与の対象における、本発明の、任意でMASP-2阻害組成物と組み合わされたMASP-3阻害組成物、または任意でMASP-2阻害組成物と組み合わされたMASP-1阻害組成物および方法の治療有効性ならびに適切な投与量は、当業者に周知の補体アッセイ法にしたがって判定することができる。補体は特定の産物を数多く生成する。過去十年間に、小さな活性化断片C3a、C4a、およびC5aならびに大きな活性化断片iC3b、C4d、Bb、およびsC5b-9を含む、これらの活性化産物の大部分に関して高感度の特異的アッセイ法が開発され、市販されている。これらのアッセイ法の大部分は、新たな抗原（ネオ抗原）と反応するモノクローナル抗体を用い、新たな抗原は、断片上に露出しているが、それが形成される天然タンパク質の上には露出していないものであり、これらのアッセイ法を非常に簡単かつ特異的にする。大部分はELISA技術に頼るが、C3aおよびC5aの場合、まだラジオイムノアッセイ法が使用されることもある。これらの後者のアッセイ法は、循環中に見られる主な形態である、プロセシングされていない断片およびそれらの「desArg」断片の両方を測定する。プロセシングされていない断片およびC5adesArgは、細胞表面レセプタに結合することによって迅速に掃去され、したがって、非常に低い濃度でしか存在しないが、一方で、C3adesArgは細胞に結合せず、血漿中に蓄積する。C3aの測定は、高感度で経路非依存的な補体活性化の指標を提供する。第二経路活性化は、Bb断片の測定および／またはD因子活性化の測定によって評価することができる。膜侵襲経路活性化の液相産物sC5b-9の検出が、補体が完全に活性化されているという証拠を提供する。レクチン経路および古典的経路はいずれも同じ活性化産物C4aおよびC4dを生成するため、これらの2つの断片の測定は、これらの2つの経路のどちらが活性化産物を生成したかに関するいかなる情報も提供しない。
哺乳動物対象における第二経路の阻害は、本明細書に開示される高親和性MASP-3阻害抗体による治療後の哺乳動物対象において以下の少なくとも1つまたは複数を特徴とする：D因子成熟の阻害；約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で対象に投与された場合の、第二経路の阻害；古典的経路が阻害されないこと；溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；プロD因子と比べた静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；ならびに／または静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成の減少。
MASP-2依存性補体活性化の阻害は、本発明の方法によるMASP-2阻害物質の投与の結果として生じる補体系の成分における以下の変化の少なくとも1つを特徴とする：MASP-2依存性補体活性化系の産物C4b、C3a、C5aおよび/またはC5b-9（MAC）の生成または産生の阻害（例えば、米国特許第7,919,094号の実施例2に記載されているように測定）、C4切断およびC4b沈着の減少またはC3切断およびC3b沈着の減少。
薬学的担体および送達ビヒクル
一般的に、MASP-3阻害抗体組成物、または、MASP-2阻害物質とMASP-3阻害物質の組み合わせを含む組成物は、他の任意の選択された治療剤と組み合わされてもよく、適宜、薬学的に許容される担体中に含まれる。担体は、無毒で、生体適合性があり、MASP-3阻害抗体またはMASP-2阻害物質(およびMASP-2阻害物質と組み合わされた他の任意の治療剤)の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ペプチド用の例示的な薬学的に許容される担体は、Yamadaに対する米国特許第5,211,657号に記載されている。本明細書に記載される、本発明において有用なMASP-3抗体は、経口投与、非経口投与、または外科的投与を可能にする、固体、半固体、ゲル、液体、または気体の形をした調製物、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリ(depository)、吸入剤、および注射剤に製剤化されてもよい。本発明はまた、医療装置などをコーティングすることによる組成物の局所投与も意図する。
注射、注入、または灌注、および局部送達を介した非経口送達に適した担体には、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、通常のリンガー液もしくは乳酸加リンガー液、デキストロース液、ハンクス液、またはプロパンジオールが含まれる。さらに、溶媒または分散媒として滅菌不揮発性油が使用されることもある。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の生体適合性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射液の調製において有用である。担体および作用物質は、液体、懸濁液、重合可能もしくは重合不可能なゲル、ペースト、または軟膏として配合されてもよい。
担体はまた、作用物質の送達を持続(すなわち、延長、遅延、もしくは調節)するために、または治療剤の送達、取り込み、安定性、もしくは薬物動態を増強するために送達ビヒクルを含んでもよい。このような送達ビヒクルは、非限定的な例として、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、無機化合物、ポリマーまたはコポリマーのヒドロゲル、およびポリマーミセルからなる、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよい。適切なヒドロゲルおよびミセル送達システムには、WO2004/009664A2に開示されるPEO：PHB：PEOコポリマーおよびコポリマー/シクロデキストリン複合体、ならびに米国特許出願公開第2002/0019369A1号に開示されるPEOおよびPEO/シクロデキストリン複合体が含まれる。このようなヒドロゲルは目的の作用部位に局所に注射されてもよく、持効性デポーを形成するように皮下または筋肉内に注射されてもよい。
本発明の組成物は、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または吸入剤として送達されるために製剤化されてもよい。
関節内送達の場合、任意でMASP-2阻害物質と組み合わせたMASP-3阻害抗体は、注射可能な前記の液体担体もしくはゲル担体、注射可能な前記の持効性送達ビヒクル、またはヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体の中に入れて運ばれてもよい。
非ペプチド物質の経口投与の場合、任意でMASP-2阻害物質と組み合わせたMASP-3阻害抗体は、スクロース、コーンスターチ、またはセルロースなどの不活性な増量剤または希釈剤の中に入れて運ばれてもよい。
局部投与の場合、任意でMASP-2阻害物質と組み合わせたMASP-3阻害抗体は、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、点眼薬、坐剤、スプレー、液体もしくは粉末の中に入れて運ばれてもよく、ゲルまたはマイクロカプセル送達システムの中に入れて経皮パッチを介して運ばれてもよい。
エアゾール剤、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、およびネブライザーを含む様々な鼻送達システムおよび肺送達システムが開発中であり、それぞれ、エアゾール剤、吸入剤、または噴霧送達ビヒクルの中に入れて本発明の送達用に適切に適合化させることができる。
くも膜下腔内(IT)送達または脳室内(ICV)送達の場合、適切に滅菌した送達システム(例えば、液体；ゲル、懸濁液など)を用いて、本発明の組成物を投与することができる。
本発明の組成物はまた、生体適合性の賦形剤、例えば、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、希釈剤、緩衝液、浸透促進剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、調味料(経口投与の場合)を含んでもよい。
抗体およびペプチドのための薬学的担体
本明細書に記載される高親和性MASP-3阻害抗体に関してより具体的には、例示的な製剤を、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体でもよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤に溶解した化合物の注射投与量の溶液または懸濁液として非経口投与することができる。さらに、MASP-3抗体を含む組成物中には、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。薬学的組成物のさらなる成分には、石油(例えば、動物由来、野菜由来、または合成由来の石油)、例えば、ダイズ油および鉱油が含まれる。一般的に、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが注射液に好ましい液体担体である。
MASP-3抗体はまた、活性物質を徐放または拍動放出(pulsatile release)を可能にするように製剤化されすることができるデポー注射剤または移植片調製物の形で投与することができる。
XVIX. 投与の方法
任意でMASP-2阻害物質と組み合わせたMASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物は、局所投与方法または全身投与方法が、治療されている状態に最も適しているかどうかに応じて多くのやり方で投与することができる。さらに、本発明の組成物を移植可能な医療装置の表面に、または移植可能な医療装置の中にコーティングまたは組み込むことによって、本発明の組成物を送達することができる。
全身送達
本明細書で使用する「全身送達」および「全身投与」という用語は、筋肉内(IM)投与経路、皮下投与経路、静脈内(IV)投与経路、動脈内投与経路、吸入投与経路、舌下投与経路、頬投与経路、局部投与経路、経皮投与経路、鼻投与経路、直腸投与経路、腟投与経路、および送達作用物質を1つまたは複数の目的の治療作用部位に効果的に分散させる他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むが、これらに限定されないことが意図される。本組成物の好ましい全身送達経路には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、動脈内経路、および吸入経路が含まれる。本発明の特定の組成物において用いられる選択された作用物質の正確な全身投与経路は、一つには、ある特定の投与経路に関連した代謝変換経路に対する作用物質感受性を説明するように決定されることが理解されると考えられる。例えば、ペプチド物質は、最も適切には、経口以外の経路によって投与することができる。
本明細書に記載されるMASP-3阻害抗体を、それを必要とする対象に任意の適切な手段によって送達することができる。MASP-3抗体およびポリペプチドの送達方法は、経口投与経路、肺投与経路、非経口投与経路(例えば、筋肉内投与経路、腹腔内投与経路、静脈内(IV)投与経路、もしくは皮下注射投与経路)、吸入投与経路(例えば、細粉製剤を介した吸入投与経路)、経皮投与経路、鼻投与経路、腟投与経路、直腸投与経路、または舌下投与経路を含み、それぞれの投与経路に適した剤形で処方されることができる。
代表的な例として、ポリペプチドを吸収することができる身体の膜、例えば、鼻、胃腸、および直腸の膜に適用することによって、MASP-3阻害抗体およびペプチドを生体内に導入することができる。ポリペプチドは典型的には浸透促進剤と共に吸収性の膜に適用される(例えば、Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5：69 (1988)； Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13：213 (1990)； Lee, V.H.L,, Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York(1991)； DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13：241 (1990)を参照されたい)。例えば、STDHFは、胆汁塩と構造が類似し、鼻送達用の浸透促進剤として用いられてきたステロイド性界面活性剤であるフシジン酸合成誘導体である(Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990)。
酵素分解からポリペプチドを保護するために、本明細書に記載されるMASP-3阻害抗体を脂質などの別の分子と結合させて導入することができる。例えば、ある特定のタンパク質を体内の酵素加水分解から保護し、従って、半減期を延長するために、ポリマー、特にポリエチレングリコール(PEG)の共有結合が用いられてきた(Fuertges, P., et al., J. Controlled Release 11：139 (1990))。タンパク質送達のための多くのポリマー系が報告されている(Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9：271 (1989)； Hori, R., et al., Pharm. Res. 6：813 (1989)：Yamakawa, L, et al., J. Pharm. Sci. 79：505 (1990)； Yoshihiro, I., et al., Controlled Release 10：195 (1989)； Asano, M., et al., J. Controlled Release 9：111 (1989)； Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9：195 (1989)； Makino, K., J. Controlled Release 12：235 (1990)； Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78：117 (1989)； Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78：219 (1989))。
最近、血清安定性および循環半減期が改善したリポソームが開発された(例えば、Webbに対する米国特許第5,741,516号を参照されたい)。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製の様々な方法が詳しく調べられている(例えば、Szokaに対する米国特許第5,567,434号；Yagiに対する米国特許第5,552,157号；Nakamoriに対する米国特許第5,565,213号；Shinkarenkoに対する米国特許第5,738,868号；およびGaoに対する米国特許第5,795,587号を参照されたい)。
経皮適用の場合、本明細書に記載されるMASP-3阻害抗体は担体および/またはアジュバントなどの他の適切な成分と組み合わされてもよい。目的の投与のために薬学的に許容されなければならなず、組成物の活性成分の活性を分解することができないことを除けば、このような他の成分がどういったものかには制限はない。適切なビヒクルの例には、精製コラーゲンを含む、または含まない、軟膏、クリーム、ゲル、または懸濁液が含まれる。MASP-3阻害抗体はまた、好ましくは、液体または半液体の形で、経皮パッチ、硬膏、および包帯に含浸されてもよい。
本発明の組成物は、望ましいレベルの治療効果を維持するよう決定された間隔で定期的に全身投与されてもよい。例えば、組成物は、例えば、皮下注射によって2〜4週間ごとにまたはそれより少ない頻度で投与されてもよい。投与計画は、作用物質の組み合わせの作用に影響を及ぼし得る様々な要因を考慮して医師によって決定されると考えられる。これらの要因は、治療されている状態の進行の程度、患者の年齢、性別、および体重、ならびに他の臨床要因を含むと考えられる。それぞれの個々の作用物質の投与量は、組成物に含まれるMASP-3阻害抗体またはMASP-2阻害物質、ならびに任意の薬物送達ビヒクル(例えば、持効性送達ビヒクル)の存在および内容の関数として変化すると考えられる。さらに、送達作用物質の投与頻度および薬物動態学的挙動の変動の原因となるように投与量を調節することができる。
局所送達
本明細書で使用する「局所」という用語は、目的の限局作用の部位の中に、または目的の限局作用の部位の周囲に薬物を適用することを包含し、例えば、皮膚または他の患部組織への局部送達、眼送達、くも膜下腔内(IT)、脳室内(ICV)、関節内、洞内、頭蓋内、もしくは小胞内の投与、留置、または灌注を含んでもよい。局所投与は、低用量の投与が全身副作用を回避するために、ならびに局所送達部位に活性物質を送達および濃縮するタイミングをより正確に制御するために好ましい場合がある。局所投与は、代謝、血流などの患者間のばらつきに関係なく標的部位において既知濃度を供給する。改善された投与量制御は直接的な送達方法によっても提供される。
MASP-3阻害抗体またはMASP-2阻害物質の局所送達は、疾患または状態を治療するための外科的方法の状況において、例えば、動脈バイパス外科手術、アテレクトミー、レーザー処置、超音波処置、バルーン血管形成術、およびステント留置などの処置中に実現することができる。例えば、バルーン血管形成術と共にMASP-3阻害抗体またはMASP-2阻害物質を対象に投与することができる。バルーン血管形成術は、収縮したバルーンを有するカテーテルを動脈に挿入することを伴う。収縮したバルーンはアテローム性動脈硬化巣の近くに配置され、プラークが血管壁に押しつけられるように膨張される。結果として、バルーン表面は血管の表面にある血管内皮細胞の層と接触する。MASP-3阻害抗体またはMASP-2阻害物質は、アテローム性動脈硬化巣の部位に該物質を放出できるようにバルーン血管形成術カテーテルに取り付けられてもよい。該物質は、当技術分野において公知の標準的な手順に従ってバルーンカテーテルに取り付けることができる。例えば、バルーンが膨張されるまで、該物質はバルーンカテーテルの一区画に保管されてもよく、膨張時に該物質は局所環境に放出される。または、バルーンが膨張された場合に、該物質は動脈壁細胞と接触するようにバルーン表面に含浸されてもよい。該物質はまた、穴のあいたバルーンカテーテル、例えば、Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85：1110-1117 (1992)に開示される穴のあいたバルーンカテーテルの中に入れて送達されてもよい。治療用タンパク質をバルーン血管形成術カテーテルに取り付けるための例示的な手順については、公開されたPCT出願WO95/23161も参照されたい。同様に、MASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質は、ステントに適用されるゲルまたはポリマーコーティングの中に含まれてもよく、血管留置後にステントがMASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質を溶出するようにステント材料に組み込まれてもよい。
関節炎および他の筋骨格障害の治療において用いられるMASP-3阻害抗体は関節内注射によって局所送達されてもよい。このような組成物は、適宜、持効性送達ビヒクルを含んでもよい。局所送達が望ましいことがある場合のさらなる例として、泌尿生殖器状態の治療において用いられるMASP-3阻害組成物は、適宜、膀胱内に、または別の泌尿生殖器構造の中に点滴注入されてもよい。
XX.治療計画
予防的用途において、薬学的組成物は、第二経路関連の疾患または障害、たとえば発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）および血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症および重症筋無力症からなる群より選択される第二経路疾患または第二経路障害に罹患しやすい、またはそうでなければその危険のある対象に、状態の症状を発症するおそれを除く、または減らすのに十分な量で投与される。治療的用途において、薬学的組成物は、第二経路関連の疾患または障害、たとえば発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される第二経路疾患または第二経路障害の疑いがあるまたはすでにそれに罹患している対象に、状態の症状を軽減するのにまたは少なくとも部分的に減らすのに十分な治療的に有効な量で投与される。
1つの態様において、高親和性MASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物は、PNHに罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象に投与される。これにしたがって、対象の赤血球は組成物の非存在においてC3の断片によってオプソニン化され、対象への組成物の投与が対象における赤血球の生存率を増加させる。1つの態様において、対象は、組成物の非存在において、（i）正常より低いレベルのヘモグロビン、（ii）正常より低いレベルの血小板；（iii）正常より高いレベルの網状赤血球、および（iv）正常より高いレベルのビリルビンからなる群より選択される1つまたは複数の症状を示し、対象への組成物の投与は、症状の少なくとも1つまたは複数を改善して、（i）増加した、正常な、もしくはほぼ正常なレベルのヘモグロビン、（ii）増加した、正常な、もしくはほぼ正常なレベルの血小板、（iii）低下した、正常な、もしくはほぼ正常なレベルの網状赤血球、および／または（iv）低下した、正常な、もしくはほぼ正常なレベルのビリルビンを生じさせる。
発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、およびベーチェット病からなる群より選択される疾患または状態の治療、予防、またはその重症度の軽減のための予防および治療計画の両方において、高親和性MASP-3阻害抗体および任意でMASP-2阻害物質を含む組成物が、対象において十分な治療結果が達成されるまで、いくつかの用量において投与され得る。本発明の1つの態様において、高親和性MASP-3阻害抗体および／またはMASP-2阻害物質は、成人患者（たとえば体重70kgの平均的成人）に、0.1mg〜10,000mg、より好適には1.0mg〜5,000mg、より好適には10.0mg〜2,000mg、より好適には10.0mg〜1,000mg、さらに好適には50.0mg〜500mgまたは10〜200mgの用量で投与され得る。小児患者の場合、用量は、患者の体重と比例して調節することができる。
本発明の高親和性MASP-3阻害抗体および任意のMASP-2阻害組成物の適用は、第二経路関連の疾患または障害、たとえば発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症および重症筋無力症からなる群より選択される疾患または障害の治療のために、組成物（たとえば、MASP-3および任意でMASP-2阻害物質または二重特異性もしくは二重阻害性物質を含む単一の組成物または別々の組成物の同時投与）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。
あるいは、組成物は、最適な治療効果のために医師によって決定される長期間にわたり、毎日、週二回、毎週、2週に一回、毎月または2月に一回のような定期的間隔で投与されてもよい。
いくつかの態様においては、少なくとも1つの高親和性MASP-3阻害抗体を含む第一の組成物および少なくとも1つのMASP-2阻害物質を含む第二の組成物が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）もしくは血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される疾患もしくは状態に罹患している対象またはそれを発症する危険のある対象に投与される。
1つの態様においては、少なくとも1つの高親和性MASP-3阻害抗体を含む第一の組成物および少なくとも1つのMASP-2阻害物質を含む第二の組成物が同時に（すなわち、約15分またはそれ未満、たとえば10分以下、5分以下、または1分以下のいずれかの時間間隔内で）投与される。1つの態様においては、少なくとも1つの高親和性MASP-3阻害抗体を含む第一の組成物および少なくとも1つのMASP-2阻害物質を含む第二の組成物が順次に投与される（すなわち、第一の組成物が第二の組成物の投与の前または後で投与され、投与の時間間隔は15分超である）。いくつかの態様においては、少なくとも1つの高親和性MASP-3阻害抗体を含む第一の組成物および少なくとも1つのMASP-2阻害物質を含む第二の組成物が同時並行的に投与される（すなわち、第一の組成物の投与期間が第二の組成物の投与と重なり合う）。たとえば、いくつかの態様において、第一の組成物および／または第二の組成物は、少なくとも1、2、3、または4週またはより長い期間、投与される。1つの態様において、少なくとも1つの高親和性MASP-3阻害抗体および少なくとも1つのMASP-2阻害物質は単位剤形に組み合わされる。1つの態様においては、少なくとも1つの高親和性MASP-3阻害抗体を含む第一の組成物および少なくとも1つのMASP-2阻害物質を含む第二の組成物が、第二経路関連の疾患または障害、たとえば発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症の治療に使用するためのキットの中にいっしょにパッケージングされる。
いくつかの態様において、PNH、加齢黄斑変性症（AMD）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）を含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症に罹患している対象は、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害物質による治療を以前に受けたことがあるかまたは現在受けている。いくつかの態様において、方法は、高親和性MASP-3阻害抗体および任意でMASP-2阻害物質を含む本発明の組成物を対象に投与する工程およびさらに、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害物質を対象に投与する工程を含む。いくつかの態様において、終末補体阻害物質はヒト化抗C5抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、終末補体阻害物質はエクリズマブである。
XXI. 実施例
以下の実施例は、本発明の実施について意図された最良の形態の単なる例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本明細書中の全ての文献引用が明確に参照により組み入れられる。
実施例1
本実施例は、MASP-2欠損マウスが、髄膜炎菌血清群Aまたは髄膜炎菌血清群Bのどちらかに感染した後に髄膜炎菌誘導死から保護されることを証明する。
方法：
MASP-2ノックアウトマウス(MASP-2 KOマウス)を、本明細書に参照として組み入れられるUS 7,919,094の実施例1に記載のように生成した。100μl体積で投与量2.6×107CFUの髄膜炎菌血清群A Z2491を腹腔内(i.p.)注射することによって、10週齢MASP-2 KOマウス(n=10)および野生型(WT)C57/BL6マウス(n=10)に接種した。感染用量を、最終濃度400mg/kgの鉄デキストランと一緒にマウスに投与した。72時間の期間にわたって感染後のマウスの生存をモニタリングした。
別の実験では、100μＬ体積で投与量6×106CFUの髄膜炎菌血清群B MC58株をi.p.注射することによって、10週齢MASP-2 KOマウス(n=10)およびWT C57/BL6マウス(n=10)に接種した。感染用量を、最終用量400mg/kgの鉄デキストランと一緒にマウスに投与した。72時間の期間にわたって感染後のマウスの生存をモニタリングした。感染後72時間の期間中に、以下の表5に記載の疾病スコアリングパラメータに基づいて、WTマウスおよびMASP-2 KOマウスの疾病スコアも求めた。この疾病スコアリングはFransen et al., (2010)の手法に基づき、これにわずかな変更を加えた。
（表５）感染マウスにおける臨床徴候に関連した疾患スコアリング
Figure 0006971306
感染を検証し、血清からの細菌クリアランスの割合を決定するために、感染後1時間おきにマウスから血液試料を採取し、分析して、髄膜炎菌の血清レベル(log cfu/mL)を求めた。
結果：
図6は、感染用量2.6×107cfuの髄膜炎菌血清群A Z2491を投与させた後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率(％)を図示したカプラン・マイヤープロットである。図6に示したように、感染後72時間の期間全体を通じて100％のMASP-2 KOマウスが生存した。対照的に、感染24時間後、WTマウスの80％しか生存しておらず(p=0.012)、感染72時間後、WTマウスの50％しか生存していなかった。これらの結果から、MASP-2欠損マウスは髄膜炎菌血清群A Z2491誘導死から保護されることが証明される。
図7は、感染用量6×106cfuの髄膜炎菌血清群B MC58株を投与した後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率(％)を図示したカプラン・マイヤープロットである。図7に示したように、感染後72時間の期間全体を通じてMASP-2 KOマウスの90％が生存した。対照的に、感染24時間後、WTマウスの20％しか生存していなかった(p=0.0022)。これらの結果から、MASP-2欠損マウスは髄膜炎菌血清群B MC58株誘導死から保護されることが証明される。
図8は、6×106cfuの髄膜炎菌血清群B MC58株にi.p.感染させた後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスから採取された血液試料中にある様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B MC58株のlog cfu/mLを図示する(両マウス群において様々な時点でn=3)。結果を平均±SEMとして表した。図8に示したように、WTマウスにおいて、血中の髄膜炎菌レベルは感染24時間後に約6.0 log cfu/mLのピークに達し、感染後36時間までに約4.0 log cfu/mLまで落ちた。対照的に、MASP-2 KOマウスにおいて、髄膜炎菌レベルは感染12時間後に約4.0 log cfu/mLのピークに達し、感染後36時間までに約1.0 log cfu/mLまで落ちた。(「*」という記号はp＜0.05を示す；「**」という記号はp=0.0043を示す)。これらの結果から、MASP-2 KOマウスにWTマウスと同用量の髄膜炎菌血清群B MC58株を感染させたが、MASP-2 KOマウスはWTと比較して菌血症のクリアランスを増強したことが証明される。
図9は、6×106cfuの髄膜炎菌血清群B MC58株を感染させて3時間後、6時間後、12時間後、および24時間後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの平均疾病スコアを図示する。図9に示したように、MASP-2欠損マウスは感染に対して高い耐性を示し、感染させて6時間後(「*」という記号はp=0.0411を示す)、12時間後(「**」という記号はp=0.0049を示す)、および24時間後(「***」という記号はp=0.0049を示す)の疾病スコアは非常にWTマウスと比較して非常に低かった。図9の結果を平均±SEMとして表した。
要約すると、本実施例の結果から、MASP-2欠損マウスは、髄膜炎菌血清群A感染後または髄膜炎菌血清群B感染後に髄膜炎菌誘導死から保護されることが証明される。
実施例2
本実施例は、髄膜炎菌感染後のMASP-2抗体の投与が髄膜炎菌感染マウスの生存率を増加させることを実証する。
背景/原理：
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,919,094号の実施例24に記載されているように、ラットMASP-2タンパク質を使用してFabファージディスプレイライブラリーをパンニングし、そこからFab2 #11を機能的に活性な抗体として同定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2aアイソタイプの完全長抗体をFab2 #11から生成した。マウスIgG2aアイソタイプの完全長MASP-2抗体を薬力学的パラメータに関して特徴決定した（米国特許第7,919,094号の実施例38に記載されているとおり）。
本実施例においては、Fab2 #11由来のマウスMASP-2完全長抗体を髄膜炎菌感染のマウスモデルにおいて分析した。
方法：
上記のように生成したFab2#11由来のマウスIgG2a完全長MASP-2抗体アイソタイプを、以下のように、髄膜炎菌感染マウスモデルにおいて試験した。
1. 感染後のマウスMASP-2モノクローナル抗体（MoAb）の投与
9週齢C57/BL6チャールズリバーマウスを、高用量（4×106cfu）の髄膜炎菌血清型B株MC58の腹腔内注射から3時間後、阻害性マウスMASP-2抗体（1.0mg/kg）（n=12）または対照アイソタイプ抗体（n=10）で処理した。
結果：
図10は、感染量4×106cfuの髄膜炎菌血清群B株MC58の投与ののち、阻害性MASP-2抗体（1.0mg/kg）または対照アイソタイプ抗体のいずれかを感染後3時間で投与したマウスの生存率％をグラフで示すカプラン・マイヤー（Kaplan-Meyer）プロットである。図10に示すように、MASP-2抗体で処理されたマウスは、90％が感染後72時間を通して生存した。対照的に、アイソタイプ抗体で処理されたマウスは、50％しか感染後72時間を通して生存しなかった。「*」という記号は、2つの生存曲線の比較によって決定されたp=0.0301を示す。
これらの結果は、MASP-2抗体の投与が、髄膜炎菌感染対象を治療し、その生存率を改善するのに有効であることを実証する。
本明細書に実証されるように、髄膜炎菌感染対象の治療におけるMASP-2抗体の使用は、感染後3時間以内に投与された場合に有効であり、感染後24時間〜48時間以内で有効であると予想される。髄膜炎菌性の疾病（髄膜炎菌血症または髄膜炎）は緊急事態であり、治療は通常、髄膜炎菌性の疾病が疑われる場合はただちに（すなわち、髄膜炎菌が病原物質として陽性と特定される前に）開始される。
実施例1において実証されたMASP-2 KOマウスの結果を考慮すると、髄膜炎菌感染前のMASP-2抗体の投与が、感染を予防するのにまたは感染の重篤さを軽減するのにも有効であると考えられる。
実施例3
本実施例は、ヒト血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3依存性であることを実証する。
原理：
機能的MBLの血清レベルが低下した患者は、再発性の細菌および真菌感染への罹患性の増大を示す（Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572：401-413 (2002)）。髄膜炎菌がMBLによって認識されることは公知であり、MBL欠損血清が髄膜炎菌を溶解しないことが示されている。
実施例1および2に記載された結果を考慮して、補体欠損血清および対照ヒト血清における髄膜炎菌感染を治療するためのMASP-2抗体投与の有効性を判定するための一連の実験を実施した。補体経路を保持するために、高い血清濃度（20％）で実験を実施した。
方法：
1. 様々な補体欠損ヒト血清におけるおよびヒトMASP-2抗体で処理されたヒト血清における血清殺菌活性
この実験には、以下の補体欠損ヒト血清および対照ヒト血清を使用した。
（表６）試験したヒト血清試料（図11に示す）
Figure 0006971306
組換えヒトMASP-2Aを抗原として使用して、ヒトMASP-2に対する組換え抗体をコンビナトリアル抗体ライブラリー（Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296：57-86 (2000)）から単離した（Chen, C. B. and Wallis, J. Biol. Chem. 276：25894-25902 (2001)）。ヒト血漿中のC4およびC3のレクチン経路媒介性活性化を強く阻害する（IC50約20nM）抗ヒトscFv断片を同定し、完全長ヒトIgG4抗体へと転換した。
髄膜炎菌血清型B-MC58を、表6に示す様々な血清とともに、それぞれ20％の血清濃度で、阻害性ヒトMASP-2抗体（全量100μl中3μg）を添加し、または添加せずに、振とうしながら37℃でインキュベートした。試料を以下の時点：0、30、60および90分間隔で採取し、平板培養したのち、生菌数を測定した。熱不活化ヒト血清を陰性対照として使用した。
結果：
図11は、表6に示すヒト血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。表7は、図11のスチューデントt検定の結果を提示する。
（表７）図11に関するスチューデントt検定結果（60分時点）
Figure 0006971306
図11および表7に示すように、ヒトMASP-2阻害抗体の添加によってヒト20％血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅が有意に高められた。
2. 様々な補体欠損ヒト血清における血清殺菌活性
この実験には、以下の補体欠損ヒト血清および対照ヒト血清を使用した。
（表８）試験したヒト血清試料（図12に示す）
Figure 0006971306
注記：試料DにおけるMASP-3-/-(MASP-1+)血清は、特徴が重なるCarnevale症候群、Mingarelli症候群、Malpuech症候群およびMichels症候群の統一用語である3MC症候群の対象から採取したものである。実施例4にさらに記載されるように、MASP-1/3遺伝子のエキソン12の突然変異は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にするが、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にしない。実施例10に記載されるように、プロD因子は3MC血清中に優先的に存在しているが、活性化されたD因子は正常ヒト血清中に優先的に存在している。
髄膜炎菌血清型B-MC58を、様々な補体欠損ヒト血清とともに、それぞれ20％の血清濃度で、振とうしながら37℃でインキュベートした。試料を以下の時点：0、15、30、45、60、90、および120分間隔で採取し、平板培養したのち、生菌数を測定した。熱不活化ヒト血清を陰性対照として使用した。
結果：
図12は、表8に示すヒト血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。図12に示すように、WT（NHS）血清が、髄膜炎菌に関して最高レベルの殺菌活性を有する。対照的に、MBL-/-およびMASP-3-/-（MASP-1充分である）ヒト血清は任意の殺菌活性を有しない。これらの結果は、ヒト20％(v/v)血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3およびMBL依存性であることを示す。表9は図12のスチューデントt検定の結果を提示する。
（表９）図12に関するスチューデントt検定結果
Figure 0006971306
要約すると、図12および表9に示す結果は、20％ヒト血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3-およびMBL依存性であることを実証する。
3. MASP-2、MASP-1/3、またはMBL A/Cを欠損している20％（v/v）マウス血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅
この実験には、以下の補体欠損マウス血清および対照マウス血清を使用した。
（表１０）試験したマウス血清試料（図13に示す）
Figure 0006971306
髄膜炎菌血清型B-MC58を、様々な補体欠損マウス血清とともに、それぞれ20％の血清濃度で、振とうしながら37℃でインキュベートした。試料を以下の時点：0、15、30、60、90、および120分間隔で採取し、平板培養したのち、生菌数を測定した。熱不活化ヒト血清を陰性対照として使用した。
結果：
図13は、表10に示すマウス血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。図13に示すように、MASP-2-/-マウス血清は、WTマウス血清よりも髄膜炎菌に関して高いレベルの殺菌活性を有する。対照的に、MASP-1/3-/-マウス血清は任意の殺菌活性を有しない。「**」という記号はp=0.0058を示し、「***」という記号はp=0.001を示す。表11は、図13のスチューデントt検定の結果を提示する。
（表１１）図13に関するスチューデントt検定結果
Figure 0006971306
要約すると、本実施例における結果は、MASP-2-/-血清が、WT血清よりも髄膜炎菌に関して高いレベルの殺菌活性を有すること、および20％血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3-およびMBL依存性であることを実証する。
実施例4
本実施例は、実施例1〜3に記載されるような、MASP-2 KOマウスにおいて認められた髄膜炎菌感染に対するMASP-3依存性抵抗の機構を決定するために実施された一連の実験を記載する。
原理：
以下のように、MASP-2 KOマウスにおいて認められた髄膜炎菌感染に対するMASP-3依存性抵抗の機構（上記実施例1〜3に記載）を決定するために一連の実験を実施した。
1. MASP-1/3欠損マウスはレクチン経路機能活性（「LEA-2」とも呼ばれる）を欠損していない
方法：
MASP-1/3欠損マウスがレクチン経路機能活性（「LEA-2」とも呼ばれる）を欠損しているかどうかを判定するために、参照により本明細書に組み入れられるSchwaeble W. et al., PNAS vol 108(18)：7523-7528 (2011)に記載されているとおりに、レクチン活性化経路特異的アッセイ条件下（1％血漿）、試験される様々な補体欠損マウス系統からの血漿中のC3コンバターゼ活性の動態を測定するためのアッセイ法を実施した。
以下のように、WT、C4-/-、MASP-1/3-/-、B因子-/-、およびMASP-2-/-マウス由来の血漿を試験した。
C3活性化を測定するために、マイクロタイタープレートを、マンナン（1μg/ウェル）、コーティング緩衝液（15mM Na2Co3、35mM NaHCO3）中ザイモサン（1μg/ウェル）またはコーティング緩衝液中1％ヒト血清アルブミン（HSA）でコーティングすることによってインサイチューで生成した免疫複合体でコーティングし、次いで、TBS（10mM Tris、140mM NaCl、pH7.4）中ヒツジ抗HAS血清（2μg/mL）を0.05％ Tween 20および5mM Ca++とともに加えた。プレートをTBS中0.1％ HSAでブロッキングし、TBS/Tween20/Ca++で3回洗浄した。血漿試料を4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4で希釈し、プレートに加え、37℃で1.5時間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗ヒトC3c（Dako）、次いでアルカリホスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgGおよびp-ニトロフェニルホスフェートを使用して、結合したC3bを検出した。
結果：
レクチン経路特異的条件下のC3活性化の動態（1％血清を有するマンナンコーティングされたプレート上のC3b沈着によって測定）を図14に示す。MASP-2-/-血漿中にはC3切断は見られなかった。B因子-/-(B因子-/-)血漿は、おそらくは増幅ループの損失のせいで、WT血漿の半分の速度でC3を切断した。C4-/-（T1/2=33分）およびMASP-1/3-/-欠損血漿（T1/2=49分）においてC3からC3bへのレクチン経路依存性転換の有意な遅延が見られた。MASP-1/3-/-血漿におけるC3活性化のこの遅延は、MASP-3依存性ではなくMASP-1依存性であることが示されている（Takahashi M. et al., J Immunol 180：6132-6138 (2008)を参照されたい）。これらの結果は、MASP-1/3-欠損マウスがレクチン経路機能活性（「LEA-2」とも呼ばれる）を欠損していないことを実証する。
2. 第二経路活性化に対する遺伝性MASP-3欠損の影響
原理：
MASP-3のセリンプロテアーゼをコードするエキソン中のフレームシフト突然変異によって生じる3MC症候群を有するMASP-3欠損患者の血清を試験することにより、第二経路活性化に対する遺伝性MASP-3欠損の影響を判定した。3MC症候群とは、特徴が重なるCarneavale症候群、Mingarelli症候群、Malpuech症候群およびMichels症候群の統一用語である。この珍しい常染色体劣性障害は、特徴的な顔面異形症、口唇裂および/または口蓋裂、頭蓋骨癒合症、学習障害、ならびに性器、四肢、および膀胱直腸異常を含む一連の発達的特徴を示す。Rooryck et al., Nature Genetics 43：197-203 (2011)は、3MC症候群の11家族を研究し、突然変異した2つの遺伝子COLEC11およびMASP-1を同定した。MASP-1遺伝子の突然変異は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にするが、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にはしない。したがって、MASP-3のセリンプロテアーゼをコードするエキソン中に突然変異を有する3MC患者は、MASP-3を欠損しているが、MASP-1を充分に有する。
方法：
MASP-3欠損血清は、3MC患者、その3MC患者の母親および父親(両親とも、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルに関してヘテロ接合性）ならびにC4欠損患者（両方のヒトC4遺伝子を欠損している）およびMBL欠損対象から得た。Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11：291-295 (1981)）に記載されているような従来のAP特異的条件下（BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、0.5〜25％の範囲の血清濃度で第二経路アッセイ法を実施し、時間の経過とともにC3b沈着を測定した。
結果：
図15は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上の第二経路駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損およびMBL欠損対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図15に示すように、MASP-3欠損患者の血清は、高い血清濃度（25％、12.5％、6.25％血清濃度）で残留第二経路(AP)活性を有するが、有意に高いAP50（すなわち、最大C3沈着の50％を達成するために必要な血清の9.8％）を有する。
図16は、「従来の」第二経路特異的（AP特異的）条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上の第二経路駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損、およびMBL欠損ヒト対象から採取された10％ヒト血清試料中の時間の関数としてグラフで示す。
以下の表12は、図15に示すAP50結果および図16に示すC3b沈着の半減期をまとめたものである。
（表１２）図15および16に示す結果の概要
Figure 0006971306
注記：BBS/Mg++/EGTA緩衝液中、レクチン経路媒介効果は、この緩衝液中のCa++の非存在のせいで失われている。
要約すると、これらのアッセイ法の条件下では、第二経路は3MC患者において有意に損なわれている。
3. MASP-2またはMASP-1/3を欠損しているマウス血清におけるマンナン、ザイモサン、および肺炎連鎖球菌D39へのC3b沈着の測定
方法：
MASP-2-/-、MASP-1/3-/-、およびWTマウスから採取された0％〜20％の範囲のマウス血清濃度を使用して、マンナン、ザイモサンおよび肺炎連鎖球菌D39でコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着を測定した。「従来の」第二経路特異的条件下（すなわちCa++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下（すなわちBBS/Mg++/Ca++）、C3b沈着アッセイ法を実施した。
結果：
図17Aは、従来の第二経路特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(BBS/Mg++/Ca++）、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスから採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図17Bは、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスからの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図17Cは、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++）、肺炎連鎖球菌D39コーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスからの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。
図18Aは、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++）、0％〜1.25％の範囲の血清濃度を使用して、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上で実施された高希釈血清中のC3b沈着アッセイ法の結果をグラフで示す。図18Bは、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/EGTA/Mg++/Ca++）、0％〜1.25％の範囲の血清濃度を使用して、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上で実施されたC3b沈着アッセイ法の結果をグラフで示す。図18Cは、従来のAP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/EGTA/Mg++/Ca++）、0％〜1.25％の範囲の血清濃度を使用して、肺炎連鎖球菌D39コーティングされたマイクロタイタープレート上で実施されたC3b沈着アッセイ法の結果をグラフで示す。
また、図18A〜Cに示すように、従来の第二経路特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下（BBS/Mg++/Ca++）、0％〜1.25％血清の範囲の高めの希釈度を使用して、マンナンコーティングされたプレート上（図18A）；ザイモサンコーティングされたプレート上（図18B）および肺炎連鎖球菌D39コーティングされたプレート上（図18C）で、C3b沈着アッセイ法を実施した。第二経路は高めの血清希釈度下で次第に消失し、そのため、Ca++の存在においてMASP-1/3欠損血清中に認められた活性はMASP-2媒介性LP活性であり、Ca++の存在におけるMASP-2欠損血清中の活性はAPのMASP-1/3媒介性残留活性である。
考察：
本実施例に記載された結果は、MASP-2阻害因子（またはMASP-2 KO）が、MASP-3駆動型第二経路活性化を促進することにより、髄膜炎菌感染からの有意な保護を提供することを実証する。マウス血清溶菌アッセイ法およびヒト血清溶菌アッセイ法の結果はさらに、髄膜炎菌に対する血清殺菌活性をモニターすることにより、髄膜炎菌に対する殺菌活性がMBL欠損(マウスMBL AおよびMBL C二重欠損血清およびヒトMBL欠損血清)中には存在しないことを示す。
図1は、本明細書に提供される結果に基づくレクチン経路および第二経路の新たな理解を示す。図1は、オプソニン化および溶解の両方におけるLEA-2の役割を表す。MASP-2は、生理学的に複数のレクチン依存状況における「下流」C3b沈着（および結果的なオプソニン化）のイニシエーターであるが（図18A、18B、18C）、それは血清感受性細菌の溶解においても役割を果たす。図1に示すように、髄膜炎菌のような血清感受性病原体の場合のMASP-2欠損またはMASP-2枯渇血清/血漿の殺菌活性の増大の原因であると考えられる分子機構は、溶菌の場合、MASP-1およびMASP-3と関連したレクチン経路認識複合体が細菌表面上で互いに近接して結合し、それにより、MASP-1がMASP-3を切断することを可能にしなければならないということである。MASP-1およびMASP-2とは対照的に、MASP-3は自己活性化酵素ではなく、多くの場合、その酵素的に活性な形態へと転換されるためにはMASP-1による活性化および切断を必要とする。
図1にさらに示すように、活性化されたMASP-3はしたがって、病原体表面上のC3b結合B因子を切断して、酵素的に活性な第二経路C3およびC5コンバターゼそれぞれC3bBbおよびC3bBb(C3b)nの形成により、第二経路活性化カスケードを開始させることができる。MASP-2を有するレクチン経路活性化複合体は、MASP-3の活性化において役割を有さず、MASP-2の非存在において、またはMASP-2の枯渇後、全レクチン経路活性化複合体はMASP-1またはMASP-3のいずれかを付加される。したがって、MASP-2の非存在において、微生物表面上で、MASP-1およびMASP-3を有するレクチン経路活性化複合体が互いに近接するようになり、より多くのMASP-3が活性化され、それにより、より高速のC3b結合B因子のMASP-3媒介性切断を生じさせて、微生物表面上に第二経路C3およびC5コンバターゼC3bBbおよびC3bBb(C3b)nが形成する可能性が顕著に増大する。これが、表面結合C5bがC6と関連し、C5bC6がC7と関連し、C5bC6C7がC8と関連し、そしてC5bC6C7C8がC9を重合させる、終末活性化カスケードC5b-C9を活性化させて膜侵襲複合体を形成させ、それが細菌表面構造に入り込み、細菌壁中の孔を形成し、それが補体標的化細菌の浸透圧性死滅を生じさせる。
この新規な概念の核心は、本明細書に提供されるデータが、図1に示すように、レクチン経路活性化複合体が2つの別々の活性化ルートを駆動することを明らかに示すということである。
実施例5
本実施例は、発作性夜間血色素尿症(PNH)のマウスモデルから得られた血液試料に由来する赤血球の溶解に対するMASP-2欠損および/またはMASP-3欠損の阻害作用を証明する。
原理/背景：
発作性夜間血色素尿症(PNH)はマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、補体誘導性の血管内溶血性貧血を特徴とする、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHの顕著な特徴は、補体制御因子CD55およびCD59がPNH赤血球上に存在しないために補体第二経路が無秩序に活性化した結果である慢性的な補体媒介性血管内溶血と、その後に起こるヘモグロビン尿症および貧血である。Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11)(2010)、Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11：528-535(2011)。PNHにおける貧血は血流中の赤血球の破壊が原因である。PNHの症状には、尿中のヘモグロビンの出現による赤色尿、背部痛、疲労、息切れ、および血栓症が含まれる。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれるか、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。PNHの治療には、貧血の場合は輸血、血栓症の場合は血液凝固阻止、および補体系を阻害することによって免疫破壊から血球を保護するモノクローナル抗体エクリズマブ(Soliris(登録商標))の使用(Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6) 552-9(2004))が含まれる。エクリズマブ(Soliris(登録商標))は、補体成分C5を標的とし、C5コンバターゼによるC5切断を遮断し、それによって、C5aの産生およびMACの集合を阻止するヒト化モノクローナル抗体である。エクリズマブによるPNH患者の治療は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって測定されるように血管内溶血を減少させ、そのため、患者の約半分におけるヘモグロビン安定化および輸血非依存性につながった(Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol11(6)(2011))。エクリズマブ療法を受けているほぼ全員の患者においてLDHレベルが正常またはほぼ正常になったが(血管内溶血の管理のため)、患者の約1/3しかヘモグロビン値 約11gr/dLに達せず、エクリズマブを服用した残りの患者は中程度から重度の(すなわち、輸血依存性)貧血をほぼ同じ割合で示し続ける(Risitano A.M. et al., Blood 113：4094-100(2009))。Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11：528-535(2011)に記載のように、エクリズマブを服用しているPNH患者は、PNH赤血球のかなりの部分に結合しているC3断片を含んだ(が、未治療患者は含んでいなかった)ことが証明された。このことから、膜に結合しているC3断片はPNH赤血球に対してオプソニンとして働き、その結果、特異的C3受容体を介して細網内皮細胞内に閉じ込められ、その後に、血管外溶血が起こるという結論が導かれた。従って、C3断片を介した血管外溶血を発症している患者は赤血球輸血を必要とし続けるので、これらの患者には、エクリズマブの使用の他に治療方針が必要とされる。
本実施例は、PNHのマウスモデルから採取された血液試料からの赤血球の溶解に対するMASP-2およびMASP-3欠損血清の効果を評価するための方法を記載し、PNHに罹患している対象を治療するためのMASP-2阻害および/またはMASP-3阻害の有効性を実証し、また、エクリズマブのようなC5阻害因子による治療を受けているPNH対象においてC3断片媒介性血管外溶血の影響を緩和するためのMASP-2の阻害因子および/またはMASP-3の阻害因子（二重または二重特異性MASP-2/MASP-3阻害因子を含む）の使用を裏付ける。
方法：
PNH動物モデル：
CrryおよびC3を欠損した（Crry/C3-/-）遺伝子標的化マウスおよびCD55/CD59欠損マウスから血液試料を採取した。これらのマウスは、赤血球上のそれぞれの表面補体制御因子を欠き、したがって、これらの赤血球はPNHヒト血球と同様に自発的に補体自己溶解を受けやすい。
これらの赤血球をさらに感作させるために、これらの細胞を、マンナンコーティングした状態およびマンナンコーティングされない状態で使用し、次いで、WT C56/BL6血漿、MBLヌル血漿、MASP-2-/-血漿、MASP-1/3-/-血漿、ヒトNHS、ヒトMBL-/-血漿およびヒトMASP-2抗体で処理されたNHS中での溶血に関して試験した。
1. MASP-2欠損/枯渇血清および対照におけるCrry/C3およびCD55/CD59二重欠損ネズミ赤血球の溶血アッセイ法
1日目、ネズミRBC(±マンナンコーティング)の調製
材料は以下を含むものであった：新鮮なマウス血液、BBS/Mg++/Ca++（4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++）、塩化クロム、CrCl3・6H2O（BBS/Mg++/Ca++中0.5mg/mL）、およびマンナン、BBS/Mg++/Ca++中100μg/mL。
全血(2mL)を、4℃の冷却遠心分離機中、2000×gで1〜2分間スピンダウンした。血漿およびバフィーコーティングを吸引した。次いで、RBCペレットを氷冷BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++2mL中に再懸濁させ、遠心処理工程を繰り返すことによって試料を3回洗浄した。3回目の洗浄後、ペレットをBBS/Mg++/Ca++4mL中に再懸濁させた。RBCの2mLアリコートをコーティングなしの対照として取っておいた。残りの2mLに、CrCl3 2mLおよびマンナン2mLを添加し、試料を穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートした。BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++7.5mLを添加することによって反応を停止させた。上記のように試料をスピンダウンし、BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++2mL中に再懸濁させ、上記のようにさらに2回洗浄したのち、4℃で貯蔵した。
2日目、溶血アッセイ法
材料は、BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++（上記）、試験血清、96ウェル丸底および平底プレートならびに410〜414nmで96ウェルプレートを読み取る分光光度計を含むものであった。
まず、RBC濃度を測定し、細胞を109/mLに調節し、この濃度で貯蔵した。使用前、細胞をアッセイ緩衝液中で108/mLまで希釈し、次いで、1ウェルあたり100uLを使用した。410〜414nmで溶血を測定した（541nmより大きな感度を可能にする）。試験血清希釈物を氷冷BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++中に調製した。各血清希釈物100μLをピペットで丸底プレートに入れた。適切に希釈したRBC調製物100μLを添加し（すなわち、108/mL）、37℃で約1時間インキュベートし、溶解に関して観察した（この時点でプレートの写真を撮り得る)。次いで、プレートを最大速度で5分間スピンダウンした。流体相100μLを吸引し、平底プレートに移し、410〜414nmでODを記録した。RBCペレットを保持した（その後、これらを水で溶解して逆の結果を得ることができる）。
実験#1
上記プロトコールに詳述したように、CD55/CD59二重欠損マウスおよびCrry/C3二重欠損マウスから新鮮な血液を採取し、赤血球を調製した。赤血球を分割し、赤血球の半分をマンナンでコーティングし、他方の半分を未処理のままにし、最終濃度を108/mLに調節し、そのうち100μLを、上記のように実施した溶血アッセイ法に使用した。
実験#1の結果：レクチン経路はPNH動物モデルにおける赤血球溶解に関与する
最初の実験において、コーティングなしのWTマウス赤血球が任意のマウス血清中で溶解しないことがわかった。さらに、マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球は、WTマウス血清中ではゆっくりと溶解するが（37度で3時間超）、MBLヌル血清中では溶解しないことがわかった（データ示さず）。
マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球はヒト血清中では急速に溶解するが、熱不活化NHS中では溶解しないことがわかった。重要なことに、マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球は、NHS中、1/640まで希釈されても溶解した（すなわち、1/40、1/80、1/160、1/320、および1/640希釈物が全て溶解した）（データ示さず）。この希釈度では、第二経路は作用しない（AP機能活性は血清濃度8％未満で有意に低下する）。
実験#1からの結論
マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球は、MBLを含む高希釈ヒト血清中では非常に良好に溶解するが、MBLを含まない高希釈ヒト血清中ではそうはならない。試験した各血清濃度での効率的な溶解は、第二経路がこの溶解に関与せず、または必要とされないことを暗示する。MBL欠損マウス血清およびヒト血清がマンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球を溶解できないことは、古典経路もまた、観察された溶解とは関係がないことを示す。レクチン経路認識分子（すなわちMBL）が必要とされるため、この溶解はレクチン経路によって媒介される。
実験#2
Crry/C3およびCD55/CD59二重欠損マウスから新鮮な血を採取し、マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球を、上記のような溶血アッセイ法において、以下のヒト血清：MASP-3-/-；MBLヌル；WT；ヒトMASP-2抗体で前処理されたNHS；および対照としての熱不活化NHSの存在において分析した。
実験#2の結果：MASP-2阻害因子およびMASP-3欠損はPNH動物モデルにおける赤血球溶解を阻止する
マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球とともにNHSを、1/640まで（すなわち、1/40、1/80、1/160、1/320および1/640）希釈された希釈物、ヒトMBL-/-血清、ヒトMASP-3欠損血清（3MC患者からのもの）およびMASP-2 mAbで前処理されたNHSおよび対照として熱不活化NHSの中でインキュベートした。
ELISAマイクロタイタープレートをスピンダウンし、非溶解赤血球をラウンドウェルプレートの底に捕集した。各ウェルの上清を捕集し、ELISAリーダーにおいてOD 415nmを読み取ることにより、溶解した赤血球から放出されたヘモグロビンの量を測定した。
MASP-3-/-血清はマンナンコーティングされたマウス赤血球をまったく溶解しないことが認められた。対照の熱不活化NHS（陰性対照）においては、予想どおり、溶解は認められなかった。MBL-/-ヒト血清は、1/8および1/16希釈度で、マンナンコーティングされたマウス赤血球を溶解した。MASP-2抗体で前処理されたNHSは、1/8および1/16希釈度で、マンナンコーティングされたマウス赤血球を溶解したが、一方、WTヒト血清は、1/32の希釈度まで、マンナンコーティングされたマウス赤血球を溶解した。
図19は、MASP-3-/-、熱不活化（HI）NHS、MBL-/-、MASP-2抗体で前処理されたNHSおよびNHS対照からの血清中、一定範囲の血清希釈度にわたり、ヒト血清によるマンナンコーティングされたネズミ赤血球の溶血（上清への溶解マウス赤血球（Crry/C3-/-）のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。
図20は、MASP-3-/-、熱不活化（HI）NHS、MBL-/-、MASP-2抗体で前処理されたNHSおよびNHS対照からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、ヒト血清によるマンナンコーティングされたネズミ赤血球の溶血（上清への溶解マウス赤血球（Crry/C3-/-）のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。
図19および20に示す結果から、MASP-3の阻害が、自己由来の補体活性化からの保護を欠損している感作赤血球の任意の補体媒介性溶解を阻止することが実証される。MASP-2抗体によるMASP-2阻害は、CH50を有意にシフトさせ、ある程度まで保護性であったが、MASP-3阻害はより有効であった。
実験#3
Crry/C3およびCD55/CD59二重欠損マウスからの新鮮な血液から採取されたコーティングなしのCrry-/-マウス赤血球を、上記のような溶血アッセイ法において、以下の血清：MASP-3-/-；MBL-/-；WT；ヒトMASP-2抗体で前処理されたNHSおよび対照として熱不活化NHSの存在において分析した。
結果：
図21は、3MC（MASP-3-/-）患者、熱不活化（HI）NHS、MBL-/-、MASP-2抗体で前処理されたNHSおよびNHS対照からのヒト血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、コーティングなしのネズミ赤血球の溶血(上清への溶解WTマウス赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図21に示し、表13にまとめているように、MASP-3の阻害が非感作WTマウス赤血球の補体媒介性溶解を阻害することが実証される。
図22は、熱不活化（HI）NHS、MBL-/-、MASP-2抗体で前処理されたNHSおよびNHS対照からのヒト血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、ヒト血清によるコーティングなしのネズミ赤血球の溶血（上清への溶解マウス赤血球（CD55/59-/-）のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。図22に示し、表13にまとめているように、MASP-2の阻害は、限られた程度まで保護的であることが実証される。
（表１３）血清濃度として表されたCH50値
Figure 0006971306
注記：「CH50」とは、補体媒介性溶血が50％に達する点である。
要約すると、本実施例における結果は、MASP-3の阻害が、自己由来補体活性化からの保護を欠損している感作および非感作赤血球の任意の補体溶解を阻止することを実証する。MASP-2阻害もまた、ある程度まで保護的である。したがって、単独のまたは組み合わされる（すなわち、同時投与され、順次に投与される）MASP-2およびMASP-3阻害因子またはMASP-2/MASP-3二重特異性または二重阻害因子は、PNHに罹患している対象を治療するために使用され得、かつエクリズマブ（Soliris（登録商標））のようなC5阻害因子による治療を受けているPNH患者における血管外溶血を緩和する（すなわち、阻害するか、予防するか、またはその重篤さを低下させる）ために使用され得る。
実施例6
本実施例は、WTまたはMASP-1/3-/-マウス血清の存在における溶解に関してマンナンコーティングされたウサギ赤血球を試験する溶血アッセイ法を記載する。
方法：
1. マウスMASP-1/3欠損血清およびWT対照血清におけるウサギRBC(マンナンコーティングされた)の溶血アッセイ法
1日目、ウサギRBCの調製
材料は以下を含むものであった：新鮮なウサギ血液、BBS/Mg++/Ca++（4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++）、0.1％ゼラチンを含むBBS/Mg++/Ca++、緩衝液に含まれた塩化クロム、すなわちCrCl3.6H2O（BBS/Mg++/Ca++中0.5mg/mL）およびマンナン、BBS/Mg++/Ca++中100μg/mL。
1. ウサギ全血（2mL）を、2つの1.5mLエッペンドルフ管に分割し、4℃の冷却エッペンドルフ遠心分離機中、8000rpm（約5.9rcf）で3分間遠心処理した。氷冷BBS/Mg++/Ca++中に再懸濁させたのち、RBCペレットを3回洗浄した。3回目の洗浄後、ペレットをBBS/Mg++/Ca++4mL中に再懸濁させた。このアリコート2mLを、コーティングなし対照として使用するために、15mLファルコンチューブに加えた。残り2mLのRBCアリコートをCrC13緩衝液2mL中に希釈し、マンナン溶液2mLを添加し、懸濁液を穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートした。BBS/0.1％ゼラチン/Mg++/Ca++7.5mLを混合物に加えることによって反応を停止させた。上記のように赤血球をペレット化し、RBCをBBS/0.1％ゼラチン/Mg++/Ca++で2回洗浄した。RBC懸濁液をBBS/0.1％ゼラチン/Mg++/Ca++中、4℃で貯蔵した。
2. 懸濁させたRBC100μLを水1.4mLで希釈し、8000rpm（約5.9rcf）で3分間スピンダウンし、上清のODを541nmで0.7に調節した（541nmで0.7のODは赤血球約109個/mLに相当）。
3. 再懸濁させたRBCをBBS/0.1％ゼラチン/Mg++/Ca++で108個/mLの濃度まで希釈した。
4. 試験血清の希釈物を氷冷BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++中に調製し、各血清希釈物100μLを丸底プレートの対応するウェルにピペットで移した。適切に希釈したRBC100μL（108/mL）を各ウェルに加えた。完全な溶解のための対照として、精製水（100μL）を希釈RBC（100μL）と混合して100％溶解を生じさせ、一方、血清なしのBBS/0.1％ゼラチン/Mg++/Ca++（100μL）を陰性対照として使用した。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。
5. 丸底プレートを3250rpmで5分間遠心処理した。各ウェルからの上清（100μL）を平底プレートの対応するウェルに移し、ELISAリーダー中、415〜490nmでODを読み取った。結果を、490nmでのODに対する415nmでのODの比として報告する。
結果：
図23は、MASP-1/3-/-およびWT対照からの血清中の一定範囲の血清濃度にわたり、マウス血清によるマンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血（上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。図23に示すように、MASP-3の阻害が、マンナンコーティングされたWTウサギ赤血球の補体媒介性溶解を阻止することが実証される。これらの結果はさらに、実施例5に記載されたようなPNHの1つまたは複数の局面の治療のためのMASP-3阻害因子の使用を裏付ける。
実施例7
本実施例は、改変されたDT40細胞株DTLacOを使用するインビトロシステムを使用する、MASP-1およびMASP-3モノクローナル抗体の生成を記載する。
背景/原理：
WO2009029315およびUS2010093033にさらに記載されているように、特定のポリペプチドの可逆性多様化誘発を可能にする改変されたDT40細胞株DTLacOを含むインビトロシステムを使用して、ヒトMASP-1およびMASP-3に対する抗体を生成した。DT40は、培養中にその重鎖および軽鎖免疫グロブリン（Ig）遺伝子を構成性突然変異させることが知られているニワトリB細胞株である。他のB細胞と同様に、この構成性突然変異誘発は、Ig遺伝子のV領域への突然変異、ひいては発現した抗体分子のCDRを標的化する。DT40細胞中の構成性突然変異誘発は、各機能的V領域よりも上流に位置する非機能的V遺伝子セグメント（疑似V遺伝子；ΨV）のアレイをドナー配列として使用する遺伝子変換によって起こる。ΨV領域の欠失は、以前、ヒトB細胞において一般に認められる機構である、多様化の機構における遺伝子転換から体細胞超変異への切替えを生じさせることが知られていた。DT40ニワトリB細胞リンパ腫システムが、エクスビボでの抗体進化のための有望な出発点であることが示されている（Cumbers, S. J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002)； Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)）。DT40細胞は培養中、8〜10時間の倍加時間（ヒトB細胞システムの場合の20〜24時間に比べて）で強く増殖し、非常に効率的な相同遺伝子標的化を支援する（Buerstedde, J. M. et al. Embo J 9, 921-927 (1990)）。DT40細胞は、多様化のための2つの別々の生理学的経路、それぞれ鋳型化突然変異および非鋳型化突然変異を創製する遺伝子転換および体細胞超変異にアクセスすることができることを条件に、非常に大きな潜在的V領域配列多様性を命令する（Maizels, N. Annu Rev Genet. 39, 23-46 (2005)）。多様化した重鎖および軽鎖免疫グロブリン（Ig）は細胞表面表示IgMの形態で発現する。表面IgMは、構造的にIgG分子に似る二価形態を有する。特定の抗原への特異性をもってIgMを表示する細胞は、抗原の固定化可溶性バージョンまたは膜表示バージョンに結合させることによって単離することができる。しかし、抗体進化のためのDT40細胞の利用は実際には限られている。理由は、他の形質転換B細胞株と同様、多様化が生理学的速度の1％未満の速度でしか起こらないからである。
本実施例において使用されるシステムにおいては、WO2009029315およびUS2010093033に記載されているように、DT40細胞を操作して、さらなる遺伝子改変の能力または突然変異誘発に寄与するための遺伝子転換および体細胞超変異の潜在能力を犠牲にすることなく、Ig遺伝子多様化の速度を加速させた。多様化の速度を増加させ、その結果、本発明者らの細胞ライブラリー中の結合特異性の複雑さを増大させるために、DT40に対して2つの主要な改変を実施した。第一に、Ig遺伝子多様化を強力な大腸菌ラクトースオペレーター/レプレッサー制御ネットワーク下に置いた。強力な大腸菌ラクトースオペレーターの約100の重合リピートからなる多量体（PolyLacO）を、相同遺伝子標的化により、再構成され、発現したIgλおよびIgH遺伝子よりも上流に挿入した。次いで、ラクトースレプレッサータンパク質(LacI)に融合した制御因子をLacO制御要素につなぐと、オペレーターDNAのためのラクトースレプレッサーの高い親和性（kD=10-14M）を利用しながら多様化を制御することができる。PolyLacOがIgλだけで組み込まれたDT40 PolyLacO-λR細胞は、任意の操作の前の親DT40細胞に対して5倍増のIg遺伝子多様化速度を示した（Cummings, W. J. et al. PLoS Biol 5, e246 (2007)）。多様化はさらに、IgλおよびIgHの両遺伝子に標的化されたPolyLacOを有するように操作された細胞（「DTLacO」）において増大した。DTLacO細胞は、親DT40 PolyLacO-λR LacI-HP1株に特徴的な2.8％に対して2.5〜9.2倍増の多様化速度を有することが実証された。したがって、PolyLacO要素を重鎖および軽鎖の両遺伝子に標的化することが多様化をDT40親細胞株に対して21.7倍に加速させた。制御因子をIg位置につなぐことは、突然変異誘発の頻度を変化させるだけでなく、突然変異誘発の経路を変更して、ユニークな配列変化のより大きな集合を創製することができる（Cummings et al. 2007； Cummings et al. 2008）。第二に、つながれた因子で加速されるIg遺伝子多様化のための配列出発点の多様な集合を生成した。2月齢ニワトリから単離した再構成Ig重鎖可変領域を重鎖位置に標的化することにより、これらの多様な配列出発点をDTLacOに加えた。これらの重鎖可変領域の追加が抗体多様化のための107の新たな出発点のレパートリーを創製した。これら新たな出発点をDTLacO細胞株に組み込むと、特定の標的に結合するクローンの同定および、その後、つながれた因子による迅速な親和性成熟が可能になる。親和性成熟ののち、成熟し、再構成された重鎖および軽鎖可変配列（VHおよびVλ；ニワトリフレームワーク領域および相補性決定領域またはCDRからなる）を、ヒトIgG1およびラムダ定常領域を含む発現ベクターにクローニングすることにより、完全長組換えキメラIgGを作製する。これらの組換えmAbは、インビトロおよびインビボ用途に適し、ヒト化の出発点として働く。
方法：
MASP-1およびMASP-3抗原結合についての選択
遺伝子標的化によって多様化させたDTLacO集団を、ヒトMASP-1（SEQ ID NO：8）およびMASP-3抗原（SEQ ID NO：2）と複合化したビーズに結合することによって最初の選択を実施し、その後、FACSにより、蛍光標識可溶性抗原を使用して選択した（Cumbers, S. J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002)； Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)。MASP-1とMASP-3との間で共有されるα鎖中の保存されたアミノ酸配列（図2に示す）および別々のβ鎖配列（図2に示す）のせいで、MASP-1およびMASP-3へのバインダのための別々の平行スクリーニングを実施して、MASP-1特異性mAb、MASP-3特異性mAbならびにMASP-1およびMASP-3の両方に結合することができる（二重特異性）mAbを同定した。2つの形態の抗原を使用して、バインダを選択し、スクリーニングした。まず、Fcドメインに融合した、完全長または断片のいずれかの組換えMASP-1またはMASP-3をDynal磁性プロテインGビーズに結合させるか、または、PECy5標識抗ヒトIgG（Fc）二次抗体を使用してFACSベースの選択に使用した。あるいは、MASP-1またはMASP-3タンパク質の組換えバージョンをDylight flourで直接標識し、選択およびスクリーニングに使用した。
結合および親和性
PCR増幅V領域を293F細胞中のヒトIgG1の発現を支持するベクターにクローニングすることによって組換え抗体を生成した（Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4)：e36032 (2012)）。MASP-1またはMASP-3を様々な濃度の蛍光標識可溶性抗原と結合させる抗体を発現するDTLacO細胞を染色することによって飽和結合反応速度を測定した。MASP-3依存性C3b沈着およびMASP-3依存性D因子切断を含むMASP-3特異性活性に関する機能アッセイ法を、それぞれ実施例8および9に記載するように実施した。MASP-1特異性活性、すなわちMASP-1依存性C3b沈着の阻害に関する機能アッセイ法を以下に記載するように実施した。
結果：
上記方法を使用して、数多くのMASP-1およびMASP-3結合抗体を生成した。FACS分析によって実証された結合を、MASP-3バインダのスクリーニングにおいて単離された代表的なクローンM3J5およびM3M1に関して記載する。
図24Aは、DTLacOクローンM3J5に関するMASP-3抗原/抗体結合のFACSヒストグラムである。図24Bは、DTLacOクローンM3M1に関するMASP-3抗原/抗体結合のFACSヒストグラムである。図24Aおよび24Bにおいて、グレーに塗りつぶした曲線はIgG1染色した陰性対照であり、濃い黒の曲線はMASP-3染色である。
図25は、MASP-3抗原に関するクローンM3J5(クローン5)の飽和結合曲線をグラフで示す。図25に示すように、MASP-3に関するM3J5抗体の見かけ結合親和性は約31nMである。
標準的方法を使用して、同定されたクローンの配列分析を実施した。すべてのクローンを共通の(DT40)VHおよびVL配列ならびに互いと比較した。2つの前述のクローンM3J5およびM3M1の配列は、MASP-1およびMASP-3のCCP1-CCP2-SP断片のスクリーニングにおいてそれぞれ同定された2つのさらなる代表的クローンD14および1E10とでアライメントされた状態で提供されている。D14および1E10は、MASP-1およびMASP-3の両方に共通の領域に結合する。
図26Aは、ニワトリのDT40 VH配列への、M3J5、M3M1、D14および1E10のVH領域のアミノ酸配列アライメントである。
図26Bは、ニワトリのDT40 VL配列への、M3J5、M3M1、D14、および1E10のVL領域のアミノ酸配列アライメントである。
各クローンのVHおよびVLアミノ酸配列を以下に提供する。
重鎖可変領域(VH)配列
図26Aは、親DTLacO（SEQ ID NO：300)、MASP-3結合クローンM3J5（SEQ ID NO：301）およびM3M1（SEQ ID NO：302）ならびにMASP-1/MASP-3二重結合クローンD14（SEQ ID NO：306）および1E10（SEQ ID NO：308）に関する重鎖可変領域（VH）配列のアミノ酸アライメントを示す。
以下のVH配列中のKabat CDRは、以下のアミノ酸位置：H1：aa31〜35；H2：aa50〜62；およびH3：aa95〜102に位置する。
以下のVH配列中のChothia CDRは、以下のアミノ酸位置：H1：aa26〜32；H2：aa52〜56；およびH3：aa95〜101に位置する。
Figure 0006971306
軽鎖可変領域(VL)配列
図26Bは、親DTLacO（SEQ ID NO：303）ならびにMASP-3結合クローンM3J5（SEQ ID NO：304）およびM3M1（SEQ ID NO：305）ならびにMASP-1/MASP-3二重結合クローンD14（SEQ ID NO：307）および1E10（SEQ ID NO：309）に関する軽鎖可変領域（VL）配列のアミノ酸アライメントを示す。
Figure 0006971306
LEA-2（MASP-2依存性）機能アッセイ法
MASP-1は、MASP-2を活性化するその能力を介してLEA-2に寄与する（図1を参照されたい）。Wieslab(登録商標)補体システムスクリーニングMBLアッセイ法（Euro Diagnostica, Malmo, Sweden）は、LEA-2依存活性化（すなわち、従来のレクチン経路活性化）を単離する条件下、C5b-C9沈着を測定する。製造者の取り扱い指示に従って、代表的なクローン1E10を400nMの最終濃度で試験してアッセイ法を実施した。
図27は、mAb 1E10の阻害活性を、アッセイキットとともに提供される陽性血清およびアイソタイプ対照抗体と比較して示す棒グラフである。図27に示すように、mAb 1E10は、LEA-2依存性活性化の部分的阻害（MASP-2のMASP-1依存性活性の阻害による）を実証するが、一方、アイソタイプ対照抗体はそれを実証しない。DTLacO中のつながれた因子を使用するMASP-1結合に関するこの抗体の継続的な親和性成熟によってより強い阻害が達成されるはずである。
代表的なmAbの場合のLEA-1（MASP-3依存性）機能アッセイ法を以下、実施例8および9に記載する。
結果の要約：
上記の結果は、DTLacOプラットフォームが、LEA-1（以下、実施例8および9に示す）およびLEA-2（本実施例に示す）に対する阻害性を有するMASP-1およびMASP-3モノクローナル抗体の迅速なエクスビボ発見を可能にすることを示した。
実施例8
黄色ブドウ球菌による3MC血清中の補体経路の分析
背景/原理：
MASP-3は、正常ヒト血清の存在または非存在において非固定化流体相マンナン、ザイモサンAまたはN-アセチルシステインへの曝露を経ても活性化されないことがわかった。しかし、組換えおよび天然のMASP-3は正常ヒト血清(NHS)または熱不活化ヒト血清（HIS）の存在および非存在において熱不活化黄色ブドウ球菌の表面で活性化されることがわかった（データ示さず）。また、正常ヒト血清の存在において黄色ブドウ球菌の表面でC3b沈着が起こり、フローサイトメーターを使用してその沈着をモニターすることができることがわかった。したがって、LEA-1に対するMASP-3の寄与を評価する手段として、本実施例に記載するように、黄色ブドウ球菌に対する第二経路（AP）応答を測定した。
方法：
組換えMASP-3：完全長組換えヒトMASP-3をコードするポリヌクレオチド配列、MASP-3の切断型セリンプロテアーゼ(SP)活性バージョン（CCP1-CCP2-SP）およびSP不活化形態のMASP-3（S679A）をpTriEx7哺乳動物発現ベクター（Invivogen）にクローニングした。得られた発現構築物は完全長MASP-3またはCCP1-CCP2-SP断片をアミノ末端Streptagおよびカルボキシ末端His6タグによってコードする。発現構築物を製造者によって提供されるプロトコールに従ってFreestyle 293-FまたはExpi293F細胞（Invitrogen）中にトランスフェクトした。5％ CO2中37℃で3〜4日間の培養ののち、Streptactinアフィニティークロマトグラフィーを使用して組換えタンパク質を精製した。
組換えMASP-1：安定化R504Q（Dobo et al., J. Immunol. 183：1207, 2009）またはSP不活化（S646A）突然変異を有し、または有さず、アミノ末端Steptagおよびカルボキシ末端His6タグを有する完全長または切断型CCP1-CCP2-SP形態の組換えMASP-1を、上記組換えMASP-3に関して記載したように生成した。
1. 3MC（ヒト）血清中の黄色ブドウ球菌におけるC3b沈着およびB因子切断
最初の実験は、フローサイトメトリーアッセイ法がAP駆動型C3b沈着（AP-C3b）の存在または非存在を検出することができることを実証するために、以下のように実施した。以下の血清：正常ヒト血清、B因子(B因子)枯渇ヒト血清、D因子枯渇ヒト血清およびプロパージン枯渇ヒト血清（Complement Technology, Tyler, Texas., USAから入手）の5％を、Mg++/EGTA緩衝液またはEDTA中、試験抗体と4℃で一晩混合した。加熱殺菌黄色ブドウ球菌（108個/反応）を100μLの全量まで各混合物に加え、37℃で40分間回転流動させた。細菌を洗浄緩衝液中で洗浄し、細菌ペレットを洗浄緩衝液中に再懸濁させ、細菌表面のC3b沈着に関して各サンプルの80μLアリコートを分析し、それを、フローサイトメトリーを使用して、抗ヒトC3c（Dako, UK）で検出した。
C3bのフローサイトメトリー検出の結果を図28Aに示す。図28Aのパネル1に示すように、APを不活化することが知られているEDTAの存在における正常ヒト血清において、C3b沈着は認められなかった（陰性対照）。Mg++/EGTAで処理された正常ヒト血清においては、レクチン非依存性補体経路だけが機能することができる。パネル2においては、Mg++/EGTA緩衝液が使用され、したがって、APは活性であり、AP駆動型C3b沈着が認められる（陽性対照）。パネル3、4、および5に示すように、それぞれB因子枯渇血清、D因子枯渇血清およびプロパージン枯渇血清においては、予想どおり第二経路駆動型C3b沈着は認められない。これらの結果は、アッセイ法がAP依存性C3b沈着を検出することができることを実証する。
MASP-3を欠損しているヒト3MC血清中でAP（LEA-1）を再構成する組換えMASP-3の能力を評価するために、上記のように黄色ブドウ球菌におけるC3b沈着アッセイ法を実施した（Rooryck C, et al., Nat. Genet. 43(3)：197-203 (2011)）。以下の試薬の組み合わせを試験した。
1. 5％正常ヒト血清+EDTA
2. 5％正常ヒト血清+Mg/EGTA
3. 5％ヒト3MC（MASP-3-/-）血清+Mg++/EGTA
4. 5％ヒト3MC（MASP-3-/-）血清+Mg++/EGTAに加えて活性完全長rMASP-3
5. 5％ヒト3MC（MASP-3-/-）血清+Mg++/EGTAに加えて切断型活性rMASP-3（CCP1/CCP2/SP）
6. 5％ヒト3MC（MASP-3-/-）血清+Mg++/EGTAに加えて不活性rMASP-3(S679A)
7. 5％ヒト3MC（MASP-3-/-）血清+Mg++/EGTAに加えて活性完全長rMASP-1
上に示すような5％血清と組換えタンパク質（各5μg）との様々な混合物を、指定された緩衝液条件（Mg++/EGTA緩衝液またはEDTAのいずれか）で4℃において一晩インキュベートした。一晩インキュベーションしたのち、108個の加熱殺菌黄色ブドウ球菌を100μLの全量まで各混合物に加え、37℃で40分間回転流動させた。細菌を洗浄し、洗浄緩衝液中に再懸濁させ、C3b沈着に関して各サンプルの80μlアリコートをFACSによって分析した。各サンプルの残り20μLアリコートを使用して、B因子切断を、以下に記載する抗B因子抗体を使用するウェスタンブロットによって測定した。
C3bのフローサイトメトリー検出の結果を図28Bに示す。パネル番号は、上述した各試薬組み合わせに指定した番号に対応する。陰性対照（パネル1）および陽性対照（パネル2）は、予想どおり、C3b沈着の非存在および存在を示す。パネル3は、AP駆動型C3b沈着が3MC血清中では起こらないことを示す。パネル4および5は、活性完全長rMASP-3（パネル4）および活性rMASP-3（CCP1-CCP2-SP）（パネル5）がいずれも3MC血清中でAP駆動型C3b沈着を回復させることを示す。パネル6は、不活性rMASP-3（S679A）が3MC血清中でAP駆動型C3b沈着を回復させないことを示す。パネル7は、rMASP-1が3MC血清中でAP駆動型C3b沈着を回復させないことを示す。
まとめると、これらの結果は、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌におけるAP駆動型C3b沈着のためにはMASP-3が必要であることを実証する。
B因子のMASP-3依存性活性化
B因子のMASP-3依存性活性化を分析するために、5％血清(正常ヒト血清または3MC患者血清のいずれか)と組換えタンパク質との様々な混合物を上記のようにアッセイした。各反応混合物から20μLを取り出し、タンパク質試料添加緩衝液に加えた。試料を70℃で10分間加熱し、SDS-PAGEゲルに添加した。B因子ポリクローナル抗体（R&D Systems）を使用してウェスタンブロット分析を実施した。B因子の活性化は、高めの分子量のプロB因子タンパク質に由来する低めの分子量の2つの切断産物（BbおよびBa）の形成によって明らかであった。
図29は、rMASP-3の存在または非存在における3MC血清中の黄色ブドウ球菌に応答したB因子切断を判定するためのウェスタンブロット分析の結果を示す。レーン1に示すように、EDTAの存在における正常ヒト血清（陰性対照）は、レーン2（陽性対照）に示されるMg++/EGTAの存在における正常ヒト血清に対して非常にわずかなB因子切断しか実証しない。レーン3に示すように、3MC血清はMg++/EGTAの存在において非常にわずかなB因子切断しか実証しない。しかし、レーン4に示すように、B因子切断は、3MC血清への完全長組換えMASP-3タンパク質（5μg）の添加およびプレインキュベーションによって回復する。
B因子/C3（H2O）切断におけるプロD因子に対するrMASP-3の影響を判定するためのアッセイ法
MASP-3依存性B因子活性化/切断のための最小要件を決定するために以下のアッセイ法を実施した。
C3(H2O)（200ng）、精製した血漿B因子（20μg）、組換えプロD因子（200ng）および組換えヒトMASP-3（200ng）を、BBS/Ca++/Mg++中、様々な組み合わせ（図30に示すような）で100μLの全量に混合し、30℃で30分間インキュベートした。5％ 2-メルカプトエタノールを含有するSDS添加色素25uLを加えることによって反応を停止させた。振とうしながら（300rpm）95℃で10分間煮沸したのち、混合物を1400rpmで5分間スピンダウンし、上清20uLを10％ SDSゲルに添加し、分離させた。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。
結果：
図30は、B因子切断が分析されるクマシー染色SDS-PAGEゲルを示す。レーン1に示すように、B因子切断はC3、MASP-3およびプロD因子の存在において最適である。レーン2に示すように、C3は絶対に必要であるが、レーン4および5に示すように、C3が存在する限り、MASP-3またはプロD因子はいずれもB因子切断を媒介することができる。
MASP-3依存性AP駆動型C3b沈着を阻害するためのMASP-3 mAbの能力の分析
本実施例に記載されるように、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌におけるAP駆動型C3b沈着にはMASP-3が必要であることが実証された。したがって、実施例7に記載されるように同定された代表的なMASP-3 mAbがMASP-3の活性を阻害することができるかどうかを判定するために以下のアッセイ法を実施した。活性組換えMASP-3（CCP1-CCP2-SP）断片タンパク質（250ng）を3つの異なる濃度（0.5、2、および4μM）のアイソタイプ対照mAb、mAb1A5（MASP-3またはMASP-1に結合しないDTLacOプラットフォームから得られた対照）またはmAbD14（MASP-3に結合する）とともに氷上で1時間プレインキュベートした。酵素-mAb混合物を50μLの最終反応量で5％ 3MC血清（MASP-3欠損）および5×107個の加熱殺菌黄色ブドウ球菌に曝露した。反応物を37℃で30分間インキュベートしたのち、C3b沈着の検出のために染色した。染色された細菌細胞をフローサイトメーターによって分析した。
図31は、rMASP-3の存在における3MC血清中のmAb濃度の関数としてプロットされた、3つの抗体から得られたC3b染色の平均蛍光強さ（MFI）をグラフで示す。図31に示すように、mAbD14は濃度依存的なC3b沈着の阻害を実証する。対照的に、対照mAbはいずれもC3b沈着を阻害しなかった。これらの結果は、mAbD14がMASP-3依存性C3b沈着を阻害することができることを実証する。DTLacOシステム中のつながれた因子を使用するMASP-3結合に関するこの抗体の継続的な親和性成熟ののち、mAbD14に関する改善された阻害活性が予想される。
結果の要約：
要約すると、本実施例の結果は、MASP-3を欠損している血清中のAPの明らかな欠陥を実証する。したがって、B因子活性化およびC3b沈着を機能的終点として使用して、MASP-3がAPに対して非常に重要な寄与を成すことが実証された。さらに、MASP-3の触媒的に活性なC末端部分を含む機能的な組換えMASP-3の添加が、3MC患者からの血清中のB因子活性化およびC3b沈着における欠陥を補正する。逆に、本実施例においてさらに実証されるように、rMASP-3を有する3MC血清中のMASP-3抗体（例えばmAbD14）の添加はAP駆動型C3b沈着を阻害する。B因子活性化、ひいてはAPにおけるMASP-3の直接的な役割が、組換えMASP-3がC3とともに組換えB因子を活性化するのに十分であるという観察によって実証される。
実施例9
本実施例は、MASP-1およびMASP-3がD因子を活性化することを実証する。
方法：
プロD因子の2つの異なる組換えバージョンを切断する能力に関して、組換えMASP-1およびMASP-3を試験した。第一のバージョン（プロD因子His）はN末端タグを欠くが、C末端Hisタグを有する。したがって、プロD因子のこのバージョンは、活性化中に切断によって除去される5アミノ酸プロペプチドを含む。第二のバージョン（STプロD因子His）はN末端上にStrep-TagII配列を有し、したがって、切断されるN末端断片を15アミノ酸まで増えている。STプロD因子はまた、His6タグをC末端に含む。STプロD因子Hisのプロペプチドの長さの増大が、プロD因子HIS形態で可能である分解に比較して、SDS-PAGEによる切断形態と非切断形態との分解を改善する。
組換えMASP-1またはMASP-3タンパク質（2μg）をプロD因子-HisまたはST-プロD因子-His基質（100ng）のいずれかに加え、37℃で1時間インキュベートした。反応物を12％Bis-Trisゲル上で電気泳動させてプロD因子と活性D因子切断産物とを分解した。分解したタンパク質をPVDF膜に移し、ウェスタンブロットによってビオチン化D因子抗体（R&D Systems）を用いる検出によって分析した。
結果：
図32はプロD因子基質切断のウェスタンブロット分析を示す。
（表１４）図32に示すウェスタンブロットに関するレーン説明
Figure 0006971306
図32に示すように、完全長MASP-3（レーン2）およびMASP-1 CCP1-CCP2-SP）断片（レーン5）だけがST-プロD因子His6を切断した。触媒的に不活性な完全長MASP-3(S679A、レーン3)およびMASP-1（S646A、レーン3）はいずれの基質も切断できなかった。プロD因子His6ポリペプチドを用いても同一の結果が得られた（図示せず）。MASP-3に対して過剰モルのMASP-1（CCP1-CCP2-SP）の比較は、少なくとも本明細書に記載される条件下、MASP-3がMASP-1よりも有効なプロD因子切断の触媒であることを示唆する。
結論：MASP-1およびMASP-3はいずれもD因子を切断し、活性化することができる。この活性はLEA-1とAPの活性化と直接関連させる。より具体的には、MASP-1またはMASP-3によるD因子の活性化がB因子活性化、C3b沈着、ならびにおそらくはオプソニン化および/または溶解を生じさせる。
MASP-3抗体によるプロD因子のMASP-3依存性切断の阻害に関するアッセイ法
実施例7に記載されたように同定された代表的なMASP-3およびMASP-1 mAbの、MASP-3依存性D因子切断に対する阻害効果を判定するために、以下のようにアッセイ法を実施した。活性組換えMASP-3タンパク質（80ng）を代表的なmAb D14、M3M1および対照抗体（MASP-1に特異的に結合するが、MASP-3には結合しない）1μgとともに室温で15分間プレインキュベートした。N末端Strepタグを有するプロD因子（ST-プロD因子-His、70ng）を加え、混合物を37℃で75分間インキュベートした。上記のように反応物を電気泳動させ、ブロッティングし、抗D因子で染色した。
図33は、MASP-3およびST-プロD因子-Hisのみを含む対照反応物（mAbなし、レーン1）と比較し、さらに、MASP-1には結合するがMASP-3には結合しない、DTLacOライブラリーから得られたmAbを含む対照反応物（レーン4）と比較した、mAb D14およびM3M1の部分的阻害活性を示すウェスタンブロットである。図33に示すように、阻害抗体の非存在において、MASP-3はプロD因子の約50％をD因子へと切断する（レーン1）。対照MASP-1特異性抗体(レーン4)はプロD因子とD因子との比率を変化させない。対照的に、レーン2および3に示すように、mAb D14およびmAb M3M1はプロD因子からD因子へのMASP-3依存性切断を阻害して、生成されるD因子を減少させる。
結論：これらの結果は、MASP-3 mAb D14およびM3M1がMASP-3依存性D因子切断を阻害することができることを実証する。DTLacOシステム中のつながれた因子を使用するMASP-3結合のためのこれらの抗体の継続的な親和性成熟ののち、mAbD14およびmAb M3M1に関する改善された阻害活性が予想される。
実施例10
本実施例は、MASP-3欠損がマンナンコーティングされたWTウサギ赤血球の補体媒介性溶解を防ぐことを実証する。
背景/原理：
本明細書の実施例5および6に記載されるように、PNHのマウスモデルから採取された血液試料からの赤血球の溶解に対するMASP-2およびMASP-3欠損血清の効果が、PNHに罹患している対象を治療するためのMASP-2阻害および/またはMASP-3阻害の有効性を実証し、また、エクリズマブのようなC5阻害因子による治療を受けているPNH対象においてC3断片媒介性血管外溶血の効果を緩和するためのMASP-2の阻害因子および/またはMASP-3の阻害因子（二重または二重特異性MASP-2/MASP-3阻害因子を含む）の使用を裏付ける。
本実施例に記載されるように、さらなる3MC患者からのMASP-3欠損血清中、C3b沈着実験および溶解実験を実施して、実施例5および6で得られた結果を確認した。加えて、3MC血清へのrMASP-3の添加がC3b沈着および溶血活性を再構成することができることを実証する実験を実施した。
方法：
以下のように、3名の異なる3MC患者からMASP-3欠損血清を採取した。
3MC患者1は、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルを含み、この3MC患者の母親および父親からも提供してもらった（両親とも、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルに関してヘテロ接合性）。
3MC患者2は、MASP-1のエキソン12、すなわち、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンにC1489T（H497Y）突然変異を有して、非機能的MASP-3を生じさせ、機能的MASP-1タンパク質を生じさせる。
3MC患者3は、MASP-1遺伝子中に確認された欠陥を有し、非機能的MASP-3および機能的MASP-1タンパク質を生じさせる。
実験#1：C3b沈着アッセイ法
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11：291-295 (1981)）に記載されているような従来のAP特異的条件下(BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、0.5〜25％の範囲の血清濃度でAPアッセイ法を実施し、時間とともにC3b沈着を測定した。
結果：
図34は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損対象(3MC)、C4欠損対象およびMBL欠損対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図34に示し、以下の表15にまとめているように、患者2および患者3からのMASP-3欠損患者血清が、高い濃度(25％、12.5％、6.25％血清濃度)での残留AP活性を有し、かつ有意に高いAP50（すなわち、最大C3沈着の50％を達成するために必要な血清の8.2％および12.3％）を有する。
図35Aは、「従来の」AP特異的条件下（すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損およびMBL欠損ヒト対象から採取された10％ヒト血清試料中の時間の関数としてグラフで示す。
以下の表15は、図34に示すAP50結果および図35Aに示すC3b沈着の半減期をまとめたものである。
（表１５）図34および図35Aに示す結果の概要
Figure 0006971306
注記：BBS/Mg++/EGTA緩衝液中、この緩衝液中のCa++の非存在のせいでレクチン経路媒介効果は見られない。
実験#2：ウェスタンブロットによる3MC患者血清中のプロD因子切断の分析
方法：3MC患者#2（MASP-3（-/-）、MASP-1（+/+））および3MC患者#3（MASP-3（-/-）、MASP-1（-/-））から血清を採取した。患者血清を、正常なドナーからの血清（W）とともに、SDS-ポリアクリルアミドゲルによって分離し、分解したタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜上にブロッティングした。ヒトD因子特異的抗体によってヒトプロD因子（25,040Da）および/または成熟D因子（24,405Da）を検出した。
結果：ウェスタンブロットの結果を図35Bに示す。図35Bに示すように、正常なドナーからの血清（W）中、D因子抗体は、成熟D因子と合致するサイズ（24,405Da）のタンパク質を検出した。図35Bにさらに示すように、D因子抗体は、3MC患者#2（P2）および3MC患者#3（P3）からの血清中に、これらの3MC患者中のプロD因子（25,040Da）の存在と合致するわずかに大きめのタンパク質を検出した。
実験#3：3MC患者血清を用いるWieslab補体アッセイ法
方法：3MC患者#2（MASP-3（-/-）、MASP-1（+/+））および3MC患者#3（MASP-3（-/-）、MASP-1（-/-））から採取した血清を、Wieslab補体システムスクリーン（Euro-Diagnostica, Malmo, Sweden）を製造者の取扱い指示に従って使用して、古典、レクチンおよび第二経路活性に関しても試験した。正常ヒト血清を対照として同時並行的に試験した。
結果：図35Cは、3MC患者#2、3MC患者#3から採取された血漿および正常ヒト血清を用いたWeislab古典的、レクチンおよび第二経路アッセイ法の結果をグラフで示す。図35Cに示すように、Wieslabアッセイ法の条件下、古典、第二およびMBL（レクチン）経路はすべて正常ヒト血清中では機能性である。3MC患者#2（MASP-3（-/-）、MASP-1（+/+））からの血清中、古典経路およびレクチン経路は機能性であるが、検出可能な第二経路活性は見られない。3MC患者#3（MASP-3（-/-）、MASP-1（-/-））からの血清中、古典経路は機能性であるが、検出可能なレクチン経路活性および検出可能な第二経路活性は見られない。
図35Bおよび35Cの結果は、LEA-1およびLEA-2経路におけるMASP-1およびMASP-3の役割の本発明者らの理解をさらに裏付ける。具体的には、MASP-3のみを欠く患者2からの血清中の第二経路の非存在およびほぼ完全に機能性のレクチン経路は、第二経路の活性化にとってMASP-3が不可欠であることを確認させる。MASP-1およびMASP-3の両方を欠く患者3からの血清は、レクチン経路および第二経路を活性化する能力を失っている。この結果は、機能的LEA-2経路にとってのMASP-1の必要性を確認させ、実施例7ならびにMASP-1がMASP-2を活性化することを実証した文献とも合致している。両血清が明らかにプロD因子を活性することができないこともまた、MASP-3がプロD因子を切断することを実証する実施例9に記載されたデータと合致している。これらの観察結果は、図1に示すようなLEA-1およびLEA-2経路と合致している。
実験#4：マンナンコーティングされたウサギ赤血球をヒト正常または3MC血清の存在における（Ca ++ の非存在における）溶解に関して試験する溶血アッセイ法
方法：
Ca++の非存在における（すなわちEGTAを使用することによる）ウサギRBCの調製
ウサギ全血（2mL）を、2つの1.5mLエッペンドルフ管に分割し、4℃の冷却エッペンドルフ遠心分離機中、8000rpm（約5.9rcf）で3分間遠心処理した。氷冷BBS/Mg++/Ca++（4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++）中に再懸濁させたのち、RBCペレットを3回洗浄した。3回目の洗浄後、ペレットをBBS/Mg++/Ca++4mL中に再懸濁させた。上記のように赤血球をペレット化し、RBCをBBS/0.1％ゼラチン/Mg++/Ca++で洗浄した。RBC懸濁液をBBS/0.1％ゼラチン/Mg++/Ca++中、4℃で貯蔵した。次いで、懸濁させたRBC100μLを水1.4mLで希釈し、8000rpm（約5.9rcf）で3分間スピンダウンし、上清のODを541nmで0.7に調節した(541nmで0.7のODは赤血球約109個/mlに相当)。その後、赤血球108個/mlの濃度を達成するために、OD 0.7で再懸濁させたRBC1mLをBBS/Mg++/EGTA 9mlに加えた。試験血清または血漿の希釈物を氷冷BBS、Mg++、EGTA中に調製し、各血清または血漿希釈物100μLを丸底プレートの対応するウェルにピペットで移した。適切に希釈したRBC 100μL（赤血球108個/ml）を各ウェルに加えた。ナノ水を使用して陽性対照（100％溶解）を製造し、血清または血漿なしのBBS/Mg++/EGTAによる希釈物を陰性対照として使用した。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。丸底プレートを3750rpmで5分間遠心処理した。次いで、各ウェルからの上清100μLを平底プレートの対応するウェルに移し、415〜490nmでODを読み取った。
結果：
図36は、Ca++の非存在下で測定した、正常な対象および2名の3MC患者(患者2および患者3)からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率（上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。図36に示すように、MASP-3欠損が、正常ヒト血清に比べて、マンナンコーティングされた赤血球の補体媒介性溶解の割合を低下させることが実証される。正常ヒト血清からの2つの曲線と3MC患者からの2つの曲線との間の差は有意である（p=0.013、フリードマン試験）。
以下の表16が、図36に示すAP50結果をまとめている。
（表１６）図36に示す結果の概要
Figure 0006971306
表16に示す血清試料をプールすると、正常ヒト血清のAP50値=7.9であり、3MC血清のAP50値=12.8であることが注目される（p=0.031、Wilcox対応対符号順位検定）。
実験#5：組換えMASP-3によるヒト3MC血清の再構成はザイモサンコーティングされたプレート上のAP駆動型C3b沈着を回復する
方法：
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11：291-295 (1981)）に記載されているような従来のAP特異的条件下（BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水）、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、以下の血清試料中で、APアッセイ法を実施した：（1）完全長活性rMASP-3が0〜20μg/mＬの範囲で加えられた3MC患者#2からの5％ヒト血清；（2）完全長活性rMASP-3が0〜20μg/mＬの範囲で加えられた3MC患者#2からの10％ヒト血清；および（3）不活性rMASP-3A（S679A）が0〜20μg/mＬの範囲で加えられた3MC患者#2からの5％ヒト血清。
結果：
図37は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、ヒト3MC患者#2（MASP-3欠損）から採取された血清試料に加えられるrMASP-3タンパク質の濃度の関数としてグラフで示す。図37に示すように、活性組換えMASP-3タンパク質は、ザイモサンコーティングされたプレート上にAP駆動型C3b沈着を濃度依存的に再構成する。図37にさらに示すように、不活性rMASP-3（S679A）を含有する3MC血清中ではC3b沈着は認められなかった。
実験#6：組換えMASP-3によるヒト3MC血清の再構成は3MC患者血清中の溶血活性を回復させる
方法：
ウサギRBCを使用して、実験#2で上述された方法を使用して、以下の試験血清を、0〜12％の範囲で用いて溶血アッセイ法を実施した：（1）正常ヒト血清；（2）3MC患者血清；（3）3MC患者血清＋活性完全長rMASP-3（20μg/ml）；および（4）熱不活化ヒト血清。
結果：
図38は、Ca++の非存在において測定された、（1）正常ヒト血清；（2）3MC患者血清；（3）3MC患者血清＋活性完全長rMASP-3（20μg/ml）；および（4）熱不活化ヒト血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率（上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定）をグラフで示す。図38に示すように、rMASP-3を含む3MC血清中のウサギRBCの溶解率は、rMASP-3を含まない3MC血清中の溶解率に比べて有意に増大する（p=0.0006）。
図39は、活性rMASP-3をBBS/Mg++/EGTA中0〜110μg/mlの濃度範囲で含有する3MC患者2および3MC患者3からの7％ヒト血清中のウサギ赤血球溶解率をグラフで示す。図39に示すように、ウサギRBC溶解率はrMASP-3の量とともに濃度依存的に100％活性まで回復する。
実験#7：MASP-3欠損(3MC)患者の血清はMBLが存在する場合に機能的MASP-2を有する
方法：
3MC血清がLEA-2を欠損しているかどうかを調べるために、マンナンコーティングされたELISAプレートを使用してC3b沈着アッセイ法を実施した。クエン酸添加血漿を、BBS緩衝液中、連続希釈度（1：80から出発して1：160、1：320、1：640、1：1280、1：2560）に希釈し、マンナンコーティングされたプレート上に固定した。ニワトリ抗ヒトC3bアッセイ法を使用して、沈着したC3bを検出した。マンナンコーティングされたELISAプレート上のLEA-2駆動型C3b沈着（APおよびLEA-1が働くには血漿希釈度が高すぎる）を、正常ヒト対象（NHS）、2名の3MC患者（患者2および患者3）、患者3の両親およびMBL欠損対象からの血清中のヒト血清濃度の関数として評価した。
結果：
図40は、正常ヒト対象（NHS）、2名の3MC患者（患者2および患者3）、患者3の両親およびMBL欠損対象からの血清に関して、マンナンコーティングされたELISAプレート上のLEA-2駆動型（すなわち、MASP-2駆動型）C3b沈着のレベルを、BBS緩衝液中に希釈されたヒト血清の濃度の関数としてグラフで示す。これらのデータは患者2がMBL充分であることを示す。しかし、患者3および患者3の母親はMBL欠損であり、したがって、この人たちの血清はLEA-2を介してC3bをマンナン上に沈着させない。これらの血清中のMBLの置換は、患者3（MASP-3欠損を生じさせるSNPに関してホモ接合性である）およびその母親（突然変異MASP-3アレルに関してヘテロ接合性である）の血清中のLEA-2媒介性C3b沈着を回復させる（データ示さず）。この発見は、3MC血清がLEA-2を欠損しているのではなく、むしろ、機能的MASP-2を有すると考えられることを実証する。
総括および結論：
これらの結果は、ザイモサンコーティングされたウェル上のC3b沈着の減少およびウサギ赤血球溶解の減少によって証明されるように、ヒト血清中のMASP-3欠損がAP活性の損失を生じさせることを実証する。機能的組換えヒトMASP-3で血清を補充することにより、両アッセイ法においてAPを回復させることができる。
実施例11
本実施例は、キメラマウスV領域／ヒトIgG4定常領域抗ヒトMASP-3モノクローナル抗体（mAb M3-1、mAb 13B1とも呼ばれる）がMASP-3媒介第二経路補体（APC）活性化の強力な阻害物質であることを実証する。
方法：
キメラマウスV領域／ヒトIgG定常領域抗ヒトMASP-3モノクローナル抗体（mAb M3-1）の生成
MASP-1/3ノックアウトマウスをヒトMASP-3 CCP1-CCP2-SPドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸301〜728）で免疫することにより、ネズミ抗ヒトMASP-3阻害抗体（mAb M3-1）を生成した（実施例14も参照されたい）。簡潔に記すと、免疫マウスからの脾細胞をP3/NS1/1-Aｇ4-1と融合し、得られたハイブリドーマクローンからの上清を、ヒトMASP-3に結合する抗体の産生に関しておよび補体プロD因子（プロCFD）からD因子（CFD）へのMASP-3媒介切断を遮断する能力に関してスクリーニングした。モノクローナル抗体（mAb）可変領域をRT-PCRによって単離し、配列決定し、ヒトIgG4発現ベクターへとクローニングした。キメラモノクローナル抗体を、一過的にトランスフェクトしたHEK293T細胞中で発現させ、精製し、マウスおよびヒトMASP-3への結合親和性に関してならびにプロCFDからCFDへのMASP-3媒介切断を阻害する能力に関して試験した。
MASP-3阻害性モノクローナル抗体M3-1（13B1）は、配列番号30として示される重鎖可変領域（VH）および配列番号45として示される軽鎖可変領域（VL）を含む。M3-1モノクローナル抗体の可変領域の配列を以下に提供する。
重鎖可変領域
以下にmAb M3-1の重鎖可変領域（VH）配列を提示する。SEQ ID NO:30のアミノ酸残基31〜35（H1）、50〜66（H2）および99〜102（H3）に対応するKabat CDR（31〜35（H1）、50〜65（H2）、および95〜102（H3）を下線で示す。
mAb M3-1重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:30）
Figure 0006971306
軽鎖可変領域
以下にmAb M3-1の軽鎖可変領域（VL）配列を提示する。SEQ ID NO:45のアミノ酸残基24〜40（L1）、56〜62（L2）および95〜102（L3）に対応するKabat CDR（24〜34（H1）、50〜56（H2）および89〜97（H3）を下線で示す。これらの領域は、Kabatシステムによって番号付けしてもChothiaシステムによって番号付けしても同じである。
mAb M3-1軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:45）
Figure 0006971306
mAb M3-1 VH CDR
Figure 0006971306
mAb M3-1 VL CDR
Figure 0006971306
先に示したように、MASP-3モノクローナル抗体M3-1は、（a）（i）SEQ ID NO:84を含むVHCDR1、（ii）SEQ ID NO:86を含むVHCDR2、および（iii）SEQ ID NO:88を含むVHCDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:142を含むVLCDR1、（ii）SEQ ID NO:144を含むVLCDR2、および（iii）SEQ ID NO:161を含むVLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。
組換え形態のヒトおよびマウスMASP-3へのmAb M3-1の結合
ELISA実験において、M3-1の一価Fabバージョンを、組換え完全長ヒトおよびマウスMASP-3タンパク質への結合に関して試験した。複数の種由来のタンパク質に結合する抗MASP-3捕捉抗体で96ウェルプレートをコーティングすることにより、結合親和性測定を実施した。捕捉抗体は、MASP-1およびMASP-3のCCP1-CCP2領域に結合することが示されている。ヒトおよびマウスタンパク質の完全長バージョンを、捕捉抗体でコーティングされたELISAプレート上に固定化し、異なる濃度のM3-1 Fabを別々のウェル中で標的タンパク質に結合させた。HRPに結合した抗カッパ軽鎖抗体（Novus Biologicals NBP1-75064）を使用して結合M3-1を検出し、TMB基質試薬セット（BD Biosciences 555214）によって可視化した。
図41は、M3-1 Fab（13B1とも呼ばれる）がヒトタンパク質への約0.117nMの見かけ結合親和性（EC50）を示す、ヒトMASP-3を用いて実施された結合実験の代表例をグラフで示す。
図42は、M3-1 Fabがマウスタンパク質への約0.214nMの見かけ結合親和性（EC50）を示す、マウスMASP-3を用いて実施された結合実験の代表例をグラフで示す。
これらの結果は、mAb M3-1（13B1）がヒトおよびマウスMASP-3の両方に高い親和性を有することを実証する。
mAb M3-1が第二経路補体（APC）活性化を阻害することができるという実証およびmAb M3-1のインビトロ効力の測定
本開示に記載されるように、MASP-3は、少なくとも一部には、中心APC酵素であるCFDの活性化のその要求のために、APCの重要な調節物質であることがわかっている。同じく本開示に記載されるように、MASP-3は相対的に低い濃度で体内を循環し、遅い異化速度を有して、MASP-3抗体投与の静脈内、皮下および経口経路を通して炎症促進経路の長期的阻害を可能にする。ヒト血清中のMASP-3媒介CFD成熟を阻害し、APCを阻害するmAb M3-1の有効性を判定するために、以下の実験を実施した。正常なヒト血清は主に活性またはプロセシングされた（すなわち成熟した）CFDを含有するため、本発明者らは、CFD枯渇ヒト血清（Complement Technology A336）を組換え非プロセシング形態のCFD（プロCFD）によって再構成する実験を実施した。したがって、この実験システムにおいて、APC活性化はプロCFDから活性CFDへのプロセシングを必要とする。
補体沈着のための活性化表面として機能するザイモサン粒子の添加により、APCを誘導した。組換えプロCFDおよびザイモサンの添加の前に、様々な濃度のmAb M3-1を血清に添加した。混合物を37℃で75分間インキュベートし、ザイモサン粒子の表面上の補体Bb因子（Quidel A252）のフローサイトメトリー検出によってAPC活性を測定した。
図43は、CFD枯渇ヒト血清中の様々な濃度のmAb M3-1の存在におけるザイモサン粒子への補体Bb因子沈着のレベル（MFI単位で測定されフローサイトメトリー検出によって決定された）をグラフで示す。図43に示すように、この実験例において、mAb M3-1は、10％ヒト血清中で強力なAPC阻害を示し、IC50は0.311nMである。
これらの結果は、MASP-3がインビトロモデルでヒト血清中のAPC活性化において重要な役割を果たすことを実証し、さらに、mAb M3-1が強力なAPC阻害物質であることを実証する。
インビボにおけるmAb M3-1によるAPCの阻害
インビボでAPCを阻害するmAb M3-1の有効性を判定するために、マウス群（n＝4）に10mg/kg mAb M3-1の単回尾静脈内注射を施した。マウスから採取した血液を使用して血清を調製して、ザイモサン粒子上のC3（同じくC3bおよびiC3b）沈着のレベルを測定するエクスビボアッセイ法におけるAPC活性のフローサイトメトリー評価のためのマトリックスを提供した。投与前時点および複数の投与後時点（96時間、1週および2週）で採取した血液から調製した血清を7.5％に希釈し、ザイモサン粒子を添加してAPCを誘導した。抗体処置マウスを、単回静脈内用量の溶媒を投与された対照マウス群（n＝4）と比較した。
図44は、野生型マウスにおけるmAb M3-1の単回投与（10mg/kg静脈内）後の様々な時点におけるザイモサン粒子へのC3沈着のレベルをグラフで示す。図44に示すように、投与前時点で、2つの条件は匹敵しうるAPC活性レベルを示す。96時間および2つのより後の時点で、mAb M3-1処置群は本質的に完全なAPC阻害を示すが、一方で、溶媒処置群のAPC活性は衰えないままである。図44に示すように、マウスに静脈内投与されたmAb M3-1の単一用量は、少なくとも14日間、全身性APC活性のほぼ完全な消失を生じさせた。
これらの結果は、mAb M3-1がマウスモデルにおいてインビボで強力なAPC阻害物質であることを実証する。
実施例12
本実施例は、キメラマウスV領域／ヒトIgG4定常領域抗ヒトMASP-3モノクローナル抗体（mAb M3-1、mAb 13B1とも呼ばれる）が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）と関連するマウスモデルにおいて、Crryを欠く赤血球の生存率に明らかな利益を提供することを実証する。
方法：
実施例11および実施例14に記載したように、キメラマウスV領域／ヒトIgG4定常領域抗ヒトMASP-3モノクローナル抗体（mAb M3-1）を生成した。さらに実施例11に記載したように、mAb M3-1がマウスモデルにおいてインビボで強力なAPC阻害物質であることがわかった。本実施例は、PNHと関連するネズミモデルにおける有効性に関するmAb M3-1の分析を記載する。
PNHと関連するネズミモデルにおける有効性に関するmAb M3-1の分析
PNHと関連するマウスモデルにおいて、マウスにおけるAPCの主要な細胞表面抑制物質を欠くCrry欠損マウスからの赤血球（RBC）をドナー細胞としての使用のために得た。野生型（WT）ドナーマウスから得たRBCを並行に実行した。これらのドナーRBCを、蛍光親油性色素（Sigma）：WT（赤）およびCrry-（緑）で示差的に標識した。2つの異なる実験において、標識されたWTおよびCrry-ドナー細胞を1：1で混合し、野生型レシピエントマウスに静脈内注射し、20,000の生細胞イベントのフローサイトメトリー評価によってレシピエントマウスにおけるWTおよびCrry欠損RBC生存率（初期時点に対する）を測定した。最初の実験においては、mAb M3-1抗体の複数の投与前処置を与え、mAb M3-1の効果を、複数のマウス実験において有効性を示した（Wang et al., PNAS vol 92:8955-8959, 1995；Hugen et al., Kidney Int 71(7):646-54, 2007）C5阻害抗体である別の阻害補体抗体mAb BB5.1（Hycult Biotechから市販）の効果と比較した。C5阻害物質の投与は、PNHを有するヒト患者のための現在の治療標準である。第二の実験においては、mAb M3-1の処置前単回投与を評価した。
第一の実験において、3つの異なるマウス群（条件ごとにn＝4）を評価した：溶媒処置条件、mAb M3-1処置条件およびmAb BB5.1（mAb遮断マウスC5）処置条件。標識された細胞を「0日目」にマウスに注射し、M3-1およびBB5.1の両方の複数の用量を以下のように投与した。−11、−4、−1、および＋6日目にmAb M3-1を静脈内投与した（10mg/kg）。−1、＋3、＋6、および＋10日目にmAb BB5.1を腹腔内注射（40mg/kg）によって投与した。溶媒処置は、mAb M3-1と同じ投与スケジュールに準じた。
図45は、mAb M3-1で処置された（−11、04、−1、および＋6日目に10mg/kg）WTレシピエントマウス、mAb BB5.1で処置されたマウスまたは溶媒で処置されたマウスにおける、14日間にわたるドナーRBC（WTまたはCrry-）の生存率をグラフで示す。図45に示すように、溶媒処置マウスにおけるマウスのRBCに典型的な生存率を示したWT RBCと比べて、Crry欠損RBCは急速なクリアランスを示した（24時間以内に75％超が浄化した）。mAb BB5.1によるマウスの処置は、Crry欠損RBC生存率において溶媒処置を上回る改善を提供しなかった。対照的に、mAb M3-1処置は、mAb BB5.1および溶媒処置マウスの両方を上回る、Crry欠損RBC生存率の劇的な改善を生じさせた。実験期間を通してmAb M3-1の保護効果が認められた。
第二の実験においては、2つの異なるWTマウス群（条件ごとにn＝4）：溶媒処置およびmAb M3-1処置において、示差的に標識されたWT（赤）およびCrry-（緑）RBCを評価した。標識されたドナー細胞をレシピエントマウスに注射する6日前（−6日目）に、溶媒または抗体（20mg/kg）のいずれかの単一用量を静脈内投与によってレシピエントマウスに与えた。そして、注射後16日間、漸増時点で、レシピエントマウスにおける生存率に関して標識されたドナーRBCを分析した。
図46は、mAb M3-1の単回投与（−6日目に20mg/kg）で処置されたWTレシピエントマウスまたは溶媒処置マウスにおける、16日間にわたるドナーRBC（WTまたはCrry-）の生存率をグラフで示す。図46に示すように、mAb M3-1の処置前単回投与は、溶媒処置マウスにおけるCrry- RBCの生存率と比べ、Crry- RBCの生存率の改善を実証した。注射後96時間で、溶媒処置WT RBCの約90％が対照条件下で生存したが、一方で、Crry- RBCは溶媒処置WTマウスにおいて5％しか生存しなかった。溶媒処置マウスとは対照的に、mAb M3-1で処置されたマウスにおいてはCrry- RBCの40％が生存した。
まとめると、これらの結果は、MASP-3阻害抗体mAb M3-1が、PNHと関連するマウスモデルにおいて重要な表面補体阻害物質Crryを欠くRBCの生存率に明らかな利益を提供することを実証する。
実施例13
本実施例は、キメラMASP-3阻害性モノクローナル抗体（mAb M3-1、mAb 13B1とも呼ばれる）が、関節リウマチ（RA）のネズミモデルにおいて、コラーゲン抗体誘導関節炎（CAIA）における臨床スコアを減らすことを実証する実験を記載する。
背景／根拠：
CAIAは、十分に確立された関節炎の動物モデルである。RAへの洞察を提供することに加えて、CAIAモデルの病態はAPCとの確立された関係を有する。Bandaらは、B因子およびD因子のようなAPCの成分に欠損を有するマウスにおいて、CAIAモデルにおける結果の改善を実証した（Banda et al., J. Immunol vol 177:1904-1912, 2006およびBanda et al., Clinical & Exp Imunol vol 159:100-108, 2009）。APCマウスノックアウトは、WT対照と比べて、より低い関節炎（疾患）スコア、より低い発生率ならびに滑膜および周囲組織中でのより少ないC3およびH因子沈着を実証する。加えて、MASP1/3ノックアウトマウスにおいて、疾患活性スコア、関節中の補体C3組織沈着および組織病理学的損傷スコアが顕著に低下した（Banda et al., J Immunol vol 185:5598-5606, 2010）。したがって、CAIAにおける有効性に関してMASP-3阻害抗体mAb M3-1を分析した。
方法：
実施例11および実施例14に記載したように、キメラMASP-3モノクローナル抗体（mAb M3-1）を生成した。さらに実施例11に記載したように、mAb M3-1がマウスモデルにおいてインビボで強力なAPC阻害物質であることがわかった。
CAIAモデルにおいて、以下のようにmAb M3-1を試験した。0日目、抗コラーゲン抗体のカクテル3mgを野生型マウス（n＝7）に静脈内注射した。＋3日目、大腸菌（E. coli）リポ多糖（LPS）（25μg／匹）をマウスに腹腔内投与した。Nandakumar et al.（Am J Pathol 163(5):1827-1837, 2003）に記載されているように、関節炎は一般に、このモデルにおいては＋3〜＋10日目に発症する。＋14日目に末端血清試料を採取した。−12、−5、＋1、および＋7日目にmAb M3-1（5mg/kgおよび20mg/kg）を投与した。陰性対照として溶媒（PBS）を注射した。
実験0〜14日目に、以下のスコアリング基準を使用してマウスごとに四足すべてで臨床スコアを評価した。
0＝正常
1＝1つの後および／または前足関節が冒されているか、またはごくわずかなびまん性紅斑および腫張がある
2＝2つの後および／または前足関節が冒されているか、または軽度のびまん性紅斑および腫張がある
3＝3つの後および／または前足関節が冒されているか、または中程度のびまん性紅斑および腫張がある
4＝顕著なびまん性紅斑および腫張があるか、または4つの指関節が冒されている
5＝重度のびまん性紅斑および足全体の重度の腫張があり、指を曲げられない
また、関節炎症状を示す処置郡内での発生率＝マウス％を測定した。
結果が図47（臨床スコア）および図48（関節炎発生率）に示されている。図47は、mAb M3-1（5mg/kgまたは20mg/kg）で処置されたマウスまたは溶媒で処置されたマウスの臨床スコアを、14日の時間経過にわたってグラフで示す。図48は、mAb M3-1（5mg/kgまたは20mg/kg）で処置されたマウスまたは溶媒で処置されたマウスの関節炎発生率を、14日の時間経過にわたってグラフで示す。図47に示すように、mAb M3-1は、5日目に始まり、実験期間を通して持続する両方の終点について明らかな治療的利益を実証する。図48に示すように、溶媒処置マウスにおいて疾患発生率は100％に達したが、5mg/kg mAb M3-1条件のマウスの2/3は無病状態のままであった。加えて、20mg/kg mAb M3-1条件では、マウスの1匹のみ（すなわち、合計n＝7の1匹のみ）が任意の関節炎症状を示した。
この実験の結果は、MASP-3阻害抗体mAb M3-1が、十分に確立された関節リウマチ（RA）のネズミモデルかつAPC活性化に強くリンクしたモデルであるCAIAモデルにおいて明らかな治療的利益を提供することを実証する。実施例11に示するように、マウスに静脈内投与された単一用量のmAb M3-1は、少なくとも14日間、全身性APC活性のほぼ完全な消失を生じさせた。本実施例に示すように、マウス結合組織に対する自己抗体の投与によって誘導された動物モデルにおいて、mAb M3-1は、臨床関節炎スコアの発生率および重症度を用量依存的に低下させた。対照処置動物と比較して、mAb M3-1は、試験された最高用量で疾患の発生率および重症度を約80％低下させた。したがって、mAb M3-1のようなMASP-3阻害抗体の投与は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節リウマチ、感染症関連関節炎、乾癬性関節炎のような関節炎、ならびに強直性脊椎炎およびベーチェット病に罹患している患者において有効な治療法になることが予想される。
実施例14
本実施例は高親和性抗ヒトMASP-3阻害抗体の生成を記載する。
背景／根拠：
MASP-3に対する限られた数の抗体が記載されている（Thiel et al., Mol. Immunol. 43:122, 2006；Moller-Kristensen et al., Int. Immunol. 19:141, 2006；Skjoedt et al., Immunobiol 215:921, 2010）。これらの抗体は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降のような検出アッセイ法およびELISAアッセイ法における捕捉または検出試薬として有用であった。しかし、Thiel et al., 2006、Moller-Kristensen et al., 2006およびSkjoedt et al., 2010に記載された抗体は、MASP-3触媒活性を阻害するとは見いだされていない。
MASP-3抗体はまた、本明細書において実施例7（また、WO2013/192240に実施例15として公開）に記載したように、MASP-3結合分子に対する改変DT40細胞株DTLacO中のニワトリ抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより、以前に生成されていた。これらの抗体は、ナノモル範囲で、10nM〜100nMのEC50でヒトMASP-3に結合し、MASP-3によるプロCFDの切断を部分的に阻害した。
本実施例は、異常に強い結合親和性（すなわち、≦500pM〜20pMの範囲のナノモル未満の結合親和性）を有する抗ヒトMASP-3阻害抗体の生成を記載する。本実施例に記載される抗体は、高い親和性（たとえば≦500pM）でヒトMASP-3に特異的に結合し、D因子成熟を阻害し、かつヒトMASP-1（SEQ ID NO:8）には結合しない。
方法：
1. キメラマウスV領域／ヒトIgG定常領域抗ヒトMASP-3モノクローナル抗体の生成
Sigma Adjuvant System（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）を使用して、7〜14週齢のC57BL/6、MASP-1/3ノックアウトマウスを、N末端にStrepTag IIエピトープタグを含むヒトMASP-3 CCP1/CCP2/SPポリペプチド（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基299〜728）；またはN末端にStrepTagIIを含むヒトMASP-3 SPドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）のいずれかで免疫した。マウス1匹あたり50μgの免疫原を腹腔内注射した。14日後、免疫マウスをアジュバント中のさらなる免疫原で追加免疫した。その後、数週間、マウスをPBS中の免疫原で14〜21日ごとに追加免疫した。マウスからの血清試料を尾部放血から定期的に調製し、抗原特異的抗体の存在に関してELISAによって試験した。脾臓融合の4日前に、有意な抗体価を有するマウスにPBS中の融合前免疫原追加免疫を施した。融合の3日前に、マウスの尾の付け根をPBS中50μgの抗CD40アゴニストmAb（R&D Systems, Minneapolis, MN）で皮下処置してB細胞数を増加させた（Rycyzyn et al., Hybridoma 27:25-30, 2008）。マウスを屠殺し、脾細胞を収穫し、50％ポリエチレングリコールまたは50％ポリエチレングリコール＋10％DMSOを使用して、選択されたネズミ骨髄腫細胞株P3/NSI/1-AG4-1（NS-1）（ATCC No. TIB18）に融合した。融合物はハイブリドーマ細胞を生成し、それをHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに播種して、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾ハイブリッドの増殖を阻害した。ハイブリドーマ選択後、MASP-3結合（ELISA）およびプロD因子活性化の阻害に関して培養上清をアッセイした。陽性ハイブリドーマを同定し、連続希釈法によってサブクローニングした。
（表１７）融合実験の概要
Figure 0006971306
注記：「ND」は、この融合物がプロCFD活性化の機能阻害に関してのみスクリーニングされたことを意味する。
結果：
表17に示すように、免疫されたMASP1/3 KOマウスから合計3328のハイブリドーマをスクリーニングし、そのうち＞303がMASP-3に結合することがわかり、そのうち16がMASP-3に結合し、かつプロCFD活性化を阻害することがわかった。実施例11に記載されたmAb M3-1（13B1）は、表17に記載された16の機能的MASP-3阻害抗体の1つである。実施例15に記載されるように、16の機能的MASP-3阻害抗体はすべて異常に強い結合親和性（≦500pM）でヒトMASP-3に結合することがわかった。
考察：
本実施例は、MASP1/3ノックアウトマウスを免疫することによる、異常に強い結合親和性（すなわち、≦500pM〜20pMの範囲のナノモル未満の結合親和性）でヒトMASP-3を阻害する抗体の生成を記載する。本実施例に記載される抗体は、高い親和性（たとえば≦500pM）でヒトMASP-3に特異的に結合し、D因子成熟を阻害し、かつヒトMASP-1には結合しない。本明細書に記載されるように、ヒト、マウスおよびニワトリMASP-3のアミノ酸配列は、MASP-3のSPドメインが、特に活性部位において高度に保存されることを明らかにした（図4および5を参照されたい）。本実施例に記載されるように、MASP1/3 KOマウスにおいて異常に強い結合親和性を有するMASP-3阻害抗体を生成する能力は、一部には、野生型マウスにおいて非常に強力なMASP-3触媒部位特異的抗体の生成を妨げ得る免疫寛容の回避による可能性が高い。
実施例15
本実施例は、高親和性抗ヒトMASP-3阻害性mAbのクローニングおよび配列分析を記載する。
方法：
組換え抗体のクローニングおよび精製：
実施例11および14に記載したハイブリドーマからRT-PCRを使用して重鎖および軽鎖可変領域をクローニングし、配列決定した。ヒトIgG4重鎖（SEQ ID NO:311）およびカッパ軽鎖（SEQ ID NO:313）定常領域に融合したマウスmAb可変領域からなるマウス−ヒトキメラmAbをExpi293F細胞中に組換えタンパク質として生成した。IgG4定常ヒンジ領域（SEQ ID NO:311）は安定化S228Pアミノ酸置換を含む。1つの態様において、キメラmAbを、S228Pアミノ酸置換を含み、かつ低いpHでFcRn相互作用を促進する変異も含むヒトIgG4定常ヒンジ領域（SEQ ID NO:312）に融合した。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列がそれぞれ図49Aおよび49Bに示され（図49Aおよび図49B中、「SIN」＝「SEQ ID NO:」）、以下に含まれる。それぞれの相補性領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）が下記の表18〜22に提供される。
図50Aは、MASP1/3 KOマウスにおいて生成された高親和性抗ヒトMASP-3阻害性mAbのVH領域の樹状図である。図50Bは、MASP1/3 KOマウスにおいて生成された高親和性抗ヒトMASP-3阻害性mAbのVL領域の樹状図である。図50Aおよび50Bに示すように、いくつかの群の関連する抗体が同定された。
以下に各高親和性MASP-3阻害抗体の重鎖可変領域（VH）配列を提示する。Kabat CDRは下線で示されている。
重鎖可変領域：
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
（表１８）MASP-3抗体VH配列（CDRおよびFR領域、Kabat）
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
以下に高親和性MASP-3阻害抗体の軽鎖可変領域（VL）配列を提示する。Kabat CDRは下線で示されている。これらの領域は、Kabatシステムによって番号付けしてもChothiaシステムによって番号付けしても同じである。
軽鎖可変領域
Figure 0006971306
Figure 0006971306
（表１９）MASP-3抗体VL配列（CDRおよびFR領域、KabatおよびChothia）
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
＊注記：mAb 1A10の軽鎖は同定されなかったため、4B6からの軽鎖を1A10 HCとともに使用した。
（表２０）IA群HC CDRのコンセンサス配列
Figure 0006971306
（表２１）IA群LC CDRのコンセンサス配列
Figure 0006971306
＊注記：CDR-L1コンセンサスは、実施例19に記載されるように生成されるバリアントを含む。
（表２２）IB群HC CDRのコンセンサス配列
Figure 0006971306
（表２３）IB群LC CDRのコンセンサス配列
Figure 0006971306
＊注記：CDR-L1コンセンサスは、実施例19に記載されるように生成されるバリアントを含む。
マウスmAb重鎖および軽鎖をコードするDNA：
SEQ ID NO:217：4D5重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:218：1F3重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:219：4B6重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:220：1A10重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:221：10D12重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:222：35C1重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:223：13B1重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:224：1G4重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:225：1E7重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:226：2D7重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:227：49C11重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:228：15D9重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:229：2F5重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:230：1B11重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:231：2F2重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:232：11B6重鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
軽鎖可変領域（マウスmAb）をコードするDNA：
SEQ ID NO:233：4D5軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:234：1F3軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:235：4B6/1A10軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:236：10D12軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:237：35C1軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:238：13B1軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:239：1G4軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:240：1E7軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:241：2D7軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:242：49C11軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:243：15D9軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:244：2F5軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:245：1B11軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:246：2F2軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:247：11B6軽鎖可変領域（親）をコードするDNA
Figure 0006971306
SEQ ID NO:310：ヒトIgG4定常領域
Figure 0006971306
SEQ ID NO:311：S228P変異を有するヒトIgG4定常領域
Figure 0006971306
SEQ ID NO:312：S228P変異を有し、かつ低いpHでFcRn相互作用を促進する変異（Xtend）も有するヒトIgG4定常領域
Figure 0006971306
SEQ ID NO:313：ヒトIgK定常領域
Figure 0006971306
実施例16
本実施例は、いくつかのインビトロアッセイ法における組換えの精製した高親和性MASP-3阻害抗体の機能的特性決定を記載する。
方法：
実施例11および14に記載したように生成した組換えMASP-3 mAbを、（i）ヒトMASP-3および他種MASP-3への結合；（ii）人工的基質の切断を阻害する能力；（iii）プロD因子からD因子への切断を阻害する能力；（iv）ヒト血清中の補体沈着の阻害および（v）ヒト血清中のウサギ赤血球溶解の阻害に関して以下のように特性決定した。
1. ヒトおよびマウスMASP-3への結合を測定するためのアッセイ法
ELISAアッセイ法：
精製した組換えMASP-3 mAbを用いるMASP-3結合アッセイ法：
ヒトMASP-3：
ヒトMASP-3（CCP1-CCP2-SP断片）への16の精製した組換えMASP-3抗体の結合を測定するために、以下のようにサンドイッチELISAを実施した。ELISAプレートを、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中4℃で、4μg/mLの捕捉抗体αM3-259で一晩コーティングした。αM3-259は、ヒトMASP-3のCCP1-CCP2-SP領域で免疫したニワトリからの高結合活性組換えキメラニワトリ−ヒトMASP-3 mAbである。ドメインマッピング研究が、αM3-259が、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、およびイヌを含む複数の種由来のMASP-3のCCP1-CCP2領域に結合することを明らかにした。図51Cに示すように、αM3-259はMASP-1にも結合する。
続いて、プレートを1％BSA／PBSでブロッキングし、PBS中で洗浄したのち、MASP-3 CCP1-CCP2-SP（2μg/mL）ととも室温で1時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し（PBS-T、0.05％）、候補MASP-3抗体を加えたのち、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し（PBS-T、0.05％）、室温で1時間、検出抗体（マウス抗ヒトカッパHRP、SouthernBiotech #9230-05）を加えた。もう一度洗浄したのち（PBS-T、0.05％）、OPT EIA TMB（BD Biosciences #555214）でプレートを発色させた（5分間）。Spectramax M5eプレートリーダを使用してA450で吸光度読みを測定した。
結果：
図51Aおよび51Bは、ヒトMASP-3（CCP1-CCP2-SP）に対するMASP-3 mAb（精製した組換え体）の結合活性をグラフで示す。図51A、図51Bおよび表24に示すように、MASP-3 mAbは、ヒトMASP-3に関して、0.241nM〜0.023nMの範囲の高い結合活性を有する。これらの値は、以前に記載されたMASP-3 mAbに関して報告された値の10〜100倍の低さである（WO2013/192240に実施例15としても公表されている、本明細書における実施例7を参照されたい）。
MASP-3 mAb結合特異性：
MASP-3に対する高親和性MASP-3 mabの特異性を判定するために、結合実験を実施して、ヒトMASP-1およびヒトMASP-2への16の精製した組換えMASP-3抗体の結合を測定した。組換えMASP-1A（S646A、CCP1-CCP2-SP断片）およびMASP-2（CCP1-CCP2-SP断片）をプレート上に直接固定化したことを除き、MASP-3結合ELISAに関して記載したように結合を測定した。
結果：
図51Cは、代表的な精製した組換え高親和性抗ヒトMASP-3阻害抗体が、MASP-3への結合に選択的であり、ヒトMASP-1には結合しないことが示される、結合実験の結果をグラフで示す。
図51Dは、代表的な精製した組換え高親和性抗ヒトMASP-3阻害抗体が、MASP-3への結合に選択的であり、ヒトMASP-2には結合しないことが示される、結合実験の結果をグラフで示す。
マウスMASP-3：
αM3-259を用いて組換え完全長マウスMASP-3（SEQ ID NO:3）をプレート上に捕捉したことを除き、ヒトMASP-3に関して先に記載したように、マウスMASP-3へのMASP-3 mAbの結合を測定した。両実験に使用された陰性対照mAbは、αM3-259と同じ免疫ニワトリから得られた組換えキメラニワトリ−ヒトmAb、mAb77であったが、mAb77はマウスMASP-3には結合しない。
結果：
図52は、マウス完全長MASP-3に対する代表的なMASP-3 mAb（精製した組換え体）の結合活性をグラフで示す。図52に示すように、試験したMASP-3 mAbの大部分はまた、マウスMASP-3に対して高い結合活性を有する。
ヒトおよびマウスMASP-3に対する16の組換えキメラMASP-3 mAbの結合活性値（EC50）を表24にまとめる。
（表２４）ヒトおよびマウスMASP-3に対するMASP-3 mAbの結合活性（図51A、51Bおよび52）
Figure 0006971306
また、MASP-3 mAbの3つ、13B1、10D12、および4D5を、組換えカニクイザル、イヌおよびラットMASP-3への結合に関して試験した。これらの結果を以下の表25にまとめる。
（表２５）MASP-3 mAb異種間結合実験の概要
Figure 0006971306
表25に示すように、MASP-3 mAb 13B1、10D12、および4D5は、試験した5つの種（ヒト、マウス、ラット、イヌ、およびカニクイザル）すべてのMASP-3に結合する。これらのmAbは、高い結合活性（≦500pM）でヒトに結合するが、他の種のMASP-3にも様々な結合活性で結合する。
2. 蛍光発生性トリペプチド切断アッセイ法
背景／根拠：
その公知の天然基質（Iwaki et al., J. Immunol. 187:3751, 2011；Cortesio and Jiang, Arch. Biochem. Biophys. 449:164-170, 2006）に加えて、MASP-3は、様々なトリペプチド基質を加水分解することが示されている（Cortesio and Jiang, Ibid.）。非常に小さな基質として、これらの分子を使用してプロテアーゼの触媒部位をマッピングすることができる。トリペプチド切断の阻害は、抗体などの阻害物質が、触媒部位への小さな基質のアクセスを直接遮断するという、または同様にアクセスを拒否するSPドメインにおけるコンフォメーションシフトを生じさせるという指示である。そのようなものとして、抗体はまた、酵素の活性部位を妨害することによって大きな天然基質の触媒作用を遮断するものと予想することができる。機能的には、これは、MASP-3ヌルマウスまたは3MC患者（MASP-3を欠損）に非常に近いであろう。
方法：
組換えmAbの抗体価測定（666nMから0.91nMまで3倍希釈）をMASP-3 CCP1-CCP2-SP（197nM）とともに室温で15分間インキュベートした。トリペプチド基質BOC-V-P-R-AMC（t-ブチルオキシカルボニル-Val-Pro-Arg-7-アミノ-4-メチルクマリン）（R&D Systems, Cat. No. ES011）を最終濃度0.2mMで添加した。Arg-AMCアミド結合の加水分解が高蛍光基AMCを放出する。Spectramax M5e蛍光プレートリーダを使用して、励起380nm／発光460nm動力学値を37℃で5分ごと70分間記録した。
結果：
図53は、MASP-3モノクローナル抗体によるMASP-3依存性蛍光発生性トリペプチド切断の阻害を測定するアッセイ法の結果をグラフで示す。図53に示すように、試験したMASP-3 mAbは3つの異なる群に入る。
1. MASP-3によるペプチド切断の強力な阻害物質であるMASP-3 mAb：1A10（29.77nM）、1G4（29.64nM）、1F3（32.99nM）、4B6（26.03nM）、4D5（27.54nM）、10D12（30.94nM）、および13B1（30.13nM）。
2. MASP-3によるペプチド切断の弱いまたは非常に弱い阻害物質であるMASP-3 mAb：15D9、11B6、2F5、1E7、および2D7。
3. 中性であるか、またはMASP-3によるペプチド切断を刺激すると考えられる、MASP-3 mAb：1B11；2F2；77（対照mAb）。
3. プロD因子からD因子への切断の阻害
方法：
活性組換えヒトMASP-3タンパク質（1反応あたり240ng）を、GVB＋＋緩衝液中、代表的なMASP-3 mAbおよび対照mAb（これはMASP-1には結合するが、MASP-3には結合しない）とともに、総量9μLで室温にて15分間プレインキュベートした。次いで、プロD因子70ngをN末端Strep-tag IIエピトープタグ（ST−プロD因子−His）とともに各チューブに添加して、1反応あたりの最終量を10μLにした。反応物をサーモサイクラ中、37℃で6時間インキュベートした。次いで、各反応物の10分の1を12％Bis-Trisゲル上で電気泳動させて、プロD因子および活性D因子切断産物を分離した。分離したタンパク質をPVDF膜に移し、ビオチン化D因子抗体（R&D Systems）を用いる検出によるウェスタンブロットを使用して分析した。
結果：
図54は、インビトロアッセイ法において代表的なMASP-3 mAbがプロCFDからCFDへの組換えMASP-3媒介切断を遮断する能力を実証するウェスタンブロット分析を示す。図54に示すように、このアッセイ法において、代表的な高親和性MASP-3阻害性mAb 13B1、4B6、1G4、2D7、10D12、1A10、4D5、1E7、および1F3マウス−ヒトキメラmAbは、プロCFD切断の部分的ないし完全な阻害を示した。
4. ザイモサンへのBb因子沈着アッセイ法
方法：
様々な濃度のMASP-3 mAbを10％CFD枯渇ヒト血清（Complement Technology A336）およびGVB＋Mg/EGTA（20nM）に添加し、氷上で30分間インキュベートしたのち、組換えSTプロD因子−His（2μg/mL最終）およびザイモサン（0.1mg/mL最終）を添加した。ザイモサン粒子は補体沈着のための活性化表面として機能する。混合物を37℃でインキュベートし、ザイモサン粒子の表面上の補体Bb因子（Quidel抗体A252）のフローサイトメトリー検出によってAPC活性を測定した。
結果：
図55Aは、D因子枯渇ヒト血清中、様々な濃度のMASP-3 mAb 1F3、1G4、2D7、および4B6の存在における、37℃で70分間のザイモサン粒子へのBb因子沈着のレベル（MFI単位で測定されフローサイトメトリー検出によって決定された）をグラフで示す。
図55Bは、CFD枯渇ヒト血清中、様々な濃度のMASP-3 mAb 4D5、10D12、および13B1の存在における、37℃で70分間のザイモサン粒子へのBb因子沈着のレベル（MFI単位で測定されフローサイトメトリー検出によって決定された）をグラフで示す。
図55Aおよび55Bに示す結果を以下の表26にまとめる。
（表２６）MASP-3 mAbによるザイモサンへのBb因子沈着の阻害（図55Aおよび図55B）
Figure 0006971306
図55A、図55B、および表26に示すように、MASP-3 mAbはヒト血清中で強力なAPC阻害を示し、IC50値は0.1nM〜3.5nMの範囲である。これらの結果は、MASP-3がインビトロモデルでヒト血清中のAPC活性化において主要な役割を果たすことを実証し、さらに、MASP-3阻害抗体が強力なAPC阻害物質であることを実証する。
5. 代表的なMASP-3 mAbがウサギ赤血球溶解を阻害する能力を測定するためのアッセイ法
方法：
別の実験状況においてAPCの阻害をモニターするために、本発明者らは、代表的なMASP-3 mAbがヒト血清中でウサギ赤血球の溶解を遮断する能力を評価した。様々な濃度のMASP-3 mAbを10％D因子枯渇ヒト血清およびGVB＋Mg/EGTA（20nM）に添加し、氷上で30分間インキュベートしたのち、組換えST−プロB因子−His（2μg/mL最終）および赤血球（2.5×108個／mL最終）を添加した。混合物を37℃で70分間インキュベートし、反応物を希釈し、遊離ヘモグロビンのレベルを示す吸光度（A405）を測定することによって、APC媒介溶血を測定した。
結果：
図56Aは、CFD枯渇ヒト血清中、様々な濃度のMASP-3 mAb 1A10、1F3、4B6、4D5、1G4、および2F2の存在におけるウサギ赤血球溶解の阻害のレベルをグラフで示す。図56Bは、CFD枯渇ヒト血清中、様々な濃度のMASP-3 mAb 1B11、1E7、1G4、2D7、および2F5の存在におけるウサギ赤血球溶解の阻害のレベルをグラフで示す。結果を表27にまとめる。
（表２７）MASP-3 mAbによるウサギ赤血球溶解の阻害（図56Aおよび図56B）
Figure 0006971306
図56A、図56B、および表27に示すように、MASP-3 mAbはウサギ赤血球のAPC駆動型溶解の阻害を示し、IC50値は0.1nM〜5.4nMの範囲である。これらの結果は、ザイモサンアッセイ法におけるMASP-3抗体の観察結果を確証し、さらに、MASP-3阻害抗体が強力なAPC阻害物質であることを実証する。
6. 3MC患者血清中のプロD因子切断の阻害
方法：
代表的な組換えMASP-3 mAb（4D5）を、正常ヒト血清および3MC患者B（「患者B」）、血清中に検出可能なMASP-3を有さず、APCの欠損を示す個体由来の血清に由来するプロD因子の組換えMASP-3切断（および活性化）を遮断する能力に関して試験した。
正常ヒト血清および患者B血清（10％最終）ならびにGVB＋Mg/EGTA（30nM）を、酵素なしで、または活性組換えMASP-3（rMASP-3；0.5μg/mL）、不活性rMASP-3、もしくは活性rMASP-3＋MASP-3 mAb 4D5（500nM最終）とともに、氷上で1時間インキュベートした。ザイモサン（最終0.1mg/mL）を添加し、混合物を37℃でインキュベートした。2時間後、試料を遠心分離し、上清を捕集した。試料を、ヒトD因子（R&D Systems AF1824）に対して産生させたヤギ抗体で免疫沈降させ、熱変性させ、ペプチド−N−グリコシダーゼ（New England Biolabs P0704L）で処置した。捕捉し、脱グリコシル化したタンパク質をSDS-PAGEで分離し、ゲルを、ビオチン化抗CFD（R&D Systems BAF1824）および高感度ストレプトアビジンHRP（Thermo Fischer Scientific 21130）を用いるウェスタンブロット分析のためにエレクトロブロットした。
結果：
図57は、3MC患者B血清中、活性rMASP-3、不活性rMASP-3、および活性rMASP-3＋mAb 4D5の存在におけるプロD因子およびD因子のレベルを分析するウェスタンブロットを示す。図57に示すように、正常なヒト血清は主に成熟形態を含み、一方で、患者B血清は主にチモーゲン形態のD因子を含む。さらに図57に示すように、ザイモサンの存在における活性rMASP-3は、患者3血清中でプロD因子の切断を生じさせるが、一方で、不活性（チモーゲン）形態のMASP-3はそれを生じさせない。最後に、図57に示すように、MASP-3 mAb 4D5は、患者3血清中、活性rMASP-3の存在においてプロD因子の切断を遮断する。これらの結果はさらに、APCの活性化におけるプロD因子の切断におけるMASP-3の役割を実証し、MASP-3阻害性mAbがMASP-3媒介プロD因子切断を遮断し、それによってAPCを遮断することができることを実証する。
実施例17
インビボでAPCを阻害する能力に関する代表的なMASP-3阻害性mAb 10D12および13B1の分析
1. インビボでのmAb M3-1（13B1）および10D12によるAPCの阻害：
方法：
インビボでAPCを阻害するMASP-3 mAb 13B1（M3-1）および10D12の有効性を判定するために、マウス群（n＝4）に10mg/kg mAb 13B1の単回尾静脈内注射を施し、第二のマウス群（n＝4）に10mg/kg mAb 10D12の単回尾静脈内注射を施した。マウスから採取した血液を使用して血清を調製して、ザイモサン粒子へのC3（同じくC3bおよびiC3b、Dako F020102-2）沈着のレベルを測定するエクスビボアッセイ法におけるAPC活性のフローサイトメトリー評価のためのマトリックスを提供した。投与前時点および複数の投与後時点（96時間、1週および2週）で収穫した血液から調製した血清を7.5％に希釈し、ザイモサン粒子（0.1mg/mL最終）を添加してAPCを誘導した。抗体処置マウスを、単回静脈内用量の溶媒を投与された対照マウス群（n＝4）と比較した。
結果：
図58は、野生型マウスにおけるmAb M3-1（13B1）、mAb 10D12または溶媒の単回投与後の様々な時点におけるザイモサン粒子へのC3沈着のレベルをグラフで示す。図58に示すように、投与前時点で、3つの条件は匹敵しうるAPC活性レベルを示す。96時間および2つのより後の時点で、両mAb処置群は全身性APC活性のほぼ完全な消失を示すが、一方で、溶媒処置群のAPC活性は衰えないままである。
これらの結果は、マウスにおいてMASP-3 mAb M3-1（13B1）およびmAb 10D12がインビボで強力なAPC阻害物質であることを実証する。
2. MASP-3 mAb 10D12で処置されたマウスにおけるB因子の状態
方法：
B因子チモーゲンから活性タンパク質分解酵素への転換中、B因子はD因子によってBa（〜30kDa）およびBb（〜60kDa）断片へと切断される。MASP-3 mAb 10D12で処置されたマウスから得られたマウス血清中のBa断片の状態を以下のように決定した。
マウス（n＝4）に10mg/kg mAb 10D12を二回、尾静脈内注射した。処置は7日の間隔で実施し、二回目の注射の3日後にマウスから血液を採取した。マウス4匹の第二の群に単回静脈内用量の溶媒（PBS）を投与した。両群から採取した血液を使用して血清を調製して、補体活性化のためのマトリックスを提供した。ザイモサン粒子（0.1mg/mL最終）を希釈血清（7.5％最終）に添加し、37℃で35分間インキュベートした。
結果：
APC活性化の測度として、図59は、mAb 10D12またはPBSで処置され、ザイモサンで刺激されたマウスから得られたマウス血清中のBa断片の状態を分析するウェスタンブロットを示す。図59の各レーンは異なるマウスを表し、レーンは、比較の目的で、代表的な溶媒マウスからの血清をMASP-3 mAb処置マウスからの血清の隣に示すよう交互に配置されている。溶媒またはmAb 10D12で処置されたマウスからの2つの対照条件が、血清試料中にザイモサンの非存在において存在するBaの基礎レベルを表すものとして、それぞれレーン1および2（ブロットの左側から開始して）に示されている。レーン3〜10はすべてザイモサンとのインキュベーション後に存在するBa断片のレベルを示す。すべての場合において、MASP-3 mAb処置マウスは溶媒処置マウスと比較してBa断片レベルの低下を実証する。
3. mAb 10D12で処置されたマウス由来の血清は溶血を阻害する
方法：
MASP-3阻害抗体によるAPC阻害の別の測度として、本発明者らは、代表的なMASP-3 mAb 10D12で処置されたマウスからの血清中、MASP-3抗体がウサギ赤血球の溶解を遮断する能力を、溶媒対照処置マウスからの血清中との比較において評価した。
マウス（n＝4／群）に溶媒対照（PBS）、10mg/kg MASP-3 mAb 10D12または25mg/kg MASP-3 mAb 10D12を三回、尾静脈内注射した。処置は互いに7日の間隔で実施し、三回目の注射の3日後にマウスから血液を採取した。血液を使用して血清を調製して、溶血反応のためのマトリックスを提供した。赤血球（2.5×108個／mL最終）を、GVB＋Mg/EGTA（20nM）中、4匹のマウスからの20％プール血清に添加した。混合物を37℃でインキュベートし、反応物を希釈し、吸光度（A405）を測定することによってAPC媒介溶血を測定した。
結果：
図60は、MASP-3 mAb 10D12（10mg/kgまたは25mg/kg）で処置されたマウスまたは溶媒対照処置マウスからの20％血清による溶血の阻害のレベルをグラフで示す。図60に示すように、10mg/kgおよび25mg/kgのMASP-3 mAb 10D12で処置されたマウスからの血清は、溶媒処置マウスと比較して、1時間の試験期間中、より少ない全溶血を実証した。
結果の総括：
本実施例に記載されるように、代表的な高親和性MASP-3阻害性mAb 13B1および10D12はインビボでAPCを阻害する。実施例12に記載したように、MASP-3モノクローナル抗体13B1（mAb M3-1とも呼ばれる）は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）と関連するマウスモデルにおいて、Crryを欠く赤血球の生存率に対して明らかな利益を提供することがわかった。実施例13に記載したように、MASP-3 mAb M3-1が臨床関節炎スコアの発生率および重症度を用量依存的に低下させることがわかった。
実施例18
本実施例は、高効力MASP-3阻害性mAbのエピトープ結合分析の結果を記載する。
1. 競合結合分析
方法：
96ウェルELISAアッセイプレートを、捕捉抗体αM3-259、MASP-1、およびMASP-3のCCP1-CCP2領域に結合することが示されているIgG4アイソタイプmAbでコーティングした。完全長ヒトMASP-3タンパク質を、捕捉抗体αM3-259を介してプレート上に固定化した。別個のコーティングされていないウェルにおいて、IgG4アイソタイプの1つの試験MASP-3 mAbの2倍希釈系を定濃度のIgG1アイソタイプの別の試験MASP-3抗体と混合した。コーティングされたウェルに混合物を添加し、捕捉されたMASP-3に結合させた。ヒトIgG1ヒンジ領域に対するHRP結合抗体（Southern Biotech 9052-05）およびTMB基質試薬セット（BD Biosciences 555214）を使用して、IgG1アイソフォームの検出によって2つの抗体の間の潜在的結合を測定した。
結果：
図61A〜61Eは競合結合分析の結果をグラフで示す。
図61Aは、mAb 4D5（IgG1）とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断するMASP-3 mAb（IgG4）を同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。
図61Bは、mAb 10D12（IgG1）とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断するMASP-3 mAb（IgG4）を同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。
図61Cは、mAb 13B1（IgG1）とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断するMASP-3 mAb（IgG4）を同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。
図61Dは、mAb 1F3（IgG1）とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断するMASP-3 mAb（IgG4）を同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。
図61Eは、mAb 1G4（IgG1）とヒトMASP-3との間の相互作用を遮断するMASP-3 mAb（IgG4）を同定するための競合結合分析の結果をグラフで示す。
図61A〜61Eからのデータを以下の表28にまとめる。
これらのデータは、MASP-3 mAb 4D5、10D12、13B1、1A10、1F3、および1G4がヒトMASP-3上で共通のエピトープまたは重複エピトープを共有することを示す。驚くことに、1G4は、MASP-3への他5つのmAbの結合を遮断する非常に限られた能力しか有しないが、これらのmAbは、MASP-3へのIG4そのものの結合をほぼ完全に遮断する。
2. 線状および非連続性MASP-3エピトープに相当するペプチドへのmAb結合の分析
方法：
16個のMASP-3 mAbのうち14個をPepscanによって評価して、それらが結合するMASP-3の領域を同定した。標的分子の線状および潜在的非連続性エピトープを再構築するために、SEQ ID NO:2（ヒトMASP-3）のアミノ酸残基299〜728に対応するペプチドのライブラリーを合成した。MASP-3のアミノ酸残基1〜298は免疫原中に存在せず、この分析には含まれなかった。
Pepscanエピトープ分析は、ペプチドを所定の三次元構造へと構造的に固定するCLIPS技術の使用を含むものであった（Timmerman et al., J Mol Recog. 20:283-299, 2007およびLangedijk et al., Analytical Biochemistry 417:149-155, 2011を参照されたい)。合成されたペプチドそれぞれへの各抗体の結合をPepscanベースのELISAで試験した。
結果：
分析した各抗体に関するPepscanからのペプチド結合結果を以下に記載し、表4、表28、および図62〜67にまとめる。
抗体1F3、4B6、4D5、および1A10（IA群）
中程度ストリンジェンシー条件下で試験した場合、抗体1F3、4B6、4D5、および1A10は非連続性エピトープ模倣体に結合し、また、単純な制約された線状模倣体にも結合した。データ分析は、抗体1F3、4B6、4D、5および1A10がすべてMASP-3のペプチドストレッチ
Figure 0006971306
を優位に認識することを実証する。このペプチドは活性部位ヒスチジンH497のすぐ隣に位置する。非連続性模倣体によってこれらの抗体に関して得られたデータは、MASP-3のペプチドストレッチ
Figure 0006971306
が結合にも寄与することを示唆する。ペプチド
Figure 0006971306
は活性部位アスパラギン酸（D553）を含む。
抗体10D12（IB群）
中程度ストリンジェンシー条件下で試験した場合、抗体10D12は、活性部位ヒスチジンH497に隣接する配列である、MASP-3のコア配列
Figure 0006971306
を有するペプチドと結合した。
抗体13B1（IC群）
中程度ストリンジェンシー条件下で試験した場合、抗体13B1は、MASP-3のペプチドストレッチ
Figure 0006971306
を含む非連続性エピトープを認識し、ペプチドストレッチ
Figure 0006971306
は、単純な制約形態で結合することもできるため、エピトープの優位部分であると考えられる。ペプチド
Figure 0006971306
は活性部位ヒスチジンH497を含む。
抗体1G4（II群）
低ストリンジェンシー条件下で試験した場合、抗体IG4は、MASP-3のペプチドストレッチ
Figure 0006971306
を含む非連続性エピトープを認識し、ペプチドストレッチ
Figure 0006971306
はエピトープの優位部分である。優位ペプチドは活性部位セリンS664の3アミノ酸内に位置する。
抗体1E7および2D7（IIIA群）
高および低ストリンジェンシー条件それぞれの下で試験した場合、抗体1E7および2D7は、MASP-3のペプチドストレッチ
Figure 0006971306
を含む非連続性エピトープを認識し、ペプチドストレッチ
Figure 0006971306
はエピトープの優位部分であり、活性部位セリンS664の3アミノ酸内に位置する。
抗体2F5および15D9（IIIB群）
低ストリンジェンシー条件下で試験した場合、抗体2F5および15D9は、MASP-3のペプチドストレッチ
Figure 0006971306
を含む非連続性エピトープを優位に認識する。ペプチド
Figure 0006971306
はそれぞれ活性部位残基H497およびS664の4または3アミノ酸内に局在する。
抗体IB11（IIIC群）
中程度ストリンジェンシー条件下で試験した場合、抗体1B11は、MASP-3のペプチドストレッチ
Figure 0006971306
を含む非連続性エピトープを認識する。
（表２８）エピトープ結合分析の概要
Figure 0006971306
Figure 0006971306
図62は、Pepscan分析によって決定された、MASP-3 mAbによるヒトMASP-3上の接触領域を示す模式図を提供する。図62に示すように、すべてのMASP-3 mAbは、MASP-3のSPドメインを含むβ鎖中に接触領域を有する。1つのmAb、1B11は、MASP-3のα鎖中のCCP2ドメインとSPドメインとの間にも接触領域を有する。
図63A〜67は、ヒトMASP-3のCCP1/2/SPドメイン上の高親和性MASP-3 mAbの接触領域を示す3Dモデルを示す。MASP-3のSPドメイン活性部位は正面を向き、触媒三残基は側鎖として示されている。
図63Aは、アミノ酸残基498〜509（SEQ ID NO:9）、アミノ酸残基544〜558（SEQ ID NO:11）、アミノ酸残基639〜649（SEQ ID NO:13）およびアミノ酸残基704〜713（SEQ ID NO:14）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 1F3、4D5、および1A10との間の接触領域を示す。
図63Bは、アミノ酸残基498〜509（SEQ ID NO:9）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 10D12との間の接触領域を示す。
図64は、アミノ酸残基494〜508（SEQ ID NO:10）およびアミノ酸残基626〜638（SEQ ID NO:12）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 13B1との間の接触領域を示す。
図65は、アミノ酸残基435〜447（SEQ ID NO:16）、アミノ酸残基454〜464（SEQ ID NO:17）、アミノ酸残基583〜589（SEQ ID NO:21）およびアミノ酸残基614〜623（SEQ ID NO:22）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 1B11との間の接触領域を示す。
図66は、アミノ酸残基454〜464（SEQ ID NO:17）、アミノ酸残基514〜523（SEQ ID NO:19）およびアミノ酸残基667〜678（SEQ ID NO:23）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 1E7、1G4および2D7との間の接触領域を示す。
図67は、アミノ酸残基454〜464（SEQ ID NO:17）、アミノ酸残基479〜493（SEQ ID NO:18）、アミノ酸残基562〜571（SEQ ID NO:20）およびアミノ酸残基667〜678（SEQ ID NO:23）を含む、ヒトMASP-3と高親和性MASP-3 mAb 15D9および2F5との間の接触領域を示す。
要約すると、14の抗体のうち12に関して確定的な結合プロファイルを得た。マッピングされた12の抗体はすべて、ペプチダーゼS1ドメイン中の溶媒暴露エピトープを認識した。多くのエピトープ決定基が活性部位触媒三残基（H497、D553、S664）の残基に近接することは、高親和性阻害性MASP-3 mAbが、酵素−基質相互作用を妨害することによって酵素活性を遮断するモデルと合致する。
実施例19
本実施例は、代表的なMASP-3 mAbのヒト化および潜在的な翻訳後修飾部位のエンジニアリングを記載する。
方法：
1. 代表的な高親和性MASP-3 mAbのヒト化
方法：
免疫原性リスクを減らすために、代表的な高親和性MASP-3阻害抗体4D5、10D12、および13B1をCDR移植法によってヒト化した。各MASP-3抗体のCDRをもっとも近いコンセンサスヒトフレームワーク配列中に移植した。バーニヤゾーン残基のいくつかをQuickchange部位特異的変異誘発（Agilent Technologies）によって改変した。得られたヒト化VHおよびVL領域をpcDNA3.1ベースのヒトIgG1またはIgG4およびIgK発現構築物に移入し、上記のように組換え抗体を発現させ、精製した。一価のFab断片を使用するELISAによってヒト化抗体の親和性を測定し、完全なIgG4フォーマットを使用するC3沈着アッセイ法によって効力を評価した。
結果：
mAb 4D5、10D12、および13B1の場合の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の代表的なヒト化バージョンのアミノ酸配列を以下に提供する。CDR（Kabat）は下線で示されている。
Figure 0006971306
Figure 0006971306
ヒトMASP-3に対する代表的なヒト化4D5、10D12、および13B1抗体の親和性を以下の表29に示す。
（表２９）MASP-3への代表的なヒト化MASP-3 mAbの結合
Figure 0006971306
ヒト化フレームワーク配列とヒト生殖系列フレームワーク配列との同一性％：
Figure 0006971306
2. 4D5、10D12、および13B1の軽鎖可変領域のCDR-1中のAsn/Asp改変部位を除去するための代表的なMASP-3 mAbの変異誘発
代表的な高親和性MASP-3阻害性mAb 4D5、10D12、および13B1を翻訳後修飾に関して分析した。後続のグリシン、セリン、ヒスチジン、アラニン、またはアスパラギン（「NG」、「NS」、「NH」、「NA」、または「NN」モチーフ）を有するアスパラギン残基は、多くの場合、アスパラギン側鎖のアミド基の加水分解、すなわち「脱アミド化」を受けやすい。後続のグリシンまたはプロリン（「DG」または「DP」モチーフ）を有するアスパラギン酸残基は、多くの場合、相互転換、すなわち「異性化」を受けやすい。このような改変は電荷不均一性を生じさせ、結合界面で起こる場合には、抗体機能に影響を及ぼすおそれがある。また、このような改変は断片化、免疫原性および凝集の危険性を増大させるおそれもある。
4D5、10D12、および13B1の軽鎖可変領域のCDR-1において潜在的な翻訳後修飾モチーフを同定した。
4D5および13B1は、軽鎖のCDR1中に1つの可能なAsn脱アミド化部位を含有した（以下の表30中に下線で示す、SEQ ID NO:142の8位および9位の「NS」として示す）。さらに以下の表30に示すように、10D12は軽鎖のCDR1中に1つの可能なAsp異性化部位を含有した。
表30に示すように、これらのMASP-3 mAbのヒト化バージョンのバリアントを部位特異的変異誘発によって生成した。上記のようにバリアントを発現させ、精製した。上記のように、一価のFab断片を使用するELISAによって親和性を測定し、完全なIgG4フォーマットを使用するC3沈着アッセイ法によって効力を評価した。
（表３０）4D5、10D12、および13B1の場合のCDR-L1のバリアント
Figure 0006971306
（表３１）ヒトMASP-3へのヒト化4D5、10D12、および13B1 mAbの変異誘発候補の結合
Figure 0006971306
（表３２）MASP-3抗体ヒト化VH配列（CDRおよびFR領域、Kabat）
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
バリアントを有する代表的なヒト化軽鎖可変領域
Figure 0006971306
（表３３）MASP-3抗体ヒト化VL配列（CDRおよびFR領域、Kabat）［＋LC-CDR1中のバリアント］
Figure 0006971306
Figure 0006971306
Figure 0006971306
実施例20
多発性硬化症のマウスモデルにおける代表的なMASP-3阻害性mAb 13B1の分析
背景／根拠：後天性の炎症性かつ脱髄性自己免疫疾患である実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症（MS）の確立された動物モデルである。APCがEAEの発症／進行において重要な役割を果たすことを示唆する証拠が、B因子中和性抗体で処置されたマウスにおいて疾患が緩和されるという報告によって提供された（Hu et al., Mol. Immunol. 54:302, 2013）。本実施例は、EAEモデルにおける代表的な高親和性MASP-3阻害抗体13B1の分析を記載する。
方法：
EAE誘導：
この実験においては、Hooke Laboratories（Lawrence, MA）から購入したEAE誘導用キットを使用してEAEを誘導した。このキットは、完全フロイントアジュバント（CFA）中の神経抗原MOG35-55および百日咳毒素を含むものであった。
野生型C57Bl/6Jメスマウス30匹をこの実験に使用し、EAE誘導の前、少なくとも1週間、施設に順化させた。誘導時、マウスはおよそ10週齢であった。以下の表34に示すように、誘導時、各マウスに対し、MOG35-55の100μL皮下（sc）注射を二回、百日咳毒素の100μL（400ng）腹腔内（ip）注射を一回、実施した。百日咳毒素の二回目の注射は一回目の24時間後に実施した。
処置：マウス30匹を3つの10匹群に分け、無関係のアイソタイプ対照mAb 10mg/kg i.v.）；mAb 13B1（抗MASP-3、10mg/kg i.v.）またはmAb 1379（抗B因子（Hu et al., Mol. Immunol. 54:302, 2013）40mg/kg i.p.）で処置した。表34に示すように、アイソタイプ対照mAbおよびMASP-3 mAb 13B1の投与は、−16日目に始まり＋12日目に終わるまで毎週実施した。mAb 1379の投与は、Hu et al., Mole Immunol 54:302-308, (2013)に記載された投与スケジュールにしたがって＋3日目から＋11日目まで隔日に実施した。
（表３４）MASP-3 mAb 13B1を用いたEAE実験の実験法
Figure 0006971306
スコアリング：症状が発現するまでマウスを1日おきにチェックし、発現後はマウスを毎日チェックした。予想されたとおり、免疫の7〜12日後に疾患の最初の徴候が出現した。以下の表35に示す尺度にしたがってマウスをスコアリングした。
（表３５）EAEモデルスコアリング基準
Figure 0006971306
結果：
図68は、MASP-3阻害性mAb 13B1（10mg/kg）、B因子mAb 1379（40mg/kg）またはアイソタイプ対照mAb（10mg/kg）のいずれかで処置されたマウスにおけるEAEモデルの結果をグラフで示す。グラフ中、下向き矢印は抗B因子抗体の投与を示し、上向き矢印はmAb 13B1の最後の投与を示す。図68に示すように、MASP-3阻害性mAb 13B1およびB因子mAb 1379で処置されたマウスは、アイソタイプ対照と比較して、表35に示すパラメータにしたがってスコアリングされる臨床症状の改善を示した。
前記にしたがって、MASP-3阻害抗体、たとえば本明細書に開示される高親和性MASP-3阻害抗体は、多発性硬化症、バロー同心性硬化症、視神経脊髄炎、マールブルグ（Marburg）型多発性硬化症、シルダー（Schilder）病、腫瘤形成性多発性硬化症、および急性散在性脳脊髄炎（ADM）に罹患している対象の治療および／またはリハビリテーションにおいて有益（神経保護的または神経再生的）であると予想される。
実施例21
カニクイザルにおける代表的な高親和性MASP-3 mAbを用いる薬力学的実験
背景／根拠：げっ歯類実験において実証したように（図44）、高親和性MASP-3阻害抗体は、インビボで定常状態（静止）プロD因子成熟を阻害することができた。本実施例は、代表的な高親和性MASP-3阻害性mAbが非ヒト霊長類におけるAPC活性を阻害することができるかどうかを判定するためにカニクイザルにおいて実施された実験を記載する。
方法： MASP-3が非ヒト霊長類におけるAPCにおいて機能すること、および高親和性MASP-3抗体が非ヒト霊長類においてAPCを阻害することができることを確認するために、カニクイザル9匹（mAb条件あたり3匹）に対し、3つの代表的な高親和性MASP-3阻害抗体：h4D5X、h10D12Xまたはh13B1Xの1つの5mg/kg単回静脈内投与を実施した。（「h」はヒト化を指し、「X」は、安定化S228Pアミノ酸置換を含むIgG4定常ヒンジ領域（SEQ ID NO:312）と、S228P変異およびまた低いpHでFcRn相互作用を促進する変異を有する変異ヒトIgG4定常領域とを指す）。3週間またはそれ以上の期間にわたり血漿（EDTA）および血清試料を規則的間隔で採取した。
処置されたサルからの血清中のAPC活性を測定するために2つのアッセイ法を用いた。第一のアッセイ法は、希釈血清に添加されたザイモサンビーズに沈着した補体Bb因子のレベルを評価した。第二のアッセイ法は、ザイモサン活性化APC、補体BaおよびBb因子、ならびにC3aの液相産物を測定した。
ザイモサンに沈着したBb因子を検出するために、Bb因子抗体A252（Quidel）を使用するフローサイトメトリーを使用した。APCの完全な阻害後のアッセイ法におけるバックグラウンドシグナルを測定するための手段として、MASP-3 mAb処置されたカニクイザルから調製された血清のアリコート（5％最終、GVB＋Mg/EGTA中に希釈）を300nMの阻害D因子抗体でスパイクした。ザイモサンへのBb因子沈着を試験する前に、サルに静脈内送達されたMASP-3 mAbによるAPC阻害の程度を測定するために、希釈血清の別のアリコートを300nMの中性アイソタイプ対照抗体（APC阻害活性を有しない）でスパイクした。スパイクされた抗体−血清混合物を氷上で30分間インキュベートしたのち、ザイモサン（0.1mg/mL最終）を添加した。混合物を37℃で65分間インキュベートし、ザイモサン粒子の表面上の補体Bb因子（Quidel抗体A252）のフローサイトメトリー検出によってAPC活性を測定した。
液相マーカーBa、Bb、およびC3aの生成を測定するために、抗MASP-3 mAb処置されたカニクイザルから調製された血清（5％最終、GVB＋Mg/EGTA中に希釈）中でザイモサン（1mg/ml最終）をインキュベートすることにより、APCをエクスビボアッセイ法で誘導した。混合物を37℃で40分間インキュベートし、ELISAベースの補体終点検出によってAPC活性を測定した。市販のELISAキット（Quidel）を使用して反応上清中のBa、BbおよびC3aを検出した。処置前の値を100％活性と設定し、インキュベートされるがザイモサンに暴露されない処置前試料を0％と設定することにより、すべての試験の吸光度値を正規化した。
MASP-3 mAb処置されたサルにおけるAPC阻害の程度を抗体標的比に関連させるために、血清MASP-3および阻害性MASP-3 mAbレベルを定量化した。サンドイッチELISAアッセイ法によって血清MASP-3を測定した。αM3-259を用いてMASP-3タンパク質をプレート上に捕捉した（実施例16に記載）。血清試料（1：40に希釈）を、まず、処置mAbに対応する未標識（非ビオチン化）MASP-3 mAbとともに37℃で1時間インキュベートし、次いで、さらに1：250に希釈し（最終1：10,000）、プレートに添加し、37℃でさらに1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチン化バージョンのmAb 10D12を検出抗体として使用した。検出工程の前に血清の大きな希釈を使用して、標的と処置mAbとを切り離し、処置抗体と検出抗体との間の競合を防止した。プレートを複数回洗浄したのち、ストレプトアビジンHRPを最終検出工程に使用した。プレートリーダを用いてA450で吸光度値を収集した。組換え完全長カニクイザルMASP-3タンパク質をアッセイすることによって作成された標準曲線からMASP-3血清濃度を外挿した。Human Therapeutic IgG4 ELISAキット（Cayman Chemicals）を製造業者の指示にしたがって使用して、血清中に存在する抗MASP-3抗体の量を検出した。
mAb h13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与で処置したのち経時的に（時間単位）カニクイザルからの血清中のプロD因子およびD因子のレベルを分析するためにウェスタンブロット分析を使用した。簡潔に記載すると、処理前（−120時間、−24時間）および処理後（72時間、168時間、336時間、504時間、672時間、および840時間）の様々な時点で得られたカニクイザル血漿20μLを、PBSおよび抗CFD抗体11.2μL（0.5μg/μL）と400μLの全量に4℃で1時間混合することによってウェスタンブロット分析を実施した。Protein A/G Plus Agarose（Santa Cruz Biotech）12μLを添加し、混合物を4℃で一晩インキュベートした。4℃で1000×gで5分間の遠心分離によって免疫沈降物を捕集した。ペレットをPBSで五回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを1×糖タンパク質変性緩衝液30μLに再懸濁させ、反応物を100℃で10分間加熱することによって糖タンパク質を変性させた。10×G2反応緩衝液、10％NP-40および2.5μLペプチド-N-グリコシダーゼ（New England Biolabs, P0704L）を各チューブに添加し、反応物を37℃で2時間インキュベートした。アガロースビーズを1000×gで5分間の遠心分離によってペレット化し、上清20μLを新たなチューブ中に捕集した。捕捉され、脱グリコシル化されたタンパク質をSDS-PAGE（NuPAGE 12％Bis-Tris Mini Gel）で分離させ、ウェスタンブロット分析のためにビオチン化抗CFD（R&D Systems BAF1824）およびPierce（商標）高感度ストレプトアビジンHRP（Thermo Fischer Scientific 21130）によってゲルをエレクトロブロットした。
結果：
図69は、時間＝0での高親和性MASP-3 mAb h13B1Xによる単回処置ののち経時的に3匹のカニクイザルの群から得られた血清試料中のAPC活性をグラフで示す。図は、APC阻害D因子mAbまたは中性アイソタイプ対照mAbのいずれかでスパイクされた5％血清中のザイモサン粒子の表面上の補体Bb因子を検出するフローサイトメトリーアッセイ法における平均MFIを示す。図69に示すように、カニクイザルは4時間という早さでAPC活性の減少を示す。MASP-3抗体処置がD因子阻害と同じくらい効果的にAPCを遮断する場合、2つのスパイクされた抗体条件は、投与後試料においては同一レベルのBb沈着阻害を示すが、投与前（または時間＝0；図69）条件ではそれを示さない。図69に示すように、処置後72時間までに、APC活性は概ね、D因子mAbを血清試料に添加することによって達成される活性まで低下する。スパイクされたD因子抗体との比較により実験的に決定されるように、h13B1X処置によるほぼ完全な阻害は投与後336時間（14日間）まで持続する。したがって、これらの結果は、高親和性MASP-3阻害性mAbによる処置が非ヒト霊長類におけるAPCの完全な持続的阻害を提供することを実証する。
図70は、高親和性MASP-3阻害性mAb h4D5X、h10D12X、またはh13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与で処置されたカニクイザルの群（各群3匹）から得られた血清試料中、ザイモサンへのBb沈着によって測定されたAPC活性をグラフで示す。上記のようにBb沈着データを収集した。非阻害アイソタイプ対照抗体でスパイクされた試料の処置前MFIを100％活性と設定し、かつ50mM EDTAとともインキュベートされた（すべての補体活性を阻害するため）処置前試料のそれを0％と設定することにより、処置時点のAPC活性を正規化した。図70に使用されたh13BX処置データは図69にも反映されている。図70に示すように、3つすべての高親和性MASP-3阻害抗体による処置は95％超のAPC阻害を生じさせた。h4D5X、h10D12Xおよびh13B1Xで処置されたカニクイザルは、それぞれ6.7、11.7、および16日間、少なくとも90％のAPC阻害を維持した。したがって、これらの結果は、これらの代表的な高親和性MASP-3阻害性mAbによる処置が5mg/kg単回投与で非ヒト霊長類におけるAPCの持続的阻害を提供することを実証する。
図71A〜CはAPC活性のさらなる測度をグラフで示す。カニクイザルの群（各群3匹）から得られたザイモサン処置された希釈血清試料において、上記のようなh4D5X、h10D12Xおよびh13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与での処置後、経時的に液相Ba（図71A）、Bb（図71B）、およびC3a（図71C）を測定した。
図71A〜Cに示すように、3つすべての高親和性MASP-3阻害抗体の単回投与は、3つの異なる液相終点によって画定されるように、APCの阻害を生じさせた。これらのデータは、図70のBb沈着実験において実証されたAPC阻害のレベルと合致し、さらに、何週にもわたり経路を阻害するこれらのmAbの有効性を示す。
図72A〜Cは、h4D5X（図72A）、h10D12X（図72B）、またはh13B1X（図72C）のいずれかで処置されたサルからの血清中に検出されたモノマーMASP-3とMASP-3 mAb抗体とのモル比に対する、液相Ba産生によって測定されるAPC活性の関係をグラフで示す。図72A〜C中の各パネルは1匹のサルからのデータを表す。この実験において使用したサル被験体および得られた血清（または血漿）は上記のもの（図69、70、および71）と同じである。
図72A〜Cは、完全なAPC阻害の時点で液相Baによって測定された、標的（MASP-3）と高親和性MASP-3阻害抗体h4D5X（図72A）、h10D12X（図72B）、およびh13B1X（図72C）とのモル比をグラフで示す。参考のために、標的：抗体のモル比1：1を各グラフ中に点線で示す。図72A〜Cに示すように、約2:1〜約2.5：1（標的：抗体）の範囲のモル比の標的（MASP-3）：高親和性MASP-3阻害性mAb h4D5X、h10D12X、およびh13B1XがAPCを完全に阻害するのに十分である。これらのデータは、これら3つの代表的なMASP-3阻害性mAbが、標的の濃度よりも低いモル濃度で存在する場合でもAPCを阻害することができる強力な高親和性MASP-3阻害抗体であることを実証する。これらの効力レベルは、mAbが、APCによって生じる疾患または適応症を治療するために臨床的に使用されるための潜在性を有することを強く示唆する。
図73は、mAb h13B1Xの5mg/kg単回静脈内投与による処置の前後で経時的に（時間単位）カニクイザルからの血清中のプロD因子およびD因子のレベルを分析するウェスタンブロットを示す。図73に示すように、D因子は、mAb h13B1Xの単回投与ののち少なくとも336時間（14日間）、血漿中にプロD因子として存在する。
結果の概要
実施例11に記載したように、マウスへの高親和性MASP-3阻害抗体mAb 13B1の単回投与は、少なくとも14日間、全身性第二経路補体活性のほぼ完全な消失を生じさせた。さらに実施例12に記載したように、PNHと関連する十分に確立された動物モデルにおいて実施された実験において、mAb 13B1がPNH様赤血球の生存率を有意に改善し、C5阻害よりも有意に良好にPNH様赤血球を保護することが実証された。さらに、実施例13に記載したように、関節炎のマウスモデルにおいてmAb 13B1が疾患の発生率および重症度を下げることが実証された。本実施例における結果は、代表的な高親和性MASP-3阻害性mAb 13B1、10D12、および4D5が霊長類において第二経路を遮断するのに非常に有効であることを実証する。カニクイザルへのmAb 13B1、10D12または4D5の単回投与は、およそ16日間持続する全身性第二経路活性の持続的消失を生じさせた。高親和性MASP-3阻害抗体で処置されたカニクイザルにおける第二経路消失の程度は、インビトロでD因子遮断によって達成される程度に匹敵し、このことはMASP-3阻害抗体によるD因子転換の完全な遮断を示した。したがって、高親和性MASP-3阻害性mAbは、第二経路活動亢進に関連する疾患、たとえば発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、ウェット型およびドライ型AMDを含む）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）または移植後TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、ならびに重症筋無力症に罹患している患者の治療において治療的有用性を有する。
VII.他の態様
本明細書の中で挙げられるすべての刊行物、特許出願、および特許は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明に記載される方法、組成物、および化合物の様々な変形および変更が当業者には明らかであろう。本発明は特定の所望の態様に関連して記載されたが、請求項に係る発明が不当にそのような特定の態様に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実に、医学、免疫学、薬理学、腫瘍学または関連分野の当業者には自明である、本発明を実施するための記載された形態の様々な変形が本発明の範囲内であるとされる。
前記にしたがって、本発明は以下の態様を特徴とする。
SPドメイン中の1つまたは複数のエピトープに結合する高親和性MASP-3阻害抗体
1A. 高い親和性（500pM未満のKDを有する）でヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合し、第二経路補体活性化を阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
2A. 以下の性質の少なくとも1つまたは複数を特徴とする、項目1の単離された抗体もしくはその抗原結合断片：
（a）プロD因子成熟を阻害すること；
（b）ヒトMASP-1（SEQ ID NO:8）に結合しないこと；
（c）哺乳動物対象において約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で第二経路を阻害すること；
（d）古典的経路を阻害しないこと；
（e）溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；
（f）MASP-3セリンプロテアーゼ基質特異的切断の阻害；
（g）溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；
（h）活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；
（i）プロD因子と比べた静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；
（j）活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；
（k）静止レベルおよび／もしくは表面誘導レベルの生成の液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの減少；ならびに／または
（l）P因子沈着の減少。
3A. 前記ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン中に位置するエピトープに特異的に結合し、該エピトープが、
Figure 0006971306
の少なくとも1つまたは複数の中に位置する、項目1または2の単離された抗体またはその抗原結合断片。[群I]
4A. SEQ ID NO:15の中のエピトープに結合する、項目3の抗体またはその抗原結合断片。［すべてのI群abを含む］
5A. SEQ ID NO:9の中のエピトープに結合する、項目3の抗体または抗原結合断片。［10D12］
6A. SEQ ID NO:10の中のエピトープに結合する、項目3の抗体または抗原結合断片。［13B1］
7A. SEQ ID NO:12の中のエピトープにも結合する、項目6の抗体または抗原結合断片。［13B1］
8A. SEQ ID NO:10および／またはSEQ ID NO:12の中のエピトープにも結合する、項目3の抗体または抗原結合断片。［13B1］
9A. SEQ ID NO:9の中のエピトープに結合する、項目3の抗体または抗原結合断片。［1F3、4B6、4D5、1A10］
10A. SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、および／またはSEQ ID NO:14の少なくとも1つの中のエピトープにも結合する、項目7の抗体または抗原結合断片。［1F3、4B6、4D5、1A10］
11A. SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、および／またはSEQ ID NO:14の少なくとも1つの中のエピトープにも結合する、項目7の抗体または抗原結合断片。［1F3、4B6、4D5、1A10］
12A. 前記抗体が
Figure 0006971306
の少なくとも1つの中のエピトープに結合する、項目1または2の抗体または抗原結合断片。［IIおよびIII群］
13A. SEQ ID NO:17の中のエピトープに結合する、項目12の抗体または抗原結合断片。［すべてのIIおよびIII群ab］
14A.
Figure 0006971306
の中のエピトープにも結合する、項目13の抗体または抗原結合断片。［1G4、1E7、2D7、15D9］
15A. SEQ ID NO:23の中のエピトープにも結合する、項目14の抗体または抗原結合断片。［1G4、1E7、2D7、15D9、2F5］
16A. SEQ ID NO:19および／またはSEQ ID NO:23の中のエピトープにも結合する、項目14の抗体または抗原結合断片。［Ig4、1E7、2D7］
17A. SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、および／またはSEQ ID NO:23の中のエピトープにも結合する、項目14の抗体または抗原結合断片。［15D9、2F5］
18A. SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、および／またはSEQ ID NO:23の少なくとも1つの中のエピトープにも結合する、項目14の抗体または抗原結合断片［15D9、2F5］。
19A. SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、および／またはSEQ ID NO:22の少なくとも1つの中のエピトープにも結合する、項目14の抗体または抗原結合断片。［1B11］
20A. SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、および／またはSEQ ID NO:22の少なくとも1つの中のエピトープにも結合する、項目14の抗体または抗原結合断片［1B11］。
21A. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、項目1〜20のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
22A. 単鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、項目1〜21のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
23A. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、項目1〜22のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
24A. ヒト化されている、項目1〜23のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
25A. 前記抗体が、500pM未満の親和性で前記ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合する、項目1〜24のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
26A. 前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、項目1〜25のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
27A. 項目1A〜26Aのいずれかの抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
A. SPドメイン中の1つまたは複数のエピトープに結合するIA群高親和性MASP-3阻害抗体（4D5、4B6、1A10＋4D5バリアント）
1B. （a）SEQ ID NO:209（XXDIN、1位のXがSまたはTでありかつ2位のXがNまたはDである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:210（
Figure 0006971306
、7位のXがGまたはDであり；8位のXがS、T、またはRであり；9位のXがIまたはTであり；13位のXがEまたはDであり；14位のXがKまたはEであり；かつ16位のXがTまたはKである）に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:211（XEDXY、1位のXがLまたはVでありかつ4位のXがTまたはSである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
（b）SEQ ID NO:212（
Figure 0006971306
、8位のXがN、I、Q、またはAであり；9位のXがSまたはTであり；かつ17位のXがAまたはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:146（KQSYNLYT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
2B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:56（TDDIN）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［4D5およびバリアント］
3B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:62（SNDIN）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［1F3、4B6、および1A10］
4B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［4D5およびバリアント］。
5B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［1F3］
6B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［4B6］
7B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR2が
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［1A10］
8B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:60（LEDTY）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［4D5およびバリアント］
9B. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:65（VEDSY）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［1F3、4B6、および1A10］
10B. （b）の軽鎖可変領域のLC-CDR1が、
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［4D5およびバリアント］
11B. （b）の軽鎖可変領域のLC-CDR1が
Figure 0006971306
を含む、項目10の単離された抗体またはその抗原結合断片。［4D5 NA変異体］
12B. （b）の軽鎖可変領域のLC-CDR1が
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［1F3および4B6］
13B. 前記HC-CDR1がSEQ ID NO:56を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:58を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:60を含み、かつ、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:142、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:258、またはSEQ ID NO:259を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:144を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:146を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［LC-CDR1にバリアントを有する4D5の6つすべてのCDR］
14B. 前記HC-CDR1がSEQ ID NO:62を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:63、SEQ ID NO:67、またはSEQ ID NO:69を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:65を含み、かつ、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:149を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:144を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:146を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［1F3、4B6、および1A10の6つすべてのCDR］
15B. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、項目1〜14のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
16B. 単鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、項目1〜15のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
17B. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、項目1〜16のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
18B. ヒト化されている、項目1〜17のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
19B. SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:248、またはSEQ ID NO:249と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:40、SEQ ID NO:250、またはSEQ ID NO:278と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［4D5親、ヒト化および改変バージョン］。
20B. SEQ ID NO:25と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:41と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［1F3］。
21B. SEQ ID NO:26と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:42と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［4B6］。
22B. SEQ ID NO:27と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:42と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［1A10］。
23B. 前記抗体が500pM未満の親和性でヒトMASP-3に結合する、項目1〜22のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
24B. 前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、項目1〜23のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
25B. 項目1B〜24Bのいずれかの抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
B. SPドメイン中の1つまたは複数のエピトープに結合するIB群高親和性MASP-3阻害抗体（10D12、35C1、および10D12バリアント）
1C. （a）SEQ ID NO:213（SYGXX、4位のXがMまたはIでありかつ5位のXがSまたはTである）に記載されるHC-CDR1；SEQ ID NO:74に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:214（GGXAXDY、3位のXがEまたはDでありかつ5位のXがMまたはLである）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
（b）SEQ ID NO:215（
Figure 0006971306
、10位のXがD、E、またはAであり；11位のXがはGまたはAであり；かつ16位のXがNまたはSである）に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:155に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:216（WQGTHFPXT、8位のXがWまたはYである）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
2C. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:72（SYGMS）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［10D12およびバリアント］
3C. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR1がSEQ ID NO:79（SYGIT）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［35C1］
4C. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:76（GGEAMDY）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［10D12およびバリアント］
5C. （a）の重鎖可変領域のHC-CDR3がSEQ ID NO:82（GGDALDY）を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［35C1］
6C. （b）の軽鎖可変領域のLC-CDR1が、
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［10D12およびバリアント］
7C. 前記軽鎖可変領域のLC-CDR1が
Figure 0006971306
を含む、項目6の単離された抗体またはその抗原結合断片。［10D12 GAバリアント］
8C. 前記軽鎖可変領域のLC-CDR1がSEQ ID NO:152を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［35C1］
9C. （b）の軽鎖可変領域のLC-CDR3が
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［10D12］
10C. （b）の軽鎖可変領域のLC-CDR3が
Figure 0006971306
を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［35C1］
11C. 前記HC-CDR1がSEQ ID NO:72を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:74を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:76を含み、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:153、SEQ ID NO:261、SEQ ID NO:262、またはSEQ ID NO:263を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:155を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:157を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［LC-CDR1にバリアントを有する10D12の6つすべてのCDR］
12C. 前記HC-CDR1がSEQ ID NO:79を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:74を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:82を含み、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:159を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:155を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:160を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［35C1の6つすべてのCDR］
13C. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、項目1〜12のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
14C. 単鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、項目1〜13のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
15C. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、項目1〜14のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
16C. ヒト化されている、項目1〜15のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
17C. SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:251、またはSEQ ID NO:252と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:43、SEQ ID NO:253またはSEQ ID NO:279と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［10D12親、ヒト化、およびバリアント］。
18C. SEQ ID NO:29と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:44と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［35C1］。
19C. 前記抗体が500pM未満の親和性でヒトMASP-3に結合する、項目1〜18のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
20C. 前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、項目1〜19のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
21C. 項目1C〜20Cのいずれかの抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
C. SPドメイン中の1つまたは複数のエピトープに結合するIC群高親和性MASP-3阻害抗体（13B1およびバリアント）
1D. （a）SEQ ID NO:84（GKWIE）に記載されるHC-CDR1；
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:88（SEDV）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
（b）
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:161（KQSYNIPT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。［13B1の6つすべてのCDR、およびLC-CDR1中のバリアント］
2D. 前記LC-CDR1がSEQ ID NO:258を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片。［13B1 LC-CDR1 NAバリアント］
3D. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、項目1〜2のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
4D. 単鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、項目1〜3のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
5D. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、項目1〜4のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
6D. ヒト化されている、項目1〜5のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
7D. SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:254、またはSEQ ID NO:255と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:256、またはSEQ ID NO:280と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［13B1親、ヒト化、およびバリアント］。
8D. 前記抗体が500pM未満の親和性でヒトMASP-3に結合する、項目1〜7のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
9D. 前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、項目1〜8のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
10D. 項目1D〜9Dのいずれかの抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
D. SPドメイン中の1つまたは複数のエピトープに結合するII群高親和性MASP-3阻害抗体（1G4）
1E. （a）SEQ ID NO:91（GYWIE）に記載されるHC-CDR1；
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:95（SIDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
（b）SEQ ID NO:163（RSSQSLVQSNGNTYLH）に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:165（KVSNRFS）に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:167（SQSTHVPPT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
2E. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、項目1の抗体またはその抗原結合断片。
3E. 単鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、項目1〜2のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
4E. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、項目1〜3のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
5E. ヒト化されている、項目1〜4のいずれか一つの抗体またはその抗原結合断片。
6E. SEQ ID NO:31と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:46と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の単離された抗体またはその抗原結合断片［1G4］。
7E. 前記抗体が500pM未満の親和性でヒトMASP-3に結合する、項目1〜6のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
8E. 前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、項目1〜7のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
9E. 項目1E〜8Eのいずれかの抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
F. SPドメイン中の1つまたは複数のエピトープに結合するIII群高親和性MASP-3阻害抗体（1E7、2D7、15D9、2F5、1B11、2F2、11B6）
1F. （a）
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、およびSEQ ID NO:112（GSHYFDY）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:184（YASESIS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む軽鎖可変領域［1E7］；または
（b）SEQ ID NO:125（DYYMN）に記載されるHC-CDR1、
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:198（YTSRLHS）に記載されるLC-CDR2、および
Figure 0006971306
に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域［2D7］；または
（c）SEQ ID NO:132に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:133に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:135に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:203に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:165に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:204に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域［49C11］；または
（d）SEQ ID NO:137に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:138に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:140に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:206に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:207に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:208に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域［15D9］；または
（e）SEQ ID NO:98に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:99に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:101に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:169に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:171に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:173に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域［2F5］；または
（f）SEQ ID NO:103に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:105に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:107に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:176に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域［1B11］；または
（g）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:116に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:118に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:188に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:190に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域［2F2］；または
（h）SEQ ID NO:114に記載されるHC-CDR1、SEQ ID NO:121に記載されるHC-CDR2、SEQ ID NO:123に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO:191に記載されるLC-CDR1、SEQ ID NO:178に記載されるLC-CDR2、およびSEQ ID NO:193に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域［11B6］
を含む、MASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
2F. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、項目1（a）〜（g）の抗体またはその抗原結合断片。
3F. 単鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および全体抗体からなる群より選択される、項目1〜2のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
4F. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、項目1〜3のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
5F. ヒト化されている、項目1〜4のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
6F. SEQ ID NO:32と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:47と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［1E7］。
7F. SEQ ID NO:33と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:48と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［2D7］。
8F. SEQ ID NO:34と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:49と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［49C11］。
9F. SEQ ID NO:35と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:50と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［15D9］。
10F. SEQ ID NO:36と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:51と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［2F5］。
11F. SEQ ID NO:37と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:52と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［1B11］。
12F. SEQ ID NO:38と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:53と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［2F2］。
13F. SEQ ID NO:39と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である重鎖およびSEQ ID NO:54と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一である軽鎖を含む、項目1の抗体またはその抗原結合断片［11B6］。
14F. 前記抗体が、500pM未満の親和性でヒトMASP-3に結合する、項目1〜13のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
15F. 前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、項目1〜14のいずれかの抗体またはその抗原結合断片。
16F. 項目1F〜15Fのいずれかの抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
E. AP疾患の治療のためのMASP-3阻害抗体の使用
1. それを必要とする哺乳動物対象に、該哺乳動物における第二経路補体経路活性化を阻害するのに十分な量の、高親和性MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を投与する工程を含む、哺乳動物における第二経路補体活性化を阻害する方法。
2. 前記抗体またはその抗原結合断片が、500pM未満の親和性でMASP-3に結合する、請求項1に記載の方法。
3. 前記抗体または前記抗原結合断片を含む前記組成物を投与する結果として、前記哺乳動物対象において以下の1つまたは複数が見られる、項目1の方法：
（a）D因子成熟の阻害；
（b）約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で該対象に投与された場合の、第二経路の阻害；
（c）古典的経路が阻害されないこと；
（d）溶血および／もしくはオプソニン化の阻害；
（e）溶血の減少、もしくはC3切断およびC3b表面沈着の減少；
（f）活性化表面へのB因子およびBb因子沈着の減少；
（g）プロD因子と比べた静止レベル（循環中、かつ活性化表面の実験的添加なし）の活性D因子の減少；
（h）活性化表面に応答した、プロD因子と比べた活性D因子のレベルの減少；ならびに／または
（i）静止レベルおよび表面誘導レベルの液相Ba、Bb、C3b、もしくはC3aの生成の減少。
4. 前記抗体が約1：1〜約2.5：1（MASP-3標的：mAb）のモル比で第二経路を阻害する、項目1の方法。
5. 前記高親和性MASP-3抗体が請求項27A、25B、21C、10D、9E、または16Fのいずれかを特徴とする、項目1〜3のいずれかの方法。
6. 前記抗体またはその抗原結合断片が、古典的経路活性化に影響することなく、第二経路を選択的に阻害する、項目1〜4のいずれかの方法。
7. 前記哺乳動物対象が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、ウェット型およびドライ型AMDを含む）、虚血再灌流障害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）もしくは移植後TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギランバレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病性網膜症、ブドウ膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム性動脈硬化症、IgA腎症、ならびに重症筋無力症からなる群より選択される第二経路疾患もしくは第二経路障害に罹患しているか、またはそれを発症する危険にある、項目1〜6のいずれかの方法。
本発明の好ましい態様が例示および説明されたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、その中で様々な変更を加えることができることが理解されるであろう。
排他的所有権または特権を主張する本発明の態様は以下のとおりに定義される。

Claims (33)

  1. ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO:2のアミノ酸残基450〜728）に特異的に結合し、
    SEQ ID NO:84（GKWIE）に記載されるHC-CDR1；
    Figure 0006971306
    に記載されるHC-CDR2；およびSEQ ID NO:88（SEDV）に記載されるHC-CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
    Figure 0006971306
    に記載されるLC-CDR1；SEQ ID NO:144（WASTRES）に記載されるLC-CDR2；およびSEQ ID NO:161（KQSYNIPT）に記載されるLC-CDR3を含む、軽鎖可変領域
    を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ネズミ抗体、およびこれらのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 単鎖抗体、scFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. ヒト化されている、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記抗体が、500pM未満の親和性で前記ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 前記抗体が哺乳動物血液中で第二経路活性化を阻害する、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸、または
    該重鎖可変領域をコードする核酸と該軽鎖可変領域をコードする核酸とを組み合わせた核酸。
  9. 請求項8に記載の核酸の1つまたは複数を含む、クローニングベクターまたは発現ベクター。
  10. 請求項9に記載のクローニングベクターまたは発現ベクターの1つまたは複数を含む、宿主細胞。
  11. 請求項10に記載の宿主細胞を培養する工程、および前記抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、請求項1に記載の抗体または抗原結合断片を産生するための方法。
  12. 請求項1に記載の抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
  13. 請求項12に記載の組成物を含む、哺乳動物における第二経路補体活性化を阻害するための薬学的組成物。
  14. 前記LC-CDR1がSEQ ID NO:258を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  15. 前記HC-CDR2がSEQ ID NO:86を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  16. 前記HC-CDR2がSEQ ID NO:275を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  17. 前記LC-CDR1がSEQ ID NO:142を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  18. 前記LC-CDR1がSEQ ID NO:257を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  19. 前記LC-CDR1がSEQ ID NO:259を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  20. 前記HC-CDR1がSEQ ID NO:84を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:86を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:88を含み、前記LC-CDR1がSEQ ID NO:258を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:144を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:161を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  21. 前記HC-CDR1がSEQ ID NO:84を含み、前記HC-CDR2がSEQ ID NO:275を含み、前記HC-CDR3がSEQ ID NO:88を含み；前記LC-CDR1がSEQ ID NO:258を含み、前記LC-CDR2がSEQ ID NO:144を含み、かつ前記LC-CDR3がSEQ ID NO:161を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  22. 前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:30に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  23. 前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:45に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  24. 前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:30に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:45に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  25. 前記重鎖可変領域が、SEQ ID NO:254またはSEQ ID NO:255に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  26. 前記軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:256またはSEQ ID NO:280に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  27. SEQ ID NO:254またはSEQ ID NO:255を含む重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:256またはSEQ ID NO:280を含む軽鎖可変領域を含み、ヒトMASP-3に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
  28. 前記重鎖可変領域がSEQ ID NO:254を含み、かつ前記軽鎖可変領域がSEQ ID NO:256を含む、請求項27記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  29. 前記重鎖可変領域がSEQ ID NO:255を含み、かつ前記軽鎖可変領域がSEQ ID NO:256を含む、請求項27記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  30. 前記重鎖可変領域がSEQ ID NO:254を含み、かつ前記軽鎖可変領域がSEQ ID NO: 280を含む、請求項27記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  31. 前記重鎖可変領域がSEQ ID NO:255を含み、かつ前記軽鎖可変領域がSEQ ID NO: 280を含む、請求項27記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  32. 前記抗体が、単鎖抗体、scFv、Fab断片、Fab'断片、F（ab'）2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および抗体全体からなる群より選択される、請求項27記載の単離された抗体。
  33. 免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項27記載の単離された抗体。
JP2019505253A 2016-08-01 2017-07-31 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ−３を阻害する組成物および方法 Active JP6971306B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021178522A JP7350822B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法
JP2021178521A JP7350821B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662369674P 2016-08-01 2016-08-01
US62/369,674 2016-08-01
US201662419420P 2016-11-08 2016-11-08
US62/419,420 2016-11-08
US201762478336P 2017-03-29 2017-03-29
US62/478,336 2017-03-29
PCT/US2017/044714 WO2018026722A1 (en) 2016-08-01 2017-07-31 Compositions and methods of inhibiting masp-3 for the treatment of various diseases and disorders

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021178521A Division JP7350821B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法
JP2021178522A Division JP7350822B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019533982A JP2019533982A (ja) 2019-11-28
JP6971306B2 true JP6971306B2 (ja) 2021-11-24

Family

ID=61073545

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019505253A Active JP6971306B2 (ja) 2016-08-01 2017-07-31 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ−３を阻害する組成物および方法
JP2021178522A Active JP7350822B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法
JP2021178521A Active JP7350821B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021178522A Active JP7350822B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法
JP2021178521A Active JP7350821B2 (ja) 2016-08-01 2021-11-01 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ－３を阻害する組成物および方法

Country Status (25)

Country Link
US (4) US10639369B2 (ja)
EP (1) EP3490603A4 (ja)
JP (3) JP6971306B2 (ja)
KR (3) KR102553777B1 (ja)
CN (4) CN116333147A (ja)
AU (4) AU2017306069B2 (ja)
BR (1) BR112019001247A2 (ja)
CA (3) CA3173979A1 (ja)
CL (1) CL2019000230A1 (ja)
CO (1) CO2019001212A2 (ja)
CR (1) CR20190105A (ja)
CU (1) CU24568B1 (ja)
EC (1) ECSP19015192A (ja)
GE (1) GEP20247593B (ja)
IL (3) IL298689B2 (ja)
JO (6) JOP20170154B1 (ja)
MA (1) MA45798A (ja)
MX (3) MX2019000965A (ja)
PE (1) PE20190389A1 (ja)
PH (1) PH12019500204A1 (ja)
SA (1) SA519400950B1 (ja)
SG (3) SG10202010279YA (ja)
TW (4) TW202214689A (ja)
UY (1) UY37349A (ja)
WO (1) WO2018026722A1 (ja)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017035405A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Amino compounds for treatment of immune and inflammatory disorders
WO2017035401A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Amide compounds for treatment of immune and inflammatory disorders
WO2018160891A1 (en) 2017-03-01 2018-09-07 Achillion Pharmaceutical, Inc. Pharmaceutical compounds for treatment of medical disorders
CA3053818A1 (en) 2017-03-01 2018-09-07 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Aryl, heteroaryl, and heterocyclic pharmaceutical compounds for treatment of medical disorders
EP3814374A4 (en) * 2018-05-25 2022-03-09 Achillion Pharmaceuticals, Inc. BIOMARKERS OF NEPHROPATHY ASSOCIATED WITH THE ALTERNATIVE COMPLEMENT PATHWAY
KR20210057086A (ko) 2018-09-06 2021-05-20 아칠리온 파르마세우티칼스 인코포레이티드 다니코판의 형태체 형태
WO2020051532A2 (en) 2018-09-06 2020-03-12 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic compounds for the treatment of medical disorders
BR112021005506A2 (pt) 2018-09-25 2021-06-15 Achillion Pharmaceuticals, Inc. formas mórficas de inibidores de fator complementar d
CN110244053B (zh) * 2019-05-09 2022-03-11 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 用于诊断狼疮肾炎并肺动脉高压疾病的分子标志物及其用途
CN112812182B (zh) * 2019-11-15 2023-01-06 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向fgfr4的单链抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CA3161701A1 (en) * 2020-01-21 2021-07-29 Zhaoli LI Semg2 antibody and use thereof
CA3189666A1 (en) * 2020-08-18 2022-02-24 William Jason Cummings Monoclonal antibodies, compositions and methods for detecting complement factor d
CN112950324B (zh) * 2021-03-15 2022-06-03 重庆邮电大学 一种知识图谱辅助的成对排序个性化电商推荐方法及系统
CN115304670A (zh) * 2021-05-07 2022-11-08 华南农业大学 一种猫冠状病毒核衣壳蛋白的鼠源单克隆抗体及其编码基因和应用
WO2023173036A2 (en) * 2022-03-10 2023-09-14 Omeros Corporation Masp-2 and masp-3 inhibitors, and related compositions and methods, for treatment of sickle cell disease

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5211657A (en) 1988-11-07 1993-05-18 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Laminin a chain deduced amino acid sequence, expression vectors and active synthetic peptides
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5856121A (en) 1994-02-24 1999-01-05 Case Western Reserve University Growth arrest homebox gene
US6074642A (en) * 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US7273925B1 (en) 1998-12-15 2007-09-25 Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
CA2391402A1 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Jens Christian Jensenius Masp-3, a complement-fixing enzyme, and uses for it
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
ES2601143T3 (es) 2002-07-19 2017-02-14 Omeros Corporation Copolímeros tribloque biodegradables, métodos de síntesis de los mismos, e hidrogeles y biomateriales preparados a partir de los mismos
US20040115194A1 (en) * 2002-09-06 2004-06-17 Yi Wang Method of treatment of asthma using antibodies to complement component C5
AU2004216176B2 (en) 2003-02-21 2008-04-03 Genentech, Inc. Methods for preventing and treating tissue damage associated with ischemia-reperfusion injury
DE102004017370A1 (de) 2004-04-08 2005-10-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh PUFA-PKS Gene aus Ulkenia
US7919094B2 (en) 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
CA2685714C (en) 2007-05-31 2016-04-12 University Of Washington Inducible mutagenesis of target genes
AU2010272483B2 (en) 2009-07-17 2016-07-21 Omeros Corporation MASP isoforms as inhibitors of complement activation
EP2462161B1 (en) * 2009-08-06 2017-03-08 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to a beta oligomers and use thereof
US8163283B2 (en) * 2009-09-03 2012-04-24 Vancouver Biotech Ltd. Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor
MX336682B (es) * 2010-03-05 2016-01-27 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra csf-1r humanos y usos de los mismos.
US20120122107A1 (en) 2010-11-16 2012-05-17 Aarhus Universitet Homeostatic multidomain protein, and uses for it
CN107011443B (zh) * 2011-05-04 2021-04-30 奥默罗斯公司 用于抑制masp-2依赖的补体活化的组合物
SI2833907T1 (en) * 2012-04-06 2018-07-31 Omeros Corporation COMPOSITION AND METHODS OF INJECTION OF MASP-1 AND / OR MASP-3 FOR TREATMENT OF PAROXYSIMAL NIGHT CHEMOGLOBINURIA
BR112014031522A2 (pt) * 2012-06-18 2017-08-01 Omeros Corp métodos para inibir a ativação de complemento dependente de masp-3, para inibir a ativação de complemento dependente de masp-2 e para fabricar um medicamento
ES2760023T3 (es) * 2013-02-20 2020-05-12 Univ Pennsylvania Tratamiento del cáncer utilizando receptor de antígeno quimérico anti-EGFRvIII humanizado
AU2014248515B2 (en) * 2013-03-13 2019-03-07 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
KR102448454B1 (ko) * 2014-01-29 2022-09-28 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체

Also Published As

Publication number Publication date
CA3031980A1 (en) 2018-02-08
AU2020204551A1 (en) 2020-07-30
AU2017306069B2 (en) 2020-09-03
US11027015B2 (en) 2021-06-08
UY37349A (es) 2018-02-28
BR112019001247A2 (pt) 2019-06-25
CA3031980C (en) 2022-12-06
AU2020204551B2 (en) 2022-09-15
CU20190006A7 (es) 2019-09-04
US11883493B2 (en) 2024-01-30
CA3173979A1 (en) 2018-02-08
AU2017306069A1 (en) 2019-01-03
JP7350822B2 (ja) 2023-09-26
CL2019000230A1 (es) 2019-07-12
EP3490603A4 (en) 2020-11-04
US20200270125A1 (en) 2020-08-27
JP2022033733A (ja) 2022-03-02
JP2019533982A (ja) 2019-11-28
JOP20220242A1 (ar) 2023-01-30
CO2019001212A2 (es) 2019-02-19
JP2022033732A (ja) 2022-03-02
IL298689A (en) 2023-01-01
PE20190389A1 (es) 2019-03-13
US20210275667A1 (en) 2021-09-09
PH12019500204A1 (en) 2020-01-20
JP7350821B2 (ja) 2023-09-26
TW202214690A (zh) 2022-04-16
JOP20220244A1 (ar) 2023-01-30
MX2019000965A (es) 2019-08-29
KR102624948B1 (ko) 2024-01-17
NZ751019A (en) 2021-10-29
IL298690B1 (en) 2023-06-01
TW201805304A (zh) 2018-02-16
AU2020250188A1 (en) 2020-11-05
KR102553777B1 (ko) 2023-07-11
TW202334243A (zh) 2023-09-01
CN116327918A (zh) 2023-06-27
US10745274B1 (en) 2020-08-18
IL264592B1 (en) 2023-06-01
AU2022256090A1 (en) 2022-11-24
IL264592B2 (en) 2023-10-01
AU2020250188B2 (en) 2023-03-09
US20200317510A1 (en) 2020-10-08
TWI820555B (zh) 2023-11-01
JOP20220245A1 (ar) 2023-01-30
MX2023000482A (es) 2023-02-13
KR20220046002A (ko) 2022-04-13
JOP20220243A1 (ar) 2023-01-30
SA519400950B1 (ar) 2022-03-16
JOP20170154A1 (ar) 2019-01-30
GEP20247593B (en) 2024-02-12
US20180140697A1 (en) 2018-05-24
KR20220045078A (ko) 2022-04-12
CA3122348A1 (en) 2018-02-08
CN109715209A (zh) 2019-05-03
CN116333147A (zh) 2023-06-27
IL298690A (en) 2023-01-01
KR20190035796A (ko) 2019-04-03
IL298689B2 (en) 2023-10-01
IL298689B1 (en) 2023-06-01
CN116333146A (zh) 2023-06-27
EP3490603A1 (en) 2019-06-05
CU24568B1 (es) 2022-01-13
TW202214689A (zh) 2022-04-16
IL264592A (en) 2019-02-28
JOP20220241A1 (ar) 2023-01-30
WO2018026722A1 (en) 2018-02-08
TWI756248B (zh) 2022-03-01
CR20190105A (es) 2019-05-14
SG10202010277SA (en) 2020-11-27
SG11201900606VA (en) 2019-02-27
WO2018026722A8 (en) 2018-12-27
ECSP19015192A (es) 2019-03-29
MA45798A (fr) 2019-06-05
SG10202010279YA (en) 2020-11-27
MX2023000525A (es) 2023-03-06
JOP20170154B1 (ar) 2023-03-28
IL298690B2 (en) 2023-10-01
CN109715209B (zh) 2022-12-06
KR102382804B1 (ko) 2022-04-11
US10639369B2 (en) 2020-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6771531B2 (ja) 様々な疾患および障害の治療のためにｍａｓｐ−１および／またはｍａｓｐ−２および／またはｍａｓｐ−３を阻害する組成物および方法
JP6971306B2 (ja) 様々な疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ−３を阻害する組成物および方法
NZ751019B2 (en) Compositions and methods of inhibiting masp-3 for the treatment of various diseases and disorders

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190322

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190213

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190322

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200316

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200612

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200914

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210203

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210319

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210430

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210721

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20211004

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20211101

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6971306

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150