KR20220046002A - 다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 masp-3을 억제하는 조성물 및 방법 - Google Patents

다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 masp-3을 억제하는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MASP-3 억제 항체 및 MASP-3 의존적 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 사용을 위한 이러한 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

다양한 질환 및 장애의 치료를 위해 MASP-3을 억제하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF INHIBITING MASP-3 FOR THE TREATMENT OF VARIOUS DISEASES AND DISORDERS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 8월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/369,674의 이익을 주장하고 2016년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 62/419,420의 이익을 주장하고 2017년 3월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/478,336의 이익을 주장하며, 이 세 가지 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록에 관한 진술
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보체 시스템은 인간 및 다른 척추동물에서 미생물 감염 및 다른 급성 손상에 대한 면역 반응을 시작하고, 증폭시키고 조율하기 위해 조기 작동하는 메커니즘을 제공한다 (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화는 잠재적 병원체에 대하여 중요한 제1 선 방어를 제공하지만, 보호 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성화는 숙주에 대한 잠재적 위험을 또한 제공할 수 있다 (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994). 예를 들어, C3 및 C5 단백질 가수분해 생성물은 호중구를 모집하고 활성화시킨다. 숙주 방어에 필수적이긴 하지만, 활성화된 호중구는 무분별하게 파괴 효소를 방출하여 장기 손상을 유발할 수도 있다. 이에 더하여, 보체 활성화는 인근의 숙주 세포, 뿐만 아니라 미생물 표적 상에 용해성 보체 구성요소의 침착을 유발하여, 숙주 세포 용해를 일으킬 수도 있다.
보체 시스템은 또한 심근 경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), ARDS, 재관류 손상(reperfusion injury), 패혈성 쇼크(septic shock), 열 화상 후 모세관 누출(capillary leakage following thermal burns), 후심폐 바이패스 염증(postcardiopulmonary bypass inflammation), 이식거부반응(transplant rejection), 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)을 포함한 많은 급성 및 만성 질환 상태의 발병과 연관성이 있다. 이들 병태 중 거의 전부에서, 보체가 원인은 아니지만 발병에 수반되는 여러 인자들 중 하나이다. 그렇지만, 보체 활성화는 주요 병리학적 메커니즘일 수도 있으며 이들 질환 상태 중 다수에서 임상적 제어에 효과적인 지점을 나타낸다. 다양한 질환 상태에서 보체-매개된 조직 손상의 중요성에 대한 인식의 증가는 효과적인 보체 억제 약물에 대한 필요성을 강조한다. 지금까지는, C5에 대한 항체인 에쿨리쥬맙 (Solaris®)이 인간 사용에 대하여 승인된 유일한 보체-표적화 약물이다. 하지만, C5는 보체 시스템에서 "다운스트림(downstream)"에 위치한 여러 효과기 분자 중 하나이고, C5의 차단이 보체 시스템의 활성화를 억제하지 않는다. 그러므로, 보체 활성화의 시작 단계의 억제자가 "다운스트림" 보체 억제자에 비해 상당한 이점을 가질 것이다.
현재, 보체 시스템은 3개의 별개의 경로, 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로를 통해 활성화될 수 있다는 것이 널리 받아들여지고 있다. 고전적 경로는 보통 외래 입자 (즉, 항원)에 결합된 숙주 항체로 구성된 복합체에 의해 촉발되며 따라서 특이적 항체 반응의 생성을 위해 항원에 대한 사전 노출을 필요로 한다. 고전적 경로의 활성화가 숙주에 의한 사전 적응성(adaptive) 면역 반응에 의존적이기 때문에, 고전적 경로는 후천적(acquired) 면역 체계의 일부이다. 그에 반해, 렉틴 및 대체 경로 둘 다는 적응성 면역에 독립적이고 선천적(innate) 면역 체계의 일부이다.
보체 시스템의 활성화는 세린 프로테아제 치모겐을 순차적으로 활성화시킨다. 고전적 경로 활성화의 제1 단계는 항원-결합된 IgG 및 IgM 분자로의 특이적 인식 분자인 C1q의 결합이다. C1q는 Cl이라고 불리는 복합체로서 Clr 및 Cls 세린 프로테아제 전구효소와 회합된다. 면역 복합체에 C1q가 결합하면, Clr의 Arg-Ile 부위의 자가 단백질 가수분해 분열 후 Clr-매개된 분열 및 Cls의 활성화가 일어나며, 이로 인해 C4 및 C2를 분열시키는 능력을 획득한다. C4는 C4a 및 C4b라고 지정된 2개의 단편으로 분열되고, 유사하게, C2는 C2a 및 C2b로 분열된다. C4b 단편은 인접한 하이드록실 또는 아미노 기와 공유 결합을 형성하고 활성화된 C2의 C2a 단편과의 비공유 상호작용을 통해 C3 전환효소 (C4b2a)를 생성할 수 있다. C3 전환효소 (C4b2a)는 C3a 및 C3b 하위 구성요소로의 단백질 가수분해 분열에 의해 C3을 활성화시켜서 C5 전환효소 (C4b2a3b)를 생성하며, 이것은 C5를 분열시킴으로써, 세포막을 붕괴시켜 세포 용해를 일으킬 수 있는 막 공격 복합체 (C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b, "MAC"로도 불림)를 형성한다. 활성화된 형태의 C3 및 C4 (C3b 및 C4b)는 다수의 포식세포에서 보체 수용체에 의해 인식되는 외래 표적 표면 상에 공유 결합에 의해 침착된다.
독립적으로, 렉틴 경로를 통한 보체 시스템 활성화의 제1 단계는 또한 특이적 인식 분자의 결합이며, 관련된 세린 프로테아제 전구효소의 활성화가 이어진다. 하지만, C1q에 의한 면역 복합체의 결합 대신에, 렉틴 경로의 인식 분자는 통틀어 렉틴이라고 불리는, 탄수화물-결합 단백질 (만난-결합 렉틴 (MBL), H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 C형 렉틴 CL-11)의 군을 포함한다. J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)) 참조. 또한 J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010) 참조.
Ikeda, 등은 처음에, C1q와 유사하게, MBL이 효모 만난-코팅된 적혈구에 결합하면 C4-의존적 방식으로 보체 시스템을 활성화시킬 수 있다는 것을 입증하였다 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. 262:7mam51-7454, (1987)). 콜렉틴 단백질 패밀리의 구성원인 MBL은 피라노오스 고리의 적도면(equatorial plane)에 위치한 3-및 4-하이드록시 기를 가진 탄수화물에 결합하는 칼슘-의존적 렉틴이다. 따라서 MBL에 대한 주요 리간드는 D-만노오스 및 N-아세틸-D-글루코사민이지만, 이 입체구조적 요건에 맞지 않는 탄수화물은 MBL에 대하여 검출 불가능한 친화도를 갖는다 (Weis et al., Nature 360:127-134, (1992)). MBL과 1가 당의 상호작용은 매우 약하며, 해리 상수는 전형적으로 한 자릿수의 밀리몰의 범위에 있다. MBL은 결합력에 의해, 즉, 서로 근접하게 위치한 다수의 단당류 잔기와 동시에 상호작용하여 글리칸 리간드로의 단단하고, 특이적인 결합을 달성한다 (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL은 일반적으로 박테리아, 효모, 기생충 및 특정 바이러스와 같은 미생물을 장식하는 탄수화물 패턴을 인식한다. 그에 반해, MBL은 일반적으로 포유류 혈장 및 세포 표면 당단백질에 존재하는 "성숙한" 복합 당컨쥬게이트(glycoconjugate)를 장식하는 끝에서 두 번째(penultimate) 및 마지막(ultimate) 당인, D-갈락토오스 및 시알산을 인식하지 않는다. 이 결합 특이성은 "외래" 표면의 인식을 촉진하고 "자가-활성화"로부터의 보호를 돕는 것으로 생각된다. 하지만, MBL은 포유류 세포의 소포체(endoplasmic reticulum) 및 골지체(Golgi)에서 격리된 N-결합된 당단백질 및 당지질 상에서 고-만노오스 "전구체(precursor)" 글리칸의 클러스터(cluster)에 높은 친화도로 결합한다 (Maynard et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, (1982)). 이에 더하여, MBL은 괴사(necrotic) 및 아폽토시스성(apoptotic) 세포에 노출될 수 있는 폴리뉴클레오타이드, DNA 및 RNA에 결합할 수 있는 것으로 나타났다 (Palaniyar et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1010:467-470 (2003); Nakamura et al., J. Leuk. Biol. 86:737-748 (2009)). 그러므로, 손상된 세포는 MBL 결합을 통한 렉틴 경로 활성화에 대한 잠재적 표적이다.
피콜린은 피브리노겐-유사 도메인이라고 불리는, MBL과는 상이한 유형의 렉틴 도메인을 가지고 있다. 피콜린은 Ca++-독립적 방식으로 당 잔기에 결합한다. 인간에서, 세 가지 종류의 피콜린 (L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린)이 확인되었다. 두 가지 혈청 피콜린, L-피콜린 및 H-피콜린은 일반적으로 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 특이성을 갖는다; 하지만, H-피콜린은 또한 N-아세틸-D-갈락토사민에 결합한다. L-피콜린, H-피콜린, CL-11, 및 MBL의 당 특이성의 차이는 상이한 렉틴이 상보적이고, 중첩되지만, 상이한 당컨쥬게이트를 표적으로 할 수도 있다는 것을 의미한다. 이 개념은, 렉틴 경로의 공지된 렉틴 중에서, 단지 L-피콜린만이 모든 그람-양성(Gram-positive) 박테리아에서 발견되는 세포벽 당컨쥬게이트인 리포테이코산에 특이적으로 결합한다는 최근의 보고서에 의해 지지된다 (Lynch et al., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)). 아세틸화된 당 모이어티(moiety)에 더하여, 피콜린은 또한 아세틸화된 아미노산 및 폴리펩타이드에 결합할 수 있다 (Thomsen et al., Mol. Immunol. 48(4):369-81 (2011)). 콜렉틴 (즉, MBL) 및 피콜린은 아미노산 서열에서 유의한 유사성이 없다. 하지만, 두 군의 단백질은 유사한 도메인 조직을 가지고 있고, C1q와 유사하게, 올리고머 구조로 조립되며, 이것은 다중부위 결합 가능성을 최대화한다.
MBL의 혈청 농도는 건강한 집단에서 매우 가변적이고 이것은 MBL 유전자의 프로모터 및 암호화 영역 모두에서 다형성(polymorphism)/돌연변이에 의해 유전적으로 제어된다. 급성기(acute phase) 단백질로서, MBL의 발현은 염증 동안에 더 상향조절된다. L-피콜린은 MBL과 유사한 농도로 혈청 내에 존재한다. 그러므로, 렉틴 경로의 L-피콜린 분지는 강도가 잠재적으로 MBL 아암(arm)과 비슷하다. MBL 및 피콜린은 또한 옵소닌으로 기능할 수 있으며, 포식세포가 MBL- 및 피콜린-장식된 표면을 표적화할 수 있게 한다. (Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita and Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1):418-25(2005) 참조). 이 옵소닌화는 이들 단백질과 그 정체가 확립되어 있지 않은 포식세포 수용체의 상호작용을 필요로 한다 (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem. 271:2448-54, (1996)).
인간 MBL은 콜라겐-유사 도메인을 통해 MBL-회합된 세린 프로테아제 (MASP)라고 불리는 독특한 C1r/Cls-유사 세린 프로테아제와 특이적이고 고-친화도의 상호작용을 형성한다. 지금까지는, 3개의 MASP가 기술되어 있다. 첫 번째로, 단일 효소 "MASP"가 확인되었고 보체 캐스케이드 (즉, C2 및 C4의 분열)의 시작의 원인이 되는 효소로서 특징지어졌다 (Matsushita et al., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol. 150:571-578, (1993)). 그 이후에 MASP 활성은, 실제로, 2개의 프로테아제, MASP-1 및 MASP-2의 혼합인 것으로 결정되었다 (Thiel et al., Nature 386:506-510, (1997)). 하지만, MBL-MASP-2 복합체는 단독으로 보체 활성화에 충분하다는 것이 입증되었다 (Vorup-Jensen et al., J. Immunol. 165:2093-2100, (2000)). 또한, 단지 MASP-2만이 높은 비율로 C2 및 C4를 분열시켰다 (Ambrus et al., J. Immunol. 170:1374-1382, (2003)). 그러므로, MASP-2는 C4 및 C2를 활성화시켜 C3 전환효소, C4b2a를 생성하는 원인이 되는 프로테아제이다. 이것은 고전적 경로의 C1 복합체와의 상당한 차이점이며, 2개의 특이적 세린 프로테아제 (C1r 및 C1s)의 협조된 작용이 보체 시스템의 활성화로 이어진다. 이에 더하여, 세 번째 새로운 프로테아제, MASP-3이 단리되었다 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 및 MASP-3은 동일한 유전자의 대안으로 스플라이싱된(spliced) 생성물이다.
MASP는 Cl 복합체의 효소적 구성요소인 Clr 및 Cls와 동일한 도메인 조직을 공유한다 (Sim et al., Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000)). 이들 도메인은 N-말단 Clr/Cls/sea urchin VEGF/골 형태 형성 단백질 (CUB) 도메인, 상피 성장 인자-유사 도메인, 제2 CUB 도메인, 직렬의 보체 제어 단백질 도메인, 및 세린 프로테아제 도메인을 포함한다. C1 프로테아제에서와 같이, MASP-2의 활성화는 세린 프로테아제 도메인에 인접한 Arg-I1e 결합의 분열을 통해 발생하며, 이것은 효소를 이황화-결합된 A 및 B 사슬로 분할하고, 후자는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다.
MBL은 또한 19 kDa (MAp19)의 MBL-회합된 단백질 또는 작은 MBL-회합된 단백질 (sMAP)로 알려져 있는, MASP-2의 촉매 활성이 없는, 대안으로 스플라이싱된 형태의 MASP-2와 회합할 수 있다 (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol. 11:859-863, (1999)). MAp19는 MASP-2의 처음 2개의 도메인에 이어서, 4개의 독특한 아미노산의 추가 서열을 포함한다. Map19의 기능은 불분명하다 (Degn et al., J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 및 MASP-2 유전자는 각각 인간 염색체 3 및 1 상에 위치한다 (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002)).
몇 가지 증거들이 상이한 MBL-MASP 복합체가 존재하고 혈청에서 MASP의 많은 부분이 MBL과 복합체를 형성하지 않는다는 것을 시사한다 (Thiel, et al., J. Immunol. 165:878-887, (2000)). H- 및 L-피콜린 둘 다는 MBL과 마찬가지로 모든 MASP에 결합하고 렉틴 보체 경로를 활성화시킨다 (Dahl et al., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002)). 렉틴 및 고전적 경로 둘 다는 공통의 C3 전환효소 (C4b2a)를 형성하고 두 가지 경로는 이 단계에서 수렴한다.
렉틴 경로는 나이브(naive) 숙주에서 감염에 대한 숙주 방어에서 주요 역할을 하는 것으로 널리 생각된다. 숙주 방어에서 MBL의 개입에 대한 강력한 증거는 기능적 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자의 분석으로부터 비롯된다 (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). 이러환 환자들은 재발성 박테리아 및 균류 감염에 대한 민감성을 나타낸다. 이들 증상은 보통 삶의 초기에, 모체로부터 유래된 항체 역가가 줄어듦에 따른 명백한 취약점 동안에, 하지만, 항체 반응의 전체 레파토리가 나타나기 전에 분명하다. 이 증후군은 종종 MBL의 콜라겐 부분의 여러 부위에서의 돌연변이로부터 발생하며, 이것은 MBL 올리고머의 적절한 형성을 방해한다. 하지만, MBL이 보체 독립적으로 옵소닌으로서 기능할 수 있기 때문에, 어느 정도로의 감염에 대한 민감성의 증가가 손상된 보체 활성화 때문인지는 알려져 있지 않다.
고전적 및 렉틴 경로와는 대조적으로, 이전에 대체 경로의 개시자들은 C1q 및 렉틴이 다른 두 경로에서 수행하는 인식 기능을 이행하지 않는 것으로 발견되었다. 현재는 대체 경로가 자발적으로 낮은 수준으로 턴오버(turnover) 활성화되며, 이것은 자발적 보체 활성화를 억제하는 적절한 분자적 요소가 결여된 외래의 또는 다른 비정상적인 표면 (박테리아, 효모, 바이러스 감염된 세포, 또는 손상된 조직)에서 쉽게 증폭될 수 있는 것으로 널리 받아들여지고 있다. 대체 경로의 활성화에 직접적으로 수반되는 4개의 혈장 단백질이 존재한다: C3, 인자 B와 D, 및 프로퍼딘.
고전적 및 대체 보체 경로 모두가 비-감염성 인간 질환의 발병에 관련이 있다는 광범위한 증거가 존재하지만, 렉틴 경로의 역할은 이제 막 평가되기 시작했다. 최근의 연구는 렉틴 경로의 활성화가 허혈(ischemia)/재관류 손상에서 보체 활성화 및 관련된 염증의 원인이 될 수 있다는 증거를 제공한다. Collard et al. (2000)은 산화 스트레스를 받은 배양된 내피 세포가 MBL에 결합하고 인간 혈청에 노출될 때 C3의 침착을 나타낸다는 것을 보고하였다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). 이에 더하여, 차단 항-MBL 단클론성 항체로의 인간 혈청의 처리는 MBL 결합 및 보체 활성화를 억제하였다. 이들 발견은 심근 허혈(myocardial ischemia)-재관류의 래트 모델로 확장되었으며 이 모델에서 래트 MBL에 대한 차단 항체로 처리된 래트는 관상 동맥이 폐색될 때 대조군 항체로 처리된 래트보다 훨씬 더 적은 심근 손상을 나타냈다 (Jordan et al., Circulation 104:1413-1418, (2001)). 산화 스트레스 후 혈관 내피세포에 대한 MBL 결합의 분자적 메커니즘은 불확실하고; 최근의 연구는 산화 스트레스 후 렉틴 경로의 활성화가 당컨쥬게이트가 아니라 혈관 내피 사이토케라틴에 대한 MBL 결합에 의해 매개될 수 있다는 것을 시사한다 (Collard et al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). 그 밖의 연구는 허혈/재관류 손상의 발병에서 고전적 및 대체 경로가 관련이 있으며 이 질환에서 렉틴 경로의 역할은 여전히 논쟁의 여지가 있다 (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).
최근의 연구는 MASP-1 및 MASP-3가 대체 경로 활성화 효소 인자 D를 치모겐 형태에서 효소적 활성 형태로 전환시킨다는 것을 나타냈다 (Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010); Iwaki et al., J. Immunol. 187:3751-58 (2011) 참조). 이 과정의 생리학적 중요성은 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈장에서 대체 경로 기능적 활성의 부재에 의해 강조된다. 고유의 C3로부터 C3b의 단백질 가수분해 생성은 대체 경로가 기능하는데 필요하다. 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)가 필수적인 서브유닛으로서 C3b를 함유하기 때문에, 대체 경로를 통한 최초 C3b의 기원에 관한 질문은 난해한 문제를 제공하고 상당한 연구를 자극하였다.
C3는 티오에스터 결합으로 알려져 있는 희귀한 번역 후 변형을 함유하는 단백질의 패밀리에 속한다 (C4 및 α-2 매크로글로불린과 함께). 티오에스터 기는 말단 카르보닐 기가 3개의 아미노산만큼 떨어진 시스테인의 설피드릴 기와 공유 티오에스터 결합을 형성하는 글루타민으로 구성된다. 이 결합은 불안정하고 친전자성 글루타밀-티오에스터는 하이드록실 또는 아미노 기와 같은 친핵성 모이어티와 반응하며 따라서 다른 분자와 공유 결합을 형성할 수 있다. 티오에스터 결합은 온전한 C3의 소수성 포켓 내에서 격리될 때 상당히 안정하다. 하지만, C3a 및 C3b로의 C3의 단백질 가수분해 분열은 C3b 상에서 고도로 반응성인 티오에스터 결합의 노출을 초래하고, 하이드록실 또는 아미노 기를 포함하는 인접한 모이어티에 의한 친핵성 공격 이후에, C3b는 표적에 공유 결합된다. 보체 표적으로의 C3b의 공유 부착에 있어서 그것의 잘 문서화된 역할 외에도, C3 티오에스터는 또한 대체 경로를 촉발하는데 있어서 중추적인 역할을 갖는 것으로 생각된다. 널리 수용되는 "틱-오버(tick-over) 이론"에 따르면, 대체 경로는 가수분해된 티오에스터 (iC3; C3(H2O)) 및 인자 B를 이용하여 C3로부터 형성되는 유체상 전환효소, iC3Bb의 생성에 의해 시작된다 (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162, (1984)). C3b-유사 C3(H2O)는 단백질에서 내부 티오에스터의 느린 자발적 가수분해에 의해 고유의 C3으로부터 생성된다 (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856-867, 1981). C3(H2O)Bb 전환효소의 활성을 통해, C3b 분자는 표적 표면 상에 침착되어 대체 경로를 시작한다.
본원에서 기술된 본 발견 이전에는, 대체 경로 활성화의 개시자에 대해서 알려진 것이 거의 없었다. 활성화 물질은 효모 세포벽 (치모산), 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 특정 면역글로불린, 바이러스, 균류, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충, 및 손상된 세포를 포함하는 것으로 생각된다. 이들 활성화 물질에 공통적인 유일한 특징은 탄수화물의 존재이지만, 탄수화물 구조의 복잡성 및 다양성은 인식되는 공유된 분자적 결정요인을 확립하는 것을 어렵게 만들었다. 대체 경로 활성화가 인자 H, 인자 I, DAF, 및 CR1과 같은 이 경로의 억제 조절 구성요소들과, 대체 경로의 유일한 양성 조절자인 프로퍼딘 간의 미세한 균형을 통해 제어된다는 것이 널리 받아들여지고 있다 (Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999) 참조).
상기 기술된 바와 같이 분명하게 조절되지 않는 활성화 메커니즘 외에도, 대체 경로는 또한 생성된 임의의 C3b가 인자 B와 함께 추가적인 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)를 형성하는데 참여할 수 있기 때문에 렉틴/고전적 경로 C3 전환효소 (C4b2a)에 대한 강력한 증폭 루프를 제공할 수 있다. 대체 경로 C3 전환효소는 프로퍼딘의 결합에 의해 안정화된다. 프로퍼딘은 대체 경로 C3 전환효소 반감기를 6 내지 10배 연장시킨다. 대체 경로 C3 전환효소로의 C3b의 추가는 대체 경로 C5 전환효소의 형성을 유도한다.
모든 세 가지 경로 (즉, 고전적, 렉틴 및 대체)는 C5에서 수렴하는 것으로 생각되었으며, 이것은 분열되어 다중 전염증성 효과를 가진 생성물을 형성한다. 수렴된 경로는 말단 보체 경로라고 불린다. C5a가 가장 강력한 아나필라톡신이며, 평활근 및 혈관 긴장도, 뿐만 아니라 혈관 투과성의 변화를 유도한다. 그것은 또한 강력한 케모탁신이고 호중구 및 단핵구 둘 다의 활성화 물질이다. C5a-매개된 세포 활성화는 사이토카인, 가수분해 효소, 아라키돈산 대사산물, 및 활성 산소종(reactive oxygen species)을 포함한, 다수의 추가적인 염증 매개물질의 방출을 유도함으로써 염증 반응을 크게 증폭시킬 수 있다. C5 분열은 막 공격 복합체 (MAC)로도 알려져 있는 C5b-9의 형성을 유도한다. 현재 저용해 MAC 침착이 용해성 기공-형성 복합체로서의 역할에 더하여 염증에서 중요한 역할을 할 수도 있다는 강력한 증거가 존재한다.
면역 방어에서의 필수적인 역할 외에도, 보체 시스템은 많은 임상적 병태에서 조직 손상의 원인이 된다. 따라서, 이들 부작용을 방지하기 위해 치료적으로 효과적인 보체 억제자를 개발하는 것이 절실히 필요하다.
한 양태에서, 본 발명은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728)에 높은 친화도 (500 pM 미만의 KD를 가짐)로 특이적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 대체 경로 보체 활성화를 억제한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 성질 중 적어도 하나 이상에 의해 특징지어진다: (a) 프로-인자(pro-factor) D 성숙화의 억제; (b) 인간 MASP-1 (서열 번호:8)에 결합하지 않음; (c) 포유류 대상체에서 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대체 경로의 억제 (d) 고전적 경로를 억제하지 않음 (e) 용혈 및/또는 옵소닌화의 억제; (f) MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분열의 억제; (g) 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착의 감소; (h) 활성화 표면 상에서 인자 B 및/또는 Bb 침착의 감소; (i) 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 휴지기 수준 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음)의 감소; (j) 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준 감소; (k) 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 휴지기 및 표면-유도된 수준의 생산 감소; 및/또는 (l) 인자 P 침착 감소. 일부 구체예에서, 단락 1 또는 2의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치하는 에피토프에 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 다음 중 적어도 하나 이상 내에 위치한다: VLRSQRRDTTVI (서열 번호:9), TAAHVLRSQRRDTTV (서열 번호:10), DFNIQNYNHDIALVQ (서열 번호:11), PHAECKTSYESRS (서열 번호:12), GNYSVTENMFC (서열 번호:13), VSNYVDWVWE (서열 번호:14) 및/또는 VLRSQRRDTTV (서열 번호:15). 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 다음 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다: ECGQPSRSLPSLV (서열 번호:16), RNAEPGLFPWQ (서열 번호:17); KWFGSGALLSASWIL (서열 번호:18); EHVTVYLGLH (서열 번호:19); PVPLGPHVMP (서열 번호:20); APHMLGL (서열 번호:21); SDVLQYVKLP (서열 번호:22); 및/또는 AFVIFDDLSQRW (서열 번호:23).
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:209 (XXDIN, 여기서 위치 1에서 X는 S 또는 T이고 위치 2에서 X는 N 또는 D이다)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:210 (WIYPRDXXXKYNXXFXD, 여기서 위치 7에서 X는 G 또는 D이고; 위치 8에서 X는 S, T 또는 R이고; 위치 9에서 X는 I 또는 T이고; 위치 13에서 X는 E 또는 D이고; 위치 14에서 X는 K 또는 E이고; 위치 16에서 X는 T 또는 K이다)으로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:211 (XEDXY, 여기서 위치 1의 X은 L 또는 V이고, 위치 4의 X는 T 또는 S이다)로 제시된 HC-CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:212 (KSSQSLLXXRTRKNYLX, 여기서 위치 8에서 X는 N, I, Q 또는 A이고; 위치 9에서 X는 S 또는 T이고; 위치 17에서 X는 A 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:146 (KQSYNLYT)으로 제시된 LC-CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:213 (SYGXX, 여기서 위치 4에서 X는 M 또는 I이고 위치 5에서 X는 S 또는 T이다)으로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:74로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:214 (GGXAXDY, 여기서 위치 3에서 X는 E 또는 D이고 위치 5에서 X는 M 또는 L이다)로 제시된 HC-CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:215 (KSSQSLLDSXXKTYLX, 여기서 위치 10에서 X는 D, E 또는 A이고; 위치 11에서 X는 G 또는 A이고; 위치 16에서 X는 N 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:155로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:216 (WQGTHFPXT, 여기서 위치 8에서 X는 W 또는 Y이다)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:84 (GKWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:86 (EILPGTGSTNYNEKFKG) 또는 서열 번호:275 (EILPGTGSTNYAQKFQG)로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:88 (SEDV)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:142 (KSSQSLLNSRTRKNYLA), 서열 번호:257 (KSSQSLLQSRTRKNYLA); 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA); 또는 서열 번호:259 (KSSQSLLNTRTRKNYLA)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:161 (KQSYNIPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:91 (GYWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:93 (EMLPGSGSTHYNEKFKG)으로 제시된 HC-CDR2, 및 서열 번호:95 (SIDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:163 (RSSQSLVQSNGNTYLH)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:165 (KVSNRFS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:167 (SQSTHVPPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다:
(a) 서열 번호:109 (RVHFAIRDTNYWMQ)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:110 (AIYPGNGDTSYNQKFKG)로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:112 (GSHYFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:182 (RASQSIGTSIH)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:184 (YASESIS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:186 (QQSNSWPYT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호:125 (DYYMN)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:127 (DVNPNNDGTTYNQKFKG)로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:129 (CPFYYLGKGTHFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:196 (RASQDISNFLN)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:198 (YTSRLHS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:200 (QQGFTLPWT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 서열 번호:137로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:138로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:140으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:206으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:207로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:208로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열 번호:98로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:99로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:101로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:169로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:171로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:173으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(e) 서열 번호:103으로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:105로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:107로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:176으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(f) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:116으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:118로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:188로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:190으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(g) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:121로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:123으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:191로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 방법은 포유동물에서 대체 경로 보체 경로 활성화를 억제하기에 충분한 고 친화도 MASP-3 억제 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 양을 필요로 하는 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 방법의 한 구체예에서, 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편은 500 pM 미만의 친화도로 MASP-3에 결합한다. 방법의 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물 투여의 결과로서 다음 중 하나 이상이 포유류 대상체에 존재한다: (a) 인자 D 성숙화의 억제; (b) 대상체에게 투여될 때 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대체 경로의 억제; (c) 고전적 경로는 억제되지 않음; (d) 용혈 및/또는 옵소닌화 억제; (e) 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착 감소; (f) 활성화 표면 상에서 인자 B 및 Bb 침착 감소; (g) 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 휴지기 수준 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음)의 감소; (h) 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소; 및/또는 (i) 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 휴지기 및 표면-유도된 수준의 생산 감소. 방법의 한 구체예에서, 조성물은 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대체 경로를 억제하는 MASP-3 억제 항체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; PNH), 나이-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration; AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation), 혈전성 미세혈관증(thrombotic microangiopathy), 천식(asthma), 고밀도 침착병(dense deposit disease), 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염(pauci-immune necrotizing crescentic glomerulonephritis), 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴(aspiration pneumonia), 내안구염(endophthalmitis), 시속척수염(neuromyelitis optica) 또는 베체트 병(Behcet's disease)으로 고통받고 있는 대상체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 방법은 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 고 친화도 MASP-3 억제제의 양을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 살아있는 대상체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용을 위한 의약을 제조하는 방법을 제공하며, 약학적 담체에서 MASP-3 억제제의 치료적 유효량을 조합하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-3 억제제는 고 친화도 MASP-3 억제 항체이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증, 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 또는 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화의 효과를 억제하는데 사용을 위한 의약을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-3 억제자를 포함하는 의약으로 또는 이것과 함께 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 조합하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 MASP-3 억제 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 고 친화도 MASP-3 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258, 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 대상체에서 PNH를 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258, 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 PNH로 고통받고 있는 대상체에서 적혈구 세포의 생존을 증가시킨다. 일부 구체예에서, PNH로 고통받고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체는 (i) 정상 수준 미만의 헤모글로빈 (ii) 정상 수준 미만의 혈소판; (iii) 정상 수준 초과의 망상 적혈구, 및 (iv) 정상 수준 초과의 빌리루빈으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 PNH로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 전신으로 (예를 들어, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 동맥내로 또는 흡입제로서) 투여된다. 일부 구체예에서, PNH로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 치료를 이전에 받았거나, 또는 현재 받고 있는 중이다. 일부 구체예에서, 방법은 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화된 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 관절염 (염증성 및 비-염증성 관절성 피진(arthritide))으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며 대상체에서 관절염을 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 골관절염(osteoarthritis), 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 베체트 병, 감염-관련 관절염 및 건선성 관절염(psoriatic arthritis)으로 구성된 군으로부터 선택된 관절염으로 고통받고 있다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 전신으로 (즉, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 동맥내로 또는 흡입제로서) 투여된다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 관절에 국소적으로 투여된다.
본원에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 다양한 구체예는, 선택적으로 MASP-2 억제제의 다양한 구체예와 조합하여, 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다.
본원에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 기술된 본 발명의 이들 및 다른 양태 및 구체예는 다음 상세한 설명 및 도면을 참조할 때 분명해질 것이다. 이 명세서에서 언급된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 공보는 모두 각각 개별적으로 포함되는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 상기 언급된 양태 및 많은 부수적인 이점들은 첨부된 도면과 함께 취해질 때, 다음 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해되는 것처럼 더 쉽게 인정될 것이다.
도 1은 렉틴 및 대체 경로의 새로운 해석을 나타낸다.
도 2는 Yongqing et al., BBA 1824:253 (2012)에 의해 변형된 바와 같이, Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002)로부터 조정된 개략도이며, MASP-1, MASP-3 및 MAp44 단백질 도메인 및 이것들을 암호화하는 엑손을 나타낸다.
도 3은 밑줄로 나타난 선도 서열을 가진 인간 MASP-3 아미노산 서열 (서열 번호:2)을 도시한다.
도 4는 다종의 전장 MASP-3 단백질의 정렬을 나타낸다.
도 5는 다종의 MASP-3 단백질의 SP 도메인의 정렬을 나타낸다.
도 6은 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 2.6 x 107 cfu의 감염 용량의 네이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 혈청군 A Z2491을 투여한 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타내는 카플란-메이어(Kaplan-Meyer) 플롯이며, MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망률로부터 보호된다는 것을 입증한다.
도 7은 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 6 x 106 cfu의 감염 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58을 투여한 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타내는 카플란-메이어 플롯이며, MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망률로부터 보호된다는 것을 입증한다.
도 8은 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 6x106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 i.p. 감염 후 상이한 시점에 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 회수한 혈액 mL 당 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 로그 cfu/mL를 그래프로 나타내며 (두 군의 마우스에 대하여 상이한 시점에 n=3), MASP-2 KO 마우스는 WT 마우스와 동일한 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염되지만, MASP-2 KO 마우스는 WT와 비교하여 균혈증(bacteremia)의 클리어런스(clearance)가 향상되었음을 입증한다.
도 9는 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 6x106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염 후 3, 6, 12 및 24시간에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 평균 질병 점수(average illness score)를 그래프로 나타내며, MASP-2-결핍 마우스가 WT 마우스와 비교하여 감염 후 6시간, 12시간, 및 24시간에 훨씬 더 낮은 질병 점수를 나타냈다는 것을 입증한다.
도 10은 실시예 2에서 기술된 바와 같이, 4x106 cfu의 감염 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여에 이어서, 감염 후 3시간에 억제 MASP-2 항체 (1 mg/kg) 또는 대조군 아이소타입(isotype) 항체의 투여 후 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타내는 카플란-메이어 플롯이며, MASP-2 항체가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 대상체를 치료하고 상기 대상체의 생존률을 향상시키는데 효과적임을 입증한다.
도 11은 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58와 함께 인큐베이션한 후 다양한 시점에 채취된 표 6에서 나타난 인간 혈청 샘플에서 다양한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 생균수의 로그 cfu/mL를 그래프로 나타낸다.
도 12는 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 표 8에서 나타난 인간 혈청 샘플에서 상이한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수의 로그 cfu/mL를 그래프로 나타내며, 인간 20% (v/v) 혈청 중의 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해가 MASP-3 및 MBL-의존적임을 나타낸다.
도 13은 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 표 10에서 나타난 마우스 혈청 샘플에서 상이한 시점에 회수된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수의 로그 cfu/mL를 그래프로 나타내며, MASP-2 -/- 넉아웃(knockout) 마우스 ("MASP-2 -/-"로 불림) 혈청이 WT 마우스 혈청보다 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 더 높은 수준의 살균 활성을 나타내는 반면에, 대조적으로, MASP-1/3 -/- 마우스 혈청은 어떠한 살균 활성도 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
도 14는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, WT, C4-/-, MASP-1/3-/-, 인자 B-/- 및 MASP-2-/- 마우스 혈청에서 렉틴 경로-특이적 조건 (1% 혈장) 하에 C3 활성화의 동역학을 그래프로 나타낸다.
도 15는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 대상체로부터 얻은 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 "전통적인(traditional)" 대체 경로-특이적 (AP-특이적) 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 대체 경로-구동된 (AP-구동된) C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 16은 실시예 4에서 기술된 바와 같이, MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 대상체로부터 얻은 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 "전통적인" AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 17A는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, "전통적인" AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로 (AP)가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻은 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 만난-코팅된 미세역가 플레이트 상의 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 17B는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻은 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 17C는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻어진 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 스트렙토코쿠스 뉴모니애(스트렙토코쿠스 뉴모니애e) D39-코팅된 미세역가 플레이트 상의 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 18A는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서, 0%에서 1.25%까지의 범위에 있는 혈청 농도를 사용하여 만난-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된, 고도로 희석된 혈청 내 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 18B는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서, 0%에서 1.25%까지의 범위에 있는 혈청 농도를 사용하여 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 18C는 실시예 4에서 기술된 바와 같이, 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서, 0%에서 1.25%까지의 범위에 있는 혈청 농도를 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 19는 실시예 5에서 기술된 바와 같이, 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca++의 존재시) MASP-3-/-의 혈청, 열 비활성화된 정상 인간 혈청 (HI NHS), MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군에서 혈청 희석의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 20은 실시예 5에서 기술된 바와 같이, 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca++의 존재시) MASP-3-/-의 혈청, 열 비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 21은 실시예 5에서 기술된 바와 같이, 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca++의 존재시) 3MC (MASP-3-/-)의 혈청, 열 비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 WT 마우스 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 22는 실시예 5에서 기술된 바와 같이, 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca++의 존재시) 열 비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, NHS + MASP-2 단클론성 항체 및 NHS 대조군의 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 비-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (CD55/59-/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다.
도 23은 실시예 6에서 기술된 바와 같이, 혈청 농도의 범위에 걸쳐 생리학적 조건 하에서 (즉, Ca++의 존재시) MASP-1/3-/- 마우스 혈청 및 WT 대조군 마우스 혈청에 의한 만난-코팅된 토끼 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 토끼 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다.
도 24A는 실시예 7에서 기술된 바와 같이, 클론 M3J5에 대한 MASP-3 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이다.
도 24B는 실시예 7에서 기술된 바와 같이, 클론 M3M1에 대한 MASP-3 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이다.
도 25는 실시예 7에서 기술된 바와 같이, MASP-3 항원에 대한 클론 M3J5 (클론 5)의 포화 결합 곡선을 그래프로 나타낸다.
도 26A는 실시예 7에서 기술된 바와 같이, 닭 DT40 VH 서열에 대한 M3J5, M3M1, D14 및 1E10의 VH 영역의 아미노산 서열 정렬이며, 점(dot)은 DT40 서열과의 아미노산 동일성을 나타내고 쇄선은 정렬을 극대화하도록 도입된 공간을 나타낸다.
도 26B는 실시예 7에서 기술된 바와 같이, 닭 DT40 VL 서열에 대한 M3J5, M3M1, D14 및 1E10의 VL 영역의 아미노산 서열 정렬이며, 점은 DT40 서열과의 아미노산 동일성을 나타내고 쇄선은 정렬을 극대화하도록 도입된 공간을 나타낸다.
도 27은 실시예 7에서 기술된 바와 같이, Wieslab Complement System Screen, MBL Pathway에서 검정 키트와 함께 제공된 양성 혈청, 뿐만 아니라 아이소타입 대조군 항체와 비교하여 단클론성 항체 (mAb) 1E10의 억제 활성을 나타내는 막대그래프이며, mAb1E10 일부는 LEA-2-의존적 활성화를 억제하는 반면 (MASP-2의 MASP-1-의존적 활성화의 억제를 통해), 아이소타입 대조군 항체는 그렇지 않다는 것을 입증한다.
도 28A는 열-살해된 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 상에서의 C3b 침착에 대한 유동 세포 분석법의 결과를 제공하며, 실시예 8에서 기술된 바와 같이, 렉틴 및 대체 경로를 비활성화시키는 것으로 알려져 있는 EDTA의 존재시 정상 인간 혈청에서는, C3b 침착이 관찰되지 않았고 (패널 1), Mg++/EGTA로 처리된 정상 인간 혈청에서는, 대체 경로-구동된 C3b 침착이 관찰되었으며 (패널 2), 패널 3, 4 및 5에서 나타난 바와 같이, 각각 인자 B-고갈된 혈청, 인자 D-고갈된 혈청 및 프로퍼딘 (인자 P)-고갈된 혈청에서는, 대체 경로 구동된 C3b 침착이 관찰되지 않았음을 입증한다.
도 28B는 실시예 8에서 기술된 바와 같이, 열-살해된 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 상에서의 C3b 침착에 대한 유동 세포 분석법의 결과를 제공하며, EDTA-처리된 정상 혈청 (패널 1)에서와 같이, Mg++/EGTA의 존재시 (패널 3) AP-구동된 C3b 침착이 3MC 혈청 내에 부재하는 반면, 패널 4 및 5에서는 활성 전장 rMASP-3 (패널 4) 및 활성 rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (패널 5)이 모두 Mg++/EGTA로 처리된 정상 혈청에서 관찰된 수준으로 3MC 혈청 중의 AP-구동된 C3b 침착을 회복시키고 (패널 2), 비활성 rMASP-3 (S679A) (패널 6) 및 야생형 야생형 rMASP-1 (패널 7)은 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착을 회복시킬 수 없다는 것을 입증한다.
도 29는 rMASP-3의 존재 또는 부재시 3MC 혈청 중의 스타필로코쿠스 아우레우스에 반응하여 인자 B 분열을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타내며, EDTA의 존재시 정상 인간 혈청 (음성 대조군, 레인 1)은 레인 2에서 나타난 Mg++/EGTA의 존재시 정상 인간 혈청 (양성 대조군)에 비해 인자 B 분열이 거의 없었고, 레인 3에서 추가로 나타난 바와 같이, 3MC 혈청은 Mg++/EGTA의 존재시 인자 B 분열이 거의 없었음을 입증한다. 하지만, 실시예 8에서 기술된 바와 같이, 레인 4에서 나타난 것처럼, 인자 B 분열은 3MC 혈청으로의 전장, 재조합 MASP-3 단백질의 추가 및 사전-인큐베이션에 의해 회복된다.
도 30은 실시예 8에서 기술된 바와 같이, 인자 B 분열이 분석되는 단백질 겔의 쿠마시(Comassie) 염색을 나타내며, C3, MASP-3 및 프로-인자 D의 존재시 (레인 1) 가장 최적이고, 레인 4 및 5에서 나타난 바와 같이, MASP-3 또는 프로-인자 D는 C3가 존재하는 한 인자 B 분열을 단독으로 매개할 수 있다는 것을 입증한다.
도 31은 실시예 8에서 기술된 바와 같이, rMASP-3의 존재시 3MC 혈청 중의 mAb 농도의 함수로서 플롯팅된(plotted) mAbD14 (MASP-3에 결합함), mAb1A5 (음성 대조군 항체) 및 아이소타입 대조군 항체로부터 얻은 스타필로코쿠스 아우레우스의 C3b 염색의 평균 형광 강도 (MFI)를 그래프로 나타내며, mAbD14가 농도-의존적 방식으로 MASP-3-의존적 C3b 침착을 억제한다는 것을 입증한다.
도 32는 실시예 9에서 기술된 바와 같이, 프로-인자 D 기질 분열의 웨스턴 블롯 분석을 나타내며, 프로-인자 D 단독 (레인 1) 또는 비활성 전장 재조합 MASP-3 (S679A; 레인 3) 또는 MASP-1 (S646A; 레인 4)과 비교하여, 전장 야생형 재조합 MASP-3 (레인 2) 및 MASP-1 (레인 5)는 프로-인자 D를 완전히 또는 부분적으로 분열시켜 성숙한 인자 D를 생성한다.
도 33은 실시예 9에서 기술된 바와 같이, 단지 MASP-3 및 프로-인자 D만을 함유하는 대조군 반응 (no mAb 없음, 레인 1), 뿐만 아니라 MASP-1에 결합하지만, MASP-3에 결합하지 않는 DTLacO 라이브러리로부터 얻은 mAb를 함유하는 대조군 반응 (레인 4)과 비교하여 MASP-3-의존적 프로-인자 D 분열에 대한 MASP-3 결합 mAb D14 (레인 2) 및 M3M1 (레인 3)의 억제 활성을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
도 34는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, MASP-3-결핍 (3MC), C4-결핍 및 MBL-결핍 대상체로부터 얻어진 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타내며, Patient 2 및 Patient 3의 MASP-3-결핍 혈청은 높은 혈청 농도 (25%, 12.5%, 6.25% 혈청 농도)에서 잔류 AP 활성을 나타내지만, 훨씬 더 높은 농도에서는 AP50을 나타냈음을 입증한다 (즉, 최대 C3 침착의 50%를 달성하는데 필요한 8.2% 및 12.3%의 혈청).
도 35A는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, MASP-3 결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 대상체로부터 얻은 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 "전통적인" AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 35B는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+)), 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))으로부터 얻은 혈장, 및 정상 공여체 (W)의 혈청을 이용한 웨스턴 블롯을 나타내며, 인간 프로-인자 D (25,040 Da) 및/또는 성숙한 인자 D (24,405 Da)는 인간 인자 D-특이적 항체로 검출되었다.
도 35C는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 3MC 환자 #2, 3MC 환자 #3으로부터 얻은 혈장, 및 정상 인간 혈청을 이용한 Weislab 고전적, 렉틴 및 대체 경로 검정의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 36은 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 두 명의 정상 인간 대상체 (NHS) 및 두 명의 3MC 환자 (Patient 2 및 Patient 3)의 혈청에서 Ca++의 부재시 측정된, 혈청 농도의 범위에 걸쳐 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 토끼 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타내며, MASP-3 결핍이 정상 인간 혈청과 비교하여 만난-코팅된 적혈구의 보체-매개된 용해의 퍼센트를 감소시킨다는 것을 입증한다.
도 37은 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 인간 3MC Patient 2 (MASP-3-/-)로부터 얻은 혈청 샘플에 추가된 재조합 전장 MASP-3 단백질의 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타내며, 음성 대조군 비활성 재조합 MASP-3 (MASP-3A; S679A)과 비교하여, 활성 재조합 MASP-3 단백질은 농도-의존적 방식으로 치모산-코팅된 플레이트 상의 AP-구동된 C3b 침착을 복원한다는 것을 입증한다.
도 38은 실시예 10에서 기술된 바와 같이, (1) 정상 인간 혈청 (NHS); (2) 3MC 환자 혈청; (3) 3MC 환자 혈청 플러스 활성 전장 재조합 MASP-3 (20 μg/ml); 및 (4) 열-비활성화된 인간 혈청 (HIS)에서 Ca++의 부재시 측정된, 혈청 농도의 범위에 걸쳐 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 토끼 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타내며, 토끼 적혈구의 퍼센트 용해는 재조합 MASP-3이 없는 3MC 혈청에서 퍼센트 용해와 비교하여 rMASP-3을 함유하는 3MC 혈청에서 유의하게 증가한다는 것을 입증한다 (p=0.0006).
도 39는 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 0 내지 110 μg/ml (BBS/Mg++/EGTA 중의)의 농도 범위에서 활성 재조합 MASP-3를 함유하는 3MC Patient 2 및 3MC Patient 3의 7% 인간 혈청에서 토기 적혈구 용해의 퍼센트를 그래프로 나타내며, 토끼 적혈구 용해의 퍼센트가 농도-의존적 방식으로 재조합 MASP-3의 양과 함께 증가한다는 것을 입증한다.
도 40은 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 정상 인간 대상체 (NHS), 두 명의 3MC 환자 (Patient 2 및 Patient 3), Patient 3의 부모 및 MBL-결핍 대상체의 혈청에 대하여, BBS 버퍼에 희석된 인간 혈청의 농도의 함수로서 만난-코팅된 ELISA 플레이트 상의 LEA-2-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 41은 실시예 11에서 기술된 바와 같이, 인간 MASP-3으로 수행된 결합 실험의 대표적인 예를 그래프로 나타내며 여기서 M3-1 Fab (13B1로도 불림)은 인간 단백질에 대하여 약 0.117 nM의 겉보기 결합 친화도(apparent binding affinity) (EC50)를 나타낸다.
도 42는 실시예 11에서 기술된 바와 같이, 마우스 MASP-3으로 수행된 결합 실험의 대표적인 예를 그래프로 나타내며, 여기서 M3-1 Fab (13B1로도 불림)는 마우스 단백질에 대하여 약 0.214 nM의 겉보기 결합 친화도 (EC50)를 나타낸다.
도 43은 실시예 11에서 기술된 바와 같이, CFD-고갈된 인간 혈청 중의 다양한 농도의 mAb M3-1 (13B1로도 불림)의 존재시 치모산 입자 상의 보체 인자 Bb 침착 (MFI 유닛으로 측정된 세포 분석 검출에 의해 결정됨)을 그래프로 나타낸다.
도 44는 실시예 11에서 기술된 바와 같이, 야생형 마우스에서 mAb M3-1 (13B1)의 단일 용량 (10 mg/kg i.v.) 이후 다양한 시점에서 치모산 입자 상의 C3 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 45는 실시예 12에서 기술된 바와 같이, mAb M3-1 (13B1) (제-11 일, 제04 일, 제-1 일 및 제+6 일에 10 mg/kg)로 처리된 야생형 수령체 마우스, mAb BB5.1 처리된 마우스, 또는 비히클(vehicle) 처리된 마우스에서 14일의 기간 동안 공여체 RBC (WT 또는 Crry-)의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타낸다.
도 46은 실시예 12에서 기술된 바와 같이, mAb M3-1 (13B1)의 단일 용량 (제-6 일에 20 mg/kg)으로 처리된 야생형 수령체 마우스 또는 비히클 처리된 마우스에서 16일의 기간 동안 공여체 RBC (WT 또는 Crry-)의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타낸다.
도 47은 실시예 13에서 기술된 바와 같이, 콜라겐-항체 유도된 관절염 모델에서 14일 시간 경과 중에 mAb M3-1 (13B1) (5 mg/kg 또는 20 mg/kg)로 처리된 마우스 또는 비히클 처리된 마우스의 임상적 점수를 그래프로 나타낸다.
도 48은 실시예 13에서 기술된 바와 같이, 콜라겐-항체 유도된 관절염 모델에서 14일 시간 경과 중에 mAb M3-1 (13B1) (5 mg/kg 또는 20 mg/kg)로 처리된 마우스 또는 비히클 처리된 마우스의 관절염의 퍼센트 발병률을 그래프로 나타낸다.
도 49A는 실시예 15에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 (≤500 pM) 항-인간 MASP-3 억제 mAb의 VH 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 49B는 실시예 15에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 (≤500 pM) 항-인간 MASP-3 억제 mAb의 VL 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 50A는 실시예 15에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 mAb의 VH 영역의 계통수이다.
도 50B는 실시예 15에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 mAb의 VL 영역의 계통수이다.
도 51A는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 결합 실험의 결과를 그래프로 나타내며, 여기서 대표적인 정제된 재조합 항-인간 MASP-3 억제 항체는 인간 MASP-3 단백질에 대하여 500 pM 미만 (예를 들어, 240 pM 내지 23 pM)의 겉보기 결합력을 나타낸다.
도 51B는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 결합 실험의 결과를 그래프로 나타내며, 여기서 대표적인 정제된 재조합 항-인간 MASP-3 억제 항체는 인간 MASP-3 단백질에 대하여 500 pM 미만 (예를 들어, 91 pM 내지 58 pM)의 겉보기 결합력을 나타낸다.
도 51C는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 결합 실험의 결과를 그래프로 나타내며, 여기서 대표적인 정제된 재조합 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 항체는 MASP-3으로의 결합에 대하여 선택적인 것인 것으로 나타났고 인간 MASP-1에는 결합하지 않는다.
도 51D는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 결합 실험의 결과를 그래프로 나타내며, 여기서 대표적인 정제된 재조합 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 항체는 MASP-3으로의 결합에 대하여 선택적인 것인 것으로 나타났고 인간 MASP-2에는 결합하지 않는다.
도 52는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 결합 실험의 결과를 그래프로 나타내며, 여기서 대표적인 정제된 재조합 항-인간 MASP-3 억제 항체는 또한 마우스 MASP-3 단백질에 대하여 높은 결합력을 나타낸다.
도 53은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 대표적인 고 친화도 MASP-3 항체가 형광원성 트리펩타이드 분열을 억제할 수 있는 능력을 측정하는 결합 실험의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 54는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb가 시험관 내(in vitro) 검정에서 인자 D로의 프로-인자 D의 재조합 MASP-3-매개된 분열을 차단할 수 있는 능력을 입증하는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 55A는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 인자 D-고갈된 인간 혈청 중에 다양한 농도의 고 친화도 MASP-3 mAb 1F3, 1G4, 2D7 및 4B6의 존재시 치모산 입자 상의 보체 인자 Bb 침착 (MFI 유닛으로 측정된 유동 세포 분석 검출로 결정됨)의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 55B는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 인자 D-고갈된 인간 혈청 중에 다양한 농도의 고 친화도 MASP-3 mAb 4D5, 10D12 및 13B1의 존재시 치모산 입자 상의 보체 인자 Bb 침착 (MFI 유닛으로 측정된 유동 세포 분석 검출로 결정됨)의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 56A는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 다양한 농도의 고 친화도 MASP-3 mAb 1A10, 1F3, 4B6, 4D5및 2F2의 존재시 토끼 적혈구 용해의 억제의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 56B는 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 다양한 농도의 고 친화도 MASP-3 mAb 1B11, 1E7, 1G4, 2D7 및 2F5의 존재시 토끼 적혈구 용해의 억제의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 57은 실시예 16에서 기술된 바와 같이, 활성 재조합 MASP-3 (rMASP-3), 비활성 rMASP-3, 및 활성 rMASP-3 플러스 고 친화도 MASP-3 mAb 4D5의 존재시 3MC 환자 혈청 (Patient B)에서 프로-인자 D 및 인자 D의 수준을 분석하는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 58은 실시예 17에서 기술된 바와 같이, 야생형 마우스에서 고 친화도 MASP-3 mAb M3-1 (13B1, 10 mg/kg) 또는 10D12 (10 mg/kg)의 단일 용량 이후 다양한 시점에서 치모산 입자에 대한 C3/C3b/iC3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 59는 실시예 17에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 mAb 10D12 (10mg/kg)로 처리된 마우스 또는 비히클 대조군 처리된 마우스에서 인자 B의 인자 Ba 단편의 상태를 분석하는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 60은 실시예 17에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 mAb 10D12 (10 mg/kg 또는 25 mg/kg)로 처리된 마우스의 20% 혈청에 의한 용혈의 억제의 수준을 그래프로 나타낸다.
도 61A는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 mAb 4D5 및 인간 MASP-3 사이의 상호작용을 차단하는 고 친화도 MASP-3 mAb를 식별하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61B는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 mAb 10D12 및 인간 MASP-3 사이의 상호작용을 차단하는 고 친화도 MASP-3 mAb를 식별하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61C는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 mAb 13B1 및 인간 MASP-3 사이의 상호작용을 차단하는 고 친화도 MASP-3 mAb를 식별하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61D는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 mAb 1F3 및 인간 MASP-3 사이의 상호작용을 차단하는 고 친화도 MASP-3 mAb를 식별하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61E는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 mAb 1G4 및 인간 MASP-3 사이의 상호작용을 차단하는 고 친화도 MASP-3 mAb를 식별하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 62는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, 펩스캔 분석에 의해 결정된, 고 친화도 MASP-3 mAb에 의한 인간 MASP-3 상의 접촉 영역을 나타내는 개략도를 제공한다.
도 63A는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, MASP-3의 아미노산 잔기 498-509 (서열 번호:9), 아미노산 잔기 544-558 (서열 번호:11), 아미노산 잔기 639 내지 649 (서열 번호:13) 및 아미노산 잔기 704 내지 713 (서열 번호:14)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 1F3, 4D5 및 1A10 사이의 접촉 영역을 나타낸다.
도 63B는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, MASP-3의 아미노산 잔기 498 내지 509 (서열 번호:9)를 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 10D12 사이의 접촉 영역을 나타낸다.
도 64는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, MASP-3의 아미노산 잔기 494 내지 508 (서열 번호:10) 및 아미노산 잔기 626 내지 638 (서열 번호: 12)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 13B1 사이의 접촉 영역을 나타낸다.
도 65는 실시예 18에서 기술된 바와 같이, MASP-3의 아미노산 잔기 435 내지 447 (서열 번호:16), 아미노산 잔기 454 내지 464 (서열 번호:17), 아미노산 잔기 583 내지 589 (서열 번호:21) 및 아미노산 잔기 614 내지 623 (서열 번호:22)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 1B11 사이의 접촉 영역을 나타낸다.
도 66은 실시예 18에서 기술된 바와 같이, MASP-3의 아미노산 잔기 454 내지 464 (서열 번호:17), 아미노산 잔기 514 내지 523 (서열 번호:19) 및 아미노산 잔기 667 내지 678 (서열 번호:23)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 1E7, 1G4 및 2D7 사이의 접촉 영역을 나타낸다.
도 67은 실시예 18에서 기술된 바와 같이, MASP-3의 아미노산 잔기 454 내지 464 (서열 번호:17), 아미노산 잔기 479 내지 493 (서열 번호:18), 아미노산 잔기 562 내지 571 (서열 번호:20), 및 아미노산 잔기 667 내지 678 (서열 번호:23)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 15D9 및 2F5 사이의 접촉 영역을 나타낸다.
도 68은 실시예 20에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 억제 mAb 13B1 (10 mg/kg), 인자 B mAb 1379 (30 mg/kg) 또는 아이소타입 대조군 mAb (10 mg/kg)으로 처리된 마우스에서 실험적 자가면역성 뇌척수염 (autoimmune encephalomyelitis; EAE) 모델의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 69는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 혈청 샘플에 혼합된 항-인자 D 항체의 존재 또는 부재시 고 친화도 MASP-3 mAb h13B1X로 처리 후 시간이 흐름에 따라 세 마리의 게먹이 원숭이(cynomolgus monkey)의 군으로부터 얻은 혈청 샘플에서 치모산 입자의 표면 상의 보체 인자 Bb를 검출하는 유동 세포 분석 검정의 평균 MFI로 결정된 APC 활성을 그래프로 나타낸다.
도 70은 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 억제 mAb h4D5X, h10D12X 또는 h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리된 게먹이 원숭이의 군 (군 당 3마리)으로부터 얻은 혈청 샘플에서 치모산 상의 Bb 침착으로 결정된 APC 활성을 그래프로 나타낸다.
도 71A은 실시예 21에서 기술된 바와 같이, mAb h4D5X, h10D12X, 및 h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리된 게먹이 원숭이의 군 (군 당 3마리)으로부터 얻은 혈청 샘플 중의 유체상 Bb로 결정된 APC 활성을 그래프로 나타낸다.
도 71B는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, mAb h4D5X, h10D12X, 및 h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리 후 시간이 흐름에 따라 게먹이 원숭이의 군 (군 당 3마리)으로부터 얻은 혈청 샘플 중의 유체상 Bb로 결정된 APC 활성을 그래프로 나타낸다.
도 71C는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, mAb h4D5X, h10D12X, 및 h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리 후 시간이 흐름에 따라 게먹이 원숭이의 군 (군 당 3마리)으로부터 얻은 혈청 샘플 중의 유체상 C3a로 결정된 APC 활성을 그래프로 나타낸다.
도 72A는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 유체상 Ba에 의해 측정된 완전한 APC 억제의 시점에서 표적 (MASP-3) 대 고 친화도 MASP-3 억제 항체 h4D5X의 몰 비를 그래프로 나타낸다.
도 72B는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 유체상 Ba에 의해 측정된 완전한 APC 억제의 시점에서 표적 (MASP-3) 대 고 친화도 MASP-3 억제 항체 h10D12X의 몰 비를 그래프로 나타낸다.
도 72C는 실시예 21에서 기술된 바와 같이, 유체상 Ba에 의해 측정된 완전한 APC 억제의 시점에서 표적 (MASP-3) 대 고 친화도 MASP-3 억제 항체 h13B1X의 몰 비를 그래프로 나타낸다.
도 73은 실시예 21에서 기술된 바와 같이, mAb h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리 후 시간 (시간)이 흐르멩 따라 게먹이 원숭이의 혈청에서 프로-인자 D 및 인자 D의 수준을 분석하는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
서열 목록의 설명
서열 번호:1 인간 MASP-3 cDNA
서열 번호:2 인간 MASP-3 단백질 (선도 서열 포함)
서열 번호:3 마우스 MASP-3 단백질 (선도 서열 포함)
서열 번호:4 래트 MASP-3 단백질
서열 번호:5 닭 MASP-3 단백질
서열 번호:6 토끼 MASP-3 단백질
서열 번호:7 게먹이 원숭이 MASP-3 단백질
서열 번호:8 인간 MASP-1 단백질 (선도 서열 포함)
인간 MASP-3 SP 도메인 펩타이드 단편:
서열 번호:9 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 498-509)
서열 번호:10 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 494-508)
서열 번호:11 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 544-558)
서열 번호:12 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 626-638)
서열 번호:13 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 639-649)
서열 번호:14 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 704-713)
서열 번호:15 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 498-508)
서열 번호:16 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 435-447)
서열 번호:17 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 454-464)
서열 번호:18 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 479-493)
서열 번호:19 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 514-523)
서열 번호:20 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 562-571)
서열 번호:21 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 583-589)
서열 번호:22 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 614-623)
서열 번호:23 (선도 서열을 포함하는 인간 MASP-3의 aa 667-678)
서열 번호:24-39: 중쇄 가변 영역-마우스 모체
서열 번호:24 4D5_VH
서열 번호:25 1F3_VH
서열 번호:26 4B6_VH
서열 번호:27 1A10_VH
서열 번호:28 10D12_VH
서열 번호:29 35C1_VH
서열 번호:30 13B1_VH
서열 번호:31 1G4_VH
서열 번호:32 1E7_VH
서열 번호:33 2D7_VH
서열 번호:34 49C11_VH
서열 번호:35 15D9_VH
서열 번호:36 2F5_VH
서열 번호:37 1B11_VH
서열 번호:38 2F2_VH
서열 번호:39 11B6_VH
서열 번호:40-54: 경쇄 가변 영역-마우스 모체
서열 번호:40 4D5_VL
서열 번호:41 1F3_VL
서열 번호:42 4B6/1A10_VL
서열 번호:43 10D12_VL
서열 번호:44 35C1_VL
서열 번호:45 13B1_VL
서열 번호:46 1G4_VL
서열 번호:47 1E7_VL
서열 번호:48 2D7_VL
서열 번호:49 49C11_VL
서열 번호:50 15D9_VL
서열 번호:51 2F5_VL
서열 번호:52 1B11_VL
서열 번호:53 2F2_VL
서열 번호:54 11B6_VL
서열 번호:55-140: 마우스 모체 MASP-3 mAb의 중쇄 프레임워크 영역 (FR) 및 상보성-결정 영역 (CDR)
서열 번호:141-208: 마우스 모체 MASP-3 mAb의 경쇄 FR 및 CDR
서열 번호:209-216: CDR 공통 서열
서열 번호:217-232: 중쇄 가변 영역 (마우스 모체)을 암호화하는 DNA
서열 번호:233-247: 경쇄 가변 영역 (마우스 모체)을 암호화하는 DNA
서열 번호:248: 인간화된 4D5_VH-14 (h4D5_VH-14) 중쇄 가변 영역
서열 번호:249: 인간화된 4D5_VH-19 (h4D5_VH-19) 중쇄 가변 영역
서열 번호:250: 인간화된 4D5_VL-1 (h4D5_VL-1) 경쇄 가변 영역
서열 번호:251: 인간화된 10D12_VH-45 (h10D12_VH-45) 중쇄 가변 영역
서열 번호:252: 인간화된 10D12_VH-49 (h10D12_VH-49) 중쇄 가변 영역
서열 번호:253: 인간화된 10D12_VL-21 (h10D12-VL-21) 경쇄 가변 영역
서열 번호:254: 인간화된 13B1_VH-9 (h13B1-VH-9) 중쇄 가변 영역
서열 번호:255: 인간화된 13B1_VH-10 (h13B1-VH-10) 중쇄 가변 영역
서열 번호:256: 인간화된 13B1-VL-1 (h13B1-VL-1) 경쇄 가변 영역
서열 번호:257: 4D5 및 13B1 LC-CDR1-NQ
서열 번호:258: 4D5 및 13B1 LC-CDR1-NA
서열 번호:259: 4D5 및 13B1 LC-CDR1-ST
서열 번호:260: 4D5, 13B1 모체 및 변이체에 대한 공통 LC-CDR1
서열 번호:261: 10D12 LC-CDR1-DE
서열 번호:262: 10D12 LC-CDR1-DA
서열 번호:263: 10D12 LC-CDR1-GA
서열 번호:264-277: 인간화된 4D5, 10D12 및 13B1에 대한 HC FR 및 CDR
서열 번호:278: h4D5_VL-1-NA
서열 번호:279: h10D12_VL-21-GA
서열 번호:280: h13B1_VL-1-NA
서열 번호:281-287 인간화된 4D5, 10D12 및 13B1에 대한 LC FR 및 CDR
서열 번호:288-293: 인간화된 4D5, 10D12, 13B1 중쇄 가변 영역 및 변이체를 암호화하는 DNA
서열 번호:294-299: 인간화된 4D5, 10D12, 13B1 경쇄 가변 영역 및 변이체를 암호화하는 DNA
서열 번호:300: 모체 DTLacO 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드
서열 번호:301: MASP-3 특이적 클론 M3J5 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드
서열 번호:302: MASP-3 특이적 클론 M3M1 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드
서열 번호:303: 모체 DTLacO 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드
서열 번호:304: MASP-3 특이적 클론 M3J5 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드
서열 번호:305: MASP-3 특이적 클론 M3M1 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드
서열 번호:306: MASP-3 클론 D14 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드
서열 번호:307: MASP-3 클론 D14 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드
서열 번호:308: MASP-1 클론 1E10 중쇄 가변 영역 (VH) 폴리펩타이드
서열 번호:309: MASP-1 클론 1E10 경쇄 가변 영역 (VL) 폴리펩타이드
서열 번호:310: 인간 IgG4 불변 영역
서열 번호:311: S228P 돌연변이를 포함한 인간 IgG4 불변 영역
서열 번호:312: S228P 돌연변이_X를 포함한 인간 IgG4 불변 영역
서열 번호:313: 인간 IgK 불변 영역
상세한 설명
I. 정의
본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 분야에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본 발명을 기술하기 위해 명세서 및 청구항에서 사용된 용어에 관하여 명료성을 제공하기 위해 다음 정의가 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 렉틴 경로 효과기 아암 1 ("LEA-1")은 MASP-3에 의한 인자 B 및 인자 D의 렉틴-의존적 활성화를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 렉틴 경로 효과기 아암 2 ("LEA-2")은 MASP-2-의존적 보체 활성화를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-3-의존적 보체 활성화"는 2개의 구성요소를 포함한다: (i) LEA-1-매개된 보체 활성화에 포함되고, Ca++의 존재시 발생하는, 인자 B 및 인자 D의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화로서, 보통 C3bBb로의 C3bB의 전환 및 인자 D로의 프로-인자 D의 전환으로 이어진다; 및 (ii) Ca++의 부재시 발생할 수 있는 인자 B 및 인자 D의 렉틴-독립적 전환으로서, 보통 C3bBb로의 C3bB의 전환 및 인자 D로의 프로-인자 D의 전환으로 이어진다. 인자 B 및 인자 D의 LEA-1-매개된 보체 활성화 및 렉틴-독립적 전환은 옵소닌화 및/또는 용해를 유발하는 것으로 결정되어 있다. 어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 단지 다수의 C3b 분자가 매우 근접하게 회합 및 결합할 때에만 C3bBb C3 전환효소는 그 기질 특이성을 변화시키고 C3bBb(C3b)n이라고 불리는 대체 경로 C5 전환효소로서 C5를 분열시키는 것으로 생각된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 LEA-2-매개된 보체 활성화라고도 불리는 용어 "MASP-2-의존적 보체 활성화"는 Ca++의 존재시 발생하여, 렉틴 경로 C3 전환효소 C4b2a를 형성하고 그 이후에 C3 분열 생성물 C3b의 축적시 옵소닌화 및/또는 용해를 유발하는 것으로 결정된 C5 전환효소 C4b2a(C3b)n을 형성하는 MASP-2 렉틴-의존적 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전통적인 대체 경로"로도 불리는 용어 "대체 경로의 전통적인 해석"은 본원에서 기술된 본 발견 이전의 대체 경로, 즉, 예를 들어, 균류 및 효모 세포벽의 치모산, 그람 음성(Gram negative) 외막, 및 토끼 적혈구, 뿐만 아니라 많은 순수한 다당류, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포의 지질다당류 (LPS)에 의해 촉발되고, 전통적으로 보체 인자 C3로부터 C3b의 자발적 단백질 가수분해 생성으로부터 발생하는 것으로 생각되는 보체 활성화를 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "대체 경로"라고도 불리는 "전통적인 대체 경로"의 활성화는 Mg++/EGTA 버퍼에서 (즉, Ca++의 부재시) 측정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "렉틴 경로"는 만난-결합 렉틴 (MBL), CL-11 및 피콜린 (H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)을 포함하는, 혈청 및 비-혈청 탄수화물-결합 단백질의 특이적 결합을 통해 일어나는 보체 활성화를 말한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 본 발명자는 렉틴 경로가 2개의 효과기 아암, 현재 MASP-3-의존적인 것으로 알려진 렉틴 경로 효과기 아암 1 (LEA-1), 및 MASP-2-의존적인 렉틴 경로 효과기 아암 2 (LEA-2)에 의해 구동된다는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 바와 같이, 렉틴 경로의 활성화는 Ca++ 함유 버퍼를 사용하여 평가된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "고전적 경로"는 외래 입자에 결합된 항체에 의해 촉발되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "HTRA-1"은 세린 펩티다아제 고온 요건 세린 프로테아제 A1을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "MASP-3 억제제"는 MASP-3 항체 및 이것의 MASP-3 결합 단편, 천연 및 합성 펩타이드, 경쟁적 기질, 소분자, 발현 억제자 및 단리된 천연 억제자를 포함하는, MASP-3-의존적 보체 활성화를 직접적으로 억제하는 임의의 작용제를 말하고, 또한 렉틴 경로에서 또 다른 인식 분자 (예를 들어, MBL, CL-11, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)로의 결합에 대하여 MASP-3과 경쟁하는 펩타이드를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-3에 특이적이고, 및 MASP-1 또는 MASP-2에 결합하지 않는다. MASP-3을 직접적으로 억제하는 억제제는 직접적 MASP-3 억제제 (예를 들어, MASP-3 항체)라고 불릴 수 있지만, MASP-3을 간접적으로 억제하는 억제제는 간접적 MASP-3 억제제 (예를 들어, MASP-3 활성화를 억제하는 MASP-1 항체)라고 불릴 수 있다. 직접적 MASP-3 억제제의 예는 MASP-3 특이적 억제제, 예컨대 보체 시스템의 다른 구성요소보다 적어도 10배 더 높은 결합 친화도로 인간 MASP-3 (서열 번호:2)의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-3 억제제이다. 직접적 MASP-3 억제제의 또 다른 예는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3 (서열 번호:2)의 세린 프로테아제 도메인에 특이적으로 결합하고 인간 MASP-1 (서열 번호:8)에 결합하지 않는 고 친화도 MASP-3 항체이다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제, 예를 들어, MASP-1-매개된 MASP-3 활성화의 억제자 (예를 들어, MASP-1 항체 또는 이것의 MASP-1 결합 단편, 천연 및 합성 펩타이드, 소분자, 발현 억제자 및 단리된 천연 억제자, 또한 MASP-3으로의 결합에 대하여 MASP-1과 경쟁하는 펩타이드를 포함)를 포함하는, MASP-3 활성화의 억제자는 MASP-3 활성을 간접적으로 억제한다. 바람직한 구체예에서, MASP-3 억제제, 예컨대 항체 또는 이것의 항원-결합 단편 또는 항원 결합 펩타이드는 인자 D의 MASP-3-매개된 성숙화를 억제한다. 또 다른 구체예에서, MASP-3 억제제는 인자 B의 MASP-3-매개된 활성화를 억제한다. 본 발명의 방법에 유용한 MASP-3 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화를 10% 초과, 예컨대 20% 초과, 50% 초과, 또는 90% 초과만큼 감소시킬 수도 있다. 한 구체예에서, MASP-3 억제제는 MASP-3-의존적 보체 활성화를 90% 초과만큼 감소시킨다 (즉, 단지 10% 또는 그 이하의 MASP-3 보체 활성화를 유도함). MASP-3 억제는 LEA-1-관련된 용해 및 옵소닌화와 인자 B 및 인자 D-관련된 용해 및 옵소닌화의 렉틴-독립적 전환 모두를 완전히 또는 부분적으로 차단할 것으로 예상된다.
한 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 500 pM 미만 (예를 들어, 250 pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 미만, 또는 10 pM 미만)의 친화도로 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728)에 결합하고 포유류 대상체의 혈액에서 보체 활성화의 대체 경로를 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 또는 그 이상)만큼 억제한다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 (본원에서 가변 도메인으로도 불림)에 위치한 적어도 하나의 에피토프 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 면역글로불린 분자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는, 예를 들어, MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 폴리펩타이드 또는 그 일부와 같은 표적 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는, 임의의 항체-생산 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 및 인간을 포함한 영장류), 또는 하이브리도마(hybridoma), 파지(phage) 선택, 재조합 발현 또는 트랜스제닉(transgenic) 동물 (또는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 다른 방법)로부터 유래된, 항체 및 이것의 항체 단편을 포함한다. 용어 "항체"는 항체의 공급원 또는 그것이 제조되는 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물, 펩타이드 합성, 등에 의해)에 관하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예시의 항체는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; 팬(pan)-특이적, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체); 인간화된 항체; 쥐 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체; 및 항-이디오타입(idiotype) 항체를 포함하고, 임의의 온전한 항체 또는 이것의 단편일 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것의 단편, 예컨대 단일 가변 영역 항체 (dAb), 또는 다른 공지된 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 등, 단일 사슬 (ScFv), 이것의 합성 변이체, 자연 발생 변이체, 필요한 특이성의 항원-결합 단편을 가진 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 및 필요한 특이성의 항원-결합 부위 또는 단편 (에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다.
"단클론성 항체"는 균질한 항체 집단을 말하며 단클론성 항체는 에피토프의 선택적 결합에 수반된 아미노산 (자연 발생 및 비-자연 발생)으로 구성된다. 단클론성 항체는 표적 항원에 매우 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이것의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (ScFv), 이것들의 변이체, 항원-결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성 및 에피토프에 결합할 수 있는 능력의 항원-결합 단편 (에피토프 인식 부위)를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성형태를 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 제조되는 방식 (예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물, 등에 의해)에 관하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 용어는 전체 면역글로불린, 뿐만 아니라 "항체"의 정의 하에 상기 기술된 단편 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은, 예를 들어, MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 항체와 같은 전장 항체로부터 유래되거나 이것과 관련된 부분을 말하며, 일반적으로 이것들의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에서 기술된 항체 및 이것의 항원-결합 단편은 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 상보성-결정 영역 ("CDR") 세트를 포함하며, CDR에 대한 지지체를 제공하고 서로에 대한 CDR의 공간적 관계를 한정하는 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 (FR) 세트 사이에 각각 개재된다(interposed). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CDR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변 영역을 말한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 시작하여, 이들 영역은 각각 "CDR1," "CDR2," 및 "CDR3"로 표시된다. 그러므로, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "FR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세트의 CDR을 구성하는 4개의 플랭킹(flanking) 아미노산 서열을 말한다. 일부 FR 잔기가 결합된 항원에 접촉할 수 있지만, FR, 특히 CDR에 직접적으로 인접한 FR 잔기는 주로 V 영역을 항원-결합 부위로 폴딩하는 원인이 된다. FR 내에서, 특정 아미노산 잔기 및 특정 구조적 특징은 매우 잘 보존된다. 이 점에 있어서, 모든 V 영역 서열은 약 90개의 아미노산 잔기의 내부 이황화 루프를 함유한다. 결합 부위로 폴딩된 V 영역 내에서, CDR은 항원-결합 표면을 형성하는 돌출(projecting) 루프 모티프(motif)로서 나타난다. 일반적으로는 정확한 CDR 아미노산 서열에 관계없이 특정 "기본형(canonical)" 구조로의 CDR 루프의 폴딩된 형태에 영향을 미치는 FR의 보존된 구조적 영역이 존재하는 것으로 인식된다.
면역글로불린 가변 영역의 구조 및 위치는 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services, 1987, 및 이것의 업데이트를 참조하여 결정될 수 있으며, 현재 인터넷 (immuno.bme.nwu.edu.) 상에서 이용 가능하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에서 폴리펩타이드 링커(linker)를 더 포함하며, 이것은 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "키메라 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 설치류) 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 상보성-결정 영역을 함유하는 한편, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래되는 재조합 단백질이다. 일부 구체예에서, 키메라 항체는 상이한 항체의 이종성 Fc 부분에 작동 가능하게 결합되거나 또는 그렇지 않으면 이것에 융합된 MASP-3 억제 항체의 항원-결합 단편으로 구성된다. 일부 구체예에서, 이종성 Fc 도메인은 IgA (하위분류 IgA1 및 IgA2 포함), IgD, IgE, IgG (하위분류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 포함) 및 IgM을 포함한, 모체 항체의 상이한 Ig 분류로부터 유래될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간화된 항체"는 비-인간 종의 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가진 키메라 분자이며, 일반적으로 재조합 기술을 사용하여 제조된다. 항원-결합 부위는 불변 도메인에 융합된 완전한 가변 영역 또는 단지 가변 도메인에서 적절한 프레임워크 영역으로 이식된 CDR만을 포함할 수도 있다. 에피토프 결합 부위는 야생형일 수도 있거나 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수도 있다. 또 다른 접근법은 인간-유래된 불변 영역을 제공하는 것뿐만 아니라, 가능한 인간 형태에 가깝게 가변 영역을 재형성하기 위해 가변 영역을 변형시키는 것에 초점을 맞춘다. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 모든 CDR 서열 (예를 들어, 마우스 항체의 6개의 CDR 모두를 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 구체예에서, 인간화된 항체는 원래의 항체에 대하여 변화된 하나 이상의 CDR (1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 가지며, 이것들은 원래의 항체의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR이라고도 불린다.
항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도 및/또는 결합력으로 결합하는 경우 표적에 "특이적으로 결합한다". 한 구체예에서, 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728)에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 표 4, 표 28에서 기술되거나 또는 도 62에서 도시된 에피토프 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "만난-결합 렉틴" ("MBL")은 만난-결합 단백질 ("MBP")과 동등하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "막 공격 복합체" ("MAC")는 막에 삽입되어 막을 붕괴시키는 5개의 말단 보체 구성요소 (C6, C7, C8 및 C9와 조합된 C5b)의 복합체를 말한다 (C5b-9로도 불림).
본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"는 제한 없이, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함하는 모든 포유동물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 알라닌 (Ala;A), 아스파라긴 (Asn;N), 아스파르트산 (Asp;D), 아르기닌 (Arg;R), 시스테인 (Cys;C), 글루탐산 (Glu;E), 글루타민 (Gln;Q), 글리신 (Gly;G), 히스티딘 (His;H), 아이소류신 (Ile;I), 류신 (Leu;L), 리신 (Lys;K), 메티오닌 (Met;M), 페닐알라닌 (Phe;F), 프롤린 (Pro;P), 세린 (Ser;S), 트레오닌 (Thr;T), 트립토판 (Trp;W), 티로신 (Tyr;Y), 및 발린 (Val;V).
넓은 의미에서, 자연 발생 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 특징에 기초하여 군들로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro을 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His를 의미한다. 아미노산의 이 분류는 다음과 같이 더 하위분류될 수 있다. "비대전(uncharged) 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln을 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp를 의미한다. "염기성" 아미노산은 Lys, Arg 또는 His를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "보존적 아미노산 치환"은 각각의 다음 군 내에서의 아미노산 사이의 치환으로 나타난다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머 또는 이것의 모방체를 말한다. 이 용어는 또한 자연 발생 뉴클레오타이드, 당 및 뉴클레오사이드 간 (백본) 공유 결합, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 상기 올리고핵염기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 항체에 의해 결합된 단백질 (예를 들어, 인간 MASP-3 단백질) 상의 부위를 발한다. "중첩 에피토프"는 적어도 하나 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 공통 아미노산 잔기(들)를 포함하는, 선형 및 비-선형 에피토프를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드," "펩타이드," 및 "단백질"은 교체 가능하게 사용되고 길이 또는 번역 후 변형에 관계없이, 아미노산의 임의의 펩타이드-결합된 사슬을 의미한다. 본원에서 기술된 MASP-3 단백질은 야생형 단백질을 함유하거나 야생형 단백질일 수 있거나 또는 50개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 이하)의 보존적 아미노산 치환을 가진 변이체일 수도 있다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 아이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.
일부 구체예에서, 인간 MASP-3 단백질은 서열 번호: 2에서 제시된 아미노산 서열을 가진 인간 MASP-3 단백질과 70 (예를 들어, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100)%, 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 펩타이드 단편은 길이가 적어도 6개 (예를 들어, 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 600개 또는 그 이상)의 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열 번호:2의 적어도 6개의 인접한 아미노산 잔기)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 MASP-3 단백질의 항원성 펩타이드 단편은 길이가 500개 미만 (예를 들어, 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개 미만)의 아미노산 잔기 (예를 들어, 서열 번호:2의 500개 미만의 인접한 아미노산 잔기)이다.
일부 구체예에서, MASP-3에 결합하는 항체의 생산의 맥락에서, 펩타이드 단편은 항원성이고 포유동물에서 항원 반응을 유도할 수 있는 전장 단백질의 능력 중 적어도 10% (예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 또는 그 이상)을 보유한다 (하기 "Methods for Producing an Antibody" 참조).
퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬시키고, 필요한 경우, 갭(gap)을 도입한 후, 참조 서열의 아미노산과 동일한 후보 서열의 아미노산의 퍼센트로 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 결정할 목적의 정렬은 기술 분야 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전장에 대하여 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘(algorithm)을 포함한, 정렬을 측정하기에 적절한 파라미터는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
대표적인 구체예에서, 인간 MASP-3 단백질 (서열 번호:2)은 서열 번호:1로 제시된 cDNA 서열에 의해 암호화된다. 당업자는 서열 번호:1에서 개시된 cDNA 서열이 인간 MASP-3의 단일 대립 유전자를 나타내고, 대립 유전자 변이 및 대안의 스플라이싱이 일어날 것으로 예상된다는 것을 인식할 것이다. 서열 번호:1에서 나타난 뉴클레오타이드 서열의 대립 유전자 변이체는 침묵(silent) 돌연변이를 함유하는 것 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 유도하는 것을 포함하며, 본 발명의 범위 내에 있다. MASP-3 서열의 대립 유전자 변이체는 표준 절차에 따라 상이한 개체의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 탐색(probe)함으로써 클로닝될 수 있거나, 또는 이러한 정보를 함유하는 데이터베이스의 상동성 비교 검색 (예를 들어, BLAST 검색)으로 확인될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 핵산 분자"는 유기체의 게놈 DNA에 통합되지 않은 핵산 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)이다. 예를 들어, 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 성장 인자를 암호화하는 DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다. 단리된 핵산 분자의 또 다른 예는 유기체의 게놈에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 특정 종으로부터 단리된 핵산 분자는 상기 종의 염색체의 완전한 DNA 분자보다 더 작다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵산 분자 구조체"는 인간의 간섭을 통해 조합되고 자연에 존재하지 않는 배열로 병치된 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형된, 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 암호화하는 핵산 분자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에 놓여지고, 이러한 유전자는 프로모터에 "작동 가능하게 결합된다"고 한다. 유사하게는, 조절 요소 및 코어 프로모터는 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동 가능하게 결합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 사용된 용어 "약"은 제공된 특정 값이 어느 정도로 달라질 수 있으며, ±10%, 바람직하게는 ±5%, 가장 바람직하게는 ±2%의 범위 이내의 변화가 주어진 값에 포함된다는 것을 명시하려는 것이다.
범위가 진술되면, 종점은 달리 진술되지 않거나 문맥상 명백하지 않는 한 범위 내에 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이 단수형 "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 달리 분명하게 나타나지 않는 한 복수의 양태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "부형제"에 대한 지시대상은 복수의 이러한 부형제 및 당업자에게 공지된 이것의 등가물을 포함하며, "작용제"에 대한 지시대상은 하나의 작용제, 뿐만 아니라 둘 이상의 작용제를 포함하고; "항체"에 대한 지시대상은 복수의 이러한 항체를 포함하고 "프레임워크 영역"에 대한 지시대상은 하나 이상의 프레임워크 영역 및 당업자에게 공지된 이것의 등가물에 대한 지시대상을 포함한다.
본 명세서의 각각의 구체예는 달리 분명하게 진술되지 않는 한 모든 다른 구체예에 준용하여(mutatis mutandis) 적용되어야 한다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구체예는 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약, 또는 조성물에 대하여 실시될 수 있으며, 그 반대도 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
II. 렉틴 경로: 새로운 해석
i. 개요: 렉틴 경로가 재정의되었다
본원에서 기술된 바와 같이, 발명자들은 렉틴 경로의 보체는 보체를 활성화시키기 위한 2개의 효과기 아암을 가지며, 둘 다 탄수화물 인식 구성요소 (MBL, CL-11 및 피콜린)로 형성된 렉틴 경로 활성화 복합체에 의해 구동된다는 놀라운 발견을 하였다: i) 본원에서 "렉틴 경로 효과기 아암 1" 또는 "LEA-1"이라고 불리는, 렉틴 경로-회합된 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3에 의해 형성된 효과기 아암; 및 (ii) 본원에서 "렉틴 경로 효과기 아암 2", 또는 "LEA-2"라고 불리는, MASP-2 구동된 활성화 효과기 아암. LEA-1 및 LEA-2는 둘 다 용해 및/또는 옵소닌화에 영향을 줄 수 있다.
또한 MASP-3에 의한 인자 B의 렉틴-독립적 전환 및 HTRA-1, MASP-1 및 MASP-3에 의한 인자 D의 렉틴-독립적 전환은 둘 다 Ca++의 부재시 일어날 수 있으며, 일반적으로 C3bBb로의 C3bB의 전환 및 인자 D로의 프로-인자 D의 전환으로 이어지는 것으로 결정되었다. 그러므로, MASP-3의 억제는 LEA-1 및 인자 B 및/또는 인자 D의 렉틴-독립적 활성화 둘 다를 억제할 수 있으며, 이것은 용해 및/또는 옵소닌화의 억제를 유도할 수 있다.
도 1은 보체 활성화 경로의 새로운 해석을 나타낸다. 도 1에서 도시된 바와 같이, LEA-1은 렉틴-결합된 MASP-3에 의해 구동되며, 이것은 인자 D의 치모겐을 활성 형태로 활성화시키고 C3b- 또는 C3b(H20)-결합된 인자 B를 분열시켜, 효소적 활성 형태 C3bBb로의 C3bB 치모겐 복합체의 전환으로 이어질 수 있다. MASP-3에 의해 생성된 활성화된 인자 D는 또한 C3bB 또는 C3b(H20) 치모겐 복합체를 효소적 활성 형태로 전환시킬 수 있다. MASP-1은 신속하게 자가-활성화될 수 있는 반면에, MASP-3은 그렇지 않다. 많은 경우에, MASP-1은 MASP-3의 활성화 물질이다.
많은 예에서 렉틴 (즉, MBL, CL-11 또는 피콜린)은 세포 표면에 대한 활성을 지시할 수 있지만, 도 1은 또한 인자 B 활성화 및/또는 인자 D 성숙화에서 MASP-3, MASP-1, 및 HTRA-1의 렉틴-독립적 기능을 개괄적으로 설명한다. LEA-1에서 MASP-3의 렉틴-회합된 형태와 같이, MASP-3의 렉틴-독립적 형태는 C3bBb로의 C3bB 또는 C3b(H20)의 전환 (또한 도 29 및 30 참조) 및 인자 D로의 프로-인자 D의 전환 (도 32 참조)을 매개할 수 있다. MASP-1 (또한 도 32 참조) 및 비-MASP-관련된 단백질 HTRA-1은 또한 렉틴 구성요소가 요구되지 않는 방식으로 인자 D를 활성화시킬 수 있다 (2011년 5월 4일 미국 시과학 안과 학회(The Association for Research in Vision and Ophthalmology) 2011 컨퍼런스에서 발표된 Stanton et al., Evidence That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration).
따라서, MASP-1 (LEA-1 및 렉틴-독립적 형태를 통해), MASP-3 (LEA-1 및 렉틴-독립적 형태를 통해), 및 HTRA-1 (렉틴-독립적 단독)은 MASP-3 - 인자 D - 인자 B 축을 따라 하나 이상의 지점에서 직접적 또는 간접적 활성화가 가능하다. 그렇게 하여, 그것들은 대체 경로의 C3 전환효소인 C3bBb를 생성하고, 그것들은 미생물 표면 상에서 C3b의 생산 및 침착을 자극한다. C3b 침착은 옵소닌화에서 중요한 역할을 하며, 숙주 포식세포, 예컨대 대식세포에 의한 파괴에 대하여 미생물의 표면을 라벨링한다. 본원에서 예로서 (도 28A 및 28B), MASP-3은 스타필로코쿠스 아우레우스의 옵소닌화에 중요하다. C3b 침착은 인간 혈청에 노출된 스타필로코쿠스 아우레우스에서 MASP-3-의존적 방식으로 신속하게 일어난다 (도 28A 및 28B).
하지만, MASP-3, MASP-1, 또는 HTRA-1의 LEA-1 및 렉틴-독립적 기능의 기여는 옵소닌화에 제한되는 것은 아니다. 도 1에서 도표로 설명된 바와 같이, 이들 3개의 구성요소는 또한 인자 B의 간접적 또는 직접적 활성화, 및 C3b의 생산에 의해 세포 용해를 유발할 수 있다. 이들 구성요소는 대체 경로 C5 전환효소, C3bBb(C3b)n을 생성하는 복합체를 형성한다. 본원에서 더 기술된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스의 용해에서 MASP-2가 아니라 (및, 그러므로, 이 예에서는 LEA-2도 아님), MASP-3 및 MBL에 대한 요건은 (도 11, 12 및 13 참조) 용해시 LEA-1에 대한 역할을 입증한다. 요약하면, 스타필로코쿠스 아우레우스 연구로부터 얻어진 옵소닌화 결과 및 네이세리아 메닝기티디스 연구에서 관찰된 용해 결과는 두 과정 모두에서 LEA-1의 역할을 지지한다 (도 1에서 도표로 설명됨). 또한, 이들 연구는 옵소닌화 및 용해 둘 다가 C3bB 또는 C3b(H20)의 전환 및/또는 인자 D로의 프로-인자 D의 전환으로부터 발생할 수 있다는 것을 입증하며; 그러므로, 두 과정은 모두 MASP-3, MASP-1, 또는 HTRA-1의 렉틴-독립적 역할의 결과일 수 있다. 따라서, 도 1에서 발명자에 의해 개발된 모델은 옵소닌화 및/또는 용해를 차단하고 이들 과정의 조절 장애에 의해 유발된 병리 상태를 치료하기 위해 원칙적으로는 MASP-3, 하지만 또한 MASP-1 및/또는 MATR-1의 억제자의 사용을 지지한다.
1. 렉틴 경로 효과기 아암 (LEA-1)
렉틴 경로의 제1 효과기 아암, LEA-1은 렉틴 경로-회합된 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3에 의해 형성된다. 본원에서 기술된 바와 같이, 발명자들은 이제 MASP-3의 부재시 및 MASP-1의 존재시, 대체 경로가 표면 구조에서 효과적으로 활성화되지 않는다는 것을 보여주었다. 이 결과들은 MASP-3가 대체 경로를 시작하는데 있어서 이전에 밝혀지지 않은 역할을 한다는 것을 입증하고, 이것은 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인이 제대로 기능하지 않게 하는 돌연변이를 가진 희귀성 3MC 상염색체 열성 장애(3MC autosomal recessive disorder)에 걸린 환자로부터 얻어진 MASP-3-결핍 3MC 혈청을 사용하여 확인된다 (Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3):197-203 (2011)). 이들 새로운 결과에 기초하여, 대체 경로를 수반하는 보체 활성화는, 통상적으로 정의되는 바와 같이, MASP-3-의존적인 것으로 예상된다. 실제로, MASP-3, 및 LEA-1의, MASP-3의 활성화는 대체 경로의 지금까지는 규정하기 힘든 개시자를 나타낼 수도 있다.
본원에서 실시예 1-4에서 더 기술된 바와 같이, MASP-2-결핍 혈청에서, 발명자는 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 더 높은 살균 활성 (즉, 용해 활성)을 유도하는 렉틴-의존적 대체 경로 활성화의 더 높은 활성을 관찰하였다. 어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, MASP-2의 부재시, MASP-1-함유 탄수화물 인식 복합체는 MASP-3-함유 탄수화물 인식 복합체에 가깝게 결합하여 MASP-3을 활성화시킬 가능성이 더 큰 것으로 생각된다. 많은 경우에, MASP-3은 자가-활성화 효소가 아니며 종종 MASP-1의 활성이 치모겐 형태에서 효소적 활성 형태로 전환되는 것을 필요로 하기 때문에, MASP-3의 활성화는 MASP-2 활성에 의존적이라는 것이 알려져 있다. MASP-1 (MASP-2와 유사하게)은 자가-활성화 효소인 한편, MASP-3은 자가-활성화되지 않으며, 많은 경우에, MASP-1의 효소적 활성이 효소적 활성 형태로 전환될 필요가 있다. Zundel S, et al., J Immunol., 172(7):4342-50 (2004) 참조. MASP-2의 부재시, 모든 렉틴 경로 인식 복합체는 MASP-1 또는 MASP-3와 함께 로딩된다. 그러므로, MASP-2의 부재는 효소적 활성 형태로의 MASP-3의 MASP-1-매개된 전환을 촉진한다. MASP-3이 활성화될 때, 활성화된 MASP-3은 C3bBb로의 C3bB의 MASP-3-매개된 전환 및/또는 인자 D로의 프로-인자 D의 전환을 통해, 현재 "LEA-1" 활성화라고 불리는 대체 경로 활성화를 시작한다. 대체 경로 C3 전환효소로도 불리는 C3bBb는 추가적인 C3 분자를 분열시켜 옵소닌 C3b 분자의 침착을 유도한다. 여러 C3b 단편이 C3bBb 전환효소 복합체에 가깝게 결합하는 경우, 대체 경로 C5 전환효소 C3bBb(C3b)n의 형성을 유도하며, 이것은 MAC의 형성을 촉진한다. 추가적으로, 표면 상에 침착된 C3b 분자는 인자 B 결합을 위한 새로운 부위를 형성하며, 이것은 인자 D 및/또는 MASP-3에 의해 분열되어 대체 경로 C3 및 C5 전환효소 복합체가 형성될 수 있는 추가적인 부위를 형성할 수 있다. 이 후자의 과정은 효과적인 용해를 위해 필요하고 초기 C3b 침착이 발생하면 렉틴을 필요로 하지 않는다. 최근의 간행물 (Iwaki D. et al., J Immunol 187(7):3751-8 (2011)), 뿐만 아니라 발명자들로부터 생성된 데이터 (도 30)는 대체 경로 C3 전환효소 치모겐 복합체 C3bB가 활성화된 MASP-3에 의해 효소적 활성 형태로 전환된다는 것을 입증한다. 발명자들은 현재 인자 B의 MASP-3-매개된 분열이 새롭게 기술된 LEA-1의 하위 구성요소를 나타내며, 이것은 대체 경로 C3 전환효소 C3bBb의 렉틴-의존적 형성을 촉진한다는 것을 발견하였다.
2. 렉틴 경로 효과기 아암 (LEA-2)
렉틴 경로의 제2 효과기 아암, LEA-2는 렉틴 경로-회합된 세린 프로테아제 MASP-2에 의해 형성된다. MASP-2는 각각의 패턴으로의 인식 구성요소의 결합시 활성화되고, 또한 MASP-1에 의해 활성화될 수도 있으며, 그 이후에 보체 구성요소 C4를 C4a 및 C4b로 분열시킨다. 혈장 C2로의 분열 생성물 C4b의 결합 후, C4b-결합된 C2는 C4b-결합된 C2를 효소적 활성 복합체 C4bC2a 및 작은 C2b 분열 단편으로 전환시키는 제2 MASP-2-매개된 분열 단계의 기질이 된다. C4b2a는 렉틴 경로의 C3-전환 C3 전환효소이며, 풍부한 혈장 구성요소 C3을 C3a 및 C3b로 전환시킨다. C3b는 티오에스터 결합을 통해 임의의 표면에 가깝게 결합한다. 여러 C3b 단편이 C3 전환효소 복합체 C4b2a에 가깝게 결합하는 경우, 이 전환효소는 C5를 C5b 및 C5a로 전환시키기 위해 그것의 특이성을 변화시켜, C5 전환효소 복합체 C4b2a(C3b)n을 형성한다. 이 C5 전환효소가 MAC의 형성을 시작할 수 있지만, 이 과정은 자체적으로 용해를 촉진하기에는 충분히 효과적이지 않은 것으로 생각된다. 대신에, LEA-2에 의해 생산된 초기 C3b 옵소닌은 새로운 대체 경로 C3 전환효소 및 C5 전환효소 부위의 형성을 위해 핵을 형성하며, 이것은 궁극적으로는 풍부한 MAC 형성 및 용해를 유도한다. 이 후자의 이벤트는 LEA-2-형성된 C3b와 회합된 인자 B의 인자 D 활성화에 의해 매개되며, 따라서 인자 D의 성숙화에서 MASP-1에 대한 필수적인 역할 때문에 LEA-1에 의존적이다. 또한 C4의 부재시 C3을 활성화시키기 위한 MASP-2-의존적 C4-바이패스 활성화 루트가 존재하며, 이것은 허혈-재관류 손상의 병리생리학에서 중요한 역할을 하는데, C4-결핍 마우스는 허혈-재관류 손상으로부터 보호되지 않는 한편, MASP-2-결핍 마우스는 허혈-재관류 손상으로부터 보호되기 때문이다 (Schwaeble et al., PNAS, 2011 supra). LEA-2는 또한 응고 경로와 관련이 있으며, 트롬빈으로의 프로트롬빈의 분열 (공통 경로) 및 또한 효소적 활성 형태 XIIa로 전환시키기 위한 인자 XII (하게만 인자(Hageman factor))의 분열을 수반한다. 인자 XIIa는 결과적으로 인자 XI를 XIa로 분열시킨다 (내인성 경로). 응고 캐스케이드(cascade)의 내인성 경로 활성화는 피브린 형성을 유도하며, 이것은 혈전 형성에 결정적으로 중요하다.
도 1은 본원에서 제공된 결과에 기초하여 렉틴 경로 및 대체 경로의 새로운 해석을 나타낸다. 도 1은 옵소닌화 및 용해 둘 다에서의 LEA-2의 역할을 설명한다. MASP-2는 생리학적으로 다수의 렉틴-의존적 설정에서 "다운스트림" C3b 침착 (및 결과로 일어난 옵소닌화)의 개시자인 한편 (도 18A, 18B, 18C), 혈청-감작된 박테리아의 용해에서 또한 역할을 한다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스와 같은 혈청-감작된 병원체에 대한 MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 혈청/혈장의 증가된 살균 활성의 원인이 되는 제안된 분자적 메커니즘은, 박테리아의 용해에 대하여, MASP-1 및 MASP-3과 관련된 렉틴 경로 인식 복합체가 박테리아 표면에서 서로 근접하여 결합해야하고, 이로써 MASP-1이 MASP-3을 분열시킬 수 있게 한다는 것이다. MASP-1 및 MASP-2와는 달리, MASP-3은 자가-활성화 효소가 아니지만, 많은 경우에, MASP-1에 의한 활성화/분열이 효소적 활성 형태로 전환되는 것을 필요로 한다.
도 1에서 추가로 도시된 바와 같이, 활성화된 MASP-3은 병원체 표면 상에서 C3b-결합된 인자 B를 분열시켜 각각 효소적 활성 대체 경로 C3 및 C5 전환효소 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n의 형성에 의한 대안의 활성화 캐스케이드를 시작할 수 있다. MASP-2-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 MASP-3의 활성화에 관여하지 않고, MASP-2의 부재시 또는 MASP-2의 고갈 이후에, 모든 렉틴 경로 활성화 복합체는 MASP-1 또는 MASP-3과 함께 로딩될 것이다. 그러므로, MASP-2의 부재시, 미생물 표면 상에서 MASP-1- 및 MASP-3-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 서로 근접하게 배치되어, 더 많은 MASP-3이 활성화되며, 이로 인해 C3b-결합된 인자 B의 더 높은 속도의 MASP-3-매개된 분열을 유도하여 미생물 표면 상에서 대체 경로 C3 및 C5 전환효소 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n을 형성할 가능성이 현저히 증가한다. 이것은 표면-결합된, C6과 관련된 C5b, C7과 관련된 C5bC6, C8과 관련된 C5bC6C7, 및 C5bC6C7C8로 구성된 막 공격 복합체를 형성하여, 박테리아 표면 구조로 삽입되어 박테리아 벽에서 공극을 형성하는 C9의 폴리머화를 유도하여, 보체-표적화된 박테리아의 삼투성 살해를 유도하는 말단 활성화 캐스케이드 C5b-C9의 활성화로 이어진다.
이 새로운 개념의 핵심은 본원에서 제공된 데이터에서 렉틴 경로 활성화 복합체가 다음 2개의 별개의 활성화 루트를 구동시킨다는 것을 분명하게 나타낸다는 것이며, 도 1에서 나타난 바와 같다:
i) LEA-1: 활성화 물질 표면 상의 인자 b의 초기 분열 및 활성화를 통해 대체 경로 전환효소 C3bBb를 생성함으로써 보체의 활성화를 시작하고 구동시키는 MASP-3-의존적 활성화 루트는 C3b 침착 및 대체 경로 전환효소 C3bBb의 형성에 촉매 작용한다. MASP-3-구동된 활성화 루트는 미생물의 옵소닌화 및 용해에 있어서 필수적인 역할을 하고 박테리아의 표면 상에서 대체 경로를 구동시켜, 막 공격 복합체를 생성하기 위한 활성화의 최적의 속도를 유도하고;
ii) LEA-2: 렉틴 경로 C3 전환효소 C4b2a 및, C3 분열 생성물 C3b의 축적시, 그 이후에 C5 전환효소 C4b2a(C3b)n의 형성을 유도하는 MASP-2-의존적 활성화 루트. 보체 C4의 부재시, MASP-2는 C2 및 응고 인자 XI를 수반하는 대안의 C3 전환효소 복합체를 형성할 수 있다.
용해에서의 역할 외에도, MASP-2-구동된 활성화 루트는 박테리아 옵소닌화에서 중요한 역할을 하는데, 미생물은 공유 결합된 C3b 및 이것의 분열 생성물 (즉, iC3b 및 C3dg)로 코팅되며, 이것들은 C3 수용체-함유 포식세포, 예컨대 과립구, 대식세포, 단핵구, 소교 세포 및 세망내피계에 의한 섭취 및 살해에 대한 표적이 될 것이다. 이것은 보체 용해에 저항성인 박테리아 및 미생물의 클리어런스의 가장 효과적인 루트이다. 이것들은 대부분의 그람-양성 박테리아를 포함한다.
LEA-1 및 LEA-2 외에도, MASP-3, MASP-1 및/또는 HTRA-1에 의한 인자 D의 렉틴-독립적 활성화에 대한 가능성이 존재하고, 또한 MASP-3에 의한 인자 B의 렉틴-독립적 활성화에 대한 가능성이 존재한다.
어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, (i) LEA-1, (ii) LEA-2 및 (iii) 인자 B 및/또는 인자 D의 렉틴-독립적 활성화는 각각 옵소닌화 및/또는 결과적인 용해를 동반한 MAC의 형성을 유도하는 것으로 생각된다.
ii. MASP-1, MASP-2 및 MASP-3의 배경기술
3개의 만난-결합 렉틴-회합된 세린 프로테아제 (MASP-1, MASP-2 및 MASP-3)는 현재 인간 혈청에서 만난-결합 렉틴 (MBL)과 관련이 있는 것으로 공지되어 있다. 만난-결합 렉틴은 최근 문헌에서는 '만노오스-결합 단백질' 또는 '만노오스-결합 렉틴'이라고도 불린다. MBL-MASP 복합체는 다양한 미생물에 존재하는 탄수화물 구조로의 MBL의 결합으로 인해 선천적 면역력에 있어서 중요한 역할을 한다. MBL과 탄수화물 구조의 특이적 어레이(array)의 상호작용은 결과적으로 보체 구성요소 C4 및 C2를 분열시켜 C3 전환효소 C4b2b를 형성함으로써 보체를 활성화시키는 MASP 전구효소의 활성화를 초래한다 (Kawasaki et al., J. Biochem 106:483-489 (1989); Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176:1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol 150:571-578 (1993)).
MBL-MASP 전구효소 복합체는, 최근까지는, 한 가지 유형의 프로테아제 (MASP-1)만을 함유하는 것으로 간주되었지만, 현재 MBL과 관련된 2개의 다른 별개의 프로테아제 (즉, MASP-2 및 MASP-3) (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)), 뿐만 아니라 "MAp19" 또는 "sMAP"라고 불리는 19 kDa의 추가적인 혈청 단백질 (Stover et al., J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover et al., J. Immunol 163:6848-6859 (1999); Takahashi et al., Int. Immunol 11:859-63 (1999))이 존재한다는 것이 분명해졌다. MAp19는 MASP-2에 대한 구조 유전자의 대안으로 스플라이싱된 유전자 생성물이고 세린 엔도펩티다아제 도메인을 포함하는, MASP-2의 4개의 C-말단 도메인이 없다. MAp19를 암호화하는 풍부하게 발현되는 절단된 mRNA 전사물은 MASP-2 유전자의 대안의 스플라이싱(splicing)/폴리아데닐화 이벤트에 의해 생성된다. 유사한 메커니즘에 의해, MASP-1/3 유전자는 3개의 주요 유전자 생성물, 2개의 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3 및 "MAp44"라고 불리는 44 kDa의 절단된 유전자 생성물을 발생시킨다 (Degn et al., J. Immunol 183(11):7371-8 (2009); Skjoedt et al., J Biol Chem 285:8234-43 (2010)).
MASP-1은 처음에 혈청 Ra-반응성 인자의 P-100 프로테아제 구성요소로 기술되었으며, 이것은 현재 MBL 플러스 MASP로 구성된 복합체인 것으로 인식된다 (Matsushita et al., Collectins and Innate Immunity, (1996); Ji et al., J Immunol 150:571-578 (1993). 보체의 고전적 경로의 C1q-(Clr)2-(Cls)2 복합체 내 C1s 효소와 명백하게 동일한 방식으로 보체 구성요소 C4 및 C2에서 작용할 수 있는 MBL-MASP 복합체 내 MBL-회합된 엔도펩티다아제의 능력은 C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체와 기능적으로 유사한 MBL-MASP 복합체가 존재한다는 것을 시사한다. C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체는 C1q와 면역 복합체에 존재하는 항체 IgG 또는 IgM의 Fc 영역의 상호작용에 의해 활성화된다. 이것은 결과적으로 보체 구성요소 C4 및 C2에서 작용하는 C1s 전구효소를 활성화시키는 C1r 전구효소의 자가활성화를 초래한다.
MBL-MASP 복합체의 화학량론은 상이한 MBL 올리고머가 상이한 비율의 MASP-1/MAp19 또는 MASP-2/MASP-3과 회합하는 것으로 보인다는 점에서 C1q-(C1r)2-(C1s)2 복합체에 대하여 발견된 것과 상이하다 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001). 혈청에서 발견된 대다수의 MASP 및 MAp19는 MBL과 복합체를 형성하지 않고 (Thiel et al., J Immunol 165:878-887 (2000)) 미생물 표면 상에서 N-아세틸글루코사민 잔기에 결합할 수 있는 피브리노겐-유사 도메인을 가진 렉틴의 최근 기술된 기인 피콜린과 부분적으로 회합할 수도 있다 (Le et al., FEBS Lett 425:367 (1998); Sugimoto et al., J. Biol Chem 273:20721 (1998)). 이것들 중에서, 인간 L-피콜린, H-피콜린 및 M-피콜린은 MASP, 뿐만 아니라 MAp19와 회합하고 피콜린에 의해 인식되는 특이적 탄수화물 구조에 결합할 때 렉틴 경로를 활성화시킬 수도 있다 (Matsushita et al., J Immunol 164:2281-2284 (2000); Matsushita et al., J Immunol 168:3502-3506 (2002)). 피콜린 및 MBL 외에도, CL-11이라고 불리는 MBL-유사 렉틴 콜렉틴이 렉틴 경로 인식 분자로 확인되었다 (Hansen et al. J Immunol 185:6096-6104 (2010); Schwaeble et al. PNAS 108:7523-7528 (2011)). 이들 대체 탄수화물 인식 분자의 생리학적 중요성을 강조하는 강력한 증거들이 존재하며 그러므로 MBL이 렉틴 활성화 경로의 유일한 인식 구성요소가 아니며 MBL 결핍이 렉틴-경로 결핍으로 오인되어서는 안 된다는 것은 중요하다. 아마도 MBL과 구조적으로 관련이 있는 대체 탄수화물-인식 복합체의 배열의 존재는 보체의 활성화를 통해 선천적 면역계의 직접적인 반응을 시작하게 되는 미생물 구조의 스펙트럼을 넓힐 수도 있다.
모든 렉틴 경로 인식 분자는 콜라겐-상동성 스토크 영역(stalk region) 내부의 특이적 MASP-결합 모티프를 특징으로 한다 (Wallis et al. J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004)). MBL, CL-11 및 피콜린의 MASP-결합 부위는 이 도메인 내부의 별개의 모티프를 특징으로 한다: Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Pro, 여기서 Hyp는 하이드록시프롤린이고 Xaa는 일반적으로 지방족 잔기이다. 이 서열 내에서 점 돌연변이(point mutation)은 MASP 결합을 붕괴시킨다.
1. MASP-1 및 MASP-3의 각각의 구조, 서열, 염색체 국소화 및 스플라이싱 변이체
도 2는 인간 MASP-1 폴리펩타이드 (서열 번호:8), 인간 MASP-3 폴리펩타이드 (서열 번호:2) 및 인간 MAp44 폴리펩타이드 및 이것드을 암호화하는 엑손의 도메인 구조를 나타내는 개략도이다. 도 2에서 도시된 바와 같이, 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3은 C1r 및 C1s에서 발견된 바와 같이 배열된 6개의 별개의 도메인, 즉, (I) N-말단 C1r/C1s/sea urchin VEGF/골 형태 형성 단백질 (또는 CUBI) 도메인; (II) 상피 성장 인자 (EGF)-유사 도메인; (III) 제2 CUB 도메인 (CUBII); (IV 및 V) 2개의 보체 조절 단백질 (CCP1 및 CCP2) 도메인; 및 (VI) 세린 프로테아제 (SP) 도메인으로 이루어져 있다.
인간 및 마우스 MASP-1 (Sato et al., Int Immunol 6:665-669 (1994); Takada et al., Biochem Biophys Res Commun 196:1003-1009 (1993); Takayama et al., J. Immunol 152:2308-2316 (1994)), 인간, 마우스, 및 래트 MASP-2 (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Endo et al., J Immunol 161:4924-30 (1998); Stover et al., J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover et al., J. Immunol 163:6848-6859 (1999)), 뿐만 아니라 인간 MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001))의 cDNA-유래된 아미노산 서열은 이들 프로테아제가 추정 촉매 도메인 내에 His, Asp 및 Ser 잔기의 특유의 트라이어드(트라이어드)를 갖는 세린 펩티다아제임을 나타낸다 (Genbank 수탁 번호: 인간 MASP-1: BAA04477.1 (서열 번호:8); 마우스 MASP-1: BAA03944; 래트 MASP-1: AJ457084; 인간 MASP-3:AAK84071 (서열 번호:2); 마우스 MASP-3: AB049755, 2/15/2012에 Genbank에 수탁됨 (서열 번호:3); 래트 MASP-3 (서열 번호:4); 닭 MASP-3 (서열 번호:5); 토끼 MASP-3 (서열 번호:6); 및 게먹이 원숭이 (서열 번호:7).
도 2에서 추가로 도시된 바와 같이, 치모겐을 활성 형태로 전환할 때, 중쇄 (알파, 또는 A 사슬) 및 경쇄 (베타, 또는 B 사슬)가 분할되어 이황화-결합된 A-사슬 및 세린 프로테아제 도메인을 나타내는 더 작은 B-사슬을 생성한다. 단일-사슬 전구효소 MASP-1은 제2 CCP 도메인 (도메인 V) 및 세린 프로테아제 도메인 (도메인 VI) 사이에 위치한 Arg-Ile 결합의 분열에 의해 활성화된다 (전구효소 C1r 및 C1s와 유사함). 전구효소 MASP-2 및 MASP-3은 MASP-1과 유사한 방식으로 활성화되는 것으로 간주된다. 각각의 MASP 단백질은 호모다이머를 형성하고 Ca++-의존적 방식으로 MBL 및 피콜린과 개별적으로 회합된다.
인간 MASP-1 폴리펩타이드 (서열 번호:8) 및 MASP-3 폴리펩타이드 (서열 번호:2)는 하나의 구조 유전자로부터 발생한다 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001), 염색체 3의 긴 아암의 3q27-28 영역으로 맵핑됨 (Takada et al., Genomics 25:757-759 (1995)). MASP-3 및 MASP-1 mRNA 전사물은 대안의 스플라이싱/폴리아데닐화 과정에 의해 주요 전사물로부터 생성된다. MASP-3 번역 생성물은 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 공통된 알파 사슬, 및 MASP-3에 고유한 베타 사슬 (세린 프로테아제 도메인)으로 구성된다. 도 2에서 도시된 바와 같이, 인간 MASP-1 유전자는 18개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-1 cDNA는 엑손 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 의해 암호화된다. 도 2에서 추가로 도시된 바와 같이, 인간 MASP 3 유전자는 12개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-3 cDNA (서열 번호:1로 제시됨)는 엑손 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 및 12에 의해 암호화된다. 대안의 스플라이싱은 엑손 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로부터 발생한 MBL-회합된 단백질 44 ("MAp44")라고 불리는 단백질을 생성한다.
인간 MASP-1 폴리펩타이드 (Genbank BAA04477.1의 서열 번호: 8)는 699개의 아미노산 잔기를 가지며, 이것은 19개의 잔기의 선도 펩타이드를 포함한다. 선도 펩타이드가 생략될 때, MASP-1의 계산된 분자 질량은 76,976 Da이다. 도 2에서 도시된 바와 같이, MASP-1 아미노산 서열은 4개의 N-결합된 글리코실화 부위를 함유한다. 인간 MASP-1 단백질의 도메인 (서열 번호:8 참조)은 도 2에서 도시되고 N-말단 C1r/C1s/sea urchin VEFG/골 형태 형성 단백질 (CUBI) 도메인 (서열 번호:8의 aa 25-137), 상피 성장 인자-유사 도메인 (서열 번호:8의 aa 139-181), 제2 CUB 도메인 (CUBII) (서열 번호:8의 aa 185-296), 뿐만 아니라 직렬의 보체 조절 단백질 (서열 번호:8의 CCP1 aa 301-363 및 CCP2 aa 367-432) 도메인 및 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:8의 aa 449-694)을 포함한다.
인간 MASP-3 폴리펩타이드 (서열 번호:2, Genbank AAK84071)는 728개의 아미노산 잔기를 가지며 (도 3에서 도시된 바와 같이), 이것은 19개의 잔기의 선도 펩타이드 (도 3에서 밑줄 그어진 아미노산 잔기로 나타남)를 포함한다.
선도 펩타이드가 생략될 때, MASP-3의 계산된 분자 질량은 81,873 Da이다. 도 2에서 도시된 바와 같이, MASP-3 내에 7개의 N-결합된 글리코실화 부위가 존재한다. 인간 MASP-3 단백질의 도메인 (서열 번호:2 참조)은 도 2에서 도시되고 N-말단 C1r/C1s/sea urchin VEGF/골 형태 형성 단백질 (CUBI) 도메인 (서열 번호:2의 aa 25-137), 상피 성장 인자-유사 도메인 (서열 번호:2의 aa 139-181), 제2 CUB 도메인 (CUBII) (서열 번호:2의 aa 185-296), 뿐만 아니라 직렬의 보체 조절 단백질 (서열 번호:2의 CCP1 aa 299-363 및 CCP2 aa 367-432) 도메인 및 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 aa 450-728)을 포함한다.
MASP-3 번역 생성물은 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 공통된, CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 도메인 (알파 사슬: 서열 번호:2의 aa 1-448)을 함유하는 알파 사슬 (중쇄), 및 MASP-3에 고유한, 세린 프로테아제 도메인을 함유하는 경쇄 (베타 사슬: 서열 번호:2의 aa 449-728)로 구성된다.
2. 다양한 종의 MASP-3 아미노산 서열의 비교
도 4는 MASP-3의 다종 정렬을 제공하여 인간 (서열 번호:2), 게먹이 원숭이 (서열 번호:7), 래트 (서열 번호:4), 쥐 (서열 번호:3), 닭 (서열 번호:5) 및 토끼 (서열 번호:6)의 전장 MASP-3 단백질의 비교를 도시한다. 도 5는 인간 (서열 번호:2의 aa 450-728); 토끼 (서열 번호:6의 aa 450-728); 쥐 (서열 번호:3의 aa aa455-733); 래트 (서열 번호:4의 aa 455-733) 및 닭 (서열 번호:5의 aa aa448-730)의 세린 프로테아제 (SP) 도메인의 다종 정렬을 제공한다.
도 4에서 도시된 바와 같이, 특히 SP 도메인에서, 상이한 종들 사이에서 MASP-3 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 높은 수준으로 보존된다 (도 5). 도 5에서 추가로 도시된 바와 같이, 촉매 트라이어드 (전장 인간 MASP-3 (서열 번호:2)을 참조하여 잔기 497의 H; 잔기 553의 D 및 잔기 664의 S)는 종 전체에 걸쳐 보존된다. 표 1은 종 전체에 걸친 MASP-3 SP 도메인의 퍼센트 동일성을 요약한다.
종 전체에 걸친 MASP-3 SP 도메인의 퍼센트 동일성
Cyno 토끼 래트 마우스 닭
인간 95% 94% 92% 91% 79%
Cyno 94% 90% 90% 79%
토끼 92% 92% 81%
래트 97% 78%
마우스 78%
MASP-3은 C4, C2 또는 C3 기질에 대한 단백질 가수분해 활성이 없다. 반대로, MASP-3은 처음에는 렉틴 경로의 억제자로 작용하는 것으로 보고되었다 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)). MASP-1 및 MASP-2와는 대조적으로, MASP-3이 자가활성화 효소가 아니기 때문에 이 결론이 내려질 수도 있다 (Zundel S. et al., J Immunol 172:4342-4350 (2004); Megyeri et al., J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013).최근에, MASP-1 및 MASP-3의 가능한 생리학적 기능에 대한 증거는 조합된 MASP-1 및 MASP-3이 결핍된 마우스 계통을 사용한 트랜스제닉 마우스 연구로부터 나타났다. MASP-1/3-넉아웃 마우스가 기능적 렉틴 경로를 갖는 한편 (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)), 그것들은 대체 경로 활성이 없는 것으로 나타난다 (Takahashi et al., JEM 207(1):29-37 (2010)). 대체 경로 활성의 결여는 대체 경로 활성에 필수적인 보체 인자 D의 처리 결함 때문인 것으로 보인다. MASP-1/3 넉아웃 마우스에서, 모든 인자 D는 단백질 가수분해에 의한 비활성 프로-형태(pro-form)로 순환하는 반면, 정상 마우스의 혈청에서, 실질적으로 모든 인자 D는 활성 형태로 존재한다. 생화학적 분석은 MASP-1이 보체 인자 D를 치모겐 형태에서 효소적 활성 형태로 전환시킬 수 있다는 것을 시사한다 (도 32; Takahashi et al., JEM 207(1):29-37 (2010)). MASP-3은 또한 시험관 내에서 프로-인자 D 치모겐을 분할하고 활성 인자 D를 생산한다 (도 32; Takahashi et al., JEM 207(1):29-37 (2010)). 인자 D는 정상적인 개체의 순환에서 활성 효소로서 존재하고, MASP-1 및 MASP-3, 뿐만 아니라 HTRA-1은 이 활성화의 원인이 될 수도 있다. 또한, 조합된 MBL 및 피콜린이 결핍된 마우스는 여전히 정상 수준의 인자 D를 생산하고 충분히 기능적인 대체 경로를 갖고 있다. 그러므로, MASP-1 및 MASP-3의 이들 생리학적 기능이 반드시 렉틴을 수반하는 것은 아니며, 따라서 렉틴 경로와 무관하다. 재조합 마우스 및 인간 MASP-3은 또한 시험관 내에서 인자 B를 분할하고 스타필로코쿠스 아우레우스 상에서의 C3 침착을 지지하는 것으로 나타난다 (도 29; Iwaki D. et al., J Immunol 187(7):3751-8 (2011)).
MASP-3에 대하여 예상치 못한 생리학적 역할이 3MC 증후군 (이전에는 Carnevale, Mingarelli, Malpuech, 및 Michels 증후군으로 지정됨; OMIM # 257920)에 걸린 환자의 최근의 연구로부터 나타났다. 이 환자들은 구개열(cleft palate), 구순열(cleft lip), 두개골 기형 및 정신 지체를 포함한, 극심한 발달 이상을 나타낸다. 유전적 분석으로 기능 장애 MASP-3 유전자에 동형 접합성인 3MC 환자를 확인하였다 (Rooryck et al., Nat Genet. 43(3):197-203 (2011)). 3MC 환자의 또 다른 군은 기능적 MASP-1 및 MASP-3 단백질의 부재로 이어지는 MASP-1 유전자의 돌연변이에 대하여 동형 접합성인 것으로 발견되었다. 하지만 3MC 환자의 또 다른 군에서는 기능적 CL-11 유전자가 없었다 (Rooryck et al., Nat Genet. 43(3):197-203 (2011)). 따라서, CL-11 MASP-3 축은 배 발생 동안에 역할을 하는 것으로 나타난다. 이 발생 경로의 분자적 메커니즘은 불명확하다. 하지만, 공통의 보체 구성요소 C3가 결핍된 개체는 이 증후군에 걸리지 않기 때문에 통상적인 보체-구동된 과정에 의해 매개될 가능성이 낮다. 따라서, 본 발명자들의 발견 이전에는, 본원에서 기술된 바와 같이, 렉틴-의존적 보체 활성화에서 MASP-3에 대한 기능적 역할이 이전에는 확립되지 않았다.
MASP-1 및 MASP-2의 촉매 단편의 구조는 X-선 결정학에 의해 결정되었다. MASP-1 프로테아제 도메인과 다른 보체 프로테아제의 구조적 비교는 이완된 기질 특이성의 근거를 나타냈다 (Dobo et al., J. Immunol 183:1207-1214 (2009)). MASP-2의 기질 결합 그루브(groove)의 접근성은 표면 루프에 의해 제한되는 한편 (Harmat et al., J Mol Biol 342:1533-1546 (2004)), MASP-1은 다른 보체 프로테아제 대신에 트립신과 유사한 개방 기질 결합 포켓(pocket)을 갖는다. MASP-1 구조의 트롬빈-유사 성질은 기질과 상호작용할 수 있는 매우 큰 60개의 아미노산 루프 (루프 B)이다. MASP-1 구조의 또 다른 흥미로운 특징은 S1 Asp189 및 Arg224 사이의 내부 염 다리(salt bridge)이다. 유사한 염다리는 인자 D의 기질 결합 포켓에서 발견될 수 있으며, 이것은 프로테아제 활성을 조절할 수 있다. C1s 및 MASP-2는
거의 동일한 기질 특이성을 갖는다. 놀랍게도, 기질 특이성을 결정하는 MASP-2의 8개의 표면 루프 중 일부는 C1s와 비교하여 매우 상이한 입체구조를 갖는다. 이것은 2개의 기능적으로 관련이 있는 효소가 같은 기질과 상이한 방식으로 상호작용한다는 것을 의미한다. 치모겐 MASP-2의 구조는 붕괴된 산소산 음이온(oxyanion) 구멍 및 기질 결합 포켓을 가진 비활성 프로테아제 도메인을 나타낸다 (Gal et al., J Biol Chem 280:33435-33444 (2005)). 놀랍게도, 치모겐 MASP-2는 큰 단백질 기질, C4 상에서 상당한 활성을 나타낸다. 치모겐 MASP-2의 구조는 매우 유연하여, 비활성 및 활성 형태 사이의 전이를 가능하게 할 가능성이 크다. 구조에 반영된 이 유연성은 자가활성화 과정에서 역할을 할 수도 있다.
노던 블롯(Northern blot) 분석은 간이 MASP-1 및 MASP-2 mRNA의 주요 공급원임을 나타낸다. MASP-1에 대한 5' 특이적 cDNA 프로브를 사용하여, 큰 MASP-1 전사물은 4.8 kb에서 및 작은 전사물은 대략 3.4 kb에서 볼 수 있으며, 인간 및 마우스 간 모두에 존재한다 (Stover et al., Genes Immunity 4:374-84 (2003)). MASP-2 mRNA (2.6 kb) 및 MAp19 mRNA (1.0 kb)는 간 조직에서 풍부하게 발현된다. MASP-3은 간에서, 및 신경 조직을 포함한 많은 다른 조직에서도 발현된다 (Lynch N. J. et al., J Immunol 174:4998-5006 (2005)).
감염 및 만성 염증 질환의 병력이 있는 환자는 활성 MBL-MASP 복합체를 형성할 수 없는 돌연변이된 형태의 MASP-2를 갖는 것으로 발견되었다 (Stengaard-Pedersen et al., N Engl J Med 349:554-560 (2003)). 몇몇 연구원들은 MBL의 결핍이 유년기에 빈번하게 감염되는 성향 (Super et al., Lancet 2:1236-1239 (1989); Garred et al., Lancet 346:941-943 (1995)) 및 HIV 감염에 대한 저항성의 감소 (Nielsen et al., Clin Exp Immunol 100:219-222 (1995); Garred et al., Mol Immunol 33 (suppl 1):8 (1996))를 이어지는 것으로 결정하였다. 하지만, 다른 연구에서는 낮은 MBL 수준과 증가된 감염의 유의한 상관관계를 입증하지 못했다 (Egli et al., PLoS One. 8(1):e51983 (2013); Ruskamp et al., J Infect Dis. 198(11):1707-13 (2008); Israels et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 95(6):F452-61 (2010)). 문헌이 섞여있지만, MASP의 결핍, 또는 미활용은 특정 병원체에 대한 즉각적이고, 비-항체-의존적 방어를 높이는 개체의 능력에 대한 부작용이 있을 수도 있다.
Ca ++ 이 없는 전통적인 검정 조건 및 Ca ++ 를 포함하는 더 생리학적인 설정의 조건을 사용하여 얻어진 결과를 강조하는, 새로운 해석을 뒷받침하는 데이터
보체의 렉틴 경로 활성화 루트가 2개의 독립적인 효과기 메커니즘을 통해 보체를 활성화시킨다는 결론을 가리키는 여러 독립적인 강력한 실험적 증거가 본원에서 제공된다: i) LEA-2: 보체-구동된 옵소닌화, 주화성 (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)), 및 세포 용해를 매개하는 MASP-2-구동된 경로, 및 ii) LEA-1: C3b 침착 및 대체 경로 전환효소 C3bBb의 형성을 촉진하는, 활성화 물질 표면 상에서의 인자 B의 분열 및 활성화를 통해 대체 경로 전환효소 C3bBb를 생성하여 보체 활성화를 시작하는 새로운 MASP-3-의존적 활성화 루트로서, 세포 용해, 뿐만 아니라 미생물 옵소닌화를 유도할 수 있다. 이에 더하여, 본원에서 기술된 바와 같이, MASP-1, MASP-3, 또는 HTRA-1, 또는 임의의 3개의 조합에 의한 인자 B 및/또는 인자 D의 별도의 렉틴-독립적 활성화는 또한 대체 경로를 통해 보체 활성화로 이어질 수도 있다.
대체 경로의 렉틴 경로-의존적 MASP-3-구동된 활성화는 세포 표면 상에서 C5b-9 막 공격 복합체 (MAC)의 형성을 통해 박테리아 세포를 용해시키기 위해 말단 활성화 캐스케이드를 통한 보체-의존적 용해에 최적의 활성화 속도를 달성하도록 C3b-결합된 인자 B의 잘 확립된 인자 D-매개된 분열에 기여하는 것으로 나타난다 (도 12-13). 이 속도-제한된 이벤트는 MASP-3 기능적 활성의 부재시, 뿐만 아니라 인자 D 기능적 활성의 부재시에도 결함이 있기 때문에 최적의 조합을 필요로 하는 것으로 나타난다. 본원에서 실시예 1-4에서 기술된 바와 같이, 발명자들은 네이세리아 메닝기티디스 감염의 실험적 마우스 모델에서 MASP-2 결핍 및 MASP-2 억제의 표현형을 연구할 때 이러한 MASP-3-의존적 렉틴 경로 기능을 발견하였다. 항체-기반 MASP-2 억제자로 처리된 유전자-표적화된 MASP-2-결핍 마우스 및 야생형 마우스는 실험적 네이세리아 메닝기티디스 감염에 고도로 저항성이다 (도 6-10 참조). 감염 용량이 야생형 한배 새끼(littermate)에서 대략 60% 사망률을 제공하도록 조정될 때, MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 마우스는 모두 감염이 제거되고 생존하였다 (도 6 및 도 10 참조). 이러한 극도로 높은 정도의 저항성은 MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 마우스 혈청에서 상당한 혈청 살균 활성 증가에 반영되었다. 추가의 실험은 이 살균 활성이 대체 경로-구동된 박테리아 용해에 의존적이라는 것을 나타냈다. 인자 B, 또는 인자 D, 또는 C3의 마우스 혈청 결핍은 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 살균 활성을 나타내지 못 했으며, 대체 경로가 말단 활성화 캐스케이드를 구동하는데 필수적이라는 것을 나타낸다. 놀라운 결과는 MBL-A 및 MBL-C (둘 다 네이세리아 메닝기티디스를 인식하는 렉틴-경로 인식 분자임)의 마우스 혈청 결핍, 뿐만 아니라 렉틴 경로-회합된 세린 프로테아제 MASP-1 및 MASP-3의 마우스 혈청 결핍이 네이세리아 메닝기티디스에 대한 모든 용균 활성을 상실하였다는 것이다 (도 13). 최근 논문 (Takahashi M. et al., JEM 207: 29-37 (2010)) 및 본원에서 제시된 연구 (도 32)는 MASP-1이 인자 D의 치모겐 형태를 효소적 활성 형태로 전환시킬 수 있고 이들 혈청에서 효소적 활성 인자 D의 부재를 통한 용해 활성의 상실을 일부 설명할 수 있다는 것을 입증한다. 이것은 이들 마우스가 정상적인 효소적 활성 인자 D를 가지고 있기 때문에 MBL-결핍 마우스에서 살균 활성의 결여를 설명할 수 없다 (Banda et al., Mol Imunol 49(1-2):281-9 (2011)). 놀랍게도, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인을 기능 장애로 만드는 돌연변이를 가진 희귀성 3MC 상염색체 열성 장애 (Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3):197-203)에 걸린 환자의 인간 혈청을 테스트했을 때, 네이세리아 메닝기티디스에 대한 살균 활성이 검출되지 않았다 (n.b.: 이들 혈청은 MASP-1 및 인자 D를 갖지만, MASP-3은 없다).
인간 혈청이 살균 활성을 발달시키기 위해 렉틴 경로-매개된 MASP-3-의존적 활성을 필요로 한다는 가설은 MBL-결핍 인간 혈청이 또한 네이세리아 메닝기티디스를 용해시키는데 실패했다는 관찰에 의해 더 지지된다 (도 11-12). MBL은 이 병원체에 결합하는 유일한 인간 렉틴-경로 인식 분자이다. MASP-3이 자가-활성화되지 않기 때문에, 발명자들은, MASP-2의 부재시, 박테리아 표면에 결합하는 모든 렉틴-경로 활성화 복합체가 MASP-1 또는 MASP-3과 함께 로딩될 것이므로, MASP-2-결핍 혈청에서의 더 높은 용균 활성이 MASP-1을 통한 MASP-3의 선호되는 활성화에 의해 설명될 수 있다는 가설을 세웠다. 활성화된 MASP-3이 인자 D (도 32) 및 인자 B 둘 다를 분열시켜 시험관 내에서 각각의 효소적 활성 형태를 생성하기 때문에 (도 30 및 Iwaki D., et al., J. Immunol.187(7):3751-3758 (2011)), MASP-3의 가장 가능성이 큰 기능은 대체 경로 C3 전환효소 (즉, C3bBb)의 형성을 촉진하는 것이다.
렉틴-의존적 역할에 대한 데이터가 매력적이긴 하지만, 다수의 실험은 MASP-3 및 MASP-1이 렉틴 분자와의 복합체에서 반드시 기능하는 것이 아님을 시사한다. 도 28B에서 도시된 바와 같은 실험들은 렉틴과의 복합체가 존재하지 않는 조건 하에서 (즉, EGTA의 존재시) MASP-3이 대체 경로를 활성화시킬 수 있는 능력을 입증한다 (스타필로코쿠스 아우레우스 상에서의 C3b 침착에 의해 입증됨). 도 28A는 이 조건들 하에서의 침착이 대체 경로의 모든 중요한 구성요소인 인자 B, 인자 D, 및 인자 P에 의존적이라는 것을 입증한다. 추가적으로, MASP-3 및 MASP-1에 의한 인자 D 활성화 (도 32), 및 MASP-3에 의한 인자 B 활성화 (도 30)는 렉틴의 부재시 시험관 내에서 일어날 수 있다. 마지막으로, 인간 혈청의 존재시 마우스 적혈구의 용혈 연구는 세포 용해에 대한 MBL 및 MASP-3 둘 다의 분명한 역할을 입증한다. 하지만, 모든 기능적 MASP-3이 MBL과 복합체를 형성할 경우 예상되는 것과는 달리, MBL의 결핍은 MASP-3의 결핍의 심각도를 완전히 재현할 수 없다. 따라서, 발명자들은 본원에서 입증된 MASP-3 (및 MASP-1)에 대한 모든 역할이 단지 렉틴과 관련된 기능에 기인할 수 있다는 관념에 의해 제한되는 것을 원치 않는다.
렉틴 경로의 2개의 효과기 아암의 확인, 뿐만 아니라 MASP-1, MASP-3, 및 HTRA-1의 가능한 렉틴-독립적 기능은 미생물 병원체 또는 변화된 숙주 세포 또는 대사 침착물의 존재시 과도한 보체 활성화에 의해 유발된, 한정된 인간 병리 상태를 효과적으로 치료하기 위한 치료적 개입에 대한 새로운 기회를 나타낸다. 본원에서 기술된 바와 같이, 발명자들은 이제 MASP-3의 부재시 및 MASP-1의 존재시, 대체 경로가 표면 구조 상에서 활성화되지 않는다는 것을 발견하였다 (도 15-16, 28B, 34-35A,B, 38-39 참조). 대체 경로는 박테리아 용해 뿐만 아니라 세포 용해를 유도하는 속도-제한 이벤트를 구동시키는데 중요하기 때문에 (Mathieson PW, et al., J Exp Med 177(6):1827-3 (1993)), 발명자들의 결과는 활성화된 MASP-3이 보체의 용해 활성에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다. 도 12-13, 19-21, 36-37, 및 39-40에서 도시된 바와 같이, MASP-1은 아니지만 MASP-3이 없는 3MC 환자의 혈청에서, 보체의 용해 말단 활성화 캐스케이드는 결함이 있다. 도 12 및 13에서 도시된 데이터는 MASP-3 및/또는 MASP-1/MASP-3 기능적 활성의 부재시 용균 활성의 상실을 입증한다. 유사하게, MASP-3-결핍 인간 혈청에서 용혈 활성의 상실은 (도 19-21, 36-37 및 39-40), 재조합 MASP-3을 추가하여 용혈을 복원할 수 있는 능력과 결합하여 (도 39-40), 표적 표면 상에서 대체 경로의 활성화가 활성화된 MASP-3의 존재에 의존적이라는 결론을 강력하게 지지한다. 상기 상세히 설명된 렉틴 경로의 새로운 해석에 기초하여, 표적 표면의 대체 경로 활성화는 LEA-1, 및/또는 MASP-3에 의해서도 매개되는 인자 B 및/또는 인자 D의 렉틴-독립적 활성화에 의존적이며, 그러므로, MASP-3-의존적 보체 활성화를 차단하는 작용제는 표적 표면 상에서 대체 경로 활성화를 방지할 것이다.
대체 경로 활성화의 MASP-3-의존적 시작의 본질적인 역할의 개시내용은 보체에 대하여 근본적으로 모든 현재 의학 교과서 및 최근의 검토 논문에서 기술된 바와 같이 대체 경로가 보체 활성화의 독립적이고, 독자적인 경로가 아니라는 것을 나타낸다. 현재 및 널리 보급된 과학적 견해는 대체 경로가 자발적 "틱-오버" C3 활성화의 증폭을 통해 특정 미립자 표적 (미생물, 치모산, 및 토끼 적혈구)의 표면 상에서 활성화된다는 것이다. 하지만, 치모산-코팅된 플레이트 및 2가지 상이한 박테리아 (네이세리아 메닝기티디스 및 스타필로코쿠스 아우레우스) 모두에서 MASP-1 및 MASP-3 이중-결핍 마우스의 혈청 및 인간 3MC 환자 혈청에서 임의의 대체 경로 활성화의 부재, 및 인간 및 마우스의 MASP-3-결핍 혈청에서 적혈구의 용혈 감소는 이들 표면 상에서 대체 경로 활성화의 시작이 기능적 MASP-3을 필요로 한다는 것을 나타낸다. MASP-3에 요구되는 역할은 렉틴-의존적 또는 -독립적일 수도 있고, 각각 대체 경로 C3 전환효소 및 C5 전환효소 복합체, 즉 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n의 형성을 유도한다. 따라서, 발명자들은 본원에서 대체 경로에 대하여 이전에는 규정하기 힘든 시작 루트의 존재를 개시한다. 이 시작 루트는 (i) LEA-1, 렉틴 경로의 새롭게 발견된 활성화 아암, 및/또는 (ii) 단백질 MASP-3, MASP-1, 및 HTRA-1의 렉틴-독립적 역할에 의존적이다.
3. 대체 경로-관련된 질환 및 병태의 치료를 위한 MASP-3 억제제의 사용
본원에서 기술된 바와 같이, 포유류 대상체, 예컨대 설치류 및 비-영장류에서 MASP-3 표적의 농도보다 낮은 몰 농도 (예를 들어, 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb))에서 대체 경로를 완전히 억제하는 것으로 나타난 고 친화도 MASP-3 억제 항체 (예를 들어, 500 pM 미만의 결합 친화도를 가짐) (실시예 11-21 참조). 실시예 11에서 기술된 바와 같이, 마우스로의 고 친화도 MASP-3 억제 항체, mAb 13B1의 단일 용량 투여는 적어도 14일 동안 전신 대체 경로 보체 활성의 거의 완전한 제거를 유도하였다. 실시예 12에서 추가로 기술된 바와 같이, PNH와 관련된 잘 확립된 동물 모델에서 실행된 연구에서 mAb 13B1이 PNH-유사 적혈구 세포의 생존률을 크게 향상시키고 C5 억제보다 PNH-유사 적혈구 세포를 훨씬 더 잘 보호했다는 것이 입증되었다. 실시예 13에서 기술된 바와 같이, mAb 13B1이 관절염의 마우스 모델에서 질환의 발병률 및 심각도를 감소시킨다는 것이 더 입증되었다. 이러한 예의 결과는 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb 13B1, 10D12 및 4D5가 영장류에서 대체 경로를 차단하는데 매우 효과적이라는 것을 입증한다. 게먹이 원숭이로의 mAb 13B1, 10D12 또는 4D5의 단일 용량 투여는 대략 16일 동안 지속되는 전신 대체 경로 활성을 지속적으로 제거하였다. 고 친화도 MASP-3 억제 항체로 처리된 게먹이 원숭이에서 대체 경로 제거의 정도는 시험관 내 및 생체 내에서 인자 D 차단에 의해 달성되는 것과 비슷하며, MASP-3 억제 항체에 의한 인자 D 전환의 완전한 차단을 나타낸다. 그러므로, 고 친화도 MASP-3 억제 mAb는 대체 경로 과다 활성에 관한 질환으로 고통받고 있는 환자의 치료에서 치료적 유용성을 갖는다.
따라서, 한 양태에서 본 발명은 필요로 하는 포유류 대상체에서 대체 경로를 억제하는 방법을 제공하며 고 친화도 (500 pM 미만의 KD를 가짐)로 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728)에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을, 대상체에서 대체 경로 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양으로, 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 하기 추가로 기술된 바와 같이 대체 경로-관련된 질환 또는 장애 (즉, 대체 경로 과다 활성에 관한 질환 또는 장애), 예를 들어, 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD, 습성 및 건성 AMD 포함), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (hemolytic uremic syndrome; HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP) 또는 이식-관련 TMA 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군(Guillain Barre Syndrome), 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (Amylotrophic lateral sclerosis; ALS), 홍반성 신염(lupus nephritis), 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematosus; SLE), 당뇨병성 망막증(Diabetic retinopathy), 포도막염(Uveitis), 만성 폐쇄성 폐 질환 (Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), C3 사구체병증(glomerulopathy), 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (Graft-versus-host disease; GVHD), 혈액 투석, 패혈증(sepsis), 전신성 염증 반응 증후군 (Systemic inflammatory response syndrome; SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (Acute Respiratory Distress Syndrome; ARDS), ANCA 맥관염(ANCA vasculitis), 항-인지질 증후군(Anti-phospholipid syndrome), 아테롬성 동맥 경화증(Atherosclerosis), IgA 신증(Nephropathy) 및 중증 근무력증으로 고통받고 있다.
A. 발작성 야간혈색뇨증에서 MASP-3의 역할 및, 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
PNH의 개요
종종 마르키아파바-미켈리 증후군(Marchiafava-Micheli syndrome)이라고도 불리는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)은 후천적이고, 잠재적으로 생명을 위협하는 혈액 질환이다. PNH는 "1차 PNH"라고 하여, 자체적으로 또는 "2차 PNH"라고 하여, 재생불량성 빈혈(aplastic anemia)과 같은 다른 골수 장애의 맥락에서 발달할 수도 있다. 대부분의 경우는 1차 PNH이다. PNH는 적혈구 세포의 보체-유도된 파괴 (용혈), 낮은 적혈구 세포 수 (빈혈증), 혈전증(thrombosis) 및 골수 부전(bone marrow failure)을 특징으로 한다. PNH의 실험 결과는 가능한 원인으로서, 자가반응성 RBC-결합 항체의 부재시 혈관내 용혈성 빈혈증과 일치하는 변화를 나타낸다: 낮은 헤모글로빈, 높아진 락테이트 데하이드로게나아제, 높아진 망상 적혈구 수 (파괴된 세포를 대체하기 위해 골수에 의해 방출된 미성숙한 적혈구), 높아진 빌리루빈 (헤모글로빈의 분해 산물(breakdown product)).
PNH의 홀마크(hallmark)는 순환 RBC의 표면 상에서, 막 공격 복합체를 포함한 말단 보체 구성요소의 조절되지 않은 활성화에 의해 유발되는 만성 보체-매개된 용혈이다. PNH RBC는 표면 상에서 보체 조절자 CD55 및 CD59의 부재로 인해 보체 활성화 및 용혈이 제어되지 않는다 (Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11):2283-91 (2010), Risitano, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011)). CD55 및 CD59는 정상적인 RBC 및 대조군 보체 활성화에서 풍부하게 발현된다. CD55는 대체 경로의 음성 조절자로 작용하며, 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb) 복합체의 조립을 억제하고 사전 형성된 전환효소의 붕괴를 가속화하여, 막 공격 복합체 (MAC)의 형성을 차단한다. CD59는 C5b678 복합체에 결합하여 C9가 결합 및 폴리머화하는 것을 방지함으로써 보체 막 공격 복합체를 직접적으로 억제한다.
용혈 및 빈혈증은 PNH의 지배적인 임상적 특징이지만, 질환은 임상 소견의 일부로서 혈전증 및 골수 부전을 더 포함하는 복합 혈액학적 장애이다 (Risitano et al, Mini Reviews in Med Chem, 11:528-535 (2011)). 분자 수준에서, PNH는 기능적인 PIG A 유전자가 없는 조혈성 줄기 세포의 비정상적인 클론 확장에 의해 유발된다. PIG A는 CD55 및 CD59를 포함하는 GPI-고정된 분류 A 당단백질의 안정한 표면 발현에 필요한 글리코실-포스파티딜 이노시톨 트랜스퍼라아제를 암호화하는 X-결합된 유전자이다. 현재 조사 중인 이유로, 자발적 체세포 돌연변이의 결과럿 발생하는 기능 장애 PIG A 유전자를 가진 조혈성 줄기 세포는 그 자손이 말초 조혈 세포 풀(pool)의 상당한 부분을 구성하는 지점까지 클론 확장될 수 있다. 돌연변이 줄기 세포 클론의 적혈구 및 림프구 자손은 둘 다 CD55 및 CD59가 없는 한편, RBC만이 순환에 들어간 후 명시적으로 용해된다.
PNH에 대한 최근의 치료법은 빈혈증에 대한 수열, 혈전증에 대한 항응고 및 보체 시스템을 억제하여 면역 파괴로부터 혈액 세포를 보호하는 단클론성 항체 에쿨리쥬맙 (Soliris®)의 사용을 포함한다 (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6):552-559 (2004)). 에쿨리쥬맙 (Soliris®)은 보체 구성요소 C5를 표적으로 하여, C5 전환효소에 의한 분열을 차단하며, 이로 인해 C5a의 생산 및 MAC의 조립을 방지하는 인간화된 단클론성 항체이다. 에쿨리쥬맙으로의 PNH 환자의 처리는 락테이트 데하이드로게나아제 (LDH)로 측정된 바와 같이, 혈관내 용혈을 감소시켜, 대략 절반의 환자에서 헤모글로빈 안정화 및 수혈 독립성을 유도한다 (Risitano et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11(6) (2011)). 에쿨리쥬맙을 이용한 요법을 받은 거의 모든 환자가 정상적인 또는 거의 정상적인 LDH 수준을 달성하는 한편 (혈관내 용혈의 제어로 인해), 약 3분의 1의 환자만이 약 11gr/dL의 헤모글로빈 값에 도달하고, 에쿨리쥬맙 상의 나머지 환자는 거의 같은 비율로 중등도 내지 중증 (즉, 수혈-의존적) 빈혈증을 지속적으로 나타낸다 (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)에서 기술된 바와 같이, 에쿨리쥬맙 상의 PNH 환자는 PNH 적혈구에 결합된 대량의 C3 단편을 포함하는 것이 입증되었다 (하지만 미처리 환자는 그렇지 않음). 이 결과는 Soliris 처리된 PNH 환자에서, C5 차단으로 인해 더 이상 용혈되지 않는 PNH RBC는 이제 옵소닌으로 작동하는 엄청난 양의 막-결합된 C3 단편을 축적시킬 수 있으며, 세망 내피 세포에서 특이적 C3 수용체를 통한 포획 및 후속 혈관외 용혈을 초래한다는 인식으로 이어진다. 따라서, 혈관내 용혈 및 그 결과로 초래된 후유증을 방지하는 한편, 에쿨리쥬맙 요법은 혈관내 용혈에서부터 혈관외 용혈까지 간단하게 이들 RBC의 성향을 전환시켜서, 많은 환자에서 상당한 잔류 미처리 빈혈증을 유발한다 (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). 그러므로, C3-단편-매개된 혈관외 용혈에 걸린 상기 환자는 계속해서 적혈구 수혈을 필요로 하기 때문에, 에쿨리쥬맙의 사용 이외의 치료 전략이 필요하다. 이러한 C3 단편을 표적화하는 접근법은 실험 시스템에서의 유용성이 입증되었다 (Lindorfer et al., Blood 115:2283-91, 2010).
PNH의 보체-시작 메커니즘
혈관내 용혈을 방지하는데 있어서의 에쿨리쥬맙의 효과와 조합하여, PNH에서 음성 보체 조절자 CD55 및 CD59의 결함이 있는 표면 발현 간의 인과관계는 PNH를 보체 시스템에 의해 매개되는 병태로서 명확하게 정의한다. 이 패러다임이 널리 받아들여지고 있지만, 보체 활성화를 시작하는 이벤트의 성질, 및 수반되는 보체 활성화 경로(들)는 이해되지 않은 채로 남아있다. CD55 및 CD59가 모든 보체 시작 경로에 공통적인 보체 캐스케이드에서 말단 증폭 단계를 부정적으로 조절하기 때문에, 이들 분자의 결핍은, 보체 활성화가, 렉틴 루트에 의해, 고전적 경로에 의해 또는 대체 경로의 자발적 턴오버에 의해 시작되는지에 관계없이, 막 공격 복합체의 과도한 형성 및 막 집적화(membrane integration)를 유도할 것이다. 따라서, PNH 환자에서, RBC 표면 상에서의 C3b 침착을 유도하는 임의의 보체 활성화 이벤트는 후속 증폭 및 병리학적 용혈 (혈관내 및/또는 혈관외)을 촉발시키고 용혈 위기(hemolytic crisis)를 일으킬 수 있다. PNH 환자에서 용혈 위기를 촉발시키는 분자적 이벤트에 대한 명확한 기계론적 해석은 여전히 규정하기 힘든 것으로 남아있다. 보체 시작 이벤트가 용혈 위기를 겪은 PNH 환자에서 명확하게 나타나지 않기 때문에, PNH에서 보체 활성화가 대체 경로의 낮은 수준의 "틱-오버" 활성화로 인해 자발적으로 일어날 수도 있으며, 이것은 그 이후에 CD55 및 CD59로 인한 말단 보체 활성화의 부적절한 제어에 의해 확대된다는 것이 우세한 견해이다.
하지만, 자연사에서, PNH는 보통 보체 활성화를 촉발시키는 것으로 보이는 감염 또는 손상과 같은 특정 이벤트 이후에 발병하거나 또는 악화된다는 것을 아는 것이 중요하다 (Risitano, Biologics 2:205-222 (2008)). 이 보체 활성화 반응은 자극적인 병원체에 대한 숙주의 사전 면역력에 의존적이지 않으며, 따라서 고전적 경로를 수반하지 않을 가능성이 크다. 대신에, 이 보체 활성화 반응은 미생물제 또는 손상된 숙주 조직의 표면 상에서 발현되는 외래의 또는 "변형 자기(altered self)" 탄수화물 패턴에 결합하는 렉틴에 의해 시작되는 것으로 보인다. 따라서, PNH에서 용혈 위기를 일으키는 이벤트는 렉틴을 통해 시작되는 보체 활성화와 밀접한 관련이 있다. 이것은 렉틴 활성화 경로가 궁극적으로 PNH 환자에서 용혈을 유도하는 시작 트리거(trigger)를 제공할 가능성을 크게 만든다.
분자 수준에서 활성화 캐스케이드를 분석하기 위한 실험 모델로서 렉틴을 통해 보체를 활성화시키는 명확한 병원체를 사용하여, 발명자들은, 자극 미생물에 따라, 보체 활성화가 LEA-2 또는 LEA-1에 의해 시작되어, 옵소닌화 및/또는 용해을 유도할 수 있다는 것을 입증한다. 렉틴 시작 이벤트에 대한 이중 반응 (즉, 옵소닌화 및/또는 용해)의 이러한 동일한 원칙은 또한 다른 유형의 감염원, 또는 숙주에 대한 조직 손상 후 렉틴에 의한 보체 활성화, 또는 PNH를 일으킬 수도 있는 다른 렉틴-구동된 보체 활성화 이벤트에 적용될 수 있을 것이다. 렉틴 경로의 이 이중성에 기초하여, 발명자들은 PNH 환자에서 LEA-2- 및/또는 LEA-1-시작된 보체 활성화가 C3b로의 RBC의 옵소닌화 및/또는 용해 및 후속 혈관외 및 혈관내 용혈을 촉진할 것이라고 유추한다. 그러므로, PNH의 설정에서, LEA-1 및 LEA-2 둘 다의 억제는 혈관내 및 혈관외 용혈 둘 다를 지시하여, C5 억제자 에쿨리쥬맙보다 상당한 이점을 제공할 것으로 예상된다.
스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 노출이 LEA-2의 렉틴-의존적 활성화를 우선적으로 촉발시키며, 이것은 C3b로의 이 미생물의 옵소닌화를 유도하는 것으로 결정되었다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애가 MAC-매개된 용해에 저항성이기 때문에, 순환으로부터의 그것의 클리어런스가 C3b로의 옵소닌화를 통해 일어난다. 이 옵소닌화 및 순환으로부터의 후속 제거는 LEA-2-의존적이며, MASP-2-결핍 마우스 및 MASP-2 단클론성 항체로 처리된 마우스에서 면역 손상된 박테리아 대조군에 의해 나타난 바와 같다 (PLOS Pathog., 8: e1002793. (2012)).
미생물제에 대한 선천적 숙주 반응에서 LEA-2의 역할을 탐색하는데 있어서, 발명자들은 추가적인 병원체를 테스트하였다. 모델 유기체로서 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)가 연구될 때 크게 다른 결과가 관찰되었다. 네이세리아 메닝기티디스는 또한 렉틴을 통해 보체를 활성화시키고, 보체 활성화는 나이브 숙주에서 네이세리아 메닝기티디스 감염의 방지에 필요하다. 하지만, LEA-2는 이 반응에서 숙주 보호적 기능적 역할을 하지 않는다: 도 6 및 7에서 도시된 바와 같이, MASP-2의 유전적 제거를 통한 LEA-2의 차단은 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 후 생존률을 감소시키지 않는다. 반대로, MASP-2 제거에 의한 LEA-2의 차단은 이들 연구에서 생존률 (도 6 및 7), 뿐만 아니라 질병 점수 (도 9)를 크게 향상시켰다. MASP-2 항체 투여에 의한 LEA-2 차단은 가능한 원인으로서 넉아웃-마우스 계통에서 2차 또는 보충 효과를 제거하면서 같은 결과를 산출하였다 (도 10). LEA-2-제거된 동물에서의 이들 바람직한 결과는 혈액으로부터의 네이세리아 메닝기티디스의 더 신속한 제거와 관련이 있다 (도 8). 또한, 본원에서 기술된 바와 같이, 정상 인간 혈청과 함께 네이세리아 메닝기티디스를 인큐베이션하는 것은 네이세리아 메닝기티디스를 살해하였다 (도 11). 아이소타입 대조군 단클론성 항체의 투여가 아니라, LEA-2를 차단하는 인간 MASP-2에 특이적인 기능적 단클론성 항체의 추가는 이 살해 반응을 향상시킬 수도 있다. 하지만, 이 과정은 MBL-결핍 인간 혈청 또는 열-비활성화된 인간 혈청이 네이세리아 메닝기티디스를 살해할 수 없기 때문에, 렉틴 및 적어도 부분적으로는 기능적 보체 시스템에 의존적이다 (도 11). 종합해보면, 이들 새로운 결과는 기능적 보체 시스템의 존재시 네이세리아 메닝기티디스 감염은 보체 활성화의 렉틴-의존적이지만 LEA-2-독립적인 경로에 의해 제어된다는 것을 시사한다.
LEA-1이 네이세리아 메닝기티디스의 렉틴-의존적 살해의 원인인 보체 경로일 수도 있다는 가설은 3MC 환자의 혈청 표본을 사용하여 테스트되었다. 이 환자는 MASP-1/3 유전자의 엑손 12에서의 넌센스(nonsense) 돌연변이에 대하여 동형 접합성이었다. 결과로서, 이 환자는 기능적 MASP-3 단백질이 없지만, 다른 보체가 충분하였다 (엑손 12는 MASP-3 전사물에 특이적이다; 돌연변이는 MASP-1 기능 또는 발현 수준에 아무 효과가 없다) (Nat Genet 43(3):197-203 (2011) 참고). 정상 인간 혈청은 네이세리아 메닝기티디스를 효과적으로 살해하였지만, MBL (렉틴 경로에 대한 인식 분자 중 하나)의 열-비활성화된 혈청 결핍 및 MASP-3-결핍 혈청은 네이세리아 메닝기티디스를 살해할 수 없었다 (도 12). 따라서, LEA-1은 네이세리아 메닝기티디스 살해를 매개하는 것으로 보인다. 이 결과는 넉아웃 마우스 계통의 혈청 샘플을 사용하여 확인되었다. 정상 마우스 혈청을 포함하는 보체는 네이세리아 메닝기티디스를 쉽게 살해하였지만, MBL-결핍 또는 MASP-1/3-결핍 마우스 혈청은 기능적 보체가 없는 열-비활성화된 혈청만큼 효과가 없었다 (도 13). 반대로, MASP-2-결핍 혈청은 네이세리아 메닝기티디스의 효율적인 살해를 나타냈다.
이 결과들은 렉틴-의존적 보체 활성화의 별개의 LEA-2 및 LEA-1 경로의 존재를 나타냄으로써 렉틴 경로에서 지금까지 알려져 있지 않은 이중성에 대한 증거를 제공한다. 상기 상세히 설명된 예에서, LEA-2 및 LEA-1은 중복되지 않고 별개의 기능적인 결과를 매개한다. 데이터는 특정 유형의 렉틴 경로 활성화 물질 (제한되는 것은 아니지만, 스트렙토코쿠스 뉴모니애를 포함함)이 LEA-2를 통한 보체 활성화를 우선적으로 시작하여 옵소닌화를 유도하는 한편, 다른 것들은 (네이세리아 메닝기티디스로 예시됨) LEA-1을 통한 보체 활성화를 우선적으로 시작하고 세포 용해 과정을 촉진한다는 것을 시사한다. 하지만, 데이터는 반드시 LEA-2를 옵소닌화로 및 LEA-1을 세포 용해 과정으로 제한하는 것은 아닌데, 두 경로가 다른 설정에서는 옵소닌화 및/또는 용해를 매개할 수 있기 때문이다.
네이세리아 메닝기티디스에 의한 렉틴-의존적 보체 활성화의 맥락에서, LEA-2의 차단이 시험관 내에서 유기체의 LEA-1-의존적 용해성 파괴를 향상시켰기 때문에, LEA-2 및 LEA-1 아암은 서로 경쟁하는 것으로 보인다 (도 13). 상기 상세히 설명된 바와 같이, 이 결과는 MASP-2의 부재시 렉틴 MASP-3 복합체의 가까이에 있는 렉틴 MASP-1 복합체의 가능성의 증가에 의해 설명될 수 있으며, 이것은 LEA-1 활성화를 향상시키며 따라서 네이세리아 메닝기티디스의 더 효과적인 용해를 촉진한다. 네이세리아 메닝기티디스의 용해가 나이브 숙주의 주요 보호 메커니즘이기 때문에, LEA-2의 차단은 생체 내에서 네이세리아 메닝기티디스 클리어런스를 증가시키고 살해를 향상시킨다.
상기 논의된 예들은 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 이후의 결과에 관하여 LEA-2 및 LEA-1의 반대 효과를 나타내는 한편, LEA-2 및 LEA-1 둘 다가 특정 결과를 생산하기 위해 시너지 효과를 나타낼 수 있는 다른 설정이 존재할 수도 있다. 하기 상세히 설명된 바와 같이, PNH에 존재하는 것과 같이 렉틴을 통한 병리학적 보체 활성화의 다른 경우에서, LEA-2- 및 LEA-1-구동된 보체 활성화는 PNH의 전반적인 병리 상태에 기여하기 위해 시너지 방식으로 협력할 수도 있다. 이에 더하여, 본원에서 기술된 바와 같이, MASP-3은 또한 Ca++의 부재시 일어날 수 있는 인자 B 및 인자 D의 렉틴-독립적 전환에 기여하여, 일반적으로 PNH의 병리 상태에 더 기여할 수 있는 C3bBb로의 C3bB의 전환 및 인자 D로의 프로-인자 D의 전환을 유도한다.
PNH의 생물학 및 예상되는 기능적 활성
이 섹션은 PNH의 시험관 내 모델에서 용혈에 대한 LEA-2 및 LEA-1 차단의 억제 효과를 기술한다. 이 결과는 PNH의 하나 이상의 양태로 고통받고 있는 대상체를 치료하기 위한 LEA-2-차단제 (제한되는 것은 아니지만, MASP-2에 결합하여 그 기능을 차단하는 항체 포함) 및 LEA-1-차단제 (제한되는 것은 아니지만, MASP-3, MASP-3, 또는 둘 다에 결합하여 이것들의 MASP-1-매개된 활성화의 기능을 차단하는 항체 포함)의 유용성, 및 또한 에쿨리쥬맙과 같은 C5-억제자로의 요법을 겪은 PNH 환자에서 C3-단편-매개된 혈관외 용혈의 효과를 개선하기 위한 LEA-2 및/또는 LEA-1, 및/또는 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적 보체 활성화의 억제자 (MASP-2 억제자, MASP-3 억제자, 및 이중- 또는 이중특이적 MASP-2/MASP-3 또는 MASP-1/MASP-2 억제자, 및 팬-특이적 MASP-1/MASP-2/MASP-3 억제자 포함)의 사용을 지지한다.
세망내피계를 통해 PNH RBC의 옵소닌화 및 혈관외 용혈을 차단하기 위한 MASP-2 억제자
상기 상세히 설명된 바와 같이, PNH 환자는 순환으로부터 RBC 클리어런스의 두 가지 별개의 메커니즘으로 인해 빈혈이 된다: 막 공격 복합체 (MAC)의 활성화를 통한 혈관내 용혈, 및 C3b로의 옵소닌화 이후의 혈관외 용혈 및 보체 수용체 결합 및 세망내피계에 의한 섭취 이후의 후속 클리어런스. 혈관내 용혈은 환자가 에쿨리쥬맙으로 처리될 때 대부분 예방된다. 에쿨리쥬맙이 보체-시작 활성화 이벤트, 뿐만 아니라 뒤이은 옵소닌화 둘 다의 다운스트림에서 발생하는 말단 용해성 효과기 메커니즘을 차단하기 때문에, 에쿨리쥬맙은 혈관외 용혈을 차단하지 않는다 (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). 대신에, 미처리 PNH 환자에서 용혈을 겪는 RBC는 이제 그 표면 상에 활성화된 C3b 단백질을 축적시킬 수 있으며, 이것은 세망내피계에 의한 흡수를 증가시키고 혈관외 용혈을 향상시킨다. 따라서, 에쿨리쥬맙 처리는 RBC 기질을 혈관내 용혈에서 잠재적 혈관외 용혈로 효과적으로 전환시킨다. 결과로서, 일부 에쿨리쥬맙-처리된 PNH 환자은 여전히 빈혈이다. 결과적으로 업스트림에서 보체 활성화를 차단하고 PNH RBC의 옵소닌화를 방지하는 작용제는 특히 가끔 에쿨리쥬맙으로 볼 수 있는 혈관외 용혈을 차단하는데 적합할 수도 있다.
본원에서 제공된 미생물 데이터는 LEA-2이 종종 렉틴-의존적 옵소닌화에 대하여 지배적인 루트임을 시사한다. 또한, 렉틴-의존적 옵소닌화 (C3b 침착으로 측정됨)가 세 가지 원형의 렉틴 활성화 표면에서 평가될 때 (만난, 도 17A; 치모산, 도 17B, 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애; 도 17C), LEA-2는 생리학적 조건 하에서 (즉, 모든 보체 경로가 작동 중인 Ca++의 존재시) 렉틴-의존적 옵소닌화에 대하여 지배적인 루트인 것으로 보인다. 이 실험 조건 하에서, MASP-2-결핍 혈청 (LEA-2가 없음)은 테스트 표면을 옵소닌화하는데 있어서 WT 혈청보다 실질적으로 덜 효과적이다. MASP-1/3-결핍 혈청 (LEA-1이 없음)이 또한 면역 손상되었지만, 이 효과는 LEA-2가 없는 혈청과 비교하여 훨씬 덜 두드러진다. 렉틴-구동된 옵소닌화에 대한 LEA-2 및 LEA-1의 기여의 상대적인 규모는 도 18A-18C에서 추가로 나타난다. 보체의 대체 경로는 렉틴 경로 또는 고전적 경로의 부재시 렉틴 활성화 표면의 옵소닌화를 지지하는 것으로 보고되었지만 (Selander et al., J Clin Invest 116(5):1425-1434 (2006)), 별도의 대체 경로는 (Ca++ 없는 검정 조건 하에서 측정됨)는 본원에서 기술된 LEA-2- 및 LEA-1-시작된 과정보다 실질적으로 덜 효과적인 것으로 보인다. 추정에 의해서, 이 데이터들은 PNH RBC의 옵소닌화가 또한 렉틴-독립적 대체 경로 활성화의 결과 대신에, LEA-2에 의해 및, 더 적게는, LEA-1 (아마도 대체 경로 증폭 루프에 의해 증폭됨)에 의해 우선적으로 시작될 수도 있다는 것을 시사한다. 그러므로, LEA-2 억제자는 PNH에서 옵소닌화를 제한하고 혈관외 용혈을 방지하는데 가장 효과적일 것으로 예상될 수 있다. 하지만, MBL 이외의 렉틴, 예컨대 피콜린이 비-탄수화물 구조, 예컨대 아세틸화된 단백질에 결합하고, MASP-3이 H-피콜린에 우선적으로 회합한다는 사실 (Skjoedt et al., Immunobiol. 215:921-931, 2010)의 인식은 또한 PNH-회합된 RBC 옵소닌화에서 LEA-1의 중요한 역할의 가능성을 열어두었다. 그러므로, LEA-1 억제자는 추가적인 항-옵소닌화 효과를 가질 것으로 예상되고, LEA-1 및 LEA-2 억제자의 조합이 최적이고 PNH 환자에서 옵소닌화 및 혈관외 용혈을 제한하는데 있어서 가장 강력한 치료적 이점을 매개할 것으로 예상된다. 따라서, LEA-2 및 LEA-1은 추가적으로 또는 시너지 효과에 의해 옵소닌화를 촉진하는 작용을 하고, 교차반응성 또는 이중특이적 LEA-1/LEA-2 억제자는 PNH에서 옵소닌화 및 혈관외 용혈을 차단하는데 가장 효과적일 것으로 예상된다.
PNH에서 MASP-3 억제자의 억제
PNH의 시험관 내 모델을 사용하여, 발명자들은 PNH에서 보체 활성화 및 결과로 일어나는 용혈이 실제로 LEA-2 및/또는 LEA-1 활성화에 의해 시작되고, 그것이 대체 경로의 독립적인 기능이 아니라는 것을 입증한다. 이 연구들은 Crry-결핍 마우스의 RBC (마우스에서 말단 보체 경로의 중요한 음성 조절자), 뿐만 아니라 CD55/CD59-결핍 마우스의 RBC (PNH 환자에 없는 동일한 보체 조절자가 없음)를 포함한, 다양한 마우스 게통의 만난-감작된 RBC를 사용하였다. 만난-감작된 Crry-결핍 RBC가 보체-충분 인간 혈청에 노출되었을 때, RBC는 3%의 혈청 농도에서 효과적으로 용혈되는 한편 (도 19 및 20) 보체-결핍 혈청 (HI: 열-비활성화된)은 용혈성이 아니었다. 놀랍게도, LEA-2가 MASP-2 항체의 추가에 의해 차단된 보체-충분 혈청은 용혈 활성이 감소되었고, 효과적인 용혈을 위해서는 6% 혈청이 필요하였다. CD55/CD59-결핍 RBC가 테스트될 때 유사한 관찰이 이루어졌다 (도 22). MASP-2 단클론성 항체로 보충된 보체-충분 인간 혈청 (즉, LEA-2이 저해된 혈청)은 용혈을 지지하는데 있어서 미처리 혈청보다 약 2배 덜 효과적이었다. 또한, 미처리 혈청과 비교하여 미처리 WT RBC의 효과적인 용혈을 촉진하기 위해서는 더 높은 농도의 LEA-2-차단된 혈청 (즉, 항 MASP-2 단클론성 항체로 처리됨)이 필요하였다 (도 21).
더욱 놀랍게도, 기능 장애 MASP-3 단백질에 대하여 동형 접합성인 (및 LEA-1이 없는) 3MC 환자의 혈청은 만난-감작된 Crry-결핍 RBC를 완전히 용해시킬 수 없었다 (도 20 및 도 21). 미감작 정상 RBC가 사용될 때 유사한 결과가 관찰되었다: 도 21에서 도시된 바와 같이, 3MC 환자로부터 분리된 LEA-1-결핍 혈청은 용혈을 매개하는데 있어서 완전히 효과가 없었다. 종합해보면, 이 데이터들은 LEA-2가 혈관내 용혈 반응에 상당히 기여하는 반면, LEA-1은 용혈을 유도하는 지배적인 보체-시작 경로인 것을 나타낸다. 따라서, LEA-2 차단제는 PNH 환자에서 RBC의 혈관내 용혈을 상당히 감소시킬 것으로 예상되는 한편, LEA-1 차단제는 더 큰 효과를 가지며 보체-구동된 용혈을 대부분 제거할 것으로 예상된다.
이 연구에 사용된 LEA-1-결핍 3MC 환자의 혈청은 통상적인 대체 경로 검정 조건 하에서 테스트될 때 약화되었지만 기능적인 대체 경로를 가지고 있었다 (도 15). 이 결과는 LEA-1이 PNH의 이러한 실험적 설정에서 통상적으로 정의되는 바와 같이 대체 경로 활성보다 더 많이 용혈에 기여한다는 것을 시시한다. 추론에 의해서, LEA-1-차단제는 적어도 PNH 환자에서 혈관내 용혈을 예방하거나 치료하는데 있어서 대체 경로의 다른 양태를 차단하는 작용제만큼 효과적인 것으로 나타난다.
PNH에서 MASP-2 억제자의 역할
본원에서 제공된 데이터는 PNH에서 빈혈증에 대한 다음 병원성 메커니즘을 시사한다: 배타적인 것은 아니지만, 대부분 LEA-1에 의해 시작되는, 말단 보체 구성요소의 조절되지 않는 활성화 및 MAC의 형성에 의한 RBC의 용해로 인한 혈관내 용혈, 및 대부분 LEA-2에 의해 시작되는 것으로 보이는, C3b에 의한 RBC의 옵소닌화에 의해 유발된 혈관외 용혈.
보체 활성화를 시작하고 MAC 형성 및 용혈을 촉진하는데 있어서 LEA-2의 구별 가능한 역할이 분명하지만, 이 과정은 용혈을 유도하는 LEA-1-시작된 보체 활성화보다 실질적으로 덜 효과적인 것으로 보인다. 따라서, LEA-2-차단제는 PNH 환자에서 혈관내 용혈을 상당히 감소시킬 것으로 예상되지만, 이 치료적 활성은 단지 부분적일 것으로 예상된다. 그에 비해, LEA-1-차단제에 대하여 PNH 환자에서 혈관내 용혈의 더 실질적인 감소가 예상된다.
PNH에서 빈혈증을 유도하는 RBC 파괴의 덜 극적이지만, 동등하게 중요한 메커니즘인 혈관외 용혈은 주로 LEA-2에 의해 대부분 매개되는 것으로 보이는, C3b에 의한 옵소닌화의 결과이다. 따라서, LEA-2-차단제는 PNH에서 RBC 옵소닌화 및 뒤이은 혈관외 용혈을 우선적으로 차단할 것으로 예상될 수도 있다. LEA-2-차단제의 이 독특한 치료 활성은 이 병원성 과정을 경험한 상기 PNH 환자에 대한 치료법이 현재 존재하지 않기 때문에 모든 PNH 환자에게 상당한 치료적 이점을 제공할 것으로 예상된다.
LEA-1 억제자 또는 말단 보체 차단제에 대한 부가 치료로서 LEA-2 억제자
본원에서 제공된 데이터는 별개의 분류의 치료제에 의해, 별도로 또는 조합으로, 표적화될 수 있는, PNH에서 RBC 클리어런스 및 빈혈증에 대한 두 가지 병원성 메커니즘을 상세히 설명한다: 배타적인 것은 아니지만, 대부분 LEA-1에 의해 시작되어, LEA-1-차단제에 의해 효과적으로 방지될 것으로 예상되는 혈관내 용혈, 및 대부분 LEA-2에 의해 구동되어, LEA-2-차단제에 의해 효과적으로 방지되는 C3b 옵소닌화에 의한 혈관외 용혈.
용혈의 혈관내 및 혈관외 메커니즘 둘 다는 PNH 환자에서 빈혈증을 유도하는 것으로 잘 기록되어 있다 (Risitano et al., Blood 113:4094-4100 (2009)). 그러므로, 주로 혈관외 용혈을 방지하는 LEA-2 차단제와 조합하여 혈관내 용혈을 방지하는 LEA-1-차단제가 PNH 환자에서 발병하는 빈혈증을 예방하는데 있어서 작용제 단독보다 더 효과적일 것으로 예상된다. 실제로, LEA-1- 및 LEA-2-차단제의 조합은 PNH에서 보체 시작의 모든 관련된 메커니즘을 방지하여 PNH에서 빈혈증의 모든 증상을 차단할 것으로 예상된다.
또한 C5-차단제 (예컨대 에쿨리쥬맙)는 혈관내 용혈을 효과적으로 차단하지만 옵소닌화를 방해하지는 않는 것으로 알려져 있다. LEA-2에 의해 매개된 혈관외 용혈에 의해 실질적인 잔류 빈혈증에 걸린 일부 항-C5-처리된 PNH 환자를 미처리된 채로 남겨두었다. 그러므로, 혈관외 용혈을 감소시키는 LEA-2 차단제와 조합하여 혈관내 용혈을 방지하는 C5-차단제 (예컨대 에쿨리쥬맙)는 PNH 환자에서 발병하는 빈혈증을 예방하는데 있어서 작용제 단독보다 더 효과적일 것으로 예상된다.
C5 활성화 및 MAC 침착을 유도하는 보체 시스템의 말단 증폭 루프를 차단하는 다른 작용제 (제한되는 것은 아니지만, 프로퍼딘, 인자 B 또는 인자 D를 차단하거나 또는 인자 I, 인자 H 또는 다른 보체 억제 인자의 억제 활성을 향상시키는 작용제 포함)는 혈관내 용혈을 억제할 것으로 예상된다. 하지만, 이 작용제들은 PNH 환자에서 LEA-2-매개된 옵소닌화를 방해할 것으로 예상되지 않는다. LEA-2에 의해 매개된 혈관외 용혈에 의해 실질적인 잔류 빈혈증에 걸린, 이러한 작용제로 처리된 일부 PNH 환자를 미처리된 채로 남겨두었다. 그러므로, 혈관외 용혈을 최소화하는 LEA-2-차단제와 조합하여 혈관내 용혈을 방지하는 이러한 작용제로의 처리는 PNH 환자에서 발병하는 빈혈증을 예방하는데 있어서 작용제 단독보다 더 효과적일 것으로 예상된다. 실제로, 이러한 작용제와 LEA-2 차단제의 조합은 PNH에서 RBC 파괴의 모든 관련된 메커니즘을 방지하여 PNH에서 빈혈증의 모든 증상을 차단할 것으로 예상된다.
PNH를 치료하기 위한 LEA-1 및 LEA-2 다중, 이중특이적 또는 팬-특이적 항체의 사용
상기 상세히 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하며, 따라서 조합하여 혈관내 용혈, 뿐만 아니라 혈관외 용혈을 매개하는 모든 보체 활성화 이벤트를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 PNH 환자에 대한 최선의 임상적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자적 실체물로 조합되고, 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 가진 이러한 실체물은 PNH에서 혈관내 용혈, 뿐만 아니라 혈관외 용혈을 효과적으로 차단하고 빈혈증을 예방할 것이다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하고 LEA-2를 감소시키고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 더 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 LEA-2를 감소시키는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 더 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 전체적인 단백질 서열 및 구조의 유사성에 기초하여, 기능적인 방식으로 MASP-1 및 MASP-2 및 MASP-3에 특이적으로 결합하여, LEA-1 및 LEA-2의 기능적 차단을 달성하는 두 개의 동일한 결합 부위를 가진 통상적인 항체가 개발될 수 있다는 것이 또한 구상될 수 있다. 팬-MASP 억제 활성을 가진 이러한 항체는 PNH 환자에서 혈관내 용혈, 뿐만 아니라 혈관외 용혈 둘 다를 차단하여 빈혈증을 효과적을 치료할 것으로 예상된다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, PNH와 같은 AP-관련된 질환 또는 병태에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같이 대상체에서 PNH를 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는, PNH로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 대상체에서 PNH를 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1, (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 PNH로 고통받고 있는 대상체에서 적혈구 세포의 생존률을 증가시킨다. 일부 구체예에서, PNH로 고통받고 있거나 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체는 (i) 정상 수준 미만의 헤모글로빈 (ii) 정상 수준 미만의 혈소판; (iii) 정상 수준 초과의 망상 적혈구, 및 (iv) 정상 수준 초과의 빌리루빈으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 PNH로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 전신으로 (예를 들어, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 동맥내로 또는 흡입제로서) 투여된다. 일부 구체예에서, PNH로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 처리를 이전에 겪었거나, 또는 현재 겪고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화된 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다.
B. 나이-관련 황반 변성에서 MASP-3의 역할 및, 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
나이 관련 황반 변성 (AMD)은 노인에서 시각 장애 및 실명의 주요 원인이고 선진국에서 실명 사례의 최대 50%를 차지한다. AMD의 유병률은 성인에서 대략 3%이고 나이에 따라 증가하여 80살이 넘는 인구의 거의 3분의 2가 일부 징후를 나타낸다. 미국에서 175만 명이 넘는 개체가 진행성(advanced) AMD에 걸려있는 것으로 추정되고 유병률은 인구 연령에 따라 증가하며 2020년까지 거의 3백만 명에 도달할 것으로 예상된다 (Friedman, D.S., et al., Arch. Ophthalmol. 122:564-572, 2004). AMD는 상부 중심 망막, 또는 황반의 광수용체의 변성, 및 중심시(central vision)의 상실을 일으키는 망막 색소 상피 (RPE)의 이상이다. 초기 및 중간 형태의 AMD는 망막의 색소 불규칙성과 함께, RPE에 인접한 망막하 공간에서 지질, 단백질, 지질단백질, 및 세포 파편을 함유하는 황색 물질인 드루젠(drusen)의 진행성 침착물을 특징으로 한다. 진행성 AMD는 두 가지 임상적인 하위 유형으로 구성된다: 비-혈관 신생 지도모양 위축증 ('건성(dry)') AMD 및 혈관 신생 삼출성 ('습성(wet)') AMD. 건성 AMD가 진행성 AMD의 80-90%를 차지하고 있지만, 불시의 및 심각한 시력 상실은 습성 AMD에 걸린 환자에서 일어난다. AMD의 두 가지 유형이 유사한 병리 상태로부터 발생한 상이한 표현형을 나타내는지 또는 두 가지 별개의 병태를 나타내는지는 알려져 있지 않다. 현재 건성 AMD를 치료하기 위해 미국식품의약관리국 (FDA)에 의해 승인된 요법이 없다. 습성 AMD에 대하여 FDA-승인된 치료 옵션은 항혈관형성제 (라니비쥬맙, 페가프타닙 나트륨, 아플리버셉트)의 유리체내 주사, 레이져 요법, 광역학적 레이져 요법, 및 미세망원인공수정체(implantable telescope)를 포함한다.
AMD의 병인론 및 병리생리학은 복잡하고 완전히 이해하지 못했다. 여러 증거들이 AM의 발병에서 보체 시스템 조절 장애의 역할을 지지한다. 유전자 결합 연구에서 AMD와 관련된 다수의 유전자좌가 확인되었으며, 다양한 보체 단백질, 인자, 및 조절자를 암호화하는 유전자를 포함한다. 보체 인자 H (CFH) 유전자의 다형성과 가장 강력한 연관이 있으며, Y402H 변종 동형 접합체는 비-위험 유전자형과 비교하여 발달 AMD에 대하여 위험이 대략 6배 증가하였고 이형 접합체는 대략 2.5배 증가하였다 (Khandhadia, S., et al., Immunobiol. 217:127-146, 2012). 보체 인자 B (CFB), C2, C3, 인자 I, 및 CFH-관련된 단백질 1 및 3을 포함하는 다른 보체 경로 암호화 유전자의 돌연변이가 또한 AMD의 위험의 증가 또는 감소와 관련이 있다 (Khandhadia et al.). AMD 환자의 공여체 눈에서의 면역조직학적 및 단백질체학적 연구는 보체 캐스케이드의 단백질이 드루젠에서 증가하고 국소화된다는 것을 보여주었다 (Issa, P.C., et al., Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249:163-174, 2011). 또한, AMD 환자는 말초 혈액에서 측정된 바와 같이 전신성 보체 활성화가 증가된다 (Issa et al., 2011, supra).
AMD의 발병에서 보체의 대체 경로가 고전적 경로보다 더 관련이 있는 것으로 보인다. 고전적 경로의 활성화에 필수적인 인식 구성요소인 C1q는 면역조직학적 분석에 의해 드루젠에서 검출되지 않았다 (Mullins et al., FASEB J. 14:835 846, 2000; Johnson et al., Exp. Eye Res. 70:441 449, 2000). 유전적 연관성 연구는 관련된 CFH 및 CFB 유전자를 갖는다. 이 단백질들은 대체 경로 증폭 루프에 수반되며, CFH는 유체상 억제자이고 CFB는 대체 경로의 활성화 프로테아제 구성요소이다. CFH의 Y402H 변종은 C-반응성 단백질, 헤파린, M 단백질, 및 글리코사미노글리칸과의 결합을 포함한 리간드 결합과의 상호작용에 영향을 미친다. 리간드에 대한 이 변화된 결합은 세포 표면으로의 결합을 감소시킬 수도 있으며, 이것은 결국 C3b 활성화 단편의 인자 I 매개된 변성의 감소 및 대체 C3 전환효소 조절 손상을 유도하여, 대체 경로의 과도한 활성화를 일으킬 수도 있다 (Khandhadia et al., 2012, supra). CFB 유전자의 변이는 AMD의 발달에 대한 보호 효과와 관련이 있다. 기능적 변종 fB32Q는 위험 변종 fB32R보다 C3b에 대하여 4배 더 낮은 결합 친화도를 가지고 있으며, C3 전환효소 형성을 감소시킨다 (Montes, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:4366-4371, 2009).
AMD에서 보체-시작 메커니즘
상기 논의된 인간 유전적 연관성 연구는 AMD 발병에서 보체 시스템에 대한 중요한 역할을 시사한다. 또한, 보체 활성화 생성물은 습성 및 건성 AMD 둘 다의 홀마크 병리학적 병소인 드루젠에 풍부하게 존재한다 (Issa, P.C., et al., Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249:163-174, 2011). 하지만, 보체 활성화를 시작하는 이벤트의 성질, 및 수반되는 보체 활성화 경로(들)는 이해되지 않은 채로 남아있다.
드루젠 침착물이 눈 연령으로서 RPE 아래에 축적되는 망막으로부터 기원한 세포 파면 및 산화 폐기물로 구성되어 있다는 것을 아는 것이 중요하다. 이에 더하여, 산화 스트레스는 중요한 역할을 하고 (Cai et al; Front Biosci., 17:1976-95, 2012), RPE에서 보체 활성화를 유발하는 것으로 나타났다 (J Biol Chem., 284(25):16939-47, 2009). 산화 스트레스 및 세포 또는 조직 손상은 둘 다 보체 시스템 렉틴을 활성화시킨다는 것이 널리 알려져 있다. 예를 들어, Collard et al.은 산화 스트레스에 노출된 내피 세포가 렉틴에 의해 매개된 풍부한 보체 침착을 촉발시키고 (Collard CD et al., Mol Immunol., 36(13-14):941-8, 1999; Collard C.D. et al., Am J Pathol., 156(5):1549-56, 2000), 렉틴 결합 및 렉틴-의존적 보체 활성화의 차단이 산화 스트레스 손상의 실험 모델의 결과를 향상시킨다는 것을 입증하였다 (Collard C.D. et al., Am J Pathol.,156(5):1549-56, 2000). 따라서, 드루젠에 존재하는 산화 폐기물이 또한 렉틴을 통해 보체를 활성화시킬 가능성이 있다. 추론에 의해서, 렉틴-의존적 보체 활성화는 AMD 발병에서 중추적인 역할을 할 수도 있다.
보체 시스템의 역할은 AMD의 마우스 모델에서 평가되었다. 산화 스트레스-매개된 광수용체 변성에 대한 실험 모델인 광 손상의 마우스 모델에서, 고전적 경로가 제거된 넉아웃 마우스 (C57BL/6 배경에서 C1qα-/-)는 야생형 한배 새끼와 비교하여 광 손상에 대하여 동일한 민감성을 나타내는 반면, 대체 경로의 보체 인자 D의 제거 (CFD-/-)는 광 손상으로부터의 보호를 유도하였다 (Rohrer, B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:5282-5289, 2007). 브루크 막(Bruch membrane)의 레이져 광응고에 의해 유도된 맥락막 혈관 신생 (CNV)의 마우스 모델에서, 보체 인자 B가 없는 넉아웃 마우스 (CFB-/-)는 야생형 마우스와 비교하여 CNV에 대하여 보호되었다 (Rohrer, B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50:3056-3064, 2009). 동일한 모델에서, 보체 활성화 부위로 표적화된 보체 인자 H (CR2-fH)의 재조합 형태의 정맥내 투여는 CNV의 정도를 감소시켰다. CR2-fH가 레이져 손상 시 또는 치료적으로 (레이져 손상 후) 투여되었는지에 관계없이 이 보호 효과가 관찰되었다. CR2-fH의 인간 치료 버젼 (TT30)은 또한 쥐 CNV 모델에서 효과적이었다 (Rohrer, B. et al. J. Ocul. Pharmacol. Ther.,28:402-409, 2012). fB는 LEA-1에 의해 활성화되고, MASP-1 및 MASP-3은 인자 D의 성숙화에 기여하기 때문에, 이 결과들은 LEA-1 억제자가 AMD 환자에서 치료적 이점을 가질 수도 있다는 것을 나타낸다. 이에 더하여, 최근의 결과는 2단계 연구로부터 보고된 최근의 결과는 매월 람팔리쥬맙 (이전에는 FCFD4514S 및 항-인자 D로도 불렸으며, 인자 D에 대한 인간화된 단클론성 항체의 항원-결합 단편이다)으로 유리체내 주사가 AMD에 부차적인 지도모양 위축증에 걸린 환자에서 지도모양 위축증 면적 진행을 감소시킨다는 것을 나타냈다 (Yaspan B.L. et al., Sci Transl. Med. 9, Issue 395, June 21, 2017).
MBL-결핍 마우스를 사용하는 AMD 설치류 모델에서 초기 실험 연구는 병원성 보체 활성화에서 렉틴 경로의 중요한 역할을 지지하지 못했다 (Rohrer et al., Mol Immunol. 48:e1-8, 2011). 하지만, MBL은 여러 렉틴 중 단지 하나이고, MBL 이외의 렉틴은 AMD에서 보체 활성화를 촉발시킬 수도 있다. 실제로, 발명자들의 이전 연구는 렉틴 경로 기능에 결정적으로 필요한 속도-제한 세린 프로테아제인 MASP-2가 AMD에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 7,919,094 (Omeros Corporation에 할당됨)에서 기술된 바와 같이, MASP-2-결핍 마우스 및 MASP-2 항체로 처리된 마우스는 검증된 습성 AMD의 전임상 모델인 레이져-유도된 CNV의 마우스 모델에서 보호되었다 (Ryan et al., Tr Am Opth Soc LXXVII:707-745, 1979). 따라서, LEA-2의 억제자는 CNV를 효과적으로 방지하고 AMD 환자에서 결과를 향상시킬 것으로 예상된다.
따라서, 상기를 고려하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 AMD에서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최선으로는, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능이 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중 특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 나이-관련 황반 변성 (습성 및 건성 형태)으로 고통받고 있는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP 1 억제제, MASP 3 억제제, 또는 MASP 1/3 억제제의 조합의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여함으로써 나이-관련 황반 변성 (습성 및 건성 형태)을 치료하기 위한 LEA-1 독립적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP 1, MASP 3, 또는 MASP 1/3 억제 조성물은, 예를 들어, 관주법, 유리체내 주사, 또는 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 적용에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP 1, MASP 3, 또는 MASP 1/3 억제제는 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 대상체에게 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 나이-관련 황반 변성로 고통받고 있는 대상체에서 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, 필요로 하는 대상체에게 MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3 또는 MASP1/3 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, LEA-1 및 LEA-2를 개별적으로 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 AMD 환자에서 향상된 치료적 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것들로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP 2 억제 조성물은, 예를 들어, 관주법, 유리체내 주사, 또는 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 국부적 적용에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP 2 억제제는 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비펩타이드성 작용제에 대한 경구 투여에 의해 대상체에게 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 선택적인 MASP 2 억제 조성물의 적용은 AMD의 치료를 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 AMD의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 AMD에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같이 대상체에서 AMD를 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는, AMD로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 AMD로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 대상체에서 AMD를 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1, (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
C. 허혈 재관류 손상에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
조직 허혈은 광범위한 임상적 장애에 대한 기초가 된다. 혈류의 적시적 복원이 허혈성 조직의 보존에 필수적이지만, 자발적으로 또는 치료적 개입을 통해 일어날 수 있는 재관류는 허혈 재관류 (I/R) 손상이라고 불리는 현상인 추가적인 조직 손상으로 이어질 수도 있는 것으로 오랫동안 인식되어 왔다 (Eltzschig, H.K. 및 Tobias, E., Nat. Med. 17:1391-1401, 2011). I/R 손상은 단일 장기, 예컨대 심장 (급성 관상동맥 증후군), 신장 (급성 신장 손상), 내장 (내장 I/R), 및 뇌 (뇌졸중)에 영향을 미칠 수도 있다. I/R 손상은 또한 다수의 장기에 영향을 미칠 수도 있으며, 예컨대 다음 주요 외상 및 소생술 (복합 장기 부전), 순환 정지 (저산소 뇌 손상, 급성 신장 손상), 말초 혈관 질환, 및 겸상 세포 질환 (급성 흉부 증후군, 급성 신장 손상)이 있다. 심장 수술 (심폐 바이패스 이후 급성 심부전), 흉부 수술 (급성 폐 손상), 말초 혈관 수술 (구획 증후군(compartment syndrome)), 혈관 수술 (급성 신장 손상), 및 고형 장기 이식 (급성 이식 장애)을 포함한 대수술은 I/R 손상과 관련이 있을 수도 있다. 현재 I/R 손상을 표적화하는 특이적 요법이 존재하지 않고 허혈 영역에서 조직의 구조를 극대화하고 이러한 공통 설정에서 기능적인 결과를 향상시키기 위해 효과적인 치료법이 필요하다.
I/R 손상의 병리생리는 복잡하고 재관류 이후 강렬한 염증 반응을 특징으로 한다. 보체 시스템의 활성화는 I/R 손상의 중요한 구성요소로서 관련이 있고 보체 활성의 억제는 다양한 동물 모델에서 효과적이었다 (Diepenhorst, G.M.P. et al., Ann. Surg. 249:889-899, 2009). I/R 손상에서 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로의 상대적 중요성은 대체로 불확실하고 영향을 받는 장기에 따라 달라질 수도 있다. 최근에 특이적 보체 단백질 및 경로-특이적 억제자가 결핍된 넉아웃 마우스의 이용 가능성은 I/R 손상에서 렉틴 및 대체 경로와 관련된 데이터를 생성하였다.
위장 I/R 손상에 있어서 대체 경로의 역할은 인자 D-결핍 (-/-) 및 이형 접합성 (+/-) 마우스를 사용하여 연구되었다 (Stahl, G.L., et al. Am. J. Pathol. 162:449-455, 2003). 일과성 위장 허혈 이후, 장 및 폐 손상이 이형 접합성 마우스와 비교하여 감소되었지만 인자 D-결핍 마우스에서는 방지되지 않았고, 인자 D (-/-) 마우스로의 인간 인자 D의 추가는 I/R 손상을 회복시켰다. 같은 모델이 C1q-결핍 및 MBL-A/C-결핍 마우스에서 평가되었고 그 결과는 위장 I/R 손상이 C1q 및 고전적 경로 활성화에 독립적이지만, MBL 및 렉틴 경로 활성화가 장 손상에 필요하다는 것을 나타냈다 (Hart, M.L., et al. J. Immunol. 174:6373-6380, 2005). 반대로, 고전적 경로의 C1q 인식 분자가 장 I/R 후 폐 손상의 원인이었다 (Hart, M.L., et al. J. Immunol. 174:6373-6380, 2005). 하나의 가설은 I/R 손상 중 보체의 활성화가 허혈성 (정상 조직은 그렇지 않음) 조직의 표면 상에 존재하는 자가-항원에 결합하는 천연 IgM, 예를 들어 비-근육 마이오신 중쇄 II형을 통해 일어난다는 것이다. 마우스 위장 I/R 손상 모델에서, 소화관(gut) 조직의 면역복합체는 고전적 경로 (C1q), 렉틴 경로 (MBL), 또는 대체 경로 (인자 B)의 시작 인자의 존재에 대하여 평가되었다 (Lee, H., et al., Mol. Immunol. 47:972-981, 2010). 그 결과는 이들 면역복합체에서 C1q 및 MBL이 검출되는 반면 인자 B는 검출되지 않았다는 것을 나타냈으며, 대체 경로가 아니라 고전적 경로 및 렉틴 경로의 개입을 나타낸다. 동일한 모델에서, 인자 B-결핍 마우스는 국소적 조직 손상으로부터 보호되지 않았으며, 대체 경로의 개입의 결여에 대하여 추가적인 지지를 제공한다. 위장 I/R 손상에서 렉틴 경로의 역할은 MASP-2-결핍 마우스에서 직접 평가되었고 그 결과는 야생형 대조군과 비교하여 이들 마우스에서 위장 손상이 감소되었다는 것을 나타냈다; MASP-2 단클론성 항체로의 처리는 유사하게 보호적이었다 (Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011). 종합해보면, 이 결과들은 위장 I/R 손상에서 렉틴 경로의 개입에 대하여 지지를 제공하며, 대체 경로의 개입에 관한 데이터는 상충된다.
마우스 심근 I/R 손상 모델에서, MBL-결핍 마우스가 심근 손상으로부터 보호되는 반면 C1q-결핍 및 C2/fB-결핍 마우스는 보호되지 않기 때문에 렉틴 경로에 대한 병원성 역할이 입증되었다 (Walsh, M.C. et al., J. Immunol. 175:541-546, 2005). 심근 I/R 손상으로부터의 보호는 또한 MASP-2-결핍 마우스에서 관찰되었다 (Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011). 래트 MBL에 대한 단클론성 항체로의 심근 I/R 모델의 래트의 처리는 허혈 후 재관류 손상을 감소시켰다 (Jordan, J.E., et al., Circulation 104:1413 18, 2001). 혈관 형성술(angioplasty)로 치료된 심근 경색 환자의 연구에서, MBL 결핍은 MBL-충분 대응물과 비교하여 감소된 90일 사망률과 관련이 있었다 (M Trendelenburg et al., Eur Heart J. 31:1181, 2010). 또한, 혈관 형성술 이후 심장 기능 장애(cardiac dysfunction)에 걸린 심근 경색 환자는 기능적으로 회복된 환자와 비교하여 대략 ~3배 더 높은 MBL 수준을 갖는다 (Haahr-Pedersen S., et al., J Inv Cardiology, 21:13, 2009). MBL 항체는 또한 시험관 내에서 산화 스트레스 후 내피 세포 상의 보체 침착을 감소시키며 심근 I/R 손상에서 렉틴 경로에 대한 역할을 나타낸다 (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549 56, 2000). I/R 손상의 마우스 이소성 동종 이식 심장 이식 모델에서, 대체 경로의 역할은 경로-특이적 융합 단백질 CR2-fH를 사용하여 연구되었다 (Atkinson, C., et al., J. Immunol. 185:7007-7013, 2010). 이식 직후 CR2-fH의 전신 투여는 모든 보체 경로를 억제하는 CR2-Crry로의 처리와 비슷한 정도로 심근 I/R 손상을 감소시켰으며, 대체 경로가 이 모델에서 핵심적으로 중요하다는 것을 나타낸다.
신장 I/R 손상의 마우스 모델에서, 대체 경로는 인자 B-결핍 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 신장 기능 감소 및 관 손상으로부터 보호된다는 점에서 관련이 있다 (Thurman, J.M., et al., J. Immunol. 170:1517-1523, 2003). 인자 B에 대한 억제 단클론성 항체로의 처리는 보체 활성화를 방지하고 쥐 신장 I/R 손상을 감소시켰다 (Thurman, J.M., et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:707-715, 2006). 쌍방 신장 I/R 손상 모델에서, MBL-A/C-결핍 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 신장 손상으로부터 보호되었고 재조합 인간 MBL은 MBL-A/C-결핍 마우스에서 보호 효과를 반전시켰으며, 이 모델에서 MBL에 대한 역할과 관련이 있다 (Moller-Kristensen, M., et al., Scand. J. Immunol. 61:426-434, 2005). 래트 일방 신장 I/R 손상 모델에서, MBL-A에 대한 단클론성 항체로의 MBL의 억제는 I/R 후 신장 기능을 보존하였다 (van der Pol, P., et al., Am. J. Transplant. 12:877-887, 2010). 흥미롭게도, 이 모델에서 MBL의 역할은 C5 항체로의 처리가 신장 손상을 방지하는데 있어서 효과가 없기 때문에, 말단 보체 구성요소의 활성화를 수반하는 것으로 보이지 않았다. 대신에, MBL은 시험관 내에서 MBL과 함께 인큐베이션된 인간 근위 관형 세포가 MBL을 내재화하며 그 이후 세포 아폽토시스를 유도하기 때문에, 관형 세포에 대하여 직접적인 독성 효과를 나타내는 것으로 보였다. 신장 I/R의 돼지 모델에서, Castellano G. et al. (Am J Pathol, 176(4):1648-59, 2010)은 고전적 경로에서 C1r 및 C1s 프로테아제 및 또한 렉틴 경로의 MBL 복합체에서 MASP-1 및 MASP-2 프로테아제를 비가역적으로 비활성화시키는 C1 억제자를 테스트하였고, 관 주위 모세혈관 및 사구체에서 보체 침착을 감소시키고 관 손상을 감소시킨다는 것을 발견하였다.
대체 경로는 인자 B-결핍 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 혈청 C5a 수준에 의해 측정된 바와 같이 전신 보체 활성화를 감소시켰고 외상 후 신경세포 사멸을 감소시켰기 때문에 실험적 외상성 뇌 손상에 수반된 것으로 보인다 (Leinhase, I., et al., BMC Neurosci. 7:55-67, 2006). 인간 뇌졸중에서, 보체 구성요소 C1q, C3c, 및 C4d는 면역조직학적 염색에 의해 허혈성 병소에서 검출되었으며, 고전적 경로를 통한 활성화를 시사한다 (Pedersen, E.D., et al., Sc및. J. Immunol. 69:555-562, 2009). 뇌 허혈의 동물 모델에서 고전적 경로의 표적화는 여러 종류의 결과를 수득하였으며, 일부 연구에서는 보호를 입증하였지만 다른 연구에서는 아무런 이점을 나타내지 못했다 (Arumugam, T.V., et al., Neuroscience 158:1074-1089, 2009). 실험 및 임상 연구는 렉틴 경로 개입에 대한 강력한 증거를 제공하였다. 실험적 뇌졸중 모델에서, MBL 또는 MASP-2의 결핍은 야생형 마우스와 비교하여 경색 크기를 감소시켰다 (Cervera A, et al.; PLoS One 3;5(2):e8433, 2010; Osthoff M. et al., PLoS One, 6(6):e21338, 2011). 또한, MBL의 수준이 낮은 뇌졸중 환자는 MBL-충분 대응물과 비교하여 더 양호한 예후를 나타낸다 (Osthoff M. et al., PLoS One, 6(6):e21338, 2011).
심폐 바이패스의 개코원숭이 모델에서, 인자 D 단클론성 항체로의 처리는 C3a, sC5b-9, 및 IL-6의 혈장 수준으로 측정된 바와 같이 전신성 염증을 억제하였고, 심근 조직 손상을 감소시켰으며, 이 모델에서 대체 경로의 개입을 나타낸다 (Undar, A., et al., Ann. Thorac. Surg. 74:355-362, 2002).
따라서, I/R에 의해 영향을 받은 장기에 따라서, 세 가지 보체 경로 모두는 발병 및 해로운 결과에 기여할 수 있다. 상기 상세히 설명된 실험 및 임상 결과에 기초하여, LEA-2 억제자는 대부분의 I/R 설정에서 보호적인 것으로 예상된다. LEA-1의 렉틴-의존적 활성화는 적어도 일부 설정에서는 대체 경로를 통한 보체 활성화를 유발할 수도 있다. 이에 더하여, LEA-2-시작된 보체 활성화는 대체 경로 증폭 루프에 의해 더 증폭되며 따라서 I/R-관련된 조직 손상을 악화시킬 수도 있다. 따라서, LEA-1 억제자는 허혈-관련된 병태로 고통받고 있는 환자에서 추가적인 또는 상호 보완적인 치료적 이점을 제공할 것으로 예상된다.
상기를 고려하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 허혈-재관류 관련 병태를 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 나타낼 것으로 예상된다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있다. 그러므로 I/R-관련된 병태에 대한 최적의 효과적인 치료는, 단독으로 또는 조합으로, LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 차단하는 활성 약학적 성분을 포함한다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA-2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 우선적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 차단할 수 있는 이중 특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 약학적 담체 중의 MASP 1 억제제, MASP 3 억제제, 또는 MASP 1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 허혈성 재관류를 겪고 있는 대상체에게 투여함으로써 허혈 재관류 손상을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP 1, MASP 3, 또는 MASP 1/3 억제 조성물은 동맥내, 정맥내, 두개내, 근육내, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 및 잠재적으로는 비펩타이드성 억제자에 대하여 경구로, 및 가장 적합하게는 동맥내 또는 정맥내 투여에 의해 대상체에게 투여될 수도 있다. 본 발명의 LEA-1 억제 조성물의 투여는 적합하게는 허혈 재관류 이벤트 직후 또는 허혈 재관류 이벤트 이후 가능한 빠르게 시작된다. 재관류가 제어된 환경에서 (예를 들어, 대동맥류 회복, 장기 이식 또는 절단되거나 외상을 입은 사지 또는 손발가락의 재유착술 후) 일어나는 경우에, LEA-1 억제제는 재관류 전에 및/또는 동안에 및/또는 후에 투여될 수도 있다. 투여는 최적의 치료 효과를 위해 의사에 의해 결정된 바에 따라 주기적으로 반복될 수도 있다.
일부 구체예에서, 방법은 대동맥류 회복, 심폐 바이패스, 장기 이식 및/또는 손발/사지 재식과 관련된 혈관 재문합(reanastomosis), 뇌졸중, 심근 경색, 및 충격 및/또는 수술 절차 이후 혈류 역학 소생술 중 적어도 하나와 관련된 허혈-재관류 손상을 치료하거나 예방하는데 사용된다.
일부 구체예에서, 방법은 장기 이식을 겪게 될, 겪고 있는, 또는 겪은 대상체에서 허혈-재관류 손상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 방법은 장기 이식을 겪게 될, 겪고 있는, 또는 겪은 대상체에서 허혈-재관류 손상을 치료하거나 예방하는데 사용되며, 단 장기 이식이 신장 이식은 아니다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 허혈성 재관류를 경험하고 있는 대상체에서 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, 대상체에게 MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 허혈 재관류 손상을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 갖는 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1을 특이적으로 인식하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP 2 억제 조성물은 동맥내, 정맥내, 두개내, 근육내, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 및 잠재적으로는 비펩타이드성 억제자에 대하여 경구로, 및 가장 적합하게는 동맥내 또는 정맥내 투여에 의해 필요로 하는 대상체에게 투여될 수도 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 투여는 적합하게는 허혈 재관류 이벤트 직후 또는 허혈 재관류 이벤트 이후 가능한 빠르게 시작된다. 재관류가 제어된 환경에서 (예를 들어, 대동맥류 회복, 장기 이식 또는 절단되거나 외상을 입은 사지 또는 손발가락의 재유착술 후) 일어나는 경우에, MASP-2 억제제는 재관류 전에 및/또는 동안에 및/또는 후에 투여될 수도 있다. 투여는 최적의 치료 효과를 위해 의사에 의해 결정된 바에 따라 주기적으로 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 선택적인 MASP 2 억제 조성물의 적용은 허혈 재관류 손상의 치료 또는 예방을 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 허혈성 재관류를 겪고 있는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, 허혈성 재관류를 겪고 있는 대상체에서 AP-관련된 질환 또는 병태에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 개시된 바와 같이 대상체에서 허혈-재관류와 관련된 조직 손상을 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는, 허혈-재관류로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
D. 염증성 및 비-염증성 관절성 피진에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
류머티스성 관절염 (RA)는 전신성 징후를 나타낼 수도 있는 활막 관절의 만성 염증 질환이다. RA는 세계 인구의 대략 1%에 영향을 미치며, 여성이 피해를 입을 가능성이 2배 내지 3배 더 크다. 관절 염증은 붓기, 통증, 및 뻣뻣함으로 나타난다. 질환이 진행됨에 따라 관절 미란(erosion) 및 파괴가 일어나서 운동 범위 손상 및 변형을 유발할 수 있다. RA의 치료 목적은 관절 손상의 예방 또는 제어, 관절 기능 상실 및 질환 진행의 예방, 증상의 경감 및 삶의 질 향상, 및 무약물 완화 달성을 포함한다. RA의 약리학적 치료는 질환-완화 항류머티스제 (DMARD), 진통제, 및 항염증제 (글루코코르티코이드 및 비-스테로이드성 항염증제)를 포함한다. DMARD는 비가역적인 관절 파괴의 내구성 완화를 유도하고 그 진행을 지연 또는 중단시킬 수 있기 때문에 가장 중요한 치료법이다. 전통적인 DMARD는 소분자, 예컨대 메토트렉세이트, 설파살라진, 하이드록시클로로퀸, 금염, 레플루노미드, D-페니실라민, 사이클로스포린, 및 아자티오프린을 포함한다. 전통적인 DMARD가 질환을 제어하기에 불충분한 경우 염증 세포 또는 매개자를 표적화하는 여러 생물학적 작용제, 예컨대 종양 괴사 인자 억제자 (에타너셉트, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리쥬맙 페골, 및 골리무맙), 사이토카인 안타고니스트 (아나킨라 및 토실리쥬맙), 리툭시맙, 및 아바타셉트가 이용 가능한 치료 옵션이 된다.
적응성 면역이 T-세포 활성화 유전자와의 유전적 연관성 및 자가 항체의 존재에 의해 입증된 바와 같이 RA 발병에 대하여 명백하게 중심에 있지만, 선천적 면역 메커니즘이 또한 관련이 있다 (McInnes, I.B. 및 Schett, G. New Engl. J. Med. 365:2205-2219, 2011). 인간 RA에서, 대체 경로 분열 단편 Bb의 활액 수준은 결정성(crystal-induced) 관절염 또는 퇴행성 관절 질환을 앓고 있는 환자의 샘플보다 몇 배 더 높으며, RA 환자에서 대체 경로의 우선적인 활성화와 관련이 있다 (Brodeur, J.P., et al., Arthritis Rheum. 34:1531-1537, 1991). 관절염의 실험적 항-II형 콜라겐 항체-수동적 전달 모델에서, 인자 B-결핍 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 염증 및 관절 손상을 감소시킨 반면, C4-결핍 마우스는 야생형 마우스와 유사한 질환 활성을 나타냈으며, 이 모델에서 고전적 경로가 아니라 대체 경로가 필요하다는 것을 나타낸다 (Banda, N.K. et al., J. Immunol. 177:1904-1912, 2006). 콜라겐 항체-유도성 관절염 (CAIA)의 동일한 실험 모델에서, 고전적 경로 활성 또는 렉틴 경로 활성 중 하나만을 가지고 있는 마우스는 관절염에 걸리지 않는다 (Banda, N.K. et al., Clin. Exp. Immunol. 159:100-108, 2010). 이 연구의 데이터는 고전적 경로 또는 렉틴 경로가 시험관 내에서 낮은 수준의 C3을 활성화시킬 수 있다는 것을 시사하였다. 하지만, 대체 경로 증폭 루프의 부재시, C3의 관절 침착 수준은 임상 질환을 생산하는데 불충분하였다. 대체 경로의 활성화에서 핵심 단계는 성숙한 인자 D로의 인자 D의 치모겐 (프로-인자 D)의 전환이며, 이것은 MASP-1 및/또는 MASP-3 (Takahashi, M., et al., J. Exp. Med. 207:29-37, 2010) 및/또는 HTRA1 (Stanton et al., Evidence That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration, presented at The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2011 conference on May 4, 2011)에 의해 매개된다. MASP-1/3의 역할이 쥐 CAIA에서 평가되었고 그 결과는 MASP-1/3 결핍 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 관절염으로부터 보호된다는 것을 보여주었다 (Banda, N.K., et al., J. Immunol. 185:5598-5606, 2010). MASP-1/3-결핍 마우스에서, CAIA의 진화 동안에 성숙한 인자 D가 아니라 프로-인자 D가 혈청에서 검출되었고, 인간 인자 D의 추가는 시험관 내에서 이 마우스들의 혈청을 사용하여 C3 활성화 및 C5a 생성을 복원하였다. 그에 반해, 관절염의 효과기 단계의 쥐 모델에서, C3-결핍 마우스는 WT 마우스와 비교하여 매우 경증의 관절염에 걸린 한편 인자 B-결핍 마우스는 여전히 관절염에 걸렸으며, 고전적/렉틴 경로 및 대체 경로 둘 다의 독립적인 기여를 나타낸다 (Hietala, M.A. et al., Eur. J. Immunol. 34:1208-1216, 2004). 염증성 관절염의 K/BxN T 세포 수용체 트랜스제닉 마우스 모델에서, C4 또는 C1q가 없는 마우스는 야생형 마우스와 유사하게 관절염에 걸린 반면 인자 B가 없는 마우스는 관절염에 걸리지 않거나 경증 관절염에 걸렸으며, 이 모델에서 고전적 겨올가 아니라 대체 경로가 필요하다는 것을 입증한다 (Ji H. et al., Immunity 16:157-168, 2002). K/BxN 모델에서, MBL-A가 없는 마우스는 혈청-유도된 관절염으로부터 보호되지 않았지만, MBL-C의 역할이 연구되지 않았기 때문에, 렉틴 경로에 대한 잠재적인 역할은 제거될 수 없었다 (Ji et al., 2002, supra).
두 조사군은 독립적으로 렉틴-의존적 보체 활성화가 RA 환자에서 MBL과 특이적인 IgG 당형태의 상호작용을 통해 염증을 촉진한다는 것을 제안하였다 (Malhotra et al., Nat. Med. 1:237 243, 1995; Cuchacovich et al., J. Rheumatol. 23:44 51, 1996). 류머티스성 병태는 분자의 Fc 영역에서 갈락토오스가 없는 IgG 당형태 (IgG0 당형태라고 불림)의 현저한 증가와 연관성이 있다 (Rudd et al., Trends Biotechnology 22:524 30, 2004). IgG0 당형태의 퍼센트는 류머티스성 병태의 질환 진행에 따라 증가하고, 환자가 완화되면 정상으로 되돌아간다. 생체 내에서, IgG0은 활액 조직 상에 침착되고 MBL은 RA에 걸린 개체의 활액에서 증가된 수준으로 존재한다. RA와 관련된 응집 아갈락토실 IgG (IgG0)은 MBL에 결합할 수 있으며 그러므로 LEA-1 및/또는 LEA-2를 통해 렉틴-의존적 보체 활성화를 시작할 수 있다. 또한, RA 환자의 MBL의 대립 유전자 변이체를 검토하는 임상 연구의 결과는 MBL이 질환에서 염증을 향상시키는 역할을 할 수도 있다는 것을 시사한다 (Garred et al., J. Rheumatol. 27:26 34, 2000). 그러므로, LEA-1 및/또는 LEA-2를 통한 렉틴-의존적 보체 활성화는 RA의 발병에서 중요한 역할을 할 수도 있다.
보체 활성화는 또한 소아 류머티스성 관절염에서 중요한 역할을 한다 (Mollnes, T.E., et al., Arthritis Rheum. 29:1359 64, 1986). 성인 RA와 유사하게, 소아 류머티스성 관절염에서, C4d (고전적 또는 LEA-2 활성화에 대한 마커)와 비교하여 대체 경로 보체 활성화 생성물 Bb의 높아진 혈청 및 활액 수준은 보체 활성화가 대부분 LEA-1에 의해 매개된다는 것을 나타낸다 (El Ghobarey, A.F. et al., J. Rheumatology 7:453 460, 1980; Agarwal, A., et al., Rheumatology 39:189 192, 2000).
유사하게, 보체 활성화는 건선성 관절염에서 중요한 역할을 한다. 이러한 병태에 걸린 환자는 순환에서 보체 활성화 생성물이 증가되고, 그들의 적혈구 세포는 더 낮은 수준의 보체 조절자 CD59를 나타내는 것으로 보인다 (Triolo,. Clin Exp Rheumatol., 21(2):225-8, 2003). 보체 수준은 질환 활성과 연관이 있고, 치료 결과를 결정하기 위한 높은 예측치를 나타낸다 (Chimenti at al., Clin Exp Rheumatol., 30(1):23-30, 2012). 실제로, 최근의 연구는 이 병태에 대한 항-TNF 요법의 효과가 보체 조절로 인한 것임을 시사한다 (Ballanti et al., Autoimmun Rev., 10(10):617-23, 2011). 건선성 관절염에서 보체의 정확한 역할이 결정되지 않았지만, 이 환자들의 순환에서 C4d 및 Bb 보체 활성화 생성물의 존재는 발병에 있어서의 중요한 역할을 시사한다. 관찰된 생성물에 근거하여, LEA-1, 및 아마도 LEA-2 또한 이 환자들에게 병리학적 보체 활성화의 원인이 있다고 생각된다.
골관절염 (OA)은 가장 일반적인 형태의 관절염이며, 미국에서 2500만명의 사람들에서 발병하였다. OA는 통증, 뻣뻣함, 관절 기능의 상실, 및 장애를 유도하는, 신생 골 형성 및 활액 증식을 동반한 관절 연골의 고장 및 궁극적 손실을 특징으로 한다. OA에 의해 빈번하게 영향을 받는 관절은 손, 목, 등 아래 부분, 무릎 및 엉덩이이다. 질환은 진행성이고 현재의 치료법은 증상성 통증 경감을 위한 것이며 질환의 자연사를 변화시키지 않는다. OA의 발병은 불확실하지만, 보체에 대한 역할과 관련이 있다. OA에 걸린 환자의 활액의 단백질체학 및 전사체학 분석에서, 건강한 개체의 샘플과 비교하여 고전적 경로 (C1s 및 C4A) 및 대체 경로 (인자 B), 및 또한 C3, C5, C7, 및 C9를 포함한 보체의 여러 구성요소가 비정상적으로 발현된다 (Wang, Q., et al., Nat. Med. 17:1674-1679, 2011). 더욱이, 내측 반월판 절제술(medial meniscectomy)에 의해 유도된 OA의 마우스 모델에서, C5-결핍 마우스는 C5-양성 마우스보다 연골 손실, 골증식체(osteophyte) 형성 및 활막염(synovitis)이 더 적고, 야생형 마우스에 대체 경로를 억제하는 융합 단백질인 CR2-fH로의 처리는 OA의 발병을 약화시켰다 (Wang et al., 2011 supra).
로스 리버 바이러스 (Ross River virus; RRV) 및 치쿤군야 바이러스 (chikungunya virus; CHIKV)는 인간에서 급성 및 지속성 관절염 및 근염(myositis)을 유발할 수 있는, 모기를 통해 감염되는(mosquito-borne) 바이러스의 군에 속한다. 풍토병을 유발하는 것 외에도, 이들 바이러스는 수백만 명의 감염된 개체를 수반하는 전염병을 유발할 수 있다. 관절염은 관절에서 바이러스 복제 및 숙주 염증 반응의 유도에 의해 시작되는 것으로 생각되고 보체 시스템은 이 과정에서 핵심 구성요소로서 적용되었다. RRV-유도된 다발성 관절염(polyarthritis)에 걸린 인간의 활액은 OA에 걸린 인간의 활액보다 더 높은 수준의 C3a를 함유한다 (Morrison, T.E., et al., J. Virol. 81:5132-5143, 2007). RRV 감염의 마우스 모델에서, C3-결핍 마우스는 야생형 마우스보다 중증 관절염에 덜 걸렸으며, 보체의 역할과 관련이 있다 (Morrison et al., 2007, supra). 수반된 특이적 보체 경로가 조사되었고 비활성화된 렉틴 경로를 가진 마우스 (MBL-A-/- 및 MBL-C-/-)는 야생형 마우스와 비교하여 관절염이 약화되었다. 그에 반해, 비활성화된 고전적 경로 (C1q-/-) 또는 대체 경로 (인자 B-/-)를 가진 마우스는 중증 관절염에 걸렸으며, 이 모델에서 MBL에 의해 시작된 렉틴 경로가 필수적인 역할을 하였다는 것을 나타낸다 (Gunn, B.M., et al., PLoS Pathog. 8:e1002586, 2012). 관절성 피진이 관절에 대한 손상을 수반하기 때문에, 다양한 병인에 의해 유발된 초기 관절 손상은 LEA-2를 통한 보체 활성화의 2차적인 파동을 촉발시킬 수도 있다. 이 개념을 지지하며, 발명자들의 이전 연구는 RA의 콜라겐-유도된 모델에서 MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 비교하여 관절 손상을 감소시켰다는 것을 입증하였다.
상기 상세히 설명된 증거 자료를 고려하여, EA-1 및 LEA-2 억제자는, 단독으로 또는 조합으로, 관절성 피진의 치료에 치료적으로 유용할 것으로 예상된다. 그러므로 관절성 피진에 최적으로 효과적인 치료는, 단독으로 또는 조합으로, LEA-1 및 LEA-2 둘 다를 차단할 수 있는 활성 약학적 성분을 포함할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 우선적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하여 이것들을 차단할 수 있는 이중 특이성 항체에 포함될 수도 있다. 그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP 1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 염증성 또는 비-염증성 관절성 피진으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여함으로써, 골관절염, 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염 및 건선성 관절염을 포함하는 염증성 또는 비-염증성 관절성 피진을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP 1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 대안으로, 루트는 국소적 전달, 예컨대 관절내 주사에 의해서 이루어질 수도 있다. LEA-1 억제제는 만성 병태의 치료 또는 제어를 위해 연장된 기간 동안 주기적으로 투여될 수 있거나, 또는 관절에 수행된 수술 절차를 포함한, 급성 외상 또는 손상 이전, 동안 및/또는 이후의 기간에 단일 또는 반복 투여에 의해 이루어질 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 대상체에게 MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP1/3 억제제의 치료적 유효량을 투여함으로써 염증 또는 비-염증성 관절성 피진 (골관절염, 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염 및 건선성 관절염 포함)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 관절성 피진을 치료하거나 예방하는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 갖는 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 갖는 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제 조성물은 필요로 하는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로는 비펩타이드성 억제자에 대하여 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 대안으로, 투여는 국소적 전달, 예컨대 관절내 주사에 의해 이루어질 수도 있다. MASP-2 억제제는 만성 질환의 치료 또는 제어를 위해 연장된 기간 동안 주기적으로 투여될 수 있거나, 또는 관절에 수행된 수술 절차를 포함한, 급성 외상 또는 손상 이전, 동안 및/또는 이후의 기간에 단일 또는 반복 투여에 의해 이루어질 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 선택저 MASP 2 억제 조성물의 적용은 염증 또는 비-염증성 관절성 피진을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중-억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 염증 또는 비-염증성 관절성 피진으로 고통받고 있는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 관절염에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 관절염 (염증성 및 비-염증성 관절성 피진)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 대상체에서 관절염을 치료하거나 또는 이것의 위험을 감소시키기 위해 본원에서 개시된 바와 같이 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 골관절염, 류머티스성 관절염, 소아 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 베체트 병, 감염-관련 관절염 및 건선성 관절염으로 구성된 군으로부터 선택된 관절염으로 고통받고 있다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 전신으로 (즉, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 동맥내로 또는 흡입제로서) 투여된다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 관절에 국소적으로 투여된다.
E. 파종성 혈관내 응고 (DIC)에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
파종성 혈관내 응고 (DIC)는 임상적으로 출혈 및/또는 혈전증으로 나타날 수 있는 응고 시스템의 과잉자극의 증후군이다. DIC는 1차 병태로서 발생하는 것이 아니라 조직 손상 (외상, 화상, 열사병, 수혈 반응, 급성 이식 거부반응), 종양 형성, 감염, 산과 병태 (전치 태반(placenta previa), 양수 색전(amniotic fluid embolism), 임신 중독증(toxemia of pregnancy)), 및 잡다한 병태, 예컨대 심인성 쇼크(cardiogenic shock), 익수(near drowning), 지방 색전증(fat embolism), 대동맥류를 포함한 다양한 질환 과정에 관련하여 발생한다. 혈소판 감소증(Thrombocytopenia)은 중환자실 내 환자의 빈번한 이상이며, 발병률은 35% 내지 44%이고, DIC는 이 사례들 중 약 25%의 병인이며, 즉, DIC는 중환자 중 대략 10%에서 발생한다 (Levi, M. 및 Opal, S.M. Crit. Care 10:222-231, 2006). DIC의 병리생리학은 근본적인 질환 과정이 생리학적 응고 반응을 시작하는 것이다. 하지만, 부혈전 물질은 정상적인 카운터밸런싱(counterbalancing) 메커니즘을 압도하며, 이로써 미세순환에서 피브린 및 혈소판이 부적절하게 침착되어, 장기 허혈, 저피브리노겐혈증(hypofibrinogenemia), 및 혈소판 감소증을 유도한다. DIC의 진단은 실험실 파라미터 (프로트롬빈 시간, 부분 트롬보플라스틴 시간, 피브린 분해 생성물, D-다이머, 또는 혈소판 수)의 이상과 함께, 적절한 근본적인 병 또는 과정에서의 임상적인 표현에 기초한다. DIC의 1차 치료는 원인이 되는 트리거(trigger)인 근본적인 병태를 해결하는 것이다. 적혈구 세포, 혈소판, 신선 냉동 혈장, 및 한랭침전물의 형태의 혈액 생성물 지지체가 임상 합병증을 치료하거나 예방하는데 필요할 수도 있다.
DIC에서 보체 경로의 역할이 여러 연구에서 조사되었다. 보체 활성화는 뇌척수막염균 감염된 소아 환자에서 평가되었으며 MBL 유전자형에 관한 임상 경과를 비교한다 (Sprong, T. et al., Clin. Infect. Dis. 49:1380-1386, 2009). 병원에 입원시, MBL 결핍된 환자는 MBL-충분 환자보다 C3bc, 말단 보체 복합체, C4bc, 및 C3bBbP의 낮은 순환 수준을 나타냈으며, 더 낮은 정도의 공통 보체, 말단 보체, 및 대체 경로 활성화를 나타낸다. 또한, DIC 및 MBL-결핍 환자의 질환 심각도 및 파라미터와 관련된 전신 보체 활성화의 정도는 MBL-충분 환자보다 더 경증의 임상 경과를 나타냈다. 그러므로, MBL 결핍은 감염에 대한 민감성의 위험 인자이지만, 패혈성 쇼크 중에 MBL 결핍은 더 낮은 질환 심각도와 관련이 있을 수도 있다.
본원에서 실시예 1-4에서 입증된 바와 같이, 실험 연구는 뇌척수막염균 감염의 병인체인 네이세리아 메닝기티디스에 대한 선천적 면역 반응에서 MBL 및 MASP-1/3의 중요한 기여를 강조하였다. 마우스 또는 인간의 MBL-결핍 혈청, MASP-3 결핍 인간 혈청, 또는 MASP-1/3 넉아웃 마우스는 시험관 내에서 보체를 활성화시키고 뇌척수막염균을 용해시키는데 야생형 혈청과 비교하여 덜 효과적이다. 유사하게, 나이브 MASP-1/3 넉아웃 마우스는 야생형 대응물보다 네이세리아 감염에 더 민감하다. 따라서, 적응성 면역의 부재시, LEA-1 경로는 네이세리아 감염에 대한 선천적-숙주 저항성에 기여한다. 반대로, LEA-1은 DIC를 포함한, 해로운 숙주 반응을 촉발시키는 병리학적 보체 활성화를 증가시킨다.
동맥 혈전증의 쥐 모델에서, MBL-널(null) 및 MASP-1/-3 넉아웃 마우스는 야생형 또는 C2/인자 B-널 마우스와 비교하여 FeCl3-유도된 혈전 형성을 감소시켰고, 결함은 재조합 인간 MBL로 복원되었다 (La Bonte, L.R., et al., J. Immunol. 188:885-891, 2012). 시험관 내에서, MBL-널 또는 MASP-1/-3 넉아웃 마우스 혈청은 야생형 또는 C2/인자 B-널 마우스 혈청과 비교하여 트롬빈 기질 분열을 감소시켰고; 재조합 인간 MASP-1의 추가는 MASP-1/-3 넉아웃 마우스 혈청의 트롬빈 기질 분열을 회복시켰다 (La Bonte et al., 2012, supra). 이 결과들은 MBL/MASP 복합체, 특히 MASP-1이 혈전 형성에 핵심 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, LEA-1은 DIC를 포함한 병리학적 혈전증에서 중요한 역할을 할 수도 있다.
실험 연구는 병리학적 혈전증에서 LEA-2에 대한 동등하게 중요한 역할을 확립하였다. 시험관 내 연구는 LEA-2이 보체 시스템 및 응고 시스템 사이의 분자적 연결을 제공한다는 것을 더 입증한다. MASP-2는 인자 Xa-유사 활성을 갖고 분열을 통해 프로트롬빈을 활성화시켜 트롬빈을 형성하며, 그 이후 피브리노겐을 제거하고 피브린 혈전 형성을 촉진시킬 수 있다 (Krarup et al., PLoS One, 18:2(7):e623, 2007 참조).
별개의 연구에서 렉틴-MASP 복합체는 MASP-2 의존적 과정에서 혈전 형성, 피브린 침착 및 피브리노펩타이드 방출을 촉진시킬 수 있는 것으로 나타났다 (Gulla et al., Immunology, 129(4):482-95, 2010). 따라서, LEA-2는 보체 시스템 및 응고 시스템의 동시의 렉틴-의존적 활성화를 촉진시킨다.
시험관 내 연구에서 MASP-1이 트롬빈-유사 활성을 갖고 (Presanis J.S., et al., Mol Immunol, 40(13):921-9, 2004), 피브리노겐 및 인자 XIII를 분열시킨다는 것을 나타냈으며 (Gulla K. C. et la., Immunology, 129(4):482-95, 2010), LEA-1이 독립적으로 또는 LEA-2와 협력하여 응고 경로를 활성화시킬 수도 있다는 것을 시사한다.
상기 상세히 설명된 데이터는 LEA-1 및 LEA-2가 렉틴-의존적 보체 활성화 및 응고 사이의 독립적인 연결을 제공한다는 것을 시사한다. 따라서, 상기 내용을 고려하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 파종성 혈관내 응고로 고통받고 있는 대상체를 치료하는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 일부 구체예에서, 대상체는 패혈증, 외상, 감염 (박테리아, 바이러스, 균류, 기생충), 악성 종양, 이식 거부반응, 수혈 반응, 조산 합병증, 혈관 동맥류, 간부전, 열사병, 화상, 방사선 노출, 쇼크, 또는 중증 독성 반응 (예를 들어, 사교상(snake bite), 곤충자상(insect bite), 수혈 반응)에 부차적인 파종성 혈관내 응고로 고통받고 있다. 일부 구체예에서, 외상은 신경학적 외상이다. 일부 구체예에서, 감염은 박테리아 감염, 예컨대 네이세리아 메닝기티디스 감염이다.
이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있다. LEA-1 및 LEA-2는 둘 다 DIC (예를 들어, 감염 또는 외상)로 이어지는 병태에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있기 때문에, LEA-1- 및 LEA-2-차단제는, 별개로 또는 조합으로, DIC의 치료에서 치료적 유용성을 나타낼 것으로 예상된다. LEA-1 및 LEA-2 차단제는 보체 및 응고 사이에서 상이한 크로스-토크(cross-talk) 메커니즘을 방지할 수도 있다. 따라서 LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 DIC 및 다른 혈전 장애를 예방하는데 있어서, 상보적이고, 부가적이고 시너지적인 효과를 나타낼 수도 있다.
이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중 특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 필요로 하는 대상체에서 파종성 혈관내 응고를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP 3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 파종성 혈관내 응고를 겪고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다. 외상 또는 다른 급성 이벤트에 부차적인 DIC의 치료 또는 예방을 위해서, LEA-1 억제 조성물은 DIC의 위험이 있는 것으로 간주되는 환자에서 외상성 손상 직후에 또는 예방적으로는 외상-유도성 손상 또는 상황, 예컨대 수술 전에, 동안에, 직후에, 또는 1 내지 7일 이상 이내에, 예컨대 24시간 내지 72시간 내에 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, LEA-1 억제 조성물은 적합하게는 속효성(fast acting) 투약 형태로, 예컨대 LEA-1 억제제 조성물을 함유하는 용액의 볼루스(bolus)의 정맥내 또는 동맥내 전달에 의해 투여될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 필요로 하는 대상체에서 파종성 혈관내 응고를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며, 대상체에게 MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 파종성 혈관내 응고를 치료하거나 예방하는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 필요로 하는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다. 외상 또는 다른 급성 이벤트에 부차적인 DIC에 대하여, MASP-2 억제 조성물은 DIC의 위험이 있는 것으로 간주되는 환자에서 외상성 손상 직후에 또는 예방적으로는 외상-유도성 손상 또는 상황, 예컨대 수술 전에, 동안에, 직후에, 또는 1 내지 7일 이상 이내에, 예컨대 24시간 내지 72시간 내에 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제 조성물은 적합하게는 속효성 투약 형태로, 예컨대 MASP-2 억제제 조성물을 함유하는 용액의 볼루스의 정맥내 또는 동맥내 전달에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 선택적인 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 대상체에서 파종성 혈관내 응고를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중-억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 파종성 혈관내 응고를 겪고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 파종성 혈관내 응고에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 파종성 혈관내 응고로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 파종성 혈관내 응고를 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
F. 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (AHUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 포함하는 혈전성 미세혈관증 (TMA)에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
혈전성 미세혈관증 (TMA)은 임상적으로 혈소판 감소증, 미세혈관성 용혈성 빈혈증, 및 가변성 장기 허혈을 특징으로 하는 장애의 군을 말한다. TMA의 특유의 병리학적 특징은 미세동맥 및 미세정맥에서 혈소판 활성화 및 미소혈전의 형성이다. 고전적 TMA는 용혈성 요독성 증후군 (HUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)이다. HUS는 급성 신부전의 존재에 의해 TTP와 구별된다. HUS는 두 가지 형태로 발생한다: 설사-관련 (D+) 또는 전형적 HUS, 및 설사 음성 (D-) 또는 비정형 HUS (aHUS).
HUS
D+HUS는 일반적으로 대장균(Escherichia coli) O157 또는 박테리아의 또 다른 쉬가(Shiga)-독소-생산 균주에 의해 유발되는 전구증상성 설사병과 연관이 있으며, 아동에서 HUS 사례의 90% 초과를 차지하고, 아동의 급성 신부전의 가장 일반적인 원인이다. 대장균 O157로의 인간 감염이 상대적으로 빈번하지만, D+HUS로 진행되는 혈리(bloody diarrhea)의 퍼센트는 산발적 사례에서는 3% 내지 7% 및 일부 발병에서는 20% 내지 30%의 범위에 있었다 (Zheng, X.L. and Sadler, J.E., Annu. Rev. Pathol. 3:249-277, 2008). HUS는 보통 설사의 발병 후 4 내지 6일에 발생하고 아동의 대략 3분의 2가 질환의 급성기에 투석을 필요로 한다. 특이적인 치료가 효과적인 것으로 나타나지 않았기 때문에 D+HUS의 치료가 지지된다. D+HUS의 예후는 호의적이며, 대부분의 환자는 신장 기능을 회복한다.
D+HUS의 발병은 미세 혈관 내피 세포, 단핵구, 및 혈소판 상의 막에 결합하는 박테리아-생산된 쉬가 독소를 수반한다. 신장의 미소혈관계가 가장 빈번하게 영향을 받는다. 결합 후, 독소는 내재화되어, 전염증성 매개자의 방출 및 궁극적으로는 세포사로 이어진다. 내피 세포 손상은 응고 캐스케이드의 활성화를 촉진함으로써 신장 미세 혈관 혈전증을 촉발시키는 것으로 생각된다. D+HUS에서 보체 시스템의 활성화에 대한 증거가 존재한다. D+HUS에 걸린 아동에서, Bb 및 SC5b-9의 혈장 수준은 정상 대조군과 비교하여 입원시 증가되었고, 퇴원 후 제28 일에 혈장 수준이 정상화되었다 (Thurman, J.M. et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 4:1920-1924, 2009). 쉬가 독소 2 (Stx2)는 활성화가 고전적 경로를 차단하는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산의 존재시 진행됨에 따라 시험관 내에서 유체상에서 대부분 대체 경로를 통해 인간 보체를 활성화시킨다는 것이 발견되었다 (Orth, D. et al., J. Immunol. 182:6394-6400, 2009). 또한, Stx2는 세포 표면 상에서 인자 I가 아니라 인자 H에 결합하였지만 이에 결합하지 않았고, 인자 H의 보조 인자 활성을 지연시켰다 (Orth et al, 2009, supra). 이 데이터들은 쉬가 독소가 직접적인 독성 효과를 포함한 다수의 잠재적인 메커니즘을 통해, 및 보체 활성화 또는 보체 조절자의 억제를 통해 간접적으로 신장 손상을 유발할 수도 있다는 것을 시사한다. 관 내피세포층에 대한 독성 효과는 LEA-2를 통해 보체를 활성화시킬 컷으로 예상되며, Schwaeble, W.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7523-7528, 2011에서 기술된 바와 같이 다양한 혈관상(vascular bed)에서 보체-매개된 재관류 손상을 예방하는데 있어서 MASP-2 차단의 효과에 의해 입증된 바와 같다.
쉬가 독소 및 지질다당류의 동시-주사에 의해 유도된 HUS의 쥐 모델에서, 인자 B-결핍 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 혈소판 감소증에 덜 걸리고 신장 장애로부터 보호되었으며, 미세 혈관 혈전증에서 대체 경로의 LEA-1-의존적 활성화와 관련이 있다 (Morigi, M. et al., J. Immunol. 187:172-180, 2011). 본원에서 기술된 바와 같이, 동일한 모델에서, MASP-2 항체의 투여가 또한 효과적이고 STX 처리 이후 생존률을 증가시켰으며, 미세 혈관 혈전증에서 LEA-2-의존적 보체 경로와 관련이 있다.
상기 언급된 바에 기초하여, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 HUS의 치료 또는 예방에 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단할 수 있는 이중-특이성 항체에 포함될 수도 있다.
aHUS
비정형 HUS는 희귀 질환이며, 미국에서 백만 명 당 2명의 추정 발병률을 갖는다 (Loirat, C. and Fremeaux-Bacchi, V. Orphanet J. Rare Dis. 6:60-90, 2011). 비정형 HUS는 어떤 나이에도 걸릴 수 있지만, 대부분의 환자는 아동기 동안에 발병된다. 비정형 HUS는 이질적이다: 어떤 사례는 가족성이고, 일부는 재발성이며, 일부는 전염병, 전형적으로는 폐 결핵(upper respiratory tract) 또는 위장염(gastroenteritis)에 의해 촉발된다. aHUS의 발병은 일반적으로 급작성이고 대부분의 환자는 입원시 투석을 필요로 한다. 환자 중 약 20%에서 신장외 징후가 존재하고 중추신경계, 심근 경색, 말단 허혈성 괴저(distal ischemic gangrene), 또는 다중기관 부전을 수반할 수도 있다. aHUS의 치료는 장기 기능 장애에 대한 지지적 관리, 혈장 주입 또는 혈장 교환, 및 미국 및 유럽 연합에서 사용에 대하여 최근 승인된 C5를 표적화하는 인간화된 단클론성 항체인 에쿨리쥬맙을 포함한다. aHUS의 예후는 D+HUS만큼 양호하지 않으며, 사망률은 급성기 동안에 대략 25%이고 대부분의 생존자는 발기 신장 질환에 걸린다.
비정형 HUS는 대략 50%의 환자가 보체 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이를 갖는다는 점에서 보체 조절 장애의 질환으로서 특성화되었다 (Zheng and Sadler, 2008 supra). 대부분의 돌연변이는 인자 H (FH)에서 볼 수 있다; 다른 돌연변이는 막 보조인자 단백질 (MCP), 인자 I (FI), 인자 B, 및 C3을 포함한다. 기능적 연구에서는 FH, MCP, 및 FI의 돌연변이가 기능 상실로 이어져 더 많은 보체 활성화를 유도하는 반면에, 인자 B의 돌연변이는 기능을 획득한다는 것을 보여주었다. 이들 돌연변이의 효과는 대부분 대체 경로에 영향을 미친다. 이들 유전적 이상은 돌연변이를 가지고 있는 가족 구성원의 대략 50%가 45살까지 질환을 나타내지 않기 때문에, 질환의 유일한 원인이 아닌 위험 요소일 뿐이다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011 supra).
인자 H는 대체 경로 보체 공격으로부터 숙주 조직을 보호하는 보체 조절 단백질이다. FH는 세 가지 방법으로 대체 경로 증폭 루프를 조절한다: FI에 대한 보조인자로서 C3b를 분열시키고, 대체 경로 C3 전환효소, C3bBb의 형성을 억제하고, 세포 표면 및 조직 매트릭스 상의 다음이온에 결합하여 C3b의 침착을 차단한다 (Atkinson, J.P. and Goodship, T.H.J., J. Exp. Med. 6:1245-1248, 2007). aHUS 환자에서 FH 돌연변이의 대부분은 단백질의 C-말단 짧은 공통 반복 도메인에서 발생하며, 이것은 헤파린, C3b, 및 내피로의 FH의 결함이 있는 결합을 초래하지만, N-말단 도메인 사이에 있는 혈장 C3 조절을 변화시키지 않는다 (Pickering, M.C. et al., J. Exp. Med. 204:1249-1256, 2007). FH-결핍 마우스는 혈장 C3 활성화를 제어할 수 없고 자발적으로 막증식성 사구체신염 II형(membranoproliferative glomerulonephritis type II)에 걸리지만 aHUS에 걸리지 않는다. 하지만, aHUS-관련 인간 FH 돌연변이와 기능적으로 동등한, 이식 유전자에 의해 마우스 FH 단백질을 발현하는 FH-결핍 마우스는 자발적으로 HUS에 걸리지만 막증식성 사구체신염 II형에 걸리지 않으며, 생체 내에서 신장 내피에서 대체 경로 활성화의 결함이 있는 제어가 FH-관련 aHUS의 발병에서 핵심 이벤트인 증거를 제공한다 (Pickering et al., 2007 supra). FH-관련 aHUS의 또 다른 형태는 FH 기능적 활성의 손실을 초래하는 항-FH 자가항체를 가진 환자에서 발생한다; 이들 환자 중 대부분은 다섯 개의 FH-관련 단백질을 암호화하는 유전자의 결실을 갖는다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011, supra).
FH와 유사하게, MCP는 표적 세포 상의 C3b 침착을 조절함으로써 보체 활성화를 억제한다. MCP 돌연변이는 낮은 C3b-결합 및 보조인자 활성을 가진 단백질을 발생시키며, 따라서 조절 장애 대체 경로 활성화를 허용한다. FI는 보조인자, 예컨대 FH 및 MCP의 존재시 C3b 및 C4b를 분열시키며, 이로 인해 C3 및 C5 전환효소의 형성을 방지하고 대체 및 고전적 보체 경로 둘 다를 억제하는 세린 프로테아제이다. FI-관련 aHUS 돌연변이 중 대부분은 C3b 및 C4b의 분해에 대한 FI 활성이 감소된다 (Zheng and Stadler, 2008, supra). FB는 대체 경로 전환효소 C3bBb의 촉매 부위를 가지고 있는 치모겐이다. 기능적 분석에서 aHUS 관련 FB 돌연변이는 대체 경로 활성화를 증가시키는 것으로 나타났다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011, supra). C3의 이형 접합성 돌연변이는 aHUS와 관련이 있다. 대부분의 C3 돌연변이는 MCP에 결합하는 C3의 결핍을 유도하여, C3b에 결합하는 FB의 능력을 증가시키고 C3 전환효소의 형성을 증가시킨다 (Loirat and Fremeaux-Bacchi, 2011, supra). 따라서, aHUS는 대체 경로 증폭 루프의 불충분한 제어를 유도하는 보체 유전자의 돌연변이와 밀접하게 관련된 질환이다. 대체 경로 증폭 루프가 인자 B 단백질 가수분해 활성에 대하여 독립적이고, LEA-1이 인자 B 활성화에 의해 요구되기 때문에 (MASP-3 의존적 분열에 의해 또는 인자 D-매개된 분열에 의해, 여기서 MASP-1은 인자 D의 성숙화에 기여한다), LEA-1-차단제는 민감한 개체에서 제어되지 않는 보체 활성화를 방지할 것으로 예상된다. 결과로서, LEA-1 차단제는 aHUS를 효과적으로 치료할 것으로 예상된다.
aHUS에서 조절되지 않는 대체 경로 증폭 루프의 중심 역할이 널리 수용되는 한편, 보체 활성화를 시작하는 트리거 및 수반된 분자적 경로는 해결되지 않았다. 상기 기술된 돌연변이를 가지고 있는 모든 개체가 aHUS에 걸리는 것은 아니다. 실제로, 가족성 연구는 aHUS의 침투도가 단지 ~50%인 것을 시사한다 (Sullivan M. et al., Ann Hum Genet 74:17-26 2010). 질환의 자연사는 aHUS가 감염 에피소드 또는 손상과 같은 시작 이벤트 이후에 가장 빈번하게 발생한다는 것을 시사한다. 감염원은 보체 시스템을 활성화시키는 것으로 널리 알려져 있다. 기존의 적응성 면역의 부재시, 감염원에 의한 보체 활성화는 주로 LEA-1 또는 LEA-2를 통해 시작될 수도 있다. 따라서, 감염에 의해 촉발된 렉틴-의존적 보체 활성화는 aHUS-취약한 개체에서 궁극적으로는 질환 진행으로 이어질 수도 있는 보체 활성화의 후속적인 병리학적 증폭을 위한 시작 트리거를 나타낼 수도 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 LEA-1- 또는 LEA-2-억제제의 유효량을 투여함으로써 감염에 부차적인 aHUS로 고통받고 있는 환자를 치료하는 것이다.
숙주 조직에 대한 다른 형태의 손상, 특히 관 내피세포층에 대한 손상은 LEA-2를 통해 보체를 활성화시킬 것이다. 산화 스트레스를 받는 인간 혈관 내피 세포는, 예를 들어, 렉틴에 결합하고 보체의 LEA-2 경로를 활성화시키는 표면 모이어티를 발현함으로써 반응한다 (Collard et al., Am J. Pathol 156(5):1549-56, 2000). 허혈/재관류 이후 혈관 손상은 또한 생체 내에서 LEA-2를 통해 보체를 활성화시킨다 (Moller-Kristensen et al., Scand J Immunol 61(5):426-34, 2005). 이 설정에서 렉틴 경로 활성화는 숙주에 대하여 병리학적 결과를 나타내고, 실시예 22 및 23에서 도시된 바와 같이, MASP-2의 차단에 의한 LEA-2의 억제는 추가의 숙주 조직 손상 및 해로운 결과를 예방한다 (Schwaeble PNAS, 2011, supra 참조).
따라서, aHUS를 촉발시키는 다른 과정은 또한 LEA-1 또는 LEA-2를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 그러므로 LEA-1 및/또는 LEA-2 경로는 aHUS에 유전적으로 취약하여, 개체에서 조절되지 않는 방식으로 부적절하게 증폭되는 초기 보체 활성화 메커니즘을 나타낼 수 있으며, 따라서 aHUS 발병을 시작할 가능성이 크다. 추론에 의해서, LEA-1 및/또는 LEA-2를 통해 보체의 활성화를 차단하는 작용제는 aHUS 민감성 개체에서 질환 진행을 방지하거나 또는 악화를 감소시킬 것으로 예상된다.
이 개념의 추가의 지지에서, 최근의 연구는 소아 aHUS 사례에서 중요한 병인체로서 스트렙토코쿠스-뉴모니애를 확인하였다 (Lee, C.S. et al, Nephrology, 17(1):48-52 (2012); Banerjee R. et al., Pediatr Infect Dis J., 30(9):736-9 (2011)). 이 특정 병인은 불리한 예후를 가지며, 사망률 및 장기간 이환률이 높은 것으로 보인다. 특히, 이 사례들은 aHUS에 취약한 것으로 알려져 있는 보체 유전자에서 일시의(concurrent) 돌연변이의 증거 없이 미세혈관증, 요독증(uremia) 및 용혈의 징후를 유도하는 비-장 감염을 수반하였다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 보체를 활성화시키는데 특히 효과적이며, 대부분 LEA-2를 통해 이루어진다는 것을 아는 것은 중요하다. 따라서, 폐렴구균 감염과 관련된 비-장 HUS의 사례에서, 미세혈관증, 요독증 및 용혈의 징후는 대부분 LEA-2의 활성화에 의해 구동될 것으로 예상되고, MASP-2 항체를 포함한, LEA-2를 차단하는 작용제는 이 환자들에서 aHUS의 진행을 방지하거나 질환 심각도를 감소시킬 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 MASP-2 억제제의 유효량을 투여함으로써 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염과 관련된 비-장 aHUS로 고통받고 있는 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
TTP
혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)은 자가면역 또는 응고 캐스케이드 또는 보체 시스템을 활성화시키는 유전적 기능 장애에 의해 유발되는 생명을 위협하는 혈액-응고 시스템의 장애이다 (George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35, 2006). 이것은 신체 전반에 걸쳐 작은 혈관에서 많은 미세한 혈전, 또는 혈전증을 초래하며, 이것은 TMA의 특징이다. 적혈구 세포는 막을 손상시켜, 혈관내 용혈을 유도하는 전단 응력을 받는다. 그 결과로 감소된 혈류 및 내피 손상은 뇌, 심장, 및 신장을 포함한 장기의 손상을 일으킨다. TTP는 임상적으로 혈소판 감소증, 미세혈관성 용혈성 빈혈증, 신경학적 변화, 신부전 및 열병을 특징으로 한다. 혈장 교환 이전의 시기에, 사망률은 급성 질환 중에 90%였다. 심지어는 혈장 교환으로도, 6개월에서의 생존률은 약 80%이다.
TTP는 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; vWF)의 큰 멀티머를 작은 유닛으로 분열시키는 원인이 되는 메탈로프로테아제인 ADAMTS-13의 유전적 또는 후천적 억제로부터 발생할 수도 있다. ADAMTS-13 억제 또는 결핍은 궁극적으로 응고를 증가시킨다 응고 (Tsai, H. J Am Soc Nephrol 14: 1072-1081, 2003). ADAMTS-13은 vWF의 활성을 조절한다; ADAMTS-13의 부재시, vWF는 혈소판에 결합할 가능성이 더 높은 큰 멀티머를 형성하고 환자를 미소혈관계에서 혈소판 응집 및 혈전증에 취약하게 만든다.
TTP에 걸린 개체에서 ADAMTS13의 많은 돌연변이가 확인되었다. 질환은 또한 ADAMTS-13에 대한 자가항체로 인해 발병할 수 있다. 이에 더하여, TTP는 유방암, 위장관암, 또는 전립선암 (George JN., Oncology (Williston Park). 25:908-14, 2011), 임신 (임신 중기(second trimester) 또는 산후) (George JN., Curr Opin Hematol 10:339-344, 2003) 중에 발병할 수 있거나, 또는 질환, 예컨대 HIV 또는 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis)과 유사한 자가면역 질환과 관련이 있다 (Hamasaki K, et al., Clin Rheumatol. 22:355-8, 2003). TTP는 또한 헤파린, 퀴닌, 면역 매개된 성분, 암 화학치료제 (블레오마이신, 시스플라틴, 시토신 아라비노시드, 다우노마이신 젬시타빈, 미토마이신 C, 및 타목시펜), 사이클로스포린 A, 경구 피임약, 페니실린, 리팜핀 및 티클로피딘 및 클로피도그렐을 포함하는 항-혈소판제를 포함한 특정 약물 요법에 의해 유발될 수 있다 (Azarm, T. et al., J Res Med Sci., 16: 353-357, 2011). TTP와 관련된 다른 요인 또는 병태는 별침 독과 같은 독소, 패혈증, 비장 격리, 이식, 맥관염, 혈관 수술, 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)로의 감염이다 (Moake JL., N Engl J Med., 347:589-600, 2002). 일과성 기능적 ADAMTS-13 결핍으로 인한 TTP는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염과 관련된 내피 세포 손상의 결과로서 일어날 수 있다 (Pediatr Nephrol, 26:631-5, 2011).
혈장 교환은 TTP에 대한 표준 치료법이다 (Rock GA, et al., N Engl J Med 325:393-397, 1991). 혈장 교환은 유전적 결함이 있는 환자에서 ADAMTS-13 활성을 대체하고 후천적 자가면역 TTP에 걸린 상기 환자에서 ADAMTS-13 자가항체를 제거한다 (Tsai, H-M, Hematol Oncol Clin North Am., 21(4): 609-v, 2007). 추가적인 작용제, 예컨대 면역억제제가 일상적으로 요법에 추가된다 (George, JN, N Engl J Med, 354:1927-35, 2006). 하지만, 혈장 교환은 환자 중 약 20%에 대해서는 성공적이지 않고, 3분의 1이 넘는 환자에서 재발하며, 혈장 반출법(plasmapheresis)은 비용이 많이 들고 기술적으로 부담이 크다. 또한, 많은 환자가 혈장 교환을 견딜 수 없다. 결론적으로, TTP에 대하여 추가적인 더 우수한 치료법이 절실하게 필요하다.
TTP가 혈액 응고 캐스케이드의 장애이기 때문에, 보체 시스템의 안타고니스트로의 처리는 질환을 안정화시키고 바로잡는데 도움을 줄 수도 있다. 대체 보체 경로의 병리학적 활성화는 aHUS와 관련이 있는 한편, TTP에서 보체 활성화의 역할은 덜 분명하다. ADAMTS13의 기능적 결핍이 TTP에 대한 민감성에 대하여 중요하지만, 급성 질환을 유발하기에는 충분하지 않다. 환경적 인자 및/또는 다른 유전적 변화가 TTP의 징후에 기여할 수도 있다. 예를 들어, 응고 캐스케이드, vWF, 혈소판 기능, 내피 혈관 표면의 구성요소, 또는 보체 시스템의 조절에 수반되는 단백질을 암호화하는 유전자는 급성 혈전성 미세혈관증의 발병과 연관성이 있을 수도 있다 (Galbusera, M. et al., Haematologica, 94: 166-170, 2009). 특히, 보체 활성화가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다; ADAMTS-13 결핍과 관련된 혈전성 미세혈관증에서의 혈청은 C3 및 MAC 침착과 보체 비활성화에 의해 폐지될 수 있는 후속적인 호중구 활성화를 유발하는 것으로 나타났다 (Ruiz-Torres MP, et al., Thromb Haemost, 93:443-52, 2005). 이에 더하여, 최근에는 TTP의 급성 질환 중에 C4d, C3bBbP, 및 C3a의 수준이 증가된 것으로 나타났으며 (M. Reti et al., J Thromb Haemost. 10(5):791-798, 2012), 고전적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로의 활성화와 일치한다. 급성 질환에서 이러한 증가된 양의 보체 활성화는 말단 경로 활성화를 시작하고 TTP의 추가의 악화의 원인이 될 수도 있다.
TTP에서 ADAMTS-13 및 vWF의 역할은 분명하게 혈소판의 활성화 및 응집의 원인이고 미세혈관증에서 전단 응력 및 침착의 후속적인 역할을 한다. 활성화된 혈소판은 보체의 고전적 경로 및 대체 경로 둘 다와 상호작용하여 이것들을 촉발시킨다. 혈소판-매개된 보체 활성화는 염증 매개자 C3a 및 C5a를 증가시킨다 (Peerschke E. et al., Mol Immunol, 47:2170-5 (2010)). 따라서 혈소판은 유전된 TTP 또는 자가면역 TTP에서 고전적 보체 활성화의 표적으로서의 역할을 할 수도 있다.
상기 기술된 바와 같이, MASP-1의 트롬빈-유사 활성 및 LEA-2-매개된 프로트롬빈 활성화로 인한 보체의 렉틴-의존적 활성화는 HUS에서 발생하는 응고 및 미세 혈관 혈전증에 대한 내피 손상과 관련된 지배적인 분자적 경로이다. 유사하게, LEA-1 및 LEA-2의 활성화는 TTP에서 응고 시스템을 직접적으로 구동시킬 수도 있다. LEA-1 및 LEA-2 경로 활성화는 TTP에서 ADAMTS-13 결핍에 의해 유발된 초기 내피 손상에 반응하여 시작될 수도 있다. 그러므로, 제한되는 것은 아니지만, MASP-2 기능, MASP-1 기능, MASP-3 기능, 또는 MASP-1 및 MASP-3 기능을 차단하는 항체를 포함하는 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 TTP로 고통받고 있는 환자에서 미세 혈관 응고, 혈전증, 및 용혈과 관련된 미세혈관증을 완화시킬 것으로 예상된다.
TTP로 고통받고 있는 환자들은 전형적으로 응급실에서 다음 중 하나 이상을 나타낸다: 자반증, 신부전, 낮은 혈소판, 빈혈증 및/또는 뇌졸중을 포함한 혈전증. TTP에 대한 관리의 현재의 표준은 2주 이상의 기간 동안, 전형적으로는 주 3회, 최대 1일 1회 대체 혈장 반출법의 카테터 내(intra-catheter) 전달 (예를 들어, 정맥내 또는 다른 형태의 카테터)을 수반한다. 대상체가 ADAMTS13의 억제자 (즉, ADAMTS13에 대한 내인성 항체)의 존재에 대하여 양성으로 테스트되면, 혈장 반출법이 면역억제 요법 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 리툭산, 또는 사이클로스포린)과 조합하여 수행될 수도 있다. 난치성 TTP에 걸린 환자 (TTP 환자 중 대략 20%)는 적어도 2주의 혈장 반출 요법에는 반응하지 않는다.
상기 언급된 바에 따르면, 한 구체예에서, TTP의 초기 진단의 설정에서, 또는 TTP의 진단과 일치하는 하나 이상의 증상 (예를 들어, 중추신경계 관여, 중증 혈소판 감소증 (아스피린을 복용하지 않으면 5000/μL 이하, 아스피린을 복용하면 20,000/μL 이하의 혈소판 수), 중증 심장 관여, 중증 폐 관여, 위장 경색 또는 괴저)을 나타내는 대상체에서, 혈장 반출법의 부재시, 또는 혈장 반출법과 조합으로 제1 선 요법으로서 LEA-2 억제제 (예를 들어, MASP-2 항체) 또는 LEA-1 억제제 (예를 들어, MASP-1 또는 MASP-3 항체)의 유효량으로 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 제1 선 요법으로서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 혈장 반출법의 잠재적 합병증, 예컨대 출혈, 감염, 및 혈장 공여체에서, 또는 그렇지 않으면 혈장 반출법을 꺼려하는 대상체에서, 또는 혈장 반출법을 이용할 수 없는 설정에서 내재된 장애 및/또는 알레르기에 대한 노출을 방지하기 위해 혈장 반출법의 부재시 1선 요법으로서 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 면역억제제 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 리툭산 또는 사이클로스포린)와 조합하여 (동시-투여 포함) 및/또는 농축된 ADAMTS-13과 조합하여 TTP로 고통받고 있는 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 기간 (예를 들어, 적어도 1일 내지 1주일 또는 2주일 동안 지속되는 급성기) 동안 TTP로 고통받고 있는 대상체에게 카테터를 통해 (예를 들어, 정맥내로) LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제를 투여한 후 이어서 제2 기간 (예를 들어, 적어도 2주 이상의 만성기) 동안 상기 대상체에게 피하로 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 및/또는 제2 기간 내 투여는 혈장 반출법의 부재시 일어난다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체가 TTP와 관련된 하나 이상의 증상으로 고통받는 것을 예방하기 위해 대상체를 유지하는데 사용된다.
또 다른 구체예에서, TTP의 하나 이상의 증상을 감소시키는데 효과적인 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제자의 양을 투여함으로써 난치성 TTP로 고통받고 있는 대상체 (즉, 적어도 2주의 혈장 반출 요법에는 반응하지 않은 대상체)를 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제자는 피하 또는 다른 비경구 투여를 통해 적어도 2주 이상의 기간에 걸쳐 만성적으로 난치성 TTP에 걸린 대상체에게 투여된다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
일부 구체예에서, 방법은 치료 전에, 및 선택적으로는 치료 중에 대상체에서 적어도 하나의 보체 인자 (예를 들어, C3, C5)의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하며, 기준치 또는 건강한 대조군 대상체와 비교하여 감소된 적어도 하나의 보체 인자 수준의 결정은 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제로의 지속적인 치료가 필요하다는 것을 나타낸다.
일부 구체예에서, 방법은 TTP로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 바람직하게는 매일 이루어지지만, 매월처럼 덜 빈번하게 이루어질 수도 있다. 치료는 연속 2일 동안 대상체의 혈소판 수가 적어도 150,000/ml보다 높을 때까지 계속된다.
요약하면, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 HUS, aHUS 및 TTP를 포함한 TMA의 치료에 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 것으로 예상되거나, 또는 다양한 형태의 TMA로 고통받고 있는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중 특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 혈전성 미세혈관증, 예컨대 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며 약학적 담체 중의 MASP 1 억제제, MASP 3 억제제, 또는 MASP 1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 혈전성 미세혈관증로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP 1, MASP 3, 또는 MASP 1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 혈전성 미세혈관증, 예컨대 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것들의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 단계를 더 포함하며 MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 혈전성 미세혈관증으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 혈전성 미세혈관증을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것이다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 선택적인 MASP-2 억제 조성물의 적용은 혈전성 미세혈관증으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 혈전성 미세혈관증을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 투여될 수 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 혈전성 미세혈관증 (예를 들어, 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 혈전성 미세혈관증 (예를 들어,용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 혈전성 미세혈관증 (예를 들어, 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP), 또는 이식-관련 TMA (TA-TMA)을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
G. 천식에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
천식은 기도의 일반적인 만성 염증 질환이다. 미국에서는 18세 미만의 700만 명의 아동들을 포함한 대략 2500만 명의 사람이 천식에 걸려 있으며, 절반 이상에서 매년 적어도 1회의 천식 발작이 발생하여, 매년 응급실 방문이 170만 건 및 입원이 450,000건을 넘는다 (world-wide-web at gov/health/prof/lung/asthma/naci/asthma-info/index.htm., 2012년 5월 4일에 접속됨). 질환은 다수의 임상적 표현형과는 이질적이다. 대부분의 일반적인 표현형은 알레르기성 천식이다. 다른 표현형은 비알레르기성 천식, 아스피린-악화된 호흡기 질환, 감염 후 천식, 직업 관련 천식, 공기로 운반되는 자극물-유도된 천식, 및 운동-유도된 천식을 포함한다. 알레르기성 천식의 중요한 특징은 다양한 특이적 및 비특이적 자극에 대한 기도 과민반응 (AHR), 과도한 기도 점액 생산, 폐 호산구 증가증(pulmonary eosinophilia), 및 높아진 혈청 IgE 농도를 포함한다. 천식의 증상은 기침, 쌕쌕거림(wheezing), 가슴 답답함(chest tightness), 및 숨가쁨(shortness of breath)을 포함한다. 천식 치료의 목표는 질환을 제어하고 악화, 일일 증상을 최소화하고, 환자를 육체적 활성인 상태로 만드는 것이다. 현재의 치료 가이드라인은 천식 제어가 이루어질 때까지의 단계별 치료를 궈장한다. 제1 치료 단계는 필요에 따라 속효성 흡입용 β2-아고니스트에 이어서, 흡입용 코르티코스테로이드, 지효성 흡입용 β2-아고니스트, 류코트리엔 개질제, 테오필린, 경구용 글루코코르티코스테로이드, 및 항-IgE 단클론성 항체와 같은 조절제를 추가하는 것이다.
천식의 기원이 다인성이지만, 일반적으로는 유전적으로 민감한 개체에서 일반적인 환경적 항원에 대한 부적절한 면역학적 반응의 결과로서 발생하는 것으로 받아들여지고 있다. 천식은 보체 활성화와 관련이 있고 아나필라톡신 (AT) C3a 및 C5a는 알레르기성 반응의 발달 및 조절과 관련이 있는 전염증성 및 면역조절 성질을 가진다 (Zhang, X. 및 Kohl, J. Expert. Rev. Clin. Immunol., 6:269-277, 2010). 하지만, 천식에서 보체의 고전적 경로, 대체 경로, 및 렉틴 경로의 상대적인 개입은 잘 이해되어 있지 않다. 대체 경로는 알레르기 유발 항원(allergen)의 표면 상에서 활성화될 수 있고 렉틴 경로는 알레르기 유발 항원 다당류 구조의 인식을 통해 활성화될 수도 있으며, 두 과정은 AT의 생성을 유도한다. 보체는 수반된 원인이 되는 알레르기 유발 항원에 따라 상이한 경로에 의해 활성화될 수도 있다. 예를 들어, 고도로 알레르기성인 파리에타리아(Parietaria) 과의 풀 꽃가루(grass pollen)는 C4의 MBL-의존적 활성화를 촉진하는데 매우 효과적이며, LEA-2와 관련이 있다. 반대로, 반대로, 집먼지 진드기(house dust mite) 알레르기 유발 항원은 보체 활성화를 위해 MBL을 필요로 하지 않는다 (Varga et al. Mol Immunol., 39(14):839-46, 2003).
천식의 환경적 트리거는 대체 경로에 의해 보체를 활성화시킬 수도 있다. 예를 들어, 담배 연기 또는 디젤 배출 입자로의 인간 혈청의 시험관 내 노출은 보체 활성화를 유도하고 그 효과는 EDTA의 존재에 의해 영향을 받지 않으며, 활성화는 고전적 경로 대신에 대체 경로를 통해 이루어진다는 것을 시사한다 (Robbins, R.A. et al, Am. J. Physiol. 260: L254-L259, 1991; Kanemitsu, H., et al., Biol. Pharm. Bull. 21:129-132, 1998). 알레르기성 기도 염증에서 보체 경로의 역할은 마우스 오발부민 감작 및 처리 모델에서 평가되었다. 야생형 마우스는 공기 알레르기 유발 항원 처리에 반응하여 AHR 및 기도 염증에 걸렸다. 모든 보체 활성화 경로를 억제하는 Crry-Ig 융합 단백질은 알레르기성 폐 염증의 마우스 오발부민 모델에서 전신으로 또는 흡입에 의해 국소적으로 투여될 때 AHR 및 폐 염증을 예방하는데 효과적이었다 (Taube et al., Am J Respir Crit Care Med., 168(11):1333-41, 2003).
야생형 마우스와 비교하여, 인자 B-결핍 마우스가 더 적은 AHR 및 기도 염증을 입증한 반면에 C4-결핍 마우스는 야생형 마우스와 유사한 효과를 나타냈다 (Taube, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:8084-8089, 2006). 이 결과는 쥐 공기 알레르기 유발 항원 처리 모델에서 고전적 경로 개입이 아닌 대체 경로 개입에 대한 역할을 지지한다. 같은 마우스 모델을 사용하여 인자 H (FH)의 연구에서 대체 경로의 중요성에 대한 추가의 증거가 제공되었다 (Takeda, K., et al., J. Immunol. 188:661-667, 2012). FH는 대체 경로의 음성 조절자이고 자가 조직의 자가 손상을 예방하는 작용을 한다. 내인성 FH는 알레르기 유발 항원 처리 동안에 기도에 존재하는 것으로 발견되었고 재조합 경쟁적 안타고니스트로의 FH의 억제는 AHR 및 기도 염증의 정도를 증가시켰다 (Takeda et al., 2012, supra). fH의 보체 조절 활성을 기존의 보체 활성화 부위로 표적화하는 FH의 보체-조절 영역에 CR2의 iC3b/C3d 결합 영역을 결합시키는 키메라 단백질인 CR2-fH의 치료적 전달은 알레르기 유발 항원 처리 후 AHR의 발달 및 기도로의 호산구 침투를 보호하였다 (Takeda et al., 2012, supra). 보호 효과는 오발부민, 뿐만 아니라 인간에서 적절한 알레르기 유발 항원인 돼지풀(ragweed) 알레르기 유발 항원으로 입증되었다.
천식에서 렉틴-의존적 보체 활성화의 역할은 균류에 의한 천식 마우스 모델에서 평가되었다 (Hogaboam et al., J. Leukocyte Biol. 75:805 814, 2004). 이 연구에서는 렉틴 보체 경로의 활성화에 대한 인식 구성요소로서 기능하는 탄수화물 결합 단백질인 만난 결합 렉틴 A (MBL-A)가 유전적으로 결힙된 마우스를 사용하였다. MBL-A(+/+) 및 MBL-A(-/-) 아스페르질루스 푸미가투스(Aspergillus. fumigatus) 감작된 마우스는 아스페르질루스 푸미가투스 코니디아(A. fumigatus conidia)로의 i.t. 처리 후 제4 일 및 제28 일에 검사되었다. 감작된 MBL-A(-/-) 마우스에서 AHR은 감작된 MBL-A (+/+) 군과 비교하여 코니디아 처리 이후 두 시점에서 크게 감소되었다. 폐 TH2 사이토카인 수준 (IL-4, IL-5 및 IL-13)은 코니디아 이후 제4 일에 야생형 군과 비교하여 아스페르질루스 푸미가투스-감작된 MBL-A(-/-) 마우스에서 훨씬 더 낮았다. 이 결과들은 MBL-A 및 렉틴 경로가 만성 균류에 의한 천식 동안에 AHR의 발달 및 유지에 주요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
상기 상세히 설명된 결과는 천식의 발병에서 렉틴-의존적 보체 활성화의 개입을 시사한다. 실험 데이터는 인자 B 활성화가 중심 역할을 한다는 것을 시사한다. 인자 B의 렉틴-의존적 활성화 및 후속적인 대체 경로의 활성화에서 LEA-1에 대한 근본적인 역할을 고려하여, LEA-1 차단제는 대체 경로에 의해 매개되는 특정 형태의 천식의 치료에 유익할 것으로 예상된다. 그러므로 이러한 치료는 집먼지 진드기-유도된 천식, 또는 담배 연기 또는 디젤 배기가스와 같은 환경적 트리거에 의해 유발된 천식에서 특히 유용할 수도 있다. 다른 한편으로 풀 꽃가루에 의해 촉발된 천식 반응은 LEA-2-의존적 보체 활성화를 유발할 가능성이 크다. 그러므로, LEA-2-차단제는 환자의 이 부분 집합에서 천식 병태를 치료하는데 특히 유용할 것으로 예상된다.
상기 상세히 설명된 데이터를 고려하여, 발명자들은 LEA-1 및 LEA-2가 천식에서 병리학적 보체 활성화를 매개하는 것으로 생각한다. 자극성 알레르기성 작용제에 따라, LEA-1 또는 LEA-2가 우선적으로 수반될 수도 있다. 따라서, 따라서, LEA-2-차단제와 조합된 LEA-1-차단제는 근본적인 병인에 관계없이 다양한 형태의 천식의 치료에 있어서 유용성을 가질 수도 있다. LEA-1 및 LEA-2-차단제는 폐 염증 및 천식의 증상을 예방하거나, 치료하거나 또는 반전시키는데 있어서 상보적이거나, 추가적이거나 또는 시너지적인 효과를 나타낼 수도 있다.
조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중 특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 천식을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 천식으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 천식을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 더 포함하며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 천식으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 천식을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및 선택적인 MASP-2 억제 조성물의 적용은 천식으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에서 천식을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 천식에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 천식으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 천식을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
H. 고밀도 침착병에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
막증식성 사구체신염 (MPGN)은 형태학적으로 사구체 간질의 내피하 연장으로 인한 혈관 사이 세포 증식 및 사구체 모세혈관 벽의 농후화를 특징으로 하는 신장 장애이다. MPGN은 1차 (특발성이라고도 불림) 또는 2차로 분류되며, 근본적인 질환으로 감염성 질환, 전신성 면역 복합 질환, 신생물, 만성 간 질환, 등이 있다. 특발성 MPGN은 세 가지 형태학적 유형을 포함한다. I형, 또는 고전적 MPGN은 고전적 보체 경로의 면역 복합체 및 활성화의 내피하 침착을 특징으로 한다. II형, 또는 고밀도 침착병 (DDD)은 추가적인 막내 고밀도 침착을 특징으로 한다. III형은 추가적인 상피하 침착을 특징으로 한다. 특발성 MPGN은 희귀성이며, 신장 증후군의 1차적인 신장 원인의 대략 4 내지 7%를 차지한다 (Alchi, B. 및 Jayne, D. Pediatr. Nephrol. 25:1409-1418, 2010). MPGN은 주로 아동 및 청년에게 영향을 미치고 신장 증후군, 급성 신염 증후군, 무증상 단백뇨증(proteinuria) 및 혈뇨증(hematuria), 또는 재발성 육안적 혈뇨증으로 나타날 수도 있다. 신장 기능장애가 대부분의 환자에서 일어나고 질환은 느린 진행성 과정을 가지며, 환자의 대략 40%가 진단 10년 이내에 말기 신장 질환에 걸린다 (Alchi 및 Jayne, 2010, supra). 현재의 치료 옵션은 코르티코스테로이드, 면역억제, 항혈소판 양생법, 및 혈장 교환을 포함한다.
DDD는 신장 생검의 면역 형광 염색에 의한 면역글로불린의 부재 및 C3의 존재에 의해 진단되고, 전자 현미경법은 사구체 기저막을 따라 특유의 고밀도 호오스뮴(osmiophilic) 침착을 보여준다. DDD는 보체의 대체 경로의 조절 장애에 의해 유발되며 (Sethi et al, Clin J Am Soc Nephrol. 6(5):1009-17, 2011), 이것은 많은 상이한 메커니즘으로부터 발생할 수 있다. DDD에서 가장 일반적인 보체 시스템 이상은 반감기를 증가시키고 그러므로 경로의 활성화를 증가시키는 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)에 대한 자가항체인 C3 신장염성 인자의 존재이다 (Smith, R.J.H. et al., Mol. Immunol. 48:1604-1610, 2011). 다른 대체 경로 이상은 인자 H의 기능을 차단하는 인자 H 자가항체, 기능 C3 돌연변이의 획득, 및 인자 H의 유전적 결핍을 포함한다 (Smith et al., 2011, supra). 최근 사례 보고서는 에클리쥬맙 (항-C5 단클론성 항체) 처리가 DDD에 걸린 두 며으이 환자에서 신장 기능의 향상과 관련이 있다는 것을 보여주며 (Daina, E. et al., New Engl. J. Med. 366:1161-1163, 2012; Vivarelli, M. et al., New Engl. J. Med. 366:1163-1165, 2012), 신장의 결과에서 보체 활성화에 대한 원인이되는 역할을 시사한다.
상기 유전적, 기능적 및 면역조직학적 및 일화적 임상 데이터를 고려해 볼 때, DDD의 발병에서 보체에 대한 중심 역할은 잘 확립되어 있다. 따라서, 보체 활성화의 질환-유발 메커니즘, 또는 후속 보체 활성화 생성물을 차단하는 개입은 이 병태를 치료하기에 치료적으로 유용할 것으로 예상된다.
인간의 유전적 데이터는 대체 경로 증폭 루프의 부적절한 제어 또는 과도한 활성화가 핵심 역할을 하는 한편, 보체-시작 이벤트는 확인되지 않았다는 것을 시사한다. 신장 생검에서 면역조직학적 연구는 병에 걸린 조직에서 MBL 침착의 증거를 나타내며, DDD에서 병리학적 보체 활성화의 시작에 렉틴 경로의 개입을 시사한다 (Lhotta et al, Nephrol Dial Transplant., 14(4):881-6, 1999). 대체 경로의 중요성은 실험 모델에서 추가로 입증되었다. 인자 H-결핍 마우스는 진행성 단백뇨증에 걸리고 인간 병태 특유의 신장 병리학적 병소를 발달시킨다 (Pickering et al., Nat Genet., 31(4):424, 2002). Pickering et al.은 대체 경로의 LEA-1-의존적 활성화를 매개하는 인자 B의 제거가 DDD로부터 인자 H-결핍 마우스를 완전히 보호한다는 것을 더 입증하였다 (Pickering et al., Nat Genet., 31(4):424, 2002).
따라서 LEA-1을 차단하는 작용제는 대체 경로의 렉틴-의존적 활성화를 효과적으로 차단하며, 따라서 DDD에 효과적인 치료를 제공할 것으로 예상된다. DDD 환자에서 대체 경로 증폭 루프가 조절되지 않는다는 것을 고려해 볼 때, 추가로 증폭 루프를 차단하는 작용제가 효과적일 것으로 예상될 수 있다. MASP-1 또는 MASP-1 및 MASP-3을 차단하는 LEA-1-표적화제가 인자 D의 성숙화를 억제하기 때문에, 이러한 작용제는 대체 경로 증폭 루프를 효과적으로 차단할 것으로 예측된다.
상기 상세히 설명된 바와 같이, 현저한 MBL 침착이 병에 걸린 신장 표본에서 발견되었으며, DDD 발병에서 렉틴-구동된 활성화 이벤트의 개연적인 개입을 강조한다. 사구체 모세혈관에 대한 초기 조직 손상이 확립되면, 손상된 사구체 내피 및 근본적인 사구체 간질 구조로의 추가적인 MBL 결합이 일어날 가능성이 크다. 이러한 조직 손상은 LEA-2의 활성화를 유도하는 것으로 널리 공지되어 있으며, 따라서 이것은 추가의 보체 활성화를 유발할 수 있다. 그러므로, LEA-2-차단제는 또한 손상된 사구체 구조 상에서 추가의 보체 활성화를 방지하는데 있어서 유용성을 가지며, 따라서 말기 신부전으로의 추가의 질환 진행을 방지할 것으로 예상된다.
상기 상세히 설명된 데이터는 DDD에서 LEA-1 및 LEA-2가 별개의 병리학적 보체 활성화 과정을 촉진한다는 것을 시사한다. 따라서, LEA-1-차단제 및 LEA-2 차단제는, 단독으로 또는 조합으로, DDD를 치료하는데 유용할 것으로 예상된다.
조합으로 사용될 때, LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 작용제 단독보다 더 효과적이거나, 상이한 단계의 질환을 치료하는데 유용할 것으로 예상된다. 그러므로 LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 DDD-관련 신장 기능 장애를 예방하거나, 치료하거나 또는 반전시키는데 있어서 상보적이거나, 추가적이거나 또는 시너지적인 효과를 나타낼 수도 있다.
조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, 억제 기능을 가진 LEA-1 및 LEA-2 차단제는 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중-특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 고밀도 침착병을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체 중의 MASP 1 억제제, MASP 3 억제제, 또는 MASP 1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 고밀도 침착병으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 고밀도 침착병을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 고밀도 침착병으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 방법이 제공된다. 고밀도 침착병을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3-억제제의 치료적 유효량을 고밀도 침착병으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 고밀도 침착병을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
LEA-1 및/또는 LEA-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 대상체에서 고밀도 침착병을 치료하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 고밀도 침착병에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 고밀도 침착병으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 고밀도 침착병을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
I. 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
핍면역 괴사성 반월상 사구체신염 (NCGN)은 사구체 모세혈관 벽이 염증의 징후를 나타내지만 검출 가능한 면역복합체 침착 또는 사구체 기저막에 대한 항체가 부족한 급속 진행 사구체 신염(rapidly progressive glomerulonephritis)의 한 형태이다. 병태는 신장 기능의 급속한 감소와 관련이 있다. NCGN에 걸린 대부분의 환자는 항호중구 세포질 자가항체 (ANCA)를 가지고 있으며 따라서 ANCA-관련 맥관염이라고 불리는 질환의 군에 속하는 것으로 발견되었다. 맥관염은 혈관벽의 염증 및 피브리노이드 괴사를 특징으로 하는 혈관 장애이다. 전신성 맥관염은 다음의 혈관 크기, 대, 중, 및 소에 따라 분류된다. 여러 형태의 소혈관 맥관염은 ANCA, 즉 베게너 육아종증(Wegener granulomatosis), 현미경 다발성 혈관염(microscopic polyangiitis), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 및 신장-제한된 맥관염 (NCGN)의 존재와 관련이 있다. 그것들은 또한 전신 홍반성 낭창과 같은 근본적인 병태의 징후일 수 있다. ANCA에 대한 표적 항원은 프로테이나아제-3 (PR3) 및 미엘로퍼옥시다아제 (MPO)를 포함한다. 핍면역 NCGN은 희귀성이며, 영국의 웨식스에서 백만 명 당 대략 4명의 발병률이 보고되었다 (Hedger, N. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 15:1593-1599, 2000). 핍면역 NCGN에 걸린 128명의 환자의 웨식스 시리즈에서, 73%가 ANCA-양성이었고 환자 중 59%에서 초기 투석이 필요하였고 36%가 장기간 투석을 필요로 하였다. 핍면역 NCGN에 대한 치료는 코르티코스테로이드 및 사이클로포스파미드 및 아자티오프린과 같은 면역억제제를 포함한다. ANCA-관련 맥관염에 대한 추가적인 치료 옵션은 리툭시맙 및 혈장 교환을 포함한다 (Chen, M. 및 Kallenberg, C.G.M. Nat. Rev. Rheumatol. 6:653-664, 2010).
NCGN은 보체 침착의 부족을 특징으로 하고, 보체의 대체 경로는 그것의 발병과 연관성이 있다. MPO-ANCA-관련 핍면역 NCGN에 걸린 7명의 환자의 신장 생검 평가에서 막 공격 복합체, C3d, 인자 B, 및 인자 P의 존재가 검출되는 반면에 (정상 대조군 또는 미세변화병(minimal change disease)에 걸린 환자의 생검에서는 검출되지 않음), C4d 및 만노오스 결합 렉틴은 검출되지 않았으며, 대체 경로의 선택적 활성화를 시사한다 (Xing, G.Q. et al. J. Clin. Immunol. 29:282-291, 2009). ㅅ실험적 NCGN은 야생형 마우스로의 항-MPO IgG의 전달 또는 면역-결핍 마우스로의 항-MPO 비장세포의 전달에 의해 유도될 수 있다 (Xiao, H. et al. J. Clin. Invest. 110:955-963, 2002). NCGN의 이 마우스 모델에서, 특이적인 보체 활성화 경로의 역할이 넉아웃 마우스를 사용하여 조사되었다. 항-MPO IgG의 주사 후, C4-/- 마우스는 야생형 마우스와 비슷하게 신장 질환에 걸리는 반면에 C5-/- 및 인자 B-/- 마우스는 신장 질환에 걸리지 않았으며, 대체 경로가 이 모델에 수반되지만 고전적 경로 및 렉틴 경로는 수반되지 않았음을 나타낸다 (Xiao, H. et al. Am. J. Pathol. 170:52-64, 2007). 더욱이, TNF--프라이밍된(primed) 인간 호중구를 가진 환자의 MPO-ANCA 또는 PR3-ANCA IgG의 인큐베이션은 C3a의 생성에 의해 검출된 바와 같이 정상 인간 혈청에서 보체 활성화를 일으키는 인자의 방출을 유발하였다; 이 효과는 건강한 대상체의 IgGF로는 관찰되지 않았으며, 호중구 및 보체 활성화에서 ANCA의 잠재적인 병원성 역할을 시사한다 (Xiao et al., 2007, supra).
이 병태에서의 대체 경로에 대하여 상기 요약된 역할에 기초하여, 대체 경로의 활성화를 차단하는 것은 ANCA 활성 NCGN의 치료에 있어서 유용성을 가질 것으로 예상된다. 발병을 위한 fB 활성화에 대한 요건을 고려해 볼 때, LEA-1의 억제자는 이 병태를 치료하고, 이 환자들의 신장 기능의 추가의 감소를 예방하는데 특히 유용할 것으로 예상된다.
하지만 환자의 또 다른 부분 집합은 ANCA의 부재시 신장 기능의 급속한 감소가 동반된 반월 형성과 함께 진행성 신장 맥관염에 걸린다. 병태의 이러한 형태는 ANCA-음성 NCGN으로 불리고 핍면역 NCGN에 걸린 모든 환자의 약 3분의 1을 구성한다 (Chen et al, JASN 18(2): 599-605, 2007). 이러한 환자는 더 젊은 경향이 있고, 신장 결과는 특히 심각한 경향이 있다 (Chen et al., Nat Rev Nephrol., 5(6):313-8, 2009). 이러한 환자의 차별적인 병리학적 특징은 신장 병소에서 MBL 및 C4d의 침착이다 (Xing et al., J Clin Immunol. 30(1):144-56, 2010). 신장 생검에서 MBL 및 C4d 염색 강도는 신장 기능과 음의 상관관계가 있었다 (Xing et al., 2010, supra). 이 결과들은 발병시 렉틴-의존적 보체 활성화에 대한 중요한 역할을 시사한다. 일반적으로 병에 걸린 조직 표본에서 인자 B가 아니라 C4d가 발견된다는 사실은 LEA-2 개입을 나타낸다.
상기 기술된 ANCA 음성 NCGN에서 렉틴-의존적 보체 활성화의 역할에 기초하여, LEA-2 경로의 활성화를 차단하는 것은 ANCA 음성 NCGN의 치료에 있어서 유용성을 가질 것으로 예상된다.
상기 상세히 설명된 데이터는 LEA-1 및 LEA-2가 각각 ANCA-양성 및 ANCA-음성 NCGN에서 병리학적 보체 활성화를 매개한다는 것을 시사한다. 따라서, LEA-2-차단제와 조합된 LEA-1-차단제는 근본적인 병인에 관계없이 모든 형태의 핍면역 NCGN의 치료에 있어서 유용성을 가질 것으로 예상된다. 그러므로 LEA-1- 및 LEA-2-차단제는 NCGN-관련 신장 기능장애를 예방하거나, 치료하거나 또는 반전시키는데 있어서 상보적이거나, 추가적이거나 또는 시너지적인 효과를 가질 수도 있다.
함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1 차단제 및 LEA-2 차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단할 수 있는 이중-특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물을 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염 (NCGN)에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염 (NCGN)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염 (NCGN)을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
J. 외상성 뇌 손상에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된, MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
외상성 뇌 손상 (TBI)은 매년 적어도 1000만 명의 사망 또는 입원을 유도하는 세계적인 주요 건강 문제이다 (Langlois, J.A. et al., J. head trauma Rehabil. 21:375-378, 2006). 2003년에 미국에서는 120만 건의 응급실 방문, 290,000건의 입원, 및 51,000건의 사망을 포함하여, 160만 명이 TBI에 걸린 것으로 추정되었다 (Rutland-Brown, W. et al., J. head trauma Rehabil. 21:544-548, 2006). 미국에서 대부분의 TBI는 낙상 및 교통사고에 의해 유발된다. TBI는 장기간 또는 평생의 육체적, 인지적, 행동적, 및 감정적인 결과를 초래할 수 있다. 500만 명이 넘는 미국인들이 TBI와 관련된 장기간 또는 평생의 장애를 가지고 살고 있다 (Langlois et al., 2006, supra).
TBI는 뇌 물질의 침투 ("침투" 손상) 또는 뇌를 침투하지 않는 손상 ("폐쇄" 손상)을 수반할 수도 있다. 손상 프로파일 및 관련 신경행동적 후유증은 침투 TBI와 폐쇄 TBI 사이에서 상당히 상이할 수 있다. 각각의 손상은 고유하지만, 전두엽 및 전두하 백질, 기저핵 및 간뇌, 입쪽 뇌 줄기, 및 해마를 포함한 측두엽을 포함하는 특정 뇌 영역이 외상-유도된 손상에 특히 취약하다 (McAllister, T.W. Dialogues Clin. Neurosci. 13:287-300, 2011). TBI는 여러 신경전달물질계의 변화를 유도할 수 있으며, 신경행동학적 장애와 관련이 있을 수도 있는 카테콜아민성 및 콜린성 시스템에서 급성기 및 만성 변경 동안에 글루타메이트 및 다른 자극성 아미노산의 방출을 포함한다 (McAllister, 2011, supra). 중요한 TBI의 생존자는 종종 인지 결함, 인격 변화, 및 정신 장애 증가, 특히 우울증, 불안함, 및 외상 후 스트레스 장애로 고통받는다. 치열한 연구에도, TBI에 대하여 사망률 및 이환률을 감소시키고 기능적인 결과를 향상시킬 수 있는 임상적으로 효과적인 치료가 발견되지 않았다.
인자 및 TBI
많은 연구에서 보체 단백질과 알츠하이머병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 귈랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 뇌 낭창(cerebral lupus), 및 뇌졸중을 포함한 신경 장애의 관계가 확인되었다 (Wagner, E., et al., Nature Rev Drug Disc. 9: 43-56, 2010에서 리뷰됨). 최근에 시냅스 배출시 C1q 및 C3에 대한 역할이 입증되었으며, 따라서 보체 인자는 정상적인 CNS 기능 및 신경변성 질환 둘 다에 수반되었을 가능성이 크다 (Stevens, B. et al., Cell 131: 1164-1178, 2007). MASP-1 및 MASP-3에 대한 유전자는 뇌와 신경교종(glioma) 세포주, T98G에서도 광범위하게 발현되며 (Kuraya, M. et al., Int Immunol., 15:109-17, 2003), CNS에서 렉틴 경로의 역할과 일치한다.
MASP-1 및 MASP-3은 병원체 및 변형 자기-세포에 대한 방어를 매개하기 위한 열쇠이지만, 렉틴 경로 또한 뇌졸중, 심장마비, 및 다른 허혈 재관류 손상 후 심각한 조직 손상의 원인이 된다. 유사하게, MASP-1 및 MASP-3은 TBI에 의해 유발되는 조직 손상의 적절한 매개자일 가능성이 크다. 대체 경로에서 인자 B의 억제는 두 가지 마우스 모델에서 TBI를 감소시키는 것으로 나타났다. 인자 B 넉아웃 마우스는 TBI 이후 보체-매개된 신경 염증 및 신경병리 상태로부터 보호된다 (Leinhase I, et al., BMC Neurosci. 7:55, 2006). 이에 더하여, 항-인자 B 항체는 TBI 유도된 마우스에서 뇌 조직 손상 및 신경세포 사멸을 감소시킨다 (Leinhase I, et al., J 신경 염증 4:13, 2007). MASP-3은 직접적으로 인자 B를 활성화시키고 (Iwaki, D. et al., J Immunol. 187:3751-8, 2011) 그러므로 TBI에서 적절한 매개자이다. 인자 B의 억제와 유사하게, LEA-1 억제자, 예컨대 MASP-3에 대한 항체는 TBI에서 조직 손상 및 이후의 후유증을 치료하기 위한 유망한 계획을 제공할 것으로 예상된다.
따라서, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 TBI에서 독립적인 치료적 이점을 가질 수도 있다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대한 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2를 결합하고 차단할 수 있는 이중-특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 외상성 뇌 손상을 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 외상성 뇌 손상으로 고통받고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 두개내, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 외상성 뇌 손상을 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, 외상성 뇌 손상으로 고통받고 있는 대상체에게 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 외상성 뇌 손상을 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 외상성 뇌 손상으로 고통받고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 외상성 뇌 손상을 치료하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하, 두개내, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 외상성 뇌 손상을 치료하거나 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체으 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 외상성 뇌 손상에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 외상성 뇌 손상으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공하는데 본원에서 개시된 바와 같이 외상성 뇌 손상을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
K. 흡인성 폐렴에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된 MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
흡인(aspiration)은 구강인두 또는 위 내용물의 하부 기도로의 흡입으로 정의된다. 흡인은 흡인성 (화학적) 폐렴, 1차 박테리아 박테리아 흡인성 폐렴, 또는 화학적 폐렴의 2차 박테리아 감염의 합병증을 초래할 수도 있다. 흡인에 대한 위험 인자는 감소된 의식 수준 (예를 들어, 두부 외상, 감각 중추의 알콜 또는 약물-유도된 변화, 뇌졸중), 다양한 위장 및 식도 이상, 및 신경근 질환을 포함한다. 지역-후천적 폐렴의 450만 건의 사례 중 5-15%가 흡인성 폐렴으로 인한 것으로 추정된다 (Marik, P.E. New Engl. J. Med. 344:665-671, 2001). 화학적 폐렴의 치료가 주로 지지되고 경험적 항생제의 사용은 논란이 많다. 박테리아 흡인성 폐렴의 치료는 적절한 항생제를 이용하여 이루어지며, 이것은 원인이 되는 유기체가 이들 설정마다 다르기 때문에 흡인이 지역 내에서 또는 병원에서 발생하는지에 따라 다르다. 고위험 환자, 예를 들어 구역 반사가 손상된 양로원 내 노인 환자에서 흡인을 방지하기 위한 조치가 취해져야 한다. 효과적인 예방인 것으로 보이는 조치는 음식 섭취 중 침대 머리 높이기, 치과 예방, 및 양호한 구강 위생을 포함한다. 예방적 항생제는 효과적인 것으로 보이지 않았고 저항성 유기체의 등장으로 이어질 수도 있기 때문에 권장되지 않는다.
보체 구성요소의 조절이 감염성 질환---패혈증, 바이러스, 박테리아, 및 균류 감염---및 폐 병태---호흡 곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 낭포성 섬유종(cystic fibrosis)을 포함하는 많은 임상적 징후에 대하여 제안되었다 (Wagner, E., et al., Nature Rev Drug Disc. 9: 43-56, 2010에서 리뷰됨). 이 제안에 대해서는 많은 임상적 및 유전적 연구에 의해 지지된다. 예를 들어, 임상적 결핵과 함께 낮은 수준의 MBL을 가진 환자의 빈도가 크게 감소하였으며 (Soborg et al., Journal of Infectious Diseases 188:777-82, 2003), 낮은 수준의 MBL이 질환으로부터의 보호와 관련이 있다는 것을 시사한다.
산 흡인 손상의 쥐 모델에서, Weiser MR et al., J. Appl. Physiol. 83(4): 1090-1095, 1997은 C3-넉아웃 마우스가 심각한 손상으로부터 보호되는 반면에; C4-넉아웃 마우스는 보호되지 않았다는 것을 입증하였으며, 보체 활성화가 대체 경로에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. 그 결과, LEA-1 억제자로 대체 경로를 차단하는 것은 흡인성 폐렴에서 치료적 이점을 제공할 것으로 예상된다.
따라서, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 흡인성 폐렴에서 독립적인 치료적 이점을 가질 수도 있다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중-특이성 항체에 포함될 수도 있다.
따라서 본 발명의 한 양태는 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 이러한 병태 또는 다른 보체 매개된 폐렴으로 고통받고 있는 대상체에게 투여함으로써 흡인성 폐렴을 치료하기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 흡입기에 의해 폐에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 흡인성 폐렴을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 흡인성 폐렴으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 흡인성 폐렴을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, 흡인성 폐렴으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 흡인성 폐렴을 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화를 둘 다 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 흡인성 폐렴으로 고통받고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 흡인성 폐렴을 치료하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하, 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중-억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로, 필요로 하는 대상체에서 흡인성 폐렴을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 흡인성 폐렴에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 흡인성 폐렴으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데 본원에서 개시된 바와 같이 흡인성 폐렴을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
L. 내안구염에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된 MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
내안구염은 안구내강의 염증성 병태이고 보통 감염에 의해 유발된다. 내안구염은 내생적이어서, 원거리 감염원 (예를 들어, 심장내막염(endocarditis))으로부터 유기체의 혈행성 확산으로부터 발생할 수도 있거나, 또는 외생적이어서, 안구 수술의 합병증, 이물질, 및/또는 안구 타박상 또는 안구 관통상으로서 외부로부터의 유기체의 직접적인 접종으로부터 유래될 수도 있다. 외생적 내안구염이 내생적 내안구염보다 훨씬 더 일반적이고 외생적 내안구염의 대부분의 사례는 안구 수술 이후에 발생한다. 미국에서, 백내장 수술이 내안구염의 주요 원인이고 이 수술의 0.1-0.3%에서 발생하며, 지난 10년 동안 발병률이 명백하게 증가하였다 (Taban, M. et al., Arch. Ophthalmol. 123:613-620, 2005). 수술 후 내안구염은 급성으로, 수술 2주 내에, 또는 지연되거나, 수술 후 수 개월 후에 나타날 수도 있다. 급성 내안구염은 전형적으로 통증, 홍조, 눈꺼풀 붓기, 및 시력 감소를 나타낸다. 지연성 내안구염은 급성 형태보다 덜 일반적이고 환자는 단지 가벼운 통증 및 감광성을 보고할 수도 있다. 내안구염의 치료는 근본적인 원인에 의존적이고 전신 및/또는 유리체내 항생제를 포함할 수도 있다. 내안구염은 시력 감소 또는 상실을 초래할 수도 있다.
AMD에 대하여 이전에 기술된 바와 같이, 다수의 보체 경로 유전자가 안과학적 장애와 관련이 있으며, 이것들은 구체적으로 렉틴 경로의 유전자를 포함한다. 예를 들어, MBL2는 AMD의 하위유형으로 확인되었다 (Dinu V, et al., Genet Epidemiol 31: 224-37, 2007). LEA-1 및 LEA-2 경로는 안구 염증성 병태, 예컨대 내안구염에 수반될 가능성이 크다 (Chow SP et al., Clin Experiment Ophthalmol. 39:871-7, 2011). Chow 등은 내안구염에 걸린 환자의 MBL 수준을 검사하였고 염증이 생긴 인간의 눈에서 MBL 수준 및 기능적 렉틴 경로 활성 둘 다가 상당히 높아졌지만 염증이 생기지 않은 대조군에서는 사실상 검출 불가능하다는 것을 입증하였다. 이것은 시력을 위협하는 안구 염증성 병태, 특히 내안구염에서 MBL 및 렉틴 경로의 역할을 시사한다. 또한, 각막의 균질 각막염(fungal keratitis)의 쥐 모델에서, MBL-A 유전자는 다섯 개의 상향조절된 염증 경로 유전자 중 하나였다 (Wang Y., et al., Mol Vis 13: 1226-33, 2007).
따라서, LEA-1 및 LEA-2 억제자는 내안구염을 치료하는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중-특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 내안구염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 내안구염으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은, 예컨대 국부적 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 관주법 또는 도포에 의해, 또는 유리체내 투여에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 내안구염을 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 내안구염으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 내안구염을 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 내안구염으로 고통받고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 내안구염을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는, 예컨대 국부적 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 관주법 또는 도포에 의해, 또는 유리체내 투여에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 대상체에서 내안구염을 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 내안구염에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 내안구염으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데 본원에서 개시된 바와 같이 내안구염을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
M. 시속척수염에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된 MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
시속척수염 (NMO)은 시신경 및 척수를 표적으로 하는 자가면역 질환이다. 이것은 시신경염(optic neuritis)으로 알려져 있는 시신경 염증, 및 척수염(myelitis)으로 알려져 있는 척수 염증을 초래한다. NMO에서 척수 병소는 다리 또는 팔의 쇠약 또는 마비, 실명, 방광 및 장 기능장애, 및 감각 기능장애로 이어질 수도 있다.
NMO는 다발성 경화증 (MS)과 여러 가지 유사성을 공유하는데, 둘 다 CNS 표적의 면역 공격으로 인한 것이고 둘 다 수초 탈락(demyelination)을 초래하기 때문이다 (Papadopoulos and Verkman, Lancet Neurol., 11(6):535-44, 2013). 하지만, NMO의 분자적 표적, 치료, 및 병소는 MS의 것들과는 별개의 것들이다. MS가 대체로 T 세포에 의해 매개되는 한편, NMO 환자는 전형적으로 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 둘러싼 성상세포에서 발견되는 단백질인 물 채널 단백질 아쿠아포린 4 (AQP4)를 표적으로 하는 항체를 갖는다. 인터페론 베타가 MS에 대하여 가장 일반적으로 사용되는 요법이지만, 일반적으로 NMO에서는 해로운 것으로 알려져 있다. NMO의 염증 병소는 척수 및 시신경에서 발견되고 백질 및 회색질을 포함한 뇌로 진행될 수도 있다. NMO 병소에서 발생하는 수초 탈락은 보체에 의해 매개된다 (Papadopoulos and Verkman, Lancet Neurol., 11(6):535-44, 2013).
보체-의존적 세포독성은 NMO 발병의 원인이 되는 주요 메커니즘인 것으로 보이고 NMO 환자의 90 이상이 AQP4에 대한 IgG 항체를 갖는다 (Jarius 및 Wildemann, Jarius S, Wildemann B., Nat Rev Neurol. 2010 Jul;6(7):383-92). 이들 항체는 혈액 뇌 장벽에서 병소의 형성을 시작한다. 성상세포의 표면 상에서 초기 항원-항체 복합체---AQP4/AQP4-IgG---는 보체 고전적 경로를 활성화시킨다. 이것은 성상세포 표면 상에서 막 공격 복합체의 형성을 일으켜, 과립구 침투, 수초 탈락, 및 궁극적으로는 성상 세포, 희돌기교세포 및 뉴런의 괴사로 이어진다 (Misu et al., Acta Neuropathol 125(6):815-27, 2013). 이들 세포적 이벤트는 조직 파괴 및 낭포성 괴사 병소의 형성에서 반영된다.
보체의 고전적 경로는 분명히 NMO 발병에 중요하다. NMO 병소는 면역글로불린 및 활성화된 보체 구성요소의 혈관 중심(vasculo centric) 침착을 나타낸다 (Jarius et al., Nat Clin Pract Neurol. 4(4):202-14, 2008). 이에 더하여, 보체 단백질, 예컨대 C5a는 NMO 환자의 뇌척수액으로부터 분리되었다 (Kuroda et al., J Neuroimmunol.,254(1-2):178-82, 2013). 또한, NMO 환자로부터 얻은 혈청 IgG는 마우스 NMO 모델에서 보체-의존적 세포독성을 유발할 수 있다 (Saadoun et al., Brain, 133(Pt 2):349-61, 2010). C1q에 대한 단클론성 항체는 NMO의 마우스 모델에서 성상세포 및 병소의 보체 매개된 파괴를 방지한다 (Phuan et al., Acta Neuropathol, 125(6):829-40, 2013).
보체의 대체 경로는 전체적인 보체 활성을 증폭시키는 역할을 한다. Harboe 및 그 동료 (2004)는 대체 경로의 선택적 차단이 고전적 경로에 의해 유도된 80% 초과의 막 공격 복합체 형성을 억제한다는 것을 입증하였다 (Harboe et al., Clin Exp Immunol 138(3):439-46, 2004). Tuzun 및 그 동료 (2013)는 NMO 환자에서 고전적 경로 및 대체 경로 생성물 둘 다를 검사하였다 (Tuzun E, et al., J Neuroimmunol. 233(1-2): 211-5, 2011). C4의 분해 산물인 C4d는 고전적 경로 활성을 평가하기 위해 측정되었고 대조군과 비교하여 NMO 환자 혈청에서 증가되었다 (2.14배 증가). 이에 더하여, 대체 경로 인자 B의 분해 산물인 인자 Bb의 증가는 MS 환자 또는 정상 대조군 개체와 비교하여 NMO 환자에서 관찰되었다 (1.33배 증가). 이것은 대체 경로 기능이 또흔 NMO에서 증가된다는 것을 시사한다. 이 활성화는 전체적인 보체 활성화를 증가시킬 것으로 예상되고, 실제로 보체 캐스케이드의 최종 생성물인 sC5b-9가 크게 증가하였다 (4.14배 증가).
MASP-3의 특이적 억제자는 NMO로 고통받고 있는 환자를 치료하는데 있어서 이점을 제공할 것으로 예상된다. 본원에서 입증된 바와 같이, MASP-3이 없는 혈청은 C5 전환효소의 필수 구성요소인 인자 B, 또는 대체 경로의 중심 활성화 물질인 인자 D를 활성화시킬 수 없다. 그러므로, 항체 또는 소분자와 같은 억제제로 MASP-3 활성을 차단하는 것은 또한 인자 B 및 인자 D의 활성화를 억제할 것으로 예상된다. 이들 두 인자의 억제는 대체 경로의 증폭을 저지하여, 전체적인 보체 활성을 감소시킨다. 그러므로 MASP-3 억제는 NMO에서 치료적 결과를 크게 향상시켜야 한다.
따라서, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제자는 NMO에서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중-특이성 항체에 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 NMO를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 NMO로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은, 예컨대 국부적 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 관주법 또는 도포에 의해, 또는 유리체내 투여에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, NMO를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 NMO로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 방법이 제공되며, NMO를 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 NMO로 고통받고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 NMO를 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는, 예컨대 국부적 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 관주법 또는 도포에 의해, 또는 유리체내 주사에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 코, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP 2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 대상체에서 NMO를 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 시속척수염 (NMO)에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 시속척수염 (NMO)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데, 본원에서 개시된 바와 같이 시속척수염 (NMO)을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
N. 베체트 병에서 MASP-3의 역할, 및 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된 MASP-3 억제 항체를 사용하는 치료 방법
베체트 병, 또는 베체트 증후군은 종종 점막 궤양 및 안구 문제를 제공하는 희귀성 면역-매개된 소혈관 전신성 맥관염이다. 베체트 병 (BD)은 터키 피부과 전문의 Hulusi Behcet가 재발성 구강 궤양, 음부 궤양, 및 포도막염의 3 증상 복합체를 처음 기술한 이후 1937년 명명되었다. BD는 원인 불명의 전신성 재발성 염증 장애이다. BD의 염증성 맥관주위염은 위장관, 폐, 근골격, 심혈관, 및 신경계를 수반할 수도 있다. BD는 파열된 혈관 동맥류s 또는 중증 신경학적 합병증 때문에 치명적일 수도 있다. 시신경병증 및 위축증은 맥관염 및 시신경을 공급하는 혈관의 폐색으로부터 발생할 수도 있다. Al-Araji A, et al., Lancet Neurol., 8(2):192-204, 2009 참조.
BD의 최고 발병률은 중동 및 극동 지역에서 일어나지만, 유럽 및 북미에서는 드물다. BD는 초기에는 코르티코스테로이드 및 면역억제제로 종종 제어되지만, 많은 사례들이 난치성이며 심각한 이환률 및 사망률을 갖는다. 인터페론-알파, IVIG, 항-TNF, 항-IL-6, 및 항-CD20을 포함하는 생물학적 작용제는 일부 사례에서는 이점을 나타냈지만, 최고의 치료에 대한 합의는 이루어지지 않았다.
BD는 분명히 염증성 장애이지만, 그것의 병리생리학은 분명하지 않다. HLA 항원과의 유전적인 관계가 있고, 전장 유전체 연관 연구는 많은 사이토카인 유전자와 관련이 있다 (Kirino et al., Nat Genet, 45(2):202-7, 2013). 면역계의 과다 활성은 보체 시스템에 의해 조절되는 것으로 보인다. C3 수준의 증가가 BD 환자 혈청에서 관찰되었고 (Bardak 및 Aridoðan, Ocul Immunol Inflamm 12(1):53-8, 2004), 뇌척수액 내 증가된 C3 및 C4는 질환과 관련이 있다 (Jongen et al., Arch Neurol, 49(10):1075-8, 1992).
Tuzun 및 그 동료 (2013)는 BD 환자의 혈청에서 고전적 경로 및 대체 경로 생성물 둘 다를 검사하였다 (Tuzun E, et al., J Neuroimmunol, 233(1-2):211-5, 2011). C4의 분해 산물 4d는 대체 경로의 업스트림에서 생성되고 초기 고전적 경로 활성을 평가하기 위해 측정되었다. C4d는 대조군과 비교하여 BD 환자 혈청에서 증가되었다 (2.18배의 증가). 인자 Bb는 인자 BDML 분해 산물이고, 대체 경로의 활성을 결정하기 위해 측정되었다. BD 환자는 정상 대조군 개체와 비교하여 인자 Bb가 증가하였으며 (2.19배의 증가) BD 대체 경로 기능의 증가와 일치한다. 보체의 대체 경로가 전체적인 보체 활성을 증폭시키는 역할을 하기 때문에, 이 활성화는 전체적인 보체 활성화를 증가시킬 것으로 예상된다. Harboe 및 그 동료 (2004)는 대체 경로의 선택적 차단이 고전적 경로에 의해 유도된 80% 초과의 막 공격 복합체 형성을 억제한다는 것을 입증하였다 (Harboe M, et al., Clin Exp Immunol, 138(3):439-46, 2004). 실제로, 보체 캐스케이드의 최종 생성물인 sC5b-9는 BD 환자에서 크게 증가하였다 (5.46배 증가). MASP-3의 특이적 억제자는 BD에서 이점을 제공해야 한다. MASP-3을 차단하는 것은 인자 B 및 인자 D의 활성화를 억제해야 한다. 이것은 대체 경로의 증폭을 중단시켜, 전체적인 보체 활성의 반응을 감소시키는 결과를 초래한다. 따라서 MASP-3 억제는 BD에서 치료적 결과를 크게 향상시켜야 한다. 그러므로, LEA-1 및/또는 LEA-2 억제자는 BD를 치료하는데 있어서 독립적인 치료적 이점을 가질 것으로 예상된다. 이에 더하여, 함께 사용된 LEA-1 및 LEA-2 억제자는 작용제 단독과 비교하여 추가적인 치료적 이점을 달성할 수도 있거나, 또는 광범위한 환자 부분 집합에 대하여 효과적인 치료를 제공할 수도 있다. 조합된 LEA-1 및 LEA-2 억제는 LEA-1-차단제 및 LEA-2-차단제의 동시-투여에 의해 달성될 수도 있다. 최적으로, LEA-1 및 LEA-2 억제 기능은 단일 분자 실체물, 예컨대 MASP-1/3 및 MASP-2-특이적 결합 부위로 구성된 이중-특이적 항체, 또는 각각의 결합 부위가 MASP-1/3 또는 MASP-2에 결합하고 차단하는 이중-특이성 항체로 포함될 수도 있다.
그러므로, 상기 언급된 바에 따르면, 본 발명의 양태는 BD를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 의존적 보체 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 약학적 담체 중의 MASP-1 억제제, MASP-3 억제제, 또는 MASP-1/3 억제제의 조합을 포함하는 LEA-1 억제제의 치료적 유효량을 포함하는 조성물을 BD로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제 조성물은, 예컨대 국부적 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 관주법 또는 도포에 의해, 또는 유리체내 투여에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 코, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
또 다른 양태에서, BD를 치료하거나, 예방하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-2-의존적 보체 활성화를 억제하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제의 치료적 유효량을 BD로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, BD를 치료하거나, 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 LEA-1 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함하는 방법이 제공되며, MASP-2 억제제 및 MASP-1, MASP-3, 또는 MASP-1/3 억제제의 치료적 유효량을 BD로 고통받고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 LEA-1-의존적 보체 활성화 및 LEA-2-의존적 보체 활성화 둘 다를 억제하는 단계를 포함한다. 상기 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로 LEA-1 및 LEA-2를 차단하는 약리학적 작용제의 조합의 사용은 LEA-1 단독의 억제와 비교하여 BD를 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데 있어서 향상된 치료 결과를 제공할 것으로 예상된다. 이 결과는, 예를 들어, LEA-2-차단 활성을 가진 항체와 함께 LEA-1-차단 활성을 가진 항체의 동시-투여에 의해 달성될 수 있다. 일부 구체예에서, LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성은 단일 분자 실체물로 조합되고, 이러한 실체물은 조합된 LEA-1- 및 LEA-2-차단 활성을 갖는다. 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1에 특이적으로 결합하고 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 항체를 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수도 있다. 대안으로, 이러한 실체물은 하나의 항원-조합 부위가 MASP-3을 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하고 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다. 이러한 실체물은 최적으로 하나의 항원-조합 부위가 MASP-1 및 MASP-3 둘 다를 특이적으로 인식하여 LEA-1을 차단하는 한편 또 다른 항원-조합 부위가 MASP-2를 특이적으로 인식하고 LEA-2를 차단하는 이중특이적 단클론성 항체로 구성될 수도 있다.
MASP-2 억제제는, 예컨대 국부적 겔, 고약 또는 점적제의 형태의 조성물의 관주법 또는 도포에 의해, 또는 유리체내 주사에 의해 눈에 국소적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신으로, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 코, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비 펩타이드성 작용제에 대해서는 경구 투여에 의해 투여될 수도 있다. 투여는 병태가 치유되었거나 제어될 때까지 의사에 의해 결정된 바에 따라 반복될 수도 있다.
본 발명의 MASP-3 억제 조성물 및/또는 MASP-2 억제 조성물의 적용은 필요로 하는 대상체에서 BD를 치료하거나 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키기 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-2 및/또는 MASP-3 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다. 대안으로, 조성물은 필요로 하는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
본원에서 실시예 11-21에서 기술된 바와 같이, AP-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 베체트 병 (BD)에서 대체 경로의 억제를 위한 치료적 유용성을 가진 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 생성되었다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 베체트 병 (BD)으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는데 본원에서 개시된 바와 같이 베체트 병 (BD)을 치료하거나 또는 이것에 걸릴 위험을 감소시키기 위해 인간 MASP-3에 결합하여 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 고 친화도 단클론성 항체 또는 이것의 항원 결합 단편의 유효량을 포함하며, 예를 들어, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) 서열 번호:86 또는 서열 번호:275를 포함하는 VHCDR2 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하는 VLCDR1 (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
MASP-3 억제제
보체의 렉틴 경로가 두 개의 주요 보체 활성화 아암, LEA-1 및 LEA-2로 구성되고, 렉틴-독립적 보체 활성화 아암이 또한 존재한다는 인식이 형성되면서, 보체의 면역 방어 능력을 완전히 정지시키지 않은 채로 (즉, 고전적 경로를 온전하게 남겨둔 채로), 대체 경로 보체 활성화와 관련된 병리 상태, 예컨대 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD, 습성 및 건성 AMD를 포함함), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 또는 이식-관련 TMA 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증 (MS), 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증 중 적어도 하나를 유발하는 이들 효과기 아암 중 하나 이상을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직하다는 것을 알게 된다. 이것은 C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 온전하게 남겨두어 면역 복합체 과정을 처리하고 감염에 대한 숙주 방어를 도울 것이다.
LEA-1-매개된 보체 활성화를 억제하는 조성물
본원에서 기술된 바와 같이, 발명자들은 용해로 이어지는 LEA-1의 활성화가 MASP-3-의존적이라는 것을 예상치 못하게 발견하였다. 본원에서 더 기술된 바와 같이, 생리학적 조건 하에서, MASP-3-의존적 LEA-1 활성화는 또한 옵소닌화에 기여하고, 이로써 LEA-2-매개된 보체 활성화에 부가적인 효과를 제공한다. 본원에서 입증된 바와 같이, Ca++의 존재시, 인자 D는 요구되지 않는데, MASP-3이 인자 D-/- 혈청에서 LEA-1의 활성화를 구동시킬 수 있기 때문이다. MASP-3, MASP-1, 및 HTRA-1은 프로-인자 D를 활성 인자 D로 전환시킬 수 있다. 유사하게, MASP-3 활성화는, 많은 경우에서, MASP-1 의존적인 것으로 보이는데, MASP-3 (MASP-1 및 MASP-2와 대조됨)은 자가-활성화 효소가 아니고 MASP-1의 도움 없이는 활성 형태로 전환될 수 없다 (Zundel, S. et al., J.Immunol. 172: 4342-4350 (2004); Megyeri et al., J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013). MASP-3이 자가활성화되지 않고, 많은 경우에, 효소적 활성 형태로 전환되기 위해 MASP-1의 활성을 필요로 하는 것처럼, 대체 경로 C3 전환효소 C3Bb의 MASP-3-매개된 활성화는 MASP-3 치모겐 또는 이미 활성화된 MASP-3을 표적화하거나, 또는 MASP-3의 MASP-1-매개된 활성화를 표적화함으로써, 또는 둘 다에 의해 억제될 수 있는데, 많은 경우에, MASP-1 기능적 활성의 부재시 MASP-3이 치모겐 형태로 남아있고 대체 경로 C3 전환효소 (C3bBb)의 직접적인 형성을 통해 LEA-1을 구동시킬 수 없기 때문이다.
그러므로, 본 발명의 한 양태에서, LEA-1을 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발시 표적화하기에 바람직한 단백질 구성요소는 MASP-3의 억제자 (MASP-1-매개된 MASP-3 활성화의 억제자 (예를 들어, MASP-3 활성화를 억제하는 MASP-1 억제자) 포함)이다.
상기 언급된 바에 따르면, 한 양태에서, 본 발명은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 MASP-3 억제제, 예컨대 MASP-3 억제 항체를 투여함으로써 LEA-1의 부작용 (즉, 용혈 및 옵소닌화)을 억제하는 방법을 제공하며, MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-3의 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
MASP-3 억제제는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 살아있는 대상체에서 MASP-3-의존적 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 본 발명의 이 양태의 실시에서, 대표적인 MASP-3 억제제는 다음을 포함한다: 인자 B의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화, 프로-인자 D의 렉틴 MASP-3-의존적 활성화, 인자 B의 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적 활성화, 및 프로-인자 D의 MASP-3-의존적, 렉틴-독립적 활성화 중 적어도 하나 이상을 억제하는 분자를 포함하는 MASP-3의 생물학적 활성을 억제하는 분자 (예컨대 소분자 억제자, MASP-3 항체 및 그 단편, 또는 MASP-3과 상호작용하거나 또는 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 차단 펩타이드), 및 MASP-3의 발현을 감소시키는 분자 (예컨대 MASP-3 안티센스 핵산 분자, MASP-3 특이적 RNAi 분자 및 MASP-3 리보자임). MASP-3 억제제는 MASP-3 단백질-대-단백질 상호작용을 효과적으로 차단하거나, MASP-3 다이머화 또는 조립을 방해하거나, Ca++ 결합을 차단하거나, MASP-3 세린 프로테아제 활성 부위를 방해하거나, 또는 MASP-3 단백질 발현을 감소시키고, 이로써 MASP-3이 LEA-1-매개된, 또는 렉틴-독립적인 보체 활성화되는 것을 방지할 수도 있다. 본원에서 더 기술된 바와 같이, MASP-3 억제제는 1차 요법으로서 단독으로 또는 다른 의학적 치료의 치료적 이점을 향상시키기 위한 보조 요법으로서 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
고 친화도 단클론성 MASP-3 억제 항체
본원에서 실시예 11-21에서 기술되고, 하기 표 2A, 2B 및 표 3에서 요약된 바와 같이, 발명자들은 놀랍게도 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에서 에피토프에 결합하는 고 친화도 (즉, ≤500 pM) MASP-3 억제 항체를 생성하였다. 본원에서 기술된 바와 같이, 발명자들은 이들 고 친화도 MASP-3 항체가 인간 혈청, 설치류 및 비-인간 영장류에서 대체 경로 보체 활성화를 억제할 수 있다는 것을 입증하였다. 이 항체들의 가변 경쇄 및 중쇄 영역이 시퀀싱되고, 단리되어 Fab 포맷 및 전장 IgG 포맷 둘 다에서 분석되었다. 실시예 15에서 기술되고, 도 50A 및 50B에서 도시된 계통수에서 나타난 바와 같이, 항체는 서열 유사성에 따라 분류될 수 있다. 이 항체들의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 개요는 도 49A 및 49B에 나타나있고 하기 표 2A 및 2B에서 제공된다. 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 인간화된 버젼이 실시예 19에서 기술된 바와 같이 생성되었고 표 3에서 요약된다.
[표 2a]
Figure pat00001
[표 2b]
Figure pat00002
대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 항체: 인간화되고 번역 후 변형 부위를 제거하기 위해 변형됨
MASP-3 항체 참조 번호 중쇄 가변 영역 aa
(서열 번호)
 경쇄 가변 영역 aa
(서열 번호)
 중쇄:
CDR1; CDR2; CDR3
(서열 번호)		 경쇄:
CDR1; CDR2;
CDR3
(서열 번호)
4D5 모체 24 40 56;58;60 142;144;146
h4D5-14-1 248 250 56;58;60 142;144;146
h4D5-19-1 249 250 56;58;60 142;144;146
h4D5-14-1-NA 248 278 56;58;60 258;144;146
h4D5-19-1-NA 249 278 56;58;60 258;144;146
10D12 모체 28 43 72;74;76 153;155;157
h10D12-45-21 251 253 72;74;76 153;155;157
h10D12-49-21 252 253 72;74;76 153;155;157
h10D12-45-21-GA 251 279 72;74;76 263;155;157
h10D12-49-21-GA 252 279 72;74;76 263;155;157
13B1 모체 30 45 84;86;88 142;144;161
h13B1-9-1 254 256 84;275;88 142;144;161
h13B1-10-1 255 256 84;86;88 142;144;161
h13B1-9-1-NA 254 280 84;275;88 258;144;161
h13B1-10-1-NA 255 280 84;86;88 258;144;161
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 고 친화도 (500 pM 미만의 KD를 가짐)로 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728)에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공하며, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 대체 경로 보체 활성화를 억제한다. 일부 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편은 포유류 대상체에서 표적 MASP-3 대 mAb 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비에서 대체 경로를 억제한다. 대체 경로 보체 활성화의 억제는 본 발명의 다양한 구체예에 따라 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템 구성요소의 다음 변화들 중 적어도 하나 이상을 특징으로 한다: 용혈 및/또는 옵소닌화 억제; 인자 B의 렉틴-독립적 전환의 억제; 인자 D의 렉틴-독립적 전환의 억제, MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분열의 억제; 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착의 감소; 활성화 표면 상의 인자 B 및 Bb 침착의 감소; 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 잔류 수준의 감소 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음); 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소; 및/또는 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 잔류 수준 및 표면-유도된 수준의 생산.
예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 포유류 대상체에서 인자 D 성숙화 (즉, 인자 D로의 프로-인자 D의 분열)를 억제할 수 있는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 전체 혈청에서 인자 D 성숙화를 미처리 대조군 혈청에서 발견된 것의 50% 미만 (예컨대 MASP-3 억제 항체와 접촉되지 않은 미처리 대조군 혈청의 40% 미만, 예를 들어 30% 미만, 예컨대 25% 미만, 예를 들어 20% 미만, 예컨대 15% 미만, 예를 들어 10% 미만, 예컨대 5% 미만)의 수준으로 억제할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 대체 경로를 선택적으로 억제하여, C1q-의존적 보체 활성화 시스템을 기능적으로 온전하게 놔둔다.
또 다른 양태에서, 본 개시물은 본원에서 개시된 MASP-3 억제 항체 또는 항원-결합 단편 중 어느 것의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 핵산 분자를 특징으로 한다. 또한 상기 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터) 및 상기 벡터를 포함하는 세포 (예를 들어, 곤충 세포, 박테리아 세포, 균류 세포, 또는 포유류 세포)를 특징으로 한다. 본 개시물은 본원에서 개시된 MASP-3 억제 항체 또는 항원-결합 단편 중 어느 것을 생산하기 위한 방법을 더 제공한다. 방법은 본원에서 개시된 항체 또는 항원-결합 단편 중 어느 것의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 함유하는 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 세포 또는 세포의 배양물은 세포 (또는 세포들의 배양물)에 의해 핵산에 의해 암호화되는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 발현시키기에 충분한 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 배양된다. 방법은 또한 세포 (또는 세포들의 배양물)로부터 또는 세포 또는 세포들이 배양되는 배지로부터 항체 또는 이것의 항원 결합 단편을 단리시키는 단계를 포함할 수 있다.
MASP-3 에피토프s 및 펩타이드
실시예 18에서 기술되고, 도 62에서 예시되고 하기 표 4에서 요약된 바와 같이, 본 발명에 따른 고 친화도 MASP-3 억제 항체 및 그 항원-결합 단편은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728) 내에서 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 것으로 발견되었다. "특이적으로 인식하다"는 항체가 임의의 다른 분자 또는 그 일부에 대한 것보다 훨씬 더 높은 친화도로 상기 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다.
대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 항체: MASP-3의 에피토프 결합 영역 (도 62 참조)
인간 MASP-3 (w/선도)에 대한 펩타이드 결합 단편 (에피토프) MASP-3 mAb Ref No.

498VLRSQRRDTTVI509 (SIN:9)
 1F3, 4B6, 4D5, 1A10, 10D12,
494TAAHVLRSQRRDTTV508 (SIN:10)
 13B1
544DFNIQNYNHDIALVQ558 (SIN:11)
 1F3, 4B6, 4D5, 1A10
626PHAECKTSYESRS638 (SIN:12)
 13B1
639GNYSVTENMFC649 (SIN:13)
 1F3, 4B6, 4D5, 1A10
704VSNYVDWVWE713 (SIN:14)
 1F3, 4B6, 4D5, 1A10
498VLRSQRRDTTV508 (SIN:15)
I군의 코어 서열		 1F3, 4B6, 4D5, 1A10, 10D12, 13B1
435ECGQPSRSLPSLV447 (SIN:16)
 1B11
454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
II군 및 III군의 코어 서열		 1G4, 1E7, 2D7, 15D9, 2F5, 1B11
479KWFGSGALLSASWIL493 (SIN 18)
 15D9, 2F5
514EHVTVYLGLH523 (SIN:19)
 1E7, 2D7, 1G4
562PVPLGPHVMP571 (SIN:20)
 15D9, 2F5
583APHMLGL589 (SIN:21)
 1B11
614SDVLQYVKLP623 (SIN:22)
 1B11
667AFVIFDDLSQRW678 (SIN:23)
 1G4, 1E7, 2D7, 15D9, 2F5
따라서, 일부 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 다음 중 적어도 하나 내에 위치한다: VLRSQRRDTTVI (서열 번호:9), TAAHVLRSQRRDTTV (서열 번호:10), DFNIQNYNHDIALVQ (서열 번호:11), PHAECKTSYESRS (서열 번호:12), GNYSVTENMFC (서열 번호:13), VSNYVDWVWE (서열 번호:14) 및/또는 VLRSQRRDTTV (서열 번호:15). 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:15 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:9 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:10 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:12 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:10 및 서열 번호:12 내에서 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:11, 서열 번호: 13 및/또는 서열 번호:14 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 다음 중 적어도 하나 이상 내에 위치한다: ECGQPSRSLPSLV (서열 번호:16), RNAEPGLFPWQ (서열 번호:17); KWFGSGALLSASWIL(서열 번호:18); EHVTVYLGLH (서열 번호:19); PVPLGPHVMP (서열 번호:20); APHMLGL (서열 번호:21); SDVLQYVKLP (서열 번호:22); 및/또는 AFVIFDDLSQRW (서열 번호:23). 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:17 내에서 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 EHVTVYLGLH (서열 번호:19) 및/또는 AFVIFDDLSQRW (서열 번호:23) 내에서 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:18, 서열 번호:20 및/또는 서열 번호:23 내에서 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:16, 서열 번호: 21 및/또는 서열 번호:22 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다.
CDR 영역:
본 발명의 한 양태에서, 항체 또는 이것의 기능적 동등물은 특이적 초가변 영역을 포함하며, CDR로 지정된다. 바람직하게는, CDR은 카바트(Kabat) CDR 정의에 따르는 CDR이다. CDR 또는 초가변 영역은, 예를 들어, 다른 항체에 대한 서열 정렬에 의해 확인될 수도 있다. 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 CDR 영역은 표 18-23에 나타나있다.
IA군 mAb
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:209 (XXDIN, 여기서 위치 1의 X는 S 또는 T이고 위치 2의 X는 N 또는 D이다)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:210 (WIYPRDXXXKYNXXFXD, 여기서 위치 7의 X는 G 또는 D이고; 위치 8의 X는 S, T 또는 R이고; 위치 9의 X는 I 또는 T이고; 위치 13의 X는 E 또는 D이고; 위치 14의 X는 K 또는 E이고; 위치 16의 X는 T 또는 K이다)으로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:211 (XEDXY, 여기서 위치 1의 X는 L 또는 V이고, 위치 4의 X는 T 또는 S이다)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:212 (KSSQSLLXXRTRKNYLX, 여기서 위치 8의 X는 N, I, Q 또는 A이고; 위치 9의 X는 S 또는 T이고; 위치 17의 X는 A 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:146 (KQSYNLYT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:56 (TDDIN)을 포함한다. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:62 (SNDIN)를 포함한다. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:58 (WIYPRDDRTKYNDKFKD)을 포함한다. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:63 (WIYPRDGSIKYNEKFTD)을 포함한다. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:67 (WIYPRDGTTKYNEEFTD)을 포함한다. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:69 (WIYPRDGTTKYNEKFTD)를 포함한다. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:60 (LEDTY)을 포함한다. 한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:65 (VEDSY)를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:142 (KSSQSLLNSRTRKNYLA); 서열 번호:257 (KSSQSLLQSRTRKNYLA), 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA); 또는 서열 번호:259 (KSSQSLLNTRTRKNYLA)를 포함한다. 한 구체예에서, LC-CDR1은 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA)을 포함한다. 한 구체예에서, LC-CDR1은 서열 번호:149 (KSSQSLLISRTRKNYLS)를 포함한다.
한 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:56을 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:58을 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:60을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하고; LC-CDR2는 서열 번호:144를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:146을 포함한다.
한 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:62를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:63, 서열 번호:67 또는 서열 번호:69를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:65를 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:149를 포함하고, LC-CDR2는 서열 번호:144를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:146을 포함한다.
IB군 mAb
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:213 (SYGXX, 여기서 위치 4의 X는 M 또는 I이고 위치 5의 X는 S 또는 T이다)으로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:74로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:214 (GGXAXDY, 여기서 위치 3의 X는 E 또는 D이고 위치 5의 X는 M 또는 L이다)로 제시된 HC-CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:215 (KSSQSLLDSXXKTYLX, 여기서 위치 10의 X는 D, E 또는 A이고; 위치 11의 X는 G 또는 A이고; 위치 16의 X는 N 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:155로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:216 (WQGTHFPXT, 여기서 위치 8의 X는 W 또는 Y이다)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
한 구체예에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:72 (SYGMS)를 포함한다. 한 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:79 (SYGIT)를 포함한다. 한 구체예에서, HC-CDR3은 서열 번호:76 (GGEAMDY)을 포함한다. 한 구체예에서, HC-CDR3은 서열 번호:82 (GGDALDY)를 포함한다. 한 구체예에서, LC-CDR1은 서열 번호:153 (KSSQSLLDSDGKTYLN); 서열 번호:261 (KSSQSLLDSEGKTYLN), 서열 번호:262 (KSSQSLLDSAGKTYLN) 또는 서열 번호:263 (KSSQSLLDSDAKTYLN)을 포함한다. 한 구체예에서, LC-CDR1은 서열 번호:263 (KSSQSLLDSDAKTYLN)을 포함한다. 한 구체예에서, LC-CDR1은 서열 번호:152를 포함한다. 한 구체예에서, LC-CDR3은 서열 번호:159 (KSSQSLLDSDGKTYLS)를 포함한다.
한 구체예에서, LC-CDR3은 서열 번호:160 (WQGTHFPYT)을 포함한다. 한 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:72를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:74를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:76을 포함하고, LC-CDR1은 서열 번호:153, 서열 번호:261, 서열 번호:262 또는 서열 번호:263을 포함하고; LC-CDR2는 서열 번호:155를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:157을 포함한다.
한 구체예에서, HC-CDR은 서열 번호:72를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:74를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:76을 포함하고, LC-CDR1은 서열 번호:153 또는 서열 번호:263을 포함하고, LC-CDR2는 서열 번호:155를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:157을 포함한다.
한 구체예에서, HC-CDR1은 서열 번호:79를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:74를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:82를 포함하고, LC-CDR1은 서열 번호:159를 포함하고, LC-CDR2는 서열 번호:155를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:160을 포함한다.
IC군 mAb
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 번호:84 (GKWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:86 (EILPGTGSTNYNEKFKG) 또는 서열 번호:275 (EILPGTGSTNYAQKFQG)으로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:88 (SEDV)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:142 (KSSQSLLNSRTRKNYLA), 서열 번호:257 (KSSQSLLQSRTRKNYLA); 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA); 또는 서열 번호:259 (KSSQSLLNTRTRKNYLA)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:161 (KQSYNIPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 구체예에서, LC-CDR1은 서열 번호:258을 포함한다.
II군 mAb
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:91 (GYWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:93 (EMLPGSGSTHYNEKFKG)으로 제시된 HC-CDR2, 및 서열 번호:95 (SIDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호:163 (RSSQSLVQSNGNTYLH)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:165 (KVSNRFS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:167 (SQSTHVPPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
III군 mAb
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다: (a) 서열 번호:109 (RVHFAIRDTNYWMQ)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:110 (AIYPGNGDTSYNQKFKG)으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:112 (GSHYFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:182 (RASQSIGTSIH)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:184 (YASESIS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:186 (QQSNSWPYT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호:125 (DYYMN)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:127 (DVNPNNDGTTYNQKFKG)로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:129 (CPFYYLGKGTHFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:196 (RASQDISNFLN)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:198 (YTSRLHS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:200 (QQGFTLPWT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 서열 번호:137로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:138로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:140으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:206으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:207로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:208로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열 번호:98로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:99로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:101로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:169로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:171로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:173으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(e) 서열 번호:103으로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:105로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:107로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:176으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(f) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:116으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:118로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:188로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:190으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(g) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:121로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:123으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:191로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(h) 서열 번호:132로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:133으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:135로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:203으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:165로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:204로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
중쇄 및 경쇄 가변 영역
한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 24-39, 248-249, 251-252, 254-255 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것들로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 항체가 서열 번호:24, 서열 번호:25, 서열 번호:26, 서열 번호:27, 서열 번호:28, 서열 번호:29, 서열 번호:30, 서열 번호:31, 서열 번호:32, 서열 번호:33, 서열 번호:34, 서열 번호:35, 서열 번호:36, 서열 번호:37, 서열 번호:38, 서열 번호:39, 서열 번호:248, 서열 번호:249, 서열 번호:251, 서열 번호:252, 서열 번호:254 또는 서열 번호:255를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 40-54, 250, 253, 256, 278, 279, 또는 280 중 어느 것과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 동일한 서열을 포함하거나 이것들로 구성된 경쇄 가변영역을 포함하거나 또는 항체가 서열 번호:40, 서열 번호:41, 서열 번호:42, 서열 번호:43, 서열 번호:44, 서열 번호:45, 서열 번호:46, 서열 번호:47, 서열 번호:48, 서열 번호:49, 서열 번호:50, 서열 번호:51, 서열 번호:52, 서열 번호:53, 서열 번호:54, 서열 번호:250, 서열 번호:253, 서열 번호:256, 서열 번호:278, 서열 번호:279 또는 서열 번호:280을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 제공한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:24, 서열 번호:248 또는 서열 번호:249와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:40, 서열 번호:250 또는 서열 번호:278과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:25와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:26과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:27과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:28, 서열 번호:251 또는 서열 번호:252과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:43, 서열 번호:253 또는 서열 번호:279와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:29와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:30, 서열 번호:254 또는 서열 번호:255와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:45, 서열 번호:256 또는 서열 번호:280과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:31과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:46과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:32와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:47과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:33과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:48과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:34와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:49와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:35와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:50과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:36과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:51과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:37과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:52와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:53과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-3 단클론성 항체는 서열 번호:39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 및 서열 번호:54와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄를 포함한다.
고 친화도 MASP-3 항체의 교차-경쟁
본원에서 기술된 바와 같이, 본원에서 개시된 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 내에서 중첩 에피토프를 인식한다. 실시예 18에서 기술되고, 도 61A-E 및 62-67에서 도시되고, 표 4 및 28에서 요약된 바와 같이, 교차-경쟁 분석 및 펩스캔 결합 분석은 고 친화도 MASP-3 억제 항체가 교차-경쟁하고 MASP-3 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 공통 에피토프에 결합한다는 것을 보여준다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 인식되는 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 내에서 에피토프 또는 그 일부에 특이적으로 인식하는 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 제공한다:
서열 번호:24로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:40으로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:25로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:40로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:26으로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:41로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:27로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:42로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:28로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:43으로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:29로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:44로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:30으로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:45로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:31로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:46로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:32로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:47로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:33으로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:48로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:34로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:49로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:35로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:50으로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:36으로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:51로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:37로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:52로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:38로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:53으로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체;
서열 번호:39로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:54로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론성 항체.
본 발명에 따르면, 주어진 항체는 또 다른 주어진 항체에 의해 인식되는 에피토프의 적어도 일부를 인식하며, 이들 두 개의 항체는 동일한 또는 중첩 에피토프를 인식한다고 말한다.
특정 단클론성 항체 (참조 항체로도 지정됨)로서 항체 (테스트 항체로도 지정됨)가 동일한 또는 중첩 에피토프를 인식하는지를 결정하기 위해서 당업자에게 이용 가능한 상이한 검정이 사용될 수도 있다. 바람직하게는, 검정은 다음 단계를 수반한다:
● 참조 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 MASP-3 또는 그 단편을 제공하는 단계
● 상기 MASP-3에 테스트 항체 및 참조 항체를 추가하는 단계로서, 테스트 항체 또는 참조 항체는 검출 가능한 라벨로 라벨링된다. 대안으로, 두 항체는 상이한 검출 가능한 라벨로 라벨링될 수도 있다.
● MASP-3에서 검출 가능한 라벨의 존재를 검출하는 단계
● 이로써 테스트 항체가 참조 항체를 대체할 수 있는지를 검출하는 단계
참조 항체가 대체되면, 테스트 항체는 참조 항체와 동일한 또는 중첩 에피토프를 인식한다. 따라서, 참조 항체가 검출 가능한 라벨로 라벨링되면, MASP-3에서 낮은 검출 가능 신호는 참조 항체의 대체를 나타낸다. 테스트 항체가 검출 가능한 라벨로 라벨링되면, MASP-3에서 높은 검출 가능 신호는 참조 항체의 대체를 나타낸다. MASP-3 단편은 바람직하게는 고체 지지체에 고정되어 용이한 핸들링을 가능하게 할 수도 있다. 검출 가능한 라벨은 임의의 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 라벨, 예컨대 효소, 방사성 동위원소, 중금속, 착색된 화합물 또는 형광 화합물일 수도 있다. 본원에서 하기 기술된 섹션 "경쟁 결합 분석" 내 실시예 18에서 테스트 항체가 참조 항체로서 동일한 또는 중첩 에피토프를 인식하는지를 결정하는 예시적인 방법이 기술되어 있다. 당업자는 문제의 특정 항체에 상기 방법을 쉽게 적용할 수 있다.
본 발명의 이 양태에서 유용한 MASP-3 항체는 임의의 항체 생산 포유동물로부터 유래된 단클론성 또는 재조합 항체를 포함하고 다중특이적 (즉, 이중특이적 또는 삼중특이적) 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 완전한 인간 항체, 항-이디오타입 항체, 및 항체 단편일 수도 있다. 항체 단편은 본원에서 더 기술된 바와 같이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 단편, scFv 단편 및 단일-사슬 항체를 포함한다.
MASP-3 항체는 본원에서 기술된 검정을 사용하여 대체 경로 보체 활성화 시스템을 억제할 수 있는 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 대체 경로 보체 활성화의 억제는 본 발명의 다양한 구체예에 따라 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화들 중 적어도 하나 이상을 특징으로 한다: 용혈 및/또는 옵소닌화 억제; 인자 B의 렉틴-독립적 전환의 억제; 인자 D의 렉틴-독립적 전환의 억제, MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분열의 억제; 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착의 감소; 활성화 표면 상의 인자 B 및 Bb 침착의 감소; 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 잔류 수준의 감소 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음); 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소; 및/또는 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 잔류 수준 및 표면-유도된 수준의 생산.
감소된 효과기 기능을 가진 MASP-3 항체
본 발명의 이 양태의 일부 구체예에서, 본원에서 기술된 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 고전적 보체 경로의 활성화로부터 발생할 수도 있는 염증을 감소시키기 위해 감소된 효과기 기능을 갖는다. 고전적 보체 경로를 촉발시킬 수 있는 IgG 분자의 능력은 분자의 Fc 부분 내에 있는 것으로 나타났다 (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738-740 (1988)). 분자의 Fc 부분이 효소 분열에 의해 제거된 IgG 분자는 이러한 효과기 기능이 전혀 없다 (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참조). 따라서, 감소된 효과기 기능을 가진 항체는 효과기 기능을 최소화하거나, 또는 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입 중 하나인 유전적으로 조작된 Fc 서열을 가짐으로써 분자의 Fc 부분이 결핍된 결과로서 생성될 수 있다.
감소된 효과기 기능을 가진 항체는 Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, (1993), 및 Rodrigues et al., J. Immunol. 151:6954-6961, (1998)에서 기술된 바와 같이 IgG 중쇄의 Fc 부분의 표준 분자생물학적 조작에 의해 생산될 수 있다. 감소된 효과기 기능을 가진 항체는 또한 보체를 활성화시키고 및/또는 Fc 수용체와 상호작용할 수 있는 능력이 감소된 인간 IgG2 및 IgG4 아이소타입을 포함한다 (Ravetch, J.V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, (1991); Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14:215-221, (1993)). IgG2 또는 IgG4 아이소타입으로 구성된 인간 MASP-1, MASP-2 또는 MASP-3 (이중, 팬, 이중특이적 또는 삼중특이적 항체)에 특이적인 인간화된 또는 완전한 인간 항체는 당업자에게 공지된 여러 방법 중 하나에 의해 생산될 수 있으며, Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, (1998)에서 기술된 바와 같다.
고 친화도 MASP-3 억제 항체의 생산
MASP-3 항체는, 예를 들어, 하기 본원에서 실시예 14에서 기술된 바와 같이 MASP-3 폴리펩타이드 (예를 들어, 전장 MASP-3) 또는 항원성 MASP- 3 에피토프-함유 펩타이드 (예를 들어, MASP-3 폴리펩타이드의 일부)를 사용하여 생산될 수 있다. 면역원성 펩타이드는 5개의 아미노산 잔기만큼 작을 수도 있다. 항체를 생산하는데 사용된 MASP-3 펩타이드 및 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드, 또는 재조합 또는 합성 펩타이드 및 촉매 반응 비활성 재조합 폴리펩타이드로서 단리될 수도 있다. MASP-3 항체를 생산하는데 유용한 항원은 또한 융합 폴리펩타이드, 예컨대 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 말토오스-결합 단백질과 MASP-3 폴리펩타이드 또는 그 일부의 융합체를 포함한다. 폴리펩타이드 면역원은 전장 분자 또는 그 일부일 수도 있다. 폴리펩타이드 일부가 합텐-유사한 경우, 이러한 부분은 유리하게는 면역화를 위해 거대분자 담체 (예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole 흐물흐물한et hemocyanin; KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 변독소)에 결합되거나 연결될 수도 있다.
단클론성 항체
본원에서 사용된 바와 같이, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻어진 것으로 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 단클론성 항체는 배양 중인 무한증식 세포주에 의해, 예컨대 Kohler, G., et al., Nature 256:495, (1975)에 의해 기술된 하이브리도마 방법에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 얻어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수도 있다 (예를 들어, Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 단클론성 항체는 또한 Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, (1991), 및 Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, (1991)에서 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이것들의 임의의 하위분류를 포함하는 임의의 면역글로불린 분류의 것일 수 있다.
예를 들어, 단클론성 항체는 MASP-3 폴리펩타이드, 또는 그 일부를 포함하는 조성물을 적합한 포유동물 (예를 들어, BALB/c 마우스)에 주사함으로써 얻어질 수 있다. 사전 결정된 기간 이후, 비장세포가 마우스로부터 제거되고 세포 배양 배지에서 현탁된다. 이어서 비장세포는 불멸 세포주와 융합되어 하이브리도마를 형성한다. 형성된 하이브리도마는 세포 배양에서 키워지고 MASP-3에 대한 단클론성 항체를 생산할 수 있는 능력에 대하여 스크리닝된다 (Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, pages 2.5.1-2.6.7, 1991. 참조).
인간 단클론성 항체는 항원 처리에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하도록 조작된 트랜스제닉 마우스의 사용을 통해 얻어질 수도 있다. 이 기술에서, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소들이 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 붕괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 균주로 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 인간 항원, 예컨대 본원에서 기술된 MASP-2 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 이러한 동물의 B-세포를 통상적인 쾰러-밀스타인(Kohler-Milstein) 기술을 사용하여 적합한 골수종 세포주에 융합시킴으로써 인간 MASP-2 항체-분비 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은, 예를 들어, Green, L.L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; 및 Taylor, L.D., et al., Int. Immun. 6 :579, 1994에 의해 기술된다.
단클론성 항체는 잘 확립되어 있는 다양한 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 단리되고 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술은 단백질-A 세파로오스를 이용한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (예를 들어, Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, pages 79-104, 1992 참조).
생산될 때, 단클론성 항체는 먼저 특이적 MASP-3 결합에 대하여, 또는 원하는 경우, 이중 MASP-1/3, MASP-2/3 또는 MASP-1/2 결합에 대하여 테스트된다. 항체가 단배깆ㄹ 항원에 결합하는지 및/또는 단백질 항원에 대한 항체에 대한 친화도를 결정하는 방법은 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질 항원으로의 항체의 결합은 다양한 기술, 제한되는 것이 아니라, 예컨대 웨스턴 블롯, 도트 블롯, 플라스몬 표면 공명 방법 (예를 들어, BIAcore system; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 및 Piscataway, NJ), 또는 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 검출되고 및/또는 정량화될 수 있다. 예를 들어, Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993), Immunol. Meth. 160:191-198; Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; 및 Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627 참조. 또한 미국 특허 번호 6,355,245 참조.
MASP-3 단클론성 항체의 친화도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다 (예를 들어, Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949 참조). 한 구체예에서, 본 발명의 방법에 유용한 MASP-3 단클론성 항체는 <100 nM, 바람직하게는 <10 nM, 바람직하게는 <2 nM의 결합 친화도로, 그리고 가장 바람직하게는 <500 pM의 고 친화도로 MASP-3에 결합한다.
MASP-3에 특이적으로 결합하는 항체가 확인되면, MASP-3 항체는 여러 기능적 검정 중 하나에서 대체 경로 억제자로서 기능할 수 있는 능력에 대하여 테스트되며, 예를 들어, 대체 경로 보체 활성화의 억제는 본 발명의 다양한 구체예에 따라 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화들 중 적어도 하나 이상을 특징으로 한다: 용혈 및/또는 옵소닌화 억제; 인자 B의 렉틴-독립적 전환의 억제; 인자 D의 렉틴-독립적 전환의 억제, MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분열의 억제; 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착의 감소; 활성화 표면 상의 인자 B 및 Bb 침착의 감소; 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 잔류 수준의 감소 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음); 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소; 및/또는 인자 P 침착의 감소.
키메라/인간화된 항체
본 발명의 방법에서 유용한 단클론성 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 분류 또는 하위분류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 분류 또는 하위분류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 키메라 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편을 포함한다 (Cabilly의 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, (1984)).
본 발명에서 유용한 키메라 항체의 한 가지 형태는 인간화된 단클론성 MASP-3 항체이다. 비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 인간화된 형태는 키메라 항체이며, 이것은 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한다. 인간화된 단클론성 항체는 비-인간 (예를 들어, 마우스) 상보성 결정 영역 (CDR)을 마우스 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄에서 인간 가변 도메인으로 전달함으로써 생산된다. 전형적으로, 인간 항체의 잔기는 이어서 비-인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개선하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 Fv 프레임워크 영역이 인간 면역글로불린의 것인 적어도 하나, 및 전형적으로는 두 개의 가변 도메인 중 실질적으로 모두를 포함할 것이다. 인간화된 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 더 상세한 설명을 위해서, Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525, (1986); Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, (1992) 참조.
본 발명에서 유용한 인간화된 항체는 적어도 MASP-3 결합 CDR3 영역을 포함하는 인간 단클론성 항체를 포함한다. 이에 더하여, Fc 부분은 IgA 또는 IgM 뿐만 아니라 인간 IgG 항체를 생산하기 위해 대체될 수도 있다. 이러한 인간화된 항체는 인간 MASP-3에 특이적으로 결합하지만 항체 자체에 대한 인간의 면역 반응을 유발하지 않기 때문에 특정 임상적 유용성을 가질 것이다. 그 결과, 그것들은, 특히 반복 또는 장기간 투여가 필요할 때, 인간에서 생체내 투여에 더 적합하다.
인간화된 단클론성 항체를 생산하는 기술은 또한, 예를 들어, Jones, P.T., et al., Nature 321:522, (1986); Carter, P., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, (1992); Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, (1992); Singer, I.I., et al., J. Immun. 150:2844, (1993); Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, (1996); 및 1997년 Queen의 미국 특허 번호 5,693,762에 의해 기술된다. 이에 더하여, Protein Design Labs (Mountain View, CA)과 같이, 특이적 쥐 항체 영역으로부터 인간화된 항체를 합성하는 상업적 실체물이 존재한다.
재조합 항체
MASP-3 항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 항체의 단편 (VH, VL, Fv, 인자 D, Fab 또는 F(ab')2)을 생산하기 위해 인간 면역글로불린 발현 라이브러리 (예를 들어, Stratagene, Corp., La Jolla, CA에서 이용 가능함)를 사용하여 제조될 수 있다. 이어서 이 단편들은 키메라 항체를 생산하기 위한 것과 유사한 기술을 사용하여 전체 인간 항체를 구성하는데 사용된다.
면역글로불린 단편
본 발명의 방법에 유용한 MASP-3 억제제는 온전한 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편을 포함하는 널리 공지된 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적 및 삼중특이적) 항체를 포함한다.
항체 분자의 작은 일부인 파라토프만이 에피토프로의 항체의 결합에 수반된다는 것은 널리 알려져 있다 (예를 들어, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986 참조). 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 고전적 보체 경로의 효과기이지만 항원 결합에 수반되지 않는다. pFc' 영역이 효소에 의해 분열되었거나, 또는 pFc' 영역 없이 생산된 항체는 F(ab')2 단편이라고 지정되고 온전한 항체의 항원 결합 부위 둘 다를 보유한다. 단리된 F(ab')2 단편은 두 개의 항원 결합 부위 때문에 2가 단클론성 단편이라고 불린다. 유사하게, Fc 영역이 효소에 의해 분열되었거나, 또는 Fc 영역 없이 생산된 항체는 Fab 단편이라고 지정되고, 온전한 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다.
항체 단편은 통상적인 방법에 의한 전체 항체의 단백질 가수분해, 예컨대 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 F(ab')2로 표시된 5S 단편을 제공하기 위해 펩신을 이용한 항체의 효소적 분열에 의해 생산될 수 있다. 이 단편은 3.5S Fab' 1가 단편을 생산하기 위해 티올 환원제를 사용하여 더 분열될 수 있다. 선택적으로, 분열 반응은 이황화 결합의 분열로부터 발생하는 설피드릴 기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로서, 펩신을 사용한 효소적 분열은 직접적으로 두 개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접적으로 생산한다. 이러한 방법들은, 예를 들어, Goldenberg의 미국 특허 번호 4,331,647; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, (1960); Porter, R.R., Biochem. J. 73:119, (1959); Edelman, et al., in Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, (1967); 및 Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 및 2.10-2.10.4에 의해 기술되어 있다.
일부 구체예에서, Fc 영역이 없는 항체 단편의 사용은 Fcγ 수용체에 Fc를 결합시킬 때 시작되는 고전적 보체 경로의 활성화를 방지하기 위해 바람직하다. Fcγ 수용체 상호작용을 방지하는 단클론성 항체를 생산할 수 있는 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fc 영역은 단백질 가수분해 효소 (예컨대 피신 분해)에 의한 부분적 분해를 사용하여 화학적으로 제거되고, 이로써, 예를 들어, Fab 또는 F(ab)2 단편과 같은 항원-결합 항체 단편을 생성할 수 있다 (Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28:69-71, (1991)). 대안으로, Fcγ 수용체에 결합하지 않는 인간 γ4 IgG 아이소타입은 본원에서 기술된 바와 같이 인간화된 항체의 구성 중에 사용될 수 있다. Fc 도메인이 없는 항체, 단일 사슬 항체 및 항원-결합 도메인은 또한 본원에서 기술된 재조합 기술을 사용하여 조작될 수 있다.
단일-사슬 항체 단편
대안으로, 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결된 MASP-3에 대해 특이적인 단일 펩타이드 사슬 결합 분자를 생성할 수 있다. Fv 단편은 단일-사슬 항원 결합 단백질 (scFv)을 생성하기 위해 펩타이드 링커에 의해 연결될 수도 있다. 이들 단일-사슬 항원 결합 단백질은 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터로 삽입되며, 이후에 대장균(E. coli)과 같은 숙주 세포로 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩타이드를 가진 단일 폴리펩타이드 사슬을 합성한다. scFv를 생산하는 방법은, 예를 들어, Whitlow, et al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, (1991); Bird, et al., Science 242:423, (1988); Ladner의 미국 특허 번호 4,946,778; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, (1993)에 의해 기술된다.
예시적인 예로서, MASP-3-특이적 scFv는 시험관 내에서 림프구를 MASP-3 폴리펩타이드에 노출시키고 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 (예를 들어, 고정된 또는 라벨링된 MASP-3 단백질 또는 펩타이드의 사용을 통해) 얻어질 수 있다. 잠재적 MASP-3 폴리펩타이드 결합 도메인을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 파지 또는 박테리아, 예컨대 대장균에서 디스플레이된 무작위(random) 펩타이드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 MASP-3과 상호작용하는 펩타이드에 대하여 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 기술은 업계에 널리 공지되어 있고 (Lardner의 미국 특허 번호 5,223,409; Lardner의 미국 특허 번호 4,946,778; Lardner의 미국 특허 번호 5,403,484; Lardner의 미국 특허 번호 5,571,698; 및 Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리 및 키트는, 예를 들어, CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)로부터 상업적으로 이용 가능하다.
본 발명의 이 양태에서 유용한 MASP-3 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-3 항원 상의 에피토프에 결합하고 대체 보체 경로 활성화를 억제하는 단일 상보성-결정 영역 (CDR)을 암호화하는 펩타이드이다.
CDR 펩타이드 ("최소 인식 단위")는 관심있는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위해 폴리머라아제 연쇄 반응을 사용하여 제조된다 (예를 들어, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, (1995); 및 Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995 참조).
본원에서 기술된 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 대체 경로 활성화를 억제하기 위해 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체는, 선택적으로는 감소된 효과기 기능을 가진, 인간화된 단클론성 MASP-3 항체이다.
이중특이적 항체
본 발명의 방법에서 유용한 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 다중특이적 (즉, 이중특이적 및 삼중특이적) 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 적어도 두 개의 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 가진, 단클론성이고, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 한 구체예에서, 조성물 및 방법은 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 대한 결합 특이성 및 MASP-2에 대한 결합 특이성을 포함하는 (예를 들어, CCP1-CCP2 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 중 적어도 하나에 결합하는) 이중특이적 항체의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 대한 결합 특이성 및 MASP-1에 대한 결합 특이성을 포함하는 (예를 들어, MASP-1의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는) 이중특이적 항체의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 MASP-3에 대한 결합 특이성 (예를 들어, MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는), MASP-2에 대한 결합 특이성 (예를 들어, CCP1-CCP2 또는 MASP-2의 세린 프로테아제 도메인 중 적어도 하나에 결합하는) 및 MASP-1에 대한 결합 특이성을 포함하는 (예를 들어, MASP-1의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는) 삼중특이적 항체의 사용을 포함한다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업자의 범위 내에 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시-발현에 기초하며, 두 개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Milstein and Cuello, Nature 305:537-539 (1983)). 원하는 결합 특이성 (항체-항원 조합 부위)을 가진 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 이용하여 이루어진다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별개의 발현 벡터로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 동시-트랜스펙션된다. 이중특이적 항체를 생성하기 위한 예시적인 현재의 공지된 방법의 더 상세한 설명을 위해서, 예를 들어, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986); WO96/27011; Brennan et al., Science 229:81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992); Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994); 및 Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991) 참조. 이중특이적 항체는 또한 교차-결합된 또는 헤테로컨쥬게이트 항체를 포함한다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 교차-결합 방법을 사용하여 제조될 수도 있다. 적합한 가교제는 업계에 널리 공지되어 있고, 많은 교차-결합 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
이중특이적 항체 단편을 제조하고 재조합 세포 배양으로부터 직접적으로 단리시키기 위한 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼(zipper)를 사용하여 생산되었다 (예를 들어, Kostelny et al. J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992) 참조). Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993)에 의해 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 메커니즘을 제공하였다. 단편은 같은 사슬 상의 두 개의 도메인 사이에서 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 강제로 쌍을 형성하고, 이로써 두 개의 항원-결합 부위를 형성한다. 이중특이적 전체 항체와는 반대로, 이중특이적 디아바디는 또한 쉽게 구성될 수 있고 대장균에서 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수도 있다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 많은 다른 폴리펩타이드, 예컨대 항체 단편)는 라이브러리의 파지 디스플레이를 사용하여 쉽게 선택될 수 있다 (WO94/13804). 항원 X에 대한 특이성을 가진 디아바디의 하나의 아암이 일정하게 유지되어야 한다면, 다른 아암이 달라지고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리가 제조될 수 있다.
단일-사슬 Fv (scFv) 다이머의 사용에 의해 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 계획이 또한 보고되어 있다 (예를 들어, Gruber et al. J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조). 대안으로, 항체는, 예를 들어, Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)에서 기술된 바와 같이 "선형 항체"일 수도 있다. 간략히 기술하면, 이들 항체는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 직렬 인자 D 세그먼트의 쌍 (VH-CHI-VH-CHI)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 또는 단일특이적일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 Wu et al., Nat Biotechnol 25:1290-1297 (2007)에서 기술된 4가 이중 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자와 같이 다양한 형태의 이중특이적 항체의 사용을 포함한다. DVD-Ig 분자는 두 개의 상이한 모체 항체의 두 개의 상이한 경쇄 가변 도메인 (VL)이 재조합 DNA 기술에 의해 직접 또는 짧은 링커를 통해 직렬로 결합된 후 이어서 경쇄 불변 도메인이 결합되도록 설계된다. 두 개의 모체 항체로부터 DVD-Ig 분자를 생성하는 방법은, 예를 들어, WO08/024188 및 WO07/024715에 더 기술되어 있고, 이것들 각각의 개시물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
XVIii. 약학적 조성물 및 전달 방법
투약
또 다른 양태에서, 본 발명은 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 대체 경로-관련된 질환 또는 병태, 예를 들어, PNH와 같은 용혈성 질환, 또는 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증 (MS), 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고통받고 있는 대상체에서 대체 경로 보체 활성화의 부작용을 억제하는 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 이 양태의 방법은 대상체에게 대체 경로 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함한다. 고 친화도 MASP-3 억제 항체 및 MASP-2 억제제는 대체 경로 보체 활성화, 및 또한 선택적으로는 MASP-2-의존적 보체 활성화와 관련된 병태를 치료하거나 개선하기 위한 치료적 유효 용량으로 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적 유효 용량은 병태의 증상의 개선을 유도하기에 충분한 MASP-3 억제 항체, 또는 MASP-3 억제 항체 및 MASP-2 억제제의 조합의 양을 말한다. 대체 경로 보체 활성화의 억제는 본 발명의 다양한 구체예에 따라 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화들 중 적어도 하나 이상을 특징으로 한다: 용혈 및/또는 옵소닌화 억제; 인자 B의 렉틴-독립적 전환의 억제; 인자 D의 렉틴-독립적 전환의 억제, MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분열의 억제; 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착의 감소; 활성화 표면 상의 인자 B 및 Bb 침착의 감소; 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 잔류 수준의 감소 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음); 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소; 및/또는 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 잔류 수준 및 표면-유도된 수준의 생산의 감소.
MASP-3 및 MASP-2 억제제의 독성 및 치료 효능은 실험 동물 모델을 활용한 표준 약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 동물 모델을 사용하여, NOAEL (부작용 수준이 관찰되지 않음) 및 MED (최소 유효 용량)는 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. NOAEL 및 MED 효과 사이의 용량 비율은 치료 비율이며, 이것은 비율 NOAEL/MED로 표현된다. 큰 치료 비율 또는 지표를 나타내는 MASP-3 억제제 및 MASP-2 억제제가 가장 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용을 위한 투약량의 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. MASP-3 억제제 및 MASP-2 억제제의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없이 MED를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투약량은 이 범위 내에서 활용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 루트에 따라 달라질 수도 있다.
임의의 화합물 제제에 대하여, 치료적 유효 용량은 동물 모델을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수도 있다. 혈장 내에서 MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제의 정량적 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서도 측정될 수도 있다.
독성 연구에 더하여, 유효량은 살아있는 대상체에 존재하는 표적 MASP 단백질의 양 및 MASP-3 또는 MASP-2 억제제의 결합 친화도에 기초하여 추정될 수도 있다.
정상 인간 대상체에서 MASP-1 수준은 혈청 내에서 1.48 내지 12.83 μg/mL의 범위의 수준으로 존재한다는 것이 보고되었다 (Terai I. et al, Clin Exp Immunol 110:317-323 (1997); Theil et al., Clin. Exp. Immunol. 169:38 (2012)). 정상 인간 대상체에서 평균 혈청 MASP-3 농도는 약 2.0 내지 12.9 μg/mL의 범위 내에 있는 것으로 보고되었다 (Skjoedt M et al., Immunobiology 215(11):921-31 (2010); Degn et al., J. Immunol Methods, 361-37 (2010); Csuka et al., Mol. Immunol. 54:271 (2013). 정상 인간 대상체에서 MASP-2 수준은 혈청 내에서 500 ng/mL의 범위의 낮은 수준으로 존재하는 것으로 나타났고, 특정 대상체에서 MASP-2 수준은 Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167 (2003) 및 Csuka et al., Mol. Immunol. 54:271 (2013)에서 기술된, MASP-2에 대한 정량적 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
일반적으로, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제를 포함하는 투여된 조성물의 투약량은 대상체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 및 이전의 병력과 같은 요인에 따라 달라진다. 예로서, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제 (예컨대 MASP-3 항체, MASP-1 항체 또는 MASP-2 항체)는 대상체 체중의 약 0.010 내지 100.0 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 10 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게는 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약량 범위 내에서 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제 (예컨대 MASP-2 항체)는 바람직하게는 대상체 체중의 약 0.010 내지 10 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게는 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약 범위 내에서 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-1 억제제 (예컨대 MASP-1 항체) 또는 MASP-3 억제제 (예컨대 MASP-3 항체)는 대상체 체중의 약 0.010 내지 100.0 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 10 mg/kg, 예컨대 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지 1.0 mg/kg, 더 바람직하게는 0.010 내지 0.1 mg/kg의 투약 범위 내에서 투여된다.
주어진 대상체에서 선택적으로 MASP-2 억제 조성물과 조합된 MASP-3 억제 조성물, 또는 선택적으로 MASP-2 억제 조성물과 조합된 MASP-1 억제 조성물의 치료 효능, 및 본 발명의 방법, 및 적절한 투약량은 당업자에게 널리 공지된 보체 검정에 따라 결정될 수 있다. 보체는 많은 특이적 생성물을 생성한다. 지난 10년 동안, 민감성이고 특이적인 검정이 개발되었고 작은 활성화 단편 C3a, C4a, 및 C5a 및 큰 활성화 단편 iC3b, C4d, Bb, 및 sC5b-9를 포함한 이들 활성화 생성물 대부분에 대하여 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 검정들 중 대부분은 단클론성 항체가 형성되는 고유의 단백질에서는 아니지만 단편 상에 노출된 새로운 항원 (신항원)과 반응하는 단클론성 항체를 이용하여, 이 검정들을 매우 단순하고 특이적이게 만든다.
대부분 ELISA 기술에 의존하지만, C3a 및 C5a에 대해서는 방사선면역검정이 때때로 이용된다. 이들 후자의 검정은 미가공 단편 및 순환에서 발견되는 대부분의 형태인 'desArg' 단편 둘 다를 측정한다. 미가공 단편 및 C5adesArg는 세포 표면 수용체에 결합하여 신속하게 제거되며 다라서 매우 낮은 농도로 존재하는 반면에 C3adesArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 축적되지 않는다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감하고, 경로-독립적인 지표를 제공한다. 대체 경로 활성화는 Bb 단편을 측정함으로써 및/또는 인자 D 활성화의 측정에 의해 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 유체상 생성물, sC5b-9의 검출은 보체가 완료될 때까지 활성화되고 있다는 증거를 제공한다. 렉틴 경로 및 고전적 경로 둘 다가 동일한 활성화 생성물, C4a 및 C4d를 생성하기 때문에, 이들 두 가지 단편의 측정은 이들 두 가지 경로 중 어느 것이 활성화 생성물을 생성했는지에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않는다.
포유류 대상체에서 대체 경로의 억제는 본원에서 개시된 고 친화도 MASP-3 억제 항체로의 처리 후 포유류 대상체에서 다음 중 적어도 하나 이상을 특징으로 한다: 인자 D 성숙화의 억제; 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대상체에게 투여될 때 대체 경로의 억제; 고전적 경로는 억제되지 않음; 용혈 및/또는 옵소닌화 억제; 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착 감소; 활성화 표면 상에서 인자 B 및 Bb 침착 감소; 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 휴지기 수준 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음)의 감소; 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소; 및/또는 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 휴지기 및 표면-유도된 수준의 생산 감소.
MASP-2-의존적 보체 활성화의 억제는 본 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 일어나는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화들 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2-의존적 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9 (MAC)의 생성 또는 생산의 억제 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,919,094의 실시예 2에서 기술된 바와 같이 측정됨), C4 분열 및 C4b 침착의 감소 또는 C3 분열 및 C3b 침착의 감소.
약학적 담체 및 전달 비히클
일반적으로, MASP-3 억제 항체 조성물, 또는 MASP-2 및 MASP-3 억제제의 조합을 포함하는 조성물은 임의의 다른 선택된 치료제와 조합될 수도 있고, 약학적으로 허용 가능한 담체에 적합하게 함유된다. 담체는 비-독성이고, 생체 적합하며 MASP-3 억제 항체 또는 MASP-2 억제제 (및 그것과 조합된 임의의 다른 치료제)의 생물학적 활성에 해로운 영향을 주지 않도록 선택된다. 펩타이드에 대한 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 Yamada의 미국 특허 번호 5,211,657에서 기술된다. 본 발명에서 유용한 MASP-3 항체는, 본원에서 기술된 바와 같이, 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 기체 형태의 조제물, 예컨대 경구, 비경구 또는 수술 투여를 허용하는 타블렛, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 흡입제, 및 주사액으로 제제화될 수도 있다. 본 발명은 또한 의료 디바이스를 코팅하는 등에 의해 조성물의 국소적 투여를 고려한다.
주사액, 주입 또는 관주법 및 국부적 전달을 통한 비경구 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리학적 포스페이트-완충된 식염수, 정상 또는 젖산 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 또는 프로판디올을 포함한다. 이에 더하여, 용매 또는 현탁 배지로서 멸균 고정유가 활용될 수도 있다. 이 목적을 위해 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 생체 적합성 오일이 활용될 수도 있다. 이에 더하여, 올레산과 같은 지방산은 주사액의 제조에 사용된다. 담체 및 작용제는 액체, 현탁액, 폴리머화 가능 또는 폴리머화 불가능 겔, 페이스트 또는 고약으로 합성될 수도 있다.
담체는 또한 작용제(들)의 전달을 지속하기 위해 (즉, 연장하거나, 지연시키거나 또는 조절하거기 위해) 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약물동역학을 향상시키기 위해 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 이러한 전달 비히클은, 비-제한적인 예로서, 단백질, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 폴리머 또는 코폴리머 하이드로겔 및 폴리머 미셀로 구성된 극미립자, 미소구체, 나노구체 또는 나노입자를 포함할 수도 있다. 적합한 하이드로겔 및 미셀 전달 시스템은 WO 2004/009664 A2에 개시된 PEO:PHB:PEO 코폴리머 및 코폴리머/사이클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0019369 A1에 개시된 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린 복합체를 포함한다. 이러한 하이드로겔은 서방출형(sustained release) 데포포(depot)를 형성하기 위해 의도된 작용 부위에 국소적으로, 또는 피하로 또는 근육내로 주사될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 피하로, 근육내로, 정맥내로, 동맥내로 전달을 위해 또는 흡입제로서 제제화될 수도 있다.
관절내 전달을 위해, MASP-3 억제 항체는, 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합으로, 상기 기술된 주사 가능한 액체 또는 겔 담체, 상기 기술된 주사 가능한 서방출형 전달 비히클, 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체에서 운반될 수도 있다.
비-펩타이드성 작용제의 경구 투여를 위해, MASP-3 억제 항체는, 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합으로, 수크로오스, 옥수수 전분, 또는 셀룰로오스와 같은 불활성 충전제 또는 희석제에서 운반될 수도 있다.
국부적 투여를 위해서, MASP-3 억제 항체, 선택적으로 MASP-2 억제제와 조합으로, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 또는 분말, 또는 경피성 패치를 통한 겔 또는 마이크로캡슐 전달 시스템에서 운반될 수도 있다.
에어로졸, 계량 흡입기, 분말 흡입기, 및 네뷸라이져를 포함하는 다양한 코 및 폐 전달 시스템이 개발 중이고 각각 에어로졸, 흡입제, 또는 분무된 전달 비히클로 본 발명의 전달에 맞춰 적합하게 개조될 수도 있다.
척추강내 (IT) 또는 뇌실내 (ICV) 전달을 위해, 적절한 멸균 전달 시스템 (예를 들어, 액체; 겔, 현탁액, 등)이 본 발명을 투여하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생체 적합성 부형제, 예컨대 분산제 또는 또는 습윤제, 현탁화제, 희석제, 버퍼, 흡수 촉진제, 에멀젼화제, 바인더, 증점제, 방향제 (경구 투여용)를 포함할 수도 있다.
항체 및 펩타이드용 약학적 담체
고 친화도 MASP-3 억제 항체에 관하여 더 구체적으로는, 본원에서 기술된 바와 같이, 예시적 제제는 물, 오일, 식염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균 액체일 수 있는 약학적 담체와 함께 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 가능 투약량으로 비경구로 투여될 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 에멀젼화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 MASP-3 항체를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 약학적 조성물의 추가적인 구성요소는 석유 (예컨대 동물, 식물 또는 합성 기원), 예를 들어, 대두 오일 및 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜은 주사용액을 위해 바람직한 액체 담체이다.
MASP-3 항체는 또한 활성제의 지속 방출 또는 박동 방출(pulsatile release)을 허용하는 방식으로 제제화될 수 있는 데포 주사 또는 이식 조제물의 형태로 투여될 수 있다.
XVIX. 투여 방식
선택적으로 MASP-2 억제제와 조합된 MASP-3 억제 항체를 포함하는 약학적 조성물은 국소 또는 전신 투여 방식이 치료되는 병태에 대하여 가장 적절한지에 따라 다양한 방식으로 투여될 수도 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 이식 가능 의료 디바이스 상에 또는 상기 디바이스로 조성물을 코팅하거나 포함시킴으로써 전달될 수 있다.
전신 전달
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전신 전달" 및 "전신 투여"는 제한되는 것이 아니라 근육내 (IM), 피하, 정맥내 (IV), 동맥내, 흡입, 설하, 구강, 국부, 경피, 코, 직장, 질, 및 단일 또는 다수의 의도된 치료 작용 부위로의 전달된 작용제의 확산을 효과적으로 유도하는 다른 투여 루트를 포함한 경구 및 비경구 루트를 포함하도록 의도된다. 본 조성물에 대한 전신 전달의 바람직한 루트는 정맥내, 근육내, 피하, 동맥내 및 흡입을 포함한다. 본 발명의 특정 조성물에 활용된 선택된 작용제에 대한 정확한 전신 투여 루트는 부분적으로는 주어진 투여 루트와 관련된 대사 변환 경로에 대한 작용제의 민감성을 고려하여 결정될 것이다. 예를 들어, 펩타이드성 작용제는 가장 적합하게는 경구 루트 이외의 루트에 의해 투여될 수도 있다.
MASP-3 억제 항체는, 본원에서 기술된 바와 같이, 임의의 적합한 수단에 의해 필요로 하는 대상체에 전달될 수 있다. MASP-3 항체 및 폴리펩타이드의 전달 방법은 경구, 폐, 비경구 (예를 들어, 근육내, 복강내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사), 흡입 (예컨대 미세 분말 제제를 통해), 경피, 코, 질, 직장, 또는 설하 투여 루트에 의한 투여를 포함하고, 각각의 투여 루트에 적합한 투약 형태로 제제화될 수 있다.
대표적인 예로서, MASP-3 억제 항체 및 펩타이드는 폴리펩타이드를 흡수할 수 있는 신체 막, 예를 들어, 코, 위장 및 직장 막으로의 도포에 의해 살아있는 신체로 도입될 수 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로 침투 강화제와 함께 흡수성 막에 도포된다 (예를 들어, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5 :69, (1988); Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, (1990); Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13 :241, (1990) 참조). 예를 들어, STDHF는 담즙산염과 구조가 유사한 스테로이드성 계면활성제인 푸시딘산의 합성 유도체이고, 비강 전달을 위한 침투 강화제로서 사용되었다 (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990.)
MASP-3 억제 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 효소적 분해로부터 폴리펩타이드를 보호하기 위해 또 다른 분자, 예컨대 지질과 함께 도입될 수도 있다. 예를 들어, 폴리머, 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 공유 부착은 신체에서 특정 단백질을 효소적 가수분해로부터 보호하여 반감기를 연장하기 위해 사용되었다 (Fuertges, F., et al., J. Controlled Release 11:139, (1990)). 많은 폴리머 시스템이 단백질 전달에 대하여 보고되었다 (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, (1989); Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, (1989); Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, (1990); Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, (1989); Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, (1989); Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, (1989); Makino, K., J. Controlled Release 12:235, (1990); Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, (1989); Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, (1989)).
최근에는, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 가진 리포솜이 개발되었다 (예를 들어, Webb의 미국 특허 번호 5,741,516 참조). 게다가, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜-유사 조제물의 다양한 방법이 검토되었다 (예를 들어, Szoka의 미국 특허 번호 5,567,434; Yagi의 미국 특허 번호 5,552,157; Nakamori의 미국 특허 번호 5,565,213; Shinkarenko의 미국 특허 번호 5,738,868; 및 Gao의 미국 특허 번호 5,795,587 참조).
경피성 도포를 위해, MASP-3 억제 항체는, 본원에서 기술된 바와 같이, 다른 적합한 성분, 예컨대 담체 및/또는 보조제와 조합될 수도 있다. 의도된 투여를 위해 약학적으로 허용 가능해야 하고, 조성물의 활성 성분의 활성을 저하시킬 수 없다는 점을 제외하고, 이러한 다른 성분의 성질에 대해서는 제한이 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐 유무에 관계없이 연고, 크림, 겔, 또는 현탁액을 포함한다. MASP-3 억제 항체는 또한, 바람직하게는 액체 또는 반액체 형태로 경피성 패치, 일회용 반창고(plaster), 및 밴드에 함침될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 주기적으로 원하는 수준의 치료 효과를 유지하기 위해 결정된 간격으로 전신으로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 조성물은, 예컨대 피하 주사에 의해, 2주 내지 4주마다 또는 덜 빈번한 간격으로 투여될 수도 있다. 투약 양생법은 작용제의 조합의 작용에 영향을 줄 수도 있는 다양한 요인들을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이러한 요인들은 치료되는 병태의 진행 정도, 환자의 나이, 성별 및 체중, 및 다른 임상적 요인들을 포함할 것이다. 개개의 작용제에 대한 투약량은 조성물에 포함된 MASP-3 억제 항체 또는 MASP-2 억제제의 기능, 뿐만 아니라 임의의 약물 전달 비히클 (예를 들어, 서방출형 전달 비히클)의 존재 및 성질에 따라 달라질 것이다. 이에 더하여, 투약량은 전달된 작용제(들)의 투여 빈도 및 약물동역학적 행동의 변화를 고려하여 조정될 수도 있다.
국소 전달
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "국소적"은 의도된 국소화된 작용 부위에 또는 그 주위로의 약물의 적용을 포함하고, 예를 들어, 피부 또는 다른 병에 걸린 조직으로의 국부 전달, 안구 전달, 척추강내 (IT), 뇌실내 (ICV), 관절내, 공동내, 두개내 또는 방광내 투여, 배치 또는 관주법을 포함할 수도 있다. 국소 투여는 더 작은 용량의 투여를 가능하게 하고, 전신적 부작용을 방지하고, 국소 전달 부위에서 활성제의 전달 시기 및 농도의 더 정확한 제어를 위해 선호될 수도 있다. 국소 투여는, 대사, 혈류, 등의 환자간 가변성에 관계없이, 표적 부위에 공지된 농도를 제공한다. 직접적인 전달 방식에 의해 향상된 투약량 제어가 또한 제공된다.
MASP-3 억제 항체 또는 MASP-2 억제제의 국소 전달은 질환 또는 병태를 치료하기 위한 수술 방법의 맥락에서, 예를 들어, 동맥 우회 수술, 죽종절제술(atherectomy), 레이져 시술, 초음파 시술, 기구 혈관 형성술 및 스텐트(stent) 배치와 같은 시술 동안에 달성될 수도 있다. 예를 들어, MASP-3 억제 항체 또는 MASP-2 억제제는 기구 혈관 형성술과 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 기구 혈관 형성술은 바람 빠진 기구를 가진 카테터를 동맥으로 삽입하는 것을 수반한다. 바람 빠진 기구는 죽상경화판(atherosclerotic plaque)에 근접하여 배치되고 플라크(plaque)가 혈관 벽을 압축하도록 부풀려진다. 결과로서, 기구 표면은 혈관 표면 상의 혈관 내피 세포층과 접촉된다. MASP-3 억제 항체 또는 MASP-2 억제제는 죽상경화판의 부위에 작용제의 방출을 허용하는 방식으로 기구 혈관 형성 카테터에 부착될 수도 있다. 작용제는 업계에 공지된 표준 과정에 따라 기구 카테터에 부착될 수도 있다. 예를 들어, 작용제는 기구가 부풀려질 때까지 기구 카테터의 구획에 저장될 수도 있으며, 그 지점에서 국소 환경으로 방출된다. 대안으로, 작용제는 기구가 부풀려질 때 동맥벽의 세포에 접촉하도록 기구 표면 상에 함침될 수도 있다. 작용제는 또한 Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85:1110-1117, (1992)에서 개시된 것과 같은 유공(perforated) 기구 카테터에서 전달될 수도 있다. 기구 혈관 형성 카테터에 치료 단백질을 부착시키기 위한 예시적 절차에 대해서는 공개된 PCT 출원 WO 95/23161을 참고하면 된다. 유사하게, 혈관 배치 후 스텐트가 MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제를 용출시킬 수 있도록, MASP-3 억제제 또는 MASP-2 억제제는 스텐트에 도포되는 겔 또는 폴리머 코팅에 포함될 수도 있거나, 또는 스텐트의 재료에 포함될 수도 있다.
관절성 피진 및 다른 근골격 장애의 치료에 사용되는 MASP-3 억제 항체는 관절내 주사에 의해 국소적으로 전달될 수도 있다. 이러한 조성물은 적합하게는 서방출형 전달 비히클을 포함할 수도 있다. 국소 전달이 바람직할 수도 있는 경우의 추가의 예로서, 비뇨생식기 병태의 치료에 사용되는 MASP-3 억제 조성물은 적합하게는 방광내로 또는 또 다른 비뇨생식기 구조 내에 서서히 주입될 수도 있다.
XX. 치료 양생법
예방적 용도로, 약학적 조성물은 대체 경로 관련 질환 또는 장애, 예를 들어, 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 대체 경로 질환 또는 장애에 취약하거나, 또는 그렇지 않으면 위험이 있는 대상체에게 병태의 증상을 나타낼 위험을 제거하거나 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 용도로, 약학적 조성물은 대체 경로-관련된 질환 또는 장애, 예컨대 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 대체 경로 질환 또는 장애로 의심되거나, 또는 이것들로부터 이미 고통받고 있는 대상체에게 병태의 증상을 경감시키거나, 또는 적어도 부분적으로 감소시키기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.
한 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 포함하는 약학적 조성물은 PNH로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 이에 따라 대상체의 적혈구 세포는 조성물의 부재시 C3의 단편에 의해 옵소닌화되고, 대상체로의 조성물의 투여는 대상체에서 적혈구 세포의 생존률을 증가시킨다. 한 구체예에서, 대상체는 조성물의 부재시 (i) 정상 수준 미만의 헤모글로빈 (ii) 정상 수준 미만의 혈소판; (iii) 정상 수준 초과의 망상 적혈구, 및 (iv) 정상 수준 초과의 빌리루빈으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내고, 대상체로의 조성물의 투여는 증상들 중 적어도 하나 이상을 개선하여, (i) 증가된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 헤모글로빈, (ii) 증가된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 혈소판, (iii) 감소된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 망상 적혈구, 및/또는 (iv) 감소된, 정상, 또는 거의 정상 수준의 빌리루빈을 유도한다.
발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염 및 베체트 병으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 병태의 치료, 예방 또는 이것들의 심각도의 감소를 위한 예방 및 치료 양생법 둘 다에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체 및 선택적으로 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성될 때까지 다회수 투약량으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 고 친화도 MASP-3 억제 항체 및/또는 MASP-2 억제제는 성인 환자 (예를 들어, 70 kg의 평균 성인 체중)에게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 더 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 더 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg, 또는 10 내지 200 mg의 투약량으로 투여될 수도 있다. 소아 환자에 대해, 투약량은 환자의 체중에 비례하여 조정될 수 있다.
본 발명의 고 친화도 MASP-3 억제 항체 및 선택적인 MASP-2 억제 조성물의 적용은 대체 경로-관련된 질환 또는 장애, 예컨대 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 장애의 치료를 위해 조성물의 단일 투여 (예를 들어, MASP-3 및 선택적으로 MASP-2 억제제, 또는 이중특이적 또는 이중 억제제를 포함하는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물의 동시-투여)에 의해, 또는 제한된 투여 순서로 수행될 수도 있다.
대안으로, 조성물은 최적의 치료 효과를 위해 의사에 의해 결정된 바와 같이 연장된 기간 동안 주기적인 간격으로, 예컨대 매일, 2주마다, 매주, 격주로, 매월 또는 2개월 마다 투여될 수도 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 병태로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여된다.
한 구체예에서, 적어도 하나의 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 동시에 (즉, 10분, 5분 또는 1분 이내와 같이 약 15분 이내의 시간 간격 내에) 투여된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 순차적으로 (즉, 제1 조성물은 제2 조성물의 투여 전에 또는 후에 투여되며, 투여의 시간 간격은 15분 초과이다) 투여된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 일시에 (즉, 제1 조성물의 투여 기간과 제2 조성물의 투여가 중첩된다) 투여된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 적어도 1, 2, 3 또는 4주 또는 그 이상의 기간 동안 투여된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 고 친화도 MASP-3 억제 항체 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제는 단위 투약 형태로 조합된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 고 친화도 MASP-3 억제 항체를 포함하는 제1 조성물 및 적어도 하나의 MASP-2 억제제를 포함하는 제2 조성물은 대체 경로-관련된 질환 또는 병태, 예컨대 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 또는 중증 근무력증의 치료에 사용을 위한 키트 내에 함께 포장된다.
일부 구체예에서, PNH, 나이-관련 황반 변성 (AMD), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS) 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 고통받고 있는 대상체는 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자로의 치료를 이전에 겪었거나, 또는 현재 겪고 있다. 일부 구체예에서, 방법은 대상체에게 고 친화도 MASP-3 억제 항체 및 선택적으로 MASP-2 억제자를 포함하는 본 발명의 조성물을 투여하는 단계 및 대상체에게 보체 단백질 C5의 분열을 억제하는 말단 보체 억제자를 더 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 인간화된 항-C5 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, 말단 보체 억제자는 에쿨리쥬맙이다.
XXI. 실시예
다음 실시예는 단지 본 발명을 실시하기 위해 현재 고려되는 최선의 방식을 예시하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에서 모든 문헌 인용문은 명백하게 참조로 포함된다.
실시예 1
이 실시예는 MASP-2 결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A 또는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B로 감염된 후 네이세리아 메닝기티디스 유도된 사망으로부터 보호된다는 것을 입증한다.
방법:
MASP-2 넉아웃 마우스 (MASP-2 KO 마우스)를 본원에 참조로 포함된 US 7,919,094의 실시예 1에서 기술된 바와 같이 생성하였다. 10주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 야생형 (WT) C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μl의 부피 중의 2.6 x 107 CFU의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 투약량으로 복강내 (i.p.) 주사에 의해 접종하였다. 감염 용량을 400 mg/kg의 최종 농도로 철 덱스트란과 함께 마우스에게 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존률을 72시간 기간 동안 모니터링하였다.
별개의 실험에서, 10주령 MASP-2 KO 마우스 (n=10) 및 WT C57/BL6 마우스 (n=10)를 100 μL의 부피 중의 6 x 106 CFU의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투약량으로 i.p. 주사에 의해 접종하였다. 감염 용량을 400 mg/kg의 최종 용량으로 철 덱스트란과 함께 마우스에게 투여하였다. 감염 후 마우스의 생존률을 72시간 기간 동안 모니터링하였다.
질병 점수를 또한 약간 수정된 Fransen et al. (2010)의 계획에 기초한 하기 표 5에서 기술된 질병 점수 파라미터에 기초하여 감염 후 72시간 기간 동안에 WT 및 MASP-2 KO 마우스에 대하여 결정하였다.
감염된 마우스에서의 임상적 징후와 관련된 질병 점수
징후 점수
정상 0
살짝 주름진 모피 1
주름진 모피, 느리고 끈적거리는 눈 2
주름진 모피, 무기력 및 감은 눈 3
매우 아프고 자극 후 움직임 없음 4
사망 5
감염을 입증하고 혈청으로부터의 박테리아의 클리어런스 속도를 결정하기 위해 혈액 샘플을 감염 후 한 시간 간격으로 마우스로부터 채취하였고 분석하여 네이세리아 메닝기티디스의 혈청 수준 (로그 cfu/mL)을 결정하였다. 결과 :
도 6은 2.6 x 107 cfu의 감염 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타내는 카플란-메이어 플롯이다. 도 6에서 도시된 바와 같이, MASP-2 KO 마우스의 100%는 감염 후 72시간 기간 내내 생존하였다. 그에 반해, WT 마우스의 단지 80% (p=0.012)만이 감염 후 24시간에 살아있었고, WT 마우스의 단지 50%만이 감염 후 72시간에 살아있었다. 이 결과들은 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A Z2491-유도된 사망률로부터 보호된다는 것을 입증한다.
도 7은 6 x 106 cfu의 감염 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타내는 카플란-메이어 플롯이다. 도 7에서 도시된 바와 같이, MASP-2 KO 마우스의 90%는 감염 후 72시간 기간 내내 생존하였다. 그에 반해, WT 마우스의 단지 20% (p=0.0022)만이 감염 후 24시간에 살아있었다. 이 결과들은 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58-유도된 사망률로부터 보호된다는 것을 입증한다.
도 8은 6x106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 i.p. 감염 후 MASP-2 KO 및 WT 마우스로부터 채취한 혈액 샘플에서 상이한 시점에 회수한 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 로그 cfu/mL를 그래프로 나타낸다 (마우스의 두 군 모두에 대하여 상이한 시점에 n=3). 결과는 평균±SEM으로 표시된다. 도 8에서 도시된 바와 같이, WT 마우스에서 혈액 내 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 24시간에 약 6.0 로그 cfu/mL으 lvlzm에 도달하였고 감염 후 36시간까지 약 4.0 로그 cfu/mL로 하락하였다. 그에 반해, MASP-2 KO 마우스에서, 네이세리아 메닝기티디스의 수준은 감염 후 12시간에 약 4.0 로그 cfu/mL의 피크에 도달하였고 감염 후 36시간까지 약 1.0 로그 cfu/mL로 하락하였다 (부호 "*"는 p<0.05를 나타내고; 부호 "**"는 p=0.0043을 나타낸다). 이 결과들은 MASP-2 KO 마우스가 WT 마우스와 같은 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염되었지만, MASP-2 KO 마우스는 WT와 비교하여 WT와 비교하여 균혈증(bacteraemia)의 클리어런스가 향상되었다는 것을 입증한다.
도 9는 6x106 cfu의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로 감염된 후 3, 6, 12 및 24시간에 MASP-2 KO 및 WT 마우스의 평균 질병 점수를 그래프로 나타낸다. 도 9에서 도시된 바와 같이, MASP-2-결핍 마우스는 감염에 대하여 높은 저항성을 나타냈으며, 질병 점수는 감염 후 6시간 (부호 "*"는 p=0.0411을 나타낸다), 12시간 (부호 "**"는 p=0.0049를 나타낸다) 및 24시간 (부호 "***"는 p=0.0049를 나타낸다)에 WT 마우스와 비교하여 훨씬 더 낮았다. 결과는 도 9에서 평균±SEM으로 표시된다.
요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2-결핍 마우스가 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 A 또는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B로의 감염 후 네이세리아 메닝기티디스-유도된 사망률로부터 보호된다는 것을 입증한다.
실시예 2
이 실시예는 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 후 MASP-2 항체의 투여가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 마우스의 생존률을 증가시킨다는 것을 입증한다.
배경/근거 :
본원에 참조로 포함된 미국 특허 7,919,094의 실시예 24에서 기술된 바와 같이, 래트 MASP-2 단백질을 활용하여 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝(pan)하였으며, 이것으로부터 Fab2 #11을 기능적 활성 항체로서 확인하였다. 래트 IgG2c 및 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 항체를 Fab2 #11로부터 생성하였다. 마우스 IgG2a 아이소타입의 전장 MASP-2 항체를 약역학적 파라미터에 대하여 특성화하였다 (미국 특허 7,919,094의 실시예 38에서 기술된 바와 같이).
이 실시예에서, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 MASP-2 전장 항체를 네이세리아 메닝기티디스 감염의 마우스 모델에서 분석하였다.
방법 :
상기 기술된 바와 같이 생성된, Fab2 #11로부터 유래된 마우스 IgG2a 전장 MASP-2 항체 아이소타입을 다음과 같이 네이세리아 메닝기티디스 감염의 마우스 모델에서 테스트하였다.
1. 감염 후 마우스-MASP-2 단클론성 항체 (MoAb)의 투여
9주령 C57/BL6 Charles River 마우스를 고용량 (4x106 cfu)의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58로의 i.p. 주사 후 3시간에 억제 마우스 MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) (n=12) 또는 대조군 아이소타입 항체 (n=10)로 처리하였다.
결과 :
도 10은 4x106 cfu의 감염 용량의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 균주 MC58의 투여에 이어서, 감염 후 3시간에 억제 MASP-2 항체 (1.0 mg/kg) 또는 대조군 아이소타입 항체의 투여 후 마우스의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타내는 카플란-메이어 플롯이다. 도 10에서 도시된 바와 같이, MASP-2 항체로 처리된 마우스의 90%는 감염 후 72시간 기간 내내 생존하였다. 그에 반해, 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스의 단지 50%만이 감염 후 72시간 기간 내내 생존하였다. 부호 "*"는 p=0.0301을 나타내며, 두 개의 생존 곡선의 비교에 의해 결정된 바와 같다.
이 결과들은 MASP-2 항체의 투여가 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 대상체를 치료하고 대상체의 생존률을 향상시키는데 효과적임을 입증한다.
본원에서 입증된 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스로 감염된 대상체의 치료시 MASP-2 항체의 사용은 감염 후 3시간 이내에 투여될 때 효과적이고, 감염 후 24시간 내지 48시간 이내에 효과적일 것으로 예상된다. 뇌척수막염균 질환 (수막구균혈증(meningococcemia) 또는 수막염(meningitis))은 응급의료상황이고, 요법은 전형적으로 뇌척수막염균 질환이 의심되면 (즉, 네이세리아 메닝기티디스가 병인체로서 양성으로 확인되기 전에) 즉시 시작될 것이다.
실시예 1에서 입증된 MASP-2 KO 마우스의 결과를 고려하여, 네이세리아 메닝기티디스로의 감염 전 MASP-2 항체의 투여는 또한 감염을 예방하거나 감염의 심각도를 개선하기에 효과적일 것이라고 생각된다.
실시예 3
이 실시예는 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해가 MASP-3-의존적이라는 것을 입증한다.
근거 :
기능적 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자는 재발성 박테리아 및 균류 감염에 대한 민감성의 증가를 나타낸다 (Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). 네이세리아 메닝기티디스는 MBL에 의해 인식되는 것으로 알려져 있으며, MBL-결핍 혈청이 네이세리아 메닝기티디스를 용해시키지 못 하는 것으로 나타났다.
실시예 1 및 2에서 기술된 결과를 고려하여, 보체-결핍 및 대조군 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스 감염을 치료하기 위한 MASP-2 항체의 투여 효능을 결정하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 보체 경로를 보존하기 위해 고농도의 혈청 (20%)에서 실험을 수행하였다.
방법 :
1. 다양한 보체-결핍 인간 혈청 및 인간 MASP-2 항체로 처리된 인간 혈청에서 혈청 살균 활성
다음 보체-결핍 인간 혈청 및 대조군 인간 혈청을 이 실험에 사용하였다:
테스트된 인간 혈청 샘플 (도 11에서 나타난 바와 같다)
샘플 혈청 유형
A 정상 인간 혈청 (NHS) + 인간 MASP-2 Ab
B NHS + 아이소타입 대조군 Ab
C MBL -/- 인간 혈청
D NHS
E 열-비활성화된 (HI) NHS
인간 MASP-2에 대한 재조합 항체를 항원으로서 재조합 인간 MASP-2A를 사용하여 조합 항체 라이브러리 (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000))로부터 단리시켰다 (Chen, C.B. 및 Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001)). 인간 혈청에서 C4 및 C3의 렉틴 경로-매개된 활성화를 강력하게 억제한 항-인간 scFv 단편 (IC50~20 nM)을 확인하였고 전장 인간 IgG4 항체로 전환시켰다. 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 억제 인간 MASP-2 항체의 추가 (100 μl 총 부피 중 3 μg) 여부와 관계없이 각각 20%의 혈청 농도의 표 6에서 나타난 상이한 혈청들과 함께 37℃에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 0, 30, 60 및 90분 간격의 시점에 샘플을 채취하였고, 플레이팅한 다음 생균수를 결정하였다. 열-비활성화된 인간 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다.
결과 :
도 11은 표 6에서 나타난 인간 혈청 샘플에서 상이한 시점에 회수된 로그 cfu/mL의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수를 그래프로 나타낸다. 표 7은 도 11에 대한 스튜던트 t-테스트(Student's t-test) 결과를 제공한다.
도 11에 대한 스튜던트 t-테스트 결과 (시점 60분)
평균 차 (Log) 유의성? P<0.05? P값 요약
A 대 B -0.3678 예 ***(0.0002)
A 대 C -1.1053 예 ***(p<0.0001)
A 대 D -0.2111 예 **(0.0012)
C 대 D 1.9 예 ***(p<0.0001)
도 11 및 표 7에서 나타난 바와 같이, 인간 20% 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해는 인간 MASP-2 억제 항체의 추가에 의해 크게 향상되었다. 2. 다양한 보체-결핍 인간 혈청에서 혈청 살균 활성
다음 보체-결핍 인간 혈청 및 대조군 인간 혈청을 이 실험에 사용하였다:
테스트된 인간 혈청 샘플 (도 12에서 도시된 바와 같다)
샘플 혈청 유형
A 정상 인간 혈청 (NHS)
B 열-비활성화된 NHS
C MBL -/-
D MASP-3 -/- (MASP-1 +)
주: 중첩되는 Carnevale, Mingarelli, Malpuech 및 Michels 증후군에 대한 통합 용어인 3MC 증후군에 걸린 대상체로부터 샘플 D의 MASP-3 -/- (MASP-1 +) 혈청을 채취하였다. 실시예 4에서 더 기술된 바와 같이, MASP-1/3 유전자의 엑손 12의 돌연변이는 MASP-1이 아니라 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인을 기능 장애로 만든다. 실시예 10에서 기술된 바와 같이, 프로-인자 D는 3MC 혈청에 우선적으로 존재하는 반면에, 활성화된 인자 D는 정상 인간 혈청에 우선적으로 존재한다. 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 각각 20%의 혈청 농도의 상이한 보체-결핍 인간 혈청과 함께 37℃에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 0, 15, 30, 45, 60, 90 및 120분 간격의 시점에 샘플을 채취하였고, 플레이팅한 다음 생균수를 결정하였다. 열-비활성화된 인간 혈청 음성 대조군으로 사용하였다.
결과 :
도 12는 표 8에서 나타난 인간 혈청 샘플에서 상이한 시점에 회수된 로그 cfu/mL의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수를 그래프로 나타낸다. 도 12에서 도시된 바와 같이, WT (NHS) 혈청은 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 가장 높은 수준의 살균 활성을 갖는다. 그에 반해, MBL -/- 및 MASP-3 -/- (MASP-1-충분) 인간 혈청은 어떠한 살균 활성도 갖고 있지 않다. 이 결과들은 인간 20% (v/v) 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해가 MASP-3- 및 MBL-의존적이라는 것을 나타낸다. 표 9는 도 12에 대한 스튜던트 t-테스트 결과를 제공한다.
도 12에 대한 스튜던트 t-테스트 결과
비교 시점
(min) 		평균 차 (Log) 유의성? P<0.05? P값 요약
A 대 B 60 -0.8325 예 ***(p<0.0001)
A 대 B 90 -1.600 예 ***(p<0.0001)
A 대 C 60 -1.1489 예 ***(p<0.0001)
A 대 C 90 -1.822 예 ***(p<0.0001)
A 대 D 60 -1.323 예 ***(0.0005)
A 대 D 90 -2.185 예 ***(p<0.0001)
요약하면, 도 12 및 표 9에 나타난 결과는 20% 인간 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해가 MASP-3- 및 MBL-의존적이라는 것을 입증한다. 3. MASP-2, MASP-1/3 또는 MBL A/C의 20% (v/v) 마우스 혈청 결핍에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해
다음 보체-결핍 마우스 혈청 및 대조군 마우스 혈청을 이 실험에 사용하였다:
테스트된 마우스 혈청 샘플 (도 13에서 도시된다)
샘플 혈청 유형
A WT
B MASP-2 -/-
C MASP-1/3 -/-
D MBL A/C -/-
E WT 열-비활성화된 (HIS)
네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58을 각각 20%의 혈청 농도의 상이한 보체-결핍 마우스 혈청과 함께 37℃에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 샘플을 0, 15, 30, 60, 90 및 120분 간격 시점에 채취하고, 플레이팅한 다음 생균수를 결정하였다. 열-비활성화된 인간 혈청 음성 대조군으로 사용하였다. 결과 :
도 13은 표 10에서 나타난 마우스 혈청 샘플에서 상이한 시점에 회수된 로그 cfu/mL의 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B-MC58의 생균수를 그래프로 나타낸다. 도 13에서 도시된 바와 같이, MASP-2 -/- 마우스 혈청은 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 WT 마우스 혈청보다 더 높은 수준의 살균 활성을 갖는다. 그에 반해, MASP-1/3 -/- 마우스 혈청은 어떠한 살균 활성도 갖지 않는다. 부호 "**"는 p=0.0058을 나타내고, 부호 "***"는 p=0.001을 나타낸다. 표 11은 도 13에 대한 스튜던트 t-테스트 결과를 제공한다.
도 13에 대한 스튜던트 t-테스트 결과
비교 시점 평균 차 (LOG) 유의성? (p<0.05)? P값 요약
A 대 B 60 min. 0.39 예 ** (0.0058)
A 대 B 90 min. 0.6741 예 *** (0.001)
요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-2 -/- 혈청이 네이세리아 메닝기티디스에 대하여 WT 혈청보다 더 높은 수준의 살균 활성을 갖고 20% 혈청에서 네이세리아 메닝기티디스의 보체-의존적 살해는 MASP-3- 및 MBL-의존적이라는 것을 입증한다. 실시예 4
이 실시예는 실시예 1-3에서 기술된 바와 같이 MASP-2 KO 마우스에서 관찰된 네이세리아 메닝기티디스 감염에 대한 MASP-3-의존적 저항성의 메커니즘을 결정하기 위해 수행된 일련의 실험을 기술한다.
근거 :
MASP-2 KO 마우스에서 관찰된 네이세리아 메닝기티디스 감염에 대한 MASP-3-의존적 저항성 (상기 실시예 1-3에서 기술됨)의 메커니즘을 결정하기 위해, 일련의 실험을 다음과 같이 수행하였다.
1. MASP-1/3-결핍 마우스는 렉틴 경로 기능적 활성 ("LEA-2"로도 불림)의 결핍이 아니다.
방법 :
MASP-1/3-결핍 마우스가 렉틴 경로 기능적 활성 (LEA-2로도 불림)의 결핍인지를 결정하기 위해, 본원에 참조로 포함된 Schwaeble W. et al., PNAS vol 108(18):7523-7528 (2011)에서 기술된 바와 같이, 렉틴 활성화 경로-특이적 검정 조건 (1% 혈장) 하에서 테스트된 다양한 보체-결핍 마우스 균주의 혈장에서 C3 전환효소 활성의 동역학을 측정하기 위한 검정을 수행하였다.
다음과 같이 WT, C4-/-, MASP-1/3-/-; 인자 B-/-, 및 MASP-2-/- 마우스로부터 혈장을 테스트하였다.
C3 활성화를 측정하기 위해, 미세역가 플레이트를 코팅 버퍼 (15 mM Na2Co3, 35 mM NaHCO3) 중의 만난 (1 μg/웰), 치모산 (1 μg/웰), 또는 코팅 버퍼 중의 1% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 코팅한 다음 0.05% Tween 20 및 5 mM Ca++와 함께 TBS (10mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4) 중의 양 항-HAS 혈청 (2 μg/mL)을 추가하여 제자리에서(in situ) 생성된 면역 복합체로 코팅하였다. 플레이트를 TBS 중의 0.1% HSA로 블로킹하고 TBS/Tween20/Ca++로 3회 세척하였다. 혈장 샘플을 4 mM 바비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4에서 희석하고, 플레이트에 추가하고 37℃에서 1.5h 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 C3b를 토끼 항-인간 C3c (Dako)에 이어서, 알칼리성 포스페이트-컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG 및 p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 검출하였다.
결과 :
렉틴 경로-특이적 조건 하에서 C3 활성화의 동역학 (1% 혈청이 들어있는 만난-코팅된 플레이트 상의 C3b 침착에 의해 측정됨)은 도 14에서 나타난다. MASP-2-/- 혈장에서 C3 분열을 볼 수 없었다. 인자 B-/- (인자 B -/-) 혈장은 WT 혈장의 절반의 속도로 C3을 분열시켰으며, 증폭 루프의 손실 때문일 것이다. C3b로의 C3의 렉틴 경로-의존적 전환의 상당한 지연을 C4-/- (T1/2=33min), 뿐만 아니라 MASP-1/3-/- 결핍 혈장 (T1/2=49 min)에서도 볼 수 있다. MASP-1/3-/- 혈장에서 C3 활성화의 이러한 지연은 MASP-3-의존적인 것이 아니라 MASP-1-의존적인 것으로 나타났다. (Takahashi M. et al., J Immunol 180:6132-6138 (2008) 참조). 이 결과들은 MASP-1/3-결핍 마우스가 렉틴 경로 기능적 활성 ("LEA-2"로도 불림)의 결핍이 아니라는 것을 입증한다.
2. 대체 경로 활성화에 대한 유전적 MASP-3 결핍의 효과
근거 :
MASP-3의 세린 프로테아제를 암호화하는 엑손에서 프레임-시프트(frame-shift) 돌연변이에 의해 유발된 3MC 증후군에 걸린 MASP-3-결핍 환자의 혈청을 테스트하여 대체 경로 활성화에 대한 유전적 MASP-3 결핍의 효과를 결정하였다. 3MC 증후군은 중첩되는 Carneavale, Mingarelli, Malpuech 및 Michels 증후군에 대한 통합 용어이다. 이들 희귀성 상염색체 열성 장애는 특유의 안면 기형, 구순열 및/또는 구개열, 두개골유합증(craniosynostosis), 학습 장애 및 생식기, 사지 및 방광요관(vesicorenal) 기형을 포함하는 광범위한 발전적 특징을 나타낸다. Rooryck et al., Nature Genetics 43:197-203 (2011)은 3MC 증후군에 걸린 11 가족을 연구하였고 두 개의 돌연변이된 유전자, COLEC11 및 MASP-1을 확인하였다. MASP-1 유전자의 돌연변이는 MASP-1의 세린 프로테아제를 암호화하는 엑손이 아니라 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 기능 장애로 만든다. 그러므로, MASP-3의 세린 프로테아제를 암호화하는 엑손의 돌연변이를 가진 3MC 환자는 MASP-3이 결핍되어 있지만 MASP-1은 충분하다.
방법 :
MASP-3-결핍 혈청을 3MC 환자, 3MC 환자의 부모 (둘 다 MASP-3 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 기능 장애로 만드는 돌연변이를 가지고 있는 대립 유전자에 대한 이형 접합성이다), 뿐만 아니라 C4-결핍 환자 (두 인간 C4 유전자의 결핍) 및 MBL-결핍 대상체로부터 얻었다. Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981))에서 기술된 바와 같이 대체 경로 검정을 전통적인 AP-특이적 조건 (BBS/Mg++/EGTA, Ca++ 없음, 여기서 BBS = 수크로오스를 함유한 바비탈 완충된 식염수) 하에 0.5 내지 25%의 범위의 혈청 농도에서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행하였고 시간이 흐름에 따른 C3b 침착을 측정하였다.
결과 :
도 15는 MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 대상체로부터 얻어진 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 대체 경로-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 15에 도시된 바와 같이, MASP-3-결핍 환자 혈청은 높은 혈청 농도 (25%, 12.5%, 6.25% 혈청 농도)에서 잔류 대체 경로 (AP) 활성을 갖지만, 훨씬 더 높은 AP50 (즉, 최대 C3 침착의 50%를 달성하는데 필요한 혈청의 9.8%)을 갖는다.
도 16은 MASP-3-결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 대상체로부터 얻어진 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 "전통적인" 대체 경로-특이적 (AP-특이적) 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 대체 경로-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
하기 표 12는 도 15에서 도시된 AP50 결과 및 도 16에서 도시된 C3b 침착에 대한 중간 시간을 요약한다.
도 15 및 16에서 도시된 결과의 요약
혈청 유형 AP 50 (%) T 1/2 (min)
MASP-3-결핍 (3MC 환자) 9.8 37.4
3MC 환자의 모 (이형 접합성) 4.3 17.2
3MC 환자의 부 (이형 접합성) 4.3 20.9
C4-결핍 4.0 11.6
MBL-결핍 4.8 11.0
주: BBS/Mg++/EGTA 버퍼에서, 렉틴 경로-매개된 효과는 이 버퍼 내 Ca++의 부재로 인해 결핍된다. 요약하면, 이러한 검정 조건 하에서, 대체 경로는 3MC 환자에서 크게 손상된다.
3. MASP-2 또는 MASP-1/3이 결핍된 마우스 혈청에서 만난, 치모산 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39 상의 C3b 침착 측정
방법 :
MASP-2-/-, MASP-1/3-/- 및 WT 마우스로부터 얻어진 0% 내지 20% 범위의 마우스 혈청 농도를 사용하여 만난, 치모산 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 C3b 침착을 측정하였다. "전통적인" 대체 경로-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서, 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (즉, BBS/Mg++/Ca++) 하에서 C3b 침착 검정을 수행하였다.
결과 :
도 17A는 전통적인 대체 경로-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서, 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스로부터 얻어진 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 만난-코팅된 미세역가 플레이트 상의 C3b 침착 수준을 그래프로 나타낸다. 도 17B는 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서, 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈청 샘플 내 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상의 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 17C는 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서, 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 WT, MASP-2-결핍, 및 MASP-1/3-결핍 마우스의 혈청 샘플 내 혈청 농도의 함수로서 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트 상의 C3b 침착 수준을 그래프로 나타낸다.
도 18A는 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 0%에서 1.25%까지의 범위에 있는 혈청 농도를 사용하여 만난-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된, 고도로 희석된 혈청 내 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 나타낸다. 도 18B는 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/EGTA/Mg++/Ca++) 하에서 0%에서 1.25%까지의 범위에 있는 혈청 농도를 사용하여 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 나타낸다. 도 18C는 전통적인 AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/EGTA/Mg++/Ca++) 하에서 0%에서 1.25%까지의 범위에 있는 혈청 농도를 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 수행된 C3b 침착 검정의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 18A-C에서 도시된 바와 같이, C3b 침착 검정을 또한 전통적인 대체 경로-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에서 또는 렉틴 경로 및 대체 경로가 둘 다 기능하게 할 수 있는 생리학적 조건 (BBS/Mg++/Ca++) 하에서 0% 내지 1.25% 혈청의 범위의 고도의 희석액을 사용하여 만난-코팅된 플레이트 (도 18A); 치모산-코팅된 플레이트 (도 18B) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니애 D39-코팅된 플레이트 (도 18C) 상에서 수행하였다. 대체 경로는 고도의 혈청 희석 하에서 감소하였으며, 따라서 Ca++의 존재시 MASP-1/3-결핍 혈청에서 관찰된 활성은 MASP-2-매개된 LP 활성이고, Ca++의 존재시 MASP-2-결핍 혈청의 활성은 AP의 MASP-1/3-매개된 잔류 활성화이다.
논의 :
이 실시예에서 기술된 결과는 MASP-2 억제자 (또는 MASP-2 KO)가 MASP-3-구동된 대체 경로 활성화를 촉진함으로써 네이세리아 메닝기티디스 감염으로부터의 상당한 보호를 제공한다는 것을 입증한다. 마우스 혈청 용균 검정 및 인간 혈청 용균 검정의 결과는 네이세리아 메닝기티디스에 대한 혈청 살균 활성을 모니터링함으로써 MBL-결핍 (마우스 MBL A 및 MBL C 이중-결핍 및 인간 MBL-결핍 혈청)에서 네이세리아 메닝기티디스에 대한 살균 활성이 없다는 것을 추가로 보여준다.
도 1은 본원에서 제공된 결과에 기초하여 렉틴 경로 및 대체 경로의 새로운 해석을 나타낸다. 도 1은 옵소닌화 및 용해 둘 다에서의 LEA-2의 역할을 설명한다. MASP-2는 생리학적으로 다수의 렉틴-의존적 설정에서 "다운스트림" C3b 침착 (및 결과로 일어난 옵소닌화)의 개시자인 한편 (도 18A, 18B, 18C), 혈청-감작된 박테리아의 용해에서 또한 역할을 한다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 네이세리아 메닝기티디스와 같은 혈청-감작된 병원체에 대한 MASP-2-결핍 또는 MASP-2-고갈된 혈청/혈장의 증가된 살균 활성의 원인이 되는 제안된 분자적 메커니즘은, 박테리아의 용해에 대하여, MASP-1 및 MASP-3과 관련된 렉틴 경로 인식 복합체가 박테리아 표면에서 서로 근접하여 결합해야하고, 이로써 MASP-1이 MASP-3을 분열시킬 수 있게 한다는 것이다. MASP-1 및 MASP-2와는 달리, MASP-3은 자가-활성화 효소가 아니지만, 많은 경우에, MASP-1에 의한 활성화/분열이 효소적 활성 형태로 전환되는 것을 필요로 한다.
도 1에 추가로 도시된 바와 같이, 활성화된 MASP-3은 병원체 표면 상에서 C3b-결합된 인자 B를 분열시켜 각각 효소적 활성 대체 경로 C3 및 C5 전환효소 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n의 형성에 의해 대체 경로 활성화 캐스케이드를 시작할 수 있다. MASP-2-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 MASP-3의 활성화에 관여하지 않고, MASP-2의 부재시 또는 MASP-2의 고갈 이후에, 모든 렉틴 경로 활성화 복합체는 MASP-1 또는 MASP-3과 함께 로딩될 것이다. 그러므로, MASP-2의 부재시, 미생물 표면 상에서 MASP-1 및 MASP-3-함유 렉틴-경로 활성화 복합체는 서로 근접하게 배치되어, 더 많은 MASP-3이 활성화되고 이로써 C3b-결합된 인자 B의 더 높은 속도의 MASP-3-매개된 분열을 유도하여 미생물 표면 상에서 대체 경로 C3 및 C5 전환효소 C3bBb 및 C3bBb(C3b)n을 형성할 가능성이 현저히 증가한다. 이것은 표면-결합된, C6과 관련된 C5b, C7과 관련된 C5bC6, C8과 관련된 C5bC6C7, 및 C5bC6C7C8로 구성된 막 공격 복합체를 형성하여, 박테리아 표면 구조로 삽입되어 박테리아 벽에서 공극을 형성하는 C9의 폴리머화를 유도하여, 보체-표적화된 박테리아의 삼투성 살해를 유도하는 말단 활성화 캐스케이드 C5b-C9의 활성화로 이어진다.
이 새로운 개념의 핵심은 본원에서 제공된 데이터에서 렉틴 경로 활성화 복합체가 두 개의 별개의 활성화 루트를 구동시킨다는 것을 분명하게 나타낸다는 것이며, 도 1에서 나타난 바와 같다.
실시예 5
이 실시예는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)의 마우스 모델로부터 얻어진 혈액 샘플로부터 적혈구 세포의 용해에 대한 MASP-2 결핍 및/또는 MASP-3 결핍의 억제 효과를 입증한다.
배경/근거 :
종종 마르키아파바-미켈리 증후군이라고도 불리는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)은 후천적이고, 잠재적으로 생명을 위협하는 혈액 질환이며, 보체-유도된 혈관내 용혈성 빈혈증을 특징으로 한다. PNH의 홀마크는 PNH 적혈구 상에서 보체 조절자 CD55 및 CD59의 부재로 인한 보체의 대체 경로의 조절되지 않는 활성화의 결과인 만성 보체-매개된 혈관내 용혈이며, 이후에 혈색뇨증 및 빈혈증이 발생한다. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011). PNH에서 빈혈증은 혈류에서 적혈구 세포의 파괴로 인한 것이다. PNH의 증상은 소변에서 헤모글로빈의 출현으로 인한 적뇨, 요통, 피로, 숨 가쁨 및 혈전증을 포함한다. PNH는 "1차 PNH"라고 하여, 자체적으로 또는 "2차 PNH"라고 하여, 재생불량성 빈혈과 같은 다른 골수 장애의 맥락에서 발달할 수도 있다. PNH의 치료법 빈혈증에 대한 수혈, 혈전증에 대한 응고 방지 및 보체 시스템을 억제하여 면역 파괴로부터 혈액 세포를 보호하는 단클론성 항체 에쿨리쥬맙 (Soliris®)의 사용을 포함한다 (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004)). 에쿨리쥬맙 (Soliris®)은 보체 구성요소 C5를 표적화하여 C5 전환효소에 의한 분열을 차단하고, 이로써 C5a의 생산 및 MAC의 조립을 방지하는 인간화된 단클론성 항체이다. 에쿨리쥬맙으로의 PNH 환자의 처리는 락테이트 데하이드로게나아제 (LDH)로 측정된 바와 같이, 혈관내 용혈을 감소시켜, 대략 절반의 환자에서 헤모글로빈 안정화 및 수혈 독립성을 유도한다 (Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). 에쿨리쥬맙을 이용한 요법을 받은 거의 모든 환자가 정상적인 또는 거의 정상적인 LDH 수준을 달성하는 한편 (혈관내 용혈의 제어로 인해), 약 3분의 1의 환자만이 약 11gr/dL의 헤모글로빈 값에 도달하고, 에쿨리쥬맙 상의 나머지 환자는 거의 같은 비율로 중등도 내지 중증 (즉, 수혈-의존적) 빈혈증을 지속적으로 나타낸다 (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)에서 기술된 바와 같이, 에쿨리쥬맙 상의 PNH 환자는 PNH 적혈구의 상당한 부분에 결합된 대량의 C3 단편을 함유하며 (하지만 미처리 환자는 그렇지 않음), 막-결합된 C3 단편이 PNH 적혈구 상에서 옵소닌으로 작동하여, 특이적 C3 수용체를 통해 세망 내피 세포에서 그것들의 포획 및 후속 혈관외 용혈을 초래한다는 것이 입증되었다. 그러므로, C3 단편-매개된 혈관외 용혈에 걸린 환자들이 적혈구 수혈을 지속적으로 필요로 하기 때문에 C3 단편-매개된 혈관외 용혈에 걸린 환자에게 에쿨리쥬맙의 사용 이외의 치료 계획이 필요하다.
이 실시예는 PNH의 마우스 모델로부터 얻어진 혈액 샘플로부터 적혈구 세포의 용해에 대한 MASP-2- 및 MASP-3-결핍 혈청의 효과를 평가하는 방법을 기술하고 PNH로 고통받고 있는 대상체를 치료하기 위한 MASP-2 억제 및/또는 MASP-3 억제의 효능을 입증하고, 또한 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제자로의 요법을 받은 PNH 대상체에서 C3 단편-매개된 혈관외 용혈의 효과를 개선하기 위한 MASP-2의 억제자 및/또는 MASP-3의 억제자 (이중 또는 이중특이적 MASP-2/MASP-3 억제자 포함)의 사용을 지지한다.
방법 :
PNH 동물 모델 :
Crry 및 C3이 결핍된 유전자-표적화된 마우스 (Crry/C3-/-) 및 CD55/CD59-결핍 마우스로부터 혈액 샘플을 얻었다. 이 마우스들은 적혈구 상에서 각각의 표면 보체 조절자가 없으며, 그러므로, 이 적혈구들은 PNH 인간 혈액 세포와 마찬가지로 자발적 보체 자가용해에 취약하다.
이 적혈구들을 훨씬 더 많이 감작시키기 위해서, 이 세포들을 만난에 의한 코팅 여부에 관계없이 사용하였다. WT C56/BL6 혈장, MBL 널 혈장, MASP-2 -/- 혈장, MASP-1/3 -/- 혈장, 인간 NHS, 인간 MBL -/- 혈장, 및 인간 MASP-2 항체로 처리된 NHS에서 용혈에 대하여 테스트하였다.
1. MASP-2-결핍/고갈된 혈청 및 대조군에서 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 쥐 적혈구의 용혈 검정
제1 일. 쥐 RBC의 제조 (± 만난 코팅).
포함되는 재료: 신선한 마우스 혈액, BBS/Mg++/Ca++ (4.4 mM 바비투르산, 1.8 mM 나트륨 바비톤, 145 mM NaCl, pH 7.4, 5mM Mg++, 5mM Ca++), 염화크롬, CrCl3·6H20 (BBS/Mg++/Ca++ 중의 0.5mg/mL) 및 만난, BBS/Mg++/Ca++ 중의 100 μg/mL.
전혈 (2 mL)을 4℃의 냉동원심분리기에서 2000xg로 1-2분 동안 스핀 다운하였다. 혈장 및 버피 코트(buffy coat)를 빨아내어 제거하였다. 이어서 샘플을 2 mL 매우 차가운 BBS/젤라틴/Mg++/Ca++에 RBC 펠릿을 재현탁하여 3x 세척하였고 원심분리 단계를 반복하였다. 3차 세척 후, 펠릿을 4 mL BBS/Mg++/Ca++에 재현탁하였다. RBC의 2 mL 앨리쿼트(aliquot)를 코팅되지 않은 대조군으로 남겨두었다. 나머지 2 mL에, 2 mL CrCl3 및 2 mL 만난을 추가하고 샘플을 RT에서 5분 동안 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 7.5 mL BBS/젤라틴/Mg++/Ca++를 추가하여 반응을 중단시켰다. 상기와 같이 샘플을 스핀 다운하고, 2 mL BBS/젤라틴/Mg++/Ca++에 재현탁하고 상기와 같이 추가로 2회 세척한 다음 4℃에 저장하였다.
제2 일. 용혈 검정
재료는 BBS/젤라틴/Mg++/Ca++ (상기와 같음), 테스트 혈청, 96-웰 둥근 바닥 및 평평한 바닥 플레이트 및 410-414 nm에서 96-웰 플레이트를 판독하는 분광 광도계를 포함한다.
RBC의 농도를 먼저 결정하고 세포를 109/mL로 조정하고, 이 농도로 저장하였다. 사용 전에, 세포를 검정 버퍼에서 108/mL로 희석한 다음, 웰 당 100 μL를 사용하였다. 용혈을 410-414 nm (541nm보다 더 높은 민감도를 허용함)에서 측정하였다. 테스트 혈청의 희석액을 매우 차가운 BBS/젤라틴/Mg++/Ca++에서 제조하였다. 각각의 혈청 희석액 100μL를 피펫을 이용하여 둥근 바닥 플레이트로 옮겼다. 적절하게 희석된 RBC 조제물 100 μL를 추가하고 (즉, 108/mL), 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션하고, 용해에 대하여 관찰하였다 (이 시점에 플레이트를 사진 촬영할 수도 있다). 이어서 플레이트를 최대 속도에서 5분 동안 스핀 다운하였다. 유체상 100 μL를 빨아들여, 평평한 바닥 플레이트로 옮기고, 410-414 nm에서 OD를 기록하였다. RBC 펠릿을 유지하였다 (이것들을 나중에 물에 용해시켜 반대 결과를 얻었다).
실험 #1
신선한 혈액을 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻었고 Crry/C3 이중-결핍 마우스의 혈액 및 적혈구를 상기 프로토콜에서 상세히 설명된 바와 같이 제조하였다. 세포를 분할하여 세포의 절반을 만난으로 코팅하고 나머지 절반을 처리하지 않은 채로 두고, 최종 농도를 108/mL로 조정하였으며, 이것들 중 100 μL를 용혈 검정에 사용하였고, 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
실험 #1의 결과: 렉틴 경로는 PNH 동물 모델에서 적혈구 용해에 수반된다
초기 실험에서, 코팅되지 않은 WT 마우스 적혈구는 어떤 마우스 혈청에서도 용해되지 않는다는 것이 결정되었다. 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 WT 마우스 혈청에서 서서히 용해되지만 (37도에서 3시간 초과), MBL 널 혈청에서는 용해되지 않는다는 것이 추가로 결정되었다 (데이터 미도시).
만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 인간 혈청에서 신속하게 용해되지만 열-비활성화된 NHS에서는 용해되지 않는다는 것이 결정되었다. 중요하게는, 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 1/640까지 희석된 NHS에서 용해되었다 (즉, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640 희석액 모두 용해됨) (데이터 미도시). 이 희석액에서, 대체 경로는 대체 경로는 작동하지 않는다 (AP 기능적 활성이 8% 혈청 농도 미만으로 크게 감소한다).
실험 #1의 결론
만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구는 MBL이 들어있는 고도로 희석된 인간 혈청에서 매우 잘 용해되지만 MBL이 없는 것에서는 용해되지 않았다. 테스트된 모든 혈청 농도에서 효율적인 용해는 대체 경로가 수반되지 않거나 이 용해에 필요하지 않다는 것을 나타낸다. MBL-결핍 마우스 혈청 및 인간 혈청이 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 용해시킬 수 없다는 것은 고전적 경로가 또한 관찰된 용해와 관련이 없다는 것을 나타낸다. 렉틴 경로 인식 분자 (즉, MBL)가 필요하기 때문에, 이 용해는 렉틴 경로에 의해 매개된다.
실험 #2
신선한 혈액을 Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스로부터 얻었고 만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구를 다음 인간 혈청의 존재 하에서 상기 기술된 바와 같이 용혈 검정으로 분석하였다: MASP-3 -/-; MBL 널; WT; 인간 MASP-2 항체로 전처리된 NHS; 및 대조군으로서 열-비활성화된 NHS.
실험 #2의 결과: MASP-2 억제자 및 MASP-3 결핍은 PNH 동물 모델에서 적혈구 용해를 방지한다
만난-코팅된 Crry-/- 마우스 적혈구와 함께, NHS, 인간 MBL-/- 혈청, 인간 MASP-3-결핍 혈청 (3MC 환자의 것), 및 MASP-2 mAb로 전처리된 NHS, 및 대조군으로서 열-비활성화된 NHS를 1/640까지 희석된 (즉, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 및 1/640) 희석액에서 인큐베이션하였다.
ELISA 미세역가 플레이트를 스핀 다운하고 용해되지 않은 적혈구를 둥근-웰 플레이트에 수거하였다. 각 웰의 상층액을 수거하고 ELISA 판독기에서 OD415 nm를 판독하여 용해된 적혈구로부터 방출된 헤모글로빈의 양을 측정하였다.
MASP-3-/- 혈청은 만난-코팅된 마우스 적혈구를 전혀 용해시키지 않았다는 것을 관찰하였다. 대조군 열-비활성화된 NHS (음성 대조군)에서, 예상된 바와 같이, 용해가 관찰되지 않았다. MBL-/- 인간 혈청은 1/8 및 1/16 희석액에서 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해시켰다. MASP-2-항체-전처리된 NHS는 1/8 및 1/16 희석액에서 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해시키는 한편 WT 인간 혈청은 1/32까지의 희석액에서 만난-코팅된 마우스 적혈구를 용해시켰다.
도 19는 MASP-3-/-의 혈청, 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, MASP-2 항체로 전처리된 NHS, 및 NHS 대조군에서 혈청 희석액의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다.
도 20은 MASP-3-/-의 혈청, 열-비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, MASP-2 항체로 전처리된 NHS, 및 NHS 대조군에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 인간 혈청에 의한 만난-코팅된 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (Crry/C3-/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다.
도 19 및 20에서 도시된 결과로부터, MASP-3을 억제하는 것이 자가 보체 활성화로부터의 보호가 결핍된 감작된 적혈구의 임의의 보체-매개된 용해를 방지한다는 것이 입증된다. MASP-2 항체로의 MASP-2 억제는 CH50을 크게 이동시켰고 어느 정도로는 보호적이었지만, MASP-3 억제가 더 효과적이었다.
실험 #3
Crry/C3 및 CD55/CD59 이중-결핍 마우스의 신선한 혈액으로부터 얻어진 코팅되지 않은 Crry-/- 마우스 적혈구를 다음 혈청의 존재 하에서 상기 기술된 바와 같이 용혈 검정으로 분석하였다: MASP-3-/-; MBL-/-; WT; 인간 MASP-2 항체로 전처리된 NHS, 및 대조군으로서 열-비활성화된 NHS.
결과 :
도 21은 3MC (MASP-3-/-) 환자의 인간 혈청, 열 비활성화된 (HI) NHS, MBL-/-, MASP-2 항체로 전처리된 NHS, 및 NHS 대조군에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 코팅되지 않은 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 WT 마우스 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다. 도 21에서 도시되고 표 13에서 요약된 바와 같이, MASP-3을 억제하는 것은 비-감작된 WT 마우스 적혈구의 보체-매개된 용해를 억제한다는 것이 입증된다.
도 22는 열-비활성화된 (HI)의 인간 혈청 NHS, MBL-/-, MASP-2 항체로 전처리된 NHS, 및 NHS 대조군에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 코팅되지 않은 쥐 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 마우스 적혈구 (CD55/59 -/-)의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다. 도 22에서 도시되고 표 13에서 요약된 바와 같이, MASP-2를을 억제하는 것은 제한된 정도로 보호적이라는 것이 입증된다.
혈청 농도로 표시되는 CH50 값
혈청 WT CD55/59 -/-
3MC 환자 용해되지 않음 용해되지 않음
열-비활성화된 NHS 용해되지 않음 용해되지 않음
MBL AO/XX 공여체 (MBL 결핍) 7.2% 2.1%
NHS + MASP-2 항체 5.4% 1.5%
NHS 3.1% 0.73%
주: "CH50"은 보체-매개된 용혈이 50%에 도달하는 지점이다.요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-3을 억제하는 것이 자가 보체 활성화로부터의 보호가 결핍된 감작된 및 감작되지 않은 적혈구의 임의의 보체 용해를 방지한다는 것을 입증한다. MASP-2 억제는 또한 어느 정도로는 보호적이다. 그러므로, 단독으로 또는 조합된 (즉, 동시-투여되거나, 순차적으로 투여된) MASP-2 및 MASP-3 억제자 또는 MASP-2/MASP-3 이중특이적 또는 이중 억제자는 PNH로 고통받고 있는 대상체를 치료하는데 사용될 수도 있고, 에쿨리쥬맙 (Soliris®)과 같은 C5 억제자로의 처리를 받은 PNH 환자에서 혈관외 용혈을 개선하는데 (즉, 억제하거나, 예방하거나 또는 이것의 심각도를 감소시키는데) 사용될 수도 있다.
실시예 6
이 실시예는 WT 또는 MASP-1/3-/- 마우스 혈청의 존재시 용해에 대하여 만난-코팅된 토끼 적혈구를 테스트하는 용혈 검정을 기술한다.
방법 :
1. 마우스 MASP-1/3-결핍 혈청 및 WT 대조군 혈청에서 토끼 RBC (만난 코팅됨)의 용혈 검정
제1 일. 토끼 RBC의 제조.
포함되는 재료: 신선한 토끼 혈액, BBS/Mg++/Ca++ (4.4 mM 바비투르산, 1.8 mM 나트륨 바비톤, 145 mM NaCl, pH 7.4, 5 mM Mg++, 5 mM Ca++), 0.1% 젤라틴이 들어있는 BBS/Mg++/Ca++, 버퍼에 함유된 염화크롬; 즉, CrCl3.6 H2O (BBS/Mg++/Ca++ 중의 0.5 mg/mL) 및 만난, BBS/Mg++/Ca++ 중의 100 μg/mL.
1. 토끼 전혈 (2 mL)을 두 개의 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 분할하고 4℃의 에펜도르프 원심분리기에서 8000 rpm (대략 5.9 rcf)으로 3분 동안 원심분리하였다. RBC 펠릿을 매우 차가운 BBS/Mg++/Ca++에 재현탁한 후 3회 세척하였다. 3차 세척 후, 펠릿을 4 mL BBS/Mg++/Ca++에 재현탁하였다. 이 앨리쿼트 2 mL을 코팅되지 않은 대조군으로서 15-mL 팔콘 튜브에 추가하였다. RBC 앨리쿼트의 나머지 2 mL을 CrCl3 버퍼 2 mL에 희석하고, 만난 용액 2 mL을 추가하고 현탁액을 실온에서 5분 동안 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 혼합물에 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++ 7.5 mL을 추가하여 반응을 중단시켰다. 적혈구를 펠릿화하고 RBC를 상기 기술된 바와 같이 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++로 2회 세척하였다. RBC 현탁액을 4℃에서 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++에 저장하였다.
2. 현탁된 RBC 100 μL를 1.4 mL 물로 희석하고 8000 rpm (대략 5.9 rcf)로 3분 동안 스핀 다운하고 541nm에서 상층액의 OD를 0.7로 조정하였다 (541nm에서 0.7의 OD는 대략 109 적혈구/mL에 상응한다).
3. 재현탁된 RBC는 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++로 108/mL의 농도까지 희석하였다.
4. 테스트 혈청의 희석액을 매우 차가운 BBS/젤라틴/Mg++/Ca++에서 제조하고 각각의 혈청 희석액 100 μL를 피펫을 이용하여 둥근 바닥 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다. 적절하게 희석된 RBC (108/mL) 100 μL를 각 웰에 추가하였다. 완전한 용해에 대한 대조군으로서, 정제수 (100 μL)를 희석된 RBC (100 μL)와 혼합하여 100% 용해를 유발하는 한편, 혈청 (100 μL)이 없는 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++를 음성 대조군으로 사용하였다. 이어서 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
5. 둥근 바닥 플레이트를 5분 동안 3250 rpm로 원심분리하였다. 각 웰의 상층액 (100 μL)을 평평한 바닥 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼고 OD를 ELISA 판독기에서 415-490nm에서 판독하였다. 결과는 490nm에서의 OD에 대한, 415nm에서의 OD의 비율로서 보고된다.
결과 :
도 23은 MASP-1/3-/- 및 WT 대조군의 혈청에서 광범위한 혈청 농도에 걸쳐 마우스 혈청에 의한 만난-코팅된 토끼 적혈구의 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 토끼 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다. 도 23에서 도시된 바와 같이, MASP-3을 억제하는 것은 만난-코팅된 WT 토끼 적혈구의 보체-매개된 용해를 방지한다는 것이 입증된다. 이 결과들은 실시예 5에서 기술된 바와 같이 PNH의 하나 이상의 양태의 치료를 위한 MASP-3 억제자의 사용을 추가로 지지한다.
실시예 7
이 실시예는 변형된 DT40 세포주, DTLacO을 포함하는 시험관 내 시스템을 사용하는 MASP-1 및 MASP-3 단클론성 항체의 생성을 기술한다.
배경/근거 :
인간 MASP-1 및 MASP-3에 대한 항체를 WO2009029315 및 US2010093033에서 추가로 기술된 바와 같이 특정 폴리펩타이드의 다양화의 가역적 유도를 허용하는 변형된 DT40 세포주, DTLacO을 포함하는 시험관 내 시스템을 사용하여 생성하였다. DT40은 배양 중에 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 (Ig) 유전자에 구성적으로 돌연변이를 일으키는 것으로 알려져 있는 닭 B 세포주이다. 다른 B 세포와 유사하게, 이 구성적 돌연변이 유발은 Ig 유전자의 V 영역 및, 따라서 발현된 항체 분자의 CDR에 대한 돌연변이를 표적으로 한다. DT40 세포에서 구성적 돌연변이 유발은 공여체 서열로서 각각의 기능적 V 영역의 업스트림에 위치한 비-기능적 V 유전자 세그먼트 (가짜(pseudo)-V 유전자; ψV)의 배열을 사용하는 유전자 전환에 의해 일어난다. ψV 영역의 결실은 이전에 인간 B 세포에서 일반적으로 관찰되는 메커니즘인, 다양화 메커니즘에서의 유전자 전환으로부터 체세포 초돌연변이로의 스위치(switch)를 유발하는 것으로 나타났다. DT40 닭 림프종 B 세포주는 생체외에서 항체 진화에 대한 유망한 시작점인 것으로 나타났다 (Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)). DT40 세포는 배양 중에 왕성하게 증식하며, 8-10시간의 증배 시간(doubling time)을 갖고 (인간 B 세포주에 대한 20-24 hr과 비교하여), 매우 효율적인 상동성 유전자 표적화를 지지한다 (Buerstedde, J.M. et al. Embo J 9, 921-927 (1990)). DT40 세포는 각각 주형(templated) 및 비주형(nontemplated) 돌연변이를 생성하는 다양화, 유전자 전환 및 체세포 초돌연변이에 대한 두 개의 별개의 생리학적 경로에 접근할 수 있다는 점을 고려하면 엄청난 잠재적인 V 영역 서열 다양성을 가지고 있다 (Maizels, N. Annu Rev Genet 39, 23-46 (2005)). 다양화된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 (Ig)은 세포-표면에 디스플레이된 IgM의 형태로 발현된다. 표면 IgM은 2가 형태를 가지고 있으며, IgG 분자와 구조적으로 유사하다. 특정 항원에 대한 특이성을 가진 IgM을 나타내는 세포는 고정된 가용성 또는 막 디스플레이된 버젼의 항원에 결합함으로써 단리될 수 있다. 하지만, 항체 진화에 대한 DT40 세포의 유용성이 실제로 제한되었는데 - 다른 형질전환된 B 세포주에서와 마찬가지로 - 1% 미만의 생리학적 비율로 발생하기 때문이다.
이 실시예에서 사용된 시스템에서, WO2009029315 및 US2010093033에서 기술된 바와 같이, 추가의 유전적 변형에 대한 능력 또는 유전자 전환 및 체세포 초돌연변이 둘 다가 돌연변이 유발에 기여할 가능성을 희생시키기 않으면서 Ig 유전자 다양화의 속도를 가속화하도록 DT40 세포를 조작하였다. DT40에 대한 두 개의 주요 변형이 다양화의 속도 및, 그 결과, 결합 특이성의 복잡성을 증가시키기 위해 이루어졌다. 먼저, Ig 유전자 다양화를 강력한 대장균 락토오스 작동자/억제자 조절 네트워크의 제어 하에 두었다. 강력한 대장균 락토오스 작동자 (PolyLacO)의 대략 100개의 폴리머화된 반복부위로 구성된 멀티머를 상동성 유전자 표적화에 의해 재배열되고 발현된 Igλ 및 IgH 유전자의 업스트림에 삽입하였다. 락토오스 억제자 단백질 (LacI)에 융합된 조절 인자는 작동자 DNA에 대한 락토오스 억제자의 고 친화도 (kD=10-14 M)를 이용하여 다양화를 조절하기 위해 LacO 조절 요소에 연결될 수 있다. Igλ에서만 PolyLacO이 통합되는 DT40 PolyLacO-λR 세포는 임의의 조작 전에 모체 DT40 세포에 비해 Ig 유전자 다양화 속도의 5배 증가를 나타냈다 (Cummings, W.J. et al. PLoS Biol 5, e246 (2007)). 다양화는 Igλ 및 IgH 유전자 둘 다를 표적화하는 PolyLacO ("DTLacO")를 가지고 있도로고 조작된 세포에서 더 증가되었다. DTLacO 세포는 모체 DT40 PolyLacO-λR LacI-HP1 세포주 특유의 2.8%에 비해 2.5- 내지 9.2배 높아진 다양화 속도를 갖는 것으로 입증되었다. 따라서, 중쇄 및 경쇄 유전자 둘 다에 대한 PolyLacO 요소를 표적화하는 것은 DT40 모체 세포주에 비해 다양화를 21.7배 가속화하였다. Ig 유전자좌에 조절 인자를 연결하는 것은 돌연변이 유발의 빈도를 변화시킬 뿐만 아니라, 독특한 서열 변화의 더 큰 컬렉션을 생성하는 돌연변이 유발 경로를 변화시킬 수 있다 (Cummings et al. 2007; Cummings et al. 2008). 두 번째로, 연결된 인자-가속화된 Ig 유전자 다양화에 대한 서열 시작점의 다양한 컬렉션을 생성하였다. 이들 다양한 서열 시작점을 2개월령 병아리로부터 분리된 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역을 중쇄 유전자좌로 표적화함으로써 DTLacO에 추가하였다. 이들 중쇄 가변 영역의 추가는 항체 다양화에 대한 107개의 새로운 시작점의 레퍼토리를 생성하였다. 이들 새로운 시작점을 DTLacO 세포주에 삽입하는 것은 특정 표적에 결합하는 클론의 확인, 및 이어서 연결된 인자에 의한 신속한 친화도 성숙화를 허용한다. 친화도 성숙화 후, 성숙화되고, 재배열된 중쇄 및 경쇄 가변 서열 (VH 및 Vλ; 닭 프레임워크 영역 및 상보성 결정 영역 또는 CDR로 구성됨)을 인간 IgG1 및 람다 불변 영역을 함유하는 발현 벡터에 클로닝하여 전장, 재조합 키메라 IgG를 제조한다. 이들 재조합 mAb는 시험관 내 및 생체 내 적용에 적합하고, 인간화를 위한 시작점으로서 역할을 한다.
방법 :
MASP-1 및 MASP-3 항원 결합에 대한 선택 .
인간 MASP-1 (서열 번호:8) 및 MASP-3 항원 (서열 번호:2)과 복합체를 형성한 비드로의 유전자 표적화에 의해 다양화된 DTLacO 집단에 결합시킴으로써 처음 선택을 수행하였고 이후의 선택은 형광 라벨링된 가용성 항원을 사용한 FACS에 의해 수행하였다 (Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005). MASP-1과 MASP-3 사이에서 공유되는 알파 사슬 (도 2에서 도시됨), 및 별개의 베타 사슬 서열 (도 2에서 도시됨)에서 보존된 아미노산 서열 때문에, MASP-1 및 MASP-3에 대한 바인더에 대한 별개의 유사한 스크리닝을 수행하여 MASP-1 특이적 mAb, MASP-3 특이적 mAb 및 또한 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 결합할 수 있는 (이중-특이적) mAb를 확인하였다. 두 가지 형태의 항원을 사용하여 바인더를 선택하고 이것에 대해 스크리닝하였다. 먼저, Fc 도메인에 융합된, 전장 또는 단편의 재조합 MASP-1 또는 MASP-3을 Dynal 자성 단백질 G 비드에 결합시키거나 또는 PECy5-라벨링된 항-인간 IgG(Fc) 2차 항체를 사용하여 FACS-기반 선택에 사용하였다. 대안으로, 재조합 버젼의 MASP-1 또는 MASP-3 단백질을 Dylight 가루로 직접 라벨링하고 선택 및 스크리닝에 사용하였다.
결합 및 친화도 .
PCR-증폭된 V 영역을 293F 세포에서 인간 IgG1의 발현을 지지하는 벡터로 클로닝하여 재조합 항체를 생성하였다 (Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012)). MASP-1 또는 MASP-3에 결합하는 항체를 발현하는 염색 DTLacO 세포를 다양한 농도의 형광-라벨링된 가용성 항원으로 염색하여 포화 결합 동역학을 결정하였다. MASP-3-의존적 C3b 침착 및 MASP-3-의존적 인자 D 분열을 포함하는 MASP-3 특이적 활성에 대한 기능적 검정을 각각 실시예 8 및 9에서 기술된 바와 같이 수행하였다. MASP-1-특이적 활성, 즉, MASP-1-의존적 C3b 침착의 억제에 대한 기능적 검정을 하기 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과 :
많은 MASP-1 및 MASP-3 결합 항체를 상기 기술된 방법을 사용하여 생성하였다. FACS 분석에 의해 입증된 바와 같이, 결합은 MASP-3 바인더에 대한 스크리닝에서 단리된 대표적인 클론 M3J5 및 M3M1에 대하여 기술되었다.
도 24A는 DTLacO 클론 M3J5에 대한 MASP-3 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이다. 도 24B는 DTLacO 클론 M3M1에 대한 MASP-3 항원/항체 결합의 FACS 히스토그램이다. 도 24A 및 24B에서, 회색으로 채워진 곡선은 IgG1-염색된 음성 대조군이고, 두꺼운 검은색 곡선은 MASP-3-염색이다.
도 25는 MASP-3 항원에 대한 클론 M3J5 (클론 5)의 포화 결합 곡선을 그래프로 나타낸다. 도 25에서 도시된 바와 같이, MASP-3에 대한 M3J5 항체의 겉보기 결합 친화도는 약 31 nM이다.
확인된 클론의 서열 분석을 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 모든 클론을 공통 (DT40) VH 및 VL 서열 및 서로와 비교하였다. 상기 언급된 두 개의 클론, M3J5 및 M3M1에 대한 서열은 각각 MASP-1 및 MASP-3의 CCP1-CCP2-SP 단편에 대한 스크리닝에서 확인된 두 개의 추가적인 대표적인 클론, D14 및 1E10과의 정렬에서 제공된다. D14 및 1E10은 MASP-1 및 MASP-3 둘 다에 공통인 영역에 결합한다.
도 26A는 닭 DT40 VH 서열에 대한 M3J5, M3M1, D14 및 1E10의 VH 영역의 아미노산 서열 정렬이다.
도 26B는 닭 DT40 VL 서열에 대한 M3J5, M3M1, D14 및 1E10의 VL 영역의 아미노산 서열 정렬이다.
각 클론의 VH 및 VL 아미노산 서열은 하기 제공된다.
중쇄 가변 영역 (VH) 서열
도 26A는 모체 DTLacO (서열 번호:300), MASP-3-결합 클론 M3J5 (서열 번호:301), 및 M3M1 (서열 번호:302), 및 MASP-1/MASP-3 이중 결합 클론 D14 (서열 번호:306), 및 1E10 (서열 번호:308)에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열의 아미노산 정렬을 나타낸다.
하기 VH 서열의 카바트 CDR은 다음 아미노산 위치에 위치한다: H1:aa 31-35; H2:aa 50-62; 및 H3:aa 95-102.
하기 VH 서열의 쵸티아 CDR은 다음 아미노산 위치에 위치한다: H1: aa 26-32; H2: aa 52-56; 및 H3: aa 95-101.
모체 DTLacO VH: (서열 번호:300)
Figure pat00003
클론 M3J5 VH: (서열 번호:301)
Figure pat00004
클론 M3M1 VH: (서열 번호:302)
Figure pat00005
클론 D14 VH: (서열 번호:306)
Figure pat00006
클론 1E10 VH: (서열 번호:308)
Figure pat00007
경쇄 가변 영역 (VL) 서열
도 26B는 모체 DTLacO (서열 번호:303) 및 MASP-3-결합 클론 M3J5 (서열 번호:304), 및 M3M1 (서열 번호:305), 및 the MASP-1/MASP-3 이중 결합 클론 D14 (서열 번호:307) 및 1E10 (서열 번호:309)에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열의 아미노산 정렬을 나타낸다.
모체 DTLacO VL: (서열 번호:303)
Figure pat00008
클론 M3J5 VL: (서열 번호:304)
Figure pat00009
클론 M3M1 VL: (서열 번호:305)
Figure pat00010
클론 D14 VL: (서열 번호:307)
Figure pat00011
클론 1E10 VL: (서열 번호:309)
Figure pat00012
LEA-2 (MASP-2-의존적) 기능적 검정
MASP-1은 MASP-2를 활성화시킬 수 있는 능력을 통해 LEA-2에 기여한다 (도 1 참조). Wieslab® Complement System Screen MBL 검정 (Euro Diagnostica, Malmo, Sweden)은 LEA-2-의존적 활성화 (즉, 전통적인 렉틴 경로 활성)를 단리시키는 조건 하에서 C5b-C9 침착을 측정한다. 검정을 400 nM의 최종 농도로서 테스트된 대표적인 클론 1E10을 이용하는 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
도 27는 검정 키트와 함께 제공된 양성 혈청, 뿐만 아니라 아이소타입 대조군 항체와 비교하여 mAb 1E10의 억제 활성을 나타내는 막대그래프이다. 도 27에서 도시된 바와 같이, mAb 1E10은 LEA-2-의존적 활성화의 부분적인 억제를 입증하는 반면에 (MASP-2의 MASP-1-의존적 활성화의 억제를 통해), 아이소타입 대조군 항체는 그렇지 않다. 더 강력한 억제가 DTLacO 시스템에서 연결된 인자를 사용하는 MASP-2 결합에 대한 이 항체의 지속적인 친화도 성숙화에 의해 달성되어야 한다.
대표적인 mAb에 대한 LEA-1 (MASP-3-의존적) Function Assay는 하기 실시예 8 및 9에서 기술된다.
결과의 요약
상기 결과는 DTLacO 플랫폼이 LEA-1 (하기 실시예 8 및 9에서 나타난 바와 같음) 및 LEA-2 (이 실시예에서 나타난 바와 같음)에 대한 억제 성질을 가진 MASP-1 및 MASP-3 단클론성 항체의 신속한 생체 외 발견을 허용한다는 것을 보여주었다.
실시예 8
스타필로코쿠스 아우레우스로 3MC 혈청에서 보체 경로의 분석
배경/근거 :
MASP-3이 정상 인간 혈청의 존재 또는 부재시 비-고정된 유체상 만난, 치모산 A 또는 N-아세틸 시스테인으로의 노출을 통해 활성화되지 않는다는 것을 결정하였다. 하지만, 재조합 및 원래의 MASP-3이 정상 인간 혈청 (NHS) 또는 열-비활성화된 인간 혈청 (HIS) (데이터 미도시)의 존재 및 부재시 열-비활성화된 스타필로코쿠스 아우레우스의 표면 상에서 활성화된다는 것을 결정하였다. 또한 C3b 침착은 정상 인간 혈청의 존재시 스타필로코쿠스 아우레우스의 표면 상에서 일어나고, 침착을 유동 세포 분석기를 사용하여 모니터링할 수 있다는 것을 결정하였다. 그러므로, 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 대체 경로 (AP) 반응을 LEA-1에 대한 MASP-3의 기여를 평가하는 수단으로서 이 실시예에서 기술된 바와 같이 측정하였다.
방법 :
재조합 MASP-3: 전장 재조합 인간 MASP-3, MASP-3의 절단된 세린 프로테아제 (SP) 활성 버젼 (CCP1-CCP2-SP), 및 MASP-3의 SP-비활성화된 형태 (S679A)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 pTriEx7 포유류 발현 벡터 (Invivogen)에 클로닝하였다. 결과로 생성된 발현 구조체는 아미노-말단 Streptag 및 카르복시-말단 His6 태그를 가진 전장 MASP-3 또는 CCP1-CCP2-SP 단편을 암호화한다. 발현 구조체를 제조사에 의해 제공되는 프로토콜에 따라 Freestyle 293-F 또는 Expi293F 세포 (Invitrogen)에 트랜스펙션하였다. 37℃에서 5% CO2에서 3 내지 4일 배양 후, 재조합 단백질을 Streptactin 친화도 크로마토그래피를 활용하여 정제하였다.
재조합 MASP-1: 안정화 R504Q (Dobo et al., J. Immunol 183:1207, 2009) 또는 SP 비활성화 (S646A) 돌연변이가 있거나 없고 아미노-말단 Steptag 및 카르복시-말단 His6 태그를 가지고 있는 전장 또는 절단된 CCP1-CCP2-SP 형태의 재조합 MASP-1을 재조합 MASP-3에 대하여 상기 기술된 바와 같이 생성하였다.
1. 3MC (인간) 혈청에서 스타필로코쿠스 아우레우스 상에서의 C3b 침착 및 인자 B 분열
유동 세포 분석 검정에서 다음과 같이 AP-구동된 C3b 침착 (AP-C3b)의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다는 것을 입증하기 위해 처음 실험을 수행하였다. 다음 혈청 5퍼센트를 4℃에서 밤새도록 Mg++/EGTA 버퍼 또는 EDTA에서 테스트 항체와 혼합하였다: 정상 인간 혈청, 인자 B (Factor B)-고갈된 인간 혈청, 인자 D-고갈된 인간 혈청 및 프로퍼딘-고갈된 인간 혈청 (Complement Technology, Tyler, Texas, USA로부터 얻어짐). 열-사멸된 스타필로코쿠스 아우레우스 (108/반응)를 총 부피 100 μL로 각 혼합물에 추가하고 37℃에서 40분 동안 회전시켰다. 박테리아를 세척 버퍼에서 세척하고, 박테리아 펠릿을 세척 버퍼에서 재현탁하고 각 샘플의 80 μL 앨리쿼트를 박테리아 표면 상의 C3b 침착에 대하여 분석하였으며, 이것은 유동 세포 분석법을 사용하여 항-인간 C3c (Dako, UK)로 검출되었다.
C3b의 유동 세포 분석 검출의 결과는 도 28A에서 도시된다. 도 28A, 패널 1, AP를 비활성화시키는 것으로 알려져 있는 EDTA의 존재시 정상 인간 혈청에서 도시된 바와 같이, C3b 침착이 관찰되지 않았다 (음성 대조군). Mg++/EGTA로 처리된 정상 인간 혈청에서, 단지 렉틴-독립적 보체 경로만이 기능할 수 있다. 패널 2에서, Mg++/EGTA 버퍼를 사용하며, 그러므로 AP는 활성이고, AP-구동된 C3b 침착이 관찰되었다 (양성 대조군). 패널 3, 4 및 5에서 도시된 바와 같이, 각각 인자 B-고갈된, 인자 D-고갈된 및 프로퍼딘-고갈된 혈청에서, 예상된 바와 같이, 대체 경로 구동된 C3b 침착이 관찰되지 않았다. 이 결과들은 검정은 AP-의존적 C3b 침착을 검출할 수 있다는 것을 입증한다.
MASP-3이 결핍된 인간 3MC 혈청에서 AP (LEA-1)를 복원할 수 있는 재조합 MASP-3의 능력을 평가하기 위해 상기 기술된 바와 같이 스타필로코쿠스 아우레우스 검정 상의 C3b 침착을 수행하였다 (Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3):197-203 (2011)). 다음 시약 조합을 테스트하였다.
1. 5% 정상 인간 혈청 +EDTA
2. 5% 정상 인간 혈청 +Mg/EGTA
3. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA
4. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 활성 전장 rMASP-3
5. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 절단된 활성 rMASP-3 (CCP1/CCP2/SP)
6. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 비활성 rMASP-3 (S679A)
7. 5% 인간 3MC (MASP-3-/-) 혈청 + Mg++/EGTA 플러스 활성 전장 rMASP-1
상기 나타난 바와 같이 5% 혈청 및 재조합 단백질 (각각 5 μg)의 다양한 혼합물을 명시된 버퍼 조건 (Mg++/EGTA 버퍼 또는 EDTA) 하에 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 밤새도록 인큐베이션한 후, 108 열-살해된 스타필로코쿠스 아우레우스를 각 혼합물에 총 부피 100 μL로 추가하고 37℃에서 40분 동안 회전시켰다. 박테리아를 세척하고 세척 버퍼에서 재현탁하고 각 샘플의 80 μl 앨리쿼트를 FACS에 의해 C3b 침착에 대하여 분석하였다. 각 샘플의 나머지 20 μL 앨리쿼트를 사용하여 하기 기술된 바와 같이 항-인자 B 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 인자 B 분열을 측정하였다.
C3b의 유동 세포 분석 검출의 결과는 도 28B에 도시된다. 패널 번호는 상기 요약된 각각의 시약 조합에 대하여 지정된 번호와 상응한다. 음성 대조군 (패널 1) 및 양성 대조군 (패널 2)은 예상된 바와 같이 C3b 침착의 부재 및 존재를 나타낸다. 패널 3은 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착이 없다는 것을 나타낸다. 패널 4 및 5는 활성 전장 rMASP-3 (패널 4) 및 활성 rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (패널 5) 둘 다가 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착을 회복시킨다는 것을 나타낸다. 패널 6은 비활성 rMASP-3 (S679A)이 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착을 회복시키지 않는다는 것을 나타낸다. 패널 7은 rMASP-1이 3MC 혈청에서 AP-구동된 C3b 침착을 회복시키지 않는다는 것을 나타낸다.
종합해보면, 이 결과들은 MASP-3이 인간 혈청에서 스타필로코쿠스 아우레우스 상에서의 AP-구동된 C3b 침착에 필요하다는 것을 입증한다.
인자 B의 MASP-3-의존적 활성화
인자 B의 MASP-3-의존적 활성화를 분석하기 위해서, 상기 나타난 바와 같은 5% 혈청 (정상 인간 혈청 또는 3MC 환자 혈청) 및 재조합 단백질의 다양한 혼합물을 상기 기술된 바와 같이 분석하였다. 각 반응 혼합물로부터, 20 μL를 제거하여 단백질 샘플 로딩 버퍼에 추가하였다. 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하고 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 인자 B 다클론성 항체 (R&D Systems)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 인자 B의 활성화는 고분자량의 프로-인자 B 단백질로부터 유래된 두 개의 저분자량 분열 생성물 (Bb 및 Ba)의 형성에 의해 분명해졌다.
도 29는 rMASP-3의 존재 또는 부재시 3MC 혈청에서 스타필로코쿠스 아우레우스에 반응하여 인자 B 분열을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다. 레인 1에서 나타난 바와 같이, EDTA의 존재시 정상 인간 혈청 (음성 대조군)은 레인 2에서 나타난 Mg++/EGTA의 존재시 정상 인간 혈청 (양성 대조군)에 비해 인자 B 분열이 거의 없음을 입증한다. 레인 3에서 나타난 바와 같이, 3MC 혈청은 Mg++/EGTA의 존재시 인자 B 분열이 거의 없음을 입증한다. 하지만, 레인 4에서 나타난 바와 같이, 인자 B 분열은 3MC 혈청으로의 전장, 재조합 MASP-3 단백질 (5 μg)의 추가 및 사전-인큐베이션에 의해 회복된다.
인자 B/C3(H2O) 분열에서 프로-인자 D에 대한 rMASP-3의 효과를 결정하기 위한 검정
인자 B의 MASP-3-의존적 활성화/분열에 대한 최소한의 요건을 결정하기 위해 다음 검정을 수행하였다.
C3(H2O) (200ng), 정제된 플라즘 인자 B (20 μg), 재조합 프로-인자 D (200 ng) 및 재조합 인간 MASP-3 (200 ng)을 다양한 조합 (도 30에서 도시된 바와 같이)으로 BBS/Ca++/Mg++ 중의 100 μL의 총 부피로 함께 혼합하고 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 5% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 SDS 로딩 염료 25 uL를 추가하여 반응을 중단시켰다. 95℃에서 교반하면서 (300 rpm) 10분 동안 끓인 후, 혼합물을 1400 rpm으로 5분 동안 스핀 다운하고 상층액 20 uL를 로딩하고 10% SDS 겔 상에서 분리하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다.
결과 :
도 30은 인자 B 분열이 분석되는 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 레인 1에서 나타난 바와 같이, 인자 B 분열은 C3, MASP-3 및 프로-인자 D의 존재시 최적이다. 레인 2에서 나타난 바와 같이, C3이 명백하게 필요하다; 하지만, 레인 4 및 5에서 나타난 바와 같이, MASP-3 또는 프로-인자 D는 C3이 존재하는 한, 인자 B 분열을 매개할 수 있다.
MASP-3-의존적 AP-구동된 C3b 침착을 억제할 수 있는 MASP-3 mAb의 능력의 분석
이 실시예에서 기술된 바와 같이 MASP-3이 인간 혈청에서 스타필로코쿠스 아우레우스 상의 AP-구동된 C3b 침착에 필요하다는 것이 입증되었다. 그러므로, 실시예 7에서 기술된 바와 같이 확인된 대표적인 MASP-3 mAb가 MASP-3의 활성을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해 다음 검정을 수행하였다. 활성 재조합 MASP-3 (CCP1-CCP2-SP) 단편 단백질 (250 ng)을 얼음 위에서 1시간 동안 세 가지 상이한 농도 (0.5, 2 및 4 μM)의 아이소타입 대조군 mAb, mAb1A5 (MASP-3 또는 MASP-1에 결합하지 않는 DTLacO 플랫폼으로부터 얻어진 대조군), 또는 mAbD14 (MASP-3에 결합함)와 함께 사전-인큐베이션하였다. 효소-mAb 혼합물을 50 μL의 최종 반응 부피로 5% 3MC 혈청 (MASP-3 결핍) 및 5x107 열-살해된 스타필로코쿠스 아우레우스에 노출시켰다. 반응물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 C3b 침착의 검출을 위해 염색하였다. 염색된 박테리아 세포를 유동 세포 분석기로 분석하였다.
도 31은 rMASP-3의 존재와 함께 3MC 혈청에서 mAb 농도의 함수로서 플롯팅된 세 개의 항체로부터 얻어진 C3b 염색의 평균 형광 강도 (MFI)를 그래프로 나타낸다. 도 31에서 도시된 바와 같이, mAbD14는 농도-의존적 방식으로 C3b 침착의 억제를 입증한다. 그에 반해, 대조군 mAb 둘 다는 C3b 침착을 억제하지 않았다. 이 결과들은 mAbD14가 MASP-3-의존적 C3b 침착을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. DTLacO 시스템에서 연결된 인자를 사용하는 MASP-3 결합에 대한 이 항체의 지속적인 친화도 성숙화 이후에 mAbD14에 대한 향상된 억제 활성이 예상된다.
결과의 요약 :
요약하면, 이 실시예의 결과는 MASP-3이 결핍된 혈청에서 AP의 분명한 결함을 입증한다. 따라서, MASP-3은 기능적 종점으로서 인자 B 활성화 및 C3b 침착을 사용하여 AP에 결정적으로 기여한다는 것이 입증되었다. 게다가, MASP-3의 촉매 작용-활성 C-말단 부분을 포함하는 기능적 재조합 MASP-3의 추가는 3MC 환자의 혈청에서 인자 B 활성화 및 C3b 침착의 결함을 바로잡는다. 반대로, 이 실시예에서 추가로 입증된 바와 같이, rMASP-3이 들어있는 3MC 혈청에서 MASP-3 항체 (예를 들어, mAbD14)의 추가는 AP-구동된 C3b 침착을 억제한다. 인자 B 활성화에서 MASP-3, 및 그러므로 AP의 직접적인 역할은 재조합 MASP-3이 C3과 함께 재조합 인자 B를 활성화시키기에 충분하다는 관찰에 의해 입증된다.
실시예 9
이 실시예는 MASP-1 및 MASP-3이 인자 D를 활성화시킨다는 것을 입증한다.
방법 :
재조합 MASP-1 및 MASP-3을 새로운 상이한 재조합 버젼의 프로-인자 D를 분할시키는 능력에 대하여 테스트하였다. 제1 버젼 (프로-인자 D-His)은 N-말단 태그가 없지만, C-말단 His 태그를 갖는다. 따라서, 이 버젼의 프로-인자 D는 활성화 동안에 분열에 의해 제거되는 5개의 아미노산 프로펩타이드를 함유한다. 제2 버젼 (ST-프로-인자 D-His)은 N-말단에 Strep-TagII 서열을 가지며, 따라서 분열된 N-말단 단편을 15개의 아미노산으로 증가시킨다. ST-프로-인자 D는 또한 C-말단에 His6 태그를 함유한다. ST-프로-인자 D-His의 프로펩타이드의 증가된 길이는 프로-인자 D-HIS 형태로 가능한 분리와 비교하여 분열된 형태와 SDS-PAGE에 의해 분열되지 않은 형태 간의 분리를 향상시킨다.
재조합 MASP-1 또는 MASP-3 단백질 (2 μg)을 프로-인자 D-His 또는 ST-프로-인자 D-His 기질 (100 ng)에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 12% Bis-Tris 겔 상에서 전기영동하여 프로-인자 D 및 활성 인자 D 분열 생성물을 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮기고 비오티닐화된 인자 D 항체 (R&D Systems)로의 검출에 의한 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
결과 :
도 32는 프로-인자 D 기질 분열의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 32에서 도시된 웨스턴 블롯에 대한 레인 설명
실험 조건 레인 1 레인 2 레인 3 레인 4 레인 5
프로-인자 D + + + + +
rMASP-3 (전장) - + _ _ _
rMASP-3a (S679A) - - + - -
rMASP-1A (S646A) - - - + -
rMASP-1 (CCP-1-CCP2-SP) - - - - +
도 32에서 도시된 바와 같이, 전장 MASP-3 (레인 2) 및 MASP-1 CCP1-CCP2-SP) 단편 (레인 5)만이 ST-프로-인자 D-His6을 분열시켰다. 촉매 작용-비활성 전장 MASP-3 (S679A; 레인 3) 및 MASP-1 (S646A; 레인 3)은 기질을 분열시키지 못 했다. 프로-인자 D-His6 폴리펩타이드로 동일한 결과를 얻었다 (미도시). MASP-3에 관하여 MASP-1 (CCP1-CCP2-SP)의 몰 초과 부분의 비교는 MASP-3이 적어도 본원에서 기술된 조건 하에서 MASP-1보다 프로-인자 D 분열의 더 효과적인 촉매임을 시사한다. 결론 : MASP-1 및 MASP-3 둘 다는 인자 D를 분열시키고 활성화시킬 수 있다. 이 활성은 LEA-1을 AP의 활성화와 직접적으로 관련이 있다. 더 구체적으로는, MASP-1 또는 MASP-3에 의한 인자 D의 활성화는 인자 B 활성화, C3b 침착, 및 아마도 옵소닌화 및/또는 용해로 이어질 것이다.
MASP-3 항체로의 프로-인자 D의 MASP-3-의존적 분열의 억제에 대한 검정
다음과 같이 MASP-3-의존적 인자 D 분열에 대한 실시예 7에서 기술된 바와 같이 확인된 대표적인 MASP-3 및 MASP-1 mAb의 억제 효과를 결정하기 위한 검정을 수행하였다. 활성 재조합 MASP-3 단백질 (80 ng)을 대표적인 mAb D14, M3M1 및 대조군 항체 (MASP-1에 특이적으로 결합하지만, MASP-3에 결합하지 않음) 1 μg과 실온에서 15분 동안 사전-인큐베이션하였다. N-말단 Strep-태그 (ST-프로-인자 D-His, 70 ng)를 가지고 있는 프로-인자 D를 추가하고 혼합물을 37℃에서 75분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 반응물을 상기 기술된 바와 같이 전기영동하고, 블롯팅하고 항-인자 D로 염색하였다.
도 33은 MASP-3 및 ST-프로-인자 D-His만을 함유하는 대조군 반응 (mAb 없음; 레인 1), 뿐만 아니라 MASP-1에 결합하지만, MASP-3에 결합하지 않는 DTLacO 라이브러리로부터 얻어진 mAb를 함유하는 대조군 반응 (레인 4)과 비교하여 mAb D14 및 M3M1의 부분적 억제 활성을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 도 33에 도시된 바와 같이, 억제 항체의 부재시, MASP-3은 프로-인자 D의 대략 50%를 인자 D로 분열시킨다 (레인 1). 대조군 MASP-1 특이적 항체 (레인 4)는 인자 D에 대한 프로-인자 D의 비율을 변화시키지 않는다. 그에 반해, 레인 2 및 3에서 나타난 바와 같이, mAb D14 및 mAb M3M1 둘 다는 인자 D로의 프로-인자 D의 MASP-3-의존적 분열을 억제하여, 생성된 인자 D의 감소를 초래한다.
결론 : 이 결과들은 MASP-3 mAb D14 및 M3M1이 MASP-3-의존적 인자 D 분열을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. DTLacO 시스템에서 연결된 인자를 사용하여 MASP-3 결합에 대한 이 항체들의 지속적인 친화도 성숙화 이후에 mAbD14 및 mAb M3M1에 대한 향상된 억제 활성이 예상된다.
실시예 10
이 실시예는 입증한다. MASP-3 결핍 prevents 보체-매개된 용해 of 만난-코팅된 WT 토끼 적혈구.
배경/근거 :
본원에서 실시예 5 및 6에서 기술된 바와 같이, PNH의 마우스 모델로부터 얻어진 혈액 샘플로부터 적혈구 세포의 용해에 대한 MASP-2- 및 MASP-3-결핍 혈청의 효과는 PNH로 고통받고 있는 대상체를 치료하기 위한 MASP-2 억제 및/또는 MASP-3 억제의 효능을 입증하였고, 또한 에쿨리쥬맙과 같은 C5 억제자로의 요법을 받고 있는 PNH 대상체에서 C3 단편-매개된 혈관외 용혈의 효과를 개선하기 위한 MASP-2의 억제자 및/또는 MASP-3의 억제자 (이중 또는 이중-특이적 MASP-2/MASP-3 억제자)의 사용을 지지하였다.
이 실시예에서 기술된 바와 같이, 추가적인 3MC 환자의 MASP-3 결핍 혈청에서 C3b 침착 실험 및 용혈 실험을 수행하하여, 실시예 5 및 6에서 얻어진 결과를 확인하였다. 이에 더하여, 3MC 혈청으로 rMASP-3의 추가가 C3b 침착 및 용혈 활성을 복원할 수 있다는 것을 입증하는 실험을 수행하였다.
방법 :
MASP-3-결핍 혈청을 다음과 같이 세 명의 상이한 3MC 환자로부터 얻었다:
3MC Patient 1: MASP-3 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 기능 장애로 만드는 돌연변이를 함유하는 대립 유전자를 함유하고, 3MC 환자의 부모 (둘 다 MASP-3 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 기능 장애로 만드는 돌연변이를 함유하는 대립 유전자에 대하여 이형 접합성)와 함께 공급됨.
3MC Patient 2: MASP-3의 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손인 MASP-1의 엑손 12에서 C1489T (H497Y) 돌연변이를 가지며, 비기능적 MASP-3, 및 기능적 MASP-1 단백질을 생성함.
3MC Patient 3: MASP-1 유전자의 결함이 확인되며, 비기능적 MASP-3, 및 비기능적 MASP-1 단백질을 생성함.
실험 #1 : C3b 침착 검정
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981))에서 기술된 바와 같이 전통적인 AP-특이적 조건 (BBS/Mg++/EGTA, Ca++ 없음, 여기서 BBS= 수크로오스를 함유하는 바비탈 완충된 식염수) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 0.5 내지 25%의 범위의 혈청 농도에서 AP 검정을 수행하였고 시간이 흐름에 따른 C3b 침착을 측정하였다.
결과 :
도 34는 MASP-3-결핍 (3MC), C4-결핍 및 MBL-결핍 대상체로부터 얻어진 혈청 샘플 중의 혈청 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 34에서 도시되고, 하기 표 15에서 요약된 바와 같이, Patient 2 및 Patient 3의 MASP-3-결핍 환자 혈청은 높은 농도 (25%, 12.5%, 6.25% 혈청 농도)에서 잔류 AP 활성을 갖지만, 훨씬 더 높은 AP50 (즉, 최대 C3 침착의 50%를 달성하는데 필요한 8.2% 및 12.3%의 혈청)를 갖는다.
도 35A는 MASP-3 결핍, C4-결핍 및 MBL-결핍 인간 대상체로부터 얻어진 10% 인간 혈청 샘플에서 시간의 함수로서 "전통적인" AP-특이적 조건 (즉, Ca++ 없는 BBS/EGTA/Mg++) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다.
하기 표 15는 도 34에서 도시된 AP50 결과 및 도 35A에서 도시된 C3b 침착에 대한 절반 시간을 요약한다.
도 34 및 35A에서 도시된 결과의 요약
혈청 유형 AP 50 (%) T 1/2 (min)
정상 4.5 26.3
MBL-결핍 (MBL-/-) 5.7 27.5
C4-결핍 (C4-/-) 5.1 28.6
3MC (Patient 3) 8.2 58.2
3MC (Patient 2) 12.3 72.4
주: BBS/Mg++/EGTA 버퍼에서, 주: BBS/Mg++/EGTA 버퍼에서, 렉틴 경로-매개된 효과는 이 버퍼 내 Ca++의 부재로 인해 결핍된다. 실험 #2: 웨스턴 블롯에 의한 3MC 환자 혈청에서 프로-인자 D 분열의 분석
방법 : 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+)) 및 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))로부터 혈청을 얻었다. 정상 공여체 (W)의 혈청과 함께, 환자 혈청을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 의해 분리하고 분리된 단백질을 폴리비닐리딘 플루오라이드 막에 블롯팅하였다. 인간 프로-인자 D (25,040 Da) 및/또는 성숙한 인자 D (24,405 Da)를 인간 인자 D-특이적 항체로 검출하였다.
결과 : 웨스턴 블롯의 결과는 도 35B에서 도시된다. 도 35B에서 도시된 바와 같이, 정상 공여체의 혈청 (W)에서, 인자 D 항체는 성숙한 인자 D (24,405 Da)와 크기가 일치하는 단백질을 검출하였다. 도 35B에서 추가로 도시된 바와 같이, 인자 D 항체는 3MC 환자 #2 (P2) 및 3MC 환자 #3 (P3)의 혈청에서 약간 더 큰 단백질을 검출하였으며, 이 3MC 환자들에서 프로-인자 D (25,040 Da)의 존재와 일치한다.
실험 #3: 3MC 환자 혈청을 이용한 Wieslab 보체 검정
방법 : 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+)) 및 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))로부터 얻어진 혈청을 또한 제조사의 지시에 따라 Wieslab Complement System Screen (Euro-Diagnostica, Malmo, Sweden)을 사용하여 고전적, 렉틴 및 대체 경로 활성에 대하여 테스트하였다. 정상 인간 혈청을 대조군으로서 동시에 테스트하였다.
결과 : 도 35C는 3MC 환자 #2, 3MC 환자 #3로부터 얻어진 혈장, 및 정상 인간 혈청을 이용한 Weislab 고전적 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로 검정의 결과를 그래프로 나타낸다. 도 35C에서 도시된 바와 같이, Wieslab 검정의 조건 하에서, 고전적 경로, 대체 경로, 및 MBL (렉틴) 경로는 정상 인간 혈청에서 모두 기능적이다. 3MC 환자 #2 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (+/+))의 혈청에서, 고전적 경로 및 렉틴 경로는 기능적이지만, 대체 경로 활성은 검출되지 않는다. 3MC 환자 #3 (MASP-3 (-/-), MASP-1 (-/-))의 혈청에서, 고전적 경로는 기능적이지만, 렉틴 경로 활성 및 대체 경로 활성은 검출되지 않는다.
도 35B 및 35C의 결과는 LEA-1 및 LEA-2 경로에서 MASP-1 및 MASP-3의 역할에 대한 발명자들의 해석을 더 지지한다. 구체적으로, 단지 MASP-3이 없는 Patient 2의 혈청에서 거의 완전히 기능적인 렉틴 경로를 가진 대체 경로의 부재는 MASP-3이 대체 경로의 활성화에 필수적임을 확인한다. MASP-1 및 MASP-3 둘 다가 없는 Patient 3의 혈청은 렉틴 경로, 뿐만 아니라 대체 경로를 활성화시킬 수 있는 능력을 상실하였다. 이 결과는 기능적 LEA-2 경로에 대한 MASP-1의 요건을 확인하고, 실시예 7 및 MASP-1이 MASP-2를 활성화시킨다는 것을 입증하는 문헌과 일치한다. 두 혈청이 명백하게 프로-인자 D를 활성화시킬 수 없다는 것은 MASP-3이 프로-인자 D를 분열시킨다는 것을 입증하는 실시예 9에서 기술된 데이터와 일치한다. 이 관찰들은 도 1에서 도식된 LEA-1 및 LEA-2 경로와 일치한다.
실험 #4: 인간 정상 또는 3MC 혈청의 존재시 (Ca ++ 의 부재시) 용해에 대하여 만난-코팅된 토끼 적혈구를 테스트하는 용혈 검정
방법 :
Ca ++ 의 부재시 토끼 RBC의 제조 (즉, EGTA를 사용하여)
토끼 전혈 (2 mL)을 두 개의 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 분할하고 4℃의 냉동 에펜도르프 원심분리기에서 8000 rpm (대략 5.9 rcf)으로 3분 동안 원심분리하였다. 매우 차가운 BBS/Mg++/Ca++ (4.4 mM 바비투르산, 1.8 mM 나트륨 바비톤, 145 mM NaCl, pH 7.4, 5 mM Mg++, 5 mM Ca++)에 재현탁한 후 RBC 펠릿을 3회 세척하였다. 3차 세척 후, 펠릿을 4 mL BBS/Mg++/Ca++에 재현탁하였다. 적혈구를 펠릿화하고 RBC를 상기 기술된 바와 같이 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++로 세척하였다. RBC 현탁액을 4℃에서 BBS/0.1% 젤라틴/Mg++/Ca++에 저장하였다. 이어서, 현탁된 RBC 100 μL를 1.4 mL 물로 희석하고 8000 rpm (대략 5.9 rcf)으로 3분 동안 스핀 다운하고 상층액의 OD를 541nm (541nm에서 0.7의 OD는 대략 109 적혈구/ml에 상응한다)에서 0.7로 조정하였다. 그 후, 108 적혈구/ml의 농도를 달성하기 위해 OD 0.7로 재현탁된 RBC 1 mL를 BBS/Mg++/EGTA 9 ml에 추가하였다. 테스트 혈청 또는 혈장의 희석액을 매우 차가운 BBS, Mg++, EGTA에서 제조하였고 각 혈청 또는 혈장 희석액 100 μL를 피펫을 이용하여 둥근 바닥 플레이트의 상응하는 웰로 옮긴다. 적절하게 희석된 RBC (108 적혈구/ml) 100 μL를 각 웰에 추가하였다. 나노물(nano-water)을 사용하여 양성 대조군 (100% 용해)을 생성하는 한편, 혈청 또는 혈장이 없는 BBS/Mg++/EGTA로의 희석액을 음성 대조군으로 사용하였다. 이어서 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 둥근 바닥 플레이트를 3750 rpm으로 5분 동안 스핀 다운하였다. 이어서, 각 웰의 상층액 100 μL를 평평한 바닥 플레이트의 상응하는 웰로 옮기고 415-490 nm에서 OD를 판독하였다.
결과 :
도 36은 정상 대상체 및 두 명의 3MC 환자 (Patient 2 및 Patient 3)의 혈청에서 다양한 혈청 농도에 걸쳐 Ca++의 부재시 측정된 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 토끼 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다. 도 36에서 도시된 바와 같이, MASP-3 결핍이 정상 인간 혈청과 비교하여 만난-코팅된 적혈구의 보체-매개된 용해의 퍼센트를 감소시킨다는 것을 입증하였다. 정상 인간 혈청의 두 개의 곡선 및 3MC 환자의 두 개의 곡선 간의 차이는 유의하다 (p=0.013, Friedman 테스트).
하기 표 16 은 도 36에서 도시된 AP50 결과를 요약한다.
도 36에서 도시된 결과의 요약
혈청 유형 AP 50 (%)
정상 인간 혈청 #1 7.1
정상 인간 혈청 #2 8.6
3MC Patient #2 11.9
3MC Patient #3 14.3
표 16에서 나타난 혈청 샘플이 풀링될 때(pooled), 정상 인간 혈청에 대한 AP50 값 = 7.9이고 3MC 혈청에 대한 AP50 값 = 12.8이다 (p=0.031, 윌콕슨 일치-쌍 부호 순위 테스트). 실험 #5: 재조합 MASP-3에 의한 인간 3MC 혈청 의 복원은 치모산 코팅된 플레이트 상에서 AP-구동된 C3b 침착을 회복한다.
방법 :
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981))에 기술된 바와 같이, 전통적인 AP-특이적 조건 (BBS/Mg++/EGTA, Ca++ 없음, 여기서 BBS=수크로오스를 함유하는 바비탈 완충된 식염수) 하에 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서 다음 혈청 샘플로 AP 검정을 수행하였다: (1) 0 내지 20 μg/mL의 범위로 추가된 전장 활성 rMASP-3을 가진 3MC Patient #2의 5% 인간 혈청; (2) 0 내지 20 μg/mL의 범위로 추가된 전장 활성 rMASP-3을 가진 3MC Patient #2의 10% 인간 혈청; 및 (3) 0 내지 20 μg/mL의 범위로 추가된 비활성 rMASP-3A (S679A)를 가진 3MC Patient #2의 5% 인간 혈청.
결과 :
도 37은 인간 3MC Patient #2 (MASP-3-결핍)로부터 얻어진 혈청 샘플에 추가된 rMASP-3 단백질의 농도의 함수로서 치모산-코팅된 미세역가 플레이트 상에서의 AP-구동된 C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 37에서 도시된 바와 같이, 활성 재조합 MASP-3 단백질은 치모산-코팅된 플레이트에서 농도-의존적 방식으로 AP-구동된 C3b 침착을 복원한다. 도 37에서 추가로 도시된 바와 같이, 비활성 rMASP-3 (S679A)을 함유하는 3MC 혈청에서 C3b 침착이 관찰되지 않았다.
실험 #6: 재조합 MASP-3에 의한 인간 3MC 혈청의 복원은 3MC 환자 혈청에서 용혈 활성을 회복한다
방법 :
0 내지 12% 혈청의 범위의 다음 테스트 혈청으로 상기 실험 #2에서 기술된 방법을 사용하여 토끼 RBC를 사용하여 용혈 검정을 수행하였다: (1) 정상 인간 혈청; (2) 3MC 환자 혈청; (3) 3MC 환자 혈청 플러스 활성 전장 rMASP-3 (20 μg/ml); 및 (4) 열-비활성화된 인간 혈청.
결과 :
도 38은 (1) 정상 인간 혈청; (2) 3MC 환자 혈청; (3) 3MC 환자 혈청 플러스 활성 전장 rMASP-3 (20 μg/ml); 및 (4) 열-비활성화된 인간 혈청에서 혈청 농도의 범위에 걸쳐 Ca++의 부재시 측정된 만난-코팅된 토끼 적혈구의 퍼센트 용혈 (광도 측정에 의해 측정된 상층액으로의 용해된 토끼 적혈구의 헤모글로빈 방출로 측정됨)을 그래프로 나타낸다. 도 38에서 도시된 바와 같이, 토끼 RBC의 퍼센트 용해는 rMASP-3이 없는 3MC 혈청에서의 퍼센트 용해와 비교하여 rMASP-3을 포함하는 3MC 혈청에서 크게 증가한다 (p=0.0006).
도 39는 BBS/Mg++/EGTA 중의 0 내지 110 μg/ml의 농도 범위에서 활성 rMASP-3을 함유하는 3MC Patient 2 및 3MC Patient 3의 7% 인간 혈청에서 토끼 적혈구 용해의 퍼센트를 그래프로 나타낸다. 도 39에서 도시된 바와 같이, 토끼 RBC 용해의 퍼센트는 100% 활성까지 농도-의존적 방식으로 rMASP-3의 양으로 회복된다.
실험 #7 : MASP-3 결핍 (3MC) 환자의 혈청은 MBL이 존재하는 경우 기능적 MASP-2를 갖는다
방법 :
3MC 혈청에 LEA-2가 결핍되었는지를 검사하기 위해 만난-코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 C3b 침착 검정을 수행하였다. 시트레이트 혈장을 BBS 버퍼에서 단계 희석하였고 (1:80에서 시작하여, 1:160, 1: 320, 1:640, 1:1280, 1:2560) 만난-코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 침착된 C3b를 닭 항-인간 C3b 검정을 사용하여 검출하였다. 만난-코팅된 ELISA 플레이트 상에 LEA-2 구동된 C3b 침착 (혈장 희석액은 AP 및 LEA-1이 작동하기에는 너무 높다)을 정상 인간 대상체 (NHS), 두 명의 3MC 환자 (Patient 2 및 Patient 3), Patient 3의 부모 및 MBL-결핍 대상체의 혈청에서 인간 혈청 농도의 함수로서 평가하였다.
결과 :
도 40은 정상 인간 대상체 (NHS), 두 명의 3MC 환자 (Patient 2 및 Patient 3), Patient 3의 부모 및 MBL-결핍 대상체의 혈청에 대하여 BBS 버퍼에 희석된 인간 혈청의 농도의 함수로서 만난-코팅된 ELISA 플레이트 상의 LEA-2-구동된 (즉, MASP-2-구동된) C3b 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 이 데이터들은 Patient 2에 MBL이 충분하다는 것을 나타낸다. 하지만, Patient 3 및 Patient 3의 모(mother)는 MBL 결핍이고, 그러므로 그들의 혈청은 LEA-2를 통해 만난 상에서 C3b를 침착시키지 않는다. 이 혈청들에서 MBL의 대체는 Patient 3 (MASP-3 결핍으로 이어지는 SNP에 대하여 동형 접합성) 및 그의 모 (돌연변이 MASP-3 대립 유전자에 대하여 이형 접합성)의 혈청에서 LEA-2 매개된 C3b 침착을 회복시킨다 (데이터 미도시). 이 결과는 3MC 혈청에서 LEA-2가 결핍된 것이 아니라, 오히려 기능적 MASP-2를 갖는 것으로 보인다는 것을 입증한다.
전체적인 요약 및 결론 :
이 결과들은 인간 혈청에서 MASP-3 결핍이 AP 활성의 손실을 일으키며, 치모산-코팅된 웰 상에서 감소된 C3b 침착 및 감소된 토끼 적혈구 용해에서 나타난 바와 같다는 것을 입증한다. 두 검정에서 AP는 혈청에 기능적, 재조합 인간 MASP-3을 보충함으로써 회복될 수 있다.
실시예 11
이 실시예는 키메라 마우스 V 영역/인간 IgG4 불변 영역 항-인간 MASP-3 단클론성 항체 (mAb M3-1, mAb 13B1로도 불림)가 MASP-3-매개된 대체 경로 보체 (APC) 활성화의 강력한 억제자임을 입증한다.
방법:
키메라 마우스 V 영역/인간 IgG 불변 영역 항-인간 MASP-3 단클론성 항체 (mAb M3-1)의 생성
인간 MASP-3 CCP1-CCP2-SP 도메인 (서열 번호:2의 aa 301-728)으로 MASP-1/3 넉아웃 마우스를 면역화함으로써 쥐 항-인간 MASP-3 억제 항체 (mAb M3-1)를 생성하였다 (실시예 14 참조). 간략히 기술된 바와 같이, 면역화된 마우스의 비장세포를 P3/NS1/1-Ag4-1과 융합시키고 결과로 생성된 하이브리도마 클론의 상층액을 인간 MASP-3에 결합하는 항체의 생산 및 인자 D (CFD)로의 보체 프로-인자 D (pro-CFD)의 MASP-3-매개된 분열을 차단하는 능력에 대하여 스크리닝하였다. 단클론성 항체 (mAb) 가변 영역을 RT-PCR로 단리시키고, 시퀀싱하고 인간 IgG4 발현 벡터로 클로닝하였다. 키메라 단클론성 항체를 일과성으로 트랜스펙션된 HEK293T 세포에서 발현시키고, 정제하고, 마우스 및 인간 MASP-3에 대한 결합 친화도 및 CFD로의 프로-CFD의 MASP-3-매개된 분열을 억제할 수 있는 능력에 대하여 테스트하였다.
MASP-3 억제 단클론성 항체 M3-1 (13B1)은 서열 번호:30으로 제시된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호:45로 제시된 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. M3-1 단클론성 항체의 가변 영역의 서열은 하기 제공된다:
중쇄 가변 영역
mAb M3-1에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열이 하기 제공된다. 카바트 CDR (31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)은 밑줄 그어져 있으며, 서열 번호:30의 아미노산 잔기 31-35 (H1), 50-66 (H2) 및 99-102 (H3)에 상응한다.
mAb M3-1 중쇄 가변 영역 (VH) (서열 번호:30)
Figure pat00013
경쇄 가변 영역
mAb M3-1에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열이 하기 제공된다. 카바트 CDR (24-34 (H1), 50-56 (H2) 및 89-97 (H3)은 밑줄 그어져 있으며, 서열 번호:45의 아미노산 잔기 24-40 (L1); 56-62 (L2) 및 95-102 (L3)에 상응한다. 이 영역들은 카바트 또는 쵸티아 시스템에 의해 넘버링되는지에 관계없이 동일하다.
mAb M3-1 경쇄 가변 영역 (VL) (서열 번호:45)
Figure pat00014
mAb M3-1 VH CDR
VHCDR1: GKWIE (서열 번호:84)
VHCDR2: EILPGTGSTNYNEKFKG (서열 번호:86)
VHCDR3: SEDV (서열 번호:88)
mAb M3-1 VL CDR
VLCDR1: KSSQSLLNSRTRKNYLA (서열 번호:142)
VLCDR2: WASTRES (서열 번호:144)
VLCDR3: KQSYNIPT (서열 번호:161)
상기 나타난 바와 같이, MASP-3 단클론성 항체 M3-1은 (a) (i) 서열 번호:84를 포함하는 VHCDR1, (ii) VHCDR2 comprising 서열 번호:86 및 (iii) 서열 번호:88을 포함하는 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) (i) 서열 번호:142를 포함하는 VLCDR1, (ii) 서열 번호:144를 포함하는 VLCDR2 및 (iii) 서열 번호:161을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
인간 및 마우스 MASP-3의 재조합 형태로의 mAb M3-1의 결합
1가 Fab 버젼의 M3-1을 ELISA 실험에서 재조합, 전장 인간 및 마우스 MASP-3 단백질로의 결합에 대하여 테스트하였다. 다종의 단백질에 결합하는 항-MASP-3 캡쳐 항체로 96-웰 플레이트를 코팅함으로써 결합 친화도를 결정하였다. 캡쳐 항체는 MASP-1 및 MASP-3의 CCP1-CCP2 영역에 결합하는 것으로 나타났다. 인간 및 마우스 단백질의 전장 버전을 캡쳐 항체로 코팅된 ELISA 플레이트에 고정하였고, 다양한 농도의 M3-1 Fab를 별도의 웰에서 표적 단백질에 결합시켰다. 결합된 M3-1을 HRP (Novus Biologicals NBP1-75064)에 컨쥬게이션된 항-카파 경쇄 항체를 사용하여 검출하고, TMB 기질 시약 세트 (BD Biosciences 555214)로 가시화하였다.
도 41은 M3-1 Fab (13B1로도 불림)가 인간 단백질에 대하여 약 0.117 nM의 겉보기 결합 친화도 (EC50)를 나타내는 인간 MASP-3으로 수행된 결합 실험의 대표적인 예를 그래프로 나타낸다.
도 42는 M3-1 Fab가 마우스 단백질에 대하여 약 0.214 nM의 겉보기 결합 친화도 (EC50)를 나타내는 마우스 MASP-3으로 수행된 결합 실험의 대표적인 예를 그래프로 나타낸다.
이 결과들은 mAb M3-1 (13B1)이 인간 및 마우스 MASP-3 둘 다에 대하여 높은 결합 친화도를 갖는다는 것을 입증한다.
mAb M3-1이 대체 경로 보체 (APC) 활성화를 억제할 수 있다는 것의 입증 및 mAb M3-1의 시험관 내 효능의 측정
본 명세서에서 기술된 바와 같이, MASP-3이 적어도 부분적으로는 중심 APC 효소인 CFD의 활성화에 대한 요건으로 인해 APC의 핵심 조절자임이 입증되었다. 또한, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, MASP-3은 체내에서 비교적 낮은 농도로 순환하고 느린 이화작용 속도를 가져서, MASP-3 항체 투여의 정맥내, 피하 및 경구 루트를 통해 전염증성 경로의 지속성 억제를 허용한다. 인간 혈청에서 MASP-3-매개된 CFD 성숙화 및 APC의 억제를 억제하는 mAb M3-1의 효능을 결정하기 위해 다음 실험을 수행하였다. 정상 인간 혈청은 대부분 활성 또는 가공된 (즉, 성숙한) CFD를 함유하며, 따라서 발명자들은 CFD-고갈된 인간 혈청 (Complement Technology A336)이 재조합, 미가공 형태의 CFD (pro-CFD)로 복원되는 실험을 수행하였다. 그러므로, 이 실험 시스템에서, APC 활성화는 활성 CFD로의 프로-CFD의 가공을 필요로 한다.
APC를 보체 침착을 위한 활성화 표면으로 기능하는 치모산 입자의 추가에 의해 유도하였다. 재조합 프로-CFD 및 치모산의 추가 전에 다양한 농도의 mAb M3-1을 혈청에 추가하였다. 혼합물을 37℃에서 75분 동안 인큐베이션하고, APC 활성을 치모산 입자의 표면 상에서 보체 인자 Bb (Quidel A252)의 유동 세포 분석 검출에 의해 측정하였다.
도 43은 CFD-고갈된 인간 혈청에서 다양한 농도의 mAb M3-1의 존재시 치모산 입자 상의 보체 인자 Bb 침착 수준 (MFI 유닛으로 측정된 유동 세포 분석 검출로 결정됨)을 그래프로 나타낸다. 도 43에서 도시된 바와 같이, mAb M3-1은 10% 인간 혈청에서 APC의 강력한 억제를 나타내며, 이 실험 예에서 0.311 nM의 IC50을 갖는다.
이 결과들은 MASP-3이 인간 혈청의 시험관 내 모델에서 APC 활성화에 있어서 핵심 역할을 한다는 것을 입증하고, mAb M3-1이 APC의 강력한 억제자임을 더 입증한다.
생체 내에서 mAb M3-1에 의한 APC의 억제:
생체 내에서 APC를 억제하는 mAb M3-1의 효능을 결정하기 위해서, 마우스의 군 (n = 4)은 10 mg/kg mAb M3-1의 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사를 받았다. 동물들로부터 수거된 혈액을 사용하여 혈청을 제조하여, 치모산 입자 상에서의 C3 (또한 C3b 및 iC3b) 침착의 수준을 측정하는 생체 외 검정에서 APC 활성의 유동 세포 분석법 평가를 위한 매트릭스를 제공한다. 투여 전 시점 및 다수의 투여 후 시점 (96 hrs, 1주, 및 2주)에 수확된 혈액으로부터 제조된 혈청을 7.5%로 희석하였고 APC를 유도하기 위해 치모산 입자를 추가하였다. 항체-처리된 마우스를 단일 정맥내 용량의 비히클이 제공된 대조군 마우스의 군 (n = 4)과 비교하였다.
도 44는 야생형 마우스에서 mAb M3-1 (10 mg/kg i.v.)의 단일 투여 후 다양한 시점에서 치모산 입자 상에서의 C3 침착 수준을 그래프로 나타낸다. 도 44에서 도시된 바와 같이, 투여 전 시점에서 두 가지 조건은 비슷한 수준의 APC 활성을 나타낸다. 96시간 및 그 이후 두 개의 시점에서, mAb M3-1 처리된 군은 근본적으로 완전한 APC 억제를 나타내는 한편, 비히클-처리된 군의 APC 활성은 줄어들지 않았다. 도 44에서 도시된 바와 같이, 마우스에게 정맥내로 투여된 mAb M3-1의 단일 용량은 적어도 14일 동안 전신 APC 활성의 거의 완전한 제거를 유도한다.
이 결과들은 mAb M3-1이 마우스 모델에서 생체 내에서 APC의 강력한 억제자임을 입증한다.
실시예 12
이 실시예는 키메라 마우스 V 영역/인간 IgG4 불변 영역 항-인간 MASP-3 단클론성 항체 (mAb M3-1, mAb 13B1로도 불림)가 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)과 관련된 마우스 모델에서 Crry가 없는 적혈구 세포의 생존에 분명한 이점을 제공한다는 것을 입증한다.
방법:
실시예 11 및 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 키메라 마우스 V 영역/인간 IgG4 불변 영역 항-인간 MASP-3 단클론성 항체 (mAb M3-1)를 생성하였다. 실시예 11에서 더 기술된 바와 같이, mAb M3-1이 마우스 모델에서 생체 내에서 APC의 강력한 억제자인 것이 결정되었다. 이 실시예는 PNHD와 관련된 쥐 모델에서 효능에 대한 mAb M3-1의 분석을 기술한다.
PNH와 관련된 쥐 모델에서 효능에 대한 mAb M3-1의 분석
PNH와 관련된 마우스 모델에서, 공여체 세포로서 사용을 위해 마우스에서 APC의 주요 세포 표면 억제자가 없는 Crry-결핍 마우스의 적혈구 세포 (RBC)를 얻었다. 야생형 (WT) 공여체 마우스로부터 얻은 RBC를 동시에 실행하였다. 이들 공여체 RBC를 형광 친유성 염료 (Sigma)로 차등적으로 라벨링하였다: WT (빨간색), 및 Crry- (녹색). 두 번의 상이한 실험에서, 라벨링된 WT 및 Crry- 공여체 세포를 1:1로 혼합하였고 야생형 수령체 마우스에 정맥내로 주사하고 수령체 마우스에서 퍼센트 WT 및 Crry-결핍 RBC 생존률 (초기 시점에 비해)을 20,000개의 살아있는 세포 이벤트의 유동 세포 분석 평가에 의해 결정하였다. 첫 번째 실험에서, mAb M3-1 항체의 다회수 투여 전 처리를 제공하였고, mAb M3-1의 효과를 다수의 마우스 연구에서 효능을 나타낸 C5 억제 항체인 또 다른 억제 보체 항체 mAb BB5.1 (Hycult Biotech에서 이용 가능함)와 비교하였다 (Wang et al., PNAS vol 92:8955-8959, 1995; Hugen et al., Kidney Int 71(7):646-54, 2007). C5 억제자의 투여는 PNH에 걸린 인간 환자에 대한 치료의 현재의 기준이다. 두 번째 실험에서, mAb M3-1의 단일 전처리 용량을 평가하였다.
첫 번째 실험에서, 세 개의 상이한 마우스 군 (조건 당 n = 4)을 평가하였다: 비히클-처리된 조건, mAb M3-1-처리된 조건, 및 mAb BB5.1 (마우스 C5를 차단하는 mAb)-처리된 조건. 라벨링된 세포를 "제0 일"에 마우스에 주사하고, M3-1 및 BB5.1 둘 다의 다회수 용량을 다음과 같이 투여하였다: mAb M3-1을 제-11 일, 제-4 일, 제-1 일, 및 제+6 일에 정맥내로 투여하였다 (10 mg/kg). mAb BB5.1을 제-1 일, 제+3 일, 제+6 일, 및 제+10 일에 복강내 주사로 투여하였다 (40 mg/kg). 비히클 처리가 mAb M3-1와 같은 투약 일정에 이어진다.
도 45는 mAb M3-1 (제-11 일, 제04일, 제-1 일 및 제+6 일에 10 mg/kg)로 처리된 WT 수령체 마우스, mAb BB5.1 처리된 마우스, 또는 비히클 처리된 마우스에서 14일 기간에 걸친 공여체 RBC (WT 또는 Crry-)의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타낸다. 도 45에서 도시된 바와 같이, 비히클-처리된 동물에서 마우스의 RBC의 전형적인 생존률을 나타내는 WT RBC와 비교하여, Crry-결핍 RBC는 신속한 클리어런스를 나타낸다 (24시간 내에 75% 초과가 제거됨). mAb BB5.1로의 마우스의 처리는 비히클 처리 동안에 Crry-결핍 RBC 생존의 향상을 나타내지 않았다. 그에 반해, mAb M3-1 처리는 mAb BB5.1 및 비히클-처리된 동물 둘 다보다 Crry-결핍 RBC 생존률의 극적인 향상을 유발하였다. mAb M3-1의 보호 효과를 실험 기간 전반에 걸쳐 관찰하였다.
두 번째 연구에서, 차등적으로 라벨링된 WT (빨간색)- 및 Crry- (녹색) RBC를 WT 마우스의 두 개의 상이한 군 (조건 당 n = 4)에서 평가하였다: 비히클-처리 및 mAb M3-1-처리. 비히클 또는 항체 (20 mg/kg)의 단일 용량을 라벨링된 공여체 세포가 수령체 마우스로 주사되기 6일 전에 (제-6 일) 정맥내 투여에 의해 수령체 마우스에 제공하였다. 이어서 라벨링된 공여체 RBC를 16일 기간 동안 주사 후 증가하는 시점에 수령체 마우스에서의 퍼센트 생존률에 대하여 분석하였다.
도 46은 단일 용량의 mAb M3-1 (제-6 일에 20 mg/kg)로 처리된 WT 수령체 마우스 또는 비히클-처리된 마우스에서 16일 기간에 걸친 공여체 RBC (WT 또는 Crry-)의 퍼센트 생존률을 그래프로 나타낸다. 도 46에서 도시된 바와 같이, 단일 전처리 용량의 mAb M3-1은 비히클-처리된 마우스에서 Crry- RBC의 생존률과 비교하여 Crry- RBC의 향상된 생존률을 입증하였다. 주사 후 96시간에, 대략 90%의 비히클-처리된 WT RBC가 대조군 조건 하에 생존하는 반면, 비히클-처리된 WT 마우스에서는 Crry- RBC의 단지 5%만이 생존하였다. 비히클-처리된 마우스와는 달리, Crry- RBC의 40%가 mAb M3-1로 처리된 마우스에서 생존하였다.
종합해보면, 이 결과들은 MASP-3 억제 항체 mAb M3-1이 PNH와 관련된 마우스 모델에서 핵심 표면 보체 억제자인 Crry가 없는 RBC의 생존에 분명한 이점을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 13
이 실시예는 키메라 MASP-3 억제 단클론성 항체 (mAb M3-1, mAb 13B1로도 불림)가 류머티스성 관절염 (RA)의 쥐 모델인 콜라겐 항체-유도된 관절염 (CAIA)에서 임상 점수를 감소시킨다는 것을 입증하는 연구를 기술한다.
배경/근거 :
CAIA는 관절염의 잘 확립된 동물 모델이다. RA에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도, CAIA 모델의 병리학은 APC와의 확립된 관계를 갖는다. Banda 및 그 동료들은 APC의 구성요소, 예컨대 인자 B 및 인자 D의 결핍을 가지고 있는 마우스의 CAIA 모델에서 향상된 결과를 입증하였다 (Banda et al., J. Immunol vol 177:1904-1912, 2006 및 Banda et al., Clinical & Exp Imunol vol 159:100-108, 2009). APC 마우스 넉아웃은 WT 대조군에 비해 더 낮은 관절염 (질환) 점수, 더 낮은 발병률, 및 활막 및 주위 조직에서 더 적은 C3 및 인자 H 침착을 입증한다. 추가적으로, MASP1/3 넉아웃 마우스에서 질환 활성 점수, 관절 내 보체 C3 조직 침착, 및 조직병리학적 손상 점수가 현저히 감소되었다 (Banda et al., J Immunol vol 185:5598-5606, 2010). 그러므로, MASP-3 억제 항체 mAb M3-1을 CAIA에서의 효능에 대하여 분석하였다.
방법:
실시예 11, 및 실시예 14에서 기술된 바와 같이, 키메라 MASP-3 단클론성 항체 (mAb M3-1)를 생성하였다. 실시예 11에서 더 기술된 바와 같이, mAb M3-1이 마우스 모델에서 생체 내에서 APC의 강력한 억제자인 것이 결정되었다.
mAb M3-1을 CAIA 모델에서 다음과 같이 테스트하였다. 야생형 마우스 (n=7)에 제0 일에 항-콜라겐 항체 칵테일 3 mg을 정맥내로 주사하였다. 마우스에 제+3 일에 대장균 지질다당류 (LPS) (25 μg/마우스)를 복강내로 투여하였다. Nandakumar et al. (Am J Pathol 163(5):1827-1837, 2003)에서 기술된 바와 같이, 전형적으로 이 모델에서 제+3 일 내지 제+10 일에 관절염이 발생한다. 말단 혈청 샘플은 제+14 일에 수거하였다. mAb M3-1 (5 mg/kg 및 20 mg/kg)을 제-12일, 제-5일, 제+1 일 및 제+7 일에 투여하였다. 비히클 (PBS)을 음성 대조군으로 주사하였다.
다음 점수 기준을 사용하여 연구 제0 일 내지 제14 일에 각 마우스에 대하여 4개의 발 모두에서 임상 점수를 평가하였다:
0= 정상
1= 병에 걸린 1개의 뒷발 및/또는 앞발 관절 또는 최소 확산 홍반 및 붓기
2= 병에 걸린 2개의 뒷발 및/또는 앞발 또는 경도 확산 홍반 및 붓기
3= 병에 걸린 3개의 뒷발 및/또는 앞발 또는 중등도 확산 홍반 및 붓기
4= 현저한 확산 홍반 및 붓기, 또는 병에 걸린 4개의 발가락 관절
5= 전체 발의 중증 확산 홍반 및 심각한 붓기, 발가락 구부릴 수 없음.
발병률 = 관절염 증상을 나타내는 처리군 내 % 마우스를 또한 결정하였다.
결과는 도 47 (임상 점수) 및 도 48 (관절염의 발병률)에서 나타난다. 도 47은 14일 시간 경과에 따라 mAb M3-1 (5 mg/kg 또는 20 mg/kg) 또는 비히클로 처리된 마우스의 임상 점수를 그래프로 나타낸다. 도 48은 14일 시간 경과에 따라 mAb M3-1 (5 mg/kg 또는 20 mg/kg) 또는 비히클로 처리된 마우스의 관절염의 퍼센트 발병률을 그래프로 나타낸다. 도 47에서 도시된 바와 같이, mAb M3-1은 제5 일에 시작하여 연구 기간 전반에 걸쳐 지속되는 두 종점에 대한 분명한 치료적 이점을 입증한다. 도 48에서 도시된 바와 같이, 비히클-처리된 동물에서 질환의 발병률은 100%에 도달하는 한편, 5 mg/kg mAb M3-1 조건의 동물들의 3분의 2는 병에 걸리지 않았다. 추가적으로, 동물 중 단 한 마리 (즉, 총 n = 7 중 단 한 마리)는 20 mg/kg mAb M3-1 조건에서 임의의 관절염 증상을 입증하였다.
이 연구의 결과는 MASP-3 억제 항체 mAb M3-1이 CAIA 모델, 류머티스성 관절염 (RA)의 잘 확립된 쥐 모델 및 APC 활성화와 밀접하게 관련된 모델에서 분명한 치료적 이점을 제공한다는 것을 입증한다. 실시예 11에서 도시된 바와 같이, 마우스에 정맥내로 투여된 단일 용량의 mAb M3-1은 적어도 14일 동안 전신 APC 활성의 거의 완전한 제거를 유도하였다. 이 실시예에서 도시된 바와 같이, 마우스 결합 조직에 대한 자가 항체의 투여에 의해 유도된 동물 모델에서, mAb M3-1은 용량-의존적 방식으로 임상적 관절염 점수의 발병률 및 심각도를 감소시켰다. 대조군-처리된 동물과 비교하여, mAb M3-1은 테스트된 가장 높은 용량에서 질환의 발병률 및 심각도를 대략 80%까지 감소시켰다. 그러므로, MASP-3 억제 항체, 예컨대 mAb M3-1의 투여는 관절염, 예컨대 류머티스성 관절염, 골관절염, 소아 류머티스성 관절염, 감염-관련 관절염, 건선성 관절염, 뿐만 아니라 강직성 척추염 및 베체트 병으로 고통받고 있는 환자에서 효과적인 요법일 것으로 예상된다.
실시예 14
이 실시예는 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 항체의 생성을 기술한다.
배경/근거:
한정된 수의 MASP-3에 특이적인 항체를 기술하였다 (Thiel et al., Mol. Immunol. 43:122, 2006; Moller-Kristensen et al., Int. Immunol. 19:141, 2006; Skjoedt et al., Immunobiol 215:921, 2010). 이 항체들은 검출 검정, 예컨대 웨스턴 블롯팅, 면역침강법에 유용하고, ELISA 검정에서 캡쳐 또는 검출 시약으로서 유용하였다. 하지만, Thiel et al., 2006, Moller-Kristensen et al., 2006 및 Skjoedt et al., 2010에 기술된 항체는 MASP-3 촉매 활성을 억제하지 않는 것으로 발견되었다.
이전에, 실시예 7에서 기술된 바와 같이, 본원에서 (또한 WO2013/192240의 실시예 15에서 공개된 바와 같이) 변형된 DT40 세포주, DTLacO에서 MASP-3 결합 분자에 대하여 닭 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 MASP-3 항체를 또한 생성하였다. 이 항체들은 10 nM 내지 100 nM의 EC50으로 나노몰 범위에서 인간 MASP-3에 결합하였고 MASP-3에 의한 프로-CFD의 분열을 부분적으로 억제하였다.
이 실시예는 비정상적으로 강력한 결합 친화도 (즉, 나노몰 미만 결합 친화도, ≤500 pM 내지 20 pM의 범위에 있음)를 가진 항-인간 MASP-3 억제 항체의 생성을 기술한다. 이 실시예에서 기술된 항체는 고 친화도 (예를 들어, ≤ 500 pM)로 인간 MASP-3에 특이적으로 결합하고, 인자 D 성숙화를 억제하지만, 인간 MASP-1 (서열 번호:8)에 결합하지 않는다.
방법:
1. 키메라 마우스 V 영역/인간 IgG 불변 영역 항-인간 MASP-3 단클론성 항체의 생성
7 내지 14주령 C57BL/6, MASP-1/3 넉아웃 마우스를 Sigma Adjuvant System (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)을 사용하여 N-말단 상에 StrepTag II 에피토프 태그를 포함하는 인간 MASP-3 CCP1/CCP2/SP 폴리펩타이드 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 299-728)로 면역화하거나; 또는 N-말단 상에 StrepTagII를 포함하는 인간 MASP-3 SP 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450-728)로 면역화하였다. 마우스에 마우스 당 50 μg 면역원을 복강내로 주사하였다. 면역화된 마우스를 14일 후에 보조제 중의 추가적인 면역원을 이용하여 부스팅하였다. 그 이후, 몇 주 동안, 마우스를 14일 내지 21일마다 PBS 중의 면역원으로 부스팅하였다. 마우스의 혈청 샘플을 꼬리 출혈로부터 주기적으로 제조하고 항원-특이적 항체의 존재에 대하여 ELISA에 의해 테스트하였다. 유의한 항체 역가를 가진 마우스는 비장 융합 전 4일에 PBS 중의 융합 전 면역원 부스트를 받았다. 융합 전 3일에, 마우스를 PBS 중의 항-CD40 아고니스트 mAb (R&D Systems, Minneapolis, MN) 50 μg으로 꼬리 밑단에 피하로 처리하여 B 세포 수를 증가시켰다 (Rycyzyn et al., Hybridoma 27:25-30, 2008 참조). 마우스를 희생시키고 비장 세포를 수확하고 50% 폴리에틸렌 글리콜 또는 50% 폴리에틸렌 글리콜 플러스 10% DMSO를 사용하여 선택된 쥐 골수종 세포주 P3/NSI/1-AG4-1 (NS-1) (ATCC No. TIB18)에 융합시켰다. 융합은 하이브리도마 세포를 생성하였으며 이것을 비-융합된 세포, 골수종 혼성체(hybrid) 및 비장 혼성체의 증식을 억제하기 위해 HAT (하이폭산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 하이브리도마 선택 후, 배양 상층액을 MASP-3 결합 (ELISA) 및 프로-인자 D 활성화의 억제에 대하여 분석하였다. 양성 하이브리도마를 확인하고 단계 희석 방법으로 서브클로닝하였다.
융합 실험의 요약
융합 면역원:
인간 MASP-3		 총 하이브리도마 MASP-3 결합 하이브리도마 MASP-3 기능적
하이브리도마
1 SP 434 38 10
2 SP 279 13 0
3 CCP1/CCP2/SP 348 40 2
4 CCP1/CCP2/SP 319 60 2
5 CCP1/CCP2/SP 651 152 1
6 CCP1/CCP2/SP 1297 ND 1
주: "ND"는 이 융합이 프로-CFD 활성화의 기능적 억제에 대해서만 스크리닝되었음을 의미한다. 결과:
표 17에서 도시된 바와 같이, 면역화된 MASP1/3 KO 마우스로부터 총 3328개의 하이브리도마를 스크리닝하였으며, 이것들 중 >303개에서 MASP-3에 결합하는 것이 발견되었고 이것들 중 16개에서 MASP-3에 결합하고 프로-CFD 활성화를 억제하는 것이 발견되었다. 실시예 11에서 기술된 mAb M3-1 (13B1)은 표 17에서 기술된 16개의 기능적 MASP-3 억제 항체 중 하나이다. 실시예 15에서 기술된 바와 같이, 모두 16개의 기능적 MASP-3 억제 항체가 비정상적으로 강력한 결합 친화도 (≤ 500 pM)로 인간 MASP-3에 결합한다는 것이 결정되었다.
논의:
이 실시예는 MASP1/3 넉아웃 마우스를 면역화하여 비정상적으로 강력한 결합 친화도 (즉, 나노몰 미만 결합 친화도, ≤500 pM 내지 20 pM의 범위에 있음)를 가진 인간 MASP-3을 억제하는 항체의 생성을 기술한다. 이 실시예에서 기술된 항체는 고 친화도 (예를 들어, ≤ 500 pM)로 인간 MASP-3에 특이적으로 결합하고, 인자 D 성숙화를 억제하고, 인간 MASP-1에 결합하지 않는다. 본원에서 기술된 바와 같이, 인간, 마우스 및 닭 MASP-3의 아미노산 서열은 MASP-3의 SP 도메인이, 특히 활성 부위에서, 고도로 보존된다는 것을 나타낸다 (도 4 및 5 참조). 이 실시예에서 기술된 바와 같이, MASP1/3 KO 마우스에서 비정상적으로 강력한 결합 친화도를 가진 MASP-3 억제 항체를 생성할 수 있는 능력은 부분적으로는 야생형 동물에서 고도로 강력한 MASP-3 촉매 부위-특이적 항체의 생성을 방해하는 면역학적 내성의 방지 때문일 것이다.
실시예 15
이 실시예는 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 mAb의 클로닝 및 서열 분석을 기술한다.
방법:
재조합 항체의 클로닝 및 정제:
중쇄 및 경쇄 가변 영역을 RT-PCR을 사용하여 실시예 11 및 14에서 기술된 하이브리도마로부터 클로닝하고 시퀀싱하였다. 인간 IgG4 중쇄 (서열 번호:311)에 융합된 마우스 mAb 가변 영역 및 카파 경쇄 (서열 번호:313) 불변 영역으로 구성된 마우스-인간 키메라 mAb를 Expi293F 세포에서 재조합 단백질로서 생산하였다. IgG4 불변 힌지 영역 (서열 번호:311)은 안정화 S228P 아미노산 치환을 함유한다. 한 구체예에서, 키메라 mAb를 S228P 아미노산 치환 및 또한 낮은 pH에서 FcRn 상호작용을 촉진하는 돌연변이를 함유하는 인간 IgG4 불변 힌지 영역 (서열 번호:312)에 융합시켰다.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열은 각각 도 49A 및 49B에서 도시되고 (도 49A 및 도 49B에서 "SIN" = "서열 번호:"), 하기 포함된다. 각각의 상보적 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역 (FR)은 하기 표 18-22에서 제공된다.
도 50A는 MASP1/3 KO 마우스에서 생성된 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 mAb의 VH 영역의 계통수이다. 도 50B는 MASP1/3 KO 마우스에서 생성된 고 친화도 항-인간 MASP-3 억제 mAb의 VL 영역의 계통수이다. 도 50A 및 50B에서 도시된 바와 같이, 관련 항체의 여러 군을 확인하였다.
각각의 고 친화도 MASP-3 억제 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH) 서열이 하기 제공된다. 카바트 CDR은 밑줄 그어져 있다.
중쇄 가변 영역:
4D5_VH: 서열 번호:24
Figure pat00015
1F3_VH: 서열 번호:25
Figure pat00016
4B6_VH: 서열 번호:26
Figure pat00017
1A10_VH: 서열 번호:27
Figure pat00018
10D12_VH: 서열 번호:28
Figure pat00019
35C1_VH: 서열 번호:29
Figure pat00020
13B1_VH: 서열 번호:30
Figure pat00021
1G4_VH: 서열 번호:31
Figure pat00022
1E7_VH: 서열 번호:32
Figure pat00023
2D7_VH: 서열 번호:33
Figure pat00024
49C11_VH: 서열 번호:34
Figure pat00025
15D9_VH: 서열 번호:35
Figure pat00026
2F5_VH: 서열 번호:36
Figure pat00027
1B11_VH: 서열 번호:37
Figure pat00028
2F2_VH: 서열 번호:38
Figure pat00029
11B6_VH: 서열 번호:39
Figure pat00030
MASP-3 항체 VH 서열 (CDR 및 FR 영역, 카바트)
MASP-3 항체 VH 서열 (CDR 및 FR 영역, 카바트)
항체 HC FR1 HC CDR1
4D5 QVQLKQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFT(서열 번호:55)
 TDDIN
(서열 번호:56)
1F3 QVQLKQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFT(서열 번호:55)
 SNDIN
(서열 번호:62)
4B6 QVQLKQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFT(서열 번호:55)
 SNDIN
(서열 번호:62)
1A10 QVQLKQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFT(서열 번호:55)
 SNDIN
(서열 번호:62)
10D12 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFT(서열 번호:71)
 SYGMS
(서열 번호:72)
35C1 QIQLVQSGPELKTPGETVKISCKASGYIFT(서열 번호:78)
 SYGIT
(서열 번호:79)
13B1 QVQLKQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFT(서열 번호:83)
 GKWIE
(서열 번호:84)
1G4 QVQLKQSGAELMKPGASVKLACKATGYTFT(서열 번호:90)
 GYWIE
(서열 번호:91)
2F5 EVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFT(서열 번호:97)
 SYWIT
(서열 번호:98)
1B11 QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT(서열 번호:102)
 DYYIN
(서열 번호:103)
1E7 QVQLKQSGPELARPWASVKISCQAFYTFSR(서열 번호:108)
 RVHFAIRDTNYWMQ
(서열 번호:109)
2F2 QVQLKQSGAELVTPGASVKMSCKASGYTFT(서열 번호:113)
 TYPIE
(서열 번호:114)
11B6 QVQLKQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFT(서열 번호:120)
 TYPIE
(서열 번호:114)
2D7 EVQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYTLT(서열 번호:124)
 DYYMN
(서열 번호:125)
49C11 EVQLQQSGPVLVKPGASGKMSCKASGYKFT
(서열 번호:131)		 DYYMI
(SEQID NO:132)
15D9 QVQLKQSGTELMKPGASVNLSCKASGYTFT(서열 번호:136)
 AYWIE
(서열 번호:137)
항체 HC FR2 HC CDR2
4D5 WVKQRPGQGLEWIG(서열 번호:57)
 WIYPRDDRTKYNDKFKD
(서열 번호:58)
1F3 WVKQRPGQGLEWIG(서열 번호:57)
 WIYPRDGSIKYNEKFTD
(서열 번호:63)
4B6 WVKQRPGQGLEWIG(서열 번호:57)
 WIYPRDGTTKYNEEFTD
(서열 번호:67)
1A10 WVKQRPGQGLEWIG(서열 번호:57)
 WIYPRDGTTKYNEKFTD
(서열 번호:69)
10D12 WVRQAPGKGLKWMG(서열 번호:73)
 WINTYSGVPTYADDFKG
(서열 번호:74)
35C1 WVKQAPGKGLKWMG(서열 번호:80)
 WINTYSGVPTYADDFKG
(서열 번호:74)
13B1 WVKQRPGHGLEWIG(서열 번호:85)
 EILPGTGSTNYNEKFKG
(서열 번호:86)
1G4 WIKQRPGQGLEWIG(서열 번호:92)
 EMLPGSGSTHYNEKFKG
(서열 번호:93)
2F5 WVKQRPGQGLEWIG(서열 번호:57) DIYPGSGSTNYNEKFKS
(서열 번호:99)
1B11 WVKQRPGQGLEWIA(서열 번호:104)
 RIYPGSGNTYYNEKFKG
(서열 번호:105)
1E7 WVKQRPGQGLEWIG(서열 번호:57) AIYPGNGDTSYNQKFKG
(서열 번호:110)
2F2 WMKQNHGKSLEWIG(서열 번호:115)
 NFHPYNDDTKYNEKFKG
(서열 번호:116)
11B6 WMKQNHGKSLEWIG(서열 번호:115)
 NFHPYNGDSKYNEKFKG
(서열 번호:121)
2D7 WVKQSHGKSLEWIG
(서열 번호:126)		 DVNPNNDGTTYNQKFKG
(서열 번호:127)
49C11
WVKQSHGKSLEWIG
(서열 번호:126)		 VIKIYNGGTSYNQKFKG
(서열 번호:133)
15D9 WVKQRPGHGLEWIG
(서열 번호:85)		 EILPGSGTTNYNENFKD
(서열 번호:138)
항체 HC FR3 HC CDR3
4D5 KATLTVDTSSNTAYMDLHSLTSEDSAVYFCSS(서열 번호:59)
 LEDTY
(서열 번호:60)
1F3 KATLTVDVSSSTAYMELHSLTSEDSAVYFCSG(서열 번호:64)
 VEDSY
(서열 번호:65)
4B6 KATLTVDVSSSTAFMELHSLTSEDSAVYFCSS(서열 번호:68)
 VEDSY
(서열 번호:65)
1A10 KATLTVDVSSSTAFMELHRLTSEDSAVYFCSS(서열 번호:70)
 VEDSY
(서열 번호:65)
10D12 RFAFSLETSARTPYLQINNLKNEDTATYFCAR(서열 번호:75)
 GGEAMDY
(서열 번호:76)
35C1 RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTTTYFCTR(서열 번호:81)
 GGDALDY
(서열 번호:82)
13B1 KATFTADSSSNTAYMQLSSLTTEDSAMYYCLR
(서열 번호:87)		 SEDV
(서열 번호:88)
1G4 KATFTADTSSNTAYMQLSGLTTEDSAIYYCVR
(서열 번호:94)		 SIDY
(서열 번호:95)
2F5 KATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR
(서열 번호:100)		 RRYYATAWFAY
(서열 번호:101)
1B11 KATLTAEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAR
(서열 번호:106)		 NYYISSPWFAY
(서열 번호:107)
1E7 KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAS
(서열 번호:111)		 GSHYFDY
(서열 번호:112)
2F2 KATLTVEKSSNTVYLELSRLTSDDSAVYFCAR
(서열 번호:117)		 RVYYSYFWFGY
(서열 번호:118)
11B6 KATLTVEKSSSTVYLELSRLPSADSAIYYCAR
(서열 번호:122)		 RHYAASPWFAH
(서열 번호:123)
2D7
RATLTVDKSSNTASMELRSLTSEDSAVYYCAI
(서열 번호:128)		 CPFYYLGKGTHFDY
(서열 번호:129)
49C11
KATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCAR
(서열 번호:134)		 GPSLYDYDPYWYFDV
(서열 번호:135)
15D9 RATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAIYYCAR
(서열 번호:139)		 SYYYASRWFAF
(서열 번호:140)
항체 HC FR4
4D5 WGQGTLVAVSS(서열 번호:61)
1F3 WGQGTLVTVSS(서열 번호:66)
4B6 WGQGTLVTVSS(서열 번호:66)
1A10 WGQGTLVTVSS(서열 번호:66)
10D12 WGQGTSVTVSS(서열 번호:77)
35C1 WGQGTSVTVSS(서열 번호:77)
13B1 WGTGTTVTVSS(서열 번호:89)
1G4 WGQGTTLTVSS(서열 번호:96)
2F5 WGQGTLVTVSS(서열 번호:66)
1B11 WGQGTLVTVSS(서열 번호:66)
1E7 WGQGTTLTVSS(서열 번호:96)
2F2 WGHGTLVTVSS(서열 번호:119)
11B6 WGQGTLVTVSS(서열 번호:66)
2D7 WGQGTSLTVSS(서열 번호:130)
49C11 WGTGTTVTVSS(서열 번호:89)
15D9 WGQGTLVTVSS(서열 번호:66)
고 친화도 MASP-3 억제 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL) 서열이 하기 제공된다. 카바트 CDR은 밑줄 그어져 있다. 이 영역들은 카바트 또는 쵸티아 시스템에 의해 넘버링되는지에 관계없이 동일하다.경쇄 가변 영역:
4D5_VL: 서열 번호:40
Figure pat00031
1F3_VL: 서열 번호:41
Figure pat00032
4B6_VL: 서열 번호:42 (1A10_VL에 대한 것과 같다)
Figure pat00033
10D12_VL: 서열 번호:43
Figure pat00034
35C1_VL: 서열 번호:44
Figure pat00035
13B1_VL: 서열 번호:45
Figure pat00036
1G4_VL: 서열 번호:46
Figure pat00037
1E7_VL: 서열 번호:47
Figure pat00038
2D7_VL: 서열 번호:48
Figure pat00039
49C11_VL:서열 번호:49
Figure pat00040
15D9_VL: 서열 번호:50
Figure pat00041
2F5_VL: 서열 번호:51
Figure pat00042
1B11_VL: 서열 번호:52
Figure pat00043
2F2_VL: 서열 번호:53
Figure pat00044
11B6_VL: 서열 번호:54
Figure pat00045
MASP-3 항체 VL 서열 (CDR 및 FR 영역, 카바트 및 쵸티아)
항체 LC FR1 LC CDR1
4D5 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMTC
(서열 번호:141)		 KSSQSLLNSRTRKNYLA
(서열 번호:142)
1F3 DIVMTQSPSSLAVSAGERVTMSC
(서열 번호:148)		 KSSQSLLISRTRKNYLS
(서열 번호:149)
4B6 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC
(서열 번호:151)		 KSSQSLLISRTRKNYLS
(서열 번호:149)
1A10* [사용된 4B6 LC:
서열 번호:151]		 [사용된 4B6 LC:
서열 번호:149]
10D12 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISC
(서열 번호:152)		 KSSQSLLDSDGKTYLN
(서열 번호:153)
35C1 DIVMTQAPLTLSVTIGQPASISC
(서열 번호:158)		 KSSQSLLDSDGKTYLS
(서열 번호:159)
13B1 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC
(서열 번호:151)		 KSSQSLLNSRTRKNYLA
(서열 번호:142)
1G4 DVLMTQTPLSLPVSLGEQASISC
(서열 번호:162)		 RSSQSLVQSNGNTYLH
(서열 번호:163)
2F5 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITC
(서열 번호:168)		 KASQNVGTAVA
(서열 번호:169)
1B11 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC
(서열 번호:175)		 KASQNVGPNVA
(서열 번호:176)
1E7 DIQLTQSPAILSVSPGERVSFSC
(서열 번호:181)		 RASQSIGTSIH
(서열 번호:182)
2F2 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVNVTC
(서열 번호:187)		 KASQNVGTHVA
(서열 번호:188)
11B6 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVNVTC
(서열 번호:187)		 KASQNVGPTVA
(서열 번호:191)
2D7 DIQMTQTPASLSASLGDRVTISC
(서열 번호:195)		 RASQDISNFLN
(서열 번호:196)
49C11 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASFSC
(서열 번호:202)		 RSSQSLIHSNGNTYLH
(서열 번호:203)
15D9 DIVMTQSQKFMSTSIGDRVSVTC
(서열 번호:205)		 RASQNVGPNLA
(서열 번호:206)
항체 LC FR2 LC CDR2
4D5 WYQQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:143)		 WASTRES
(서열 번호:144)
1F3 WYQQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:143)		 WASTRES
(서열 번호:144)
4B6 WYQQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:143)		 WASTRES
(서열 번호:144)
1A10 [사용된 4B6 LC:
서열 번호:143]		 [사용된 4B6 LC:
서열 번호:144]
10D12 WLLQRPGQSPKRLIY
(서열 번호:154)		 LVSKLDS
(서열 번호:155)
35C1 WLLQRPGQSPKRLIY
(서열 번호:154)		 LVSKLDS
(서열 번호:155)
13B1 WYQQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:143)		 WASTRES
(서열 번호:144)
1G4 WYLQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:164)		 KVSNRFS
(서열 번호:165)
2F5 WYQQKPGQSPKLLIS
(서열 번호:170)		 SASNRYT
(서열 번호:171)
1B11 WYQQKPGQSPKALIY
(서열 번호:177)		 SASYRYS
(서열 번호:178)
1E7 WYQQRTNGSPRLLIK
(서열 번호:183)		 YASESIS
(서열 번호:184)
2F2 WYQQKPGQSPKALIY
(서열 번호:177)		 SASYRYS
(서열 번호:178)
11B6 WYQQKPGQSPKALIY
(서열 번호:177)		 SASYRYS
(서열 번호:178)
2D7 WYQQKPNGTVKLLVF
(서열 번호:197)		 YTSRLHS
(서열 번호:198)
49C11 WYLQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:164)		 KVSNRFS
(서열 번호:165)
15D9 WYQQKPGQSPKALIY
(서열 번호:177)		 SASYRFS
(서열 번호:207)
항체 LC FR3 LC CDR3
4D5 GVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVQAEDLAVYYC
(서열 번호:145)		 KQSYNLYT
(서열 번호:146)
1F3 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC
(서열 번호:150)		 KQSYNLYT
(서열 번호:146)
4B6 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC
(서열 번호:150)		 KQSYNLYT
(서열 번호:146)
1A10 [사용된 4B6 LC:
서열 번호:150]		 [사용된 4B6 LC:
서열 번호:146]
10D12 GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC
(서열 번호:156)		 WQGTHFPWT
(서열 번호:157)
35C1 GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC
(서열 번호:156)		 WQGTHFPYT
(서열 번호:160)
13B1 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC
(서열 번호:150)		 KQSYNIPT
(서열 번호:161)
1G4 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC
(서열 번호:166)		 SQSTHVPPT
(서열 번호:167)
2F5 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDVADYFC
(서열 번호:172)		 QQYNSYPLT
(서열 번호:173)
1B11 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC
(서열 번호:179)		 QQYNRYPLT
(서열 번호:180)
1E7 GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC
(서열 번호:185)		 QQSNSWPYT
(서열 번호:186)
2F2 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC
(서열 번호:189)		 QQYNSYPRALT
(서열 번호:190)
11B6 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHSEDLAEYFC
(서열 번호:192)		 QQYNSYPFT
(서열 번호:193)
2D7 GVPSRFSGSGSGAEHSLTISNLEQEDVATYFC
(서열 번호:199)		 QQGFTLPWT
(서열 번호:200)
49C11 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC
(서열 번호:166)		 SQSTHVPWT
(서열 번호:204)
15D9 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC
(서열 번호:189)		 QQYNRYPFT
(서열 번호:208)
항체 LC FR4
4D5 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
1F3 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
4B6 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
1A10 [사용된 4B6 LC:
서열 번호:147]
10D12 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
35C1 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
13B1 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
1G4 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
2F5 FGAGTKLELKR
(서열 번호:174)
1B11 FGAGTKLELKR
(서열 번호:174)
1E7 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
2F2 FGAGTKLELKR
(서열 번호:174)
11B6 FGSGTKLEIKR
(서열 번호:194)
2D7 FGGGTKVEIKR
(서열 번호:201)
49C11 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
15D9 FGSGTKLEIKR
(서열 번호:194)
*주: mAb 1A10에 대한 경쇄는 확인되지 않았고, 따라서 4B6의 경쇄를 1A10 HC와 함께 사용하였다.
IA군 HC CDR에 대한 공통 서열:
항체 영역 서열
4D5 HC-CDR1 TDDIN (서열 번호:56)
1F3 HC-CDR1 SNDIN (서열 번호:62)
4B6 HC-CDR1 SNDIN (서열 번호:62)
1A10 HC-CDR1 SNDIN (서열 번호:62)
공통 HC-CDR1 XXDIN (서열 번호:209)
여기서
위치 1의 X는 S 또는 T이고;
위치 2의 X는 N 또는 D이다
4D5 HC-CDR2 WIYPRDDRTKYNDKFKD (서열 번호:58)
1F3 HC-CDR2 WIYPRDGSIKYNEKFTD (서열 번호:63)
4B6 HC-CDR2 WIYPRDGTTKYNEEFTD (서열 번호:67)
1A10 HC-CDR2 WIYPRDGTTKYNEKFTD (서열 번호:69)
공통 HC-CDR2 WIYPRDXXXKYNXXFXD (서열 번호:210)
여기서
위치 7의 X는 G 또는 D이고; 위치 8의 X는 S, T 또는 R이고; 위치 9의 X는 I 또는 T이고; 위치 13의 X는 E 또는 D이고; 위치 14의 X는 K 또는 E이고; 위치 16의 X는 T 또는 K이다
4D5 HC-CDR3 LEDTY (서열 번호:60)
1F3 HC-CDR3 VEDSY (서열 번호:65)
4B6 HC-CDR3 VEDSY (서열 번호:65)
1A10 HC-CDR3 VEDSY (서열 번호:65)
공통 HC-CDR3 XEDXY (서열 번호:211)
여기서 위치 1의 X는 L 또는 V이고,
위치 4의 X는 T 또는 S이다
IA군 LC CDR에 대한 공통 서열:
항체 영역 서열
4D5 LC-CDR1 KSSQSLLNSRTRKNYLA (서열 번호:142)
4D5-NQ LC-CDR1 KSSQSLLQSRTRKNYLA (서열 번호:257)
4D5-NA LC-CDR1 KSSQSLLASRTRKNYLA (서열 번호:258)
4D5-ST LC-CDR1 KSSQSLLNTRTRKNYLA (서열 번호:259)
1F3 LC-CDR1 KSSQSLLISRTRKNYLS (서열 번호:149)
4B6 LC-CDR1 KSSQSLLISRTRKNYLS (서열 번호:149)
공통* LC-CDR1 KSSQSLLXXRTRKNYLX (서열 번호:212)
여기서 위치 8의 X는 N, I, Q 또는 A이고;
위치 9의 X는 S 또는 T이고;
위치 17의 X는 A 또는 S이다
4D5 LC-CDR2 WASTRES (서열 번호:144)
1F3 LC-CDR2 WASTRES (서열 번호:144)
4B6 LC-CDR2 WASTRES (서열 번호:144)
공통 LC-CDR2 WASTRES (서열 번호:144)
4D5 LC-CDR3 KQSYNLYT (서열 번호:146)
1F3 LC-CDR3 KQSYNLYT (서열 번호:146)
4B6 LC-CDR3 KQSYNLYT (서열 번호:146)
공통 LC-CDR3 KQSYNLYT (서열 번호:146)
*주: CDR-L1 공통 서열은 실시예 19에서 기술된 바와 같이 생성된 변이체를 포함한다.
IB군 HC CDR에 대한 공통 서열:
항체 영역 서열
10D12 HC-CDR1 SYGMS (서열 번호:72)
35C1 HC-CDR1 SYGIT (서열 번호:79)
공통 HC-CDR1 SYGXX (서열 번호:213)
여기서 위치 4의 X는 M 또는 I이고;
위치 5의 X는 S 또는 T이다
10D12 HC-CDR2 WINTYSGVPTYADDFKG (서열 번호:74)
35C1 HC-CDR2 WINTYSGVPTYADDFKG (서열 번호:74)
공통 HC-CDR2 WINTYSGVPTYADDFKG (서열 번호:74)
10D12 HC-CDR3 GGEAMDY (서열 번호:76)
35C1 HC-CDR3 GGDALDY (서열 번호:82)
공통 HC-CDR3 GGXAXDY (서열 번호:214)
여기서 위치 3의 X는 E 또는 D이고;
위치 5의 X는 M 또는 L이다
IB군 LC CDR에 대한 공통 서열:
항체 영역 서열
10D12 LC-CDR1 KSSQSLLDSDGKTYLN (서열 번호:153)
10D12-DE LC-CDR1 KSSQSLLDSEGKTYLN (서열 번호:261)
10D12-DA LC-CDR1 KSSQSLLDSAGKTYLN (서열 번호:262)
10D12-GA LC-CDR1 KSSQSLLDSDAKTYLN (서열 번호:263)
35C1 LC-CDR1 KSSQSLLDSDGKTYLS (서열 번호:159)
공통* LC-CDR1 KSSQSLLDSXXKTYLX (서열 번호:215)
여기서 위치 10의 X는 D, E 또는 A이고;
위치 11의 X는 G 또는 A이고;
위치 16의 X는 N 또는 S이다
10D12 LC-CDR2 LVSKLDS (서열 번호:155)
35C1 LC-CDR2 LVSKLDS (서열 번호:155)
공통 LC-CDR2 LVSKLDS (서열 번호:155)
10D12 LC-CDR3 WQGTHFPWT (서열 번호:157)
35C1 LC-CDR3 WQGTHFPYT (서열 번호:160)
공통 LC-CDR3 WQGTHFPXT (서열 번호: 216)
여기서 위치 8의 X는 W 또는 Y이다
*주: CDR-L1 공통 서열은 실시예 19에서 기술된 바와 같이 생성된 변이체를 포함한다.마우스 mAb 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA:
서열 번호:217: 4D5 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00046
서열 번호:218: 1F3 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00047
Figure pat00048
서열 번호:219: 4B6 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00049
서열 번호:220: 1A10 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00050
서열 번호:221: 10D12 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00051
서열 번호:222: 35C1 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00052
서열 번호:223: 13B1 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00053
서열 번호:224: 1G4 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00054
Figure pat00055
서열 번호:225: 1E7 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00056
서열 번호:226: 2D7 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00057
서열 번호:227: 49C11 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00058
서열 번호:228: 15D9 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00059
서열 번호:229: 2F5 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00060
서열 번호:230: 1B11 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00061
서열 번호:231: 2F2 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00062
서열 번호:232: 11B6 중쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00063
경쇄 가변 영역 (마우스 mAb)을 암호화하는 DNA:
서열 번호:233: 4D5 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00064
서열 번호:234: 1F3 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00065
서열 번호:235: 4B6/1A10 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00066
Figure pat00067
서열 번호:236: 10D12 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00068
서열 번호:237: 35C1 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00069
서열 번호:238: 13B1 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00070
서열 번호:239: 1G4 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00071
서열 번호:240: 1E7 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00072
서열 번호:241: 2D7 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00073
Figure pat00074
서열 번호:242: 49C11 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00075
서열 번호:243: 15D9 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00076
서열 번호:244: 2F5 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00077
서열 번호:245: 1B11 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00078
서열 번호:246: 2F2 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00079
서열 번호:247: 11B6 경쇄 가변 영역 (모체)을 암호화하는 DNA
Figure pat00080
Figure pat00081
서열 번호:310: 인간 IgG4 불변 영역
Figure pat00082
서열 번호:311: S228P 돌연변이를 가진 인간 IgG4 불변 영역
Figure pat00083
서열 번호:312: S228P 돌연변이 및 또한 낮은 pH에서 FcRn 상호작용을 촉진하는 돌연변이 (Xtend)를 가진 인간 IgG4 불변 영역
Figure pat00084
서열 번호:313: 인간 IgK 불변 영역
Figure pat00085
실시예 16
이 실시예는 여러 시험관 내 검정에서 재조합 정제된 고 친화도 MASP-3 억제 항체의 기능적 특성화를 기술한다.
방법 :
실시예 11 및 14에서 기술된 바와 같이 생성된 재조합 MASP-3 mAb를 다음과 같이 (i) 인간 MASP-3 및 다른 종의 MASP-3으로의 결합; (ii) 인공 기질의 분열을 억제할 수 있는 능력; (iii) 프로-인자 D의 인자 D로의 분열을 억제할 수 있는 능력; (iv) 인간 혈청에서 보체 침착의 억제 및 (v) 인간 혈청에서 토끼 적혈구 용해의 억제에 대하여 특성화하였다:
1. 인간 및 마우스 MASP-3으로의 결합을 결정하기 위한 검정
ELISA 검정 :
정제된 재조합 MASP-3 mAb로의 MASP-3 결합 검정:
인간 MASP-3 :
인간 MASP-3 (CCP1-CCP2-SP 단편)로의 16개의 정제된 재조합 MASP-3 항체의 결합을 측정하기 위해 다음과 같이 샌드위치 ELISA 검정을 수행하였다. ELISA 플레이트를 4 μg/mL으로 캡쳐 항체 αM3-259가 들어있는 카보네이트/바이-카보네이트 버퍼로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. αM3-259는 인간 MASP-3의 CCP1-CCP2-SP 영역으로 면역화된 닭의 높은 결합력의 재조합 키메라 닭-인간 MASP-3 mAb이다. 도메인 맵핑 연구는 αM3-259가 인간, 게먹이 원숭이, 마우스, 래트 및 개를 포함하는 다종의 MASP-3의 CCP1-CCP2 영역에 결합한다는 것을 나타낸다. 도 51C에서 도시된 바와 같이, αM3-259는 또한 MASP-1에 결합한다.
플레이트를 그 후에 1% BSA/PBS로 블로킹하고, PBS로 세척한 다음 MASP-3 CCP1-CCP2-SP (2 μg/mL)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 (PBS-T, 0.05%) 후보 MASP-3 항체를 추가한 후 이어서 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 (PBS-T, 0.05%) 검출 항체를 실온에서 한 시간 동안 추가하였다 (마우스 항-인간 카파-HRP, SouthernBiotech #9230-05). 추가의 세척 후 (PBS-T, 0.05%) 플레이트를 OPT EIA TMB (BD Biosciences #555214)로 현상하였다 (5분). A450에서 판독하는 흡광도를 Spectramax M5e 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
결과:
도 51A 및 도 51B는 인간 MASP-3 (CCP1-CCP2-SP)에 대한 MASP-3 mAb (정제된 재조합)의 결합력을 그래프로 나타낸다. 도 51A, 도 51B, 및 표 24에서 도시된 바와 같이, MASP-3 mAb는 인간 MASP-3에 대하여 높은 결합력을 가지며, 0.241 nM 내지 0.023 nM의 범위에 있다. 이 값들은 이전에 기술된 MASP-3 mAb (본원에서 실시예 7 참조, 또한 WO2013/192240의 실시예 15로서 공개됨)에 대하여 보고된 것들보다 10 내지 100배 더 낮다.
MASP-3 mAb 결합 특이성:
MASP-3에 대한 고 친화도 MASP-3 mab의 특이성을 결정하기 위해, 결합 실험을 수행하여 인간 MASP-1 및 인간 MASP-2로의 16개의 정제된 재조합 MASP-3 항체의 결합을 측정하였다. 재조합 MASP-1A (S646A, CCP1-CCP2-SP 단편) 및 MASP-2 (CCP1-CCP2-SP 단편)이 플레이트 상에 직접 고정된다는 것을 제외하면, MASP-3 결합 ELISA에 대하여 기술된 바와 같이 결합을 결정하였다.
결과:
도 51C는 결합 실험의 결과를 그래프로 나타내며 여기서 대표적인 정제된 재조합 고 친화도 인간 MASP-3 억제 항체는 MASP-3으로의 결합에 대하여 선택적인 것으로 나타났고 인간 MASP-1에 결합하지 않는다.
도 51D는 결합 실험의 결과를 그래프로 나타내며 여기서 대표적인 정제된 재조합 고 친화도 인간 MASP-3 억제 항체는 MASP-3으로의 결합에 대하여 선택적인 것으로 나타났고 인간 MASP-2에 결합하지 않는다.
마우스 MASP-3:
마우스 MASP-3으로의 MASP-3 mAb의 결합을 재조합, 전장 마우스 MASP-3 (서열 번호:3)이 플레이트 상에서 αM3-259로 캡쳐된다는 것을 제외하면 인간 MASP-3에 대하여 상기 기술된 바와 같이 측정하였다. 두 실험에서 사용된 음성 대조군 mAb는 αM3-259와 동일한 면역화된 닭으로부터 얻어진 재조합, 키메라 닭-인간 mAb인 mAb77이지만, mAb 77은 마우스 MASP-3에 결합하지 않는다.
결과 :
도 52는 마우스 전장 MASP-3에 대한 대표적인 MASP-3 mAb (정제된 재조합)의 결합력을 그래프로 나타낸다. 도 52에서 도시된 바와 같이, 테스트된 대부분의 MASP-3 mAb는 또한 마우스 MASP-3에 대하여 높은 결합력을 갖는다.
인간 및 마우스 MASP-3에 대한 16개의 재조합 키메라 MASP-3 mAb의 결합력 값 (EC50)은 표 24에 요약된다.
인간 및 마우스 MASP-3에 대한 MASP-3 mAb의 결합력 (도 51A, 51B 및 52)
항체 클론 mAb를 생성하는데 사용된 항원 인간 MASP-3 (CCP1-CCP2-SP) 결합력 (EC 50 nM) 마우스 MASP-3
(전장)
결합력
(EC 50 nM)
1A10* SP 0.241 0.15
1B11 SP 0.059 1.10
1E7 SP 0.112 117.00
1F3 SP 0.236 0.111
1G4 SP 0.177 3.70
2D7 SP 0.122 NA
2F2 SP 0.057 0.105
2F5 SP 0.073 0.102
4B6 SP 0.211 0.188
4D5 SP 0.058 0.098
10D12 CCP1-CCP2-SP 0.089 0.081
11B6 CCP1-CCP2-SP 0.060 0.066
13B1 CCP1-CCP2-SP 0.059 0.035
15D9 CCP1-CCP2-SP 0.074 0.092
35C1 CCP1-CCP2-SP 0.091 0.209
49C11 CCP1-CCP2-SP 0.069 0.064
세 가지 MASP-3 mAb - 13B1, 10D12 및 4D5 - 를 또한 재조합 게먹이 원숭이, 개, 및 래트 MASP-3으로의 결합에 대하여 테스트하였다. 이 결과들은 하기 표 25에 요약된다.
MASP-3 mAb 종 교차 결합 실험의 요약
MASP-3의 종 Fab 결합의 순위
인간 13B1 (pM)
Figure pat00086
10D12 (pM)
Figure pat00087
4D5 (pM)
게먹이 원숭이 13B1 (pM)
Figure pat00088
4D5 (pM) > 10D12 (pM)
개 13B1 (pM) > 10D12 (pM) >> 4D5 (nM)
래트 13B1 (pM)
Figure pat00089
10D12 (pM) >> 4D5 (nM)
마우스 10D12 (pM) > 13B1 (pM) >> 4D5 (nM)
표 25에서 도시된 바와 같이, MASP-3 mAb 13B1, 10D12 및 4D5는 테스트된 다섯 종의 MASP-3 (인간, 마우스, 래트, 개 및 게먹이 원숭이) 모두에 결합한다. 이들 mAb는 높은 결합력 (≤500 pM)으로 인간에 결합하는 한편, 다양한 결합력으로 다른 종의 MASP-3에 결합한다. 2. 형광원 트리펩타이드 분열 검정
배경/근거 :
공지된 천연 기질 외에도 (Iwaki et al., J. Immunol. 187:3751, 2011; Cortesio and Jiang, Arch. Biochem. Biophys. 449:164-170, 2006), MASP-3는 다양한 트리펩타이드 기질을 가수분해하는 것으로 나타났다 (Cortesio and Jiang, Ibid.). 매우 작은 기질로서, 이 분자들을 사용하여 프로테아제의 촉매 부위를 맵핑할 수 있다. 트리펩타이드 분열의 억제는 항체와 같은 억제제가 촉매 부위로의 작은 기질의 접근을 직접적으로 차단하거나 또는 유사하게 접근을 거부하는 SP 도메인에서 입체구조의 변화를 유발한다는 표시이다. 이와 같이, 항체는 또한 효소의 활성 부위를 방해함으로써 큰 천연 기질의 촉매를 차단할 것으로 예상될 수 있다. 기능적으로, 이것은 MASP-3 널 마우스 또는 3MC 환자 (MASP-3의 결핍)와 가장 근사하다.
방법 :
재조합 mAb의 적정 (666 nM에서 0.91 nM로 3배 희석)을 MASP-3 CCP1-CCP2-SP (197 nM)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 트리펩타이드 기질 BOC-V-P-R-AMC (t-부틸옥시카르보닐-Val-Pro-Arg-7-아미노-4-메틸쿠마린) (R&D Systems, Cat. No. ES011)을 0.2 mM의 최종 농도로 추가하였다. Arg-AMC 아미드 결합의 가수분해는 고도의 형광 기인 AMC를 방출시킨다. 여기 380nm/방출 460nm 동역학 값을 Spectramax M5e 형광 플레이트 판독기를 사용하여 37℃에서 70분 동안 5분마다 기록하였다.
결과 :
도 53은 MASP-3 단클론성 항체로의 MASP-3-의존적 형광원성 트리펩타이드 분열의 억제를 측정하는 검정의 결과를 그래프로 나타낸다. 도 53에서 도시된 바와 같이, 테스트된 MASP-3 mAb를 세 개의 별개의 군으로 분류한다:
1. MASP-3에 의한 펩타이드 분열의 강력한 억제자인 MASP-3 mAb:
1A10 (29.77 nM), 1G4 (29.64 nM), 1F3 (32.99 nM), 4B6 (26.03 nM), 4D5 (27.54 nM), 10D12 (30.94 nM) 및 13B1 (30.13 nM).
2. MASP-3에 의한 펩타이드 분열의 약한 또는 매우 약한 억제자인 MASP-3 mAb: 15D9, 11B6, 2F5, 1E7 및 2D7
3. 중성이거나 MASP-3에 의한 펩타이드 분열을 자극하는 것으로 보이는 MASP-3 mAb: 1B11; 2F2; 77 (대조군 mAb)
3. 프로-인자 D의 인자 D로의 분열의 억제
방법 :
활성 재조합 인간 MASP-3 단백질 (반응 당 240 ng)을 9 μL의 총 부피로 GVB++ 버퍼 중의 대표적인 MASP-3 mAb 및 대조군 mAb (MASP-1에 결합하지만 MASP-3에 결합하지 않음)와 함께 실온에서 15분 동안 사전 인큐베이션하였다. 이어서 N-말단 Strep-tag II 에피토프 태그 (ST-프로-인자 D-His)를 가진 프로-인자 D 70 ng을 각 튜브에 추가하여 반응 당 최종 부피를 10 μL로 만들었다. 반응물을 써모사이클러(thermocycler)에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 각 반응물의 10분의 1을 12% Bis-Tris 겔 상에서 전기영동하여 프로-인자 D 및 활성 인자 D 분열 생성물을 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮기고 비오티닐화된 인자 D 항체 (R&D Systems)로의 검출에 의한 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였다.
결과 :
도 54는 시험관 내 검정에서 프로-CFD의 CFD로의 재조합 MASP-3-매개된 분열을 차단할 수 있는 대표적인 MASP-3 mAb의 능력을 입증하는 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 54에서 도시된 바와 같이, 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb 13B1, 4B6, 1G4, 2D7, 10D12, 1A10, 4D5, 1E7, 및 1F3 마우스-인간 키메라 mAb는 이 검정에 프로-CFD 분열의 부분적 내지 충분한 억제를 나타냈다.
4. 치모산 검정에서 인자 Bb 침착
방법:
다양한 농도의 MASP-3 mAb를 10% CFD-고갈된 인간 혈청 (Complement Technology A336) 및 GVB + Mg/EGTA (20 nM)에 추가하고 재조합 ST-프로-인자 D-His (2 μg/mL 최종) 및 치모산 (0.1 mg/mL 최종)의 추가 전에 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 치모산 입자는 보체 침착에 대한 활성화 표면으로 기능한다. 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였고 APC 활성을 치모산 입자의 표면 상에서 보체 인자 Bb (Quidel 항체 A252)의 유동 세포 분석 검출에 의해 측정하였다.
결과:
도 55A는 인자 D-고갈된 인간 혈청에서 다양한 농도의 MASP-3 mAb 4D5, 10D12 및 13B1의 존재시 37℃에서 70분 동안 치모산 입자 상의 인자 Bb 침착 수준 (MFI 유닛으로 측정된 유동 세포 분석 검출로 결정됨)을 그래프로 나타낸다.
도 55B는 CFD-고갈된 인간 혈청에서 다양한 농도의 MASP-3 mAb 1F3, 1G4, 2D7 및 4B6의 존재시 37℃에서 70분 동안 치모산 입자 상의 인자 Bb 침착 수준 (MFI 유닛으로 측정된 유동 세포 분석 검출로 결정됨)을 그래프로 나타낸다.
도 55A 및 55B에서 도시된 결과는 하기 표 26에서 요약된다.
MASP-3 mAb에 의한 치모산 상에서의 인자 Bb 침착의 억제 (도 55A 및 도 55B)
항체 치모산 상의 인자 Bb 침착의 억제 (IC50 nM)
1F3 0.1
1G4 1.1
2D7 3.5
4B6 0.2
4D5 0.4
10D12 0.5
13B1 0.3
도 55A, 도 55B 및 표 26에서 도시된 바와 같이, MASP-3 mAb는 인간 혈청에서 APC의 강력한 억제를 나타내며, IC50 값은 0.1 nM 내지 3.5 nM의 범위에 있다. 이 결과들은 MASP-3이 인간 혈청의 시험관 내 모델에서 APC 활성화에 있어서 핵심 역할을 한다는 것을 입증하고, MASP-3 억제 항체가 APC의 강력한 억제자임을 더 입증한다.
5. 토끼 적혈구 용해를 억제할 수 있는 대표적인 MASP-3 mAb의 능력을 측정하기 위한 검정
방법:
또 다른 실험적 맥락에서 APC의 억제를 모니터링하기 위해서, 발명자들은 인간 혈청에서 토끼 적혈구의 용해를 차단할 수 있는 대표적인 MASP-3 mAb의 능력을 평가하였다. 다양한 농도의 MASP-3 mAb를 10% 인자 D-고갈된 인간 혈청 및 GVB + Mg/EGTA (20 nM)에 추가하고 재조합 ST-프로-인자 B-His (2 μg/mL 최종) 및 적혈구 (2.5x108 세포/mL 최종)의 추가 전에 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 37℃에서 70분 동안 인큐베이션하고 반응물을 희석하고 유리 헤모글로빈의 수준을 나타내는 흡광도 (A405)를 측정함으로써 APC-매개된 용혈을 측정하였다.
결과:
도 56A는 CFD-고갈된 인간 혈청에서 다양한 농도의 MASP-3 mAb 1A10, 1F3, 4B6, 4D5, 1G4 및 2F2의 존재시 토끼 적혈구 용해의 억제의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 56B는 CFD-고갈된 인간 혈청에서 다양한 농도의 MASP-3 mAb 1B11, 1E7, 1G4, 2D7 및 2F5의 존재시 토끼 적혈구 용해의 억제의 수준을 그래프로 나타낸다. 결과는 표 26에서 요약된다.
MASP-3 mAb에 의한 토끼 적혈구 용해의 억제 (도 56A 및 도 56B)
항체 토끼 적혈구 용해의 억제 (IC 50 nM)
1A10 0.2
1F3 0.2
4B6 0.2
4D5 0.1
1G4 2.7
2F2 0.8
1B11 NA
1E7 NA
2D7 5.4
2F5 0.9
도 56A, 도 56B 및 표 27에서 도시된 바와 같이, MASP-3 mAb는 토끼 적혈구의 APC-구동된 용혈의 억제를 나타내며, IC50 값은 0.1 nM 내지 5.4 nM의 범위에 있다. 이 결과는 치모산 검정에서 MASP-3 항체의 관찰을 입증하고, MASP-3 억제 항체가 APC의 강력한 억제자임을 더 입증한다. 6. 3MC 환자 혈청에서 프로-인자 D 분열의 억제
방법:
대표적인 재조합 MASP-3 mAb (4D5)을 정상 인간 혈청 및 혈청에 검출 가능한 MASP-3이 없고 APC에서 결핍을 나타내는 개체인 3MC Patient B ("Pat B")의 혈청으로부터 기원한 프로-인자 D의 재조합 MASP-3 분열 (및 활성화)을 차단할 수 있는 능력에 대하여 테스트하였다.
정상 인간 혈청과 Patient B 혈청 (10% 최종) 및 GVB + Mg/EGTA (30 nM)를 효소가 없거나 또는 활성 재조합 MASP-3 (rMASP-3; 0.5 μg/mL), 비활성 rMASP-3, 또는 활성 rMASP-3 플러스 MASP-3 mAb 4D5 (500 nM 최종)와 함께 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 치모산 (0.1 mg/mL 최종)을 추가하고, 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였다. 2시간 후, 샘플을 원심분리하고 상층액을 수거하였다. 샘플을 인간 인자 D (R&D Systems AF1824)에 대하여 생산된 염소 항체로 면역 침강시키고, 열 변성시키고, 펩타이드-N-글리코시다제 (New England Biolabs P0704L)로 처리하였다. 챕쳐되고 탈글리코실화된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 겔을 비오티닐화된 항-CFD (R&D Systems BAF1824) 및 고 민감성 스트렙타비딘-HRP (Thermo Fischer Scientific 21130)를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 위해 전기블롯팅하였다.
결과:
도 57은 활성 rMASP-3, 비활성 rMASP-3, 및 활성 rMASP-3 플러스 mAb 4D5의 존재시 3MC Patient B 혈청에서 프로-인자 D 및 인자 D의 수준을 분석하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 57에서 도시된 바와 같이, 정상 인간 혈청은 대부분 성숙한 형태를 함유하는 한편, Patient B 혈청은 원칙적으로 인자 D의 치모겐 형태를 함유한다. 도 57에서 추가로 도시된 바와 같이, 활성 rMASP-3은 치모산의 존재시 Patient 3 혈청에서 프로-인자 D의 분열을 유발하는 한편, MASP-3의 비활성 (치모겐) 형태는 그렇지 않다. 결국, 도 57에서 도시된 바와 같이, MASP-3 mAb 4D5는 활성 rMASP-3의 존재시 Patient 3 혈청에서 프로-인자 D의 분열을 차단한다. 이 결과는 APC의 활성화시 프로-인자 D의 분열에서의 MASP-3의 역할을 더 입증하고, MASP-3 억제 mAb가 MASP-3 매개된 프로-인자 D 분열을 차단하고 이로써 APC를 차단할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 17
생체 내에서 APC를 억제할 수 있는 능력에 대한 대표적인 MASP-3 억제 mAb 10D12 및 13B1의 분석
1. 생체 내에서 mAb M3-1 (13B1) 및 10D12에 의한 APC의 억제:
방법:
생체 내에서 APC를 억제하는 MASP-3 mAb 13B1 (M3-1) 및 10D12의 효능을 결정하기 위해서, 마우스의 군 (n = 4)은 10 mg/kg mAb 13B1의 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사를 받았고 마우스의 두 번째 군 (n=4)은 10 mg/kg mAb 10D12의 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사를 받았다. 동물로부터 수거된 혈액을 혈청을 제조하는데 사용하여, 치모산 입자 상의 C3 (또한 C3b 및 iC3b, Dako F020102-2) 침착의 수준을 측정하는 생체 외 검정에서 APC 활성의 유동 세포 분석 평가를 위한 매트릭스를 제공한다. 투여 전 시점 및 다회수 투여 후 시점 (96 hrs, 1주, 및 2주)에 수확된 혈액으로부터 제조된 혈청을 7.5%로 희석하였고 치모산 입자 (0.1 mg/mL 최종)를 추가하여 APC를 유도하였다. 항체-처리된 마우스를 단일 정맥내 용량의 비히클이 제공된 대조군 마우스의 군 (n = 4)과 비교하였다.
결과:
도 58은 야생형 마우스에서 mAb M3-1 (13B1), mAb 10D12, 또는 비히클의 단일 투여 후 다양한 시점에서 치모산 입자 상의 C3 침착의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 58에서 도시된 바와 같이, 투여 전 시점에서 세 가지 조건은 비슷한 수준의 APC 활성을 나타낸다. 96시간 및 그 이후 두 개의 시점에서, mAb-처리된 군은 전신 APC 활성의 거의 완전한 제거를 나타내는 한편, 비히클-처리된 군의 APC 활성은 줄어들지 않았다.
이 결과들은 MASP-3 mAb M3-1 (13B1) 및 mAb 10D12가 마우스 생체 내에서 APC의 강력한 억제자임을 입증한다.
2. MASP-3 mAb 10D12로 처리된 마우스에서 인자 B의 상태
방법:
활성 단백질 가수분해 효소로의 인자 B 치모겐의 전환 중에, 인자 B를 인자 D에 의해 Ba (~30 kDa) 및 Bb (~60 kDa) 단편으로 분열시킨다. MASP-3 mAb 10D12로 처리된 마우스로부터 얻어진 마우스 혈청에서 Ba 단편의 상태를 다음과 같이 결정하였다.
마우스 (n=4)에 2회의 10 mg/kg mAb 10D12의 정맥내 꼬리 정맥 주사를 제공하였다. 처리는 7일 간격으로 이루어졌고 혈액을 2차 주사 후 3일에 동물로부터 수거하였다. 네 마리의 마우스의 두 번째 세트는 단일 정맥내 용량의 비히클 (PBS)을 받았다. 두 군으로부터 수거된 혈액을 사용하여 혈청을 제조하여, 보체 활성화에 대한 매트릭스를 제공한다. 치모산 입자 (0.1 mg/mL 최종)를 희석된 혈청에 추가하고 (7.5% 최종) 37℃에서 35분 동안 인큐베이션하였다.
결과:
APC 활성화의 수단으로서, 도 59는 mAb 10D12 또는 PBS로 처리되고 치모산으로 자극된 마우스로부터 얻어진 마우스 혈청에서 Ba 단편의 상태를 분석하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 59의 각 레인은 상이한 마우스를 대표하고, 비교의 목적을 위해 MASP-3 mAb-처리된 마우스에 인접한 대표적인 비히클 마우스의 혈청을 교대로 나타낸다. 비히클 또는 mAb 10D12로 처리된 마우스의 두 개의 대조군 조건은 치모산의 부재시 혈청 샘플에 존재하는 Ba의 기저 수준의 대표로서 각각 레인 1 및 2에서 나타난다 (블롯의 왼측면에서부터 시작한다). 레인 3 내지 10은 모두 치모산과 함께 인큐베이션한 후 존재하는 Ba 단편의 수준을 나타낸다. 모든 경우에, MASP-3 mAb-처리된 마우스는 비히클-처리된 동물과 비교하여 Ba 단편의 감소된 수준을 입증한다.
3. mAb 10D12로 처리된 마우스의 혈청은 용혈을 억제한다
방법:
MASP-3 억제 항체에 의한 APC 억제의 또 다른 수단으로서, 발명자들은 비히클 대조군 처리된 마우스의 혈청과 비교하여 대표적인 MASP-3 mAb 10D12로 처리된 마우스의 혈청에서 토끼 적혈구의 용해를 차단할 수 있는 MASP-3 항체의 능력을 평가하였다.
마우스 (n=4/군)에 3회의 비히클 대조군 (PBS), 10 mg/kg MASP-3 mAb 10D12, 또는 25 mg/kg MASP-3 mAb 10D12의 정맥내 꼬리 정맥 주사를 제공하였다. 처리는 7일 간격으로 이루어졌고 혈액을 3차 주사 후 3일에 동물로부터 수거하였다. 혈액을 사용하여 혈청을 제조하여, 용혈 반응을 위한 매트릭스를 제공한다. 적혈구 (2.5 x 108 세포/mL 최종)를 GVB + Mg/EGTA (20 nM)에서 네 마리의 마우스의 20% 풀링된 혈청에 추가하였다. 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고 반응물을 희석하고 흡광도 (A405)를 측정하여 APC-매개된 용혈을 측정하였다.
결과:
도 60은 MASP-3 mAb 10D12 (10 mg/kg 또는 25 mg/kg)로 처리된 마우스 또는 비히클 대조군 처리된 마우스의 20% 혈청에 의한 용혈의 억제의 수준을 그래프로 나타낸다. 도 60에서 도시된 바와 같이, 10mg/kg 및 25 mg/kg 둘 다의 MASP-3 mAb 10D12로 처리된 마우스의 혈청은 비히클-처리된 마우스와 비교하여 1시간 테스트 기간 동안 더 적은 전제 용혈을 입증하였다.
결과의 전체적인 요약:
이 실시예에서 기술된 바와 같이, 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb 13B1 및 10D12는 생체 내에서 APC를 억제한다. 실시예 12에서 기술된 바와 같이, MASP-3 단클론성 항체 13B1 (mAb M3-1로도 불림)이 발작성 야간혈색뇨증 (PNH)과 관련된 마우스 모델에서 Crry가 없는 적혈구 세포의 생존에 분명한 이점을 제공한다는 것이 결정되었다. 실시예 13에서 기술된 바와 같이, MASP-3 mAb M3-1은 용량-의존적 방식으로 임상 관절염 점수의 발병률 및 심각도를 감소시킨다는 것이 결정되었다.
실시예 18
이 실시예는 고 효능 MASP-3 억제 mAb의 에피토프 결합 분석의 결과를 기술한다.
1. 경쟁 결합 분석
방법:
96 웰 ELISA 검정 플레이트를 MASP-1 및 MASP-3의 CCP1-CCP2 영역에 결합하는 것으로 나타난 IgG4 아이소타입 mAb인, 캡쳐 항체 αM3-259로 코팅하였다. 전장 인간 MASP-3 단백질을 캡쳐 항체 αM3-259를 통해 플레이트에 고정시켰다. 별개의 코팅되지 않은 웰에서, IgG4 아이소타입의 하나의 테스트 MASP-3 mAb2배 희석 시리즈를 일정한 농도의 IgG1 아이소타입의 또 다른 테스트 MASP-3 항체와 혼합하였다. 혼합물을 코팅된 웰이 추가하고 캡쳐된 MASP-3에 결합시켰다. 두 항체 간의 잠재적인 경쟁을 인간 IgG1 힌지 영역에 대한 HRP-컨쥬게이트된 항체 (Southern Biotech 9052-05), 및 TMB 기질 시약 세트 (BD Biosciences 555214)를 사용한 IgG1 아이소폼의 검출에 의해 결정하였다.
결과:
도 61A-61E는 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61A는 mAb 4D5 (IgG1) 및 인간 MASP-3 간의 상호작용을 차단하는 MASP-3 mAb (IgG4)를 확인하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61B는 mAb 10D12 (IgG1) 및 인간 MASP-3 간의 상호작용을 차단하는 MASP-3 mAb (IgG4)를 확인하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61C는 13B1 (IgG1) 및 인간 MASP-3 간의 상호작용을 차단하는 MASP-3 mAb (IgG4)를 확인하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61D는 mAb 1F3 (IgG1) 및 인간 MASP-3 간의 상호작용을 차단하는 MASP-3 mAb (IgG4)를 확인하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61E는 mAb 1G4 (IgG1) 및 인간 MASP-3 간의 상호작용을 차단하는 MASP-3 mAb (IgG4)를 확인하기 위한 경쟁 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸다.
도 61A 내지 61E의 데이터는 하기 표 28에서 요약되어 있다.
이 데이터는 MASP-3 mAb 4D5, 10D12, 13B1, 1A10, 1F3 및 1G4가 인간 MASP-3 상에서 공통 에피토프 또는 중첩 에피토프를 공유한다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 1G4는 MASP-3으로의 다른 다섯 개의 mAb의 결합을 차단하기 위한 매우 한정된 능력을 갖고 있지만, 상기 mAb는 MASP-3에 대한 1G4 그 자체의 결합을 거의 완벽하게 차단한다.
2. 선형 및 비연속적(discontinuous) MASP-3 에피토프를 나타내는 펩타이드로의 mAb 결합의 분석
방법:
MASP-3 mAb가 결합하는 MASP-3의 영역을 확인하기 위해 16개의 MASP-3 mAb 중 14개를 펩스캔에 의해 평가하였다. 표적 분자의 선형 및 잠재적인 비연속적 에피토프를 재구성하기 위해, 서열 번호:2 (인간 MASP-3)의 아미노산 잔기 299 내지 728에 상응하는 펩타이드의 라이브러리를 합성하였다. MASP-3의 아미노산 잔기 1-298은 면역원에 존재하지 않았고 이 분석에 포함시키지 않았다.
펩스캔 에피토프 분석은 펩타이드를 한정된 3차원 구조로 구조적으로 고정하는 CLIPS 기술의 사용을 포함하였다 (Timmerman et al., J Mol Recog. 20:283-299, 2007 및 Langedijk et al., Analytical Biochemistry 417:149-155, 2011 참조).
각각의 합성된 펩타이드로의 각 항체의 결합을 펩스캔-기반 ELISA에서 테스트하였다.
결과:
분석된 각 항체에 대한 펩스캔의 펩타이드 결합 결과는 하기 기술되고 표 4, 표 28 및 도 62-67에서 요약된다.
항체 1F3, 4B6, 4D5 및 1A10 (IA군)
중간 엄중 조건 하에서 테스트될 때, 항체 1F3, 4B6, 4D5 및 1A10은 비연속적 에피토프 모방체에 결합하고 또한 단순하고 제한된(constrained) 및 선형 모방체에 결합하였다. 데이터 분석은 항체 1F3, 4B6, 4D5 및 1A10이 모두 지배적으로 MASP-3의 펩타이드 스트레치(stretch) 498VLRSQRRDTTVI509 (서열 번호:9)를 인식한다는 것을 입증한다. 이 펩타이드는 활성 부위 히스티딘, H497에 바로 인접하게 위치한다. 비연속적 모방체를 가진 이 항체들에 대하여 얻어진 데이터는 MASP-3의 펩타이드 스트레치 544DFNIQNYNHDIALVQ558 (서열 번호:11), 639GNYSVTENMFC649 (서열 번호:13) 및 704VSNYVDWVWE713 (서열 번호:14)이 또한 결합에 기여한다는 것을 시사한다. 펩타이드 544DFNIQNYNHDIALVQ558 (서열 번호:11)은 활성 부위 아스파테이트 (D553)를 함유한다.
항체 10D12 (IB군)
중간 엄중 조건 하에서 테스트될 때, 항체 10D12는 활성 부위 히스티딘, H497에 인접한 서열인 MASP-3의 핵심 서열 498VLRSQRRDTTVI509 (서열 번호:9)을 가진 펩타이드에 결합한다.
항체 13B1 (IC군)
중간 엄중 조건 하에서 테스트될 때, 항체 13B1은 MASP-3의 펩타이드 스트레치 494TAAHVLRSQRRDTTV508 (서열 번호:10) 및 626PHAECKTSYESRS638 (서열 번호:12)을 포함하는 비연속적 에피토프를 인식하며, 펩타이드 스트레치 626PHAECKTSYESRS638 (서열 번호:12)이 단순 제한된 형태로 결합될 수도 있기 때문에 에피토프의 지배적인 부분인 것으로 보인다. 펩타이드 494TAAHVLRSQRRDTTV508 (서열 번호:10)은 활성 부위 히스티딘, H497을 포함한다.
항체 1G4 (II군)
낮은 엄중 조건 하에서 테스트될 때, 항체 1G4는 MASP-3의 펩타이드 스트레치 454RNAEPGLFPWQ464 (서열 번호:17), 514EHVTVYLGLH523 (서열 번호:19) 및 667AFVIFDDLSQRW678 (서열 번호:23)을 포함하는 비연속적 에피토프를 인식하며, 펩타이드 스트레치 667AFVIFDDLSQRW678 (서열 번호:23)이 에피토프의 지배적인 부분이다. 지배적 펩타이드는 활성 부위 세린, S664의 세 개의 아미노산 내에 위치한다.
항체 1E7 및 2D7 (IIIA군)
각각 높고 낮은 엄중 조건 하에서 테스트될 때, 항체 1E7 및 2D7은
recognize a 비연속적 에피토프 comprising
MASP-3의 펩타이드 스트레치 454RNAEPGLFPWQ464 (서열 번호:17), 514EHVTVYLGLH523 (서열 번호:19) 및 667AFVIFDDLSQRW678 (서열 번호:23)을 포함하는 비연속적 에피토프를 인식하며, 펩타이드 스트레치 667AFVIFDDLSQRW678 (서열 번호:23)이 에피토프의 지배적인 부분이고 활성 부위 세린, S664의 세 개의 아미노산 내에 위치한다.
항체 2F5 및 15D9 (IIIB군)
낮은 엄중 조건 하에서 테스트될 때, 항체 2F5 및 15D9는 MASP-3의 펩타이드 스트레치 454RNAEPGLFPWQ464 (서열 번호:17), 479KWFGSGALLSASWIL493 (서열 번호:18), 562PVPLGPHVMP571 (서열 번호:20) 및 667AFVIFDDLSQRW678 (서열 번호:23)을 포함하는 비연속적 에피토프를 지배적으로 인식한다. 펩타이드 479KWFGSGALLSASWIL493 (서열 번호:18) 및 667AFVIFDDLSQRW678 (서열 번호:23)은 각각 활성 부위 잔기 H497 및 S664의 네 개 또는 세 개의 아미노산 내에 위치한다.
항체 1B11 (IIIC군)
중간 엄중 조건 하에서 테스트될 때, 항체 1B11은 MASP-3의 펩타이드 스트레치 435ECGQPSRSLPSLV447 (서열 번호:16), 454RNAEPGLFPWQ464 (서열 번호:17), 583APHMLGL589 (서열 번호:21) 및 614SDVLQYVKLP623 (서열 번호:22)을 포함하는 비연속적 에피토프를 인식한다.
에피토프 결합 분석의 요약
MASP-3 mAb 참조 번호/군 인간 MASP-3 (w/선도) 상의 펩타이드 결합 단편 (에피토프) 다음과 경쟁함 펩타이드 분열 검정
4D5
IA군		 498VLRSQRRDTTVI509 (SIN:9)
544DFNIQNYNHDIALVQ558 (SIN:11)
639GNYSVTENMFC649 (SIN:13)
704VSNYVDWVWE713 (SIN:14)		 1F3, 1G4, 4D5, 10D12, 13B1 억제한다
1F3
IA군		 498VLRSQRRDTTVI509 (SIN:9)
544DFNIQNYNHDIALVQ558 (SIN:11)
639GNYSVTENMFC649 (SIN:13)
704VSNYVDWVWE713 (SIN:14)		 1F3, 1G4, 4D5, 10D12, 13B1 억제한다
4B6
IA군		 498VLRSQRRDTTVI509 (SIN:9)
544DFNIQNYNHDIALVQ558 (SIN:11)
639GNYSVTENMFC649 (SIN:13)
704VSNYVDWVWE713 (SIN:14)		 1F3, 1G4, 4D5, 10D12, 13B1 억제한다
1A10
IA군		 498VLRSQRRDTTVI509 (SIN:9)
544DFNIQNYNHDIALVQ558 (SIN:11)
639GNYSVTENMFC649 (SIN:13)
704VSNYVDWVWE713 (SIN:14)		 1F3, 1G4, 4D5, 10D12, 13B1 억제한다
10D12
IB군		 498VLRSQRRDTTVI509 (SIN:9) 1F3, 1G4, 4D5, 10D12, 13B1 억제한다
13B1
IC군
 494TAAHVLRSQRRDTTV508 (SIN:10)
626PHAECKTSYESRS638 (SIN:12)		 1F3, 1G4, 4D5, 10D12, 13B1 억제한다
I군
핵심 서열		 498VLRSQRRDTTV508 (SIN:15)
1G4
II군-
I군 및 III군과 교차 경쟁함		 454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
514EHVTVYLGLH523 (SIN:19)
667AFVIFDDLSQRW678 (SIN:23)		 1F3, 1G4, 4D5, 10D12, 13B1 억제한다
1E7
IIIA군		 454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
514EHVTVYLGLH523 (SIN:19)
667AFVIFDDLSQRW678 (SIN:23)		 1G4 약하게 억제한다
2D7
IIIA군		 454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
514EHVTVYLGLH523 (SIN:19)
667AFVIFDDLSQRW678 (SIN:23)		 약하게 억제한다
2F5
IIIB군

 454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
479KWFGSGALLSASWIL493(SIN 18)
562PVPLGPHVMP571 (SIN:20)
667AFVIFDDLSQRW678 (SIN:23)		 효과 없음
15D9
IIIB군		 454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
479KWFGSGALLSASWIL493(SIN 18)
562PVPLGPHVMP571 (SIN:20)
667AFVIFDDLSQRW678 (SIN:23)		 효과 없음
1B11
IIIC군		 435ECGQPSRSLPSLV447 (SIN:16)
454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
583APHMLGL589 (SIN:21)
614SDVLQYVKLP623 (SIN:22)		 자극한다
II군 및 III군에 대한 핵심 서열 454RNAEPGLFPWQ464 (SIN:17)
2F2
IV군		 결합 에피토프 미결정 1F3, 4D5, 11B6, 2F2 자극한다
11B6
IV군		 결합 에피토프 미결정 1F3, 4D5, 11B6, 2F2 효과 없음
도 62는 펩스캔 분석에 의해 결정된 바와 같이 MASP-3 mAb에 의한 인간 MASP-3 상의 접촉 영역을 나타내는 개략도를 제공한다. 도 62에서 도시된 바와 같이, 모든 MASP-3 mAb는 MASP-3의 SP 도메인을 함유하는 베타 사슬 내에 접촉 영역을 갖는다. 하나의 mAb, 1B11은 또한 MASP-3의 알파 사슬 내 CCP2 및 SP 도메인 사이에서 접촉 영역을 갖는다. 도 63A 내지 67은 인간 MASP-3의 CCP1/2/SP 도메인 상에 고 친화도 MASP-3 mAb의 접촉 영역을 나타내는 3-D 모델을 도시하며, MASP-3의 SP 도메인 활성 부위는 정면을 향하고 있고 촉매 트라이어드(triad)는 측쇄로서 나타낸다.
도 63A는 aa 잔기 498-509 (서열 번호:9), aa 잔기 544-558 (서열 번호:11), aa 잔기 639 내지 649 (서열 번호:13) 및 aa 잔기 704 내지 713 (서열 번호:14)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 1F3, 4D5 및 1A10 사이의 접촉 영역을 도시한다.
도 63B는 aa 잔기 498 내지 509 (서열 번호:9)를 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 10D12 사이의 접촉 영역을 도시한다.
도 64는 잔기 494 내지 508 (서열 번호:10) 및 aa 잔기 626 내지 638 (서열 번호: 12)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 13B1 사이의 접촉 영역을 도시한다.
도 65는 잔기 435 내지 447 (서열 번호:16), aa 잔기 454 내지 464 (서열 번호:17), aa 잔기 583 내지 589 (서열 번호:21) 및 aa 잔기 614 내지 623 (서열 번호:22)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 1B11 사이의 접촉 영역을 도시한다.
도 66은 aa 잔기 454 내지 464 (서열 번호:17), aa 잔기 514 내지 523 (서열 번호:19) 및 aa 잔기 667 내지 678 (서열 번호:23)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 1E7, 1G4 및 2D7 사이의 접촉 영역을 도시한다.
도 67은 aa 잔기 454 내지 464 (서열 번호:17), aa 잔기 479 내지 493 (서열 번호:18), aa 잔기 562 내지 571 (서열 번호:20), 및 aa 잔기 667 내지 678 (서열 번호:23)을 포함하는, 인간 MASP-3 및 고 친화도 MASP-3 mAb 15D9 및 2F5 사이의 접촉 영역을 도시한다.
요약하면, 결론적인 결합 프로파일을 14개의 항체 중 12개에 대하여 얻었다. 모두 12개의 맵핑된 항체는 펩티다아제 S1 도메인 내에서 용매 노출된 에피토프를 인식하였다. 활성 부위 촉매 트라이어드 (H497, D553, S664)에 대한 잔기에 대한 많은 에피토프 결정요인의 인접함은 고 친화도 억제 MASP-3 mAb가 효소-기질 상호작용을 방해하여 효소 활성을 차단하는 모델과 일치한다.
실시예 19
이 실시예는 대표적인 MASP-3 mAb의 인간화 및 잠재적 번역 후 변형 부위의 조작을 기술한다.
방법:
1. 대표적인 고 친화도 MASP-3 mAb의 인간화
방법:
면역원성 위험을 감소시키기위해, 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 항체 4D5, 10D12 및 13B1를 CDR-이식 방법으로 인간화하였다. 각각의 MASP-3 항체의 CDR을 가장 가까운 공통 인간 프레임워크 서열로 이식하였다. 버니어 구역(Vernier zone) 잔기의 일부를 Quickchange 부위-관련 돌연변이 유발에 의해 변형시켰다 (Agilent Technologies). 결과로 생성된 인간화된 VH 및 VL 영역을 pcDNA3.1-기반 인간 IgG1 또는 IgG4 및 IgK 발현 구조체로 옮기고, 재조합 항체를 상기 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 인간화된 항체의 친화도를 1가 Fab 단편을 사용하는 ELISA에 의해 결정하였고, 효능을 온전한 IgG4 포맷을 사용하는 C3 침착 검정으로 평가하였다.
결과:
mAb 4D5, 10D12 및 13B1에 대한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 대표적인 인간화된 버젼의 아미노산 서열이 하기 제공된다. CDR (카바트)은 밑줄 그어져 있다.
4D5:
h4D5_VH-14 (서열 번호:248)
Figure pat00090
h4D5_VH-19 (서열 번호:249)
Figure pat00091
h4D5_VL-1 (서열 번호:250)
Figure pat00092
10D12:
h10D12_VH-45 (서열 번호:251)
Figure pat00093
h10D12_VH-49 (서열 번호:252)
Figure pat00094
h10D12_VL-21 (서열 번호:253)
Figure pat00095
13B1
h13B1_VH-9 (서열 번호:254)
Figure pat00096
h13B1_VH-10 (서열 번호:255)
Figure pat00097
h13B1_VL-1 (서열 번호:256)
Figure pat00098
인간 MASP-3에 대한 대표적인 인간화된 4D5, 10D12 및 13B1 항체의 친화도는 하기 표 29에서 나타난다.
MASP-3으로의 대표적인 인간화된 MASP-3 mAb의 결합
MASP-3 항체 클론
(Fab 포맷) 		인간 MASP-3으로의 결합
EC 50 (nM)
4D5 모체 Fab 0.107
h4D5_14-1 Fab
(VH-14 및 VL-1)		 0.085
h4D5_19-1 Fab
(VH-19 및 VL-1)		 0.079
10D12 모체 Fab 0.108
h10D12_45-21 Fab
(VH-45 및 VL-21)		 0.108
h10D12_49-21 Fab
(VH-49 및 VL-21)		 0.115
13B1 모체 Fab 0.123
h13B1_9-1 Fab
(VH-9 및 VL-1)		 0.101
h13B1_10-1 Fab
(VH-10 및 VL-1)		 0.097
인간 생식세포 계열 프레임워크 서열에 대한 인간화된 프레임워크 서열의 퍼센트 동일성:h4D5_VH-14=90%; h4D5_VH-19=91%; h4D5_VL-1=100%;
h10D12_VH-45=92%; h10D12_VH-49=91%; h10D12_VL-21=93%;
h13B1_VH-9=95%; h13B1_VH-10=94%; h13B1_VL-1=100%
2. 4D5, 10D12 및 13B1의 경쇄 가변 영역의 CDR-1에서 Asn/Asp 변형 부위를 제거하기 위한 대표적인 MASP-3 mAb의 돌연변이 유발
대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb 4D5, 10D12 및 13B1을 번역 후 변형에 대하여 분석하였다. 연속된 글리신, 세린, 히스티딘, 알라닌 또는 아스파라긴을 갖는 아스파라긴 잔기 ("NG", "NS", "NH", "NA", 또는 "NN" 모티프)는 종종 아스파라긴 측쇄의 아미드 기의 가수분해, 또는 "탈아미드화"에 민감하다. 연속된 글리신 또는 프롤린 ("DG" 또는 "DP" 모티프)을 가진 아스파르트산 잔기는 종종 상호 전환, 또는 "이성질체화"에 민감하다. 이러한 변형은 전하 이질성을 초래하고 결합 계면에서 발생하면 항체 기능에 영향을 줄 수도 있다. 그것들은 또한 단편화, 면역원성 및 응집의 위험을 증가시킬 수도 있다.
잠재적 번역 후 변형 모티프를 4D5, 10D12 및 13B1의 경쇄 가변 영역의 CDR-1에서 확인하였다.
4D5 및 13B1은 경쇄의 CDR1에서 하나의 가능한 Asn 탈아미드화 부위 (하기 표 30에서 밑줄 그어져 있는 서열 번호:142의 위치 8 및 9에서 "NS"로 나타남)를 함유하였다. 하기 표 30에서 추가로 나타난 바와 같이, 10D12는 경쇄의 CDR1에서 하나의 가능한 Asp 이성질체화 부위를 함유하였다.
이들 MASP-3의 인간화된 버젼의 변이체를 표 30에서 도시된 바와 같이 부위-관련 돌연변이 유발에 의해 생성하였다. 변이체를 상기 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 1가 Fab 단편을 사용하는 ELISA에 의해 친화도를 결정하였고, 효능을 상기 기술된 바와 같이 온전한 IgG4 포맷을 사용하는 C3 침착 검정으로 평가하였다.
4D5, 10D12 및 13B1에 대한 CDR-L1의 변이체
항체 영역 서열
4D5 모체 LC-CDR1 KSSQSLLNSRTRKNYLA (서열 번호:142)
4D5-NQ 돌연변이 LC-CDR1 KSSQSLLQSRTRKNYLA (서열 번호:257)
4D5-NA 돌연변이 LC-CDR1 KSSQSLLASRTRKNYLA (서열 번호:258)
4D5-ST 돌연변이 LC-CDR1 KSSQSLLNTRTRKNYLA (서열 번호:259)
13B1 모체 LC-CDR1 KSSQSLLNSRTRKNYLA (서열 번호:142)
13B1-NQ LC-CDR1 KSSQSLLQSRTRKNYLA (서열 번호:257)
13B1-NA LC-CDR1 KSSQSLLASRTRKNYLA (서열 번호:258)
13B1-ST LC-CDR1 KSSQSLLNTRTRKNYLA (서열 번호:259)
4D5, 13B1 및 변이체에 대한 공통 서열 LC-CDR1 KSSQSLLXXRTRKNYLA (서열 번호:260)
여기서 위치 8의 X는 N, Q 또는 A이고;
위치 9의 X는 S 또는 T이다
10D12 모체 LC-CDR1 KSSQSLLDSDGKTYLN (서열 번호:153)
10D12-DE 돌연변이 LC-CDR1 KSSQSLLDSEGKTYLN (서열 번호:261)
10D12-DA 돌연변이 LC-CDR1 KSSQSLLDSAGKTYLN (서열 번호:262)
10D12-GA 돌연변이 LC-CDR1 KSSQSLLDSDAKTYLN (서열 번호:263)
35C1 LC-CDR1 KSSQSLLDSDGKTYLS (서열 번호:159)
10D12, 35C1 및 변이체의 공통 서열 LC-CDR1 KSSQSLLDSXXKTYLX (서열 번호:215)
여기서 위치 10의 X는 D, E 또는 A이고;
위치 11의 X는 G 또는 A이고; 및
위치 16의 X는 N 또는 S이다
인간 MASP-3에 대한 인간화된 4D5, 10D12 및 13B1 mAb의 돌연변이 유발된 후보의 결합
MASP-3 항체 클론
(Fab 포맷) 		인간 MASP-3으로의 결합
EC 50 (pM)
h4D5_19-1 모체 Fab
(VH-19 및 VL-1)		 102
h4D5-19-1-NQ Fab
(VH-19 및 VL-1-NQ)		 732
h4D5-19-1-NA Fab
(VH-19 및 VL-1-NA)		 122
h4D5-19-1-ST Fab
(VH-19 및 VL-1-ST)		 151
h10D12_45-21 모체 Fab
(VH-45 및 VL-21)		 108
h10D12-45-21-DE Fab
(VH-45 및 VL-21-DE)		 326
h10D12-45-21-DA Fab
(VH-45 및 VL-21-DA)		 294
h10D12-45-21-GA Fab
(VH-45 및 VL-21-GA)		 181
h13B1_10-1 모체 Fab
(VH-10 및 VL-1)		 100
h13B1_10-1-NQ Fab
(VH-10 및 VL-1-NQ)		 138
h13B1_10-1-NA Fab
(VH-10 및 VL-1-NA)		 105
h13B1_10-1-ST Fab
(VH-10 및 VL-1-ST)		 120
MASP-3 항체 인간화된 VH 서열 (CDR 및 FR 영역, 카바트)
항체 HC FR1 HC CDR1
4D5 모체
(SIN:24)		 QVQLKQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFT
(서열 번호:55)		 TDDIN
(서열 번호:56)
h4D5_VH-14
(SIN:248)		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
(서열 번호:264)		 TDDIN
(서열 번호:56)
h4D5_VH-19
(SIN:249)		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
(서열 번호:264) 		TDDIN
(서열 번호:56)
10D12 모체
(SIN:28)		 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFT
(서열 번호:71)		 SYGMS
(서열 번호:72)
h10D12_VH-45
(SIN:251)		 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFT
(서열 번호:269)		 SYGMS
(서열 번호:72)
h10D12-VH-49
(SIN:252)		 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFT
(서열 번호:269)		 SYGMS
(서열 번호:72)
13B1 모체
(SIN:30)		 QVQLKQSGAELMKPGASVKLSCKATGYTFT
(서열 번호:83)		 GKWIE
(서열 번호:84)
h13B1_VH-9
(SIN:254)		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
(서열 번호:273)		 GKWIE
(서열 번호:84)
h13B1_VH-10
(SIN:255)		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
(서열 번호:273)		 GKWIE
(서열 번호:84)
항체 HC FR2 HC CDR2
4D5 모체 WVKQRPGQGLEWIG(서열 번호:57)
 WIYPRDDRTKYNDKFKD
(서열 번호:58)
h4D5_VH-14 WVRQAPGQGLEWIG(서열 번호:265)
 WIYPRDDRTKYNDKFKD
(서열 번호:58)
h4D5_VH-19 WVRQAPGQGLEWIG(서열 번호:265)
 WIYPRDDRTKYNDKFKD
(서열 번호:58)
10D12 모체 WVRQAPGKGLKWMG(서열 번호:73)
 WINTYSGVPTYADDFKG
(서열 번호:74)
h10D12_VH-45 WVRQAPGKGLKWMG(서열 번호:73)
 WINTYSGVPTYADDFKG
(서열 번호:74)
h10D12-VH-49 WVRQAPGKGLKWMG(서열 번호:73)
 WINTYSGVPTYADDFKG
(서열 번호:74)
13B1 모체 WVKQRPGHGLEWIG(서열 번호:85)
 EILPGTGSTNYNEKFKG
(서열 번호:86)
h13B1_VH-9 WVRQAPGQGLEWIG(서열 번호:274)
 EILPGTGSTNYAQKFQG
(서열 번호:275)
h13B1_VH-10 WVRQAPGQGLEWIG(서열 번호:274)
 EILPGTGSTNYNEKFKG
(서열 번호:86)
항체 HC FR3 HC CDR3
4D5 모체 KATLTVDTSSNTAYMDLHSLTSEDSAVYFCSS
(서열 번호:59)		 LEDTY
(서열 번호:60)
h4D5_VH-14 KATLTVDTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSS
(서열 번호:266)		 LEDTY
(서열 번호:60)
h4D5_VH-19 RATLTVDTSSNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSS
(서열 번호:267)		 LEDTY
(서열 번호:60)
10D12 모체 RFAFSLETSARTPYLQINNLKNEDTATYFCAR
(서열 번호:75)		 GGEAMDY
(서열 번호:76)
h10D12_VH-45 RFVFSLDTSVRTPYLQISSLKAEDTAVYFCAR
(서열 번호:270)		 GGEAMDY
(서열 번호:76)
h10D12-VH-49 RFVFSLDTSVRTPYLQISSLKAEDTATYFCAR
(서열 번호:271)		 GGEAMDY
(서열 번호:76)
13B1 모체 KATFTADSSSNTAYMQLSSLTTEDSAMYYCLR
(서열 번호:87)		 SEDV
(서열 번호:88)
h13B1_VH-9 RATFTADSSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLR
(서열 번호:276)		 SEDV
(서열 번호:88)
h13B1_VH-10 RATFTADSSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLR
(서열 번호:276)		 SEDV
(서열 번호:88)
항체 HC FR4
4D5 모체 WGQGTLVAVSS
(서열 번호:61)
h4D5_VH-14 WGQGTLVTVSS
(서열 번호:268)
h4D5_VH-19 WGQGTLVTVSS
(서열 번호:268)
10D12 모체 WGQGTSVTVSS
(서열 번호:77)
h10D12_VH-45 WGQGTLVTVSS
(서열 번호:272)
h10D12-VH-49 WGQGTLVTVSS
(서열 번호:272)
13B1 모체 WGTGTTVTVSS
(서열 번호:89)
h13B1_VH-9 WGQGTLVTVSS
(서열 번호:277)
h13B1_VH-10 WGQGTLVTVSS
(서열 번호:277)
변이체를 가진 대표적인 인간화된 경쇄 가변 영역: h4D5_VL-1-NA (서열 번호:278)
Figure pat00099
h10D12_VL-21-GA (서열 번호:279)
Figure pat00100
h13B1_VL-1-NA (서열 번호:280)
Figure pat00101
MASP-3 항체 인간화된 VL 서열 (CDR 및 FR 영역, 카바트) [플러스 LC-CDR1의 변이체]
항체 LC FR1 LC CDR1
4D5 모체
(SIN:40)		 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMTC
(서열 번호:141)		 KSSQSLLNSRTRKNYLA
(서열 번호:142)
h4D5_VL-1
(SIN:250)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC
(서열 번호:281)		 KSSQSLLNSRTRKNYLA
(서열 번호:142)
h4D5_VL-1-NA
(SIN:278)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC
(서열 번호:281)		 KSSQSLLASRTRKNYLA
(서열 번호:258)
10D12 모체
(SIN:43)		 DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISC
(서열 번호:152)		 KSSQSLLDSDGKTYLN
(서열 번호:153)
h10D12_VL-21
(SIN:253)		 DVLMTQTPLSLSVTPGQPASISC
(서열 번호:285)		 KSSQSLLDSDGKTYLN
(서열 번호:153)
h10D12_VL-21-GA
(SIN:279)		 DVLMTQTPLSLSVTPGQPASISC
(서열 번호:285)		 KSSQSLLDSDAKTYLN
(서열 번호:263)
13B1 모체 DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC
(서열 번호:151)		 KSSQSLLNSRTRKNYLA
(서열 번호:142)
h13B1_VL-1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC
(서열 번호:281)		 KSSQSLLNSRTRKNYLA
(서열 번호:142)
h13B1_VL-1-NA DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC
(서열 번호:281)		 KSSQSLLASRTRKNYLA
(서열 번호:258)
항체 LC FR2 LC CDR2
4D5 모체 WYQQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:143)		 WASTRES
(서열 번호:144)
h4D5_VL-1 WYQQKPGQPPKLLIY
(서열 번호:282)		 WASTRES
(서열 번호:144)
h4D5_VL-1-NA WYQQKPGQPPKLLIY
(서열 번호:282)		 WASTRES
(서열 번호:144)
10D12 모체 WLLQRPGQSPKRLIY
(서열 번호:154)		 LVSKLDS
(서열 번호:155)
h10D12_VL-21 WLLQRPGQSPKRLIY
(서열 번호:154)		 LVSKLDS
(서열 번호:155)
h10D12_VL-21-GA WLLQRPGQSPKRLIY
(서열 번호:154)		 LVSKLDS
(서열 번호:155)
13B1 모체 WYQQKPGQSPKLLIY
(서열 번호:143)		 WASTRES
(서열 번호:144)
h13B1_VL-1 WYQQKPGQPPKLLIY
(서열 번호:282)		 WASTRES
(서열 번호:144)
h13B1_VL-1-NA WYQQKPGQPPKLLIY
(서열 번호:282)		 WASTRES
(서열 번호:144)
항체 LC FR3 LC CDR3
4D5 모체 GVPDRFTGSGSGTDFSLTISSVQAEDLAVYYC
(서열 번호:145)		 KQSYNLYT
(서열 번호:146)
h4D5_VL-1 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
(서열 번호:283)		 KQSYNLYT
(서열 번호:146)
h4D5_VL-1-NA GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
(서열 번호:283)		 KQSYNLYT
(서열 번호:146)
10D12 모체 GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC
(서열 번호:156)		 WQGTHFPWT
(서열 번호:157)
h10D12_VL-21 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
(서열 번호:286)		 WQGTHFPWT
(서열 번호:157)
h10D12_VL-21-GA GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
(서열 번호:286)		 WQGTHFPWT
(서열 번호:157)
13B1 모체 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC
(서열 번호:150)
 KQSYNIPT
(서열 번호:161)
h13B1_VL-1 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
(서열 번호:283)		 KQSYNIPT
(서열 번호:161)
h13B1_VL-1-NA GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
(서열 번호:283)		 KQSYNIPT
(서열 번호:161)
항체 LC FR4
4D5 모체 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
h4D5_VL-1 FGQGTKVEIKR
(서열 번호:284)
h4D5_VL-1-NA FGQGTKVEIKR
(서열 번호:284)
10D12 모체 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
h10D12_VL-21 FGQGTKVEIKR
(서열 번호:287)
h10D12_VL-21-GA FGQGTKVEIKR
(서열 번호:287)
13B1 모체 FGGGTKLEIKR
(서열 번호:147)
h13B1_VL-1 FGQGTKVEIKR
(서열 번호:284)
h13B1_VL-1-NA FGQGTKVEIKR
(서열 번호:284)
실시예 20다발성 경화증의 마우스 모델에서 대표적인 MASP-3 억제 mAb 13B1의 분석
배경/근거: 후천적 염증 및 탈수초성 자가면역 장애인 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)의 확립된 동물 모델이다. APC가 EAE의 발달/진행에 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 증거가 인자 B-중화 항체로 처리된 마우스에서 질환이 약화된다는 보고에 의해 제공되었다 (Hu et al., Mol. Immunol. 54:302, 2013). 이 실시예는 EAE 모델에서 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 항체, 13B1의 분석을 기술한다.
방법:
EAE 유도:
이 연구에서 EAE를 유도하기 위해 Hooke Laboratories (Lawrence, MA)에서 구입한, EAE 유도용 키트를 사용하였다. 이 키트는 완전 프로이트 보조제 (CFA), 뿐만 아니라 백일해(pertussis) 독소 내에 신경 항원 MOG35-55를 함유하였다.
30마리의 야생형 C57 Bl/6J 암컷 마우스를 이 연구에 사용하였고 EAE 유도 전에 적어도 1주 동안 시설에 적응시켰다. 마우스는 유도시 대략 10주령이었다. 하기 표 34에서 도시된 바와 같이, 유도시, 각 마우스는 MOG35-55의 2회의 100 μL 피하 (sc) 주사 및 100 μL (400 ng) 백일해 독소의 1회 복강내 (ip) 주사를 받았다. 백일해 독소의 2차 주사를 1차 주사 후 24시간에 투여하였다.
처리: 30마리의 마우스를 10마리씩 3개의 군으로 나누고 무관한 아이소타입 대조군 mAb 10 mg/kg i.v.); mAb 13B1 (항-MASP-3, 10 mg/kg i.v.) 또는 mAb 1379 (항-인자 B (Hu et al., Mol. Immunol. 54:302, 2013) 40 mg/kg i.p.)로 처리하였다. 표 34에서 도시된 바와 같이, 아이소타입 대조군 mAb 및 MASP-3 mAb 13B1로의 투약은 매주 이루어지며 제-16 일에 시작하여 제+12 일에 끝났다. mAb 1379의 투약은 Hu et al., Mole Immunol 54:302-308, (2013)에서 기술된 투약 일정에 따라 제+3 일에서 제+11까지 격일마다 이루어졌다.
MASP-3 mAb 13B1을 이용한 EAE 실험에 대한 실험 방법
투여일 백일해 독소
400 ng i.p.		 MOG 펩타이드 35-55
250 μg		 mAb 1379
(항-인자 B)
40 mg i.p.		 아이소타입 대조군 mAb
10 mg/kg i.v.		 mAb 13B1
(항-MASP-3)
10 mg/kg i.v.
-16 + +
-9 + +
-2 + +
0 + +
+1 +
+3 +
+5 + + +
+7 +
+9 +
+11 +
+12 + +
채점: 증상이 나타날 때까지 격일마다 마우스를 체크하였으며, 그 이후에는 매일 체크하였다. 질환의 최초 징후는 예상된 바와 같이 면역화 이후 7-12일에 나타났다. 마우스를 하기 표 35에서 나타난 등급에 따라 채점하였다.
EAE 모델 채점 기준
점수 임상적 관찰
0.0 면역화되지 않은 마우스와 비교하여 마우스의 운동 기능에서 명백한 변화 없음. 꼬리 밑단을 잡고 들어올릴 때, 꼬리는 긴장감이 있고 곧게 서있다. 뒷다리는 보통 벌어져 있다. 마우스가 걸을 때, 보행 또는 머리 기울임이 없다.
0.5 꼬리 끝이 흐물흐물하다. 꼬리 밑단을 잡고 마우스를 들어올릴 때, 꼬리는 끝을 제외하고는 긴장감이 있다. 꼬리에서 근육 긴장이 느껴지는 한편, 꼬리를 계속해서 움직다.
1.0 흐물흐물한 꼬리. 꼬리 밑단을 잡고 마우스를 들어올릴 때, 곧게 서있는 대신에, 전체 꼬리가 손가락 위로 늘어진다. 뒷다리는 보통 벌어져 있다. 꼬리 움직임의 징후가관찰되지 않는다.
1.5 흐물흐물한 꼬리 및 뒷다리 억제. 꼬리 밑단을 잡고 들어올릴 때, 전체 꼬리가 손가락 위로 늘어진다. 마우스가 와이어랙(wire rack)으로 떨어질 때, 적어도 하나의 뒷다리는 일관되게 떨어진다. 걸음걸이가 아주 약간 흔들린다.
2.0 꼬리 밑단을 잡고 들어올릴 때, 다리가 벌어지지 않지만, 서로 밀착된다. 마우스가 걷는 것이 관찰될 때, 분명히 흔들리는 걸음걸이를 갖는다. 한쪽 발에서는 발가락이 끌릴 수도 있지만, 다른쪽 다리의 움직임이 명확하게 억제되지 않는다;
또는
마우스는 0.0점인 것으로 보이지만, 걷는 것이 관찰될 때 머리 기울임의 명백한 징후가 나타난다. 균형이 불량하다.
2.5 흐물흐물한 꼬리 및 뒷다리 끌림. 양 뒷다리는 어느 정도 움직임을 갖지만, 발이 끌린다 (마우스는 뒷발로 이동함). - 또는 - 한쪽 다리의 움직임이 없고/한쪽 다리는 완전히 끌리지만, 다른쪽 다리는 움직인다. - 또는 - 들어올릴 때 EAE 심각도가 경증으로 보이지만 (점수 0.0-1.5점으로서), 강력한 머리 기울임으로 인해 때때로 마우스가 넘어진다.
3.0 흐물흐물한 꼬리 및 뒷다리의 완전한 마비 (가장 일반적임). - 또는 - 흐물흐물한 꼬리 및 뒷다리의 거의 완전한 마비. 한쪽 또는 양쪽 뒷다리는 패들링(paddle)이 가능하지만, 뒷다리는 엉덩이 앞으로 움직일 수 없다. - 또는 - 한쪽 앞다리 및 한쪽 뒷다리의 마비를 동반한 흐물흐물한 꼬리. - 또는 - 다음 모든 것: 심각한 머리 기울임, 케이지 가장자리를 따라서만 걸음, 케이지 벽에 대고 밀기, 꼬리 밑단을 잡고 들어올릴때 회전.
3.5 흐물흐물한 꼬리 및 완전한 뒷다리 마비. 이에 더하여, 마우스가 케이지 둘레를 따라 움직이지만, 측면으로 놓아지면, 스스로 똑바로 설 수 없다. 뒷다리는 몸의 한쪽 면에 함께 있다. - 또는 - 마우스는 케이지 둘레를 따라 움직이지만, 뒤쪽 4분의 1은 팬케이크(pancake)처럼 납작해서, 마우스 앞쪽 4분의 1이 혹처럼 보인다.
4.0 흐물흐물한 꼬리, 완전한 뒷다리 마비 및 부분적 앞다리 마비. 마우스는 케이지 둘레를 따라 최소한으로 움직이지만 경계 및 수유를 나타낸다. 2일 동안 마우스 점수가 4.0인 이후에 종종 안락사가 권장된다. 하지만, 매일 s.c. 유체로, 일부 마우스는 3.5 또는 3.0으로 회복할 수 있다. 심각한 마비로 인해 마우스가 안락사되면, 나머지 실험에서 상기 마우스에 대하여 5.0의 점수가 입력된다.
4.5 완전한 뒷다리 마비 및 부분적 앞다리 마비, 케이지 둘레의 움직임 없음. 마우스는 경계심이 없다. 마우스는 앞다리가 최소한으로 움직인다. 마우스는 접촉에 간신히 반응한다. 안락사가 권장된다. 심각한 마비로 인해 마우스가 안락사되면, 나머지 실험에서 상기 마우스에 대하여 5.0의 점수가 입력된다.
5.0 마우스는 케이지에서 자연적으로 굴러다닌다.
결과:도 68은 MASP-3 억제 mAb 13B1 (10mg/kg), 인자 B mAb 1379 (40 mg/kg) 또는 아이소타입 대조군 mAb (10 mg/kg)로 처리된 마우스에서 EAE 모델의 결과를 그래프로 나타내며, 아래쪽을 가리키는 화살표는 항-인자 B 항체의 투약을 나타내고 위쪽을 가리키는 화살표는 mAb 13B1의 최종 투여를 나타낸다. 도 68에서 도시된 바와 같이, MASP-3 억제 mAb 13B1 및 인자 B mAb 1379로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군과 비교하여 표 35에서 나타난 파라미터에 따라 채점된 임상 증상의 향상을 나타냈다.
상기 언급된 바에 따르면, MASP-3 억제 항체, 예컨대 본원에서 개시된 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 다발성 경화증, 발로 동심성 경화증(Balo concentric sclerosis), 시속척수염, 마르부르크 다발성 경화증(Marburg multiple sclerosis), 쉴더병(Schilder's disease), 종괴 형성 다발성 경화증(Tumefactive multiple sclerosis) 및 급성 산재성 뇌척수염 (acute disseminated encephalomyelitis; ADM)으로 고통받고 있는 대상체의 치료 및/또는 재활에 유익할 (신경보호 또는 신경재생) 것으로 예상된다.
실시예 21
게먹이 원숭이에서 대표적인 고 친화도 MASP-3 mAb를 이용한 약역학적 연구
배경/근거: 설치류 연구 (도 44)에서 입증된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 억제 항체는 생체 내에서 정지-상태 (휴지기) 프로-인자 D 성숙화를 억제할 수 있었다. 이 실시예는 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb가 비-인간 영장류에서 APC 활성을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해 게먹이 원숭이에서 수행된 연구를 기술한다.
방법: MASP-3는 비-인간 영장류에서 APC에서 기능하고, 고 친화도 MASP-3 항체가 비-인간 영장류에서 APC를 억제할 수 있다는 것을 확인하기 위해서, 9마리의 게먹이 원숭이 (mAb 조건 당 3마리 동물)에게 3개의 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 항체, h4D5X, h10D12X, 또는 h13B1X 중 하나로의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량을 제공하였다. ("h"는 인간화된 것을 말하고, "X"는 안정화 S228P 아미노산 치환을 함유하는 IgG4 불변 힌지 영역 (서열 번호:312) 및 S228P 돌연변이 및 또한 낮은 pH에서 FcRn 상호작용을 촉진하는 돌연변이를 가진 돌연변이 인간 IgG4 불변 영역을 말한다). 3주 이상의 기간에 걸쳐 규칙적인 간격으로 혈장 (EDTA) 및 혈청 샘플을 수거하였다.
두 가지 검정을 이용하여 처리된 원숭이의 혈청에서 APC 활성을 측정하였다. 첫 번째 검정은 희석된 혈청에 추가된 치모산 비드 상에 침착된 보체 인자 Bb의 수준을 평가하였다. 두 번째 검정은 치모산-활성화된 APC의 유체상 생성물, 보체 인자 Ba 및 Bb, 뿐만 아니라 C3a를 측정하였다.
인자 Bb 항체 A252 (Quidel)를 사용한 유동 세포 분석법을 사용하여 치모산 상에 침착된 인자 Bb를 검출하였다. APC의 완전한 억제 후 검정에서 백그라운드 신호를 결정하기 위한 수단으로서, MASP-3 mAb-처리된 게먹이 원숭이로부터 제조된 혈청 (5% 최종, GVB + Mg/EGTA에 희석됨)의 앨리쿼트를 300 nM의 억제 인자 D 항체와 혼합하였다. 원숭이에게 정맥내로 전달된 MASP-3 mAb에 의한 APC의 억제의 정도를 결정하기 위해서, 희석된 혈청의 또 다른 앨리쿼트를 치모산 상의 인자 Bb 침착을 테스트하기 전에 300 nM의 중성 아이소타입 대조군 항체 (APC 억제 활성이 없음)와 혼합하였다. 혼합된 항체-혈청 혼합물을 치모산 추가 (0.1 mg/mL 최종) 전에 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 37℃에서 65분 동안 인큐베이션하였고, 치모산 입자의 표면 상의 보체 인자 Bb (Quidel 항체 A252)의 유동 세포 분석 검출에 의해 APC 활성을 측정하였다.
유체상 마커 Ba, Bb, 및 C3a의 생성을 결정하기 위해서,
생체 외 검정에서 항-MASP-3 mAb-처리된 게먹이 원숭이로부터 제조된 혈청 (5% 최종, GVB + Mg/EGTA에 희석됨)에서 치모산 (1 mg/mL 최종)을 인큐베이션함으로써 APC를 유도하였다. 혼합물을 37℃에서 40분 동안 인큐베이션하였고, APC 활성을 보체 종점의 ELISA-기반 검출에 의해 측정하였다. 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트 (Quidel)를 사용하여 반응 상층액에서 Ba, Bb, 및 C3a를 검출하였다. 모든 테스트의 흡광도 값을 전처리 값을 100% 활성으로, 및 인큐베이션되지만, 치모산에 노출되지 않은 전처리 샘플을 5%로 설정하여 표준화하였다.
MASP-3 mAb-처리된 원숭이에서 APC 억제의 정도를 항체 대 표적 비와 연관시키기 위해서, 혈청 MASP-3 및 억제 MASP-3 mAb 수준을 정량화하였다. 혈청 MASP-3를 샌드위치 ELISA 검정에 의해 측정하였다. MASP-3 단백질을 플레이트 상에서 αM3-259로 캡쳐하였다 (실시예 16에서 기술됨). 혈청 샘플 (1:40으로 희석됨)을 먼저 37℃에서 1시간 동안 처리 mAb에 상응하는 라벨링되지 않은 (비-비오티닐화된) MASP-3 mAb와 함께 인큐베이션한 다음, 1:250 (최종 1:10,000)로 더 희석하여 플레이트에 추가하고 37℃에서 추가의 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 비오티닐화된 버젼의 mAb 10D12를 검출 항체로 사용하였다. 검출 단계 전 혈청의 대량 희석을 사용하여 표적 및 처리 mAb를 분리시키고, 처리 항체 및 검출 항체 간의 경쟁을 방지하였다. 플레이트를 여러 번 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP를 최종 검출 단계에 사용하였다. 플레이트 판독기로 A450에서 흡광도 값을 수집하였다. MASP-3 혈청 농도를 재조합, 전장 cyno MASP-3 단백질을 분석하여 생성된 표준 곡선으로부터 추정하였다. 혈청에 존재하는 항-MASP-3 항체의 양을 제조사의 지시에 따라 Human Therapeutic IgG4 ELISA Kit (Cayman Chemicals)를 사용하여 검출하였다.
웨스턴 블롯 분석을 사용하여 mAb h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리 후 시간(시간)이 흐름에 따라 게먹이 원숭이의 혈청에서 프로-인자 D 및 인자 D의 수준을 분석하였다. 간략히 기술하면, 처리 전 (-120hr, -24hr) 및 처리 후 (72hr, 168hr, 336 hr, 504hr, 672hr 및 840 hr) 상이한 시점에 얻어진 게먹이 원숭이 혈장 20 μL를 400μL의 총 부피로 4℃에서 1시간 동안 PBS 및 항-CFD 항체 (0.5 μg/μL) 11.2 μL와 혼합하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. Protein A/G Plus Agarose (Santa Cruz Biotech) 12 μL를 추가하고 혼합물을 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 1000 x g로 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 면역침강물을 수거하였다. 펠릿을 PBS로 5회 세척하였다. 최종 세척 후, 펠릿을 1x Glycoprotein Denaturing Buffer 30 μL에 재현탁시키고 당단백질을 100℃에서 10분 동안 반응물을 가열하여 변성시켰다. 10X G2 반응 버퍼, 10% NP-40 및 2.5 μL 펩타이드-N-글리코시다제 (New England Biolabs, P0704L)를 각 튜브에 추가하고 반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 아가로스 비드를 1000 x g로 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 20 μL 상층액을 새로운 튜브에 수거하였다. 캡쳐되고 탈글리코실화된 단백질을 SDS-PAGE (NuPAGE 12% Bis-Tris Mini Gel)로 분리시키고 겔을 비오티닐화된 항-CFD (R&D Systems BAF1824) 및 Pierce ™ High Sensitivity Streptavidin-HRP (Thermo Fischer Scientific 21130)로의 웨스턴 블롯 분석을 위해 전기영동하였다.
결과:
도 69는 고 친화도 MASP-3 mAb h13B1X로 시간=0에서 단일 처리 후 시간이 흐름에 따라 3마리 게먹이 원숭이의 군으로부터 얻어진 혈청 샘플에서 APC 활성을 그래프로 나타낸다. 도면은 APC-억제 인자 D mAb 또는 중성 아이소타입 대조군 mAb와 혼합된 5% 혈청에서 치모산 입자의 표면 상의 보체 인자 Bb를 검출하는 유동 세포 분석 검정에서 평균 MFI를 나타낸다. 도 69에서 도시된 바와 같이, 동물은 빠르면 4 hr에 감소된 APC 활성을 입증한다. MASP-3 항체 처리가 인자 D 억제만큼 효과적으로 APC를 차단하면, 두 개의 혼합된 항체 조건은 투여 전 (또는 시간 = 0; 도 69) 조건에서는 아니지만 투여 후 샘플에서는 Bb 침착의 동일한 수준의 억제를 입증할 것이다. 도 69에서 도시된 바와 같이, 처리 후 72 hr까지, APC 활성은 대략 혈청 샘플에 인자 D mAb를 추가하여 달성되는 정도로 감소하였다. h13B1X 처리로 인한 거의 완전한 억제는, 혼합된 인자 D 항체와 비교에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이, 투여 후 336 hr (14일)까지 지속된다. 따라서, 이 결과들은 고 친화도 MASP-3 억제 mAb로의 처리가 비-인간 영장류에서 APC의 완전하고, 지속적인 억제를 제공한다는 것을 입증한다.
도 70은, 치모산 상의 Bb 침착에 의해 결정된 바와 같이, 고 친화도 MASP-3 억제 mAb h4D5X, h10D12X 또는 h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리된 게먹이 원숭이의 군 (군 당 3마리의 동물)으로부터 얻어진 혈청 샘플에서 APG 활성을 그래프로 나타낸다. Bb 침착 데이터를 상기 기술된 바와 같이 수집하였다. 처리 시점에 대한 APC 활성을 비-억제, 아이소타입 대조군 항체와 혼합된 샘플의 전처리 MFI를 100% 활성으로서, 및 50 mM EDTA와 함께 인큐베이션된 (모든 보체 활성을 억제하기 위해) 전처리 샘플을 5%로 설정하여 표준화하였다. 도 70에 사용된 h13BX 처리 데이터는 또한 도 69에도 반영되어 있다. 도 70에서 도시된 바와 같이, 3개의 고 친화도 MASP-3 억제 항체 모두의 처리는 95%가 넘는 APC의 억제를 초래하였다. h4D5X-, h10D12X-, 및 h13B1X-처리된 동물은 각각 6.7, 11.7, 및 16일 동안 적어도 90%의 APC 억제를 유지하였다. 따라서, 이 결과들은 이들 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb로의 처리가 단일 5 mg/kg 용량으로 비인간 영장류에서 APC의 지속적인 억제를 제공한다는 것을 입증한다.
도 71A-C는 APC 활성의 추가적인 측정을 그래프로 나타낸다. 유체상 Ba (도 71A), Bb (도 71B) 및 C3a (도 71C)를 h4D5X, h10D12X, 및 h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리 후 시간이 흐름에 따라 게먹이 원숭이의 군 (군 당 3마리의 동물)으로부터 얻어진 치모산-처리된, 희석된 혈청 샘플에서 측정하였다.
도 71A-C에서 도시된 바와 같이, 3개의 고 친화도 MASP-3 억제 항체 모두의 단일 투여는 3개의 상이한 유체상 종점에 의해 한정된 바와 같이, APC의 억제를 초래하였다. 이 데이터들은 도 70의 Bb 침착 연구에서 입증된 APC 억제의 수준과 일치하고, 몇 주 동안 경로를 억제하는 이들 mAb의 효능을 추가로 예시한다.
도 72A-C는 h4D5X (도 72A), h10D12X (도 72B) 또는 h13B1X (도 72C)로 처리된 원숭이의 혈청에서 검출된 모노머 MASP-3 및 MASP-3 mAb 항체의 몰 비에 관하여, 유체상 Ba 생산에 의해 결정된 바와 같이, APC 활성의 관계를 그래프로 나타낸다. 도 72A-C의 각 패널은 한 마리 원숭이의 데이터를 나타낸다. 사용된 원숭이 대상체 및 이 연구에서 얻어진 혈청 (또는 혈장)은 상기 기술된 것과 동일하다 (도 69, 70, 및 71).
도 72A-C는, 유체상 Ba에 의해 측정된 바와 같이, 완전한 APC 억제의 시점에 표적 (MASP-3) 대 고 친화도 MASP-3 억제 항체 h4D5X (도 72A), h10D12X (도 72B) 및 h13B1X (도 72C)의 몰 비를 그래프로 나타낸다. 참고의 목적으로, 표적 대 항체의 1:1의 몰 비는 각 그래프에서 점선으로 나타난다. 도 72A-C에서 도시된 바와 같이, 약 2:1 내지 약 2.5:1 (표적 대 항체)의 범위의 몰 비에서 표적 (MASP-3) 대 고 친화도 MASP-3 억제 mAb h4D5X, h10D12X 및 h13B1X는 APC를 완전히 억제하기에 충분하다. 이 데이터들은 이들 3개의 대표적인 MASP-3 억제 mAb가 표적의 농도보다 낮은 몰 농도로 존재할 때 APC를 억제할 수 있는 강력한 고 친화도 MASP-3 억제 항체임을 입증한다. 이들 효능의 수준은 APC에 의해 유발된 질환 또는 적응증을 치료하는데 임상적으로 사용될 가능성이 있다는 것을 강력하게 나타낸다.
도 73은 mAb h13B1X의 단일 5 mg/kg 정맥내 용량으로 처리 전 및 후 시간 (시간)이 흐름에 따라 게먹이 원숭이의 혈청에서 프로-인자 D 및 인자 D의 수준을 분석하는 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 73에서 도시된 바와 같이, 인자 D는 mAb h13B1X의 단일 투여 후 적어도 336시간 (14일) 동안 프로-인자 D로서 혈장 내에 존재한다.
결과의 요약
실시예 11에서 기술된 바와 같이, 마우스로의 고 친화도 MASP-3 억제 항체, mAb 13B1의 단일 용량 투여는 적어도 14일 동안 전신 대체 경로 보체 활성의 거의 완전한 제거를 유도하였다. 실시예 12에서 더 기술된 바와 같이, PNH와 관련된 잘 확립된 동물 모델에서 수행된 연구에서, mAb 13B1이 PNH-유사 적혈구 세포의 생존을 크게 향상시키고 C5 억제보다 훨씬 더 양호하게 PNH-유사 적혈구 세포를 보호한다는 것이 입증되었다. 실시예 13에서 기술된 바와 같이, mAb 13B1이 관절염의 마우스 모델에서 질환의 발병률 및 심각도를 감소시킨다는 것이 더 입증되었다. 이 실시예의 결과는 대표적인 고 친화도 MASP-3 억제 mAb 13B1, 10D12 및 4D5가 영장류에서 대체 경로를 차단하는데 매우 효과적임을 입증한다. 게먹이 원숭이로의 mAb 13B1, 10D12 또는 4D5의 단일 용량 투여는 대략 16일 동안 지속되는 전신 대체 경로 활성의 지속적인 억제를 초래하였다. 고 친화도 MASP-3 억제 항체로 처리된 게먹이 원숭이에서 대체 경로 제거의 정도는 시험관 내에서 인자 D 차단에 의해 달성된 것과 비슷하며, MASP-3 억제 항체에 의한 인자 D 전환의 완전한 차단을 나타낸다. 그러므로, 고 친화도 MASP-3 억제 mAb는 대체 경로 과다 활성과 관련된 질환, 예를 들어, 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD, 습성 및 건성 AMD 포함), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 또는 이식-관련 TMA 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 고통받고 있는 환자의 치료시 치료적 유용성을 갖는다.
VII. 다른 구체예
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 및 특허는 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 기술된 방법, 조성물, 및 화합물의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 분명할 것이다. 본 발명은 특정한 원하는 구체예와 관련하여 기술되었지만, 청구된 발명이 이러한 특정 구체예에 지나치게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 의학, 면역학, 약리학, 종양학의 분야, 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범위 내에 있도록 의도된다.
상기 언급된 바에 따르면, 본 발명은 다음 구체예를 특징으로 한다.
SP 도메인 내에서 하나 이상의 에피토프에 결합하는 고 친화도 MASP-3 억제 항체
1A. 고 친화도 (500 pM 미만의 KD를 가짐)로 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728)에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 대체 경로 보체 활성화를 억제한다.
2A. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 성질 중 적어도 하나 이상을 특징으로 한다:
(a) 프로-인자 D 성숙화를 억제함;
(b) 인간 MASP-1 (서열 번호:8)에 결합하지 않음;
(c) 포유류 대상체에서 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대체 경로를 억제함
(d) 고전적 경로를 억제하지 않음.
(e) 용혈 및/또는 옵소닌화 억제;
(f) MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분열의 억제;
(g) 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착 감소;
(h) 활성화 표면 상에서 인자 B 및 Bb 침착 감소;
(i) 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 휴지기 수준 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음)의 감소;
(j) 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소;
(k) 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 휴지기 및/또는 표면-유도된 수준의 생산 감소; 및/또는
(l) 인자 P 침착의 감소.
3A. 단락 1 또는 2의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 VLRSQRRDTTVI (서열 번호:9), TAAHVLRSQRRDTTV (서열 번호:10), DFNIQNYNHDIALVQ (서열 번호:11), PHAECKTSYESRS (서열 번호:12), GNYSVTENMFC (서열 번호:13), VSNYVDWVWE (서열 번호:14) 및/또는 VLRSQRRDTTV (서열 번호:15) 중 적어도 하나 이상 내에 위치한다. [I군]
4A. 단락 3의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:15 내에서 에피토프에 결합한다. [모든 I군 ab를 포함함]
5A. 단락 3의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:9 내에서 에피토프에 결합한다. [10D12]
6A. 단락 3의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:10 내에서 에피토프에 결합한다. [13B1]
7A. 단락 6의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 서열 번호:12 내에서 에피토프에 결합한다. [13B1]
8A. 단락 3의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 서열 번호:10 및/또는 서열 번호:12 내에서 에피토프에 결합한다. [13B1]
9A. 단락 3의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호:9 내에서 에피토프에 결합한다. [1F3, 4B6, 4D5, 1A10]
10A. 단락 7의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 서열 번호:11, 서열 번호: 13 및/또는 서열 번호:14 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다. [1F3, 4B6, 4D5, 1A10]
11A. 단락 7의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 서열 번호:10, 서열 번호:11, 서열 번호:13 및/또는 서열 번호:14 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다. [1F3, 4B6, 4D5, 1A10]
12A. 단락 1 또는 2의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 ECGQPSRSLPSLV (서열 번호:16), RNAEPGLFPWQ (서열 번호:17); KWFGSGALLSASWIL(서열 번호:18); EHVTVYLGLH (서열 번호:19); PVPLGPHVMP (서열 번호:20); APHMLGL (서열 번호:21); SDVLQYVKLP (서열 번호:22); 및/또는 AFVIFDDLSQRW (서열 번호:23) 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다. [II군 및 III군]
13A. 단락 12의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:17 내에서 에피토프에 결합한다. [II군 및 III군 ab 모두]
14A. 단락 13의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 EHVTVYLGLH (서열 번호:19) 및/또는 AFVIFDDLSQRW (서열 번호:23) 내에서 에피토프에 결합한다. [1G4, 1E7, 2D7 15D9]
15A. 단락 14의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 서열 번호:23 내에서 에피토프에 결합한다. [1G4, 1E7, 2D7, 15D9, 2F5]
16A. 단락 14의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 서열 번호:19 및/또는 서열 번호:23 내에서 에피토프에 결합한다. [Ig4, 1E7, 2D7]
17A. 단락 14의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 서열 번호:18, 서열 번호:20 및/또는 서열 번호:23 내에서 에피토프에 결합한다. [15D9, 2F5]
18A. 단락 14의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 서열 번호:18, 서열 번호:20 및/또는 서열 번호:23 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다. [15D9, 2F5].
19A. 단락 14의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 서열 번호:16, 서열 번호: 21 및/또는 서열 번호:22 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다. [1B11]
20A. 단락 14의 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 서열 번호:16, 서열 번호: 21 및/또는 서열 번호:22 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합한다 [1B11].
21A. 단락 1-20 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 쥐 항체, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
22A. 단락 1-21 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 1가 항체 및 전체 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
23A. 단락 1-22 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
24A. 단락 1-23 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다.
25A. 단락 1-24 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 결합한다.
26A. 단락 1-25 중 어느 것의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 포유류 혈액에서 대체 경로 활성화를 억제한다.
27A. 단락 1A-26A 중 어느 것의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
A. SP 도메인 내에서 하나 이상의 에피토프에 결합하는 IA군 고 친화도 MASP-3 억제 항체 (4D5, 4B6, 1A10 플러스 4D5 변이체)
1B. MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호:209 (XXDIN, 여기서 위치 1의 X는 S 또는 T이고 위치 2의 X는 N 또는 D이다)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:210 (WIYPRDXXXKYNXXFXD, 여기서 위치 7의 X는 G 또는 D이고; 위치 8의 X는 S, T 또는 R이고; 위치 9의 X는 I 또는 T이고; 위치 13의 X는 E 또는 D이고; 위치 14의 X는 K 또는 E이고; 위치 16의 X는 T 또는 K이다)으로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:211 (XEDXY, 여기서 위치 1의 X는 L 또는 V이고, 위치 4의 X는 T 또는 S이다)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호:212 (KSSQSLLXXRTRKNYLX, 여기서 위치 8의 X는 N, I, Q 또는 A이고; 위치 9의 X는 S 또는 T이고; 위치 17의 X는 A 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:146 (KQSYNLYT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
2B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:56 (TDDIN)을 포함한다. [4D5 및 변이체]
3B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:62 (SNDIN)를 포함한다. [1F3, 4B6 및 1A10]
4B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:58 (WIYPRDDRTKYNDKFKD)을 포함한다 [4D5 및 변이체].
5B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:63 (WIYPRDGSIKYNEKFTD)을 포함한다. [1F3]
6B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:67 (WIYPRDGTTKYNEEFTD)을 포함한다. [4B6]
7B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:69 (WIYPRDGTTKYNEKFTD)를 포함한다. [1A10]
8B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:60 (LEDTY)을 포함한다 [4D5 및 변이체]
9B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:65 (VEDSY)를 포함한다. [1F3, 4B6 및 1A10]
10B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:142 (KSSQSLLNSRTRKNYLA); 서열 번호:257 (KSSQSLLQSRTRKNYLA), 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA); 또는 서열 번호:259 (KSSQSLLNTRTRKNYLA)를 포함한다. [4D5 및 변이체]
11B. 단락 10의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA)을 포함한다. [4D5 NA 돌연변이]
12B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:149 (KSSQSLLISRTRKNYLS)를 포함한다. [1F3 및 4B6]
13B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:56을 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:58을 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:60을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하고; LC-CDR2는 서열 번호:144를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:146을 포함한다. [LC-CDR1에서 변이체를 가진 4D5의 6개의 CDR 모두].
14B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:62를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:63, 서열 번호:67 또는 서열 번호:69를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:65를 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:149를 포함하고, LC-CDR2는 서열 번호:144를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:146을 포함한다. [1F3, 4B6 및 1A10의 6개의 CDR 모두]
15B. 단락 1-14 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 쥐 항체, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
16B. 단락 1-15 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 1가 항체 및 전체 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
17B. 단락 1-16 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
18B. 단락 1-17 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다.
19B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:24, 서열 번호:248 또는 서열 번호:249와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:40, 서열 번호:250 또는 서열 번호:278과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [4D5 모체, 인간화된 및 변형된 버젼].
20B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:25와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [1F3].
21B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:26과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [4B6].
22B. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:27과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [1A10].
23B. 단락 1-22 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3에 결합한다.
24B. 단락 1-23 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체는 포유류 혈액에서 대체 경로 활성화를 억제한다.
25B. 단락 1B-24B 중 어느 것의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
B. SP 도메인 내에서 하나 이상의 에피토프에 결합하는 IB군 고 친화도 MASP-3 억제 항체 (10D12, 35C1 및 10D12 변이체)
1C. MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호:213 (SYGXX, 여기서 위치 4의 X는 M 또는 I이고 위치 5의 X는 S 또는 T이다)으로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:74로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:214 (GGXAXDY, 여기서 위치 3의 X는 E 또는 D이고 위치 5의 X는 M 또는 L이다)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호:215 (KSSQSLLDSXXKTYLX, 여기서 위치 10의 X는 D, E 또는 A이고; 위치 11의 X는 G 또는 A이고; 위치 16의 X는 N 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:155로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:216 (WQGTHFPXT, 여기서 위치 8의 X는 W 또는 Y이다)으로 제시된 LC-CDR3을 경쇄 가변 영역.
2C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:72 (SYGMS)를 포함한다. [10D12 및 변이체]
3C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:79 (SYGIT)를 포함한다. [35C1]
4C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:76 (GGEAMDY)을 포함한다. [10D12 및 변이체].
5C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:82 (GGDALDY)를 포함한다. [35C1]
6C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:153 (KSSQSLLDSDGKTYLN); 서열 번호:261 (KSSQSLLDSEGKTYLN), 서열 번호:262 (KSSQSLLDSAGKTYLN) 또는 서열 번호:263 (KSSQSLLDSDAKTYLN)을 포함한다. [10D12 및 변이체]
7C. 단락 6의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:263 (KSSQSLLDSDAKTYLN)을 포함한다. [10D12 GA 변이체]
8C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:152를 포함한다. [35C1]
9C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR3은 서열 번호:159 (KSSQSLLDSDGKTYLS)를 포함한다. [10D12]
10C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR3은 서열 번호:160 (WQGTHFPYT)을 포함한다. [35C1]
11C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:72를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:74를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:76을 포함하고, LC-CDR1은 서열 번호:153, 서열 번호:261, 서열 번호:262 또는 서열 번호:263을 포함하고; LC-CDR2는 서열 번호:155를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:157을 포함한다. [LC-CDR1에서 변이체를 가진 10D12의 6개의 CDR 모두]
12C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, HC-CDR1은 서열 번호:79를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:74를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:82를 포함하고, LC-CDR1은 서열 번호:159를 포함하고, LC-CDR2는 서열 번호:155를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:160을 포함한다. [35C1의 6개의 CDR 모두]
13C. 단락 1-12 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 쥐 항체, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
14C. 단락 1-13 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 1가 항체 및 전체 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
15C. 단락 1-14 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
16C. 단락 1-15 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다.
17C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:28, 서열 번호:251 또는 서열 번호:252와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:43, 서열 번호:253 또는 서열 번호:279와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [10D12 모체, 인간화된 및 변이체].
18C. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:29와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [35C1].
19C. 단락 1-18 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3에 결합한다.
20C. 단락 1-19 중 어느 것의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서 상기 항체는 포유류 혈액에서 대체 경로 활성화를 억제한다.
21C. 단락 1C-20C 중 어느 것의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
C. SP 도메인 내에서 하나 이상의 에피토프에 결합하는 IC군 고 친화도 MASP-3 억제 항체 (13B1 및 변이체)
1D. MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호:84 (GKWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:86 (EILPGTGSTNYNEKFKG) 또는 서열 번호:275 (EILPGTGSTNYAQKFQG)로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:88 (SEDV)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호:142 (KSSQSLLNSRTRKNYLA), 서열 번호:257 (KSSQSLLQSRTRKNYLA); 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA); 또는 서열 번호:259 (KSSQSLLNTRTRKNYLA)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:161 (KQSYNIPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역. [LC-CDR1에서 13B1 및 변이체의 6개의 CDR 모두]
2D. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, LC-CDR1은 서열 번호:258을 포함한다. [13B1 LC-CDR1 NA 변이체]
3D. 단락 1-2 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 쥐 항체, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
4D. 단락 1-3 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 1가 항체 및 전체 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
5D. 단락 1-4 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
6D. 단락 1-5 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다.
7D. 단락 1의 단리된 항체 또는 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:30, 서열 번호:254 또는 서열 번호:255와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:45, 서열 번호:256 또는 서열 번호:280과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [13B1 모체, 인간화된 및 변이체].
8D. 단락 1-7 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3에 결합한다.
9D. 단락 1-8 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체는 포유류 혈액에서 대체 경로 활성화를 억제한다.
10D. 단락 1D-9D 중 어느 것의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
D. SP 도메인 내에서 하나 이상의 에피토프에 결합하는 II군 고 친화도 MASP-3 억제 항체 (1G4)
1E. MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호:91 (GYWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:93 (EMLPGSGSTHYNEKFKG)으로 제시된 HC-CDR2, 및 서열 번호:95 (SIDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호:163 (RSSQSLVQSNGNTYLH)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:165 (KVSNRFS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:167 (SQSTHVPPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역.
2E. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 쥐 항체, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
3E. 단락 1-2 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 1가 항체 및 전체 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
4E. 단락 1-3 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
5E. 단락 1-4 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편 is 인간화된.
6E. 단락 1의 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:31과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:46과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [1G4].
7E. 단락 1-6 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3에 결합한다.
8E. 단락 1-7 중 어느 것의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 포유류 혈액에서 대체 경로 활성화를 억제한다.
9E. 단락 1E-8E 중 어느 것의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
E. SP 도메인 내에서 하나 이상의 에피토프에 결합하는 III군 고 친화도 MASP-3 억제 항체 (1E7, 2D7, 15D9, 2F5, 1B11, 2F2, 11B6)
1F. MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호:109 (RVHFAIRDTNYWMQ)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:110 (AIYPGNGDTSYNQKFKG)으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:112 (GSHYFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:182 (RASQSIGTSIH)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:184 (YASESIS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:186 (QQSNSWPYT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 [1E7]; 또는
(b) 서열 번호:125 (DYYMN)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:127 (DVNPNNDGTTYNQKFKG)로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:129 (CPFYYLGKGTHFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:196 (RASQDISNFLN)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:198 (YTSRLHS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:200 (QQGFTLPWT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 [2D7]; 또는
(c) 서열 번호:132로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:133으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:135로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:203으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:165로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:204로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 [49C11]; 또는
(d) 서열 번호:137로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:138로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:140으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:206으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:207로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:208로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 [15D9]; 또는
(e) 서열 번호:98로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:99로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:101로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:169로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:171로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:173으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역. [2F5]; 또는
(f) 서열 번호:103으로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:105로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:107로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:176으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 [1B11]; 또는
(g) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:116으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:118로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:188로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:190으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 [2F2]; 또는
(h) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:121로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:123으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:191로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193으로 제시된 LC-CDR3 을 포함하는 경쇄 가변 영역. [11B6]
2F. 단락 1(a)-(g)의 항체 또는 이것의 항원 결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 쥐 항체, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
3F. 단락 1-2 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 1가 항체 및 전체 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
4F. 단락 1-3 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함한다.
5F. 단락 1-4 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된다.
6F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:32와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:47과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [1E7].
7F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:33과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:48과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [2D7].
8F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:34와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:49와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [49C11].
9F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:35와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:50과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [15D9]
10F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:36과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:51과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [2F5].
11F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:37과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:52와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [1B11].
12F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:53과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [2F2].
13F. 단락 1의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:54와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다 [11B6].
14F. 단락 1-13 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3에 결합한다.
15F. 단락 1-14 중 어느 하나의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체는 포유류 혈액에서 대체 경로 활성화를 억제한다.
16F. 단락 1F-15F 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
A. AP 질환의 치료를 위한 MASP-3 억제 항체의 사용
1. 포유동물에서 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 방법은 포유동물 필요로 하는 대상체에게 포유동물에서 대체 경로 보체 경로 활성화를 억제하기에 충분한 고 친화도 MASP-3 억제 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 양을 투여하는 단계를 포함한다.
2. 청구항 1의 방법으로서, 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편은 500 pM 미만의 친화도로 MASP-3에 결합한다.
3. 단락 1의 방법으로서, 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물의 투여의 결과로서 다음 중 하나 이상이 포유류 대상체에 존재한다:
(a) 인자 D 성숙화의 억제;
(b) 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대상체에게 투여될 때 대체 경로의 억제;
(c) 고전적 경로는 억제되지 않음;
(d) 용혈 및/또는 옵소닌화 억제;
(e) 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착 감소;
(f) 활성화 표면 상에서 인자 B 및 Bb 침착 감소;
(g) 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 휴지기 수준 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음)의 감소;
(h) 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소; 및/또는
(i) 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 휴지기 및 표면-유도된 수준의 생산 감소.
4. 단락 1의 방법으로서, 항체는 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대체 경로를 억제한다.
5. 단락 1-3 중 어느 것의 방법으로서, 고 친화도 MASP-3 항체는 청구항 27A, 25B, 21C, 10D, 9E 또는 16F 중 어느 것에 따라 특성화된다.
6. 단락 1-4 중 어느 것의 방법으로서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 고전적 경로 활성화에 영향을 주지 않으면서 선택적으로 대체 경로를 억제한다.
7. 단락 1-6 중 어느 것의 방법으로서, 포유동물 대상체는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD, 습성 및 건성 AMD 포함), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS),혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 또는 이식-관련 TMA 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 대체-경로 질환 또는 장애로 고통받고 있거나, 또는 이것에 걸릴 위험이 있다.
본 발명의 바람직한 구체예가 예시되고 기술되었지만, 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 그 안에서 많은 변화가 일어날 수 있다는 것을 알아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Omeros Corporation University of Leicester Cummings, W. Jason Demopulos, Gregory A. Dudler, Thomas Schwaeble, Hans-Wilhelm Tjoelker, Larry W. Wood, Christi L. Yabuki, Munehisa <120> Compositions and Methods of Inhibiting MASP-3 for the Treatment of Various Diseases and Disorders <130> MP.1.0254.PCT <150> US 62/478,336 <151> 2017-03-29 <150> US 62/419,420 <151> 2016-11-08 <150> US 62/369,674 <151> 2016-08-01 <160> 313 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3895 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 attccggcac agggacacaa acaagctcac ccaacaaagc caagctggga ggaccaaggc 60 cgggcagccg ggagcaccca aggcaggaaa atgaggtggc tgcttctcta ttatgctctg 120 tgcttctccc tgtcaaaggc ttcagcccac accgtggagc taaacaatat gtttggccag 180 atccagtcgc ctggttatcc agactcctat cccagtgatt cagaggtgac ttggaatatc 240 actgtcccag atgggtttcg gatcaagctt tacttcatgc acttcaactt ggaatcctcc 300 tacctttgtg aatatgacta tgtgaaggta gaaactgagg accaggtgct ggcaaccttc 360 tgtggcaggg agaccacaga cacagagcag actcccggcc aggaggtggt cctctcccct 420 ggctccttca tgtccatcac tttccggtca gatttctcca atgaggagcg tttcacaggc 480 tttgatgccc actacatggc tgtggatgtg gacgagtgca aggagaggga ggacgaggag 540 ctgtcctgtg accactactg 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tccagacaag cacaaagcaa tctttcagcc 3120 ttgaaatgta ttatctgaaa ggctacctga agcccaggcc cgaatatggg gacttagtcg 3180 attacctgga aaaagaaaag acccacactg tgtcctgctg tgcttttggg caggaaaatg 3240 gaagaaagag tggggtgggc acattagaag tcacccaaat cctgccaggc tgcctggcat 3300 ccctggggca tgagctgggc ggagaatcca ccccgcagga tgttcagagg gacccactcc 3360 ttcatttttc agagtcaaag gaatcagagg ctcacccatg gcaggcagtg aaaagagcca 3420 ggagtcctgg gttctagtcc ctgctctgcc cccaactggc tgtataacct ttgaaaaatc 3480 attttctttg tctgagtctc tggttctccg tcagcaacag gctggcataa ggtcccctgc 3540 aggttccttc tagctggagc actcagagct tccctgactg ctagcagcct ctctggccct 3600 cacagggctg attgttctcc ttctccctgg agctctctct cctgaaaatc tccatcagag 3660 caaggcagcc agagaagccc ctgagaggga atgattggga agtgtccact ttctcaaccg 3720 gctcatcaaa cacactcctt tgtctatgaa tggcacatgt aaatgatgtt atattttgta 3780 tcttttatat catatgcttc accattctgt aaagggcctc tgcattgttg ctcccatcag 3840 gggtctcaag tggaaataaa ccctcgtgga taaccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3895 <210> 2 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Trp Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ser Ala His Thr Val Glu Leu Asn Asn Met Phe Gly Gln Ile Gln 20 25 30 Ser Pro Gly Tyr Pro Asp Ser Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Val Thr Trp 35 40 45 Asn Ile Thr Val Pro Asp Gly Phe Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met His 50 55 60 Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu Cys Glu Tyr Asp Tyr Val Lys Val 65 70 75 80 Glu Thr Glu Asp Gln Val Leu Ala Thr Phe Cys Gly Arg Glu Thr Thr 85 90 95 Asp Thr Glu Gln Thr Pro Gly Gln Glu Val Val Leu Ser Pro Gly Ser 100 105 110 Phe Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Gly Phe Asp Ala His Tyr Met Ala Val Asp Val Asp Glu Cys Lys 130 135 140 Glu Arg Glu Asp Glu Glu Leu Ser Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 145 150 155 160 Ile Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Phe Gly Tyr Ile Leu His Thr 165 170 175 Asp Asn Arg Thr Cys Arg Val Glu Cys Ser Asp Asn Leu Phe Thr Gln 180 185 190 Arg Thr Gly Val Ile Thr Ser Pro Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys 195 200 205 Ser 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9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 200 Gln Gln Gly Phe Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 201 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 201 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 202 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 202 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Phe Ser Cys 20 <210> 203 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 203 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 204 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 205 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 205 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys 20 <210> 206 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 206 Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Pro Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 207 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 207 Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser 1 5 <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 208 Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 209 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> where Xaa at position 1 is S or T <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> where Xaa at position 2 is N or D <400> 209 Xaa Xaa Asp Ile Asn 1 5 <210> 210 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> where Xaa at position 7 is G or D <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> where Xaa at position 8 is S or T or R <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> where Xaa at position 9 is I or T <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> where Xaa at position 13 is E or D <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> where Xaa at position 14 is K or E <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> where Xaa at position 16 is T or K <400> 210 Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Xaa Xaa Xaa Lys Tyr Asn Xaa Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Asp <210> 211 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> where Xaa at position 1 is L or V <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> where Xaa at position 4 is T or S <400> 211 Xaa Glu Asp Xaa Tyr 1 5 <210> 212 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> where Xaa at position 8 is N or I or Q or A <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> where Xaa at position 9 is S or T <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> where Xaa at position 17 is A or S <400> 212 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Xaa Xaa Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Xaa <210> 213 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> where Xaa at position 4 is M or I <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> where Xaa at position 5 is S or T <400> 213 Ser Tyr Gly Xaa Xaa 1 5 <210> 214 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> where Xaa at position 3 is E or D <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> where Xaa at position 5 is M or L <400> 214 Gly Gly Xaa Ala Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 215 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> where Xaa at position 10 is D or E or A <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> where Xaa at position 11 is G or A <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> where Xaa at position 16 is N or S <400> 215 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Xaa Xaa Lys Thr Tyr Leu Xaa 1 5 10 15 <210> 216 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> where Xaa at position 8 is W or Y <400> 216 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Xaa Thr 1 5 <210> 217 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<213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 219 caggtgcagc tgaagcagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaattg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca agtaacgata taaactgggt gaaacagagg 120 cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatccta gagatggtac tactaagtac 180 aatgaggagt tcacggacaa ggccacattg actgttgacg tatcctccag cacagcgttc 240 atggagctcc acagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgttc aagtgtcgag 300 gattcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctt ca 342 <210> 220 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 220 caggtgcagc tgaagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca agtaacgata taaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttatccta gagatggtac tactaagtac 180 aatgagaagt tcacggacaa ggccacattg actgttgacg tatcctccag cacagcgttc 240 atggagctcc acaggctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgttc aagtgtcgag 300 gattcttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctt ca 342 <210> 221 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 221 cagatccagt tggtacagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta tattttcaca agctatggaa tgagctgggt gagacaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat 180 gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag aactccctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgcgc aagagggggc 300 gaagctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348 <210> 222 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 222 cagatccagt tggtacagtc tggacctgag ctgaagacgc caggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta tatcttcaca tcctatggaa ttacctgggt gaaacaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct actctggagt gccaacatat 180 gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cgtctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acgactacat atttctgtac aagagggggt 300 gatgctttgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca 348 <210> 223 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial sequence 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caggtgcagc tgaagcagtc tgggcctgag ctggcaaggc cttgggcttc agtgaagata 60 tcctgccagg ctttctacac cttttccaga agggtgcact ttgccattag ggataccaac 120 tactggatgc agtgggtaaa acagaggcct ggacagggtc tggaatggat cggggctatt 180 tatcctggaa atggtgatac tagttacaat cagaagttca agggcaaggc cacattgact 240 gcagacaaat cctccagcac agcctacatg caactcagca gcctgacatc tgaggactct 300 gcggtctatt actgtgcatc cggtagccac tactttgact actggggcca aggcaccact 360 ctcacagtct cctca 375 <210> 226 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 226 gaggtccagc tgcaacaatc tgggcctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60 tcctgtaagg cttctggata cacgctcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggagat gttaatccta acaatgatgg tactacctac 180 aaccagaaat tcaagggcag ggccacattg actgtagaca agtcttccaa cacagcctcc 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct actactgtgc aatatgcccc 300 ttttattacc tcggtaaagg gacccacttt gactactggg gccaaggcac ctctctcaca 360 gtctcctca 369 <210> 227 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 227 gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgtg ctggtgaagc ctggggcttc agggaagatg 60 tcctgtaagg cttctggata caaattcact gactactata tgatctgggt gaagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggagtt attaaaattt ataacggtgg tacgagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagggcca 300 tctctctatg attacgaccc ttactggtac ttcgatgtct ggggcacagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 228 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 228 caggtgcagc tgaagcagtc tggaactgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaacctt 60 tcctgcaagg cttctggcta cacattcact gcctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtac tactaactac 180 aatgagaact tcaaggacag ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac aagtgaggac tctgccatct attactgtgc aagatcctat 300 tactacgcta gtagatggtt tgctttctgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctcttca 360 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<220> <223> Synthetic <400> 239 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga acaagcctcc 60 atctcttgca gatcaagtca gagccttgta caaagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339 <210> 240 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 240 gacatccagc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60 ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120 aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180 aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa acgg 324 <210> 241 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 241 gatatccaga tgacacagac tccagcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgta gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca acagaaaccg 120 aatggaactg ttaaactcct agtcttctac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggagcagag cattctctca ccattagcaa cctggagcag 240 gaagatgttg ccacttactt ttgccaacag ggttttacgc ttccgtggac gttcggtggg 300 ggcaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 242 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 242 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 ttctcttgca gatctagtca gagccttata cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339 <210> 243 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 243 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat caataggaga 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cctggtatca acagaaacca 120 gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240 gaagacttgg cagactattt ctgtcagcaa tataaccgct atcctctcac gttcggtgct 300 gggaccaaac tggagctgaa acgg 324 <210> 246 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 246 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac 60 gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actcatgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg cgtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240 gaagacctgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atcctcgagc gctcacgttc 300 ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgg 330 <210> 247 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 247 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac 60 gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt cctactgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcaatctc ctaaagcact aatttactcg 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Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 313 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 313 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (66)

  1. 고 친화도 (500 pM 미만의 KD를 가짐)로 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 (서열 번호:2의 아미노산 잔기 450 내지 728)에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 대체 경로 보체 활성화를 억제하는, 단리된 단클론성 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  2. 제1 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 다음 성질들 중 적어도 하나 이상을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편:
    (a) 프로-인자 D 성숙화의 억제;
    (b) 인간 MASP-1 (서열 번호:8)에 결합하지 않음;
    (c) 포유류 대상체에서 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 mAb)에서 대체 경로의 억제;
    (d) 고전적 경로를 억제하지 않음.
    (e) 용혈 및/또는 옵소닌화 억제;
    (f) MASP-3 세린 프로테아제 기질-특이적 분열의 억제;
    (g) 용혈 감소 또는 C3 분열 및 C3b 표면 침착 감소;
    (h) 활성화 표면 상에서 인자 B 및 Bb 침착 감소;
    (i) 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 휴지기 수준 (순환시, 및 활성화 표면의 실험적 추가 없음)의 감소;
    (j) 활성화 표면에 반응하여 프로-인자 D에 비해 활성 인자 D의 수준의 감소;
    (k) 유체상 Ba, Bb, C3b, 또는 C3a의 휴지기 및 표면-유도된 수준의 생산 감소; 및/또는
    (l) 인자 P 침착의 감소.
  3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 VLRSQRRDTTV (서열 번호:15), TAAHVLRSQRRDTTV (서열 번호:10), VLRSQRRDTTVI (서열 번호:9), DFNIQNYNHDIALVQ (서열 번호:11), PHAECKTSYESRS (서열 번호:12), GNYSVTENMFC (서열 번호:13), 및/또는 VSNYVDWVWE (서열 번호:14) 중 적어도 하나 이상 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  4. 제3 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:15 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  5. 제3 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:10 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제3 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 번호:9 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제5 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 서열 번호:12 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제6 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열 번호:11, 서열 번호: 13 및/또는 서열 번호:14 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 상기 항체는 ECGQPSRSLPSLV (서열 번호:16), RNAEPGLFPWQ (서열 번호:17); KWFGSGALLSASWIL(서열 번호:18); EHVTVYLGLH (서열 번호:19); PVPLGPHVMP (서열 번호:20); APHMLGL (서열 번호:21); SDVLQYVKLP (서열 번호:22); 및/또는 AFVIFDDLSQRW (서열 번호:23) 중 적어도 하나 내에서 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 다음을 포함하는 MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편:
    (a) 서열 번호:84 (GKWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:86 (EILPGTGSTNYNEKFKG) 또는 서열 번호:275 (EILPGTGSTNYAQKFQG)으로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:88 (SEDV)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:142 (KSSQSLLNSRTRKNYLA), 서열 번호:257 (KSSQSLLQSRTRKNYLA); 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA); 또는 서열 번호:259 (KSSQSLLNTRTRKNYLA)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:161 (KQSYNIPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (b) 서열 번호:213 (SYGXX, 여기서 위치 4의 X는 M 또는 I이고 위치 5의 X는 S 또는 T이다)으로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:74로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:214 (GGXAXDY, 여기서 위치 3의 X는 E 또는 D이고 위치 5의 X는 M 또는 L이다)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:215 (KSSQSLLDSXXKTYLX, 여기서 위치 10의 X는 D, E 또는 A이고; 위치 11의 X는 G 또는 A이고; 위치 16의 X는 N 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:155로 제시된 LC-CDR2; 및 서열 번호:216 (WQGTHFPXT, 여기서 위치 8의 X는 W 또는 Y이다)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (c) 서열 번호:209 (XXDIN, 여기서 위치 1의 X는 S 또는 T이고 위치 2의 X는 N 또는 D이다)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:210 (WIYPRDXXXKYNXXFXD, 여기서 위치 7의 X는 G 또는 D이고; 위치 8의 X는 S, T 또는 R이고; 위치 9의 X는 I 또는 T이고; 위치 13의 X는 E 또는 D이고; 위치 14의 X는 K 또는 E이고; 위치 16의 X는 T 또는 K이다)으로 제시된 HC-CDR2; 및 서열 번호:211 (XEDXY, 여기서 위치 1의 X는 L 또는 V이고, 위치 4의 X는 T 또는 S이다)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:212 (KSSQSLLXXRTRKNYLX, 여기서 위치 8의 X는 N, I, Q 또는 A이고; 위치 9의 X는 S 또는 T이고; 위치 17의 X는 A 또는 S이다)로 제시된 LC-CDR1; 서열 번호:144 (WASTRES)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:146 (KQSYNLYT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  11. 제10 항에 있어서, (a)에서, LC-CDR은 서열 번호:258을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제10 항에 있어서, (a)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:30, 서열 번호:254 또는 서열 번호:255와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:45, 서열 번호:256 또는 서열 번호:280과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  13. 제10 항에 있어서, (b)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:72 (SYGMS)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  14. 제10 항에 있어서, (b)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:79 (SYGIT)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  15. 제10 항에 있어서, (b)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:76 (GGEAMDY)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  16. 제10 항에 있어서, (b)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:82 (GGDALDY)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  17. 제10 항에 있어서, (b)에서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:153 (KSSQSLLDSDGKTYLN); 서열 번호:261 (KSSQSLLDSEGKTYLN), 서열 번호:262 (KSSQSLLDSAGKTYLN) 또는 서열 번호:263 (KSSQSLLDSDAKTYLN)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  18. 제10 항에 있어서, (b)에서, 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:152를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  19. 제10 항에 있어서, (b)에서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR3은 서열 번호:159 (KSSQSLLDSDGKTYLS)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  20. 제10 항에 있어서, (b)에서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR3은 서열 번호:160 (WQGTHFPYT)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  21. 제10 항에 있어서, (b)에서, HC-CDR1은 서열 번호:72를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:74를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:76을 포함하고, LC-CDR1은 서열 번호:153, 서열 번호:261, 서열 번호:262 또는 서열 번호:263을 포함하고; LC-CDR2는 서열 번호:155를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:157을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  22. 제10 항에 있어서, (b)에서, HC-CDR1은 서열 번호:79를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:74를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:82를 포함하고, LC-CDR1은 서열 번호:159를 포함하고, LC-CDR2는 서열 번호:155를 포함하고, LC-CDR3은 서열 번호:160을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  23. 제10 항에 있어서, (b)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:28, 서열 번호:251 또는 서열 번호:252와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:43, 서열 번호:253 또는 서열 번호:279와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  24. 제10 항에 있어서, (b)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:29와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  25. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:56 (TDDIN)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  26. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR1은 서열 번호:62 (SNDIN)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  27. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:58 (WIYPRDDRTKYNDKFKD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  28. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:63 (WIYPRDGSIKYNEKFTD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  29. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:67 (WIYPRDGTTKYNEEFTD)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  30. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR2는 서열 번호:69 (WIYPRDGTTKYNEKFTD)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  31. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:60 (LEDTY)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  32. 제10 항에 있어서, (c)에서, (a)의 중쇄 가변 영역의 HC-CDR3은 서열 번호:65 (VEDSY)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  33. 제10 항에 있어서, (c)에서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:142 (KSSQSLLNSRTRKNYLA); 서열 번호:257 (KSSQSLLQSRTRKNYLA), 서열 번호:258 (KSSQSLLASRTRKNYLA); 또는 서열 번호:259 (KSSQSLLNTRTRKNYLA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  34. 제10 항에 있어서, (c)에서, (b)에 따르는 경쇄 가변 영역의 LC-CDR1은 서열 번호:149 (KSSQSLLISRTRKNYLS)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  35. 제10 항에 있어서, (c)에서, HC-CDR1은 서열 번호:56을 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:58을 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:60을 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:142, 서열 번호:257, 서열 번호:258 또는 서열 번호:259를 포함하고; LC-CDR2는 서열 번호:144를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:146을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  36. 제10 항에 있어서, (c)에서, HC-CDR1은 서열 번호:62를 포함하고, HC-CDR2는 서열 번호:63, 서열 번호:67 또는 서열 번호:69를 포함하고, HC-CDR3은 서열 번호:65를 포함하고 LC-CDR1은 서열 번호:149를 포함하고, LC-CDR2는 서열 번호:144를 포함하고 LC-CDR3은 서열 번호:146을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  37. 제10 항에 있어서, (c)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:24, 서열 번호:248 또는 서열 번호:249와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:40, 서열 번호:250 또는 서열 번호:278과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  38. 제10 항에 있어서, (c)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:25와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:41과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  39. 제10 항에 있어서, (c)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:26과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  40. 제10 항에 있어서, (c)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:27과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:42와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  41. MASP-3에 결합하는 단리된 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편으로서,
    (a) 서열 번호:91 (GYWIE)로 제시된 HC-CDR1; 서열 번호:93 (EMLPGSGSTHYNEKFKG)으로 제시된 HC-CDR2, 및 서열 번호:95 (SIDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:163 (RSSQSLVQSNGNTYLH)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:165 (KVSNRFS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:167 (SQSTHVPPT)로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (b) 서열 번호:109 (RVHFAIRDTNYWMQ)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:110 (AIYPGNGDTSYNQKFKG)으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:112 (GSHYFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:182 (RASQSIGTSIH)로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:184 (YASESIS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:186 (QQSNSWPYT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (c) 서열 번호:125 (DYYMN)로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:127 (DVNPNNDGTTYNQKFKG)로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:129 (CPFYYLGKGTHFDY)로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:196 (RASQDISNFLN)으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:198 (YTSRLHS)로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:200 (QQGFTLPWT)으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (d) 서열 번호:132로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:133으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:135로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:203으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:165로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:204로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (e) 서열 번호:137로 제시된 HC-CDR1 서열 번호:138로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:140으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:206으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:207로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:208로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (f) 서열 번호:98로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:99로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:101로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:169로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:171로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:173으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (g) 서열 번호:103으로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:105로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:107로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:176으로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (h) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:116으로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:118로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:188로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:190으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (i) 서열 번호:114로 제시된 HC-CDR1, 서열 번호:121로 제시된 HC-CDR2, 서열 번호:123으로 제시된 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호:191로 제시된 LC-CDR1, 서열 번호:178로 제시된 LC-CDR2 및 서열 번호:193으로 제시된 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  42. 제41 항에 있어서, (a)에서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 서열 번호:31과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:46과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  43. 제41 항에 있어서, (b)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:32와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:47과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  44. 제41 항에 있어서, (c)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:33과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:48과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  45. 제41 항에 있어서, (d)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:34와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:49와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  46. 제41 항에 있어서, (e)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:35와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:50과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  47. 제41 항에 있어서, (f)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:36과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:51과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  48. 제41 항에 있어서, (g)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:37과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:52와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  49. 제41 항에 있어서, (h)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:38과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:53과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  50. 제41 항에 있어서, (i)에서, 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 서열 번호:39와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:54와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  51. 제1 항, 제10 항 또는 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 쥐 항체, 및 상기 언급된 것들 중 어느 것의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편.
  52. 제1 항, 제10 항 또는 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이것의 항원 결합 단편은 단일 사슬 항체, ScFv, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 힌지 영역이 없는 1가 항체 및 전체 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  53. 제1 항, 제10 항 또는 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  54. 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화된 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원 결합 단편.
  55. 제1 항, 제10 항 또는 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 500 pM 미만의 친화도로 인간 MASP-3의 세린 프로테아제 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  56. 제1 항, 제10 항 또는 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 포유류 혈액에서 대체 경로 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
  57. 제1 항 내지 제56 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 DNA 서열.
  58. 제57 항의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  59. 제58 항의 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  60. 제1 항 내지 제56 항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, 제59 항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 단리시키는 단계를 포함하는 방법.
  61. 제1 항 내지 제56 항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  62. 포유동물에서 대체 경로 보체 활성화를 억제하는 방법으로서, 필요로 하는 포유동물 대상체에게 포유동물에서 대체 경로 보체 경로 활성화를 억제하기에 충분한 고 친화도 MASP-3 억제 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 제61 항의 조성물의 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  63. 제62 항에 있어서, 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편은 500 pM 미만의 친화도로 MASP-3에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제62 항 또는 제63 항에 있어서, 항체는 약 1:1 내지 약 2.5:1의 몰 비 (MASP-3 표적 대 MASP-3 억제 mAb)에서 대체 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제62 항에 있어서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 고전적 경로 활성화에 영향을 주지 않으면서 대체 경로를 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제62 항에 있어서, 필요로 하는 대상체는 발작성 야간혈색뇨증 (PNH), 나이-관련 황반 변성 (AMD, 습성 및 건성 AMD 포함), 허혈-재관류 손상, 관절염, 파종성 혈관내 응고, 혈전성 미세혈관증 (용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS),혈전성 혈소판 감소성 자반증 (TTP) 또는 이식-관련 TMA 포함), 천식, 고밀도 침착병, 핍면역 괴사성 반월상 사구체신염, 외상성 뇌 손상, 흡인성 폐렴, 내안구염, 시속척수염, 베체트 병, 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군, 알츠하이머병, 근위축성 축삭 경화증 (ALS), 홍반성 신염, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 당뇨병성 망막증, 포도막염, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C3 사구체병증, 이식 거부반응, 이식편대숙주병 (GVHD), 혈액 투석, 패혈증, 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), ANCA 맥관염, 항-인지질 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, IgA 신증 및 중증 근무력증으로 구성된 군으로부터 선택된 대체-경로 질환 또는 장애로 고통받고 있거나, 또는 이것들에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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