KR102448454B1 - Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체 - Google Patents

Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR102448454B1
KR102448454B1 KR1020167023436A KR20167023436A KR102448454B1 KR 102448454 B1 KR102448454 B1 KR 102448454B1 KR 1020167023436 A KR1020167023436 A KR 1020167023436A KR 20167023436 A KR20167023436 A KR 20167023436A KR 102448454 B1 KR102448454 B1 KR 102448454B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
muc1
cells
cancer
cell
Prior art date
Application number
KR1020167023436A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160132012A (ko
Inventor
도널드 더블유. 쿠페
서렌더 카르반다
Original Assignee
다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
지너스 온콜로지 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크., 지너스 온콜로지 엘엘씨 filed Critical 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크.
Publication of KR20160132012A publication Critical patent/KR20160132012A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102448454B1 publication Critical patent/KR102448454B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 MUC1-C/세포외 도메인 (MUC1-C/ECD)에 결합하는 항체, 및 MUC1 항원을 발현하는 암을 치료하기 위해 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

MUC1-C/세포외 도메인 (MUC1-C/ECD)에 대한 항체 {ANTIBODIES AGAINST THE MUC1-C/EXTRACELLULAR DOMAIN (MUC1-C/ECD)}
본 발명의 배경
본 출원은 2014년 1월 29일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 61/933,001 우선권 주장하며, 상기 출원은 그 내용 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
40 KB [마이크로소프트 윈도우즈(Microsoft Windows)®에서 측정]이고, 2015년 1월 29일 작성된, 파일명 "GENUP0032WO_ST25.txt"에 포함되어 있는 서열 목록은 본원과 함께 전자 제출된 것이고, 본원에서 참조로 포함된다.
1. 본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 의학, 종양학 및 면역치료제 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 MUC1-양성 암을 검출 및 치료하는 데 사용하기 위한 면역시약 개발에 관한 것이다.
2. 본 발명의 배경기술
뮤신은 상피 세포에 의해 주로 발현되는, 광범위하게 O-글리코실화된 단백질이다. 분비되고, 막 결합된 뮤신은 독소, 미생물 및 외부 환경과의 계면에서 발생하는 다른 형태의 스트레스에 의해 유도된 손상으로부터 상피 세포의 정단 경계를 보호하는 물리적 장벽을 형성한다. 막통과 뮤신 1 (MUC1)은 또한 그의 세포질 도메인을 통하여 세포의 내부에 신호를 전달할 수 있다. MUC1은 성게 정자 단백질-에테로키나제-아그린 (SEA) 도메인의 존재를 제외하면, 다른 막-결합 뮤신과의 서열 유사성은 없다 (문헌 [Duraisamy et al., 2006]). 상기와 관련하여, MUC1은 단일 폴리펩티드로서 번역된 후, 상기 SEA 도메인에서 자가절단된다 (문헌 [Macao, 2006]).
본 발명자들 등에 의해 MUC1은 암에서의 그의 역할에 대하여 광범위하게 연구되어 왔다. 상기 논의된 바와 같이, 인간 MUC1은 단일 폴리펩티드로 번역되고, 세포질 망상 구조 내에서 N- 및 C-말단 서브유니트 (MUC1-N 및 MUC1-C)으로 절단되는 이종이량체 당단백질이다 (문헌 [Ligtenberg et al., 1992]; [Macao et al., 2006]; [Levitin et al., 2005]). 대부분의 인간 암종에서 관찰되는 바와 같이 (문헌 [Kufe et al., 1984]) MUC1의 비정상적인 과다발현은 종양생성능 및 부착 비의존성 성장을 부여한다 (문헌 [Li et al., 2003a]; [Huang et al., 2003]; [Schroeder et al., 2004]; [Huang et al., 2005]). 다른 연구에서는 MUC1의 과다발현이 산화적 스트레스에 의해 유발된 아포토시스, 및 유전자 독성 항암제에 대한 저항성을 부여한다고 입증되었다 (문헌 [Yin and Kufe, 2003]; [Ren et al., 2004]; [Raina et al., 2004]; [Yin et al., 2004]; [Raina et al., 2006]; [Yin et al., 2007]).
고정되고 분비된 뮤신 패밀리는 상피 세포 표면의 보호 장벽을 제공하는 데에서 작용한다. 상피층이 손상되면, 이웃 세포 사이의 밀착 연접부는 파괴되고, 극성은 세포가 헤레귤린 유도성 수복 프로그램을 개시함에 따라 상실된다 (문헌 [Vermeer et al., 2003]). MUC1-N은 세포 표면으로부터 배출되어 (문헌 [Abe and Kufe, 1989]), MUC1-C만이 남아 세포의 내부로의 환경적 스트레스 신호의 트랜스듀서로서의 기능을 하게 된다. 이와 관련하여, MUC1-C는 ErbB 수용체 패밀리의 구성원과 세포 표면 복합체를 형성하며, MUC1-C는 헤레귤린 자극에 반응하여 핵으로 표적된다 (문헌 [Li et al., 2001]; [Li et al., 2003c]). MUC1-C는 또한 MUC1 세포질 도메인 (CD)과 카테닌 패밀리의 구성원 사이의 직접적 상호작용을 통하여 ErbB 수용체 및 Wnt 신호전달 경로를 통합하는 데 작용한다 (문헌 [Huang et al., 2005]; [Li et al., 2003c]; [Yamamoto et al., 1997]; [Li et al., 1998]; [Li et al., 2001]; [Li and Kufe, 2001]). 다른 연구를 통해 MUC1-CD가 글리코겐 신타제 키나제 3β, c-Src, 단백질 키나제 Cδ 및 c-Abl에 의하여 인산화된다는 것이 입증되었다 (문헌 [Raina et al., 2006]; [Li et al., 1998]; [Li et al., 2001]; [Ren et al., 2002]). 상기 상호작용 중 임의의 것을 억제시키는 것이 MUC1과 관련된 암에 대한 치료적 개입의 가능 지점을 나타낸다.
본 발명의 요약
따라서, 본 발명에 따라, 서열 번호 2에 의해 정의되는 MUC1-C/세포외 도메인 (MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체로서, 여기서, 상기 항체는
(a) IgG 항체이고/거나;
(b) 암 세포 성장을 억제시키고/거나;
(c) 암 세포 사멸을 유도하고/거나;
(d) 각각 서열 번호 3, 4, 및 5, 또는 6, 7 및 8, 또는 27, 28 및 29, 또는 42, 43 및 44, 또는 45, 46 및 47, 또는 48, 49 및 50과 90% 이상의 상동성을 가지는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 9, 10 및 11 또는 12, 13 및 14, 또는 30, 31 및 32, 또는 51, 52, 및 53, 또는 54, 55 및 56, 또는 57, 58 및 59와 90% 이상의 상동성을 가지는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 각각 포함하고/거나;
(e) 서열 번호 15, 19, 23, 60, 64 또는 68과 80% 이상의 상동성을 가지는 가변 중쇄, 및 서열 번호 17, 21, 25, 62, 66, 70과 80% 이상의 상동성을 가지는 가변 경쇄를 각각 포함하고/거나;
(f) 서열 번호 16, 20, 24, 61, 65 또는 69와 70% 이상의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는 가변 중쇄, 및 서열 번호 18, 22, 26, 63, 67 또는 71과 70% 이상의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는 가변 경쇄를 각각 포함하는 것인 항체를 제공한다.
중쇄 및 경쇄는 각각 서열 번호 15, 19, 23, 60, 64 또는 68, 및 17, 21, 25, 62, 66 또는 70과 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다. 중쇄 및 경쇄는 각각 서열 번호 16, 20, 24, 61, 65 또는 69, 및 18, 22, 26, 63, 67 또는 71과 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 번호 33, 34 또는 35에 결합하지 않는다.
항체는 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 또는 Fab 단편일 수 있다. 항체는 MUC1-C/ECD 및 다른 암 세포 표면 항원에 대해 특이성을 가지는 재조합 항체일 수 있다. 항체는 뮤린 항체, IgG, 인간화 항체 또는 인간화 IgG일 수 있다. 항체는 표지, 예컨대, 펩티드 태그, 효소, 자기 입자, 발색단, 형광 분자, 화학 발광성 분자, 또는 염료를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 그에 연결된, 예컨대, 광불안정 링커 또는 효소적으로 절단되는 링커를 통해 상기 항체에 연결된 항종양 약물을 추가로 포함할 수 있다. 항종양 약물은 독소, 방사성 동위 원소, 시토카인 또는 효소일 수 있다. 항체는 나노입자 또는 리포솜에 접합될 수 있다. 세포 사멸의 유도로는 항체-의존성 세포 세포독성 또는 보체-매개 세포독성을 포함할 수 있다.
대상체에서 MUC1-양성 암 세포를 상기 기술된 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법 또한 제공한다. MUC1-양성 암 세포는 고형 종양 세포, 예컨대, 폐암 세포, 뇌암 세포, 두부경부암 세포, 유방암 세포, 피부암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 위암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 자궁암 세포, 자궁경부암 세포, 난소암 세포, 고환암 세포, 피부암 세포, 또는 식도암 세포일 수 있거나, 또는 백혈병 또는 골수종, 예컨대, 급성 골수양 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종일 수 있다.
본 방법은 상기 MUC1-양성 암 세포를 제2 항암제 또는 치료법, 예컨대, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 독소 요법과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제2 항암제 또는 치료법은 세포내 MUC1 기능을 억제시킬 수 있다. 제2 항암제 또는 치료법은 상기 제1 작용제와 동시에 제공될 수 있거나, 또는 상기 제1 작용제 이전 및/또는 그 이후에 제공될 수 있다. MUC1-양성 암 세포는 전이성 암 세포, 다중 약물 저항성 암 세포 또는 재발성 암 세포일 수 있다.
항체는 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 또는 Fab 단편일 수 있다. 항체는 MUC1-C/ECD 및 다른 암 세포 표면 항원에 대해 특이성을 가지는 재조합 항체일 수 있다. 항체는 뮤린 항체, IgG, 인간화 항체 또는 인간화 IgG일 수 있다. 항체는 표지, 예컨대, 펩티드 태그, 효소, 자기 입자, 발색단, 형광 분자, 화학 발광성 분자, 또는 염료를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 그에 연결된, 예컨대, 광불안정 링커 또는 효소적으로 절단되는 링커를 통해 상기 항체에 연결된 항종양 약물을 추가로 포함할 수 있다. 항종양 약물은 독소, 방사성 동위 원소, 시토카인 또는 효소일 수 있다. 항체는 나노입자 또는 리포솜에 접합될 수 있다.
(i) 서열 번호 2에 의해 정의되는 MUC1-C/세포외 도메인 (MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 제1 단일 쇄 항체로서, 여기서, 상기 항체는
(a) IgG 항체이고/거나;
(b) 암 세포 성장을 억제시키고/거나;
(c) 암 세포 사멸을 유도하고/거나;
(d) 각각 서열 번호 3, 4, 및 5, 또는 6, 7 및 8, 또는 27, 28 및 29, 또는 42, 43 및 44, 또는 45, 46 및 47, 또는 48, 49 및 50과 90% 이상의 상동성을 가지는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 9, 10 및 11 또는 12, 13 및 14, 또는 30, 31 및 32, 또는 51, 52, 및 53, 또는 54, 55 및 56, 또는 57, 58 및 59와 90% 이상의 상동성을 가지는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 각각 포함하고/거나;
(e) 서열 번호 15, 19, 23, 60, 64 또는 68과 80% 이상의 상동성을 가지는 가변 중쇄, 및 서열 번호 17, 21, 25, 62, 66, 70과 80% 이상의 상동성을 가지는 가변 경쇄를 각각 포함하고/거나;
(f) 서열 번호 16, 20, 24, 61, 65 또는 69와 70% 이상의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는 가변 중쇄, 및 서열 번호 18, 22, 26, 63, 67 또는 71과 70% 이상의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는 가변 경쇄를 각각 포함하는 것인 제1 단일 쇄 항체; 및
(ii) T 또는 B 세포에 결합하는 제2 단일 쇄 항체를 포함하는 융합 단백질 또한 제공한다.
제2 단일 쇄 항체는 CD3에, T 세포에 또는 B 세포에 결합할 수 있다. 융합 단백질은 표지 또는 치료학적 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 단일 쇄 항체는 서열 번호 3, 4 또는 5에 결합하지 않는다.
또 다른 실시양태에서,
(i) 서열 번호 2에 의해 정의되는 MUC1-C/세포외 도메인 (MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 단일 쇄 항체 가변 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 여기서, 상기 항체는
(a) IgG 항체이고/거나;
(b) 암 세포 성장을 억제시키고/거나;
(c) 암 세포 사멸을 유도하고/거나;
(d) 각각 서열 번호 3, 4, 및 5, 또는 6, 7 및 8, 또는 27, 28 및 29, 또는 42, 43 및 44, 또는 45, 46 및 47, 또는 48, 49 및 50과 90% 이상의 상동성을 가지는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 9, 10 및 11 또는 12, 13 및 14, 또는 30, 31 및 32, 또는 51, 52, 및 53, 또는 54, 55 및 56, 또는 57, 58 및 59와 90% 이상의 상동성을 가지는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 각각 포함하고/거나;
(e) 서열 번호 15, 19, 23, 60, 64 또는 68과 80% 이상의 상동성을 가지는 가변 중쇄, 및 서열 번호 17, 21, 25, 62, 66, 70과 80% 이상의 상동성을 가지는 가변 경쇄를 각각 포함하고/거나;
(f) 서열 번호 16, 20, 24, 61, 65 또는 69와 70% 이상의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는 가변 중쇄, 및 서열 번호 18, 22, 26, 63, 67 또는 71과 70% 이상의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는 가변 경쇄를 각각 포함하는 것이고;
여기서, 가요성 힌지가 상기 단일 쇄 항체 가변 영역의 C-말단에 부착되어 있는 것인, 엑토도메인;
(ii) 막통과 도메인; 및
(iii) 상기 단일 쇄 항체 가변 영역이 MUC1과 맞물렸을 때, 신호 전달 기능을 포함하는 것인, 엔도도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
막통과 및 엔도도메인은 같은 분자로부터 유래된 것일 수 있다. 엔도도메인은 CD3-제타 도메인 또는 고친화성 FcεRI를 포함한다. 가요성 힌지는 CD8α 또는 Ig로부터의 것일 수 있다. 또한 상기 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 단일 쇄 가변 영역은 서열 번호 3, 4 또는 5에 결합하지 않는다.
본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있다는 것이 고려된다.
청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때, "한"("a" 또는 "an")이라는 단어를 사용하는 것은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상의," "적어도 하나의," 및 "하나 또는 하나 초과의"라는 의미와 일치한다. "약"이라는 단어는 언급된 수치의 ±5%를 의미한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 구체적인 실시양태를 명시하였지만, 당업자에게는 본 상세한 설명으로부터 본 발명의 정신 및 범주 내에 다양한 변화 및 변형이 자명해지는 바, 상세한 설명 및 구체적인 예는 단지 예시로 제공된 것임을 이해하여야 한다.
도면의 간단한 설명
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 구체적인 실시양태에 관한 상세한 설명과 함께 본 도면 중 하나 이상의 것을 참조로 하여 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1a-b. (도 1a) MUC1-C/ECD의 아미노산 서열 (58 aa: 서열 번호 2). (도 1b) 구축물 mFc-링커-MUC1-C/ECD-신호 서열을 CHO-K1 세포에서 안정하게 발현시켰다. 단백질을 CHO 세포 스프 (soup)로부터로 정제하고, 이를 사용하여 마우스에게 백신접종 (immunize)한다. 같은 단백질을 사용하여 마우스를 부스팅시켰다. 혈청 역가를 측정하고, 양성 역가 후, 비장을 융합하여 하이브리도마를 생성하였다.
도 2. (보류)
도 3. MUC1-C/ECD 단백질로부터 3가지 중복 펩티드를 합성하여 ELISA 검정법을 이용하여 양성 Mab 클론을 위한 선형 에피토프 맵핑에서 사용하였다. 3가지 펩티드에 대한 서열은 P1:SVVVQLTLAFREGTINVHDVET (서열 번호 33); P2:VETQFNQYKTEAASRYNLTISD (서열 번호 34); P3:TISDVSVSDVPFPFSAQSGAG (서열 번호 35)이다.
도 4. (상기 기술된 바와 같은) 수개의 점 돌연변이를 가지는 MUC1-C/ECD cDNA를 생성하였다 (ECD-WT - 서열 번호 2; ECD-L6A - 서열 번호 36; ECD-L8A - 서열 번호 37; ECD-L6,8A - 서열 번호 38; ECD-Q23V - 서열 번호 39; ECD-Q26V - 서열 번호 40; ECD-N36A - 서열 번호 41). CHO-K1 세포를 개별적으로 각각의 상기 cDNA로 형질감염시켜 단백질을 발현시키고, 분비하였다. 단백질을 정제하였고, 이는 ELISA 검정법을 이용하여 양성 Mab 클론에 대한 입체구조적 에피토프를 정의하는 데 사용할 것이다. 양성 대조군은 CHO-K1 세포로부터 발현되고, 정제된 wt mFc-MUC1-C/ECD 단백질이 될 것이다.
도 5. (보류)
도 6a-c. (도 6a) 백신접종 후, 마우스를 출혈시키고, MUC1-C/ECD 단백질로 면역블롯팅하여 면역 혈청을 분석하였다. MUC1-C/CD 단백질을 음성 대조군으로서 사용하였다. (도 6b) CHO-K1 세포로부터 정제된 mFc- 및 hFc-MUC1-C/ECD 단백질로 면역블롯팅하여 MAb 클론 8E1, 8F1, 2A6 및 6A6을 분석하였다. 2차 Ab: 항-마우스-HRP (F(ab)2 특이) (1:5,000) (도 6c) 클론 6A6 항체로 면역블롯팅하여 MUC1-음성 293T 세포, NSCLC H-1975 및 MCF-7 & ZR-75-1 유방암종 세포 용해물을 분석하였다.
도 7. 박테리아로부터 생산되고, 정제된 mFc-MUC1-C/ECD (p58-mFc), MUC1-SEA 도메인 (p62-mFc) 및 p62 단독 단백질로 면역블롯팅하여 MAb 클론 8E1, 6A6, 2G11 및 2H11을 분석하였다.
도 8. 박테리아로부터 정제된 mFc-MUC1-C/ECD (p58-mFc), MUC1-SEA 도메인 (p62-mFc) 및 p62 단독 단백질로 면역블롯팅하여 MAb 클론 8E1, 6A6, 2G11 및 2H11을 분석하였다.
도 9. 박테리아로부터 정제된 mFc-MUC1-C/ECD (p58-mFc), MUC1-SEA 도메인 (p62-mFc) 및 p62 단독 단백질로 면역블롯팅하여 MAb 클론 8E1, 6A6, 2G11 및 2H11을 분석하였다.
도 10. MV4-11, MOLM-14 (AML); U266, RPMI8226 (다발성 골수종) 및 원발성 AML 세포를 사용하여 유세포 분석법에 의해 MAb 클론 8E1, 6A6 및 양성 대조군 DF3을 분석하였다.
도 11. 562/CsiRNA 및 K562/MUC1siRNA CML 세포를 사용하여 유세포 분석법에 의해 MAb 클론 8E1 및 6A6을 분석하였다.
도 12. 37℃에서 3시간 동안 H-1975 비소세포 폐암종 세포를 사용한 FITC-표지화된 항-MUC1-C/ECD MAb 8E1의 내재화. 후기 엔도솜/리소좀 소포체에서의 캡핑 및 반점 염색 (화살표 표시).
도 13. 37℃에서 3시간 동안 H-1975 비소세포 폐암종 세포를 사용한 FITC-표지화된 항-MUC1-C/ECD MAb 6A6의 내재화. 후기 엔도솜/리소좀 소포체에서의 캡핑 및 반점 염색 (화살표 표시).
도 14. 37℃에서 3시간 동안 ZR-75-1 유방암종 세포를 사용한 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 6A6의 내재화.
도 15. 4℃ 또는 37℃에서 3시간 동안 MUC1-음성 HEK-293T 세포를 사용하여 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 염색을 수행하였을 때, 있다 해도 염색은 거의 일어나지 않았다.
도 16. 37℃에서 3시간 동안 MOLM-14 AML 세포를 사용한 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 8E1의 내재화.
도 17. 37℃에서 3 hr 동안 K562/MUC1siRNA 및 K562/CsiRNA CML 세포를 사용한 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 8E1의 내재화.
도 18. 4℃에서 ZR-75-1 유방암종 세포에서의 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 6A6의 원형질막 염색, 및 RFP 초기 엔도솜 마커와 그의 공동 국재화.
도 19. 37℃에서 ZR-75-1 유방암종 세포에서의 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 6A6의 내재화, 및 RFP-엔도사이트 마커와 그의 공동 국재화.
도 20. 37℃에서 H-1975 NSCLC 세포에서의 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 6A6의 내재화, 및 RFP-엔도사이트 마커와 그의 공동 국재화 (화살표 표시).
도 21. 37℃에서 H-1975 NSCLC 세포에서의 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 8E1의 내재화, 및 RFP-엔도사이트 마커와 그의 공동 국재화 (화살표 표시).
도 22. 37℃에서 H-1975 NSCLC 세포에서의 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 8E1의 내재화, 및 RFP-리소좀 마커와 그의 공동 국재화 (화살표 표시).
도 23. 37℃에서 H-1975 NSCLC 세포에서의 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 6A6의 내재화, 및 RFP-리소좀 마커와 그의 공동 국재화 (화살표 표시).
도 24. 37℃에서 3시간 동안 마우스 NSCLC (KW-814) 세포를 사용한 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 6A6의 내재화.
도 25. 37℃에서 3시간 동안 K562 CML 세포를 사용한 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 8E1 및 6A6의 내재화. IgG 표지화를 음성 대조군으로서 사용하였다. RFP-리소좀 IF를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 26. 37℃에서 RFP-엔도사이트 마커로 형질감염된 H-1975 NSCLC 세포의 면역형광 (우측 패널). 알렉사 플루오르 488-표지화된 이소형 대조군 IgG 항체와 함께 인큐베이션된 RFP-엔도사이트 마커로 형질감염된 H-1975 세포의 염색 (중간 패널).
도 27. 37℃에서 RFP-리소좀 마커로 형질감염된 H-1975 NSCLC 세포의 면역형광 (우측 패널). 알렉사 플루오르 488-표지화된 이소형 대조군 IgG 항체와 함께 인큐베이션된 RFP-리소좀 마커로 형질감염된 H-1975 세포의 염색 (중간 패널).
도 28. 37℃에서 H-1975 NSCLC 세포에서의 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 항체 8E1의 내재화, 및 RFP-리소좀 마커와 그의 공동 국재화.
도 29. 마우스 384 백신접종으로부터 항체 클론 선별.
도 30. 박테리아에서 제조된 MUC1 단백질과 항-MUC1-C/ECD 항체의 상호작용.
도 31. HCT-116/벡터 및 HCT-116/MUC1 세포를 30 min 동안 7B8 또는 마우스 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린-플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology))와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔(FACScan)에 의해 반응성을 검출하였다. 본 결과는 HCT-116/벡터 세포 (MUC1-음성)와 달리, MUC1-양성 HCT-116/MUC1 세포에서 7B8의 강한 반응성이 관찰되었다는 것을 입증한다.
도 32. ZR-75-1 유방암종 세포를 30 min 동안 7B8 또는 마우스 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린-플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔에 의해 반응성을 검출하였다. 본 결과는 IgG 대조군과 달리, 7B8이 ZR-75-1 세포와 강하게 반응하였다는 것을 입증한다.
도 33. ZR-75-1 유방암종 세포, MCF-7 유방암종 세포 및 HCT-116/MUC1 결장암종 세포를 30 min 동안 7B8과 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린-플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔에 의해 반응성을 검출하였다. 본 결과는 7B8이 상기의 모든 세포 유형과 강하게 반응하였다는 것을 입증한다.
도 34. MDA-MB-468/CshRNA 및 MDA-MB-468/MUC1shRNA 삼중 유방암종 세포 MCF-7 유방암종 세포를 30 min 동안 IgG와 함께, 또는 7B8과 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린-플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔에 의해 반응성을 검출하였다. 본 결과는 MDA-MB-468/MUC1shRNA (MUC1-하향 조절) 세포와 달리, MUC1-양성 MDA-MB-468/CshRN세포에서 7B8의 강한 반응성이 관찰되었다는 것을 입증한다.
도 35. ZR-75-1 유방암종 세포, MCF-7 유방암종 세포 및 HCT-116/MUC1 결장암종 세포를 30 min 동안 2B11과 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린-플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔에 의해 반응성을 검출하였다. 본 결과는 2B11이 3가지 세포 유형 모두와 강하게 반응하였다는 것을 입증한다.
도 36. ZR-75-1 유방암종 세포, MCF-7 유방암종 세포 및 HCT-116/MUC1 결장암종 세포를 30 min 동안 4G5와 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린-플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔에 의해 반응성을 검출하였다. 본 결과는 4G5가 3가지 세포 유형 모두와 강하게 반응하였다는 것을 입증한다.
도 37. HCT116/MUC1-야생형 및 HCT116/MUC1-CQC→AQA 돌연변이체 세포를 30 min 동안 7B8과 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린-플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔에 의해 반응성을 검출하였다. 본 결과는 상기 두 세포 유형 모두와 7B8의 강한 반응성을 입증하는 것이며, 이는 MUC1-C/MUC1-C 동종이량체화가 7B8의 결합을 위해 요구되는 것은 아니라는 것을 시사하는 것이다.
도 38. 항원으로 플레이트를 코팅하고, 다중의 상이한 농도의 정제된 항체 7B8, 4G5 및 2B11과의 반응성에 의해 ELISA 검정법을 수행하였다. 결합 곡선은 3가지 항체 모두와의 반응성이 유사하다는 것을 입증한다.
도 39. 7B8, 2B11 및 4G5 클론으로부터의 결과 요약.
도 40. 야생형 항원으로 플레이트를 코팅하고, 상이한 정제된 항체 7B8, 4G5 및 2B11과의 상이한 돌연변이체 단백질 (LTL→ATA; QFNQ→AFNQ 및 QFNA) 반응성에 의해 ELISA 검정법을 수행하였다. 돌연변이체 단백질에 대한 상이한 항체 클론의 감수성은 도면에 제시되어 있다.
도 41. 2B11 클론의 중쇄 및 경쇄로부터의 CDR 영역의 서열 분석.
도 42. 4G5 클론의 중쇄 및 경쇄로부터의 CDR 영역의 서열 분석.
도 43. 7B8 클론의 중쇄 및 경쇄로부터의 CDR 영역의 서열 분석.
도 44. 결장암종의 FFPE 절편에서의 7B8 항체를 사용한 IHC 분석.
도 45. 전체 세포 용해물을 사용하여 수행된 웨스턴 블롯팅에서 7B8의 성능을 분석하였고, 본 결과는 MUC1-C 단백질과 항-MUC1-C/ECD 항체의 특이적인 반응성을 입증한다. 293T 세포는 MUC1을 발현하지 않으며, 따라서, 웨스턴 블롯 분석에서 음성을 띤다.
도 46. 2B11, 7B8 및 4G5 항체를 사용하여 ELISA 검정법을 수행하였다. 본 결과는 상기 3가지 항체와 임의의 펩티드와의 반응성은 억제되지 않았음을 입증하는 것이며, 이는 에피토프가 선형이 아님을 시사하는 것이다.
도 47. 7B8 및 3D1 클론: 중복 펩티드의 선형 에피토프 맵핑. 전체 MUC1-C/ECD 영역 (58개의 아미노산)에 걸쳐 있는 3개의 중복 펩티드를 합성하였다. 플레이트를 MUC1-C/ECD 항원으로 코팅하고, P1, P2 또는 P3 펩티드의 존재 또는 부재하에서 7B8 또는 3D1 정제된 항체와 함께 인큐베이션시킴으로써 ELISA 검정법을 수행하였다.
도 48a-b: 점 돌연변이체를 사용한 7B8 및 3D1의 입체구조적 에피토프 맵핑. MUC1-C/ECD 영역에서 8개의 중요한 개별 점 돌연변이체를 생성하고, 각 단백질을 정제하였다. 별개의 96웰 플레이트를 상기 8개의 정제된 단백질로 코팅하였다. 7B8 및 3D1 정제된 항체를 각각의 상기 플레이트와 함께 인큐베이션시키고, ELISA 검정법을 수행하였다.
도 49. 7B8 및 3D1의 입체구조적 에피토프 맵핑. ATCC로부터 ZR-75-1 유방암종 세포를 입수하고, 10% 열 불활성화된 우태아 혈청 + 항생제를 포함하는 중에 유지시켰다. 세포를 정제된 MUC1-C/ECD 단백질과 함께, 또는 상응하는 부피의 PBS와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 7B8 또는 3D1 항체를 첨가하고, 유세포 분석법 분석을 위해 세포를 제조하였다. DF3 항체를 양성 대조군으로서 사용하고, 항-MUC1-C/CD 항체 (CD1)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 적절한 단계 후, 세포를 유세포 분석법(FLOW)에 의해 분석하였다.
도 50. 하이브리도마 441.3.3D1.D6.D11.B1.F10의 모노클로날 항체 서열분석. 냉동된 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이어서, PCR을 수행하여 항체의 가변 영역 (중쇄 및 경쇄)을 증폭시킨 후, 이어서, 이를 별개로 표준 클로닝 벡터로 클로닝하고, 서열분석하였다. VH 및 VL 삽입체 크기가 올바른 5개의 단일 콜로니를 서열분석하였다. 리더 아미노산 서열 (중쇄) 및 리더 아미노산 서열 (경쇄)은 도면에서 일반 텍스트로 제시되어 있고, CDR은 밑줄체로 표시되어 있고, 프레임워크 영역은 굵은체로 표시되어 있다. 중쇄 = 서열 번호 82; 경쇄 = 서열 번호 83.
도 51a-b. 7B8 및 3D1 항체의 항체-약물 접합체 (ADC) 및 상기 항체-약물-접합체의 생물학적 활성.
도 52a-b. 제공된 하이브리도마 536064-1의 전체 RNA의 아가로스 겔 전기영동. (도 52a) DNA 마커 III. (도 52b) 레인 M, DNA 마커 III; 레인 R, 536064-1의 전체 RNA.
도 53. 536064-1의 PCR 생성물의 아가로스 겔 전기영동. 레인 M, DNA 마커 III; 레인 1, VH 536064-1; 레인 2, VL 536064-1.
예시적인 실시양태에 관한 설명
본 발명자들은 MUC1-C 단백질의 외부 도메인 중 58개의 아미노산으로 이루어진 비-배출 부분 (non-shed portion)에 대한 항체를 생성하였다. 상기 항체는 MUC1-C의 상기 부분에 선택적으로 결합하고, 이로써, N-말단 영역 절단 이후, MUC1의 활성을 차단하는 기회를 제공하는 것으로 나타났다. 이는 또한 심지어 N-말단 MUC1 도메인의 절단 후에도 MUC1을 발현하는 암 세포에 치료학적 페이로드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 측면 및 다른 측면은 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
I. MUC1
A. 구조
MUC1은 정상 분비성 상피 세포의 정단 경계 상에서 발현되는 뮤신형 당단백질이다 (문헌 [Kufe et al., 1984]). MUC1은 단일 폴리펩티드로 합성되고, 이 전구체가 세포질 망상 구조 에서 2개의 서브유니트로 절단된 후, 이종이량체를 형성한다 (문헌 [Ligtenberg et al., 1992]). 상기 절단은 자가촉매적 과정에 의해 매개될 수 있다 (문헌 [Levitan et al., 2005]). 상기 >250 kDa의 MUC1 N-말단 (MUC1 N-ter, MUC1-N) 서브유니트는 고도로 보존된 변이에 의하여 불완전하고, O-연결된 글리칸에 의하여 변형된 가변적 개수의 20개의 아미노산으로 이루어진 직렬적 반복부 (tandem repeat)를 포함한다 (문헌 [Gendler et al., 1988]; [Siddiqui et al., 1988]). MUC1-N은 58개의 아미노산으로 이루어진 세포외 영역, 28개의 아미노산으로 이루어진 막통과 도메인 및 72개의 아미노산으로 이루어진 세포질 도메인 (CD)을 포함하는, ~23 kDa C-말단 서브유니트 (MUC1 C-ter, MUC1-C)와의 이량체화에 의해 세포 표면에 고정된다 (문헌 [Merlo et al., 1989]). 본 발명의 항체의 결합이 이루어지는 부분은 MUC1-C/ECD의 58개의 아미노산으로 부분 (이탤릭체로 표시)이다. 인간 MUC1-C 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00001
.
굵은체로 표시된 서열은 CD를 나타내고, 밑줄체로 표시된 부분은 올리고머 억제 펩티드이다. 정상 상피의 암종으로의 형질전환과 함께, MUC1은 세포질에서 및 전체 세포막에 걸쳐서 비정상적으로 과다발현된다 (문헌 [Kufe et al., 1984]; [Perey et al., 1992]). 세포막-결합된 MUC1은 클라트린-매개된 세포내이입에 의하여 엔도솜으로 표적화된다 (문헌 [Kinlough et al., 2004]). 또한, MUC1-N이 아닌, MUC1-C는 핵 (문헌 [Baldus et al., 2004]; [Huang et al., 2003]; [Li et al., 2003a]; [Li et al., 2003b]; [Li et al., 2003c]; [Wei et al., 2005]; [Wen et al., 2003]) 및 미토콘드리아 (문헌 [Ren et al., 2004])로 표적화된다.
B. 기능
MUC1-C는 ErbB 수용체 패밀리의 구성원과 (문헌 [Li et al., 2001b]; [Li et al., 2003c]; [Schroeder et al., 2001]), 그리고, Wnt 이펙터, β-카테닌 (문헌 [Yamamoto et al., 1997])과 상호작용한다. 표피 성장 인자 수용체 및 c-Src는 Y-46에서 MUC1 세포질 도메인 (MUC1-CD)을 인산화하여 MUC1 및 β-카테닌의 결합을 증가시킨다 (문헌 [Li et al., 2001a]; [Li et al., 2001b]). MUC1 및 β-카테닌의 결합은 또한 글리코겐 신타제 키나제 3β 및 단백질 키나제 Cδ에 의하여 조절된다 (문헌 [Li et al., 1998]; [Ren et al., 2002]). MUC1은 β-카테닌과 함께 핵에 공동 국재화되고 (문헌 [Baldus et al., 2004]; [Li et al., 2003a]; [Li et al., 2003c]; [Wen et al., 2003]), Wnt 표적 유전자의 전사를 공동 활성화시킨다 (문헌 [Huang et al., 2003]). 다른 연구들은 MUC1이 또한 p53에 직접 결합하고, p53 표적 유전자의 전사를 조절한다는 것을 밝혔다 (문헌 [Wei et al., 2005]). 특히, MUC1-C의 과다발현은 부착-비의존성 성장 및 종양생성능을 유도하기에 충분하다 (문헌 [Huang et al., 2003]; [Li et al., 2003b]; [Ren et al., 2002]; [Schroeder et al., 2004]).
II. 모노클로날 항체 제조
A. 일반적인 방법
MUC1-C/ECD에 대한 항체는 당업계에 널리 공지된 바와 같이 표준 방법에 의해 제조될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]; 미국 특허 4,196,265 참조). 모노클로날 항체 (MAb)를 생성하는 방법은 일반적으로 폴리클로날 항체를 제조하는 방법과 동일한 방식으로 시작된다. 상기 두 방법에 대한 제1 단계는 적절한 숙주의 백신접종 또는 이전 천연 감염에 기인하여 면역성을 띠는 대상체 확인 (identification)이다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 백신접종을 위해 제공된 조성물은 그의 면역원성을 달리할 수 있다. 그러므로, 펩티드 또는 폴리펩티드 면역원을 캐리어에 커플링시킴으로써 달성될 수 있는 바, 대개는 숙주 면역계를 부스팅시키는 것이 필요하다. 예시적이고, 바람직한 캐리어는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 우혈청 알부민 (BSA)이다. 다른 알부민, 예컨대, 오브알부민, 마우스 혈청 알부민 또는 토끼 혈청 알부민 또한 캐리어로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 캐리어 단백질에 접합시키는 수단은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 카르보디이미드 및 비스-디아조화 벤지딘을 포함한다. 또한 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 특정 면역원 조성물의 면역원성은 애주번트로 알려져 있는, 면역 반응의 비 특이 자극 인자의 사용으로 증강될 수 있다. 예시적이고, 바람직한 애주번트로는 완전 프로인트 애주번트 (사멸된 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 함유하는 면역 반응의 비 특이 자극 인자), 불완전 프로인트 애주번트, 및 수산화알루미늄 애주번트를 포함한다.
폴리클로날 항체 제조에 사용되는 면역원 조성물의 양은 면역원의 성질 뿐만 아니라, 백신접종을 위해 사용되는 동물에 따라 달라진다. 면역원을 투여하는 데 사용한 다양한 경로 (피하, 근육내, 진피내, 정맥내 및 복강내)가 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체 제조는 백신접종 후 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 샘플링함으로써 모니터링될 수 있다. 2차 부스터 주사 또한 제공할 수 있다. 적합한 역가를 달성할 때까지 부스팅 및 적정 과정을 반복한다. 원하는 수준의 면역원성을 수득하였을 때, 면역화된 동물을 출혈시킬 수 있고, 혈청을 단리시키고, 보관하고/거나, 동물을 사용하여 MAb를 생성할 수 있다.
백신접종 후, MAb 생성 프로토콜에서 사용하기 위해 항체를 생산할 수 있는 잠재능이 있는 체세포 , 특히, B 림프구 (B　세포)를 선택한다. 상기 세포는 생검된 비장 또는 림프절로부터, 순환 혈액으로부터 수득할 수 있다. 이어서, 면역화된 동물로부터의 항체 생산 B 림프구를 불멸 골수종 세포의 세포, 일반적으로, 면역화된 동물과 동일한 종의 것과, 또는 인간 또는 인간/마우스 키메라 세포와 융합시킨다. 하이브리도마 생산 융합 방법에서 사용하기에 적합화된 골수종 세포주는 바람직하게 항체를 생산하지 않고, 융합률이 높으며, 추후 오직 원하는 융합된 세포 (하이브리도마)의 성장을 지지하는 특정의 선별 배지 중에서 성장하지 못하게 효소가 결핍되어 있는 것이다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 다수의 골수종 세포 중 어느 하나가 사용될 수 있다 (문헌 [Goding, pp. 65-66, 1986]; [Campbell, pp. 75-83, 1984]). 예를 들어, 면역화된 동물이 마우스일 경우, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 Bul이 사용될 수 있고; 래트일 경우, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210이 사용될 수 있고; U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6은 인간 세포 융합물과 관련하여 모두 유용하다. 하나의 특정 뮤린 골수종 세포는 NS-1 골수종 세포주 (이는 또한 P3-NS-1-Ag4-1로도 명명됨)로서, 이는 세포주 저장 번호 GM3573을 요청함으로써 NIGMS 휴먼 제네틱 뮤턴트 셀 레포지토리(NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository)로부터 쉽게 이용가능하다. 사용될 수 있는 또 다른 마우스 골수종 세포주는 8-아자구아닌-저항성 마우스 뮤린 골수종 SP2/0 비-생산자 세포주이다. 더욱 최근에는 KR12 (ATCC CRL-8658; K6H6/B5 (ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668) 및 HMMA2.5 (문헌 [Posner et al., 1987])를 비롯한, 인간 B 세포와 함께 사용하기 위한 추가의 융합 파트너 세포주가 기술되었다. 본 발명에서 항체는, SP2/0 세포주의 IL-6 분비 유도체인 SP2/0/mIL-6 세포주를 사용하여 생성되었다.
항체 생산 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 생성하는 방법은 세포막의 융합을 촉진시키는 작용제 또는 작용제들 (화학물질 또는 전기)의 존재하에서, 비록 비율은 각각 20:1 내지 약 1:1로 달라질 수 있기는 하지만, 보통은 체세포를 골수종 세포와 약 2:1 비율로 혼합하는 것을 포함한다. 센다이(Sendai) 바이러스를 사용하는 융합 방법은 문헌 [Kohler and Milstein (1975; 1976)]에 기술되어 있고, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대, 37% (v/v) PEG를 사용하는 것은 문헌 [Gefter et al. (1977)]에 기술되어 있다. 전기적으로 유도된 융합 방법을 사용하는 것 또한 적절하다 (문헌 [Goding, pp. 71-74, 1986]).
융합 방법을 통해 보통 생존가능한 하이브리드는 저빈도로 약 1 x　10-6 내지 1 x　10- 8으로 제조된다. 그러나, 생존가능한 융합된 하이브리드는 선별 배지 중에서의 배양에 의해 주입된 모체 세포 (특히, 일반적으로 계속해서 무기한적으로 분열하는 주입된 골수종 세포)로부터 분화되기 때문에, 이는 문제가 되지 않는다. 선별 배지는 일반적으로 조직 배양 배지 중에서의 뉴클레오티드의 새로운 합성을 차단하는 작용제를 함유하는 것이다. 예시적이고, 바람직한 작용제는 아미노프테린, 메토트렉세이트, 및 아자세린이다. 아미노프테린 및 메토트렉세이트는 퓨린 및 피리미딘, 둘 모두의 새로운 합성을 차단하는 반면, 아자세린은 오직 퓨린 합성만을 차단한다. 아미노프테린 또는 메토트렉세이트가 사용되는 경우, 배지는 뉴클레오티드의 공급원으로서 히포크산틴 및 티미딘으로 보충된다 (HAT 배지). 아자세린이 사용되는 경우, 배지는 히포크산틴으로 보충된다. B 세포 공급원이 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus: EBV)로 형질전환된 인간 B 세포주일 경우, 골수종에 융합되지 않은 EBV 형질전환된 세포주를 제거하기 위해 와베인 (ouabain)이 첨가된다.
바람직한 선별 배지는 HAT 또는 와베인을 포함하는 HAT이다. 오직 뉴클레오티드 우회 경로 (salvage pathway)를 작동할 수 있는 세포만이 HAT 배지 중에서 생존할 수 있다. 골수종 세포에는 우회 경로의 중요한 효소, 예컨대, 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT)가 결여되어 있으며, 생존하지 못한다. B 세포는 이 경로를 작동할 수 있지만, 배양물 중에서 수명이 제한되어 있고, 일반적으로, 약 2주 이내에 죽는다. 그러므로, 선별 배지 중에서 생존할 수 있는 유일의 세포는 골수종 및 B　세포로부터 형성된 하이브리드이다. 융합을 위해 사용되는 B 세포의 공급원이 EBV 형질전환된 B 세포의 세포주일 경우, 여기서는 EBV 형질전환된 B 세포가 약물 사멸에 대하여 감수성이기 때문에, 하이브리드의 약물 선별을 위해 와베인 또한 사용되는 반면, 사용되는 골수종 파트너는 와베인 저항성인 것으로 선택된다.
배양은 특이 하이브리도마의 선별 기점이 되는 하이브리도마의 집단을 제공한다. 전형적으로, 하이브리도마 선별은 세포를 마이크로타이터 플레이트에서 단일-클론 희석에 의해 배양한 후, (약 2 내지 3주 후) 원하는 반응성에 대하여 개별 클론 상청액을 시험함으로써 수행된다. 검정법은 고감도이고, 간단하고, 신속하여야 하며, 예컨대, 방사성면역검정법, 효소 면역검정법, 세포독성 검정법, 플라크 검정법, 도트 면역결합 검정법 등과 같은 검정법이 있다.
이어서, 선별된 하이브리도마를 연속적으로 희석시키거나, 유세포 분석 분류에 의해 단일 세포 분류하고, 개별 항체 생산 세포주로 클로닝한 후, 이어서, 클론을 무기한적으로 증식시켜 mAb를 수득할 수 있다. 세포주는 2가지 기본 방식으로 MAb 제조를 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마 샘플을 동물 (예컨대, 마우스) 내로 (대개는 복강 내로) 주사할 수 있다. 임의적으로, 주사 전에 동물을 탄화수소, 특히, 오일, 예컨대, 프리스탄 (테트라메틸펜타데칸)으로 프라이밍한다. 인간 하이브리도마가 상기 방식으로 사용될 때, 종양 거부를 막기 위해 면역 손상된 마우스, 예컨대, SCID 마우스에 주사하는 것은 임의적이다. 주사맞은 동물에서는 융합된 세포 하이브리드에 의해 생산되는 특이 모노클로날 항체를 분비하는 종양이 발생하게 된다. 이어서, 동물의 체액, 예컨대, 혈청 또는 복수액을 채취하여(tapped) MAb를 고농도로 제공할 수 있다. 또한 개별 세포주를 시험관내에서 배양할 수 있으며, 여기서, MAb는 천연적으로 배양 배지로 분비되며, 그로부터 MAb는 고농도로 쉽게 수득될 수 있다. 대안적으로, 인간 하이브리도마 세포주는 세포 상청액 중에서 면역글로불린을 제조하는 데 시험관내에서 사용될 수 있다. 세포주는 고순도의 인간 모노클로날 면역글로불린을 회수할 수 있는 능력을 최적화시키기 위하여 무혈청 배지 중에서의 성장을 위해 적합화될 수 있다.
원하는 경우, 어느 수단에 의해서든 그에 의해 제조된 MAb를 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래프 방법, 예컨대, FPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체의 단편은 효소, 예컨대, 펩신 또는 파파인을 이용한 분해를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디술피드 결합의 절단에 의해 정제된 모노클로날 항체로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 의해 포함되는 모노클로날 항체 단편은 자동화된 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
모노클로날을 생성하는 데 분자 클로닝 접근법이 사용될 수 있다는 것 또한 고려된다. 이를 위해, 하이브리도마 세포주로부터 RNA를 단리시키고, 항체 유전자를 RT-PCR에 의해 수득하고, 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝한다. 대안적으로, 세포주로부터 단리된 RNA로부터 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리를 제조하고, 바이러스 항원을 사용하여 패닝함으로써 적절한 항체를 발현하는 파지미드를 선별한다. 종래 하이브리도마 기법에 비하여 상기 접근법이 가지는 장점은 대략 104배만큼 많은 항체를 단일 회차로 제조 및 스크리닝할 수 있고, H 및 L 쇄 조합에 의해 새로운 특이성을 생성함으로써 적절한 항체를 찾을 수 있는 기회를 추가로 증가시킨다는 점이다.
본 발명에서 유용한 항체의 제조를 교시하는 다른 미국 특허 (각각은 본원에서 참조로 포함된다)로는 조합 접근법을 사용하는 키메라 항체의 제조를 기술하는 미국 특허 5,565,332; 재조합 면역글로불린 제제를 기술하는 미국 특허 4,816,567; 및 항체-치료제 접합체를 기술하는 미국 특허 4,867,973을 포함한다.
B. 본 발명의 항체
본 발명에 따른 항체는 제1 경우에서 그의 결합 특이성에 의해, 본 경우에서는 MUC1-C/ECD에 대한 그의 결합 특이성에 의해 정의될 수 있고, 특히:
Figure 112016082964921-pct00002
(서열 번호 2)인 것으로 정의될 수 있다. 당업자는 당업계에 널리 공지된 기법을 사용하여 제공된 항체의 결합 특이서/친화도를 평가함으로써 상기 항체가 본 청구범위의 범주 내에 포함되는지 여부를 결정할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 면역글로불린 G (IgG) 항체 이소형이다. 인간에서 혈청 면역글로불린 중 대략 75%를 나타내는 것인, IgG는 순환 중에서 발견되는 가장 풍부한 항체 이소형이다. IgG 분자는 형질 B 세포에 의해 합성되고, 분비된다. 인간에는 4종의 IgG 서브부류 (IgG1, 2, 3, 및 4)가 존재하며, 이는 혈청 중의 그의 존재비 수준으로 명명된 것이다 (IgG1의 존재비가 가장 높다). 그 범위는 Fc 수용체에 대하여 높은 친화도를 가지는 것에서부터 친화성이 없는 것까지에 이른다.
IgG는 혈액 및 세포외 체액 중에서 발견되는 주요 항체 이소형으로, 이는 신체 조직의 감염을 조절할 수 있게 한다. 많은 종류의, 병원체를 나타내는 바이러스, 박테리아, 및 진균에 결합함으로써, IgG는 신체를 감염으로부터 보호한다. 이는 여러 면역 기전을 통해 수행하며: 병원체의 IgG-매개 결합은 그를 응집을 통해 함께 결합시키고, 고정화시키며; (옵소닌 작용으로 공지된) 병원체 표면의 IgG 코팅을 통해서 그는 식세포성 면역 세포에 의해 인식되고, 섭취될 수 있고; IgG는 병원체를 제거시키는 면역 단백질 생산의 캐스케이드인 보체계의 고전적 경로를 활성화시키고; IgG는 또한 독소에 결합하고, 그를 중화시킨다. IgG는 또한 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 세포내 항체-매개 단백질 분해에서 중요한 역할을 하는 데, 여기서, IgG는 시토졸에서 마킹된 비리온을 프로테아좀으로 지시하기 위해 TRIM21 (인간에서 IgG에의 친화도가 가장 큰 수용체)에 결합한다. IgG는 또한 II형 및 III형 과민증과도 관련이 있다. IgG 항체는 항체 반응의 부류 전환 및 성숙화 이후에 생성되고, 따라서, 이는 주로 2차 면역 반응에 참여한다. IgG는 작은 크기의 단량체로 분비되는 바, 이에 쉽게 조직으로 관류될 수 있다. 이는 인간 태반을 쉽게 통과할 수 있도록 촉진시켜 주는 수용체를 가지는 유일한 이소형이다. 모유에 분비된 IgA와 함께 태반을 통해 흡수된 잔류 IgG는 그 자신의 면역계가 발생하기 이전에 신생아에게 체액 면역을 제공한다. 초유, 특히, 소의 초유는 IgG를 높은 비율로 함유한다. 병원체에 대한 사전 면역을 가지는 개체에서, IgG는 항원 자극 후 약 24-48시간에 출현한다.
또 다른 측면에서, 항체는 그의 결합 특이성을 결정하는 그의 가변 서열에 의해 정의될 수 있다. 예는 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00003
추가로, 항체 서열은 임의적으로 하기에 더욱 상세하게 논의되는 방법을 사용하여 상기 제공된 서열로부터 달라질 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열은 (a) 가변 영역이 경쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있고, (b) 아미노산이 그의 변형에 의해 잔기의 화학적 특성에는 급격한 영향은 미치지 않으면서, 상기 기술된 것으로부터 달라질 수 있고 (소위 보존적 치환으로 명명된다), (c) 아미노산이 주어진 비율(%)만큼, 예컨대, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성에 의해 상기 기술된 것으로부터 달라질 수 있다는 점에서 상기 기술된 것으로부터 달라질 수 있다. 대안적으로, 항체를 코딩하는 핵산은 (a) 경쇄의 불변 도메인으로부터 분리될 수 있거나, (b) 그의 변형에 의해, 코딩되는 잔기에는 변화를 주지 않으면서, 상기 기술된 것으로부터 달라질 수 있거나, (c) 주어진 비율(%)만큼, 예컨대, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성에 의해 상기 기술된 것으로부터 달라질 수 있거나, 또는 (d) 저염 및/또는 고온 조건, 예컨대, 약 50℃ 내지 약 70℃에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl에 의해 제공되는 조건으로 예시되는 바와 같은, 고도로 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 능력에 의해 상기 기술된 것으로부터 달라질 수 있다.
아미노산 서열을 보존적으로 변이시킬 때, 아미노산의 아미노산의 하이드로파틱 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 아미노산의 하이드로파틱 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해되고 있다 (문헌 [Kyte and Doolittle, 1982]). 아미노산의 상대적인 하이드로파틱 특징이 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 최종적으로는 이것이 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 단백질의 상호작용을 정의한다고 인식되고 있다.
친수성에 기초하여 유사 아미노산을 효과적으로 치환할 수 있다는 것 또한 당업계에서 이해되고 있다. 그의 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관 관계가 있다고 미국 특허 4,554,101 (본원에서 참조로 포함된다)에 진술되어 있다. 미국 특허 4,554,101에서 상세하게 설명된 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 배정되었다: 염기성 아미노산: 아르기닌 (+3.0), 리신 (+3.0), 및 히스티딘 (-0.5); 산성 아미노산: 아스파르테이트 (+3.0 ± 1), 글루타메이트 (+3.0 ± 1), 아스파라긴 (+0.2), 및 글루타민 (+0.2); 친수성, 비이온성 아미노산: 세린 (+0.3), 아스파라긴 (+0.2), 글루타민 (+0.2), 및 트레오닌 (-0.4), 황 함유 아미노산: 시스테인 (-1.0) 및 메티오닌 (-1.3); 소수성, 비방향족 아미노산: 발린 (-1.5), 류신 (-1.8), 이소류신 (-1.8), 프롤린 (-0.5 ± 1), 알라닌 (-0.5), 및 글리신 (0); 소수성, 방향족 아미노산: 트립토판 (-3.4), 페닐알라닌 (-2.5), 및 티로신 (-2.3).
아미노산은 유사한 친수성을 가지는 또 다른 것 대신으로 치환될 수 있고, 생물학적으로 또는 면역학적으로 변형된 단백질을 생산할 수 있다는 것이 이해된다. 그러한 변이에서, 그의 친수성 값이 ± 2 이내인 아미노산 치환이 바람직하고, ± 1 이내인 것이 특히 바람직하며, ± 0.5 이내인 것이 더욱더 특히 바람직하다.
상기 개략적으로 설명된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 그의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 다양한 상기와 같은 특징들을 고려한 예시적인 치환이 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다.
C. 항체 서열 조작
다양한 실시양태에서, 다양한 이유에서, 예컨대, 발현 개선, 교차 반응성 개선, 하나 이상의 천연 이펙터 기능, 예컨대, 보체 활성화 또는 면역 세포 (예컨대, T 세포)의 동원의 표적에서 벗어난 결합 또는 폐기 (abrogation)의 감소를 위해 확인된 항체의 서열을 조작하는 것을 선택할 수 있다. 특히, IgM 항체는 IgG 항체로 전환될 수 있다. 하기는 항체 조작과 관련된 기법에 관한 일반 논의이다.
하이브리도마를 배양한 후, 세포를 용해시키고, 전체 RNA를 추출할 수 있다. RT와 함께 무작위 육량체를 사용하여 RNA의 cDNA 카피를 생성할 수 있고, 이어서, 인간 가변 유전자 서열 모두를 증폭시킬 수 있을 것으로 예상되는 PCR 프라이머의 다중 혼합물을 사용하여 PCR을 수행할 수 있다. PCR 생성물을 pGEM-T 이지(pGEM-T Easy) 벡터로 클로닝한 후, 표준 벡터 프라이머를 사용하여 자동 DNA 서열분석에 의해 서열분석할 수 있다. 하이브리도마 상청액으로부터 수집되고, 프로테인 G(Protein G) 칼럼을 사용하여 FPLC에 의해 정제된 항체를 사용하여 결합 및 중화 검정을 수행할 수 있다. 클로닝 벡터로부터의 중쇄 및 경쇄 Fv DNA를 론자(Lonza) pConIgG1 또는 pConK2 플라스미드 벡터로 서브클로닝하여 재조합 전장의 IgG 항체를 생성하고, 293 프리스타일(Freestyle) 세포 또는 론자 CHO 세포로 형질감염시키고, CHO 세포 상청액으로부터 수집하고, 정제할 수 있다.
최종 cGMP 제조 공정과 동일한 숙주 세포 및 세포 배양 공정에서 제조된 항체의 빠른 이용가능성은 공정 개발 프로그램 지속 기간을 단축시킬 수 있는 잠재능을 가진다. 론자는 CHO 세포에서 소량 (최대 50 g)의 항체를 신속하게 제조하기 위해, CDACF 배지에서 성장한 풀링된 형질감염체를 사용하는 일반 방법을 개발하였다. 실제 일과성 시스템보다 약간 느리기는 하지만, 그가 가진 장점으로는 생성물 농도가 더 높고, 생산 세포주와 동일한 숙주 및 공정을 사용한다는 점을 포함한다. 1회용 생물 반응 장치에서 모델 항체를 발현하는, GS-CHO 풀의 성장 및 생산성의 예: 유가식 모드로 작동되는 1회용 백 생물 반응 장치 배양물 (5 L 작업 부피) 중에서 2 g/L의 수거 항체 농도는 형질감염 9주 이내에 달성되었다.
pCon 벡터스(pCon Vectors)™는 전체 항체를 재발현시키기 쉬운 방식이다. 불변 영역 벡터는 pEE 벡터로 클로닝된 다양한 면역글로불린 불변 영역 벡터를 제공하는 벡터 세트이다. 상기 벡터는 인간 불변 영역을 포함하는 전장의 항체의 용이한 구축 및 GS 시스템™의 편리함을 제공한다.
항체 분자는 예를 들어, mAb의 단백질 분해 절단에 의해 제조된 단편 (예컨대, F(ab'), F(ab')2), 또는 예를 들어, 재조합 수단에 의해 제조가능한 단일 쇄 면역글로불린을 포함할 것이다. 상기 항체 유도체는 1가이다. 한 실시양태에서, 상기 단편은 서로, 또는 다른 항체 단편 또는 수용체 리간드와 함께 조합되어 "키메라" 결합 분자를 형성할 수 있다. 중요하게는, 상기 키메라 분자는 같은 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 치환기를 함유할 수 있다.
인간 요법에서 사용할 때 임의의 면역 반응을 약화시키기 위해서 비-인간 숙주에서 제조된 항체를 "인간화"시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 인간화 항체는 시험관내 또는 생체내 맥락에서 연구될 수 있다. 인간화 항체는 항체의 면역원성 부분을 상응하되, 비-면역원성인 부분으로 치환함으로써 제조될 수 있다 (즉, 키메라 항체). PCT 출원 PCT/US86/02269; EP 출원 184,187; EP 출원 171,496; EP 출원 173,494; PCT 출원 WO 86/01533; EP 출원 125,023; 문헌 [Sun et al. (1987)]; [Wood et al. (1985)]; 및 [Shaw et al. (1988)]; 상기 참고 문헌 모두는 본원에서 참조로 포함된다. "인간화" 키메라 항체에 관한 일반 리뷰는 문헌 [Morrison (1985)] (이 또한 본원에서 참조로 포함된다)에 제시되어 있다. 대안적으로, "인간화" 항체는 CDR 또는 CEA 치환에 의해 제조될 수 있다. 문헌 [Jones et al. (1986)]; [Verhoeyen et al. (1988)]; [Beidler et al. (1988)]; 상기 모두 본원에서 참조로 포함된다.
관련된 실시양태에서, 항체는 개시된 항체의 유도체, 예컨대, 개시된 항체의 것과 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체 (예컨대, 키메라, 인간화 또는 CDR 이식된 항체)이다. 추가의 다른 실시양태에서, 항체는 완전한 인간 재조합 항체이다.
본 발명은 또한 이소형 변형도 고려한다. 상이한 이소형을 가지도록 Fc 영역을 변형시킴으로써 상이한 기능성을 달성할 수 있다. 예를 들어, IgG4로 변형시킴으로써 다른 이소형과 관련된 면역 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다.
변형된 항체는 표준 분자 생물학적 기법을 통한 발현, 또는 폴리펩티드의 화학적 합성을 비롯한, 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의해 제조될 수 있다. 재조합 발현 방법은 본 명세서 어디에서나 다루고 있다.
D. 발현
본 발명에 따른 핵산은 임의적으로 다른 단백질 서열에 연결된 항체를 코딩할 것이다. 본 출원에서 사용되는 바, "MUC1-C 항체를 코딩하는 핵산"이라는 용어는 전체 세포 핵산이 없는, 단리된 핵산 분자를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 서열 중 임의의 것에 의해 코딩된 항체에 관한 것이다.
Figure 112016082964921-pct00004
본 발명의 DNA 세그먼트는 상기 기술된 서열의 생물학상 기능적으로 등가인 단백질 및 펩티드를 코딩하는 것을 포함한다. 상기 서열은 핵산 서열 및 그에 따라 코딩된 단백질 내에 천연적으로 존재하는 것으로 알려져 있는 코돈 중복 및 아미노산 기능적 등가성의 결과로서 생성될 수 있다. 대안적으로, 기능적으로 등가인 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술을 적용시킴으로써 생성될 수 있으며, 여기서, 단백질 구조 변화는 교환되는 아미노산의 특성을 고려함으로써 조작될 수 있다. 사람에 의해 디자인된 변이는 부위 지정 돌연변이유발 기법을 적용시킴으로써 도입될 수 있거나, 하기 기술되는 바와 같이, 무작위로 도입되고, 원하는 기능을 위해 추후에 스크리닝될 수 있다.
특정 실시양태 범위 내에서, 발현 벡터는 그로부터 발현된 폴리펩티드를 제조 및 단리시키기 위해 MUC1-C 리간드 트랩을 발현시키기 위해 사용된다. 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 유전자 요법에 사용된다. 발현은 적절한 신호가 벡터에 제공되는 것을 필요로 하며, 이는 다양한 조절 요소, 예컨대, 숙주 세포에서 관심 유전자의 발현을 구동시키는, 바이러스 및 포유동물 공급원, 둘 모두로부터의 인핸서/프로모터를 포함한다. 숙주 세포에서 메신저 RNA 안정성 및 번역가능성을 최적화시키도록 디자인된 요소 또한 정의된다. 약물 선별 마커의 발현을 폴리펩티드의 발현에 연관시키는 요소인 바, 생성물을 발현하는 영구적인 안정한 세포 클론을 확립하기 위해 다수의 우성 약물 선별 마커를 사용하기 위한 조건 또한 제공한다.
본 출원 전역에 걸쳐, "발현 구축물"이라는 용어는 핵산 코딩 서열 중 일부 또는 그 모두가 전사될 수 있는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산을 함유하는 임의 유형의 유전자 구축물을 포함하는 것을 의미한다. 전사체는 단백질로 번역될 수 있지만, 그러할 필요는 없다. 특정 실시양태에서, 발현은 유전자의 전사, 및 mRNA의 유전자 생성물로의 번역, 둘 모두를 포함한다. 다른 실시양태에서, 발현은 오직 관심 유전자를 코딩하는 핵산의 전사만을 포함한다.
"벡터"라는 용어는 그의 복제가 이루어질 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 핵산 서열이 그 안으로 삽입될 수 있는 캐리어 핵산 분자를 의미하는 것으로 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있는데, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 이물질 (foreign)이라는 것, 또는 서열이 세포내 서열과 상동성이기는 하지만, 숙주 세포 핵산 내의 위치에서 그 서열은 보통 관찰되지 않는다는 것을 의미한다. 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체 (예컨대, YAC)를 포함한다. 당업자는 문헌 [Sambrook et al. (1989)] 및 [Ausubel et al. (1994)] (이 둘 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 표준 재조합 기법을 통해 잘 장치함으로써 벡터를 구축할 수 있을 것이다.
"발현 벡터"라는 용어는 전사될 수 있는 유전자 생성물 중 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 의미한다. 일부 경우에서, RNA 분자는 이어서, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에서, 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 제조에서 상기 서열은 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있는데, 이는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역을 위해 필요한 핵산 서열을 의미한다. 전사 및 번역을 지배하는 제어 서열 이외에도, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능도 발휘할 수 있는 핵산 서열을 함유할 수 있으며, 그는 하기에 기술된다.
1. 조절 요소
"프로모터"는 전사 개시 및 속도를 제어하는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 이는 예컨대, RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전자 요소를 함유할 수 있다. "작동적으로 배치된," "작동적으로 연결된," "제어하에" 및 "전사 제어하에"라는 어구는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 핵산 서열과 관련된 올바른 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 의미한다. 프로모터는 "인핸서"와 함께 사용될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수도 있는데, 여기서, 인핸서란 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용성 조절 서열을 의미한다.
프로모터는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치하는 5' 비-코딩 서열을 단리시킴으로써 수득될 수 있는 바, 이에 유전자 또는 서열과 천연적으로 결합된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 "내인성"인 것으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 핵산 서열의 하류 또는 상류에 위치하는 것으로서, 상기 서열과 천연적으로 결합된 것일 수 있다. 대안적으로, 그의 천연 환경에서는 핵산 서열과 천연적으로 결합하고 있지 않은 프로모터를 의미하는, 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 세그먼트를 배치함으로써 특정의 장점을 얻을 수 있을 수 있다.
재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 그의 천연 환경에서는 핵산 서열과 천연적으로 결합하고 있지 않은 인핸서를 의미한다. 상기 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 원핵, 바이러스, 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "천연적으로 발생하지 않는," 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 제조하는 것 이외에도, 상기 서열은 본원에 개시된 조성물과 함께, PCR™을 비롯한, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (미국 특허 4,683,202, 미국 특허 5,928,906 (상기 특허는 각각 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 추가로, 무핵 세포 소기관, 예컨대, 미토콘드리아, 엽록체 등 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열 또한 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
발현을 위해 선택된 세포 유형, 세포 소기관, 및 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이라는 것은 당연하다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위하여 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합을 사용하는 것에 대해 알고 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989)] (본원에서 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다. 사용되는 프로모터는 구성적, 조직 특이성, 유도성일 수 있고/거나, 적절한 조건하에서 도입된 DNA 세그먼트의 고수준의 발현을 지시하는 데 유용하고, 예컨대, 재조합 단백질 및/또는 펩티드를 대규모로 제조하는 데 이롭다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
하기 표 3에는 본 발명과 관련하여 유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있는 수개의 요소/프로모터가 열거되어 있다. 본 목록은 발현 촉진에 관여하는 모든 가능한 요소를 철저하게 제시한 것으로 의도된 것이 아니며, 이는 단지 그에 대한 예시일 뿐이다. 하기 표 4는 특이 자극에 대한 반응으로 활성화될 수 있는 핵산 서열의 영역인 유도성 요소의 예를 제공하는 것이다.
Figure 112016082964921-pct00005
Figure 112016082964921-pct00006
Figure 112016082964921-pct00007
Figure 112016082964921-pct00008
조직 특이성 프로모터 또는 요소의 아이덴티티 뿐만 아니라, 그의 활성을 특징 규명하는 검정법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 영역의 예로는 인간 LIMK2 유전자 (문헌 [Nomoto et al. 1999]), 소마토스타틴 수용체 2 유전자 (문헌 [Kraus et al., 1998]), 뮤린 정소상체 레티노산-결합 유전자 (문헌 [Lareyre et al., 1999]), 인간 CD4 (문헌 [Zhao-Emonet et al., 1998]), 마우스 알파2 (XI) 콜라겐 (문헌 [Tsumaki, et al., 1998]), D1A 도파민 수용체 유전자 (문헌 [Lee, et al., 1997]), 인슐린 유사 성장 인자 II (문헌 [Wu et al., 1997]), 인간 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (문헌 [Almendro et al., 1996])을 포함한다. 종양 특이성 프로모터 또한 본 발명에서 사용될 수 있는 것을 알 수 있다. 상기와 같은 일부 프로모터는 하기 표 5에 기술되어 있다.
Figure 112016082964921-pct00009
Figure 112016082964921-pct00010
Figure 112016082964921-pct00011
코딩 서열을 효율적으로 번역하는 데 특이 개시 신호 또한 필요할 수 있다. 이 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 비롯한, 외인성 번역 제어 신호가 제공되어야 할 필요가 있을 수 있다. 당업계의 숙련가는 쉽게 이를 결정하고, 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 전체 삽입체가 확실하게 번역될 수 있도록 하기 위해서는 개시 코돈이 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 함께 "프레임내"에 존재하여야 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성인 것일 수 있다. 발현율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함함으로써 증강될 수 있다.
2. IRES
본 발명의 특정 실시양태에서, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 요소의 용도가 다중유전자, 또는 폴리시스트론성 메시지를 생성하는 데 이용된다. IRES 요소는 5'-메틸화된 캡 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고, 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다 (문헌 [Pelletier and Sonenberg, 1988]). 피코르나바이러스 과의 두 구성원 (폴리오 바이러스 및 뇌심근염 바이러스)으로부터 유래된 IRES 요소 (문헌 [Pelletier and Sonenberg, 1988]) 뿐만 아니라, 포유동물 메시지로부터의 IRES (문헌 [Macejak and Sarnow, 1991])가 기술되었다. IRES 요소는 이종성 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 각각이 IRES에 의해 이격되어 있는 다중 오픈 리딩 프레임은 함께 전사될 수 있고, 이로써, 폴리시스트론성 메세지가 생성될 수 있다. IRES 요소에 의해, 각 오픈 리딩 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근가능하다. 다중 유전자는 단일 메세지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용함으로써 효율적으로 발현될 수 있다 (미국 특허 5,925,565 및 5,935,819 (본원에서 참조로 포함된다) 참조).
3. 다목적 클로닝 부위
벡터는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있으며, 이들 중에서 임의의 것은 벡터를 절단하기 위하여 표준 재조합 기술과 함께 이용될 수 있다. 문헌 [Carbonelli et al., 1999], [Levenson et al., 1998], 및 [Cocea, 1997] (본원에서 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다. "제한 효소 분해"란 핵산 분자 중 오직 특이 위치에서만 작용하는 효소로 핵산 분자를 촉매적으로 절단하는 것을 의미힌다. 이러한 제한 효소들 다수는 상업적으로 이용가능하다. 상기 효소의 용도는 당업자에 의해 널리 이해되고 있다. 빈번하게는, 외인성 서열을 벡터에 라이게이션시키기 위하여 MCS 내부를 절단하는 제한 효소를 이용하여 벡터를 선형화 또는 단편화시킨다. "라이게이션"이란 서로 인접하여 있거나, 또는 인접하지 않은 두 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 의미한다. 제한 효소 및 라이게이션 반응을 포함하는 기법은 재조합 기술분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다.
4. 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵생물 RNA 분자는 RNA 스플라이싱을 거쳐 1차 전사체로부터 인트론을 제거한다. 게놈 진핵생물 서열을 함유하는 벡터는 단백질 발현을 위해 전사체의 적절한 프로세싱이 확실히 진행될 수 있도록 공여자 및/또는 수용자 스플라이싱 부위를 필요로 할 수 있다 (문헌 [Chandler et al., 1997] (본원에서 참조로 포함된다) 참조).
5. 종결 신호
본 발명의 벡터 또는 구축물은 일반적으로 적어도 1종의 종결 신호를 포함할 것이다. "종결 신호" 또는 "종결 인자"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특이 종결에 관여하는 DNA 서열로 구성된다. 따라서, 특정 실시양태에서, RNA 전사체의 제조를 종료하는 종결 신호가 고려된다. 생체내에서 바람직한 메세지 수준을 달성하는 데에는 종결 인자가 필요할 수 있다.
진핵생물 시스템에서, 종결 인자 영역은 또한 폴리아데닐화 부위를 노출시키기 위해 새 전사체의 부위 특이 절단을 허용하는 특이 DNA 서열을 포함할 수 있다. 이는 약 200개의 A 잔기 (폴리A)로 이루어진 스트레치를 전사체 3' 단부에 부가하기 위해 특수화된 내인성 폴리머라제에 신호를 전달한다. 폴리A 테일로 변형된 RNA 분자는 더욱 안정적인 것으로 보이며, 더욱 효율적으로 번역된다. 따라서, 진핵생물을 포함하는 다른 실시양태에서, 상기 종결 인자는 RNA의 절단을 위한 신호를 포함하는 것이 바람직하고, 종결 인자 신호는 메세지의 폴리아데닐화를 촉진시키는 것이 더욱 바람직하다. 종결 인자 및/또는 폴리아데닐화 부위 요소는 메세지 수준을 증강시키고/거나, 카세트로부터 다른 서열로의 번역 초과(read-through)를 최소화하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에서의 사용을 위해 고려되는 종결 인자로는 본원에 기술되거나, 또는 당업계의 숙련가에게 공지된, 임의의 공지된 전사 종결 인자를 포함하며, 예를 들어, 유전자의 종결 서열, 예컨대, 예를 들어, 소 성장 호르몬 종결 인자 또는 바이러스 종결 서열, 예컨대, 예를 들어, SV40 종결 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 종결 신호는 예컨대, 서열 말단절단에 기인한 전사가능한 또는 번역가능한 서열의 결핍일 수 있다.
6. 폴리아데닐화 신호
발현, 특히 진핵생물 발현에서는 전형적으로 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 위해 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 발명의 성공적인 실시에 중요하지는 않을 것으로 사료되고/거나, 상기와 같은 임의 서열이 사용될 수 있다. 특정 실시양태는 다양한 표적 세포에서 잘 작용하는 것으로 알려져 있고/거나, 편리한, SV40 폴리아데닐화 신호 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화는 전사체의 안정성을 증가시킬 수 있거나, 또는 세포질 수송을 촉진시킬 수 있다.
7. 복제 기점
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위하여, 그 위치에서 복제가 개시되는 것인 특이 핵산 서열인 하나 이상의 복제 기점 부위 (대개는 "ori"로 명명됨)를 함유할 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포가 효모일 경우, 자율 복제 서열 (ARS)이 사용될 수 있다.
8. 선별가능한 및 스크리닝가능한 마커
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물을 함유하는 세포는 발현 벡터 중에 마커를 포함함으로써 시험관내에서 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 상기 마커는 세포에 식별가능한 변화를 부여함으로써 발현 벡터를 함유하는 세포가 용이하게 확인될 수 있도록 허용할 것이다. 일반적으로, 선별가능한 마커는 선별될 수 있도록 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선별가능한 마커는 마커 존재가 그가 선별될 수 있도록 하는 것인 반면, 음성 선별가능한 마커는 그의 존재가 그의 선별을 막는 것이다. 양성 선별가능한 마커의 예로는 약물 저항성 마커가 있다.
보통, 약물 선별 마커를 포함하는 것이 형질전환체의 클로닝 및 확인에 도움을 주며, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 유용한 선별가능한 마커이다. 조건 실행에 기초하여 형질전환체가 식별될 수 있도록 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에도, 스크리닝가능한 마커, 예컨대, 그의 기본 원리는 비색 분석인 것인 GFP를 비롯한, 다른 유형의 마커 또한 고려된다. 대안적으로, 스크리닝가능한 효소, 예컨대, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT)가 사용될 수 있다. 당업자는 또한 면역학적 마커를 사용하는 방법, 가능하게는 FACS 분석과 함께 사용하는 방법에 대해 알 것이다. 사용되는 마커는 그가 유전자 생성물을 코딩하는 핵산과 함께 동시에 발현될 수 있는 바, 중요하지는 않을 것으로 사료된다. 선별가능한 및 스크리닝가능한 마커의 추가 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
9. 바이러스 벡터
세포를 효율적으로 감염시키거나, 그에 유입될 수 있고, 숙주 세포 게놈 내로 통합되고, 바이러스 유전자를 안정적으로 발현할 수 있는 특정 바이러스 벡터의 능력을 통해 다수의 상이한 바이러스 벡터 시스템이 개발되고, 적용되어 왔다 (문헌 [Robbins et al., 1998]). 바이러스 시스템은 현재 생체외 및 생체내 유전자 전달을 위한 벡터로서의 사용을 위해 개발 중에 있다. 예를 들어, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터는 질환, 예컨대, 암, 낭포성 섬유증, 고셰병, 신장 질환 및 관절염 치료에 대해 현재 평가 중에 있다 (문헌 [Robbins and Ghivizzani, 1998]; [Imai et al., 1998]; 미국 특허 5,670,488). 하기 기술되는 각종 바이러스 벡터는 특정 유전자 치료학적 적용에 따라 구체적인 장점 및 단점을 나타낸다.
아데노바이러스 벡터. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스 발현 벡터는 발현 구축물의 전달을 위해 고려된다. "아데노바이러스 발현 벡터"란, (a) 구축물 패키지를 지원하고, (b) 궁극적으로는 그 안에 클로닝된 조직 또는 세포 특이 구축물을 발현하는 데 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구축물을 포함하는 것을 의미한다.
아데노바이러스는 선형 이중 가닥 DNA를 포함하며, 게놈 크기는 30 내지 35 kb 범위이다 (문헌 [Reddy et al., 1998]; [Morrison et al., 1997]; [Chillon et al., 1999]). 본 발명에 따른 아데노바이러스 발현 벡터는 유전적으로 조작된 형태의 아데노바이러스를 포함한다. 아데노바이러스 유전자 전달이 가지는 장점으로는 비-분열 세포, 중간 크기의 게놈을 비롯한, 매우 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있는 능력, 조작의 용이함, 높은 감염성 및 고 역가로 성장할 수 있는 능력을 포함한다 (문헌 [Wilson, 1996]). 추가로, 아데노바이러스 DNA는 다른 바이러스 벡터와 관련된 잠재적인 유전독성 없이, 에피솜 방식으로 복제할 수 있기 때문에, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 염색체 통합을 유발하지 않는다. 아데노바이러스는 또한 구조상 안정적이며 (문헌 [Marienfeld et al., 1999]), 대규모 증폭 이후에 어떤 게놈 재배열도 검출되지 않았다 (문헌 [Parks et al., 1997]; [Bett et al., 1993]).
아데노바이러스 게놈의 가장 중요한 특징은 조기 영역 (E1, E2, E3 및 E4 유전자), 중간 영역 (pIX 유전자, Iva2 유전자), 후기 영역 (L1, L2, L3, L4 및 L5 유전자), 주요 후기 프로모터 (MLP), 역-말단-반복부 (ITR) 및 ψ 서열이다 (문헌 [Zheng, et al., 1999]; [Robbins et al., 1998]; [Graham and Prevec, 1995]). 조기 유전자 E1, E2, E3 및 E4는 감염 후 바이러스로부터 발현되고, 바이러스 유전자 발현, 세포 유전자 발현, 바이러스 복제, 및 세포 아포토시스 억제를 조절하는 폴리펩티드를 코딩한다. 추가로 바이러스 감염 동안, MLP는 활성화되고, 이로써, 아데노바이러스 캡시드화에 필요한 폴리펩티드를 코딩하는 후기 (L) 유전자의 발현이 이루어진다. 중간 영역은 아데노바이러스 캡시드의 성분을 코딩한다. 아데노바이러스 역 말단 반복부 (ITR; 길이 100-200 bp)는 시스 요소이고, 복제 기점으로서 작용하고, 바이러스 DNA 복제에 필요하다. ψ 서열은 아데노바이러스 게놈 패키징에 필요하다.
유전자 전달 벡터로서 사용하기 위한 아데노바이러스를 생성하는 공통된 접근법은 E2, E3 및 E4 프로모터의 유도에 관여하는 E1 유전자의 결실 (E1-)이다 (문헌 [Graham and Prevec, 1995]). 이어서, E1 유전자 대신 치료학적 유전자 또는 유전자들이 재조합적으로 삽입될 수 있고, 여기서, 치료학적 유전자(들)의 발현은 E1 프로모터 또는 이종성 프로모터에 의해 구동된다. 이어서, E1-, 복제-결핍성 바이러스는 트랜스로 E1 폴리펩티드를 제공하는 "헬퍼" 세포주 (예컨대, 인간 배아 신장 세포주 293)에서 증식된다. 따라서, 본 발명에서, E1-코딩 서열이 제거된 위치에 형질전환 구축물을 도입하는 것이 편리할 수 있다. 그러나, 아데노바이러스 서열 내의 구축물 삽입 위치는 본 발명에 중요하지 않다. 대안적으로, E3 영역, E4 영역의 부분, 또는 그 둘 모두가 결실될 수 있고, 여기서, 유전자 전달에서의 사용을 위해 진핵 세포에서 작동가능한 프로모터의 제어하에 이종성 핵산 서열은 아데노바이러스 게놈 내로 삽입된다 (미국 특허 5,670,488; 미국 특허 5,932,210 (상기 특허는 각각 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)).
비록 아데노바이러스 기반 벡터가 다른 벡터 시스템에 비하여 수개의 독특한 장점을 제공하기는 하지만, 이는 대개 벡터 면역원성, 재조합 유전자의 삽입을 위한 크기 제한 및 낮은 복제 수준에 의해 제한된다. 전장의 디스트로핀 유전자 및 복제에 필요한 말단 반복부를 포함하고, 오픈 리딩 프레임 모두가 결실된 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조 (문헌 [Haecker et al., 1996])는 상기 언급된 아데노바이러스가 가지는 단점에 일부 잠재적으로 유망한 장점을 제공한다. 벡터를 293 세포에서 헬퍼 바이러스를 이용하여 고 역가로 성장시켰고, 이는 mdx 마우스에서, 시험관내 근관에서, 및 생체내 근육 섬유에서 디스트로핀을 효과적으로 형질도입할 수 있었다. 헬퍼-의존성 바이러스 벡터는 하기에서 논의한다.
아데노바이러스 벡터를 사용하는 데 있어 중요 관심사는 패키징 세포주에서 벡터를 제조하는 동안 또는 개체의 유전자 요법 치료 동안 복제 능력이 있는 바이러스의 생성이다. 복제 능력이 있는 바이러스의 생성은 환자에게는 의도치 않은 바이러스 감염 및 병적 결과에 대한 심각한 위협을 제기할 수 있다. 문헌 [Armentano et al. (1990)]에는 복제 결함 아데노바이러스 벡터 제조가 기술되어 있으며, 이는 의도하지 않은, 복제 능력이 있는 아데노바이러스의 생성에 대한 잠재능을 제거한다고 주장한다 (미국 특허 5,824,544 (이는 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)). 복제 결함 아데노바이러스 방법은 결실된 E1 영역 및 재국재화된 단백질 IX 유전자를 포함하며, 여기서, 벡터는 이종성 포유동물 유전자를 발현한다.
아데노바이러스 벡터는 복제 결함, 또는 적어도 조건부로 복제 결함이어야 한다는 요건 이외에도, 아데노바이러스 벡터의 성질이 본 발명의 성공적인 실시에 중요하지는 않을 것으로 사료된다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 공지된 혈청형 및/또는 서브군 A-F 중 임의의 것일 수 있다. 서브군 C의 아데노바이러스 타입 5는 본 발명에서의 사용을 위해 조건부 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위해 바람직한 출발 물질이다. 아데노바이러스 타입 5는 그에 대한 다량의 생화학적 및 유전적 정보가 공지되어 있는 인간 아데노바이러스이기 때문이며, 이는 역사적으로 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 대부분의 구성을 위해 사용되어 왔다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 전형적인 벡터는 복제 결함이 있는 것이며, 아데노바이러스 E1 영역을 가지지 않을 것이다. 아데노바이러스 성장 및 조작은 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 시험관내 및 생체내에서 광범위한 숙주 범위를 나타낸다 (미국 특허 5,670,488; 미국 특허 5,932,210; 미국 특허 5,824,544). 이러한 바이러스 군은 고 역가로, 예컨대, 1 ml당 109 내지 1011 플라크 형성 단위로 수득될 수 있고, 이는 고도의 감염성을 띤다. 아데노바이러스 생활 주기는 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 외래 유전자는 에피솜 형태로 존재하며, 그러므로 숙주 세포에 대하여 낮은 유전독성을 띤다. 많은 실험, 기술 혁신, 임상전 연구 및 임상 시험에서는 현재 유전자 전달 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 것에 관하여 연구되고 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 유전자 전달 기반 유전자 요법이 간 질환 (문헌 [Han et al., 1999]), 정신 질환 (문헌 [Lesch, 1999]), 신경 질환 (문헌 [Smith, 1998]; [Hermens and Verhaagen, 1998]), 관상 동맥 질환 (문헌 [Feldman et al., 1996]), 근육 질환 (문헌 [Petrof, 1998]), 위장관 질환 (문헌 [Wu, 1998]) 및 각종 암, 예컨대, 결장직장암 (문헌 [Fujiwara and Tanaka, 1998]; [Dorai et al., 1999]), 췌장암, 방광암 (문헌 [Irie et al., 1999]), 두부경부암 (문헌 [Blackwell et al., 1999]), 유방암 (문헌 [Stewart et al., 1999]), 폐암 (문헌 [Batra et al., 1999]) 및 난소암 (문헌 [Vanderkwaak et al., 1999])을 위해 개발 중에 있다.
레트로바이러스 벡터. 본 발명의 특정 실시양태에서, 유전자 전달을 위해 레트로바이러스를 사용하는 것이 고려된다. 레트로바이러스는 RNA 게놈을 포함하는 RNA 바이러스이다. 숙주 세포가 레트로바이러스로 감염되었을 때, 게놈 RNA는 DNA 중간체로 역전사되고, 이는 감염된 세포의 염색체 DNA 내로 통합된다. 이러한 통합된 DNA 중간체는 프로바이러스로 지칭된다. 레트로바이러스가 가지는 특별한 장점은 면역원성 바이러스 단백질을 발현하지 않고, 숙주 DNA 내로 통합함으로써 관심 유전자 (예컨대, 치료학적 유전자)로 분열 세포를 안정적으로 감염시킬 수 있다는 점이다. 이론상, 통합된 레트로바이러스 벡터는 관심 유전자를 발현하면서, 감염된 숙주 세포가 살아있는 동안 유지될 것이다.
레트로바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 3개의 유전자: gag, pol, 및 env를 가지는데, 이는 2개의 긴 말단 반복부 (LTR) 서열 측면에 위치한다. gag 유전자는 내부 구조 (기질, 캡시드, 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 코딩하고; pol 유전자는 RNA-지정 DNA 폴리머라제 (역전사 효소)를 코딩하고, env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 코딩한다. 5' 및 3' LTR은 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진시키는 역할을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 모든 다른 시스-작용 서열을 함유한다.
본 발명의 재조합 레트로바이러스는 천연 바이러스의 구조, 감염성 유전자 중 일부가 제거되고, 표적 세포에 전달하고자 하는 핵산 서열로 대신 대체될 수 있도록 하는 방식으로 유전적으로 변형될 수 있다 (각각 미국 특허 5,858,744; 미국 특허 5,739,018 (본원에서 참조로 포함된다)). 바이러스에 의한 세포 감염 후, 바이러스는 그의 핵산을 세포 내로 주입하고, 레트로바이러스 유전 물질은 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이어서, 전달된 레트로바이러스 유전 물질은 숙주 세포 내에서 전사되고, 단백질로 번역된다. 다른 바이러스 벡터 시스템과 같이, 벡터 제조 동안 또는 요법 동안 복제 능력이 있는 레트로바이러스 생성이 주요 관심사가 된다. 본 발명에 사용하는 데 적합한 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 표적 세포를 감염시킬 수 있고, 그의 RNA 게놈을 역전사시킬 수 있고, 역전사된 DNA를 표적 세포 게놈 내로 통합시킬 수는 있지만, 표적 세포 내에서는 복제를 할 수 없고, 이로써, 감염성 레트로바이러스 입자를 생산하지 못하는, 결함이 있는 레트로바이러스 벡터이다 (예컨대, 표적 세포 내로 전달된 레트로바이러스 게놈은 비리온 구조 단백질을 코딩하는 유전자인 gag에, 및/또는 역전사 효소를 코딩하는 유전자인 pol에 결함이 있다). 따라서, 프로바이러스의 전사, 및 감염성 바이러스 내로의 조립은 적절한 헬퍼 바이러스의 존재하에서, 또는 오염성 헬퍼 바이러스의 동시 제조 없이 캡시드화가 가능한 적절한 서열을 함유하는 세포주에서 이루어진다.
레트로바이러스의 성장 및 유지는 당업계에 공지되어 있다 (미국 특허 5,955,331; 미국 특허 5,888,502 (상기 특허는 각각 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)). 문헌 [Nolan et al.]에는 이종성 유전자를 포함하는, 안정한 고 역가의, 헬퍼를 포함하지 않는 레트로바이러스의 제조가 기술되어 있다 (미국 특허 5,830,725 (이는 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)). 양생성 (emphoteric) 또는 동종(ecotrophic) 숙주 범위를 가지는 헬퍼를 포함하지 않는 레트로바이러스를 생성하는 데 유용한 패키징 세포주를 구축하는 방법 뿐만 아니라, 재조합 레트로바이러스를 사용하여 생체내 및 시험관내에서 진핵 세포 내로 관심 유전자를 도입하는 방법이 본 발명에서 고려된다 (미국 특허 5,955,331).
현재, 벡터-매개 유전자 전달에 대한 모든 임상 시험들은 대다수가 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 기반 레트로바이러스 벡터 유전자 전달을 이용한다 (문헌 [Robbins et al., 1998]; [Miller et al., 1993]). 레트로바이러스 유전자 전달의 단점으로는 안정적인 감염을 위해서는 진행 중인 세포 분열이 요구된다는 점 및 큰 유전자의 전달을 막는 코딩 능력을 포함한다. 그러나, 특정의 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 (예컨대, HIV), 시미안 (simian) 면역결핍 바이러스 (SIV) 및 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV)에 대한 최근의 개발은 잠재적으로 유전자 요법 적용을 위해 레트로바이러스 벡터를 생체내에서 사용할 수 있도록 허용한다 (문헌 [Amado and Chen, 1999]; [Klimatcheva et al., 1999]; [White et al., 1999]; [Case et al., 1999]). 예를 들어, HIV 기반 벡터는 비-분열 세포, 예컨대, 뉴런 (문헌 [Miyatake et al., 1999]), 섬 세포 (문헌 [Leibowitz et al., 1999]) 및 근육 세포 (문헌 [Johnston et al., 1999])를 감염시키는 데 사용되어 왔다. 레트로바이러스를 통한 유전자의 치료학적 전달은 현재 다양한 장애, 예컨대, 염증성 질환, 질환 (문헌 [Moldawer et al., 1999]), AIDS (문헌 [Amado and Chen, 1999]; [Engel and Kohn, 1999]), 암 (문헌 [Clay et al., 1999]), 뇌혈관 질환 (문헌 [Weihl et al., 1999]) 및 혈우병 (문헌 [Kay, 1998) 치료에 대하여 평가되고 있다.
헤르페스바이러스 벡터. 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) I형 및 II형은 70-80개의 유전자를 코딩하는, 대략 150 kb의 이중 가닥, 선형 DNA 게놈을 함유한다. 야생형 HSV는 세포를 용해 방식으로 감염시키고, 특정 세포 유형 (예컨대, 뉴런)에서 잠복기를 확립할 수 있다. 아데노바이러스와 유사하게, HSV 또한 근육 (문헌 [Yeung et al., 1999]), 귀 (문헌 [Derby et al., 1999]), 눈 (문헌 [Kaufman et al., 1999]), 종양 (문헌 [Yoon et al., 1999]; [Howard et al., 1999]), 폐 (문헌 [Kohut et al., 1998]), 뉴런 (문헌 [Garrido et al., 1999]; [Lachmann and Efstathiou, 1999]), 간 (문헌 [Miytake et al., 1999]; [Kooby et al., 1999]) 및 췌장도 (문헌 [Rabinovitch et al., 1999])를 비롯한, 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다.
HSV 바이러스 유전자는 세포 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사되고, 일시적으로 조절되어 대략 3개로 분간될 수 있는 단계 또는 동적 부류로 유전자 생성물을 전사하고, 이어서 합성한다. 이러한 유전자 단계는 즉시 조기 (IE) 또는 α 유전자, 조기 (E) 또는 β 유전자 및 후기 (L) 또는 γ 유전자로 지칭된다. 새로 감염된 세포의 핵에 바이러스의 게놈이 도착한 후 즉시 IE 유전자는 전사된다. 상기 유전자의 효율적인 발현은 사전 바이러스 단백질 합성을 필요로 하지 않는다. IE 유전자 생성물은 전사를 활성화시키고, 바이러스 게놈의 나머지를 조절하는 데 요구된다.
치료학적 유전자 전달에서의 사용을 위해서는 HSV는 복제 결함이 되어야 한다. 복제 결함 HSV 헬퍼 바이러스를 포함하지 않는 세포주를 생성하는 프로토콜은 기술되어 있다 (미국 특허 5,879,934; 미국 특허 5,851,826 (상기 특허는 각각 그 전문이 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)). α4 또는 Vmw175로도 알려져 있는, 한 IE 단백질인 ICP4는 바이러스 감염성 및 IE로부터 후기 전사로의 전이, 둘 모두를 위해서 절대적으로 요구된다. 따라서, HSV 유전자 발현 조절에 있어 그의 복잡하고, 다기능적인 성질 및 중심적인 역할에 기인하여, ICP4는 전형적으로 HSV 유전자 연구의 표적이 되어 왔다.
ICP4가 결실된 HSV 바이러스의 표현형 연구는 상기 바이러스가 유전자 전달 목적에 잠재적으로 유용할 것이라는 것을 시사한다 (문헌 [Krisky et al., 1998a]). 유전자 전달에 바람직한 것이 되게 만드는 것인, ICP4가 결실된 바이러스의 한 특성은, 바이러스 DNA 합성을 지시하는 단백질 뿐만 아니라, 바이러스의 구조 단백질을 코딩하는 바이러스 유전자의 발현 없이, 오직 5개의 다른 IE 유전자: ICP0, ICP6, ICP27, ICP22 및 ICP47만을 발현한다는 점이다 (문헌 [DeLuca et al., 1985]). 이러한 특성은 유전자 전달 후, 숙주 세포 대사 또는 면역 반응에 미칠 수 있는 가능한 유해 효과를 최소화시키는 데 바람직할 수 있다. ICP4 이외에도, IE 유전자 ICP22 및 ICP27의 추가의 결실은 HSV 세포독성 감소를 실질적으로 개선시키고, 조기 및 후기 바이러스 유전자 발현을 막았다 (문헌 [Krisky et al., 1998b]).
유전자 전달에서 HSV의 치료학적 잠재능은 다양한 시험관내 모델 시스템에서 및 생체내에서 질환, 예컨대, 파킨슨병 (문헌 [Yamada et al., 1999), 망막아세포종 (문헌 [Hayashi et al., 1999), 뇌내 및 진피내 종양 (문헌 [Moriuchi et al., 1998), B 세포 악성 종양 (문헌 [Suzuki et al., 1998), 난소암 (문헌 [Wang et al., 1998) 및 뒤시엔느 근위축증 (문헌 [Huard et al., 1997)에 대해서 입증되었다.
아데노 -관련 바이러스 벡터. 파르보바이러스 과의 구성원인 아데노-관련 바이러스 (AAV)는 유전자 전달 치료제로서의 사용이 증가되고 있는 인간 바이러스이다. AAV는 다른 바이러스 시스템에서는 발견되지 않은 여러 유익한 특징을 가지고 있다. 첫째, AAV는 비분열 세포를 비롯한, 광범위한 숙주 세포를 감염시킬 수 있다. 둘째, AAV는 상이한 종으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. 셋째, AAV는 어떤 인간 또는 동물 질환과도 연관이 없으며, 통합시 숙주 세포의 생물학적 특성을 변경시키는 것으로 보이지 않는다. 예를 들어, 인간 집단 중 80-85%가 AAV에 노출되어 온 것으로 추정된다. 마지막으로, AAV는 광범위한 물리적 및 화학적 조건하에서 안정적이며, 이로써, 생산, 보관 및 수송 요건에 적합하다.
AAV 게놈은 4,681개의 뉴클레오티드를 함유하는 선형 단일 가닥 DNA 분자이다. AAV 게놈은 일반적으로 길이가 대략 145 bp인 역 말단 반복부 (ITR)가 각 단부 측면에 위치하는 내부 비-반복형 게놈을 포함한다. ITR은 DNA 복제 기점, 및 바이러스 게놈에 대한 패키징 신호를 비롯한, 다중 기능을 한다. 게놈의 내부 비-반복 부분은 AAV 복제 (rep) 및 캡시드 (cap) 유전자로 알려져 있는 2개의 큰 오픈 리딩 프레임을 포함한다. rep 및 cap 유전자는 바이러스가 복제될 수 있도록 하고, 바이러스 게놈을 비리온 내로 패키징할 수 있도록 하는 바이러스 단백질을 코딩한다. AAV rep 영역으로부터 적어도 4개의 바이러스 단백질 패밀리, Rep 78, Rep 68, Rep 52, 및 Rep 40이 발현되는데, 이는 그의 겉보기 분자량에 따라 명명된 것이다. AAV cap 영역은 3개 이상의 단백질, VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다.
AAV는 AAV 비리온 형성을 위해 헬퍼 바이러스 (예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 백시니아)와의 공동 감염을 필요로 하는 헬퍼 의존성 바이러스이다. 헬퍼 바이러스와의 공동 감염 부재하에서, AAV는 바이러스 게놈이 숙주 세포 염색체 내로 삽입되지만, 감염성 비리온은 생산하지 않는 잠복 상태를 확립한다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염이 통합된 게놈을 "구제"하여 그를 복제시키고, 그의 게놈을 감염성 AAV 비리온 내로 패키징시킨다. 비록 AAV가 상이한 종으로부터의 세포를 감염시킬 수는 있지만, 헬퍼 바이러스는 숙주 세포와 동일한 종이어야 한다 (예컨대, 인간 AAV는 개 아데노바이러스와 공동 감염된 개 세포에서 복제될 것이다).
AAV는 AAV 게놈의 내부 비-반복 부분을 결실시키고, ITR 사이에 이종성 유전자를 삽입함으로써 관심 유전자를 전달하도록 조작되었다. 이종성 유전자는 표적 세포에서 유전자 발현을 구동할 수 있는 이종성 프로모터 (구성적, 세포 특이, 또는 유도성)에 기능적으로 연결될 수 있다. 이종성 유전자를 함유하는 감염성 재조합 AAV (rAAV)를 제조하기 위해, 적합한 생산자 세포주를 이종성 유전자를 함유하는 rAAV 벡터로 형질감염시킨다. 생산자 세포를 그의 각각의 내인성 프로모터 또는 이종성 프로모터의 제어하에서 AAV rep 및 cap 유전자를 보유하는 제2 플라스미드로 동시에 형질감염시킨다. 최종적으로, 생산자 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시킨다.
일단 상기 인자가 합치되고 나면, 비록 이는 야생형 AAV 게놈이기는 하지만, 이종성 유전자는 복제되고, 패키징된다. 표적 세포가 생성된 rAAV 비리온으로 감염되었을 때, 이종성 유전자는 유입되고, 표적 세포에서 발현된다. 표적 세포에는 rep 및 cap 유전자, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자가 없기 때문에, rAAV는 야생형 AAV를 추가로 복제, 패키징 또는 형성할 수 없다.
그러나, 헬퍼 바이러스의 사용은 많은 문제를 제기한다. 첫째, rAAV 생산 시스템에서의 아데노바이러스 사용은 숙주 세포가 rAAV 및 감염성 아데노바이러스, 둘 모두를 생산시킨다. 오염성인 감염성 아데노바이러스는 열 처리 (56℃에서 1시간)에 의해 불활성화될 수 있다. 그러나, 열 처리는 기능성 rAAV 비리온의 역가를 대략 50%만큼 하락시킨다. 둘째, 다양한 양의 아데노바이러스 단백질이 상기 제제에 존재한다. 예를 들어, 상기 rAAV 비리온 제제에서 수득된 총 단백질 중 대략 50% 이상의 단백질은 유리 아데노바이러스 섬유 단백질이다. 상기 아데노바이러스 단백질은 완전히 제거되지 않으면, 환자로부터 면역 반응을 유도하는 잠재능을 가진다. 셋째, 헬퍼 바이러스를 사용하는 AAV 벡터 생산 방법은 다량의 고 역가 감염성 헬퍼 바이러스의 사용 및 조작을 필요로 하는데, 이는 많은 건강상 및 안전상의 문제를 제기하며, 특히, 헤르페스바이러스의 사용과 관련하여 그러하다. 넷째, rAAV 비리온 생산 세포에서 헬퍼 바이러스 입자를 동시에 생산하는 것은 다량의 숙주 세포 공급원을 rAAV 비리온 생산으로부터 다른 방향으로 전환시키고, 이로써, 잠재적으로는 더 낮은 수율의 rAAV 비리온을 얻게 된다.
렌티바이러스 벡터. 렌티바이러스는 공통 레트로바이러스 유전자인 gag, pol, 및 env 이외에도, 조절 또는 구조 기능을 가지는 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 복잡성이 더 높기 때문에 잠복 감염 과정에서와 같이 바이러스는 그의 생활 주기를 조정할 수 있다. 렌티바이러스의 일부 예로는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 시미안 면역결핍 바이러스: SIV를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 병독성 유전자를 다중으로 약독화시킴으로써 생성되고, 예를 들어, 유전자env , vif , vpr , vpu 및 nef는 결실되고, 이로써, 생물학적으로 안전한 벡터가 제조된다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 핵산 서열의 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 발현을 위해 사용될 수 있다. 렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 레트로바이러스에서 발견되는 3가지 유전자: gag, pol 및 env를 가진다 (이는 2개의 긴 말단 반복부 (LTR) 서열 측면에 위치한다). gag 유전자는 내부 구조 (기질, 캡시드, 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 코딩하고; pol 유전자는 RNA-지정 DNA 폴리머라제 (역전사 효소), 프로테아제, 및 인테그라제를 코딩하고; env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 코딩한다. 5' 및 3' LTR은 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진시키는 역할을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 모든 다른 시스-작용 서열을 함유한다. 렌티바이러스는 vif , vpr , tat, rev, vpu, nef 및 vpx를 비롯한 추가 유전자를 가진다.
게놈의 역전사를 위해(tRNA 프라이머 결합 부위), 및 바이러스 RNA의 입자로의 효율적인 캡시드화를 위해(Psi 부위) 필요한 서열은 5' LTR에 인접하게 위치한다. 캡시드화(또는 레트로바이러스 RNA의 감염성 비리온 내로의 패키징)을 위해 필요한 서열이 바이러스 게놈으로부터 결손되었다면, cis 결함이 게놈 RNA의 캡시드화를 막는다. 그러나, 생성된 돌연변이체는 여전히 그대로 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Naldini et al., (1996)]; [Zufferey et al., (1997)]; 미국 특허 6,013,516; 및 5,994,136을 참조할 수 있다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산의 도입을 위해, 선별을 위해, 및 핵산의 숙주 세포 내로의 전달을 위해 필수적인 서열을 운반하도록 구성된다. 관심 벡터의 gag, pol 및 env 유전자 또한 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 관련 유전자를 선택된 벡터로 클로닝한 후, 이를 사용하여 관심 표적 세포를 형질전환시킨다.
패키징 기능, 즉, gag, pol 및 env, 뿐만 아니라, rev 및 tat를 운반하는 2개 이상의 벡터로 적합한 숙주 세포가 감염된 것인, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 미국 특허 5,994,136 (본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 이는 바이러스 gag 및 pol 유전자를 코딩하는 핵산을 제공할 수 있는 제1 벡터, 및 패키징 세포를 생산하는 바이러스 env를 코딩하는 핵산을 제공할 수 또 다른 벡터를 기술한다. 이종성 유전자, 예컨대, 본 발명에서 STAT-1α 유전자를 제공하는 벡터를 상기 패키징 세포 내로 도입함으로써 관심 외래 유전자를 운반하는 감염성 바이러스 입자를 방출하는 생산자 세포를 수득할 수 있다. env는 바람직하게는 인간 및 다른 종의 세포의 형질도입을 허용하는 암포트로픽 외피 단백질이다.
외피 단백질을 항체, 또는 특정 세포 유형의 수용체로의 표적화를 위한 특정 리간드와 연결시킴으로써 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 특이 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 코딩하는 또 다른 유전자와 함께 관심 서열 (조절 영역 포함)을 바이러스 벡터 내로 삽입함으로써, 예를 들어, 벡터는 이에 표적 특이적인 것이 된다.
바이러스 env 핵산 서열을 제공하는 벡터는 조절 서열, 예컨대, 프로모터 또는 인핸서와 작동가능하게 회합된다. 조절 서열은 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소, 인간 사이토메갈로바이러스 인핸서 또는 백시니아 P7.5 프로모터를 비롯한, 임의의 진핵성 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 일부 경우에서, 예컨대, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소와 같은 프로모터-인핸서 요소는 LTR 서열 내에 또는 그에 인접하게 위치한다.
이종성 또는 외래 핵산 서열, 예컨대, 본원에서 STAT-1α 코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 조절 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게, 이종성 서열은 프로모터에 연결되어 키메라 유전자를 생성한다. 이종성 핵산 서열은 또한 바이러스 LTR 프로모터-인핸서 신호, 또는 내부 프로모터의 제어하에 일 수 있고, 레트로바이러스 LTR 내에 보유된 신호를 여전히 트랜스진을 효율적으로 발현시킬 수 있다. 마커 유전자는 벡터의 존재에 대하여 검정하는 데, 및 이로써, 감염 및 통합을 확인하는 데 사용될 수 있다. 마커 유전자의 존재를 통하여 오직 삽입체를 발현하는 숙주 세포만을 확실하게 선별할 수 있고, 그를 성장시킬 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 항생제 및 다른 독성 물질, 예컨대, 스티디놀, 퓨로마이신, 히그로마이신, 네오마이신, 메토트렉세이트 등에 대한 저항성을 부여하는 단백질 및 세포 표면 마커를 코딩한다.
벡터를 형질감염 또는 감염을 통해 패키징 세포주 내로 도입한다. 패키징 세포주는 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 입자를 생산한다. 형질감염 또는 감염 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 패키징 벡터 및 전달 벡터의 패키징 세포주로의 공동 형질감염 후, 재조합 바이러스를 배양 배지로부터 회수하고, 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정한다. 따라서, 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공에 의해 일반적으로 우성 선별가능한 마커, 예컨대, neo, DHFR, Gln 신테타제 또는 ADA와 함께 패키징 구축물을 인간 세포주 내로 도입한 후, 적절한 약물의 존재하에 선별하고, 클론을 단리시킨다. 선별가능한 마커 유전자는 구축물 중 패키징 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
렌티바이러스 전달 벡터 (문헌 [Naldini et al. (1996)])는 시험관내에서 성장 정지된 인간 세포를 감염시키고, 성체 래트의 뇌 내로 직접 주사한 후 뉴런을 형질도입시키는 데 사용되어 왔다. 벡터는 생체내에서 마커 유전자를 뉴런 내로 전달하는 데 효율적이었고, 검출가능한 병상이 없는 경우 장기간의 발현이 달성되었다. 벡터의 단일 주사 후 10개월 동안 분석된 동물에서는 트랜스진의 평균 발현 수준에서는 어떤 감소도 없었고, 조직 병상 또는 면역 반응에 관한 징후도 없는 것으로 나타났다 (문헌 [Blomer et al., 1997]). 따라서, 본 발명에서, 생체외에서 재조합 렌티바이러스로 감염된 세포를 그래프팅(graft) 또는 이식할 수 있거나, 또는 생체내에서 세포를 감염시킬 수 있다.
다른 바이러스 벡터. 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터의 개발 및 유용성은 계속해서 개선 및 진화되고 있다. 다른 바이러스 벡터 예컨대, 폭스바이러스; 예컨대, 백시니아 바이러스 (문헌 [Gnant et al., 1999]; [Gnant et al., 1999]), 알파 바이러스; 예컨대, 신드비스 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스 (문헌 [Lundstrom, 1999]), 레오바이러스 (문헌 [Coffey et al., 1998]) 및 인플루엔자 A 바이러스 (문헌 [Neumann et al., 1999)가 본 발명에서의 사용을 위해 고려되고, 표적 시스템의 필수적인 특성에 따라 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 백시니아 바이러스 벡터는 본 발명에서의 사용을 위해 고려된다. 백시니아 바이러스는 이종성 유전자 발현을 위해 특히 유용한 진핵성 바이러스 벡터 시스템이다. 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스가 적절히 조작되었을 때, 단백질은 합성되고, 프로세싱되고, 원형질 막으로 수송된다. 유전자 전달 벡터로서의 백시니아 바이러스는 최근 예컨대, EMAP-II (문헌 [Gnant et al., 1999]), 내이 (문헌 [Derby et al., 1999]), 신경아교종 세포, 예컨대, p53 (문헌 [Timiryasova et al., 1999]) 및 다양한 포유동물 세포, 예컨대, P450 (미국 특허 5,506,138)와 같이, 인간 종양 세포로 유전자를 전달하는 것으로 입증되었다. 백시니아 바이러스의 제조, 성장 및 조작은 미국 특허 5,849,304 및 미국 특허 5,506,138(이는 각각 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
다른 실시양태에서, 신드비스 바이러스 벡터는 유전자 전달에서 사용하기 위한 것으로 고려된다. 신드비스 바이러스는 베네수엘라, 서부 및 동부 말 뇌염 바이러스와 같이 중요한 병원체를 포함하는 알파바이러스 속의 종이다 (문헌 [Garoff and Li, 1998]). 시험관내에서 신드비스 바이러스는 각종 조류, 포유동물, 파충류, 및 양서류 세포를 감염시킨다. 신드비스 바이러스 게놈은 길이가 11,703개의 뉴클레오티드 길이인, 단일 가닥 RNA의 단일 분자로 이루어진다. 게놈 RNA는 감염성을 띠고, 5' 말단에서 캡핑되고, 3' 말단에서 폴리아데닐화되고, mRNA로서의 역할을 한다. 백시니아 바이러스 26S mRNA의 번역을 통해 폴리단백질이 생산되고, 이는 바이러스, 및 가정컨대, 숙주 코딩된 프로테아제의 조합에 의해 공동으로 및 번역 후에 절단되어 3개의 바이러스 구조 단백질, 캡시드 단백질 (C) 및 2개의 외피 당단백질 (E1, 및 비리온 E2의 전구체 PE2)이 수득된다.
신드비스 바이러스의 3가지 특징은 그가 이종성 유전자의 발현을 위해 유용한 벡터라는 것을 제안한다. 첫째, 천연적으로 및 실험실에서 그의 넓은 숙주 범위. 둘째, 유전자 발현이 숙주 세포의 세포질에서 발생하고, 그는 속도가 빠르고 효율적이라는 점. 셋째, 간단하게는 감염 후 다양한 시점에 배양물을 비허용 온도로 옮겨 놓음으로써 이종성 코딩 서열의 발현을 조정하는 데 사용될 수 있는, RNA 합성에서 온도 감수성 돌연변이가 이용가능하다는 점. 신드비스 바이러스의 성장 및 유지는 당업계에 공지되어 있다 (미국 특허 5,217,879) (이는 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다).
키메라 바이러스 벡터. 키메라 또는 하이브리드 바이러스 벡터는 치료학적 유전자 전달에서의 사용을 위해 개발되고 있으며, 본 발명에서 사용하기 위한 것으로 고려된다. 키메라 폭스바이러스/레트로바이러스 벡터 (문헌 [Holzer et al., 1999]), 아데노바이러스/레트로바이러스 벡터 (문헌 [Feng et al., 1997]; [Bilbao et al., 1997]; [Caplen et al., 1999]) 및 아데노바이러스/아데노-관련 바이러스 벡터 (문헌 [Fisher et al., 1996]; 미국 특허 5,871,982)가 기술되었다.
상기 "키메라" 바이러스 유전자 전달 시스템은 2가지 이상의 모체 바이러스 종의 바람직한 특징을 이용할 수 있다. 예를 들어 윌슨(Wilson) 등은 하기 기술된, 아데노바이러스의 부분, AAV 5' 및 3' ITR 서열 및 선택된 트랜스진을 포함하는 키메라 벡터 구축물을 제공한다 (미국 특허 5,871,983 (이는 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)).
아데노바이러스/AAV 키메라 바이러스는 재조합 AAV/트랜스진 게놈을 표적 세포로 전달하는 셔틀로서 아데노바이러스 핵산 서열을 사용한다. 하이브리드 벡터 에서 사용되는 아데노바이러스 핵산 서열의 범위는 하이브리드 바이러스 입자를 제조하는 데 헬퍼 바이러스의 사용을 필요로 하는 최소 서열량에서부터, 결실된 유전자 생성물이 선택된 패키징 세포에 의해 하이브리드 바이러스 생산 과정에서 공급될 수 있는 것인 아데노바이러스 유전자의 단지 선택된 결실까지의 범위일 수 있다. 최소한, pAdA 셔틀 벡터에서 사용되는 아데노바이러스 핵산 서열은 모든 바이러스 유전자가 결실되어 있고, 오직 아데노바이러스 게놈 DNA를 미리 형성된 캡시드 헤드 내로 패키징하는 데 필요한 아데노바이러스 서열만을 함유하는 아데노바이러스 게놈 서열이다. 더욱 구체적으로, 사용되는 아데노바이러스 서열은 선형 Ad 게놈을 패키징하는 데 필요한 서열 및 E1 프로모터에 대한 인핸서 요소를 함유하는 천연 5' 패키징/인핸서 도메인 및 (복제 기점으로서 작용하는) 아데노바이러스의 시스-작용성 5' 및 3' 역 말단 반복부 (ITR) 서열이다. 아데노바이러스 서열은 원하는 결실, 치환, 또는 돌연변이를 함유하도록 변형될 수 있지만, 단, 원하는 기능이 제거되지 않는다.
상기 키메라 벡터에서 유용한 AAV 서열은 rep 및 cap 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 결실된 바이러스 서열이다. 더욱 구체적으로, 사용되는 AAV 서열은 시스-작용성 5' 및 3' 역 말단 반복부 (ITR) 서열이다. 이러한 키메라는 숙주 세포로의 고 역가 트랜스진 전달, 및 상기 트랜스진을 숙주 세포 염색체 내로 안정적으로 통합시킬 수 있는 능력을 특징으로 한다 (미국 특허 5,871,983 (이는 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다)). 하이브리드 벡터 구축물에서, AAV 서열은 상기 논의된 선택된 아데노바이러스 서열 측면에 위치한다. 5' 및 3' AAV ITR 서열 그 자체는 선택되는 트랜스진 서열 및 하기 기술되는 관련 조절 요소이 측면에 위치한다. 따라서, 트랜스진 및 측면에 위치하는 5' 및 3' AAV 서열에 의해 형성된 서열은 벡터의 아데노바이러스 서열에서 결실 부위에 삽입될 수 있다. 예를 들어, AAV 서열은 바람직하게는 아데노바이러스의 결실된 E1a/E1b 유전자 부위에 삽입된다. 대안적으로, AAV 서열은 E3 결실부, E2a 결실부 등에 삽입될 수 있다. 하이브리드 바이러스에서 오직 아데노바이러스 5' ITR/패키징 서열 및 3' ITR 서열만이 사용되는 경우, AAV 서열은 그 사이에 삽입된다.
벡터 및 재조합 바이러스의 트랜스진 서열은 관심 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 단편을 코딩하는, 아데노바이러스 서열에는 이종성인 유전자, 핵산 서열, 또는 그의 역전사체일 수 있다. 트랜스진은 트랜스진 전사를 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동적으로 연결된다. 트랜스진 서열의 조성은 생성되는 하이브리드 벡터가 이용되는 용도에 의존할 것이다. 예를 들어, 한 유형의 트랜스진 서열은 숙주 세포에서 원하는 유전자 생성물을 발현하는 치료학적 유전자를 포함한다. 상기 치료학적 유전자 또는 핵산 서열은 전형적으로 유전된 또는 비유전된 유전자 결함을 대체 또는 보정하기 위해 또는 후생적 장애 또는 질환을 치료하기 위해 생체내 또는 생체외에서 환자에서의 투여 및 발현을 위한 생성물을 코딩한다.
10. 비-바이러스 형질전환
본원에 기술된 바와 같이, 또는 당업계의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 본 발명과 함께 사용하기 위한 것으로, 세포 소기관, 세포, 조직 또는 유기체의 형질전환을 위해 핵산을 전달하는 데 적합한 방법은 사실상 핵산 (예컨대, DNA)을 세포 소기관, 세포, 세포, 조직 또는 유기체 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함하는 것으로 간주된다. 상기 방법으로는 예컨대, 미세주사 (문헌 [Harland and Weintraub, 1985]; 미국 특허 5,789,215 (본원에서 참조로 포함된다))를 비롯한, 주사 (미국 특허 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859 (이들은 각각 본원에서 참조로 포함된다))에 의한; 전기천공에 의한 (미국 특허 5,384,253 (본원에서 참조로 포함된다)); 인산칼슘 침전법에 의한 (문헌 [Graham and Van Der Eb, 1973]; [Chen and Okayama, 1987]; [Rippe　et al.,　1990]); DEAE-덱스트란에 이어서, 폴리에틸렌 글리콜 사용에 의한 (문헌 [Gopal, 1985]); 직접적인 초음파 로딩에 의한 (문헌 [Fechheimer　et al.,　1987]); 리포솜 매개 형질감염에 의한 (문헌 [Nicolau and Sene, 1982]; [Fraley et al., 1979]; [Nicolau et al., 1987]; [Wong et al., 1980]; [Kaneda et al., 1989]; [Kato et al.,　1991]); 미세발사체 충격요법에 의한 (PCT 출원 번호 WO 94/09699 및 95/06128; 미국 특허 5,610,042; 5,322,783, 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 및 5,538,880 (이는 각각 본원에서 참조로 포함된다)); 탄화규소 섬유에 의한 교반에 의한 (문헌 [Kaeppler　et al.,　1990; 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765 (이는 각각 본원에서 참조로 포함된다)); 또는 원형질체의 PEG-매개된 변형에 의한 (문헌 [Omirulleh　et al.,　1993]; 미국 특허 4,684,611 및 4,952,500 (이는 각각 본원에서 참조로 포함된다)); 또는 건조/억제-매개된 DNA 흡수에 의한 (문헌 [Potrykus et al., 1985]) DNA의 직접적인 전달을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기법 적용을 통해, 예컨대, 상기 세포 소기관(들), 세포(들), 조직(들), 또는 유기체(들)는 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
주사. 특정 실시양태에서, 핵산은 예컨대, 피하로, 진피내로, 근육내로, 정맥내로, 또는 복강내로 1회 이상의 주사 (즉, 바늘 주사)를 통해 세포 소기관, 세포, 조직 또는 유기체에 전달될 수 있다. 백신 주사 방법은 당업계의 숙련가에게 널리 공지되어 있다 (예컨대, 염수 용액을 포함하는 조성물의 주사). 본 발명의 추가의 실시양태는 직접적인 미세주사에 의해 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 직접적인 미세주사는 핵산 구축물을 제노푸스(Xenopus) 난모세포 내로 도입하는 데 사용되어 왔다 (문헌 [Harland and Weintraub, 1985]).
전기천공. 본 발명의 특정 실시양태에서, 핵산은 전기천공을 통해 세포 소기관, 세포, 조직 또는 유기체 내로 도입된다. 전기천공은 세포 및 DNA의 현탁액을 고압 방전에 노출시키는 것을 포함한다. 상기 방법의 일부 변형법에서, 표적 수혜자 세포를 비처리 세포보다 전기천공에 의한 형질전환에 대하여 더욱 감수성인 세포로 만들기 위해 특정 세포벽 분해 효소, 예컨대, 펙틴 분해 효소가 사용된다 (미국 특허 5,384,253 (본원에서 참조로 포함된다)). 대안적으로, 수혜자 세포는 기계적 상처에 의한 형질전환에 대하여 감수성인 더 큰 세포가 될 수 있다.
전기천공을 이용하여 진핵 세포를 형질감염시키는 것은 매우 성공적이었다. 상기 방식으로 마우스 프리-B 림프구를 인간 κ-면역글로불린 유전자로 형질감염시키고 (문헌 [Potter　et al.,　1984]), 래트 간세포는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 형질감염시켰다 (문헌 [Tur-Kaspa　et al.,　1986]).
세포, 예컨대, 식물 세포에서 전기천공에 의한 형질전환을 수행하기 위해, 부서지기 쉬운 조직, 예컨대, 세포 현탁 배양물 또는 배 발생 캘러스를 사용할 수 있거나, 또는 대안적으로, 미숙한 배야 또는 다른 조직화된 조직을 직접 형질전환시킬 수 있다. 상기 기법에서, 세포를 펙틴 분해 효소(펙토리아제)에 노출시킴으로써, 또는 제어된 방식으로 기계적으로 상처를 입힘으로써 선택된 세포의 세포벽을 부분적으로 분해시킬 것이다. 온전한 세포의 전기천공에 의해 형질전환된 일부 종의 예로는 옥수수 (미국 특허 5,384,253; 문헌 [Rhodes　et al.,　1995]; [D'Halluin　et al.,　1992]), 밀 (문헌 [Zhou　et al.,　1993]), 토마토 (문헌 [Hou and Lin, 1996]), 대두 (문헌 [Christou　et al.,　1987]) 및 담배 (문헌 [Lee　et al.,　1989]를 포함한다).
또한, 식물 세포의 전기천공 형질전환을 위해 원형질체를 사용할 수 있다 (문헌 [Bates, 1994]; [Lazzeri, 1995]). 예를 들어, 자엽으로부터 유래된 원형질체의 전기천공에 의한 트랜스제닉 대두 식물의 생성은 국제 특허 출원 번호 WO 92/17598 (디르(Dhir) 및 위드홀름(Widholm)) (본원에서 참조로 포함된다)에 의해 기술되었다. 원형질체 형질전환이 기술된 다른 종의 예로는 보리 (문헌 [Lazerri, 1995), 수수 (문헌 [Battraw　et al.,　1991]), 옥수수 (문헌 [Bhattacharjee　et al.,　1997]), 밀 (문헌 [He　et al.,　1994]) 및 토마토 (문헌 [Tsukada, 1989])를 포함한다.
인산칼슘. 본 발명의 다른 실시양태에서, 인산칼슘 침전법을 이용하여 핵산을 세포에 도입한다. 상기 기법을 사용하여 인간 KB 세포를 아데노바이러스 5 DNA로 형질감염시켰다 (문헌 [Graham and Van Der Eb, 1973]). 또한, 상기 방식으로, 마우스 L(A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeL세포를 네오마이신 마커 유전자로 형질감염시키고 (문헌 [Chen and Okayama, 1987), 및 래트 간세포를 다양한 마커 유전자로 형질감염시켰다 (문헌 [Rippe　et al.,　1990]).
DEAE-덱스트란: 또 다른 실시양태에서, 핵산을 DEAE-덱스트란에 이어서, 폴리에틸렌 글리콜에 의해 세포로 전달한다. 상기 방식으로, 리포터 플라스미드를 마우스 골수종 및 적백혈병 세포 내로 도입하였다 (문헌 [Gopal, 1985]).
초음파 로딩. 본 발명의 추가의 실시양태는 직접적인 초음파 로딩에 의해 핵산을 도입하는 것을 포함한다. LTK- 섬유아세포를 초음파 로딩에 의해 티미딘 키나제 유전자로 형질감염시켰다 (문헌 [Fechheimer　et al.,　1987]).
리포솜-매개 형질감염. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 핵산을 지질 복합체, 예를 들어, 리포솜에 포획시킬 수 있다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포체 구조이다. 다중판 리포솜은 수성 매질에 의해 분리되어 있는 다중의 지질층을 가진다. 이는 인지질이 과량의 수용액 중에 현탁되었을 때에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조 형성 이전에 자가 재배열되고, 지질 이중층 사이의 물과 용해된 용질을 포획한다 (문헌 [Ghosh and Bachhawat, 1991]). 리포펙트아민 (기브코 BRL(Gibco BRL)) 및 수퍼펙트(Superfect) (퀴아젠)와 복합체를 형성하는 핵산 또한 고려된다.
시험관내 외래 DNA의 리포솜-매개 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다 (문헌 [Nicolau and Sene, 1982]; [Fraley　et al.,　1979]; [Nicolau　et al.,　1987]). 배양된 닭 배아, HeLa 및 간종양 세포에서의 외래 DNA의 리포솜-매개 전달 및 발현의 실현가능성 또한 입증되었다 (문헌 [Wong　et al., 1980]).
본 발명의 특정 실시양태에서, 리포솜은 혈구 응집성 바이러스 (HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 이는 세포막과의 융합을 가속화시키고, 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 진입을 촉진시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Kaneda　et al.,　1989]). 다른 실시양태에서, 리포솜은 핵 비-히스톤 염색체 단백질 (HMG-1)과 복합체를 형성하거나, 그와 함께 사용될 수 있다 (문헌 [Kato　et al.,　1991]). 추가의 다른 실시양태에서, 리포솜은 HVJ 및 HMG-1, 둘 모두와 복합체를 형성하거나, 그와 함께 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다.
수용체-매개 형질감염. 또한 추가로, 핵산은 수용체-매개 전달 비히클을 통해 표적 세포로 전달될 수 있다. 이는 표적 세포에서 발생하게 되는 수용체-매개 세포내이입에 의해 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 다양한 수용체의 세포 유형 특이 분포에 비추어 볼 때, 상기 전달 방법은 본 발명에 또 다른 정도의 특이성을 부가한다.
특정 수용체-매개 유전자 표적화 비히클은 세포 수용체 특이 리간드 및 핵산-결합제를 포함한다. 다른 것은 전달하고자 하는 핵산이 작동적으로 부착되어 있는 세포 수용체 특이 리간드를 포함한다. 기법의 작동가능성을 확립한, 수용체-매개 유전자 전달에 여러 리간드가 사용되어 왔다 (문헌 [Wu and Wu, 1987]; [Wagner　et al.,　1990]; [Perales　et al.,　1994]; EPO 0273085 (마이어스(Myers)). 또 다른 포유동물 세포 유형과 관련하여 특이적인 전달이 기술되었다 (문헌 [Wu and Wu, 1993] (본원에서 참조로 포함된다)). 본 발명의 특정 측면에서, 리간드는 표적 세포 집단에서 특이적으로 발현되는 수용체에 상응하는 것으로 선택될 것이다.
다른 실시양태에서, 세포 특이 핵산 표적화 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포솜과 함께 특이 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달하고자 하는 핵산(들)은 리포솜 내에 하우징되고, 특이 결합 리간드는 리포솜 막 내로 기능적으로 도입된다. 따라서, 리포솜은 표적 세포의 수용체(들)에 특이적으로 결합할 것이며, 그 내용물을 세포에 전달할 것이다. 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF)가 EGF 수용체의 상향조절을 보이는 세포에 핵산을 수용체-매개 전달할 때 사용되는 시스템을 사용하는 경우에 상기 시스템은 작용성인 것으로 나타났다.
추가의 다른 실시양태에서, 표적화된 전달 비히클의 핵산 전달 비히클 성분은 리포솜 그 자체일 수 있고, 이는 바람직하게는 세포 특이 결합을 지시하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함할 것이다. 예를 들어, 락토실-세라미드, 갈락토스-말단 아시알강글리오시드 (asialganglioside)는 리포솜 내로 도입되었고, 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수 증가가 관찰되었다 (문헌 [Nicolau　et al., 1987]). 본 발명의 조직 특이 형질전환 구축물이 유사한 방식으로 표적 세포 내로 특이적으로 전달될 수 있다는 것이 고려된다.
11. 발현 시스템
상기에서 논의된 조성물 중 적어도 일부 또는 모두를 포함하는 다수의 발현 시스템이 존재한다. 원핵생물 및/또는 진핵생물 기반 시스템은 핵산 서열, 또는 그의 동족 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드를 제조하기 위하여 본 발명과 함께 사용하는 데 이용될 수 있다. 상기와 같은 다수의 시스템은 상업적으로 이용가능하고, 널리 이용가능하다.
곤충 세포/바큘로바이러스 시스템은 예컨대, 미국 특허 5,871,986 및 4,879,236 (둘 모두 본원에서 참조로 포함된다)에서 기술된 바와 같이 이종성 핵산 세그먼트의 단백질 발현을 높은 수준으로 생산할 수 있고, 예로써, 인비트로겐(Invitrogen)®으로부터 맥스백(MaxBac)® 2.0 및 클론테크(Clontech)®로부터 백팩™ 바큘로바이러스 발현 시스템(BacPack™ Baculovirus Expression System)하에 구입할 수 있다.
발현 시스템의 다른 예로는, 합성 엑디손 유도성 수용체를 포함하는, 스트라타진(Stratagene)®의 컴플리트 컨트롤(Complete Control)™ 유도성 포유동물 발현 시스템, 또는 그의 pET 발현 시스템, E. 콜라이(E. coli) 발현 시스템을 포함한다. 유도성 발현 시스템의 또 다른 예는 인비트로겐®으로 이용가능한, 전장의 CMV 프로모터를 이용한 유도성 포유동물 발현 시스템인 T-렉스(T-Rex)™ (테트라사이클린-조절된 발현) 시스템을 보유하는 것이 있다. 인비트로겐®은 또한, 메탄영양성 효소 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica)에서 재조합 단백질을 고수준으로 생산하도록 디자인된, 피치아 메타놀리카 발현 시스템으로 불리는, 효소 발현 시스템을 제공한다. 당업자는 핵산 서열 또는 그의 동족 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드를 생산하기 위하여 벡터, 예컨대, 발현 구축물을 발현시키는 방법에 대해 알고 있을 것이다.
1차 포유동물 세포 배양물을 다양한 방식으로 제조할 수 있다. 세포를 시험관내에서 발현 구축물과 접촉한 상태로 유지시키면서, 생존가능한 상태로 그대로 보존하기 위해서는, 세포를 확실하게 올바른 비율의 산소 및 이산화탄소, 및 영양소와 접촉한 상태로 유지시키지만, 미생물 오염으로부터는 보호하는 것이 필요하다. 세포 배양 기법은 널리 알려져 있다.
상기 내용의 한 실시양태는 단백질 제조를 위해 세포를 불멸화시키기 위하여 유전자 전달을 사용하는 것을 포함한다. 관심 단백질에 대한 유전자를 적절한 숙주 세포 내로 상기 기술된 바와 같이 전달한 후, 적절한 조건하에서 세포를 배양할 수 있다. 실제로 임의 폴리펩티드에 대한 유전자가 상기 방식으로 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터, 및 그 안에 포함되는 요소를 생성하는 것은 상기에서 논의하였다. 대안적으로, 제조하고자 하는 단백질은 보통 해당 세포에 의해 합성되는 내인성 단백질일 수 있다.
유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 베로(Vero) 및 헬라(HeLa) 세포 및 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포주, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN 및 MDCK 세포가 있다. 추가로, 원하는 방식으로, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱하는 숙주 세포주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 상기 변형 (예컨대, 글리코실화) 및 프로세싱 (예컨대, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 번역 후 프로세싱 및 변형에 대해 특이적이고, 특이적인 기전을 가진다. 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 프로세싱이 확실히 이루어질 수 있도록 하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다.
각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 HSV 티미딘 키나제, 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 선별 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 저항성을 부여하는 dhfr; 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt; 아미노글리코시드 G418에 대한 저항성을 부여하는 neo; 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro에 대한 선별에 대한 기반으로서 항-대사산물 저항성이 사용될 수 있다.
E. 정제
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 정제될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "정제된"이라는 용어는 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 의미하고자 하는 것으로서, 여기서, 단백질을 그의 천연적으로 수득가능한 상태와 비교하였을 때 어느 정도까지 정제된다. 그러므로, 정제된 단백질이란 또한 그가 천연적으로 존재할 수 있는 환경으로부터 유래된 단백질도 의미한다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이러한 명칭은 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예컨대, 조성물 중 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상을 구성하는 조성물을 의미할 것이다.
단백질 정제 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기법은 1 레벨에서, 세포 환경의 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로의 조 분별화 (crude fracttionation)를 포함한다. 폴리펩티드를 다른 단백질로부터 분리하고, 관심 폴리펩티드를 크로마토그래피 및 전기영동 기법을 사용하여 추가로 정제하여 부분적으로 또는 완전히 정제 (또는 균일하게 정제)할 수 있다. 순수한 펩티드의 정제에 특히 적합화된 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전점이다. 다른 단백질 정제 방법으로는 황산암모늄, PEG, 항체 등을 이용한 침전법, 또는 열 변성, 이어서, 원심분리; 겔 여과, 역상, 히드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 상기 및 다른 기법의 조합에 의한 것이 있다.
본 발명의 항체를 정제할 때, 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 폴리펩티드를 발현시키고, 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 태그부착된 부분에 결합하는, 친화성 칼럼을 사용하여 다른 세포 성분으로부터 정제될 수 있다. 당업계에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나, 또는 특정 단계는 생략될 수 있고, 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드를 제조하는 적합한 방법을 여전히 그대로 얻을 수 있는 것으로 간주된다.
통상, 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 분별화 이용 작용제 (즉, 단백질 A)이다. 대안적으로, 항원은 적절한 항체를 동시에 정제하고, 선별하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 대개 지지체, 예컨대, 칼럼, 필터, 또는 비드에 결합된 선별제를 이용한다. 항체는 지지체에 결합되어 있고, 오염물질은 제거되고 (예컨대, 세척으로 제거되고), 항체는 조건 (염, 열 등)에 가함으로써 유리된다.
본 개시내용에 비추어, 단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법이 당업자에게 공지될 것이다. 이는 예를 들어, 활성 분획의 특이 활성을 측정하거나, 또는 SDS/PAGE 분석에 의하여 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 또 다른 방법은 분획의 특이 활성을 계산하고, 그 활성을 초기 추출물의 특이 활성과 비교하고, 이로써, 순도를 계산하는 것이다. 활성량을 나타내는 데 사용되는 실제 단위는 물론 정제 다음으로 선택되는 특정 검정 기법, 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 활성을 보이는지 여부에 의존할 것이다.
폴리펩티드의 이동은 때로는 상이한 SDS/PAGE 조건에 따라 유의적으로 달라질 수 있는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Capaldi et al., 1977]). 그러므로, 상이한 전기영동 조건하에서 정제된 또는 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량은 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
F. 단일 쇄/단일 도메인 항체
단일 쇄 가변 단편 (scFv)은 짧은 (일반적으로, 세린, 글리신) 링커와 함께 연결된, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합물이다. 단일 도메인 항체로도 알려져 있는, 상기 키메라 분자는, 링커 펩티드의 도입, 및 불변 영역의 제거에도 불구하고, 원래의 면역글로불린의 특이성은 보유하고 있다. 이러한 변형은 일반적으로 특이성은 변경되지 않는 상태 그대로 남겨 둔다. 상기 분자는 역사적으로는 단일 펩티드로서 항원 결합 도메인을 발현하는 데 고도로 편리한 파지 디스플레이를 촉진시키도록 생성되었다. 대안적으로, scFv는 하이브리도마로부터 유래된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 단일 도메인 또는 단일 쇄 가변 단편에는 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역이 존재하지 않으며, 따라서, 항체를 정제하는 데 사용되는 공통 결합 부위 (예컨대, 단백질 A/G)가 존재하지 않는다 (단일 쇄 항체는 Fc 영역을 포함한다). 상기 단편은 대개 프로테인 L을 사용하여 정제/고정화될 수 있는 데, 그 이유는 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문이다.
가요성 링커는 일반적으로 나선 및 선회 촉진 아미노산 잔기, 예컨대, 알라닌, 세린 및 글리신으로 구성된다. 그러나, 다른 잔기 또한 작용할 수 있다. 문헌 [Tang et al. (1996)]에서는 단백질 링커 라이브러리로부터 단일 쇄 항체 (scFv)에 대한 적합화된 링커를 신속하게 선별하는 수단으로서 파지 디스플레이를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자가 다양한 조성의 18개의 아미노산 폴리펩티드를 코딩하는 세그먼트에 의해 연결되어 있는 무작위 링커 라이브러리가 구성되었다. scFv 레퍼토리 (대략 5　x　106개의 상이한 구성원)를 사상 파지 상에 디스플레이하고, 이에 대하여 합텐을 이용하여 친화성 선별을 수행하였다. 선별된 변이체 집단은 결합 활성에서 유의적인 증가를 보였지만, 상당한 서열 다양성은 그대로 유지하였다. 이어서, 스크리닝 1054　개별 변이체를 통해 가용성 형태로 효율적으로 제조되는, 촉매적으로 활성인 scFv를 수득하였다. 서열 분석을 통해 VH C 말단 다음에 존재하는 2개의 링커 잔기에 보존되는 프롤린이 존재하고, 선별된 테터의 유일의 공통 특징으로서 다른 위치에 아르기닌 및 프롤린이 풍부하게 존재하는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 재조합 항체는 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 허용하는 서열 또는 모이어티를 포함한다. 상기 서열로는 J 쇄와 함께 다량체 형성을 허용하는 IgA로부터 유도된 것을 포함한다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 실시양태에서, 쇄는 예컨대, 비오틴/아비딘과 같이, 두 항체의 조합을 허용하는 작용제로 변형될 수 있다.
별개의 실시양태에서, 단일 쇄 항체는 비-펩티드 링커 또는 화학적 유니트를 사용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 다른 세포에서 생산되고, 정제된 후, 이어서, 적절한 방식으로 함께 연결될 것이다 (즉, 중쇄의 N-말단은 적절한 화학적 브릿지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착된다).
가교 시약은 2개의 상이한 분자, 예컨대, 안정화제 및 응고제의 작용기를 연결하는 분자 브릿지를 형성하는 데 사용된다. 그러나, 같은 유사체의 이량체 또는 다량체, 또는 상이한 유사체로 구성된 이종체 복합체가 생성될 수 있다고 고려된다. 2개의 상이한 성분을 단계식으로 연결하기 위해, 원치않는 동종중합체 형성을 제거하기 위해 이종이작용성 가교제가 사용될 수 있다.
예시적인 이종이작용성 가교제는 2개의 반응성 기: 1급 아민기와 반응하는 기 (예컨대, N-히드록시 숙신이미드), 및 티올기와 반응하는 나머지 다른 하나의 기 (예컨대, 피리딜 디술피드, 말레이미드, 할로겐 등)를 함유한다. 1급 아민 반응성 기를 통해 가교제는 한 단백질 (예컨대, 선별된 항체 또는 단편)의의 리신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응성 기를 통해, 이미 제1 단백질에 연결된 가교제는 다른 단백질 (예컨대, 선별제)의 시스테인 잔기 (유리 술프히드릴 기)와 반응한다.
혈액 중에서 적합한 안정성을 가지는 가교제가 사용되는 것인 바람직하다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합시키는 데 성공적으로 사용될 수 있는 많은 유형의 디술피드 결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체적으로 장애를 받는 디술피드 결합을 함유하는 링커는, 작용 부위에의 도착 이전에 표적 펩티드가 유리되는 것을 방지하면서, 생체내에서 더욱 큰 안정성을 제공하는 것으로 입증될 수 있다. 이러한 링커는 연결 작용제들 중 하나의 기이다.
또 다른 가교 시약은 SMPT로서, 이는 인접한 벤젠 고리 및 메틸 기에 의해 "입체적으로 장애를 받는" 디술피드 결합을 함유하는 이작용성 가교제이다. 디술피드 결합의 입체 장애는 티올레이트 음이온, 예컨대, 조직 및 혈액 중에 존재할 수 있는 글루타티온에 의한 공격으로부터 상기 결합을 보호함으로써, 부착된 작용제가 표적 부위에 전달되지 이전에 접합체가 분리되는 것을 막는 데 도움을 주는 역할을 하는 것으로 간주된다.
SMPT 가교 시약은 다수의 다른 공지된 가교 시약과 같이, 작용기, 예컨대, 시스테인의 SH 또는 1급 아민 (예컨대, 리신의 엡실론 아미노 기)를 가교 결합시킬 수 있는 능력을 부여한다. 또 다른 가능한 유형의 가교제로는 절단가능한 디술피드 결합을 함유하는 이종이작용성 광반응성 페닐아지드, 예컨대, 술포숙신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트를 포함한다. N-히드록시-숙신이미딜 기는 1급 아미노 기와 반응하고, 페닐아지드 (광분해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
장애를 받는 가교제 이외에도, 장애를 받지 않는 링커 또한 이와 함께 사용될 수 있다. 보호된 디술피드를 함유 또는 생성하는 것으로 간주되지 않는, 다른 유용한 가교제로는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올레인을 포함한다 (문헌 [Wawrzynczak & Thorpe, 1987]). 상기 가교제의 사용은 당업계에서 잘 이해되고 있다. 또 다른 실시양태는 가요성 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 4,680,338에는 아민 함유 중합체 및/또는 단백질과 함께 리간드의 접합체를 제조하는 데, 특히, 킬레이터, 약물, 효소, 검출가능한 표지 등과의 항체 접합체를 형성하는 데 유용한 이작용성 링커가 기술되어 있다. 미국 특허 5,141,648 및 5,563,250에는 다양한 약한 조건하에서 절단가능한 불안정한 결합을 함유하는 절단가능한 접합체가 개시되어 있다. 상기 링커는 관심 작용제가 링커에 직접 결합될 수 있고, 절단으로 활성 작용제가 유리되는 경우에 특히 유용하다. 특정 용도로는 유리 아미노 또는 유리 술프히드릴 기의 단백질, 예컨대, 항체, 또는 약물에의 첨가를 포함한다.
미국 특허 5,856,456은 폴리펩티드 구성 성분을 연결하여 융합 단백질, 예컨대, 단일 쇄 항체를 제조하는 데 사용하기 위한 펩티드 링커를 제공한다. 링커의 길이는 최대 약 50개의 아미노산 길이고, 하전된 아미노산 (바람직하게, 아르기닌 또는 리신) 다음에 프롤린이 존재하는 것을 적어도 1회 포함하고, 증가된 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 5,880,270에는 다양한 면역진단 및 분리 기법에 유용한 아미노옥시 함유 링커가 개시되어 있다.
G. 변형된 항체
1. CAR
(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 키메라 항원 수용체 (CAR)로도 또한 알려져 있는) 인공 T 세포 수용체는 면역 이펙터 세포 상에 임의적인 특이성을 이식하는 것인, 조작된 수용체이다. 전형적으로, 상기 수용체는 모노클로날 항체의 특이성을 T 세포 상에 이식시키는 데 사용되며, 그의 코딩 서열의 전달은 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진된다. 이러한 방식으로, 입양 세포 전달을 위해 다수의 암 특이 T 세포가 생성될 수 있다. 상기 접근법에 대한 I상 임상 연구를 통해 효능이 밝혀졌다.
상기 분자 중 가장 보편적인 형태는 CD3-제타 막통과 및 엔도도메인에 융합된, 모노클로날 항체로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 융합물이다. 상기 분자는 그의 표적의 scFv에 의한 인식에 대한 반응으로 제타 신호를 전달한다. 상기 구축물의 예로는 [디시알로강글리오시드 (disialoganglioside) GD2를 인식하는] 하이브리도마 14g2a로부터 유래된 scFv의 융합물인, 14g2a-제타가 있다. (보통은 온코레트로바이러스 벡터 형질도입에 의해 달성되는 것으로) T 세포가 상기 분자를 발현할 때, 상기 T 세포는 GD2를 발현하는 표적 세포 (예컨대, 신경아세포종 세포)를 인식하고, 그를 사멸시킨다. 악성 B 세포를 표적하기 위해, 연구원들은 B 계통 분자인 CD19에 대해 특이적인 키메라 면역수용체를 사용하여 T 세포의 특이성을 다시 지시하였다.
면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 부분은 가요성 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 상기 scFv는 신호 펩티드 앞에서 초기 단백질을 세포질 망상 구조로 지시하고, 이어서, 표면 발현을 지시한다 (이는 절단된다). 가요성 스페이서를 통해 scFv는 상이한 방향으로 배향될 수 있고, 이로써, 항원에 결합할 수 있다. 막통과 도메인은 보통, 세포 내로 돌출되어 있고, 원하는 신호를 전달하는 신호전달 엔도도메인의 원래의 분자로부터 유래된 전형적인 소수성 알파 나선이다.
실제로 I형 단백질은 그 사이가 막통과 알파 나선으로 연결되어 있는 2개의 단백질 도메인이다. 막통과 도메인이 통과하는 세포막 지질 이중층은 외부 부분 (엑토도메인)으로부터 내부 부분 (엔도도메인)을 분리시키는 작용을 한다. 한 단백질로부터의 엑토도메인을 또 다른 단백질의 엔도도메인에 부착시키면, 전사의 인식을 후자의 신호에 조합하는 분자가 생성된다는 것은 그리 놀라운 것은 아니다.
엑토도메인. 신호 펩티드는 초기 단백질을 세포질 망상 구조로 지시한다. 이는 수용체를 글리코실화시키고, 세포막에 부착시키고자 한다면 필수적인 것이다. 임의의 진핵생물 신호 펩티드 서열은 일반적으로 잘 작용한다. 일반적으로, 천연적으로 아미노-말단의 대부분의 성분에 부착된 신호 펩티드가 사용된다 (예컨대, 경쇄 - 링커 - 중쇄 배향의 scFv에서, 경쇄의 천연 신호가 사용된다).
항원 인식 도메인은 일반적으로 scFv이다. 그러나, 여기에는 많은 대안이 존재한다. 간단한 엑토도메인 (예컨대, HIV 감염된 세포를 인식하는 CD4 엑토도메인), 및 더 많은 외래 종의 인식 성분, 예컨대, 연결된 시토카인 (이는 시토카인 수용체를 보유하는 세포의 인식을 유도한다)을 가지는, 천연 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 단일 쇄로부터 유래된 항원 인식 도메인이 기술되었다. 실제로, 고친화도로 주어진 표적에 결합하는 거의 모든 것은 항원 인식 영역으로서 사용될 수 있다.
스페이서 영역은 항원 결합 도메인을 막통과 도메인에 연결한다. 항원 인식이 용이하게 이루어질 수 있도록 항원 결합 도메인이 상이한 방향으로 배향할 수 있게 하는 데 충분할 정도로 가요성을 띠어야 한다. 가장 간단한 형태는 IgG1로부터의 힌지 영역이다. 대안으로는 면역글로불린의 CH2CH3 영역 및 CD3의 부분을 포함한다. 대부분의 scFv 기반 구축물의 경우, IgG1 힌지면 충분하다. 그러나, 가장 우수한 스페이서는 대개 실험적으로 결정되어야 한다.
막통과 도메인. 막통과 도메인은 막에 걸쳐 있는 소수성 알파 나선이다. 일반적으로, 엔도도메인의 대부분의 막 인접 성분으로부터의 막통과 도메인이 사용된다. 흥미롭게도, CD3-제타 막통과 도메인을 사용하면, 인공 TCR은, 천연 CD3-제타 막통과 하전된 아스파르트산 잔기의 존재에 의존하는 천연 TCR a 인자로 도입될 수 있다. 상이한 막통과 도메인을 통해 상이한 수용체 안정성을 얻게 된다. CD28 막통과 도메인을 통해 훌륭히 발현된 안전적인 수용체를 얻게 된다.
엔도도메인. 이는 수용체의 "맨 끝부분(business-end)"이다. 항원 인식 후, 수용체 클러스터 및 신호는 세포로 전달된다. 가장 보편적으로 사용되는 엔도도메인 성분은 3개의 ITAM을 함유하는 CD3-제타이다. 이는 항원 결합 후, 활성화 신호를 T 세포에 전달한다. CD3-제타는 완전히 능력이 있는 활성화 신호를 제공할 수 없고, 추가의 공동 자극 신호전달이 요구된다. 예를 들어, 증식/생존 신호를 전달하기 위해 키메라 CD28 및 OX40이 CD3-제타와 함께 사용될 수 있거나, 또는 3개 모두가 함께 사용될 수 있다.
"제1세대" CAR은 전형적으로, 내인성 TCR로부터의 1차 신호 전달자인, CD3 ξ-쇄로부터의 세포내 도메인을 가졌다. "제2세대" CAR은 각종 공동 자극 단백질 수용체 (예컨대, CD28, 41BB, ICOS)로부터의 세포내 신호전달 도메인을 CAR의 세포질 테일에 부가하여 추가 신호를 T 세포에 제공한다. 임상전 연구는 제2세대 CAR 디자인이 T 세포의 항종양 활성을 개선시킨다고 밝혀졌다. 더욱 최근에, "제3세대" CAR은 효능을 추가로 증강시키기 위해 다중 신호전달 도메인, 예컨대, CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40을 조합한다.
CAR-변형된 T 세포는 사실상 임의의 종양 관련 항원을 표적하도록 조작될 수 있기 때문에, 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포의 입양 전달은 유망항 항암 치료제이다. 이 접근법 경우, 심오한 방식으로 환자 특이적인 암 요법을 개선시킬 수 있는 큰 잠재능이 존재한다. 환자의 T 세포를 수집한 후, 환자의 종양 세포 상에서 항원에 대해 특이적으로 CAR을 발현하도록 세포를 유전적으로 조작한 후, 이를 다시 환자 내로 주입한다. 비록 CAR-변형된 T 세포의 입양 전달이 독특하고, 유망한 암 치료제이기는 하지만, 안전성에 관한 상당한 문제가 존재한다. 상기 요법에 관한 임상 시험에서, 건강한 조직이 종양 세포와 동일한 표적 항원을 발현하였을 때, 이를 통해 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)과 유사한 결과를 얻었고, 상기 CAR의 잠재적인 독성 효과가 밝혀졌다. 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결 방안은 자살 유전자를 변형된 T 세포로 조작하는 것이다. 이러한 방식으로, GVHD 동안 자살 유전자를 활성화시키도록 디자인된 프로드럭을 투여함으로써 자살 유전자가 활성화된 CAR T 세포에서 아포토시스를 유발한다. 이러한 방법은 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)에서 안전하게 및 효과적으로 사용되어 왔다. 자살 유전자 요법을 CAR-변형된 T 세포 입양 세포 전달의 임상적 적용에 채용하는 것은 전반적인 항종양 효능은 개선시키면서, GVHD를 완화시키는 잠재능을 가진다.
2. ADC
항체 약물 접합체 또는 ADC는 암을 앓는 사람의 치료를 위한 표적화된 요법으로서 디자인된 고도로 강력한 효능을 가진 새로운 부류의 바이오제약 약물이다. ADC는 불안정한 결합을 가진 안정적인 화학적 링커를 통해 생물학적으로 활성인 세포독성 (항암) 페이로드 또는 약물에 연결된 항체 (전체 mAb 또는 항체 단편, 예컨대, 단일 쇄 가변 단편, 또는 scFv)로 구성된 복합체 분자이다. 항체 약물 접합체는 생체접합체 및 면역접합체의 예이다.
모노클로날 항체의 독특한 표적화 능력을 세포독성 약물의 암 사멸 능력과 조합함으로써, 항체-약물 접합체는 건강한 조직과 이환된 조직을 고감도로 구별할 수 있게 한다. 이는 전통적인 화학요법제와 달리, 항체-약물 접합체는 암 세포를 표적하고, 그를 공격하여 건강한 세포는 덜 심하게 영향을 받게 된다는 것을 의미한다.
ADC 기반 항종양 요법 개발에서, 항암 약물 (예컨대, 세포 독소(cell toxin) 또는 세포독소(cytotoxin))을 특정 종양 마커 (예컨대, 이상적으로는 오직 종양 세포에서 또는 그 위에서만 발견되는 단백질; 본 경우, MUC1)를 특이적으로 표적하는 항체에 커플링시킨다. 항체는 신체내에서 상기 단백질을 추적하여 찾아내고, 암 세포 표면에 그 자신을 부착시킨다. 항체와 표적 단백질 (항원) 사이의 생화학적 반응은 종양 세포에서 신호를 일으키고, 이어서, 이는 세포독소와 함께 항체를 흡착 또는 내재화시킨다. ADC 내재화 후, 세포독성 약물은 유리되고, 암을 사멸시킨다. 이러한 표적화에 기인하여, 이상적으로, 약물은 다른 화학요법제보다 부작용이 더 낮고, 더 넓은 치료창을 제공한다.
항체와 세포독성제 (항암제) 사이의 안정적인 연결이 ADC의 중요한 측면이다. 링커는 이황화, 히드라존 또는 펩티드 (절단가능), 또는 티오에테르 (절단불가능)를 비롯한 화학적 모티프에 기반하고, 세포독성제의 분포 및 표적 세포로의 전달을 제어한다. 절단가능 및 절단불가능한 유형의 링커는 임상전 및 임상 시험에서 안전한 것으로 입증되었다. 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin)은 강력하고, 고도의 독성을 띠는 항미세관제인 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 MMAE (합성 항신생물제)를 인간 특이 CD30-양성 악성 종양 세포에 전달하는 효소 감수성의 절단가능한 링커를 포함한다. 튜불린의 중합화를 차단함으로써 세포 분열을 억제시키는 것인 MMAE는 그의 독성이 높기 때문에, 단일 작용제 화학요법 약물로서 사용될 수 없다. 그러나, 항-CD30 모노클로날 항체 (cAC10, 종양 괴사 인자 또는 TNF 수용체의 세포막 단백질)에 연결된 MMAE의 조합은 세포외 체액에서 안정적이고, 카텝신에 의해 절단가능하고, 요법에 안전한 것으로 입증되었다. 허가받은 다른 ADC인 트라스투주맙 엠탄신(Trastuzumab emtansine)은 미세소관 형성 억제제인 메르탄신 (DM-1) (메이탄신(Maytansine)의 유도체), 및 안정적이고, 절단불가능한 링커에 의해 부착된 항체인 트라스투주맙 (허셉틴(Herceptin)®/제넨테크(Genentech)/로슈(Roche))의 조합이다.
더욱 우수하고, 더욱 안정적인 링커의 이용가능성으로 인해 화학 결합의 작용은 변화하게 되었다. 절단가능하거나, 또는 절단불가능한 링커 유형이 세포독성 (항암) 약물에 특이적인 특성을 투여한다. 예를 들어, 절단불가능한 링커는 세포 내에서는 약물을 유지한다. 그 결과, 전체 항체, 링커, 및 세포독성제 (항암제)는 표적화된 암 세포로 진입하고, 상기 암 세포에서 항체는 아미노산 수준으로 분해된다. 생성된 복합체인 아미노산, 링커 및 세포독성제는 이제 활성 약물이 된다. 그에 반해, 절단가능한 링커는 암 세포에서 효소에 의해 촉매화되고, 상기 암 세포에서 세포독성제를 유리시킨다. 차이는 절단가능한 링커를 통해 전달된 세포독성 페이로드가 "방관자 사멸 (bystander killing)"로 불리는 과정에서 이웃하는 암 세포를 공격하면서, 표적화된 세포로부터 이탈할 수 있다.
현재 개발 중에 있는 또 다른 유형의 절단가능한 링커는 세포독성 약물과 절단 부위 사이에 추가의 분자를 부가한다. 이러한 링커 기술을 통해 연구자들은 절단 동역학적 성질의 변화에 대한 우려 없이 유연성이 더 큰 ADC를 생성할 수 있게 된다. 연구자들은 또한 펩티드에서 아미노산을 서열분석하는 방법인 에드만(Edman) 분해에 기반한 신규의 펩티드 절단 방법을 개발하고 있다. ADC 개발에 있어 향후 방향은 안정성 및 치료 지수를 추가로 개선시키는 부위 특이 접합 (TDC) 및 α 방출 면역접합체 및 항체-접합된 나노입자 개발 또한 포함한다.
3. BiTE
이중특이성 T 세포 관여 항체 (Bi-specific T-cell engager: BiTE)는 항암 약물로서의 사용을 위해 연구되고 있는 인공 이중특이성 모노클로날 항체 부류이다. 이는 암 세포에 대하여 숙주 면역계, 더욱 구체적으로, T 세포의 세포독성 활성을 지시한다. BiTE는 마이크로메트 아게(Micromet AG)의 등록 상표이다.
BiTE는 약 55 킬로달톤의 단일 펩티드 상의 상이한 항체의 두 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 다른 나머지 하나는 종양 특이성 분자, 본 경우에는 MUC1를 통해 종양 세포에 결합한다.
다른 이중특이성 항체와 같이, 및 일반 모노클로날 항체와는 달리, BiTE는 T 세포와 종양 세포 사이에 연결을 형성한다. 이는 MHC I 또는 공동 자극 분자의 존재와는 상관 없이, 단백질, 예컨대, 퍼포린 및 그랜자임을 생산함으로써 T 세포가 종양 세포 상에서 세포독성 활성을 발휘하도록 유발시킨다. 상기 단백질은 종양 세포로 진입하여 세포의 아포토시스를 개시한다. 이러한 작용은 종양 세포에 대한 T 세포 공격시 관찰되는 생리학적 과정을 모방한다.
2010년 6월 현재 임상 시험 중에 있는 BiTE로는 B 세포 상에서 발현되는 표면 분자인 CD19에 대한, 비호지킨 림프종 및 급성 림프아구성 백혈병 치료를 위한 블리나투모맙(Blinatumomab) (MT103); 및 EpCAM 항원에 대한, 위장관 암 및 폐암 치료를 위한 MT110을 포함한다.
동일한 기술을 사용함으로써 흑색종 (MCSP 특이 BiTE 사용) 및 급성 골수양 백혈병 (CD33 특이 BiTE 사용)이 표적화될 수 있다. 상기 분야에서의 연구는 현재 진행 중에 있다. 신규한 항암 요법에 대한 또 다른 방안은 BiTE를 사용하여 현재 사용되고 있는 종래 항체, 예컨대, 트라스투주맙 (HER2/neu 표적화), 세툭시맙 및 파니투무맙 (상기 둘 모두 EGF 수용체 표적화) 중 일부를 다시 조작하는 것이다. CD66e 및 EphA2에 대한 BiTE 또한 개발 중에 있다.
III. 제약 제제 및 암 치료법
A. 암
암은 조직으로부터 세포의 클론 집단의 증식으로부터 발생한다. 발암으로 지칭되는 암 발생은 여러 방식으로 모델링되고, 특징 규명될 수 있다. 암 발생과 염증 사이에 연관이 있는 것으로 장기간 이해되어 왔다. 염증 반응이 미생물 감염에 대한 숙주 방어에 관여하고, 이는 또한 조직 수복 및 재생을 구동시킨다. 상당수의 증거가 염증과 암 발생 위험 사이의 관련성을 시사하고, 즉, 만성 염증이 이형성증을 유도할 수 있다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 암 세포로는 일반적으로 MUC1을 발현하는 임의의 세포, 및 더욱 특히, MUC1을 과다발현하는 것을 포함한다. 적절한 암 세포는 유방암, 폐암, 결장암, 췌장암, 신장암, 위암, 간암, 골암, 혈액암 (예컨대, 백혈병 또는 림프종), 신경 조직암, 흑색종, 난소암, 고환암, 전립샘암, 자궁경부암, 질암, 또는 방광암 세포일 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 다양한 종, 예컨대, 인간, 비-인간 영장류 (예컨대, 원숭이, 개코원숭이, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 게르빌, 햄스터, 래트 및 마우스에 적용될 수 있다. 암은 또한 재발성, 전이성 및/또는 다중 약물 저항성일 수 있고, 본 발명의 방법은 특히 암을 절제가능하게 하기 위해, 관해 (remission)를 연장시키거나, 또는 재유도하기 위해, 혈관신생을 억제시키기 위해, 전이를 예방 또는 제한하기 위해, 및/또는 다중 약물 저항성 암을 치료하기 위해 상기 암에 적용될 수 있다. 세포 수준에서 이는 암 세포를 사멸시키는 것, 암 세포 성장을 억제시키는 것, 또는 다르게는 종양 세포의 악성 표현형을 역전 또는 감소시키는 것으로 해석될 수 있다.
B. 제제 및 투여
본 발명은 항-MUC1-C 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 구체적인 실시양태에, "제약상 허용되는"이라는 용어는 동물에서, 및 더욱 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인을 받았거나, 또는 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있다는 것을 의미힌다. "담체"라는 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제, 또는 비히클을 의미한다. 상기 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일 (페트롤륨, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등 포함)을 포함할 수 있다. 다른 적합한 제약 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크롯, 염수, 덱스트로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 음이온과 형성된 것, 예컨대, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것, 및 양이온과 형성된 것, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등을 포함한다.
본 발명의 항체는 고전적 제약 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 조성물의 투여는 표적 조직이 본 경로를 통해 이용가능한 한, 임의의 일반 경로를 퉁해 이루어질 것이다. 이는 경구, 비강, 협측, 직장, 질, 또는 국부를 포함한다. 대안적으로, 투여는 진피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 상기 조성물은 보통 상기 기술된 바와 같이, 제약상 허용되는 조성물로서 투여될 것이다. 직접적인 종양내 투여, 종양 관류, 또는 예를 들어, 국소 또는 국부 맥관 구조 또는 림프계에서, 또는 절개된 종양상에서의 종양으로의 국소 또는 국부 투여가 특히 관심의 대상이 된다.
활성 화합물은 또한 비경구적으로 또는 복막내로 투여될 수 있다. 유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염으로서의 상기 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대, 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에 제조될 수 있다. 분산액 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 일반 보관 및 사용 조건하에서, 상기 제제는 미생물 성장을 막기 위해 보존제를 함유한다.
C. 조합 요법
본 발명의 맥락에서, 본원에 기술된 항-MUC1-C 항체는 화학요법적, 방사성 요법적 중재, 또는 다른 치료법과 함께 유사하게 사용될 수 있을 것으로도 또한 고려된다. 또한, 특히, 항-MUC1-C/ECD 항체를 MUC1 기능의 다른 측면을 표적하는 다른 요법, 예컨대, MUC1 세포질 도메인을 표적하는 펩티드 및 소분자와 함께 조합하는 것이 효과적인 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여, 세포를 사멸시키고, 세포 성장을 억제시키고, 전이를 억제시키고, 혈관신생을 억제시키기 위해 또는 다르게는 종양 세포의 악성 표현형을 역전 또는 감소시키기 위해, 일반적으로는 "표적" 세포를 본 발명에 따른 항-MUC1-C 항체 및 적어도 1종의 다른 작용제와 접촉시킬 것이다. 상기 조성물은 세포를 사멸 또는 그의 증식을 억제시키는 데 효과적인 조합된 양으로 제공될 것이다. 이 과정은 세포를 본 발명에 따른 항-MUC1-C 항체 및 다른 작용제(들) 또는 인자(들)와 동시에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는 세포를 두 작용제 모두를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제제와 접촉시킴으로써, 또는 세포를, 한 조성물은 본 발명에 따른 항-MUC1-C 항체를 포함하고, 나머지 다른 조성물은 다른 작용제를 포함하는 것인, 다른 두 조성물 또는 제제와 동시에 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.
대안적으로, 항-MUC1-C 항체 요법은 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 작용제 치료 이전에 또는 그 이후에 이루어질 수 있다. 다른 작용제 및 항-MUC1 항체가 세포에 별개로 적용되는 실시양태에서, 일반적으로 각 전달의 시간 사이에 유의한 기간이 만료되지 않도록 하여, 상기 작용제 및 발현 구축물이 세포에 이로운 조합된 효과를 계속해서 미칠 수 있도록 할 것이다. 그러한 경우, 세포를 서로 약 12-24시간 이내, 및 더욱 바람직하게, 서로 약 6-12시간 이내 (여기서, 지연 시간은 단지 약 12시간인 것이 가장 바람직하다) 두 방식 모두와 접촉시키는 것이 고려된다. 그러나, 일부 상황에서는 각 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과하는 경우, 유의적으로 치료 기간을 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.
항-MUC1 항체 또는 다른 작용제 중 어느 하나를 1회 초과로 투여하는 것이 바람직할 수 있다는 것 또한 생각해볼 수 있다. 본 발명에 따른 항-MUC1-C 항체가 "A"이고, 다른 요법이 "B"인 경우, 아래 예시된 바와 같이, 다양한 조합이 사용될 수 있다:
Figure 112016082964921-pct00012
다른 조합도 고려된다. 또한, 세포 사멸을 달성하기 위해, 두 작용제 모두를 세모를 사멸시키는 데 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달한다.
암 요법에 적합한 작용제 또는 인자로는 세포에 적용되었을 때, DNA 손상을 유도하는 임의의 화학적 화합물 또는 치료 방법을 포함한다. 그러한 작용제 및 인자로는 DNA 손상을 유도하는 방사선 및 파장, 예컨대, 방사선 조사, 마이크로파, 전자 방출 등을 포함한다. "화학요법제" 또는 "유전독성제"로도 기술되는 다양한 화학적 화합물이 사용될 수 있다. 이는 국재화된 종양 부위에 방사선을 조사함으로써 달성될 수 있고; 대안적으로, 대상체에게 치료학상 유효량의 제약 조성물을 투여함으로써 종양 세포를 작용제와 접촉시킬 수 있다.
다양한 부류의 화학요법제가 본 발명과 함께 조합된 사용을 위해 고려된다. 예를 들어, 선택적 에스트겐 수용체 길항제 ("SERM"), 예컨대, 타목시펜(Tamoxifen), 4-히드록시 타목시펜 (아피목스펜(Afimoxfene)), 팔소덱스(Falsodex), 랄옥시펜(Raloxifene), 바제독시펜(Bazedoxifene), 클로미펜(Clomifene), 페마렐레(Femarelle), 라소폭시펜(Lasofoxifene), 오르멜록시펜(Ormeloxifene), 및 토레미펜(Toremifene)이 있다.
사용될 것으로 고려되는 화학요법제로는 예컨대, 캄토테신, 악티노마이신-D, 마이토마이신 C를 포함한다. 본 발명은 또한 예컨대, X선과 시스플라틴의 사용 또는 시스플라틴과 에토포시드의 사용과 같은, 방사선 기반이든 또는 실제 화합물이든 상관없이, 하나 이상의 DNA 손상제의 조합의 사용을 포함한다. 상기 작용제는 상기 기술된 바와 같이, 그를 MUC1 펩티드와 조합함으로써 조합된 치료 조성물, 또는 키트로서 제조되고, 사용될 수 있다.
열 충격 단백질 90은 많은 진핵 세포에서 발견되는 조절 단백질이다. HSP90 억제제는 암 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다. 그러한 억제제로는 겔다나마이신(Geldanamycin), 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, PU-H71 및 리파부틴(Rifabutin)을 포함한다.
DNA를 직접적으로 가교하거나, 부가물을 형성하는 작용제 또한 구상된다. 예컨대, 시스플라틴과 같은 작용제, 및 다른 DNA 알킬화제가 사용될 수 있다. 시스플라틴은 암을 치료하는 데 널리 사용되고 있으며, 여기서, 임상 적용에서 사용되는 유효 용량은 총 3회 과정으로 매 3주마다 5일 동안 20 mg/㎡이다. 시스플라틴은 경구로 흡수되지 않으므로, 정맥내, 피하, 종양내 또는 복강내 주사를 통하여 전달되어야만 한다.
DNA를 손상시키는 작용제로는 또한 DNA 복제, 유사 분열 및 염색체 분리를 간섭하는 화합물을 포함한다. 그러한 화학요법적 화합물로는 독소루비신으로도 알려진 아드리아마이신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신 등을 포함한다. 신생물을 치료하기 위한 임상 환경에서 널리 사용되는 상기 화합물은 독소루비신의 경우, 21일 간격으로 25-75 mg/㎡의 용량으로 정맥내 볼루스 주사를 통하여, 에토포시드의 경우, 35-50 mg/㎡의 용량으로 정맥내 또는 정맥내 용량의 2배로 경구적으로 투여된다. 예컨대, 탁산과 같은 미세소관 억제제 또한 고려된다. 이들 분자는 주목(Taxus) 속의 식물체에 의하여 생산된 디테르펜이며, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한다.
표피 성장 인자 수용체 억제제, 예컨대, 이레사(Iressa), FK506-결합 단백질 12-라파마이신 연관된 단백질 1 (FRAP1)로도 알려져 있는 mTOR인 라파마이신의 포유동물 표적은 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동, 세포 생존, 단백질 합성 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 그러므로, 라파마이신 및 그의 유사체 ("라파로그(rapalog)")는 본 발명에 따른 암 요법에서 사용하기 위한 것으로 고려된다.
또 다른 가능한 요법은 전신성 염증에 관여하는 시토카인이자, 급성기 반응을 자극하는 시토카인 군의 구성원인 TNF-α (종양 괴사 인자-알파)이다. TNF의 주된 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNF는 또한 아포토시스성 세포 사멸을 유도하고, 염증을 유도하고, 종양생성 및 바이러스 복제를 억제시킬 수 있다.
핵산 전구체 및 서브유니트의 합성 및 충실도(fidelity)를 파괴하는 작용제 또한 DNA 손상을 유도한다. 그러한 다수의 핵산 전구체가 개발되었다. 광범위한 시험을 거쳤고, 쉽게 이용가능한 작용제가 특히 유용하다. 따라서, 작용제, 예컨대, 5-플루오로우라실은 신생 조직에 의하여 우선적으로 사용되며, 이로써, 신생 세포를 표적하는 데 특히 유용하게 된다. 비록 독성이 매우 높기는 하지만, 그러나, 5-FU는 국소 투여를 비롯한 정맥내 투여로 넓은 범위의 담체에서 적용가능하며, 통상 3 내지 15 mg/kg/일 범위의 용량으로 사용된다.
DNA를 손상시키고, 광범위하게 사용되어 온 다른 인자로는 γ선, x선으로 통상 알려져 있는 것, 및/또는 방사성 동위 원소의 종양 세포로의 지정된 전달을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자, 예컨대, 마이크로파 및 UV-조사 또한 고려된다. 상기 인자들 모두 넓은 범위의 DNA 및 DNA의 전구체에 대한 손상, DNA의 복제 및 수복, 및 염색체의 조립 및 유지에 영향을 미칠 가능성이 가장 크다. x선 조사량은 장기간 (3 내지 4주)인 경우, 50 내지 200 렌트겐 (roentgen)의 1일 선량에서부터 2,000 내지 6,000 렌트겐의 단일 선량 범위이다. 방사성 동위 원소에 대한 조사량 범위는 광범위하게 변하며, 동위원소의 반감기, 방사되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수에 의존한다.
추가로, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법 및 수술이 사용될 수 있다는 것 또한 고려된다. 특히, 표적화된 요법, 예컨대, 아바스틴(Avastin), 얼비툭스(Erbitux), 글리벡(Gleevec), 허셉틴(Herceptin) 및 리툭산(Rituxan)이 사용될 수 있다.
조합 요법에 대하여 특히 이로운 접근법은 MUC1을 표적하는 제2 작용제를 선택하는 것이다. 본 발명자에 의해 출원된 공계류 중인 출원에서, 피험체에게, 적어도 4개의 연속 MUC1 잔기 및 20개 이하의 연속 MUC1 잔기로 이루어지고, 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, CQC의 아미노-말단 시스테인은 그의 NH2-말단에서 천연 MUC-1 막통과 서열과 상응할 필요는 없는 적어도 1개의 아미노산 잔기에 의해 커버되는 것인, 피험체에서 MUC1-양성 종양 세포를 억제시키는 방법을 개시하였다. 펩티드는 적어도 5개의 연속 MUC1 잔기, 적어도 6개의 연속 MUC1 잔기, 적어도 7개의 연속 MUC1 잔기, 적어도 8개의 연속 MUC1 잔기를 포함할 수 있고, 더욱 구체적으로 서열은 CQCR (서열 번호 XX), CQCRR (서열 번호 XX), CQCRRR (서열 번호 XX), CQCRRRR (서열 번호 XX), CQCRRK (서열 번호 XX), CQCRRKN (서열 번호 XX), 또는 RRRRRRRRRCQCRRKN (서열 번호 XX)을 포함할 수 있다. 펩티드는 MUC1의 10개 이하의 연속 잔기, 11개 이하의 연속 잔기, 12개 이하의 연속 잔기, 13개 이하의 연속 잔기, 14개 이하의 연속 잔기, 15개 이하의 연속 잔기, 16개 이하의 연속 잔기, 17개 이하의 연속 잔기, 18개 이하의 연속 잔기, 또는 19개 이하의 연속 잔기를 함유할 수 있다. 펩티드는 세포 전달 도메인, 예컨대, 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K에 융합될 수 있다. 펩티드는 모든 L 아미노산, 모든 D 아미노산, 또는 L 및 D 아미노산의 믹스를 포함할 수 있다. 미국 특허 번호 8,524,669를 참조할 수 있다.
본 기술에 대한 변형법이 미국 특허 시리얼 번호 13/026,858에 기술되어 있다. 상기 출원에는 MUC1-양성 암 세포를, 적어도 4개의 연속 MUC1 잔기 및 20개 이하의 연속 MUC1 잔기로 이루어지고, 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, (i) CQC의 아미노-말단 시스테인은 그의 NH2-말단에서 천연 MUC1 막통과 서열과 상응할 필요는 없는 1개 이상의 아미노산 잔기에 의해 커버되고; (ii) 펩티드는 천연 MUC1 잔기에 상응하는 양으로 하전된 아미노산 잔기 이외에도, 3-5개의 연속 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는 것인, MUC1-양성 암 세포를 억제시키는 방법이 개시되어 있다. MUC1-양성 세포는 고형 종양 세포, 예컨대, 폐암 세포, 뇌암 세포, 두부경부암 세포, 유방암 세포, 피부암 세포, 간암 세포, 췌장암 세포, 위암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 자궁암 세포, 자궁경부암 세포, 난소암 세포, 고환암 세포, 피부암 세포 또는 식도암 세포일 수 있다. MUC1-양성 세포는 백혈병 또는 골수종 세포, 예컨대, 급성 골수양 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종 세포일 수 있다. 펩티드는 스타플드(stapled) 펩티드, 고리화된(cyclized) 펩티드, 펩티도모방체 또는 펩토이드일 수 있다. 상기 방법은 세포를 제2 항암제와 접촉시키는 단계로서 여기서, 예컨대, 여기서, 제2 항암제를 펩티드 이전에, 펩티드 이후에, 또는 펩티드와 동시에 접촉시키는 것인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 억제는 암 세포 성장, 암 세포 증식을 억제시키는 것, 또는 예컨대, 아포토시스에 의해 암 세포 사멸을 유도하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명자들에 의해 향상된 또 다른 기술 (미국 특허 출원 시리얼 번호 13/045,033 참조)로는 세포를 하기 구조를 가지는 플라본, 또는 그의 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 염증 신호전달을 억제시키는 방법을 포함한다:
Figure 112016082964921-pct00013
상기 식에서,
R1은 H, -OH, =O, 치환된 또는 비치환된 알킬(C1-8), 알콕시(C1-8), 할로알킬(C1-8), 치환된 페닐 또는 비치환된 페닐이고, 여기서, R1이 =O일 경우, C7-C8은 이중 결합이고;
R2는 H,-OH, 알킬(C1-8), 치환된 페닐, 비치환된 페닐, 페닐, 페닐 티아졸, 이미다졸, 피라졸 또는 푸란이고;
R3은 H, -OH, =O, 할로겐, 할로알킬(C1-8), 치환된 또는 비치환된 알킬(C1-8), 치환된 페닐 또는 비치환된 페닐이고, 여기서, R3이 =O일 경우, C8-C9는 이중 결합이고;
R4는 H 또는 -OH이고;
R5는 H,-OH, 치환된 또는 비치환된 알킬(C1-8) 또는 알콕시(C1-8), 또는 OR8이고, 여기서, R8은 알킬(C-1-8), 에스테르 또는 아미드이고;
R6은 H,-OH, 치환된 또는 비치환된 알킬(C1-8) 또는 알콕시(C1-8), 또는 OR8이고, 여기서, R8은 알킬(C-1-8), 에스테르 또는 아미드이고;
R7은 H, -OH, 또는 치환된 또는 비치환된 알킬(C1-8)이되,
단, R1 및 R3은 둘 모두가 =O가 될 수 없다.
R1은 =O일 수 있다. R3은 =O일 수 있다. 플라본은 모린(Morin), 아피게닌(Apigenin), 켐페롤(Kaempferol), 피세틴(Fisetin), PD98059, 7-(벤질옥시)-4-(트리플루오로메틸)-2H-크로멘-2-온 또는 7-[(3-옥소부탄-2-일)옥시]-4-페닐-2H-크로멘-2-온, 또는 상기 중 임의의 것의 염이다.
당업자는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, Chapter 33], 특히, 624-652 페이지로 안내된다. 치료되는 대상체의 상태에 따라 반드시 투여량이 일부 변동될 것이다. 어느 경우에서든 투여 담당자가 개별 대상체에 적절한 용량을 결정하게 될 것이다. 또한, 인간 투여용인 경우, 제제는 FDA 생물 표준 사무국(FDA Office of Biologics standards)이 요구하는 멸균성, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
IV. 항체 접합체
항체는 적어도 1종의 작용제에 연결되어 항체 접합체를 형성할 수 있다. 항체 분자의 진단제 또는 치료제로서의 효능을 증가시키기 위해, 적어도 1종의 원하는 분자 또는 모이어티에 연결 또는 공유적으로 결합시키거나, 또는 복합체를 형성하는 것이 통상적이다. 상기 분자 또는 모이어티는 제한하는 것은 아니지만, 적어도 1종의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있다. 이펙터 분자는 예컨대, 면역억제/항-염증과 같은, 원하는 활성을 가지는 분자를 포함한다. 상기 분자의 비제한적인 예는 상기에 기술되어 있다. 상기 분자는 임의적으로 분자가 표적 부위에서 또는 그 부근에서 유리되게 허용하도록 디자인된 절단가능한 링커를 통해 부착된다.
그에 반해, 리포터 분자는 검정법을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체에 접합된 리포터 분자의 비제한적인 예로는 효소, 방사성표지, 합텐, 형광성 표지, 인광성 분자, 화학발광성 분자, 발색단, 광친화성 분자, 발색 입자 또는 리간드, 예컨대, 비오틴을 포함한다.
항체 접합체는 일반적으로 진단제로서 사용하는 데 선호된다. 항체 진단제는 일반적으로 2가지 부류, 예컨대, 다양한 면역검정법에서 시험관내 진단제로 사용하기 위한 것, 및 일반적으로 "항제 지정된 영상화"로서 알려져 있는 생체내 진단 프로토콜에서 사용하기 위한 것에 포함된다. 항체에의 그의 부착 방법과 같이, 다수의 적절한 영상화제가 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 미국 특허 5,021,236, 4,938,948, 및 4,472,509 참조). 사용되는 영상화 모이어티는 상자성 이온 (paramagentic ion), 방사성 동위 원소, 형광 색소, NMR-검출가능한 물질, 및 X선 영상화제일 수 있다.
상자성 이온인 경우, 예로서, 이온, 예컨대, 크롬 (III), 망간 (II), 철 (III), 철 (II), 코발트 (II), 니켈 (II), 구리 (II), 네오디뮴 (III), 사마륨 (III), 이테르븀 (III), 가돌리늄 (III), 바나듐 (II), 테르븀 (III), 디스프로슘 (III), 홀뮴 (III) 및/또는 에르븀 (III)을 언급할 수 있고, 가돌리늄이 특히 바람직하다. 다른 맥락, 예컨대, X선 영상화에서 유용한 이온으로는 란타늄 (III), 금 (III), 납 (II), 및 특히, 비스무트 (III)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
치료 및/또는 진단 적용에서 방사성 동위 원소인 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152유로퓸(Eu), 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크네튬99m 및/또는 이트륨90을 언급할 수 있다. 특정 실시양태에서, 대개는 125I가 사용하는 데 바람직하고, 대개는 그의 낮은 에너지 및 긴 범위의 검출에 대한 적합성에 기인하여 테크네튬99m 및/또는 인듐111 또한 바람직하다. 방사성 표지화된 모노클로날 항체는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨, 및 화학적 산화제, 예컨대, 소듐 히포클로라이트, 또는 효소적 산화제, 예컨대, 락토퍼옥시다제와 접촉시킴으로써 모노클로날 항체를 요오드화할 수 있다. 모노클로날 항체는 리간드 교환 프로세스에 의해, 예를 들어, 퍼테크네이트를 주석 함유 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 칼럼 상에서 킬레이팅하고, 항체를 상기 칼럼에 적용시킴으로써 테크네튬99m으로 표지화될 수 있다. 대안적으로, 예컨대, 퍼테크네이트, 환원제, 예컨대, SNCl2, 완충제 용액, 예컨대, 소듐-칼륨 프탈레이트 용액, 및 항체를 인큐베이션시킴으로써 수행되는 직접적으로 표지화하는 기법이 사용될 수 있다. 대개는 방사성 동위 원소를 항체에 결합시키는 데 중간 작용기가 사용되고, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA)이 금속 이온으로서 존재한다.
접합체로서 사용하기 위한 것으로 고려된 형광성 표지 중에는 알렉사 350, 알렉사 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 파시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그래핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)를 포함한다.
고려되는 또 다른 유형의 항체 접합체는 주로 시험관내에서 사용하기 위한 것으로 의도되는 것으로서, 여기서, 항체가 2차 결합 리간드에 및/또는 발색원성 기질과의 접촉시 발색된 생성물을 생성하는 효소 (효소 태그)에 결합되어 있는 것이다. 적합한 효소의 예로는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (호스래디쉬) 하이드로겐 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 바람직한 2차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙트아비딘 화합물이다. 상기 표지의 용도는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 미국 특허 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 및 4,366,241에 기술되어 있다.
분자를 항체에 부착시키는 추가의 또 다른 공지된 부위 특이 부착 방법은 항체와 합텐 기반 친화성 표지의 반응을 포함한다. 본질적으로, 합텐 기반 친화성 표지는 항원 결합 부위 중의 아미노산과 반응하여 상기 부위를 파괴시키고, 특이 항원 반응을 차단한다. 그러나, 이는 항체 접합체에 의한 항원 결합을 손실시키는 바, 이롭지 않을 수도 있다.
저강도 자외선에 의해 생성되는 반응성 니트렌 중간체를 통해 단백질에의 공유 결합을 형성하는 데 아지도 기를 함유하는 분자 또한 사용될 수 있다 (문헌 [Potter and Haley, 1983]). 특히, 퓨린 뉴클레오티드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조 세포 추출물 중에서 뉴클레오티드 결합 단백질을 확인하기 위해 부위 지정 광프로브로서 사용되어 왔다 (문헌 [Owens & Haley, 1987]; [Atherton et al., 1985]). 2- 및 8-아지도 뉴클레오티드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오티드 결합 도메인을 맵핑하는 데에도 사용되어 왔고 (문헌 [Khatoon et al., 1989]; [King et al., 1989]; [Dholakia et al., 1989]), 항체 결합제로서 사용되어 왔다.
항체를 그의 접합체 모이어티에 부착 또는 접합시키는 여러 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 부착 방법은 예를 들어, 항체에 부착된 유기 킬레이팅제, 예컨대, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 무수물 (DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔술폰아미드; 및/또는 테트라클로로-3α-6α-디페닐글리코우릴-3을 이용하여 금속 킬레이트 착체를 사용하는 것을 포함한다 (미국 특허 4,472,509 및 4,938,948). 모노클로날 항체는 또한 커플링제, 예컨대, 글루타르알데히드 또는 페리오데이트의 존재하에서 효소와 반응할 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 상기 커플링제의 존재하에서, 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 미국 특허 4,938,948에서는 모노클로날 항체를 사용하여 유방 종양의 영상화가 달성되고, 검출가능한 영상화 모이어티는 링커, 예컨대, 메틸-p-히드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-히드록시페닐)프로피오네이트를 사용하여 항체에 결한된다.
다른 실시양태에서, 항체 조합 부위를 변경시키지 않는 반응 조건을 사용하여 면역글로불린의 Fc 영역에 술프히드릴 기를 선택적으로 도입함으로써 면역글로불린을 유도체화하는 것이 고려된다. 본 방법론에 따라 제조되는 항체 접합체는 개선된 수명, 특이성 및 감수성을 보이는 것으로 개시되어 있다 (미국 특허 5,196,066 (본원에서 참조로 포함된다)). 리포터 또는 이펙터 분자가 Fc 영역 중 탄수화물 잔기에 접합되는, 이펙터 또는 리포터 분자의 부위 특이 부착 또한 문헌에 개시되어 있다 (문헌 [O'Shannessy et al., 1987]). 상기 접근법은 진단학상 및 치료학상 유망한 항체를 제조하는 것으로 보고되었으며, 상기 항체는 현재 임상 평가 중에 있다.
V. 면역검출 방법
추가의 다른 실시양태에서, MUC1 및 그의 관련된 항원에 결합, 그를 정제, 제거, 정량화 및 다르게는 일반적으로 그를 검출하는 면역검출 방법이 있다. 일부 면역검출 방법으로 몇 가지를 언급하자면, 효소 결합된 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사성면역검정법 (RIA), 면역방사 검정법, 형광면역검정법, 화학발광성 검정법, 생체발광 검정법, 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 특히, MUC1-C 항체의 검출 및 정량화를 위한 경쟁적 검정법 또한 제공한다. 각종의 유용한 면역검출 방법의 단계가 과학 문헌 예컨대, 문헌 [Doolittle and Ben-Zeev (1999)], [Gulbis and Galand (1993)], [De Jager et al. (1993)], 및 [Nakamura et al. (1987)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은 샘플을 수득하고, 경우에 따라, 면역복합체의 형성을 허용하는 데 효과적인 조건하에서 샘플을 1차 항체와 접촉시키는 것을 포함한다.
면역 복합체 (1차 면역 복합체)가 형성될 수 있도록 하는 데 효과적인 조건하에서, 및 그러한 충분한 시간 동안 선택된 생물학적 샘플을 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 간단하게 항체 조성물을 샘플에 첨가하고, 항체가, 면역 복합체를 형성하는 데, 즉, MUC1에 결합하는 데 충분한 시간 동안 혼합물을 인큐베이션시키는 것의 문제이다. 이후, 일반적으로 샘플-항체 조성물, 예컨대, 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯을 세척하여 비특이적으로 결합된 임의의 항체 종을 세척하여 제거함으로써 오직 1차 면역 복합체 내에서 특이적으로 결합된 항체만이 검출될 수 있도록 할 것이다.
일반적으로, 면역 복합체 형성 검출은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 다양한 접근법의 적용을 통해서 달성될 수 있다. 본 방법은 일반적으로 표지 또는 마커, 예컨대, 방사성 동위 원소, 형광성, 생물학적 및 효소 태그 중 임의의 것의 검출에 기반한다. 상기 표지 사용에 관한 특허로는 미국 특허 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 및 4,366,241을 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이, 2차 결합 리간드, 예컨대, 2차 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열 사용을 통한 추가의 이점을 찾을 수 있다.
검출에서 사용되는 항체는 그 자체가 검출가능한 표지에 연결될 수 있고, 이어서, 간단하게 상기 표지를 검출할 수 있으며, 이로써, 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양을 측정할 수 있다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에 결합된 1차 항체는 항체에 대해 결합 친화성을 가지는 2차 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이 경우, 2차 결합 리간드는 검출가능한 표지에 연결될 수 있다. 2차 결합 리간드는 대개 그 자체가 항체이며, 따라서, "2차" 항체로 명명될 수 있다. 2차 면역 복합체가 형성되는 데 효과적인 조건하에서, 및 그러한 충분한 시간 동안 1차 면역 복합체를 표지화된 2차 결합 리간드, 또는 항체와 접촉시킨다. 이어서, 일반적으로는 2차 면역 복합체를 세척하여 비특이적으로 결합된 표지화된 임의의 2차 항체 또는 리간드를 제거한 후, 2차 면역 복합체 중의 남은 표지를 검출한다.
추가의 방법으로는 2 단계 접근법에 의해 1차 면역 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 2차 결합 리간드, 예컨대, 항체에 대하여 결합 친화성을 가지는 항체는 상기 기술된 바와 같이, 2차 면역 복합체를 형성하는 데 사용된다. 세척 후, 2차 면역 복합체를 다시 면역 복합체 (3차 면역 복합체)를 형성하는 데 효과적인 조건하에서, 및 그러한 충분한 시간 동안 2차 항체에 대하여 결합 친화성을 가지는 3차 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체를 검출가능한 표지에 연결시켜 그렇게 형성된 3차 면역 복합체가 검출될 수 있도록 한다. 본 시스템은 원하는 경우, 신호 증폭을 제공할 수 있다.
한 면역검출 방법은 2개의 상이한 항체를 이용한다. 제1 비오티닐화된 항체는 표적 항원을 검출하는 데 사용되고, 이어서, 복합체를 형성한 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하는 데 2차 항체가 사용된다. 상기 방법에서, 시험하고자 하는 샘플을 먼저 제1 단계의 항체를 함유하는 용액 중에서 인큐베이션시킨다. 표적 항원이 존재할 경우, 항체 중 일부는 항원에 결합하여 비오티닐화된 항체/항원 복합체를 형성한다. 이어서, 항체/항원 복합체를 연속된 스트렙트아비딘 (또는 아비딘), 비오티닐화된 DNA, 및/또는 상보성 비오티닐화된 DNA 용액 중에서 인큐베이션시킴으로써 증폭시키고, 여기서, 각 단계에서는 추가의 비오틴 부위를 항체/항원 복합체에 첨가한다. 적합한 수준의 증폭이 달성될 때까지 증폭 단계를 반복하고, 상기 시점에서 샘플을 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액 중에서 인큐베이션시킨다. 상기 제2 단계 항체를 예를 들어, 색원체 기질을 사용하여 조직 효소학적 방법에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 효소로 표지화한다. 적합하게 증폭된 경우, 육안으로 관찰가능한 접합체가 제조될 수 있다.
공지된 또 다른 면역검출 방법은 면역-PCR (중합효소 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR 방법은 비오티닐화된 DNA와 인큐베이션시키는 데까지 칸토어(Cantor) 방법과 유사하고, 다회의 스트렙트아비딘 및 비오티닐화된 DNA 인큐베이션을 사용하는 대신, DNA/비오틴/스트렙트아비딘/항체 복합체를 항체를 유리시키는 저 pH 또는 고염 항체를 사용하여 세척하여 제거한다. 이어서, 생성된 세척액을 사용하여 적절한 제어하에 적합한 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론상으로는, 단일 항원 분자를 검출하는 데, PCR의 막대한 증폭 능력 및 특이성이 사용될 수 있다.
A. ELISA
그의 가장 간단한 의미에서 면역검정법은 결합 검정법이다. 특정의 바람직한 면역검정법은 당업계에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA) 및 방사성면역검정법 (RIA)이다. 조직 절편을 이용하는 면역조직화학적 검출 또한 특히 유용하다. 그러나, 검출은 상기 기법으로만 제한되지 않으며, 웨스턴 블롯팅, 도트 블롯팅, FACS 분석 등 또한 사용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
한 예시적인 ELISA에서, 본 발명의 항체를 단백질 친화성을 보이는 선택된 표면, 예컨대, 폴리스티렌마이크로타이터 플레이트 중의 웰에 고정화시킨다. 이어서, MUC1을 함유할 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 결합시키고, 세척하여 비특이적으로 결합한 면역 복합체를 제거한 후, 결합 항원을 검출할 수 있다. 검출가능한 표지에 연결된 또 다른 항-MUC1-C 항체를 첨가함으로써 검출을 달성할 수 있다. 이러한 유형의 ELISA은 간단하게 "샌드위치 ELISA"이다. 제2 항-MUC1-C 항체를 첨가한 후, 검출가능한 표지에 연결된, 2차 항체에 대하여 결합 친화성을 가지는 3차 항체를 첨가함으로써 검출을 달성할 수 있다.
또 다른 예시적인 ELISA에서, MUC1 항원을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 웰 표면 상에 고정화시킨 후, 항-MUC1-C 항체와 접촉시킨다. 결합시키고, 세척하여 비특이적으로 결합한 면역 복합체를 제거한 후, 결합한 항-MUC1-C 항체를 검출한다. 초기 항-MUC1-C 항체가 검출가능한 표지에 연결된 경우, 면역 복합체를 직접 검출할 수 있다. 또한, 검출가능한 표지에 연결된, 1차 항-MUC1-C 항체에 대하여 결합 친화성을 가지는 2차 항체를 사용하여 면역 복합체를 검출할 수 있다.
사용되는 포맷과 상관없이, ELISA는 공통적으로 예컨대, 코팅, 인큐베이션 및 결합, 세척하여 비특이적으로 결합한 종 제거, 및 결합된 면역 복합체 검출과 같은 특정의 특징을 가진다. 이는 하기에 기술한다.
항원 또는 항체로 플레이트를 코팅할 때, 일반적으로는 플레이트의 웰을 항체 또는 항원 용액과 밤새도록 또는 특정 기간 동안 인큐베이션시킬 것이다. 이어서, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거할 것이다. 이어서, 웰 중 임의의 남아있는 이용가능한 표면을 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성을 띠는 비특이 단백질로 "코팅"한다. 이는 우혈청 알부민 (BSA), 카제인 또는 분유액을 포함한다. 코팅함으로써 고정화 표면 상의 비특이 흡착 부위를 차단할 수 있고, 이로써, 표면 상의 항혈청의 비특이 결합에 의해 유발되는 배경은 감소된다.
ELISA에서는 아마도 직접적인 방법보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 더욱 통상적일 것이다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고, 비반응성 물질로 코팅하여 배경을 감소시키고, 세척하여 비결합 물질을 제거한 후, 고정화 표면을 면역 복합체 (항원/항체) 형성에 효과적인 조건하에서 시험하고자 하는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이어서, 면역 복합체를 검출하기 위해서는 표지화된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지화된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
"면역 복합체 (항원/항체) 형성에 효과적인 조건하에서"란, 조건이 바람직하게, 항원 및/또는 항체를 용액, 예컨대, BSA, 소 감마 글로불린 (BGG) 또는 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)/트윈으로 희석시키는 것을 포함한다. 상기 첨가되는 작용제는 또한 비특이 배경을 감소시키는 데 도움을 주는 경향이 있다.
"적합한" 조건이란 또한 인큐베이션을 효과적인 결합을 허용하는 데 충분한 온도에서 또는 그러한 기간 동안 진행한다는 것을 의미한다. 인큐베이션 단계는 전형적으로, 바람직하게, 대략 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도에서 약 1　내지 2시간부터 4시간 등이거나, 약 4℃ 등에서 밤새도록 진행하는 것일 수 있다.
ELISA에서 모든 인큐베이션 단계 이후에, 접촉된 표면을 세척하여 복합체를 형성하지 못한 물질을 제거한다. 바람직한 세척 방법은 용액, 예컨대, PBS/트윈, 또는 보레이트 완충제로 세척하는 것을 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이의 특이 면역 복합체 형성 및 이어지는 세척 이후에, 심지어 소량으로 존재하는 경우라도 존재하는 면역 복합체를 측정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 2차 또는 3차 항체는 검출을 허용하는 회합된 표지를 가지게 될 것이다. 바람직하게, 이는 적절한 발색성 기질과 인큐베이션시켰을 때 발색시키는 효소가 될 것이다. 따라서, 예를 들어, 추가의 면역 복합체 형성이 발생하는 데 바람직한 기간 동안 및 그러한 조건하에서 1차 및 2차 면역 복합체를 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 하이드로겐 퍼옥시다제 접합된 항체와 접촉 또는 인큐베이션 (예컨대, PBS 함유 용액, 예컨대, PBS-트윈 중 실온에서 2시간 동안 인큐베이션)시키고자 할 것이다.
표지화된 항체와 인큐베이션시키고, 이어서, 세척하여 비결합 물질을 제거한 후, 발색성 기질, 예컨대, 우레아, 또는 브로모크레졸 퍼플, 또는 2,2'-아지도-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-술폰산 (ABTS), 또는 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우, H2O2와 함께 인큐베이션시킴으로써 표지의 양을 정량화한다. 이어서, 예컨대, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 발색 정도를 측정함으로써 정량화한다.
B. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯 (대안적으로, 단백질 면역블롯)은 주어진 조직 균질액 또는 추출물 샘플 중 특이 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기법이다. 이는 폴리펩티드의 길에 의해 (변성 조건) 또는 단백질의 3D 구조에 의해 (천연/비-변성 조건) 천연 또는 변성된 단백질을 분리하는 겔 전기영동을 사용한다. 이어서, 단백질을 막 (전형적으로, 니트로셀룰로스 또는 PVDF)로 옮기고, 여기서, 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로빙 (검출)한다.
샘플은 전체 조직으로부터, 또는 세포 배양물로부터 채취될 수 있다. 대부분의 경우에서, 먼저 고제 조직을 블렌더를 사용하여 (샘플 부피가 더 큰 경우), 균질화기를 사용하여 (부피가 더 작은 경우) 기계적으로, 또는 초음파 처리에 의해 파괴시킨다. 또한 상기 기계적 방법 중 하나에 의해 세포를 파괴하고 개봉할 수 있다. 그러나, 박테리아, 바이러스 또는 환경 샘플은 단백질의 공급원이 될 수 있고, 따라서, 웨스턴 블롯팅은 오직 세포 연구로만 제한되지 않는다는 점에 주의하여야 한다. 세포 용해를 돕고, 단백질을 가용화시키기 위해 여러 종의 계면활성제, 염, 및 완충제가 사용될 수 있다. 대개는 그 자신의 효소에 의한 샘플의 분해를 막기 위하여 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 첨가된다. 조직 제조는 대개 단백질 변성을 막기 위해 냉온에서 수행된다.
겔 전기영동을 사용하여 샘플의 단백질을 분리한다. 단백질 분리는 등전점 (pI), 분자량, 전기 전하, 또는 상기 인자의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 분리 성질은 샘플 처리 및 겔 성질에 의존한다. 이는 단백질을 측정하는 데 있어 매우 유용한 방법이다. 이는 또한 단일 샘플로부터의 단백질을 2차원으로 확산시키는 2차원 (2-D) 겔을 이용하는 것이 가능하다. 단백질은 1차원으로 등전점 (그가 중성 순전하를 가지게 되는 pH)에 따라, 2차원으로 그의 분자량에 따라 분리된다.
단백질이 항체 검출에 접근가능하도록 만들기 위해, 단백질을 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF)로 제조된 막 상에서 겔 내에서 그로부터 이동시킨다. 막을 겔 상단에 배치하고, 필터지 스택을 그 위에 배치한다. 전체 스택을 완충제 용액 중에 배치하고, 이는 모세관 작용에 의해 상기 여과지에서 위로 이동하게 되며, 그와 함께 단백질의 이동이 이루어지게 된다. 단백질을 이동시키는 또 다른 방법은 전기블롯팅으로 명명되며, 이는 겔로부터 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막 내로 단백질에 대하여 인력을 가하는 데 전류를 이용한다. 단백질은 겔 내에서 그가 가진 조직은 유지하면서, 막 상에서 겔 내에서 그로부터 이동한다. 상기 블롯팅 프로세스의 결과로서, 단백질은 검출을 위한 얇은 표면층에 노출된다 (하기 참조). 그의 비 특이 단백질 결합 특성 (즉, 모든 단백질에 동일하게 잘 결합하는 특성)을 위해 다양한 2개의 막 모두 선택된다. 단백질 결합은 소수성 상호작용 뿐만 아니라, 막과 단백질 사이의 하전된 상호작용에 기초한다. 니트로셀룰로스 막이 PVDF보다 더 저렴하지만, 훨씬 더 쉽게 부서지기 쉽고, 반복된 프로빙에 대해 잘 유지되지 못한다. 겔로부터 막으로의 이동에 관한 균일성 및 전반적인 효과는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 또는 폰소 S(Ponceau S) 염료로 막을 염색함으로써 체크될 수 있다. 일단 옮기고 나면, 단백질을 표지화된 1차 항체를 사용하여 검출하거나, 비표지화된 1차 항체를 사용하고, 이어서, 표지화된 단백질 A 또는 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 2차 표지화된 항체를 사용하여 간접 검출에 의해 검출한다.
C. 면역조직화학법
항체는 또한 면역조직화학법 (IHC)에 의한 연구를 위해 제조된, 새로 냉동된 및/또는 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직 블록과 함께 사용될 수 있다. 상기 입자성 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자의 사전 IHC 연구에서 성공적으로 사용되어 왔고, 당업자에게 널리 공지되어 있다 (문헌 [Brown et al., 1990]; [Abbondanzo et al., 1990]; [Allred et al., 1990]).
간략하면, 실온에서 작은 플라스틱 캡슐 중 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS)에서 50　ng의 냉동된 "미분된" 조직을 재수화시키고; 원심분리에 의해 입자를 펠릿화하고; 이를 점성 포매 매질 (OCT)에 재현탁시키고; 캡슐을 도립시키고/거나, 원심분리에 의해 다시 펠릿화하고; -70℃ 이소펜탄 중에서 급속 냉동시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고/거나, 조직의 냉동 실린더를 제거하고; 조직 실린더를 동결 마이크로톰 척 상에 조직 실린더를 고정시키고/거나, 캡슐로부터 25-50 연속 절편으로 절단함으로써 냉동된 절편을 제조할 수 있다. 대안적으로, 전체 냉동된 조직 샘플이 연속 절편 절단을 위해 사용될 수 있다.
플라스틱 미세원심분리관에서 50　mg 샘플을 재수화하고; 펠릿화하고; 4시간 고정시키기 위해 10% 포르말린 중에 재현탁시키고; 세척/펠릿화하고; 가온 2.5% 아가 중에 재현탁시키고; 펠릿화하고; 빙수에서 냉각시켜 아가를 경화시키고; 상기 관으로부터 조직/아가 블록을 제거하고; 블록을 파라핀 중에 침투 및/또는 포매시키고/거나; 최대 50개의 연속 영구 절편으로 절단하는 것을 포함하는 유사 방법에 의해 영구 절편을 제조할 수 있다. 또한, 전체 조직 샘플을 치환할 수 있다.
D. 면역검출 키트
추가의 다른 실시양태에서, 상기 기술된 면역검출 방법과 함꼐 사용하기 위한 면역검출 키트가 있다. 따라서, 면역검출 키트는 적합한 용기 수단에 MUC1 항원에 결합하는 1차 항체, 및 임의적으로 면역검출 시약을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, MUC1-C 항체를 고체 지지체, 예컨대, 칼럼 매트릭스 및/또는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 미리 결합시킬 수 있다. 키트의 면역검출 시약은 주어진 항체와 회합 또는 그에 연결된 검출가능한 표지를 비롯한, 다양한 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 회합 또는 그에 부착된 검출가능한 표지 또한 고려된다. 예시되는 제2 리간드는 1차 항체에 대하여 결합 친화성을 가지는 2차 항체이다.
본 키트에서 사용하는 데 적합한 추가의 면역검출 시약은 2차 항체에 대해 결합 친화성을 가지며, 검출가능한 표지에 연결된 것인 3차 항체와 함께, 1차 항체에 대하여 결합 친화성을 가지는 2차 항체를 포함하는 2 성분 시약을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 다수의 예시적인 표지가 당업계에 공지되어 있고, 상기 표지 모두 본원에서 논의된 실시양태와 관련하여 사용될 수 있다.
키트는 검출 검정법에 대한 표준 곡선을 제작하는 데 사용될 수 있는 바와 같이, 표지화 여부에 상관없이, 적합하게 분취된 MUC1 항원 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 완전히 접합된 형태, 중간체 형태, 또는 키트 사용자에 의해 접합되는 별개의 모이어티로서, 항체-표지 접합체를 함유할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질 중에 또는 동결건조된 형태로 패키징될 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 1종의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지, 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이며, 항체는 그 안으로 배치되거나, 또는 바람직하게는 분취될 수 있다. 키트는 또한 상업적 판매를 위해 밀폐된 구획 안에 항체, 항원을 함유하기 위한 수단, 및 임의의 다른 시약 용기를 포함할 것이다. 상기 용기는 그 안에 원하는 바이알을 보유하는 주사 또는 블로우 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
VI. 실시예
하기 실시예는 특정 실시양태를 입증하기 위해 포함된 것이다. 하기 실시예에 개시된 기법은 본 발명자에 의해 본 실시양태의 실시에서 잘 작용하는 것으로 밝혀진 기법을 나타내는 것이며, 따라서, 상기 기법은 그의 실시를 위해 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 당업자는 이해하여야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이, 개시된 구체적인 실시양태에 대해 많은 변형이 이루어질 수 있으며, 이를 통해서도 여전히 비슷한 또는 유사한 결과를 얻게 된다는 것을 이해하여야 한다.
실시예 1 - 항체 제조 및 스크리닝 방법
면역 혈청의 백신접종 및 검사. 마우스 면역글로불린의 Fc에 융합된 MUC1-C의 ECD를 함유하는 단백질 (MUC1-C/ECD-mFc)로 C57Bl/6 마우스를 면역화시켰다. 마우스 2마리를 완전 프로인트 애주번트 (FCA)와 혼합된 100 ㎍의 MUC1-C/ECD-mFc로 면역화시키고, 3일 후, PBS 중 100 ㎍의 MUC1-C/ECD-mFc로 면역화시켰다. 하기 표 6에 제시된 바와 같이, FCA 중 50 ㎍의 MUC1-C/ECD-mFc를 PBS 중 50 ㎍의 MUC1-C/ECD-mFc와 함께 교대로 매 3일마다 8회에 걸쳐 마우스를 반복적으로 부스팅시켰다. 최종 부스팅은 면역 혈청 체크 후, 50 ㎍의 항원을 이용하여 정맥내로 수행하였다. 음성 대조군으로서 면역 이전 혈청을 수집하였다. 면역 혈청은 스케줄에 따라 7차 주사 이후에 수집하였고, 혈청을 하기 기술되는 방법에 따라 웨스턴 블롯팅 및 ELISA, 둘 모두에 의해 시험하였다.
ELISA. 100 ㎕의 1 ㎍/ml MUC1-C/ECD-hFc 또는 MUC1-C/ECD-mFc 또는 hFc (음성 대조군으로서)로 플레이트를 코팅하여 ELISA를 수행하였다. 플레이트와 함께 1 hr 동안 인큐베이션시킴으로써 코팅된 단백질에 대한 하이브리도마 상청액 또는 면역 혈청을 스크리닝하였다. HRP (홀스 래디쉬 퍼옥시다제)에 접합된 특이적인 2차 항체 (항-마우스 Ig, F(ab)2 특이)와 함께 인큐베이션시킴으로써 결합 항체를 검출하였다. 추가로, 30 min 동안 HRP 특이 기질을 이용하여 반응을 발색시키고, 405 nm에서 플레이트를 판독하였다.
웨스턴 블롯팅. 전체 세포 용해물을 이용한 항체에 대한 웨스턴 블롯팅 실시는 하기와 같이 수행하였다. ZR-75-1 유방암종, MCF-7 유방암종, H441 비소세포 폐암종 및 293T 세포로부터의 전체 세포 용해물에 대해 SDS-PAGE를 수행하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 놓았다. 정제된 모노클로날 항체를 막과 함께 인큐베이션시키고, 항원에 결합한 항체를 HRP-접합된 염소 항-마우스 Ig, F(ab)2 특이 (1:5,000 희석; GE 헬쓰케어(GE Healthcare))에 이어서, 증강된 화학발광 (GE 헬쓰케어)에 의해 검출하였다.
Figure 112016082964921-pct00014
하이브리도마를 위한 융합 및 1차 스크리닝. ELISA로부터 얻은 결과에 기초하여, 골수종 세포와의 융합을 위해 두 마우스 모두로부터 얻은 비장을 사용하여 하이브리도마를 생성하였다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 존재하에 마우스 골수종 세포 sp2/0-Ag14 및 비장 세포를 1:3의 비율로 혼합하여 비장-골수종 융합을 수행하였다. 융합 후, 선별 HAT 배지 중에서 세포 배양을 수행하였다. 항원으로서 재조합 MUC-C/ECD-mFc 또는 MUC1-C/ECD-hFc를 사용하여 웨스턴 블롯 또는 간접 ELISA에 의해 하이브리도마를 선별하고, 클론이 안정해질 때까지 제한 희석 프로토콜에 의해 서브클로닝을 수행하였다. 마우스 1의 비장으로부터 수득된 융합 클론은 315.1 클론으로 명명하고, 유사하게, 마우스 2로부터의 것은 315.2 클론으로 명명한다. 다른 백신접종 배치로부터의 마우스 1의 비장으로부터 수득된 융합 클론은 384 클론으로 명명한다. 315.2 클론으로부터 7개의 모체 양성 클론 (3G1. 3H7, 4A11, 4H3, 5A4, 8E1 및 8F1)이 확인되었다. 마우스 315.1로부터 6개의 모체 양성 클론 (1A4, 1G4, 2A6, 6D12, 6A6, 5G6)이 확인되었다. 마우스 384로부터 2개의 모체 양성 클론 (2G11,2H11)이 선별되었다. 상기 클론들을 ELISA에 의해 다시 확인하였고, 스크리닝하는 동안, 마우스는 항원으로서 MUC1-C/ECD-hFc로 면역화되었는 바, 본 발명자들은 오직 hFc 단백질에만 반응성인 임의의 클론은 배제시켰다.
2차 스크리닝. 96웰 플레이트에서 제한 희석에 의해 선별된 모체 클론에 대하여 서브클로닝을 수행하고, 상기 웰로부터의 상청액에 대해 ELISA에 의해서 추가의 스크리닝을 수행하였다. 흡광도 값이 더 높은 서브클론을 더 큰 웰에서 확장시키고, ELISA에 의해 확인하기 위해 상청액을 선별하였다. 상기 단계에서는 각 모체 클론으로부터 최대 3개의 서브클론을 선택하였다. 이들 선별된 서브클론은 MUC1-C/ECD 단백질 뿐만 아니라, hFc 단백질에도 반응성인 것으로 확인되었다. 315.1 및 315.2 마우스로부터의 선별된 서브클론:
Figure 112016082964921-pct00015
포유동물 mFc-MUC1-C/ECD로 면역화된 마우스 384에서는 2개의 추가 클론, 2G11 및 2H11이 생성되었다 (도 29). 　이들 클론은 웨스턴 블롯 분석에서 박테리아에 의해 생산된 MUC1-C/ECD 단백질과 양성적으로 반응하였다 (도 30). 　따라서, 상기 클론의 특징은 6A6, 8E1, 2A6 및 8F1과는 상이하다 (도 30).
최종 클론 선별. 상기 언급된 기준에 따라 서브클론을 선택하고, mAb 제조 및 정제를 진행하거나, 클론의 순도 (단일 세포 클론) 및 안정성에 따라 추가의 서브클로닝을 진행하였다. 따라서, 안정성에 대해 서브클로닝한 후, 제조 및 정제에 대하여 최종적으로 하기 서브클론이 선별되었다:
Figure 112016082964921-pct00016
항- MUC1 -C/ ECD 모노클로날 항체 정제. 저수준의 소 IgG를 함유하는 10% FBS로 보충된 DMEM (인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 중에서 하이브리도마를 성장시켰다. 아크타 X프레스 FPLC 시스템(Akta Xpress FPLC system) (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))을 사용하여 50 mM 인산나트륨/300 mM NaCl로 평형화된 프로테인 세파로스를 통해 배양물 상청액을 통과시켰다. 세척 후, 0.1 M 시트레이트 완충제 (pH 3.0)를 사용하여 항체를 용리시켰다. 용리된 분획을 중화시키고, 풀링하고, PBS에 대해 투석시키고, 암미콘 울트라셀 10K 필터(Amicon Ultracel 10K filter) (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌러리카))를 사용하여 농축시켰다. 상기 정제된 항체 모두를 상이한 희석률로 ELISA로 Muc1-ECD에 대한 그의 반응성에 대하여 시험하였다.
항- MUC1 -C/ ECD 항체의 명명법. 본 발명자들은 MUC1-C 단백질의 ECD에 대한 7개의 상이한 모노클로날 항체를 발생시키고, 정제하였으며, 이들 항체는 그의 정제 기점이 된 서브클론의 명칭을 따서 식별된다. 그러나, 간단함을 이유로, 하기 명시되는 바와 같이, 그의 모체 클론의 명칭을 따서 명명되었다.
Figure 112016082964921-pct00017
웨스턴 블롯 분석. 웨스턴 블롯팅으로 항체 성능을 분석하였다. MUC1-ECD-mFc 및/또는 MUC1-ECD-hFc (0.5 및 1 ㎍/레인)에 대해 SDS-PAGE를 수행하고, 20 V에서 60 min 동안 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 놓았다. 모노클로날 항체를 막과 함께 인큐베이션시키고, 항원에 결합한 항체를 HRP-접합된 염소 항-마우스 Ig, F(ab)2 특이 (1:5,000 희석; GE 헬쓰케어)에 이어서, 증강된 화학발광 (GE 헬쓰케어)에 의해 검출하였다.
유세포 분석법 분석. 세포 표면 MUC1-C 단백질에 결합할 수 있는 항체의 능력을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 세포를 30 min 동안 항-MUC1-C/ECD 항체 또는 마우스 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 세척하고, 염소 항-마우스 면역글로불린플루오레세인-접합된 항체 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)와 함께 인큐베이션시키고, 1% 포름알데히드/PBS 중에서 고정시켰다. 면역형광 FAC스캔(FACScan)에 의해 반응성을 검출하였다. 면역형광 FAC스캔에 의해 반응성을 검출하였다 (하기 표 8).
Figure 112016082964921-pct00018
세포 성장 억제 검정법/ 트리판 블루 ( Trypan Blue) 배제. 트리판 블루 배제 검정법. 세포를 그의 성장률에 기초하여 추정 개수로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 웰 중에서 세포를 밤새도록 성장시킨 후, 37℃, 5% CO2에서 다양한 시간 간격으로 (예컨대, 3일마다 한번씩) 2-4 ㎍/ml의 항체를 첨가하고, 혼합하였다. 항체와 함께 6일 인큐베이션시킨 후, 트립신 처리에 의해 세포를 수거하고, 트리판 블루 배제 방법에 의해 생존가능한 세포를 계수하였다.
세포 성장 억제 검정법/ 알라마르 블루(Alamar Blue). 대안적으로, 96웰 플레이트에 세포를 플레이팅하였다. 밤새도록 성장시킨 후, 10 ㎍/ml를 시작으로 하여 2배씩 연속하여 희석시키면서 다양한 농도의 항체로 세포를 처리하였다. 항체(들)를 4-6일 동안 처리한 후, 알라마르 블루 시약을 웰에 첨가하고, 3-5 hr 동안 인큐베이션시키고, 써모맥스(Thermomax) 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스((Molecular Devices))를 이용하여 570 nm (여기 파장) 및 600 nm (방출 파장)에서 플레이트를 판독함으로써 흡광도를 측정하였다. 알라마르 블루의 환원 비율(%)은 검정법에서 살아있는 세포의 비율(%)에 비례하고, 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 소프트웨어를 이용하여 산출하고, 4-파라미터 곡선으로서 플롯팅하였다.
ZR-75-1 유방암 세포 및 H-1975 폐암 세포에서의 항-MUC1-C/ECD MAb 8E1 및 6A6의 세포 내재화. MAb 6A6 및 8E1을 FITC 또는 알렉사 플루오르 488로 직접 표지화하고, 표지화한 후, 항체를 제조사의 설명서에 따라 정제하였다. 유리 바닥 배양 플레이트 상에서 성장시킨 ZR-75-1 또는 H-1975 세포에서 면역형광을 평가하였다. FITC- 또는 알렉사 플루오르 488-접합된 MAb 6A6 또는 8E1을 4 및 2 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. MUC1-음성 HEK-293T 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 먼저, 4℃에서 60 min 동안 표면 표지화를 수행하였다. 37℃에서 추가로 3 hr 동안 배지 중에서 인큐베이션시킴으로써 표면 결합 항체의 내재화를 개시하였다. 이어서, 적절한 파장을 사용하여 표면형광 현미경(에피형광)으로 살아있는 세포를 분석하였다.
ZR-75-1 유방암종 및 H-1975 NSCLC 세포에서의 엔도솜 마커와의 MAb 6A6 및 8E1의 공동 국재화. 10% 열 불활성화된 우태아 혈청, 스트렙토마이신 (100 mg/ml), 페니실린 (100 U/ml), 및 2 Mm L-글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 인간 ZR-75-1 및 H-1975 세포를 성장시켰다. 표지화하기 48 h 전 유리 바닥 배양 플레이트에 RPMI-1640을 포함하는 플레이트당 15,000개의 세포로 세포를 시딩하였다. 알렉사 플루오르 488-접합된 MAb 6A6 또는 8E1을 4 및 2 ㎍/ml의 농도로 사용하였다. 알렉사 플루오르 488-표지화된 비 특이 IgG (이소형 대조군 항체)를 음성 대조군으로서 사용하였다. MUC1-음성 HEK-293T 세포를 추가의 음성 대조군으로서 사용하였다. ZR-75-1 또는 H-1975 세포를 MAb와 함께 인큐베이션시키기 전 16-18 h 동안 RFP-엔도사이트 마커 (인비트로겐)로 형질감염시켰다. 적절한 시점에, 세포를 PBS로 세척하고, PBS 중 0.5% BSA로 차단시켰다. 알렉사 플루오르 488-표지화된 MAb 8E1 또는 6A6 (2 ㎍/ml)을 사용하여 4℃에서 60 min 동안 세포를 표지화하였다. 인큐베이션시킨 후, 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 막 결합에 대하여 모니터링하기 위해 4℃에서 또는 내재화를 위해 37℃에서 추가의 3 h 동안 배양 배지 중에서 인큐베이션시켰다. 처리 기간 종료시, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 60X 유침용 대물 렌즈를 사용하여 니콘(Nikon) 디콘볼루션 광역 표면형광 시스템을 이용함으로써 조사하고, NIS-소자 소프트웨어 (니콘)을 이용하여 영상을 포착하였다. 모든 영상은 이미지 J 소프트웨어(Image J software)를 이용하여 분석하였다.
실시예 2 - 항체 제조 및 스크리닝 결과
웨스턴 블롯팅 결과, 항-MUC1-C/ECD 항체와 MUC1-C/ECD 단백질의 특이적인 반응성이 입증되었고, MUC1-CD 단백질 (음성 대조군)과는 반응하지 않은 것으로 나타났다. 트리판 블루 배제 방법에 의해 수득된 세포 생존가능성 검정법은 하기 표 9 내지 27에 제시되었다. 상기 결과를 통해 항-MUC1-C/ECD 항체는 세포 성장 억제에 대하여 다른 선택적인 영향을 미친다는 것이 명확하게 입증되었다. 세포의 생존가능성은 항체 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 그러나, 항체 농도가 2 mg/ml 초과로 증가하였을 때에는 생존가능성에 어떤 영향도 미치지 않았다. 상기 데이터는 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 동시에 수행된 검정법으로 확증된다. 특정 유형의 세포를 억제시키는 데 있어서 항체의 선택성은, 6D12 항체로 처리되었을 때 어떤 중요한 세포 성장 억제도 보이지 않은 MCF-7 세포를 사용하여 입증되었다.
Figure 112016082964921-pct00019
4 ㎍/ml 항-p59 항체 2A6 및 6A6으로 H1975 세포 처리. 항-MUC1 CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 8,000개의 세포/웰/ml RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00020
4 ㎍/ml 항-p59 항체 2A6 및 6A6으로 H-1975 세포 처리. 8,000개의 세포/웰/ml RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00021
4 ㎍/ml 항-p59 항체 2A6 및 6A6으로 293T 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 4,500개의 세포/웰/ml (DMEM 중)로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00022
4 ㎍/ml 항-p59 항체-2A6 및 6A6으로 ZR75-1 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 10,000개의 세포/웰/ml RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00023
4 ㎍/ml 항-p59 항체 8F1, 2A6 및 6A6으로 ZR75-1 세포 처리. 항-MUC1-CD 4 ㎍/ml를 대조군으로서 사용하였다. 10,000개의 세포/웰/ml RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 같은 날 (세포 시딩일) 항체 처리를 수행하였다. 세포를 7일째 수거하였다.
Figure 112016082964921-pct00024
4 ㎍/ml 항-p59 항체 8F1, 2A6 및 6A6으로 ZR75-1 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 5,000개의 세포/웰/ml RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. (오직 세포 시딩일에만) 항체 처리를 수행하였다. 9일째 (같은날) 수거하였다:
Figure 112016082964921-pct00025
2 및 4 ㎍/ml 항-p59 항체 (315.2.8F1.D2.D1)로 H1650 세포 처리. 항-MUC1-CD 항체를 이소형 매치된 대조군 (IgG1카파)으로서 2 및 4 ㎍/ml로 사용하였다. 8,000개의 세포/웰/800 ㎕ RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 6일 동안 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00026
4 ㎍/ml 항-p59 항체 (315.2.8F1.D2.D1)로 H1975 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 8,000개의 세포/웰/800 ㎕ RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00027
4 ㎍/ml 항-p59 항체 (315.2.8F1.D2.D1)로 H1975 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml를 대조군으로서 사용하였다. 8,000개의 세포/웰/800 ㎕ RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00028
4 ㎍/ml 항-p59 항체 (315.2.8F1.D2.D1)로 HEK293T 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 4,500개의 세포/웰/800 ㎕ RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 계획상 세포를 6일 동안 매일 처리하는 것으로 하였다. 그러나, 세포는 빠르게 성장하였고, 이에, 처리 5일 후 수거하였다.
Figure 112016082964921-pct00029
2 및 4 ㎍/ml 항-p59 항체 (315.2.8F1.D2.D1)로 ZR-75.1 세포 처리. 10,000개의 세포/웰/800 ㎕ RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 6일 동안 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00030
4 ㎍/ml 항-p59 항체 (315.2.8F1.D2.D1)로 ZR 75-1 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 10,000개의 세포/웰/800 ul RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00031
Figure 112016082964921-pct00032
Figure 112016082964921-pct00033
Figure 112016082964921-pct00034
Figure 112016082964921-pct00035
Figure 112016082964921-pct00036
4 ㎍/ml 항-p59 항체 2A6 및 6A6으로 H1975 세포 처리. 항-MUC1-CD (4 ㎍/ml)를 대조군으로서 사용하였다. 8,000개의 세포/웰/ml RPMI로 a24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
Figure 112016082964921-pct00037
5 ㎍/ml 항-p59 항체 또는 IgM 대조군 항체로 SKOV3 세포 처리. 10,000개의 세포/800 ㎕ RPMI로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날 항체 처리를 시작하였다. 세포를 6일 동안 매일 처리하였다.
ZR-75-1 유방암종 또는 H-1975 NSCLC 세포주를 사용하여 FITC 또는 알렉사 플루오르 488에 접합된 MAb 6A6 및 8E1의 내재화를 평가하였다. 대조군으로서 MUC1-음성 HEK293T 세포를 사용하여 결합 및 내재화에 대한 선택성을 정의하였다. 본 결과는 H-1975 NSCLC 세포를 37℃에서 3 h 동안 태그부착된 항체와 함께 인큐베이션시켰을 때, FITC-표지화된 6A6 및 8E1 항체의 유의적인 내재화가 일어났다는 것을 입증한다 (도 12 및 13). ZR-75-1 유방암종 세포에서 알렉사 플루오르 488-표지화된 6A6 항체를 37℃에서 3 h 동안 사용하였을 때, 유사한 결과를 얻었다 (도 14). 4℃ 또는 37℃에서 3 h 동안 인큐베이션시켰을 때, 어떤 항체도 MUC1-음성 HEK-293T 세포에는 결합하지 않았다 (도 15 및 데이터를 제시하지 않음).
본 발명자들은 먼저 4℃에서 알렉사 플루오르 488-6A6 MAb의 ZR-75-1 유방암종 세포에의 결합을 평가하였다. 면역형광 분석을 통하여 4℃에서 원형질막에서의 ZR-75-1에의 MAb 6A6 항체의 결합을 확인하였다 (도 18). ZR-75-1 세포를 RFP 엔도솜 마커와 함께 인큐베이션시키고, 4℃에서 분석하였을 때, 유사한 면역형광 표면 염색이 관찰되었다. 또한, 4℃에서 조기 엔도솜과 함께 공동 국재화되는 곳 (오렌지색/노란색 부분)인 세포막에서 알렉사 플루오르 488-표지화된 6A6 (녹색)이 검출가능하였다. 37℃에서 3 h 동안 더욱 장기간 인큐베이션시켰을 때, MAb 6A6은 세포질로 이동하였으며, 여기서, RFP 엔도솜 마커와 함께 공동 국재화되었다. 37℃에서 3 h 경과 후 후기 엔도솜 내의 알렉사 플루오르 488-태그부착된 6A6 항체의 상기와 같은 내재화 및 국재화는 오버레이로 오렌지색으로 분명하게 나타났다 (흰색 화살표 표시, 도 19). 이러한 관찰 결과는 형광 표지화된 6A6 항체 대다수가 (4℃에서) 조기 세포내이입 구획 밖으로 이동할 수 있고, 37℃에서 후기 엔도솜/리소좀과 함께 공동 국재화될 수 있다는 것을 제안한다.
H-1975 비소세포 암종 세포에서 항- MUC1 -C/ ECD Mab의 내재화 및 엔도솜 마커 와의 공동 국재화. 이어서, 본 발명자들은 H-1975 NSCLC 세포에서 알렉사 플루오르 488-6A6 및 8E1 MAb의 내재화를 평가하였다. 공동 국재화 연구를 위해, H-1975 세포를 항-MUC1-C/ECD Mab 6A6 또는 8E1과 인큐베이션시키기 전 16-18 h 동안 RFP-엔도사이트 마커로 형질감염시켰다. 추가로, 대조군으로 RFP-엔도사이트 마커로 형질감염된 H-1975 세포 또한 별개로 알렉사 플루오르 488-표지화된 이소형 대조군 항체 (IgG)와 함께 인큐베이션시켰다. 면역형광 분석을 통해서 RFP-엔도사이트 마커에 의한 세포 형질감염 후, 엔도솜의 염색을 확인하였다 (도 26). 중요하게, 본 결과를 통해 IgG 이소형 대조군 항체와 함께 인큐베이션시켰을 때, 세포 염색은 있다 해도 거의 없는 것으로 입증되었다 (도 26). 추가로, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰을 때, H-1975 세포에서 알렉사 플루오르 488-표지화된 MAb 6A6의 내재화가 이루어졌다는 것이 면역형광 분석을 통해 입증되었다 (도 20). H-1975 세포를 RFP-엔도사이트 마커로 형질감염시키고, 37℃에서 분석하였을 때, 유사한 염색이 관찰되었다. 더욱 중요하게, 알렉사 플루오르 488-표지화된 6A6은 37℃에서 명백하게 엔도솜과 함께 공동 국재화되었다는 결과가 나타났다. 37℃에서 3 h 경과 후 후기 엔도솜 내의 알렉사 플루오르 488-태그부착된 6A6 항체의 상기와 같은 내재화 및 국재화는 오버레이로 오렌지색/노란색으로 분명하게 나타났다 (도 20). RFP-엔도사이트 마커로 형질감염된 H-1975 세포를 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 8E1 Mab와 함께 인큐베이션시켰을 때, 유사한 결과가 관찰되었다 (도 21).
MUC1-음성 HEK-293T 세포에서 형광 표지화된 6A6의 결합을 평가함으로써 접합체의 특이성을 추가로 조사하였다. 본 결과를 통해 HEK-293T 세포를 4℃ 또는 37℃에서 3 hr 동안 태그부착된 항체와 함께 인큐베이션시켰을 때, 알렉사 플루오르 488-표지화된 6A6 항체의 염색은 있다 해도 거의 없는 것으로 입증되었다 (도 26). 추가로, ZR-75-1 세포에서 알렉사 플루오르 488-표지화된 이소형 대조군 (IgG) 항체를 4℃ 또는 37℃에서 3 hr 동안 사용하였을 때에는 어떤 면역형광도 관찰되지 않았다 (데이터를 제시하지 않음).
H-1975 비소세포 암종 세포에서 항- MUC1 -C/ ECD Mab의 내재화 및 리소좀 마커 와의 공동 국재화. 이어서, 본 발명자들은 H-1975 NSCLC 세포에서 알렉사 플루오르 488-6A6 및 8E1 MAb의 내재화 및 그의 리소좀과의 공동 국재화를 평가하였다. 공동 국재화 연구를 위해, H-1975 세포를 항-MUC1-C/ECD Mab 6A6 또는 8E1과 인큐베이션시키기 전 16-18 h 동안 RFP-리소좀 마커로 형질감염시켰다. 추가로, 대조군으로 RFP-리소좀 마커로 형질감염된 H-1975 세포 또한 별개로 알렉사 플루오르 488-표지화된 이소형 대조군 항체 (IgG)와 함께 인큐베이션시켰다.
면역형광 분석을 통해서 RFP-리소좀 마커에 의한 세포 형질감염 후, 리소좀의 염색을 확인하였다 (도 27). 흥미롭게도, 본 결과를 통해 IgG 이소형 대조군 항체와 함께 인큐베이션시켰을 때, 세포 염색은 있다 해도 거의 없는 것으로 입증되었다 (도 27). 추가로, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰을 때, H-1975 세포에서 알렉사 플루오르 488-표지화된 MAb 8E1의 내재화가 이루어졌다는 것이 면역형광 분석을 통해 입증되었다 (도 28). H-1975 세포를 RFP-리소좀 마커로 형질감염시키고, 37℃에서 분석하였을 때, 유사한 염색이 관찰되었다. 더욱 흥미롭게, 알렉사 플루오르 488-표지화된 8E1이 37℃에서 명백하게 리소좀과 함께 공동 국재화되었다는 결과가 나타났다. 37℃에서 3 h 경과 후 리소좀 내의 알렉사 플루오르 488-태그부착된 8E1 항체의 상기와 같은 내재화 및 국재화는 오버레이로 오렌지색/노란색으로 분명하게 나타났다 (도 28). RFP-리소좀 마커로 형질감염된 H-1975 세포를 알렉사 플루오르 488-표지화된 항-MUC1-C/ECD 6A6 MAb와 함께 인큐베이션시켰을 때, 유사한 결과가 관찰되었다 (도 23).
도 3은 MUC1-C/ECD (58 aa)으로부터의 3개의 중복 펩티드의 서열을 보여주는 것이다. 기술한 항체 모두 상기 3개의 펩티드 중 어느 것과도 반응하지 못한다.
결론적으로, 반응성 및 이소형에 대한 ELISA 데이터, 유세포 분석법 데이터 (특이성 및 선택성), 웨스턴 블롯 분석 (정제된 단백질 및 세포 용해물), 면역형광 (내재화; 엔도솜 & 리소좀과의 공동 국재화), 선형 및 입체구조적 에피토프 맵핑 (중복 ECD 펩티드 및 다중의 단일 점 돌연변이체 사용) 및 생물학적 활성 연구 (시험관내 다중 세포주)를 수행하였다. 다중의 IgG 클론 (6A6, 8E1/8F1, 2A6, 2G11, 2H11)이 확인되었고, 하기에서 이를 추가로 기술한다.
7B8 및 3D1 항체의 특징 규명. 합성된 전체 MUC1-C/ECD 영역 (58 아미노산)에 걸쳐 있는 3개의 중복 펩티드를 사용하여 7B8 및 3D1 클론의 선형 에피토프 맵핑을 수행하였다. P1, P2 또는 P3 펩티드의 존재 또는 부재하에서 7B8 또는 3D1 정제된 항체를 사용하여 ELISA 검정법을 수행하였다. 도 47에 제시한 바와 같이, 본 결과를 통해 7B8 및 3D1의 항원에의 결합이 상기 3개의 중복 펩티드 중 어느 것에 의해서도 억제되지 못했다는 것이 입증된다. MUC1-C/ECD 영역 중의 8개의 중요한 개별 점 돌연변이체를 사용하여 ELISA에 의해 7B8 및 3D1의 입체구조적 에피토프 맵핑을 수행하였다. 본 결과는 항체 3D1이 적어도 부분적으로는, MUC1-C/ECD에 존재하는 D19 아미노산에 감수성이라는 것을 입증한다 (도 48a-b). 상기 관찰 결과는 D19가 3D1 결합을 위한 입체구조적 코어/포켓의 일부분이라는 것을 시사한다. ZR-75-1 유방암종 세포를 사용하여 MUC1-C/ECD와의 경쟁 포맷으로 7B8 또는 3D1 항체 결합을 측정하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 7B8과 달리, 세포를 MUC1-C/ECD 단백질과 함께 인큐베이션시키면, 3D1의 결합은 완전히 폐기된다는 것이 본 결과를 통해 입증되었다 (도 49). 상기 관찰 결과는 7B8 및 3D1의 입체구조적 결합 에피토프가 상이하다는 것을 시사한다. 하이브리도마 3D1에 대한 서열분석 결과는 도 50에 제시되어 있고, 이는 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
2 mg의 각 모노클로날 항체를 절단가능한 링커 발린-시트룰린-p-아미노벤질 (Val-Cit-PAB)을 통해 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)에 접합시킴으로써 7B8 및 3D1의 항체-약물 접합체 (ADC)를 생성하였다. MMAF는 그의 세포독성 활성을 약화시키는 하전된 C-말단 페닐알라닌을 포함하는 신규한 아우리스타틴 유도체이다. 생성된 ADC의 구조는 하기에 제시되어 있다.
Figure 112016082964921-pct00038
본 발명자들은 절단가능한 링커를 사용하여 7B8-MMAF 및 3D1-MMAF 접합체의 시험관내 효능을 측정하였다. 다중 배양된 MUC1-양성 세포주 상에서 7B8 및 3D1 접합체의 항-증식성 효과를 평가하였다. 중요하게, MMAF에 연결된 CD1 (MUC1-C의 내부 세포질 도메인을 표적하는 항체)과 비교하였을 때, 절단가능한 링커를 통해 MMAF에 연결된 7B8 및 3D1은 유의적인 항-증식성 활성을 보였다. 7B8 및 3D1 항체 접합체는 ZR-75-1 유방암종 세포에서 용량에 의존하는 방식의 증식 억제를 유도하였고, IC50 값은 각각 ~860 pM 및 1.32 nM이었다 (도 51a). MDA-MB-468 삼중 음성 유방암종 세포를 7B8 또는 3D1 MMAF 접합체로 처리하였을 유사한 결과를 수득하였다 (도 51b).
실시예 3 - 항체 서열분석 방법 및 결과
8E1 / 8F1. 퀴아젠(Qiagen) 키트를 사용하여 하이브리도마로부터 전체 RNA를 추출하였다. 퀴아젠® 원스텝(QIAGEN® OneStep) RT-PCR 키트 (카탈로그 번호 210210)를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 각 RNA 샘플에 대해, 가변 영역의 리더 서열을 커버하는 축퇴성 정방향 프라이머 혼합물을 사용하여 12개의 개별 중쇄 및 11개의 경쇄 RT-PCR 반응을 셋업하였다. 역 프라이머는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역에 위치한다. 어떤 제한 부위도 프라이머 내로 조작하지 않았다.
반응 셋업은 하기와 같았다:
5x 퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 완충제 5.0 ㎕
dNTP 믹스 (10 mM의 각 dNTP 함유) 0.8 ㎕
프라이머 세트 0.5 ㎕
퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 효소 믹스 0.8 ㎕
주형 RNA 2.0 ㎕
RN아제 무함유 물 20.0 ㎕가 될 때까지
총 부피 20.0 ㎕
PCR 조건은 하기와 같았다:
역전사: 50℃, 30 min
개시 PCR 활성화: 95℃, 15 min
사이클링: 94℃, 25 sec
54℃, 30 sec
72℃, 30 sec로 20 사이클
최종 연장: 72℃, 10 min.
제1 라운드 반응으로부터의 RT-PCR 생성물을 제2 라운드 PCR에서 추가로 증폭시켰다. 항체 가변 영역에 특이적인 세미-네스티드(semi-nested) 프라이머 세트를 사용하여 12개의 개별 중쇄 및 11개의 경쇄 RT-PCR 반응을 셋업하였다.
반응 셋업은 하기와 같았다:
2x PCR 믹스 10 ㎕
프라이머 세트 2 ㎕
제1 라운드 PCR 생성물 8 ㎕
총 부피 20 ㎕
PCR 조건은 하기와 같았다:
초기 변성 95℃에서 5 min,
95℃에서 25 sec,
57℃에서 30 sec,
68℃에서 30 sec로 25 사이클
최종 연장 10 min 68℃.
PCR 종료 후, PCR 반응 샘플을 아가로스 겔 상에서 전개시켜 증폭된 DNA 단편을 시각화하였다. 올바른 항체 가변 영역 DNA 단편의 크기는 400-500 염기쌍이어야 한다.
PCR 양성 밴드를 TOPO에 의해 클로닝한 후, PCR 증폭시키고, 이어서, 겔 전기영동하고, 아가로스 겔로부터 회수하였다. 대략 24개의 클론의 서열을 분석하고, 서열분석 데이터를 사용하여 CDR 분석을 수행하고, 2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 확인하였고, 이는 하기에 제시되어 있다:
중쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00039
(서열 번호 15)
Figure 112016082964921-pct00040
(서열 번호 16).
경쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00041
(서열 번호 19)
Figure 112016082964921-pct00042
(서열 번호 20).
6A6. 퀴아젠® RN이지 미니 키트(QIAGEN® RNeasy Mini Kit) (카탈로그 번호 74104)를 사용하여 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 제1 라운드 RT-PCR 퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 키트 (카탈로그 번호 210210)를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 각 RNA 샘플에 대해, 가변 영역의 리더 서열을 커버하는 축퇴성 정방향 프라이머 혼합물을 사용하여 12개의 개별 중쇄 및 11개의 경쇄 RT-PCR 반응을 셋업하였다. 역 프라이머는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역에 위치한다. 어떤 제한 부위도 프라이머 내로 조작하지 않았다.
반응 셋업은 하기와 같았다:
5x 퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 완충제 5.0 ㎕
dNTP 믹스 (10 mM의 각 dNTP 함유) 0.8 ㎕
프라이머 세트 0.5 ㎕
퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 효소 믹스 0.8 ㎕
주형 RNA 2.0 ㎕
RN아제 무함유 물 10.9 ㎕
총 부피 20.0 ㎕
PCR 조건은 하기와 같았다:
역전사: 50℃, 30 min
개시 PCR 활성화: 95℃, 15 min
94℃, 25 sec
54℃, 30 sec
72℃, 30 sec로 20 사이클
최종 연장: 72℃, 10 min.
제1 라운드 반응으로부터의 제2 라운드 세미-네스티드 PCR RT-PCR 생성물을 제2 라운드 PCR에서 추가로 증폭시켰다. 항체 가변 영역에 특이적인 세미-네스티드 프라이머 세트를 사용하여 12개의 개별 중쇄 및 11개의 경쇄 RT-PCR 반응을 셋업하였다.
반응 셋업은 하기와 같았다:
2x PCR 믹스 10.0 ㎕
프라이머 세트 2.0 ㎕
제1 라운드 PCR 생성물 8.0 ㎕
총 부피 20.0 ㎕
PCR 조건은 하기와 같았다:
초기 변성: 95℃, 5 min
95℃, 25 sec
57℃, 30 sec
68℃, 30 sec로 25 사이클
최종 연장: 68℃, 10 min.
PCR 종료 후, PCR 반응 샘플을 아가로스 겔 상에서 전개시켜 증폭된 DNA 단편을 시각화하였다. 올바른 항체 가변 영역 DNA 단편의 크기는 400-500 염기쌍이어야 한다. PCR 양성 밴드를 TOPO에 의해 클로닝한 후, PCR 증폭시키고, 이어서, 겔 전기영동하고, 아가로스 겔로부터 회수하였다. 대략 24개의 클론의 서열을 분석하고, 서열분석 데이터를 사용하여 CDR 분석을 수행하였다 (월드 와이드 웹vbase2.org의 VBASE2를 사용하여 CDR 영역을 정의하였다). 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 확인하였다:
중쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00043
(서열 번호 17)
Figure 112016082964921-pct00044
(서열 번호 18).
경쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00045
(서열 번호 21)
Figure 112016082964921-pct00046
(서열 번호 22).
2H11. 중쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00047
(서열 번호 23)
Figure 112016082964921-pct00048
(서열 번호 24).
경쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00049
(서열 번호 25)
Figure 112016082964921-pct00050
(서열 번호 26).
2B11. 중쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00051
(서열 번호 60)
Figure 112016082964921-pct00052
(서열 번호 61).
경쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00053
(서열 번호 62)
Figure 112016082964921-pct00054
(서열 번호 63).
4G5. 중쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00055
(서열 번호 64)
Figure 112016082964921-pct00056
(서열 번호 65).
경쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00057
(서열 번호 66)
Figure 112016082964921-pct00058
(서열 번호 67).
7B8. 중쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00059
(서열 번호 68)
Figure 112016082964921-pct00060
(서열 번호 69).
경쇄 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00061
(서열 번호 70)
Figure 112016082964921-pct00062
(서열 번호 71).
3D1. 트리아졸® 리에이전트(TRIzol® Reagent)의 기술 매뉴얼에 따라 의뢰인에 의해 제공받은 냉동 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 프라임스크립트™ 제1 가닥 cDNA 합성 키트(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)의 기술 매뉴얼에 따라 이소형 특이 안티센스 프라이머 또는 범용 프라이머를 이용하여 전체 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 진스크립트(GenScript)의 RACE의 표준 작동 방법에 따라 VH 및 VL 의 항체 단편을 증폭시켰다.
증폭된 항체 단편을 별개로 표준 분자 클로닝 방법을 사용하여 표준 클로닝 벡터로 클로닝하였다. 콜로니 PCR 스크리닝을 수행하여 올바른 크기의 삽입체를 포함하는 클론을 확인하였다. 각 항체 단편에 대하여 5개 이상의, 올바른 크기의 삽입체를 포함하는 단일 콜로니의 서열분석을 수행하였다.
DNA 마커 III (티안젠(Tiangen) 카탈로그 번호 MD103)과 함께 샘플의 단리된 RNA를 1.5% 아가로스/겔레드(GelRed)™ 겔 상에서 전개시켰다 (도 52). DNA 마커 마커 III과 함께 각 샘플의 PCR 생성물 4 ㎕를 1.5% 아가로스/겔레드 ™ 겔 상에서 전개시켰다 (도 53). PCR 생성물을 정제하고, 추가 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
올바른 VH 및 VL 삽입체 크기를 가지는 5개의 단일 콜로니를 서열분석을 위해 보냈다. 5개의 상이한 클론의 VH 및 VL 유전자 (상세한 설명을 위해 서열 및 서열 정렬에 대하여 첨부 파일 참조)는 거의 동일한 것으로 보였다. 하기 열거된 컨센서스 서열은 하이브리도마 441.3.3D1.D6.D11.B1.F10에 의해 생산된 항체 (항-Muc-1)의 서열인 것으로 간주된다.
중쇄 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00063
(서열 번호 72)
Figure 112016082964921-pct00064
(서열 번호 73).
중쇄 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다:
Figure 112016082964921-pct00065
(서열 번호 74)
Figure 112016082964921-pct00066
(서열 번호 75).
*****************
본원에서 개시되고, 청구된 조성물 및 방법들은 모두 본 개시내용을 고려하여 과도한 실험 없이도 제조되고, 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 특정 실시양태에 의해 기술되었지만, 이는 본 발명의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어남 없이, 조성물 및 방법에 대하여, 및 본원에 기술된 방법의 단계에서 또는 단계 순서에서 변형이 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적 및 생리학적, 둘 모두로 관련이 있는 특정 작용제는, 동일하거나, 유사한 결과를 달성하면서, 본원에 기술된 작용제 대신으로 치환될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구범에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 정신, 범주 및 개념에 포함된다고 간주된다.
VII. 참고 문헌
하기 참고 문헌은 본원에 기술된 것에 대한 예시적인 절차상의 상세한 설명 또는 그를 보충하는 상세한 설명을 제공하는 정도로 본원에서 구체적으로 참조로 포함된다.
미국 특허 3,817,837
미국 특허 3,850,752
미국 특허 3,939,350
미국 특허 3,996,345
미국 특허 4,196,265
미국 특허 4,275,149
미국 특허 4,277,437
미국 특허 4,366,241
미국 특허 4,472,509
미국 특허 4,554,101
미국 특허 4,680,338
미국 특허 4,683,202
미국 특허 4,684,611
미국 특허 4,816,567
미국 특허 4,867,973
미국 특허 4,879,236
미국 특허 4,938,948
미국 특허 4,952,500
미국 특허 5,021,236
미국 특허 5,141,648
미국 특허 5,196,066
미국 특허 5,217,879
미국 특허 5,302,523
미국 특허 5,322,783
미국 특허 5,384,253
미국 특허 5,464,765
미국 특허 5,506,138
미국 특허 5,538,877
미국 특허 5,538,880
미국 특허 5,550,318
미국 특허 5,563,055
미국 특허 5,563,250
미국 특허 5,565,332
미국 특허 5,580,859
미국 특허 5,589,466
미국 특허 5,610,042
미국 특허 5,656,610
미국 특허 5,670,488
미국 특허 5,702,932
미국 특허 5,736,524
미국 특허 5,739,018
미국 특허 5,780,448
미국 특허 5,789,215
미국 특허 5,824,544
미국 특허 5,830,725
미국 특허 5,849,304
미국 특허 5,851,826
미국 특허 5,856,456
미국 특허 5,858,744
미국 특허 5,871,982
미국 특허 5,871,983
미국 특허 5,871,986
미국 특허 5,879,934
미국 특허 5,880,270
미국 특허 5,888,502
미국 특허 5,925,565
미국 특허 5,928,906
미국 특허 5,932,210
미국 특허 5,935,819
미국 특허 5,945,100
미국 특허 5,955,331
미국 특허 5,981,274
미국 특허 5,994,136
미국 특허 5,994,624
미국 특허 6,013,516
미국 특허 시리얼 번호 12/789,127
미국 특허 시리얼 번호 13/026,858
미국 특허 시리얼 번호 13/045,033
Figure 112016082964921-pct00067
Figure 112016082964921-pct00068
Figure 112016082964921-pct00069
Figure 112016082964921-pct00070
Figure 112016082964921-pct00071
Figure 112016082964921-pct00072
Figure 112016082964921-pct00073
Figure 112016082964921-pct00074
Figure 112016082964921-pct00075
Figure 112016082964921-pct00076
SEQUENCE LISTING <110> DANA-FARBER CANCER INSTITUTE, INC. GENUS ONCOLOGY, LLC. <120> ANTIBODIES AGAINST THE MUC1-C/EXTRACELLULAR DOMAIN (MUC1-C/ECD) <130> IPA161053-US <150> US 61/933,001 <151> 2014-01-29 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile 50 55 60 Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr 65 70 75 80 Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln 85 90 95 Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr 100 105 110 Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp 115 120 125 Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu 145 150 155 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Ala Lys Asn Tyr Leu Gly Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His Asp 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Val Arg Leu Tyr Tyr Gly Asn Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Gln Ser Leu Val His Asn Asn Gly Asp Thr Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 11 Ser Gln Thr Thr His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 12 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 13 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met 50 55 60 Glu Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Leu Tyr Tyr Gly Asn Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagagtc cctgaaactc 60 tcctgtgaat ccaatgaata cgaattccct tcccatgaca tgtcttgggt ccgcaagact 120 ccggagaaga ggctggagtt ggtcgcagcc attaatagtg atggtggtag cacctactat 180 ccagacacca tggagagacg attcatcatc tccagagaca ataccaagaa gaccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acagccttgt attactgtgt aagactctac 300 tatggtaatg ttatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 17 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Met Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Pro Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Asn Tyr Leu Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcgcagag cctgtccatg 60 acatgcaccg tctcagggtt ttcattaact acctatggtg ttcactgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctggtagtg atatggagtg atggaagcac aacctataat 180 tcacctctca agtccagact gagcatcagc agggacaact ccaagagcca agtattctta 240 aaaatgaaca gtctccaagc tgatgacaca gccatctact actgtgccaa aaattacctc 300 ggtagtctgg actactgggg tcagggaacc tcagtcaccg tctcctca 348 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 tcagagcctt gtacacagta atggaaacac ctatttatat tggtacctac agaagccagg 60 ccagtctcca aagctcctga tctacaaagt ttccaaccga ttttctgggg tcccagacag 120 gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cacactcaag atcagcagag tggaggctga 180 ggatctggga gtttatttct gctctcaaag tacacatgtt cctctcacgt tcggtgctgg 240 gaccaagctg gagctgaaac 260 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 21 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 gatgttgtgt tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacaataatg gagacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac attcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaactac acatgttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaac 337 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 23 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Thr Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Gly Thr Gly Gly Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro 115 120 <210> 24 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagacc 60 tcctgcaagg cctctggtta taccttcaca ggctattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 gcagatgact tcaagggacg gtttgccttg tctctggaaa cctctgccag cactacctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgt tagggggacg 300 gggggtgacg actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagccaa aacgacaccc 360 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 25 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 115 120 <210> 26 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 gatgttgtga tgacccaaac tccgctctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120 taccttcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccggttt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 aacagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaggtac acatgttcct 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Ser Met His 1 5 10 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Asp Asp Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Gly Thr Gly Gly Asp Asp 1 5 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr 20 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Thr Ile Ser Asp 20 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala 1 5 10 15 Gln Ser Gly Ala Gly 20 <210> 36 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide (mutant ECD-L6A) <400> 36 Ser Val Val Val Gln Ala Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 <210> 37 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide (mutant ECD-L8A) <400> 37 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Ala Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 <210> 38 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide (mutant ECD-L6,8A) <400> 38 Ser Val Val Val Gln Ala Thr Ala Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 <210> 39 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide (mutant ECD-Q23V) <400> 39 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Val Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 <210> 40 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 40 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Val Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 <210> 41 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide (mutant ECD-N36A) <400> 41 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr Ala Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro 35 40 45 Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 50 55 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 42 Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Thr <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 44 Asp Gly Asp Tyr Val Ser Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 46 His Ile Tyr Trp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 47 Gly Val Ser Ser Trp Phe Pro Tyr 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 48 Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Phe Trp Ile Glu 1 5 10 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 49 Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 50 Tyr Asp Tyr Thr Ser Ser Met Asp Tyr 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Met His 1 5 10 15 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Gln Gln Asn Trp Lys Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 54 Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Asn Tyr Val Ala 1 5 10 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 55 Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Ser 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 56 Gln Gln His Tyr Ile Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 57 Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 58 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 59 Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 60 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 60 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ile Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Phe 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Tyr Asp Tyr Thr Ser Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaaaatt 60 tcctgcaagg ctattggctt cacattcaat tacttctgga tagagtgggt aaaacagagg 120 cctgggcatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaactggtag tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccatattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgt aagatacgac 300 tatacctctt ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcag 355 <210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 62 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asn Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 63 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 63 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60 ttgacctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca 120 gagcagtctc ctaaactact gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccaat 180 cgcttcacgg gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagaccttg cagattatta ctgtggacag agttacagct atccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322 <210> 64 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 64 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ser His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Pro Gly Val Ser Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 65 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 65 cagattactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120 cagccttcag gaaagggtct ggaatggctg tcacacattt actgggatga tgacaagcgc 180 tataacccat ccctgaagag ccgactctca atctccaagg atacctccag aaaccaggta 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcccggc 300 gtatcctcat ggtttcctta ctggggccca gggactctgg tcactgtctc tgcag 355 <210> 66 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 66 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Pro Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Asn Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Val 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ile Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 67 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 67 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcctgtat cagcaggaga cagggttacc 60 gtgacctgca aggccagtca gagtgtgggt aattatgtag cctggtacca acagaagcca 120 ggacagtctc ctaaactact gatatacttt gcatccaatc gctatagtgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggtt 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag cattatatct ttccgtatac gttcggatcg 300 gggaccaagc tggaaataaa ac 322 <210> 68 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 68 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Glu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Tyr Ser Ser Ser Ala Ser 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Asp Gly Asp Tyr Val Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 358 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 69 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agagaagctg 60 tcctgcaagg cttctgggca caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaacggtcg tacttactac 180 aatgagaact tcaagaccaa ggccacactg actgtagaca aatattccag ctcagcctcc 240 atgcaactcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagtgatggt 300 gactacgtct cgggctttgc ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag 358 <210> 70 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 70 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Gln Tyr Ser 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Val Glu Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Asn Trp 85 90 95 Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 71 <211> 334 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 71 gacattgtgc tcacccaatc tccaggttct ttggctgtgt ctctagggca gagtgtcacc 60 atctcctgca gagccagtga aagtgttcaa tattctggca ctagtttaat gcactggtat 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg gtgcatccaa cgtagagact 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctgtggagg aggatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaaattggaa ggttccttgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334 <210> 72 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 72 caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60 tcctgcaaga cttctggcta tgcattcagt aacttctgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gtctagagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga cactaactac 180 aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagtctaac atctgaggcc tctgcggtct atttctgtgc aaggtcctac 300 tataggtcgg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtctctgt ctctgca 357 <210> 73 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Ser Val Ser Ala 115 <210> 74 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 74 gacatcttgc taactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60 ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120 aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180 aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240 gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaataact ggccactcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 75 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 75 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 76 Asn Phe Trp Met Asn 1 5 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 77 Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 78 Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 79 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His 1 5 10 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 80 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 81 Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 82 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 82 Met Glu Trp Pro Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Glu Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Ser Asn Phe Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Arg Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ala 130 135 <210> 83 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 83 Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 100 105 110 Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125

Claims (63)

  1. 서열 번호 2에 의해 정의되는 MUC1-C 세포외 도메인 (MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 항체로서, 여기서, 상기 항체는 각각 서열 번호 76, 77 및 78을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 79, 80 및 81을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 각각 포함하는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가
    (a) IgG 항체이거나;
    (b) 암 세포 성장을 억제시키거나;
    (c) 암 세포 사멸을 유도하는, 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 또는 Fab 단편인, 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 MUC1-C/ECD 및 다른 암 세포 표면 항원에 대해 특이성을 가지는 재조합 항체인, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체가 뮤린 항체 또는 인간화 항체인, 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 뮤린 항체가 IgG인, 항체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 인간화 항체가 IgG인, 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체가 표지를 추가로 포함하는, 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 태그, 효소, 자기 입자, 발색단, 형광 분자, 화학 발광성 분자, 또는 염료인, 항체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체가 그에 연결된 항종양 약물을 추가로 포함하는, 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항종양 약물이 광불안정 링커 또는 효소적으로 절단되는 링커를 통해 상기 항체에 연결되어 있는, 항체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 항종양 약물이 독소, 방사성 동위 원소, 시토카인 또는 효소인, 항체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가, 서열 번호 76 내지 81의 6개 CDR을 임의의 변형 없이 유지하면서, 각각 서열 번호 73 및 75와 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가지는 것인, 항체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열 번호 72 및 74와 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는, 항체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항체가 나노입자 또는 리포솜에 접합되어 있는, 항체.
  16. 제1항에 있어서, 세포 사멸 유도가 항체-의존성 세포 세포독성 또는 보체-매개 세포독성을 포함하는, 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 암이 MUC1-양성 암인, 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 MUC1-양성 암이 고형 종양; 백혈병 또는 골수종; 또는 전이성 암, 다중 약물 저항성 암 또는 재발성 암인, 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 고형 종양이 폐암, 뇌암, 두부경부암, 유방암, 피부암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 직장암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 고환암, 피부암, 또는 식도암인, 약제학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 백혈병 또는 골수종이 급성 골수양 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 다발성 골수종인, 약제학적 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 제2 항암제 또는 치료법을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제2 항암제 또는 치료법이 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 독소 요법으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 제2 항암제 또는 치료법이 세포내 MUC1 기능을 억제시키는, 약제학적 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 상기 제2 항암제 또는 치료법이 상기 제1 작용제와 동시에; 또는 상기 제1 작용제 이전 및/또는 그 이후에 제공되는, 약제학적 조성물.
  25. 제17항에 있어서, 상기 항체가 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 또는 Fab 단편인, 약제학적 조성물.
  26. 제17항에 있어서, 상기 항체가 MUC1-C/ECD 및 다른 암 세포 표면 항원에 대해 특이성을 가지는 재조합 항체인, 약제학적 조성물.
  27. 제17항에 있어서, 상기 항체가 뮤린 항체 또는 인간화 항체인, 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 뮤린 항체가 IgG인, 약제학적 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 인간화 항체가 IgG인, 약제학적 조성물.
  30. 제17항에 있어서, 상기 항체가 그에 연결된 항종양 약물을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항종양 약물이 광불안정 링커 또는 효소적으로 절단되는 링커를 통해 상기 항체에 연결되어 있는, 약제학적 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항종양 약물이 독소, 방사성 동위 원소, 시토카인, 또는 효소인, 약제학적 조성물.
  33. 제17항에 있어서, 상기 항체가 표지를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 표지가 펩티드 태그, 효소, 자기 입자, 발색단, 형광 분자, 화학 발광성 분자, 또는 염료인, 약제학적 조성물.
  35. 제17항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가, 서열 번호 76 내지 81의 6개 CDR을 임의의 변형 없이 유지하면서, 각각 서열 번호 73 및 75와 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가지는, 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄가 각각 서열 번호 72 및 74와 85%, 90%, 95% 또는 99%의 상동성을 가지는 핵산에 의해 코딩되는, 약제학적 조성물.
  37. 제17항에 있어서, 상기 항체가 리포솜 또는 나노입자에 접합되어 있는, 약제학적 조성물.
  38. 제17항에 있어서, 상기 항체가 세포 사멸을 유도하는, 약제학적 조성물.
  39. 융합 단백질로서,
    (i) 서열 번호 2에 의해 정의되는 MUC1-C/세포외 도메인 (ECD)에 선택적으로 결합하는 제1 단일 쇄 항체로서, 여기서, 상기 항체는 각각 서열 번호 76, 77 및 78을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 79, 80 및 81을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 각각 포함하는, 제1 단일 쇄 항체; 및
    (ii) T 또는 B 세포에 결합하는 제2 단일 쇄 항체를 포함하는, 융합 단백질.
  40. 제39항에 있어서, 상기 제2 단일 쇄 항체가 CD3, T 세포, 또는 B 세포에 결합하는, 융합 단백질.
  41. 제39항에 있어서, 상기 융합 단백질이 표지 또는 치료학적 모이어티를 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  42. 키메라 항원 수용체로서,
    (i) 서열 번호 2에 의해 정의되는 MUC1-C/세포외 도메인 (MUC1-C/ECD)에 선택적으로 결합하는 단일 쇄 항체 가변 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 여기서, 상기 항체는 각각 서열 번호 76, 77 및 78을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 중쇄, 및 각각 서열 번호 79, 80 및 81을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 가변 경쇄를 각각 포함하고;
    여기서, 가요성 힌지가 상기 단일 쇄 항체 가변 영역의 C-말단에 부착되어 있는 것인, 엑토도메인;
    (ii) 막통과 도메인; 및
    (iii) 상기 단일 쇄 항체 가변 영역이 MUC1과 맞물렸을 때, 신호 전달 기능을 포함하는 것인, 엔도도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  43. 제42항에 있어서, 상기 막통과 및 엔도도메인이 같은 분자로부터 유래된 것인, 키메라 항원 수용체.
  44. 제42항에 있어서, 상기 엔도도메인이 CD3-제타 도메인 또는 고친화성 FcεRI를 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  45. 제42항에 있어서, 상기 가요성 힌지가 CD8α 또는 Ig로부터의 것인, 키메라 항원 수용체.
  46. 제42항의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 막통과 및 엔도도메인이 같은 분자로부터 유래된 것인, 세포.
  48. 제46항에 있어서, 상기 엔도도메인이 CD3-제타 도메인 또는 고친화성 FcεRI를 포함하는, 세포.
  49. 제46항에 있어서, 상기 가요성 힌지가 CD8α 또는 Ig로부터의 것인, 세포.
  50. 제38항에 있어서, 상기 세포 사멸이 항체-의존성 세포 세포독성 또는 보체-매개 세포독성에 의해 유도되는, 약제학적 조성물.
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
KR1020167023436A 2014-01-29 2015-01-29 Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체 KR102448454B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461933001P 2014-01-29 2014-01-29
US61/933,001 2014-01-29
PCT/US2015/013410 WO2015116753A1 (en) 2014-01-29 2015-01-29 Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160132012A KR20160132012A (ko) 2016-11-16
KR102448454B1 true KR102448454B1 (ko) 2022-09-28

Family

ID=52463213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167023436A KR102448454B1 (ko) 2014-01-29 2015-01-29 Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체

Country Status (11)

Country Link
US (3) US10059775B2 (ko)
EP (1) EP3099719B1 (ko)
JP (2) JP6908381B2 (ko)
KR (1) KR102448454B1 (ko)
CN (1) CN106132992B (ko)
AU (1) AU2015211034B2 (ko)
CA (1) CA2938111C (ko)
ES (1) ES2794088T3 (ko)
IL (1) IL246997A0 (ko)
MX (1) MX2016009954A (ko)
WO (1) WO2015116753A1 (ko)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3099719B1 (en) * 2014-01-29 2020-04-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
EP3131929B1 (en) * 2014-04-16 2022-06-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies for the prevention or the treatment of bleeding episodes
EP3256494A4 (en) 2015-02-10 2018-12-05 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-muc1* antibodies
JP6996728B2 (ja) * 2016-01-07 2022-01-17 学校法人自治医科大学 グルコーストランスポーター１発現用アデノ随伴ウイルスベクター
GB201610902D0 (en) * 2016-06-22 2016-08-03 Bergen Teknologioverforing As And Bergenbio As Anti-Axl Antagonistic Antibodies
EP3484927A1 (en) * 2016-07-15 2019-05-22 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors (cars) specific for muc1 and methods for their use
JOP20170154B1 (ar) * 2016-08-01 2023-03-28 Omeros Corp تركيبات وطرق لتثبيط masp-3 لعلاج أمراض واضطرابات مختلفة
US10617773B2 (en) 2016-08-05 2020-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against the MUC1-C/extracellular domain (MUC1-C/ECD)
CA3039797A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-muc1* antibodies and use of cleavage enzyme
EP3538141A4 (en) * 2016-11-10 2020-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. ILT3 LIGAND
IL269488B2 (en) * 2017-03-21 2023-09-01 Peptron Inc Conjugation of an antibody specifically for muc1 and its use
WO2018174544A2 (ko) * 2017-03-21 2018-09-27 주식회사 펩트론 Muc1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
AU2018302647A1 (en) * 2017-07-18 2020-02-06 Kyoto University Anti-human CCR1 monoclonal antibody
CN109336980B (zh) * 2017-07-27 2022-04-12 上海细胞治疗研究院 一种靶向Muc1的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
GB201806333D0 (en) * 2018-04-18 2018-05-30 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Parvovirus vector production
TWI825098B (zh) * 2018-05-18 2023-12-11 德商葛萊高托普公司 抗ｍｕｃ１抗體
AU2019339452A1 (en) * 2018-09-11 2021-03-25 Washington University Anti-trem-2 agonist antibodies
AU2020290579A1 (en) * 2019-06-14 2021-12-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against MUC1 and methods of use thereof
CA3186181A1 (en) * 2020-07-16 2022-01-20 Surender Kharbanda Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
WO2022150803A1 (en) * 2021-01-05 2022-07-14 Musc Foundation For Research Development AN AGR2Xcd3 BISPECIFIC ENGAGER FOR THE TREATMENT OF CANCER
JP2024508808A (ja) * 2021-02-26 2024-02-28 テネオバイオ， インコーポレイテッド 抗ｍｕｃ１－ｃ抗体及びｃａｒ－ｔ構造
MX2023014109A (es) * 2021-05-28 2024-01-17 Xyone Therapeutics Inc Constructos de anticuerpos multiespecificos contra dominio extracelular/muc1-c (muc1-c/ecd).
WO2023240135A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Bifunctional chelators and conjugates
WO2024159087A1 (en) * 2023-01-26 2024-08-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Developing a car-engager platform to enhance the functionality and/or persistence of car t cells
US20240261406A1 (en) 2023-02-02 2024-08-08 Minerva Biotechnologies Corporation Chimeric antigen receptor compositions and methods for treating muc1* diseases

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004005470A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Immunogen, Inc. Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
EP0243029A1 (en) 1986-04-08 1987-10-28 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene
EP0273085A1 (en) 1986-12-29 1988-07-06 IntraCel Corporation A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells
US5164313A (en) 1987-06-05 1992-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus encoding cytochromes P-450
US5141648A (en) 1987-12-02 1992-08-25 Neorx Corporation Methods for isolating compounds using cleavable linker bound matrices
US5563250A (en) 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
WO1990002806A1 (en) 1988-09-01 1990-03-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
WO1991016353A1 (en) * 1990-04-23 1991-10-31 Corvas International N.V. Thrombus-specific antibody derivatives
JPH049249A (ja) 1990-04-27 1992-01-14 Kusuda:Kk 塗型剤吹き付け機
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
AU1871492A (en) 1991-03-29 1992-11-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The Production fo transgenic soybean plants
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
WO1994002620A2 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells
US5879934A (en) 1992-07-31 1999-03-09 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains for gene transfer
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
TW442569B (en) 1993-10-25 2001-06-23 Canji Inc Recombinant adenoviral vector
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
JPH09511405A (ja) 1994-09-08 1997-11-18 ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング レトロウイルスベクターハイブリッド及びその遺伝子転移のための使用
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US5830725A (en) 1995-04-28 1998-11-03 The Board Of Trustees For The Leland Stanford Junior University Rapid, stable high-titre production of recombing retrovirus
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5851826A (en) 1995-07-26 1998-12-22 Children's Medical Center Corporation Helper virus-free herpesvirus vector packaging system
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5739018A (en) 1996-08-07 1998-04-14 The Regents Of The University Of California Packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors
US5871983A (en) 1996-09-13 1999-02-16 Eli Lilly And Company Glucosyltransferase gene GTFE from amycolatopsis orientalis
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
WO2002022685A2 (en) * 2000-09-11 2002-03-21 Kufe Donald W Muc1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom
EP1354196B1 (en) 2000-11-27 2010-09-15 Minerva Biotechnologies Corporation Diagnostics, drug screening and treatment for cancer
IL158126A0 (en) 2001-03-29 2004-03-28 Univ Ramot Peptides and antibodies to muc 1 proteins
EP2337801A4 (en) * 2008-10-06 2012-07-25 Minerva Biotechnologies Corp MUC1 ANTIBODIES *
PT2352508E (pt) 2008-10-17 2014-05-26 Genus Oncology Llc Péptidos do domínio citoplasmático muc1 como inibidores de cancro
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione
EP3099719B1 (en) * 2014-01-29 2020-04-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies against the muc1-c/extracellular domain (muc1-c/ecd)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004005470A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Immunogen, Inc. Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3099719A1 (en) 2016-12-07
AU2015211034B2 (en) 2020-04-09
US10059775B2 (en) 2018-08-28
US20220049014A1 (en) 2022-02-17
IL246997A0 (en) 2016-09-29
MX2016009954A (es) 2017-02-23
JP7117410B2 (ja) 2022-08-12
JP2017505625A (ja) 2017-02-23
US20160340442A1 (en) 2016-11-24
JP6908381B2 (ja) 2021-07-28
WO2015116753A1 (en) 2015-08-06
CN106132992A (zh) 2016-11-16
JP2021100942A (ja) 2021-07-08
AU2015211034A1 (en) 2016-08-11
US11136410B2 (en) 2021-10-05
US20180312605A1 (en) 2018-11-01
ES2794088T3 (es) 2020-11-17
KR20160132012A (ko) 2016-11-16
CA2938111C (en) 2024-02-06
EP3099719B1 (en) 2020-04-01
CN106132992B (zh) 2020-08-07
CA2938111A1 (en) 2015-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102448454B1 (ko) Muc1-c/세포외 도메인 (muc1-c/ecd)에 대한 항체
JP2017505625A5 (ko)
CN109071666B (zh) 人脊髓灰质炎病毒受体(pvr)特异性抗体
JP7282401B2 (ja) 癌治療のための抗ｆａｍ１９ａ５抗体の用途
KR20150002621A (ko) 항 ｓｅｚ6 항체들 및 사용 방법
JP7335937B2 (ja) 癌マーカーおよび治療標的としてのグリピカン２
US10617773B2 (en) Antibodies against the MUC1-C/extracellular domain (MUC1-C/ECD)
KR20230116767A (ko) Muc1-c/세포외 도메인(muc1-c/ecd)에 대한 항체
US11117977B2 (en) Anti-fibulin-3 antibodies and uses thereof
JP2024522116A (ja) Ｍｕｃ１－ｃ／細胞外ドメイン（ｍｕｃ１－ｃ／ｅｃｄ）に対する多重特異性抗体構築物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right