PT1344533E

PT1344533E - Composições farmacêuticas compreendendo lectina de ligação a manose

Info

Publication number: PT1344533E
Application number: PT03388016T
Authority: PT
Inventors: Jesper Lund Larsen; Leif Kongerslev
Original assignee: Natimmune As
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2007-01-31
Also published as: EP1344533A1; US20040006009A1; US7462596B2; EP1344533B1; ATE337014T1; JP2005526084A; WO2003077937A1; DE60307701T2; DE60307701D1; DK1344533T3; ES2271515T3; CN1652813A; AU2003215524A1

Description

ΕΡ 1 344 533 /PT

DESCRIÇÃO "Composições farmacêuticas compreendendo lectina de ligação a manose"

Campo do Invento 0 presente invento refere-se a composições farmacêuticas compreendendo lectina de ligação a manose. Além disso, o invento refere-se ao tratamento de uma condição clinica que utiliza as referidas composições farmacêuticas e à utilização das composições farmacêuticas para a preparação de um medicamento.

Antecedentes do Invento A MBL é uma proteína da família colectina e é caracterizada por uma estrutura oligomérica de subunidades. Cada subunidade consiste em 3 polipéptidos idênticos consistindo cada um num domínio de reconhecimento de hidratos de carbono tipo C (CRD), dependente do cálcio, ligado a uma haste colagenosa. 0 número de subunidades numa molécula MBL é variável (Lipscombe, R.J., et al., 1995), no entanto, foi sugerido que o polipéptido biologicamente activo é um oligómero que consiste em mais de três subunidades. A MBL que ocorre naturalmente no plasma compreende principalmente oligómeros de mais de três subunidades e, adicionalmente, formas de proteína desnaturadas e estruturalmente comprometidas que conduzem, por exemplo, a bandas em geles de SDS entre as bandas de MBL dominantes correspondentes aos oligómeros superiores. A MBL recombinantemente produzida revela uma variação de oligómeros similar à MBL derivada de plasma (Vorup-Jensen, T., et al., 2001). No entanto, a MBL recombinantemente produzida tem normalmente um conteúdo maior de formas de massa baixa do que a MBL derivada de plasma. As formas de massa baixa de MBL incluem, por exemplo, cadeias polipeptídicas únicas, subunidades únicas e subunidades diméricas. 2

ΕΡ 1 344 533 /PT A MBL está estruturalmente relacionada com o subcomponente Clq do componente Cl do complemento e parece que a MBL activa o sistema do complemento através da protease serina associada denominada MASP (Matsushita, M., 1992) ou plOO (Ji, Y.-H., et al., 1993), que são similares aos componentes Clr e Cls da via clássica. A via de activação do complemento de MBL é denominada a via MBLectina. De acordo com o mecanismo postulado para esta via, a MBL liga-se a estruturas de hidratos de carbono específicas observadas na superfície de uma gama de microrganismos incluindo bactérias, leveduras, protozoários parasíticos e vírus (Turner, M.W., 1996) e a sua actividade antimicrobiana resulta da activação dos componentes da via do complemento líticos, terminais (Kawasaki, N. et al., 1989) ou promoção de fagocitose (Kuhlman, M. et al., 1989).

Foi descrito que o nível de MBL no plasma pode ser geneticamente determinado (Sumiya, M. et al., 1991, Lipscombe, R.J., et al., 1992, Madsen, H.O., et al., 1994). A deficiência em MBL está associada a susceptibilidade a infecções frequentes por uma variedade de microrganismos na infância (Super, M. et al., 1989, Garred, P. et al., 1995) e possivelmente, em adultos (Garred, P. et al., 1995,

Summerfield, J.A., et al., 1995). A informação recente associa a deficiência em MBL à infecção por HIV e à mais rápida morte após desenvolvimento do SIDA (Nielsen, S.L., et al., 1995, Garred, P., et al., 1997) . A MBL liga-se à forma galactosilo de IgG (GO), que se observa em elevadas concentrações em doentes com artrite reumatóide e depois activa o complemento (Malhotra, R., et al., 1995). A deficiência em MBL está também associada a uma predisposição para abortos espontâneos recorrentes (Kilpatrick, D.C., et al., 1995) e também ao desenvolvimento de lúpus eritematoso sistémico (Davis, E.J., et al., 1995). A MASP-1 (protease serina associada a MBL 1) é uma protease serina similar em estrutura a Clr e Cls da via do complemento embora tenha uma estrutura em espiral de histidina do tipo observado em proteases tripsina e proteases serina tipo tripsina. A MASP-1 mostrou estar envolvida na activação do complemento por MBL. Foi descrito um clone de ADNc que codifica MASP-1 que codifica um péptido de comando 3

ΕΡ 1 344 533 /PT putativo de 19 aminoácidos seguido por 680 resíduos de aminoácidos que se prevê formarem o péptido maduro. A MASP-2 (protease serina associada a MBL 2) (Thiel, S., et al., 1997) é uma protease serina similar em estrutura a

Clr e Cls da via do complemento. Como estes, e contrariamente à MASP-1, não tem qualquer estrutura em espiral de histidina do tipo observado em proteases tripsina e proteases serina tipo tripsina. A MASP-2 mostrou estar envolvida na activação do complemento por MBL. A MASP-3 mostra alguma homologia com MASP-1 e MASP-2 e as duas proteases serina associadas a Clq, Clr e Cls. A MBL purificada a partir do soro foi previamente utilizada numa formulação farmacêutica contendo adicionalmente albumina de soro humano para tratar dois indivíduos deficientes em MBL tendo o referido tratamento com MBL resultado na redução significativa de infecções (Valdimarson, et al., 1998). Adicionalmente, foram descritas na arte anterior várias outras formulações farmacêuticas de MBL.

Valdimarson et al. descrevem a perfusao de uma solução contendo 200 μg/ml de MBL em NaCl 0,15M e albumina de soro humano a 1% p/v (=10 mg/ml). A US 5270199 descreve uma formulação de MBL compreendendo 5 a 100 μg/ml de MBL e/ou fragmento de MBL. A WO 99/64453 descreve várias formulações de MBL compreendendo MBL e um agente estabilizante. Como exemplo preferido é mencionada uma formulação compreendendo 300 a 400 μg/ml de MBL em PBS com albumina a 0,5% (p/v) (=5 mg/ml).

As composições farmacêuticas compreendendo 250-500 μg/ml de MBL com albumina a 0,5% são descritas em Laursen, I. (2001) Downstream PPB Abstracts (Amersham Bioscience), página 15-17.

No entanto, estas formulações de MBL compreendem ou pequenas quantidades de MBL e/ou elevada concentração de 4 ΕΡ 1 344 533 /PT outras proteínas.

Sumário do Invento

No entanto, há necessidade para formulações de MBL, que compreendam MBL estável, compreendendo tais formulações em particular quantidades reduzidas de proteína contendo estabilizantes, tais como, por exemplo, quantidades reduzidas de albumina de soro humano.

Quase todas as formulações farmacêuticas que compreendem proteínas ou polipéptidos como ingrediente activo compreendem também um ou mais estabilizante(s) da referida proteína ou polipéptido. Em particular, os referidos estabilizantes podem ser detergentes ou proteína contendo estabilizantes. Contudo, para muitos fins, é desejável omitir ou reduzir a quantidade de aditivos diferentes, tais como estabilizantes para utilização em composições farmacêuticas, em particular, a quantidade de proteína contendo estabilizantes, no entanto, e com frequência, a redução de proteína contendo estabilizantes resulta em estabilidade reduzida do componente de proteína activo.

Os inventores desenvolveram métodos para produção de MBL altamente concentrada e mostraram, surpreendentemente, que as formulações de MBL compreendendo concentrações elevadas de MBL podem ser suficientemente estáveis para serem utilizadas em formulações farmacêuticas mesmo se não for adicionada nenhuma ou for adicionada apenas uma quantidade reduzida de proteína contendo estabilizante.

Por conseguinte, é um primeiro objectivo do presente invento proporcionar composições farmacêuticas compreendendo aditivos farmaceuticamente aceitáveis e a) pelo menos, 200 μ-g/ml de material contendo proteína, em que a lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL constitui, pelo menos, 35% (p/p) da proteína total; ou b) pelo menos, 400 μρ/ιηΐ de lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL. 5

ΕΡ 1 344 533 /PT É um segundo objectivo do presente invento proporcionar composições farmacêuticas compreendendo aditivos farmaceuticamente aceitáveis; e lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL; e, pelo menos, um catião bivalente. É um terceiro objectivo do presente invento proporcionar um processo de preparação das referidas composições farmacêuticas, compreendendo os passos de

a) Fornecimento da lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL b) Mistura da referida MBL e/ou variantes de MBL com aditivos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, com catiões bivalentes c) e, assim, obtenção das referidas composições farmacêuticas. É um outro objectivo do presente invento proporcionar o tratamento de uma condição clínica num indivíduo em sua necessidade, compreendendo a administração das referidas composições farmacêuticas. 0 tratamento pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em tratamento curativo, de melhoria, de alívio e de prevenção e tratamento suplementar. É ainda um outro objectivo do presente invento proporcionar a utilização da composição acima mencionada, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição clinica num indivíduo em sua necessidade. É, adicionalmente, um objectivo do presente invento proporcionar um medicamento para utilização no tratamento de uma condição clínica num indivíduo em sua necessidade compreendendo uma composição como acima descrito. É, adicionalmente, um objectivo do presente invento proporcionar utilizações das referidas composições farmacêuticas para fins de diagnóstico.

Breve descrição das figuras A Figura 1 ilustra os dados de activação de C4 para amostras de formulação de MBL a 1 mg/ml armazenadas durante 6

ΕΡ 1 344 533 /PT 12 meses a +4°C e -20 °C quando comparadas com a MBL de referência. A Figura 2 ilustra os cromatogramas de SEC do padrão de referência no topo seguido por amostra de estabilidade a 1 mg/ml mantida a +4 graus e a -20 graus. É detectado um pequeno pico de frente na amostra mantida arrefecida correspondente a 1% do conteúdo total de MBL. A Figura 3 ilustra os dados de espectrometria de massa. Picos similares para a referência e as amostras de MBL de 12 meses não indicam alterações na cadeia polipeptidica de MBL durante o armazenamento.

Breve descrição da lista de sequências SEQ ID NO:l: Sequência da proteína MBL humana SEQ ID NO:2: Sequência da proteína MASP-1 humana SEQ ID NO:3: Sequência da proteína MASP-2 humana SEQ ID NO:4: Sequência da proteína MASP-3 humana

Descrição detalhada do invento

MBL e Variantes de MBL O presente invento proporciona i.a. composições farmacêuticas compreendendo MBL e/ou variantes de MBL. As composições farmacêuticas devem compreender, em geral, uma concentração elevada de MBL, por exemplo, a composição pode compreender, pelo menos, 300 μg/ml, tal como, pelo menos, 500 μρ/ιηΐ, por exemplo, pelo menos, 750 tal como, pelo menos, 1000 μρ/ιηΐ, por exemplo, pelo menos, 1300 μρ/ιηΐ de MBL e/ou variantes de MBL.

Por conseguinte, a composição pode estar compreendida num intervalo de 200 a 10000 μρ/ιηΐ, tal como de 200 a 5000 μρ/πιΐ, por exemplo de 200 a 3000 μρ/ιηΐ, tal como de 200 a 2000 μg/ml, por exemplo, de 200 a 1500 μg/ml de MBL e/ou variantes de MBL. 7

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Nas concretizações do presente invento em que as composições farmacêuticas compreendem um catião bivalente prefere-se que as referidas composições compreendam, pelo menos, 300 tal como, pelo menos, 500 μρ/ml, por exemplo, pelo menos, 750 μρ/ιηΐ, tal como, pelo menos, 1000 μρ/ιηΐ, tal como, pelo menos, 1500 μρ/ιηΐ, por exemplo, pelo menos, 2000 μρ/ιηΐ, tal como, pelo menos, 2500 μ,ς/ml, por exemplo, pelo menos, 3000 μq/ml, tal como, pelo menos, 3500 μρ/ιηΐ, por exemplo, pelo menos, 4000 μρ/ιηΐ, tal como, pelo menos, 5000 μρ/ιηΐ, por exemplo, pelo menos, 6000 μρ/ιηΐ, tal como, pelo menos, 7000 μρ/ηιΐ, por exemplo, pelo menos, 8000 μρ/ιηΐ, tal como, pelo menos, 9000 μρ/ιηΐ, por exemplo, pelo menos, 10000 μρ/ιηΐ de MBL e/ou variantes de MBL. A concentração de MBL deve ser, em geral, determinada por determinação e/ou cálculo do peso dos aminoácidos que constituem MBL. Em geral, o peso é calculado para corresponder à forma não glicosilada de MBL. Por conseguinte, em geral, o peso de MBL não inclui qualquer glicosilação e não inclui o conteúdo em água. Numa concretização, a concentração de MBL pode ser determinada utilizando uma análise de aminoácidos como aqui descrito abaixo. Cálculo da Concentração de MBL por Análise de Aminoácidos:

Nem todos os aminoácidos podem ser calculados numa análise de aminoácidos - no entanto, normalmente, a massa dos aminoácidos não detectáveis pode ser facilmente calculada a partir da composição dos aminoácidos detectados quando se determina a concentração de uma solução pura ou bastante pura de MBL. O cálculo da concentração de MBL pode ser realizado de acordo com um certo número de métodos diferentes. De preferência, pode ser utilizado um dos dois métodos aqui descritos abaixo, mais preferivelmente, pode ser utilizado o método 2 aqui descrito abaixo. A quantidade de hidratos de carbono não é normalmente calculada, i.e. a concentração de proteína referida vai normalmente representar apenas o conteúdo em péptido isolado. 8

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No entanto, é possível determinar a massa total de péptido+hidrato de carbono a partir da quantidade de aminoácidos.

Aminoácidos não detectáveis:

Quando se calcula MBL, os aminoácidos não detectáveis são * Triptofano (Trp é hidrolisado em ácido); estão presentes 3 Trp na cadeia polipeptídica * Histidina (His é co-eluída com Tris); está presente apenas uma His na cadeia polipeptídica * Hidroxilisina (Hyl não é aplicada durante a calibração); podem estar presentes no máximo 4 Hyl na cadeia polipeptídica * Hidroxiprolina (Hyp); estão presentes no máximo 8, tipicamente 4, Hyp na cadeia polipeptídica.

Os aminoácidos detectáveis - mas de cálculo incerto - são * Lisina (Lys está parcialmente hidroxilada); estão presentes 15-19 Lys na cadeia polipeptídica; podem estar hidroxiladas no máximo 4 Lys * Prolina (Pro está parcialmente hidroxilada); estão presentes 10-18 Pro na cadeia polipeptídica; podem estar hidroxiladas no máximo 8 Pro. Método 1:

Moles de aminoácidos detectáveis e moles de aminoácidos não detectáveis na amostra analisada:

Aminoácidos não detectáveis = Trp, His, Hyp e Hyl: Presume-se que estejam presentes, em média, 4 Hyp, 4 Hyl, 14 Pro e 15 Lys.

Moles Não Detectadas = [Trp]+[His]+[Hyp]+[Hyl] = 3+1+4+4 = 12

Factor de Correcção para Moles Não Detectadas = Moles Totais/Moles Detectadas = Moles Totais/(Moles Totais-Moles Não Detectadas) = 228/(228-12) = 1,0556 9

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Aminoácidos não detectáveis = Trp, His, Hyp e Hyl:

Massa Não Detectada = [MTrp]+[MHis]+[MHyp]+[MHyl] = 3*186,21+1*137,14+4*113,11+4*144,17 = 1725,89

Massa Detectada = [MAsx] + [MThr ] + [MSer ] + [MGlx] + [MPro] + [MGly] + [MAla] + [MCys ] + [MVal] + [MMet] + [Mlle] + [MLeu] + [MTyr] + [MPhe] + [MLys] + [MArg] = 25*115,09+15*101,11+13*87,08+27*129,12+14*97,12+31*57,05+ 16*71,08+7*103,15+10*99,13+2*131,20+8*113,16+17*113,16+1* 163,18+9*147,18+15*128,17+6*156,19 = 22429,93

Factor de Correcção para Massa Não Detectada = Massa Total/Massa Detectada = (Massa Detectada+Massa Não Detectada)/Massa Detectada = 1,0769 Método 2:

Aminoácidos não detectáveis = Trp, His, Pro/Hyp e Lys/Hyl: Presume-se que estejam presentes, em média, 4 Hyp, 4 Hyl, 14 Pro e 15 Lys.

Moles Não Detectadas = [Trp]+[His]+[Pro/Hyp]+[Lys/Hyl] = 3+1+18+19 = 41

Factor de Correcção para Moles Não Detectadas = Moles Totais/Moles Detectadas = Moles Totais/(Moles Totais-Moles Não Detectadas) = 228/(228-41) = 1,2193

Massa de aminoácidos detectáveis e massa de aminoácidos não detectáveis na amostra analisada:

Para cada aminoácido, a massa é calculada como moles vezes massa molar (corrigida para a água ligada a péptido ausente).

Por exemplo: [MThr] = [Thr]*(119,12-18,01) = [Thr]*101,ll

Aminoácidos não detectáveis = Trp, His, Pro/Hyp e Lys/Hyl:

Massa Não Detectada = [MTrp]+[MHis]+[MPro]+[MHyp]+[MLys] +[MHyl] = 3*186,21+1*137,18+97,12+19*128,17 = 4879,16 10

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Massa Detectada = [MAsx ] + [MThr ] + [MSer] + [MGlx] + [MGly ] + [MAla ] + [MCys] + [MVal] + [MMet ] + [Mlle] + [MLeu] + [MTyr] + [MPhe] + [MArg] = 25*115,09+15*101,11+13*87,08+27*129,12+31*57,05+16*71,08+ 7*103,15+10*99,13+2*131,20+8*113,16+17*113,16+1*163,18+ 9*147,18+6*156,19 = 19147,70

Factor de Correcção para Massa Não Detectada = Massa Total/Massa Detectada = (Massa Detectada+Massa Não Detectada)/Massa Detectada = 1,2548

Comparação da avaliação do método 1 e método 2: O Método 1 é baseado em estimativas de aprox. 95% dos aminoácidos, enquanto que o Método 2 é baseado em estimativas de apenas aprox. 75% dos aminoácidos.

Em geral, todas as estimativas realizadas para o conteúdo de aminoácidos são calculadas pelos dois métodos não sendo normalmente observada qualquer diferença significativa nos resultados. O Método 2 não faz quaisquer suposições sobre o conteúdo de Hyl e Hyp, sendo, por conseguinte, preferido.

Para certos fins, a concentração de MBL é dada em moles em vez de peso/volume. Uma vez que a MBL pode estar presente como oligómero compreendendo quantidades diferentes de subunidades é difícil definir 1 mole de MBL. No âmbito do presente invento prefere-se que 1 mole de MBL se refira a 1 mole de cadeias polipeptídicas individuais de MBL. As referidas cadeias polipeptídicas de MBL individuais podem ser não glicosiladas, parcialmente glicosiladas ou totalmente glicosiladas. Prefere-se que a molaridade da MBL seja calculada anticipando que a MBL não é glicosilada. O peso molecular das cadeias polipeptídicas individuais de MBL não glicosiladas é de 24800 Da. O peso molecular das cadeias polipeptídicas individuais de MBL totalmente glicosiladas é de 25900 Da. O peso molecular da forma que ocorre mais normalmente de cadeias polipeptídicas individuais de MBL glicosiladas é de 25500 Da. 11

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Assim, dependendo do estado de glicosilação de MBL, 1 mg/ml de MBL corresponde ao intervalo de 38 a 41 μΜ, de preferência ao intervalo de 38,6 a 40,3 μΜ. Para a maioria das aplicações práticas, 1 mg/ml de MBL corresponde a aproximadamente 39,2 μΜ. No entanto, 1 mg/ml de MBL não glicosilado corresponde a aproximadamente 40,3 μΜ, enquanto que 1 mg/ml de MBL totalmente glicosilada corresponde a aproximadamente 38,6 μΜ.

Os cálculos acima referem-se a MBL de SEQ ID NO:l.

Contudo, é evidente que os métodos podem ser adaptados para calcular a concentração de fragmentos de MBL e/ou variantes.

Para muitos fins é desejável que a composição farmacêutica compreenda uma quantidade reduzida de proteínas diferentes de MBL (ver aqui abaixo).

Por conseguinte, são preferidas composições farmacêuticas, nas quais a MBL ou variantes de MBL constitua, pelo menos 35% (p/p) , tal como, pelo menos 40% (p/p) , por exemplo, pelo menos, 50% (p/p), tal como, pelo menos, 60% (p/p), pelo menos, por exemplo, 70% (p/p), tal como, pelo menos 80% (p/p) , por exemplo, pelo menos, 90% (p/p) , tal como, pelo menos, 95% (p/p) , por exemplo, pelo menos 98% (p/p) , tal como, pelo menos 99% (p/p) , por exemplo, pelo menos, 99,5% (p/p), tal como, pelo menos, 99,8% (p/p) da proteína total.

Numa concretização do invento, a MBL constitui essencialmente toda a proteína total. O termo "essencialmente toda" destina-se a abranger "toda a detectável", de preferência, toda a proteína detectável por coloração com azul brilhante de Coomassie.

Numa outra concretização, a composição farmacêutica pode compreender aditivos de proteína normalmente utilizados, por exemplo, proteínas que actuam como estabilizantes ou proteína contendo estabilizantes. As proteínas úteis como estabilizantes incluem, por exemplo, albumina de soro humano 12 ΕΡ 1 344 533 /PT ou outros tipos de albumina de soro. Adicionalmente, a proteína contendo estabilizantes pode ser fornecida no soro humano em bruto ou suas fracções. É, em geral, importante para a estabilidade das formulações farmacêuticas que contêm proteína, que elas compreendam uma concentração adequada de proteínas. Em geral, se a concentração da proteína de interesse for baixa, há um risco significativo de adesão inespecífica da proteína de interesse às superfícies de um recipiente de armazenamento ou semelhante. Além disso, as interacções proteína-proteína estabilizam a estrutura tridimensional das proteínas, podendo, por conseguinte, uma concentração maior de proteína reduzir a desnaturação. Por outro lado, as soluções de proteína compreendendo uma concentração elevada da proteína de interesse não são, em geral, estáveis, porque pode ocorrer agregação da referida proteína a uma velocidade mais rápida (Frokjaer e Hovgaard, p. 102, Wang, 1999). Para ultrapassar os problemas acima mencionados é, por conseguinte, comum adicionar estabilizantes, por exemplo, proteína contendo estabilizantes, tal como albumina (Akers, et al., 2000, pgs. 166-167) ou, por exemplo, detergentes, a formulações farmacêuticas compreendendo proteínas.

No entanto, nem sempre é desejável adicionar estabilizantes a uma composição farmacêutica. A proteína contendo estabilizantes, normalmente utilizada, tal como albumina, é normalmente purificada a partir do soro, o que é indesejável devido ao risco de transferência de patogénios do dador soro. Adicionalmente, é frequentemente desejável reduzir o número de aditivos adicionados a uma composição farmacêutica de forma a manter a produção tão simples quanto possível. Menos passos de produção são mais fáceis de executar, reduzem os custos e reduzem também o risco de perda de proteína e degradação. Assim, é frequentemente preferível que não sejam adicionados quaisquer estabilizantes de proteína, por exemplo, que não seja adicionada qualquer proteína contendo estabilizantes nem detergentes.

Surpreendentemente, numa concretização o presente invento descreve uma formulação farmacêutica compreendendo MBL, em que a referida composição farmacêutica não compreende 13

ΕΡ 1 344 533 /PT quaisquer estabilizantes de proteína, i.e. a formulação não compreende outra proteína detectável diferente de MBL e a formulação não compreende qualquer detergente.

Assim, numa concretização preferida do invento, a MBL constitui essencialmente toda a proteína total da composição farmacêutica. Em particular, pode ser preferível que a composição não compreenda proteínas purificadas a partir do soro ou de outras amostras do corpo humano ou animal. Devido ao risco de transferência de vírus ou outros agentes patogénicos a partir do dador, é frequentemente desejável administrar composições farmacêuticas, que não compreendam compostos purificados a partir do soro ou de outras amostras de corpo humano ou animal.

Por conseguinte, numa concretização preferida do presente invento, a composição farmacêutica não compreende proteínas ou material contendo proteína purificado a partir do soro ou de outras amostras de corpo humano ou animal. Nesta concretização, prefere-se que todo ou essencialmente todo o material contendo proteína seja preparado utilizando métodos recombinantes.

Numa concretização do presente invento, a MBL ou variantes MBL pode ser modificada de forma a aumentar mais a estabilidade. Por conseguinte, está incluído no presente invento que a MBL ou variantes de MBL pode ser PEGuilada, acilada ou de outra forma modificada para aumentar a semivida da MBL ou variantes de MBL in vivo. 0 termo MBL e variantes de MBL destina-se a incluir qualquer forma de MBL ou de um seu qualquer homólogo funcional. Em particular, a MBL e variantes MBL pode ser proteína compreendendo, pelo menos, um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos identificada como SEQ ID N0:1 ou um seu homólogo funcional. A MBL de acordo com o presente invento pode compreender uma ou mais subunidades. Cada subunidade de MBL consiste normalmente em 3 polipéptidos individuais, compreendendo, de preferência, cada polipéptido individual uma sequência de aminoácidos identificada por SEQ ID N0:1 ou um seu fragmento 14 ΕΡ 1 344 533 /PT de um seu homólogo funcional. Por exemplo, a MBL pode ser monómeros, dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmeros, heptâmeros, octâmeros, nonâmeros, decâmeros, 11-meros, 12-meros de subunidades ou a MBL pode compreender ainda mais do que 12 subunidades. A MBL compreende, de preferência, mais de duas subunidades. A MBL a ser utilizada no presente invento pode ser derivada de uma qualquer fonte adequada, por exemplo, a MBL pode ser MBL que ocorre naturalmente ou a MBL pode ser MBL recombinantemente produzida. Quando se utiliza MBL recombinantemente produzida no presente invento, prefere-se que a referida MBL recombinantemente produzida tenha um perfil de distribuição de tamanhos que seja similar à MBL que ocorre naturalmente. Por conseguinte, prefere-se que, pelo menos, 50%, por exemplo, pelo menos, 70%, tal como, pelo menos, 80%, por exemplo, pelo menos, 90%, tal como, pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos, 99% da MBL tenha um peso molecular aparente >200 kDa quando determinado por SDS-PAGE de não redução.

De acordo com o invento, a MBL pode ser MBL humana ou MBL de outra espécie animal, em que neste aspecto o sistema imune esteja a actuar como o sistema imune humano, por exemplo, mas não limitado a, MBL de chimpanzés e de macacos rhesus.

Numa concretização do presente invento, a MBL é MBL de soro humano que ocorre naturalmente, purificada. Numa outra concretização do invento, a MBL foi recombinantemente produzida. Prefere-se que a MBL tenha sido recombinantemente produzida.

Exemplos de métodos preferidos de produção de MBL recombinante são descritos no pedido PCT WO00/70043. Em particular, a MBL recombinante a ser utilizada neste invento pode ser preparada como descrito no exemplo 1 do pedido PCT WO00/70043. No exemplo, a MBL recombinante é preparada pela utilização de um vector de expressão compreendendo sequências do gene MBL humano. A MBL pode também ser produzida como descrito no exemplo 1 aqui abaixo. 15

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De forma a obter composições farmacêuticas compreendendo MBL e/ou variante de MBL muito concentrada, pode ser necessário concentrar uma composição de MBL e/ou variante de MBL concentrada. A concentração pode ser realizada por um qualquer método convencional, por exemplo, por utilização de um dispositivo de filtração e exposição a uma força centrífuga. No entanto, para concentração de grandes quantidades de proteína podem ser preferidos outros métodos. 0 invento refere-se também a composições farmacêuticas compreendendo variantes de MBL e aos métodos que as utilizam. As variantes de MBL podem ser, por exemplo, homólogos funcionais de MBL (ver, por exemplo, aqui abaixo) . 0 péptido de MBL isolado que inclui um seu qualquer homólogo funcional, pode compreender, numa concretização, pelo menos, 80 resíduos de aminoácidos, tal como, pelo menos, 100 resíduos de aminoácidos, tal como, pelo menos, 150 resíduos de aminoácidos, tal como, pelo menos, 200 resíduos de aminoácidos, por exemplo, pelo menos, 220 resíduos de aminoácidos, tal como, pelo menos, 250 resíduos de aminoácidos. Outra proteína A composição farmacêutica de acordo com o invento pode compreender outras proteínas diferentes de MBL.

Por exemplo, a composição pode compreender, pelo menos, 300 μρ/ηαΐ, tal como, pelo menos, 500 μρ/ιηΐ, por exemplo, pelo menos, 750 μρ/πιΐ, tal como, pelo menos, 1000 μg/ml, por exemplo, pelo menos, 1300 μρ/ιηΐ de proteína total ou material contendo proteína. Assim, a composição pode estar compreendida, por exemplo, no intervalo de 300 a 3000 μρ/ιηΐ, tal como no intervalo de 500 a 3000 μρ/πιΐ, por exemplo, no intervalo de 750 a 3000 μρ/ιηΐ, tal como, no intervalo de 1000 a 3000 μg/ml, por exemplo, no intervalo de 1300 a 3000 μg/ml, tal como, no intervalo de 1000 a 2000 μρ/ιηΐ de proteína total ou material contendo proteína.

As outras proteínas podem ser quaisquer proteínas adequadas. Numa concretização, a composição farmacêutica para 16 ΕΡ 1 344 533 /PT além de MBL pode compreender uma ou mais proteína (s) naturalmente associada(s) a MBL.

Assim, numa concretização o presente invento refere-se a uma composição farmacêutica, em que a proteína total para além de MBL compreende adicionalmente uma ou mais protease serina associada a MBL (MASP) ou suas variantes.

Por exemplo, a MASP e variantes de MASP pode ser seleccionada a partir do grupo constituído por MASP-1 de SEQ ID NO: 2, MASP-2 de SEQ ID N0:3, MASP-3 de SEQ ID NO: 4, seus fragmentos e seus homólogos funcionais. Os homólogos funcionais das proteínas MASP são aqui descritos abaixo.

Composição farmacêutica

Num aspecto, o presente invento refere-se a uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode ser formulada num certo número de formas diferentes, dependendo da finalidade para a composição farmacêutica particular.

Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada de modo a que seja útil para uma forma de administração particular. As formas de administração preferidas são aqui descritas abaixo.

Numa concretização, a composição farmacêutica é formulada de modo a ser um líquido. Por exemplo, a composição pode ser uma solução de proteína ou a composição pode ser uma suspensão de proteína. 0 referido líquido pode ser adequado para administração parentérica, por exemplo, para injecção ou perfusão.

Em concretizações preferidas do invento, a composição farmacêutica é adequada para injecção em bólus, o que requer que a concentração de MBL seja suficientemente elevada de modo a que uma dose adequada de MBL (ver doses de MBL preferidas aqui abaixo) possa estar contida num volume, que pode ser administrado por injecção em bólus. As composições farmacêuticas para injecção em bólus, compreendem, de preferência, pelo menos, 500 μρ/ιηΐ, mais preferivelmente, pelo menos, 750 μρ/ιηΐ, ainda mais preferivelmente, pelo 17

ΕΡ 1 344 533 /PT menos, 1000 μg/ml, por exemplo, pelo menos 1300 μρ/ιηΐ de MBL e/ou variantes de MBL. O líquido pode ser um qualquer líquido útil, no entanto, é frequentemente preferido que o líquido seja um líquido aquoso. Para muitas finalidades, em particular quando o líquido é utilizado para administração parentérica, é adicionalmente preferido que o líquido seja estéril. A esterilidade pode ser conferida por um qualquer método convencional, por exemplo, filtração, irradiação ou aquecimento.

Adicionalmente, prefere-se que as composições farmacêuticas para administração parentérica tenham sido submetidas a um passo de redução de vírus, i.e. filtração de vírus e/ou tratamento acídico. A finalidade da filtração de vírus é a redução de quaisquer contaminantes de vírus. Por conseguinte, os filtros utilizados são, em geral, constituídos por várias membranas de fibra oca, onde os vírus e outros contaminantes são separados da solução de proteína por exclusão de tamanhos. O princípio por trás da separação é a diferença entre a permeabilidade da MBL e do vírus através das fibras ocas. A diferença na permeabilidade da proteína e vírus é muito aumentada, quando a solução passa através de camadas múltiplas, pelo que os filtros utilizados compreendem, de preferência, várias camadas. A filtração de vírus pode ser realizada por um qualquer método convencional conhecido do perito, por exemplo, como descrito no exemplo 1 aqui abaixo.

Numa concretização do presente invento, o líquido pode compreender um ou mais veículos lipófilos, por exemplo, um ou mais veículos lipófilos adequados para libertação controlada de MBL e/ou variantes de MBL. O líquido pode conter, adicionalmente, quaisquer aditivos farmaceuticamente aceitáveis, adequados. Os aditivos farmaceuticamente aceitáveis preferidos são aqui descritos abaixo.

Para fins de armazenamento, a solução de proteína ou a suspensão de proteína pode ser armazenada a uma qualquer 18 ΕΡ 1 344 533 /PT temperatura desejável, por exemplo, de -100°C a 0°C, tal como de 0°C a 4°C, por exemplo, de 4°C a 10°C, tal como de 10°C a 15°C, por exemplo, de 15°C a 25°C, tal como de 15°C a 35°C.

Por conseguinte, numa concretização do invento, a solução ou suspensão pode ser congelada. Para a maioria das finalidades, a solução ou suspensão é apenas congelada para fins de armazenamento e deve ser descongelada antes da utilização. A composição farmacêutica pode ser acondicionada em doses unitárias únicas, que podem ser mais adequadas para o utilizador. Assim, as composições farmacêuticas para injecção em bólus podem ser acondicionadas em doses unitárias de, por exemplo, no máximo 10 ml, de preferência, no máximo 8 ml, mais preferivelmente, no máximo 6 ml, tal como no máximo 5 ml, por exemplo, no máximo 4 ml, tal como no máximo 3 ml, por exemplo, aproximadamente 2,2 ml. A composição farmacêutica pode ser acondicionada num qualquer recipiente adequado. Num exemplo, uma dose única da composição farmacêutica pode ser acondicionada em seringas para injecção.

Numa outra concretização do presente invento, a composição farmacêutica é uma composição seca. A composição seca pode ser utilizada como tal, mas para a maioria das finalidades, a composição é uma composição seca apenas para armazenamento. Antes da utilização, a composição seca pode ser dissolvida ou suspensa numa composição liquida adequada, por exemplo, água estéril.

Assim, a composição farmacêutica pode ser uma composição seca, compreendendo proteína seca por congelação. A referida composição seca é capaz de ser reconstituída, de preferência numa solução ou suspensão. A proteína pode ser seca por congelação utilizando um qualquer método convencional conhecido do perito na arte. Para secagem por congelação pode ser necessário adicionar um ou mais agentes crioprotectores. Exemplos de agentes crioprotectores preferidos são aqui dados abaixo. 19

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Numa concretização do invento, a composição farmacêutica compreende ainda um ou mais compostos activos, adicionalmente à MBL e/ou variantes de MBL. Uma tal composição farmacêutica pode também ser fornecida na forma de um estojo-de-partes.

Administração A composição farmacêutica pode ser preparada de modo a ser adequada para um ou mais método (s) de administração particular(es) . Além disso, o método de tratamento aqui descrito pode envolver diferentes métodos de administração.

Em geral, pode ser utilizado no presente invento um qualquer método de administração, no qual a MBL possa ser administrada a um indivíduo de modo a que a MBL activa possa alcançar o sítio de doença.

Por exemplo, as composições farmacêuticas do invento podem ser parentericamente administradas, isto é por administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intranasal, intra-rectal, intravaginal ou intraperitoneal. Os compostos podem também ser administrados por inalação, isto é, por administração intranasal e inalação oral. As formas de administração adequadas para tal administração, tal como uma formulação em aerossol ou um inalador de dose medida, podem ser preparadas por técnicas convencionais.

Por conseguinte, numa concretização do presente invento a forma de administração pode ser seleccionada a partir do grupo constituído por injecção, perfusão, administração nasal, administração transdérmica, administração pulmonar, administração alvo e iontoforética.

Em geral, para injecção e perfusão a composição farmacêutica deve ser um líquido estéril. A injecção pode ser injecção num qualquer sítio preferido, por exemplo, a injecção pode ser seleccionada a partir do grupo que consiste em injecção intravenosa, subcutânea, intra-arterial, intramuscular e intraperitoneal. A perfusão é geralmente perfusão intravenosa. 20

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Numa concretização preferida do presente invento, a forma de administração é uma injecção em bólus. Para uma tal concretização, prefere-se que a composição farmacêutica compreenda uma elevada concentração de MBL, de modo a poder-se administrar MBL suficiente. É uma vantagem do presente invento que as composições farmacêuticas proporcionadas compreendam concentrações elevadas de MBL e, por conseguinte, permitam que se administre MBL suficiente como injecção em bólus.

Adicionalmente, a via de administração pode ser administração cutânea numa membrana mucosa. A membrana mucosa à qual a preparação farmacêutica do invento é administrada pode ser uma qualquer membrana mucosa do mamífero à qual a substância biologicamente activa é para ser dada, por exemplo, nariz, vagina, olho, boca, tracto genital, pulmões, tracto gastrintestinal ou recto.

As composições farmacêuticas de acordo com o presente invento podem ser administradas numa ou mais vez(es), por exemplo, podem ser administradas no intervalo de 2 a 5 vezes, tal como 5 a 10 vezes, por exemplo, 10 a 20 vezes, tal como 20 a 50 vezes, por exemplo, 50 a 100 vezes, tal como mais de 100 vezes. A dose de MBL a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado assim como da condição clínica. Em geral, pode-se administrar um intervalo de 0,1 mg a 10 mg, tal como um intervalo de 0,5 mg a 5 mg, por exemplo, aproximadamente 1 mg de MBL por 10 kg de massa corporal. Numa concretização do invento, a dose está no intervalo de 2 a 12 mg, tal como no intervalo de 3 a 10 mg, por exemplo, no intervalo de 4 a 9 mg, tal como no intervalo de 5 a 8 mg, por exemplo, no intervalo de 6 a 7 mg, tal como aproximadamente 6,6 mg de MBL por administração a um ser humano adulto.

As composições farmacêuticas de acordo com o invento podem ser administradas com, pelo menos, um outro composto activo. Os compostos podem ser simultaneamente administrados, quer como formulações separadas quer combinados numa forma de dose unitária, ou sequencialmente administrados. 21

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Numa concretização do presente invento, a composição farmacêutica pode ser administrada como parte de um procedimento de diagnóstico. Por exemplo, o diagnóstico pode ser a determinação do nível de um ou mais compostos num indivíduo. Para fins de diagnóstico pode ser necessário administrar ao referido indivíduo composições farmacêuticas compreendendo níveis elevados de MBL, por exemplo, antes da referida determinação.

Estabilidade de composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas de acordo com o presente invento são, de preferência, estáveis, i.e. podem ser armazenadas a longo prazo sem perda massiva de actividade e/ou sem alterações maiores na distribuição de tamanhos. Em particular, prefere-se que a MBL e/ou variantes de MBL compreendida nas composições farmacêuticas seja estável e, mais preferivelmente, que a MBL e/ou variantes de MBL seja estável durante o armazenamento a longo prazo.

Pelo termo “estável" pretende-se dizer que a MBL e/ou variantes de MBL compreendida nas composições farmacêuticas mantém, de preferência, pelo menos, parte da actividade inicial durante o armazenamento a longo prazo. Assim, a MBL e/ou variantes de MBL compreende, de preferência, pelo menos, 20%, mais preferivelmente, pelo menos, 30%, ainda mais preferivelmente, pelo menos, 40%, ainda mais preferivelmente, pelo menos, 50%, ainda mais preferivelmente, pelo menos, 60%, ainda mais preferivelmente, pelo menos, 70%, ainda mais preferivelmente, pelo menos, 80%, ainda mais preferivelmente, pelo menos, 85%, ainda mais preferivelmente, pelo menos, 90%, tal como, pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos, 96%, tal como, pelo menos, 97%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal como, pelo menos, 99%, por exemplo essencialmente toda a actividade inicial após armazenamento a longo prazo.

Alternativamente, prefere-se que a amostra de MBL e/ou variante de MBL armazenada a longo prazo compreenda, pelo menos, 20%, tal como, pelo menos, 30%, por exemplo, pelo menos, 40%, tal como, pelo menos, 50%, por exemplo, pelo menos, 60%, tal como, pelo menos, 70%, por exemplo, pelo menos, 80%, tal como, pelo menos, 85%, por exemplo, pelo 22 ΕΡ 1 344 533 /PT menos, 90%, tal como, pelo menos, 95%, por exemplo, pelo menos 96%, tal como, pelo menos, 97%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal como, pelo menos, 99%, por exemplo, essencialmente toda a actividade de uma amostra de MBL armazenada a -80°C. A actividade da MBL pode ser determinada, por exemplo, pela sua capacidade de activar ou inactivar o sistema do complemento. Quando C4 é clivado por MBL/MASP é exposto um éster de tiol activo e C4 fica covalentemente ligado aos grupos nucleófilos próximos. Quando se realiza um teste numa cavidade de plástico revestida, uma parte substancial do C4b vai ficar ligada à cavidade de plástico revestida e pode ser detectada por anticorpo anti-C4. Um TRIFMA quantitativo para a actividade de MBL pode ser realizado por 1) revestimento das cavidades de microtitulação com 1 g de manano em 100 1 de tampão; 2) bloqueio com Tween-20; 3) aplicação de complexos de MBL numa quantidade predeterminada; 4) aplicação de amostras de teste; 5) aplicação de factor do complemento purificado C4 a 5 g/ml; 6) incubação durante uma hora a 37°C; 7) aplicação de anticorpo anti-C4 marcado com Eu; 8) aplicação de solução de intensificação; e 9) leitura do Eu por fluorometria resolvida por tempo. (0 cálculo por ELISA pode ser similarmente realizado, por exemplo, por aplicação de anti-C4 marcado com biotina no passo 7; 8) aplicação de

avidina marcada com fosfatase alcalina; 9) aplicação de substrato; e 10) leitura da intensidade de coloração). Entre cada passo, a placa foi incubada à temperatura ambiente e lavada, excepto entre os passos 8 e 9. Pode ser construída uma curva de calibração utilizando diluições de MBL com actividade conhecida. 0 teste é realizado, de preferência, em condições que impeçam a activação de C4 pelas vias de activação do complemento clássicas ou alternativas. A activação de C4 foi completamente inibida pela benzamidina inibidora de protease serina. A activação da via clássica é efectivamente eliminada por realização do passo 3) na presença de força iónica suficientemente elevada (NaCl 0,7 a 2,0M; de preferência NaCl a aproximadamente 1,0M) que não interfere com o complexo de MBL mas destrói completamente o complexo Clqrs; a activação da via alternativa é efectivamente impedida por teste à diluição acima descrita. 23

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No entanto, prefere-se que a actividade de MBL seja determinada de acordo com o teste de activação de C4 descrito no exemplo 9 aqui abaixo. A MBL e/ou variantes de MBL estável não é, de preferência, quebrada ou é quebrada apenas numa quantidade limitada durante o armazenamento a longo prazo, i.e., de preferência, a MBL e/ou variantes de MBL estável não é quebrada ou é quebrada apenas numa quantidade limitada por quebra física e/ou química durante o armazenamento. Por conseguinte, a maioria dos polipéptidos compreendidos na MBL e/ou variantes de MBL são, de preferência, do mesmo comprimento (i.e. contêm a mesma quantidade de aminoácidos) após armazenamento do que antes do armazenamento. 0 comprimento da MBL e/ou variantes de MBL e o conteúdo em aminoácidos assim como a concentração de proteína MBL podem ser determinados por um certo número de métodos diferentes, por exemplo, por análise de aminoácidos, cromatografia de permuta aniónica, por coloração de Coomassie em MBL reduzida ou por manchas Western de MBL não reduzida, por espectrometria de massa ou por cromatografia de exclusão de tamanhos.

Assim, de preferência, pelo menos, 10%, tal como, pelo menos, 20%, tal como, pelo menos, 30%, por exemplo, pelo menos, 40%, tal como, pelo menos, 50%, por exemplo, pelo menos, 60%, tal como, pelo menos, 70%, por exemplo, pelo menos, 80%, tal como, pelo menos, 85%, por exemplo, pelo menos, 90%, tal como, pelo menos, 95%, por exemplo, pelo menos, 96%, tal como, pelo menos, 97%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal como, pelo menos, 99% dos polipéptidos de MBL/variante de MBL são , pelo menos , 50% , por exemplo, pelo menos 60%, tal como, pelo menos, 70%, por exemplo, pelo menos, 80%, tal como, pelo menos, 85%, por exemplo, pelo menos, 90%, tal como, pelo menos, 95%, por exemplo, pelo menos, 96%, tal como, pelo menos, 97%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal comc i, pelo menos, 99%, por exemplo, aproximadamente 100% do comprimento inicial.

Além disso, prefere-se que, pelo menos, 50%, por exemplo, pelo menos, 60%, tal como, pelo menos, 70%, por exemplo, pelo menos, 80%, tal como, pelo menos, 85%, por 24

ΕΡ 1 344 533 /PT exemplo, pelo menos, 90%, tal como, pelo menos, 95%, por exemplo, pelo menos, 96%, tal como, pelo menos, 97%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal como, pelo menos, 99% dos polipéptidos de MBL/variante de MBL não apresentem alterações na cadeia polipeptídica após armazenamento quando investigados por espectrometria de massa.

Adicionalmente, prefere-se que, pelo menos, 50%, por exemplo, pelo menos, 60%, tal como, pelo menos, 70%, por exemplo, pelo menos, 80%, tal como, pelo menos, 85%, por exemplo, pelo menos, 90%, tal como, pelo menos, 95%, por exemplo, pelo menos, 96%, tal como, pelo menos, 97%, por exemplo, pelo menos, 98%, tal como, pelo menos, 99% dos polipéptidos de MBL/variante de MBL armazenados eluam similarmente à MBL/variantes de MBL inicial ou MBL/variantes de MBL armazenada a -80°C após cromatografia de exclusão de tamanhos. A cromatografia de exclusão de tamanhos pode ser realizada, por exemplo, como descrito no exemplo 10 aqui abaixo.

Pelo termo "comprimento inicial" quer-se dizer o comprimento dos polipéptidos de MBL/variante de MBL antes do armazenamento ou alternativamente o comprimento dos polipéptidos de MBL/variante de MBL armazenados a -80°C, o que numa concretização preferida do invento corresponde à MBL de comprimento total, por exemplo, o comprimento total do polipéptido identificado por SEQ ID NO:l. Em geral, o comprimento de MBL/variante de MBL pode ser determinado por determinação do peso molecular dos polipéptidos de MBL/variante de MBL medido em Daltons.

Por armazenamento a longo prazo, pretende-se dizer armazenamento no intervalo de 1 a 4 semanas, tal como de 1 a 3 meses, tal como de 3 a 6 meses, tal como de 6 a 12 meses, por exemplo, 1 a 2 anos, tal como de 2 a 3 anos, por exemplo, 3 a 5 anos, tal como 5 a 7 anos, por exemplo, 7 a 10 anos, tal como mais de 10 anos. O armazenamento a longo prazo está, de preferência, no intervalo de 1 a 2 anos, mais preferivelmente no intervalo de 2 a 5 anos. A estabilidade de MBL e/ou variantes de MBL está dependente das condições de armazenamento. A MBL e/ou 25

ΕΡ 1 344 533 /PT variantes de MBL é estável quando armazenada, de preferência, a uma temperatura, por exemplo, no intervalo de -80°C a -20°C, tal como -25°C a -15°C, por exemplo, -15°C a 0°C, tal como 0°C a 4°C, por exemplo, 2°C a 10°C, tal como 5°C a 15°C, por exemplo, -10°C a 20°C, tal como 15°C a 35°C, por exemplo, 15°C a 30°C, tal como 15°C a 25°C. Numa concretização preferida do invento a MBL e/ou variantes de MBL pode ser armazenada a temperaturas próximas de 4°C, numa outra concretização preferida do invento a MBL e/ou variantes de MBL pode ser armazenada a temperaturas próximas de -20°C, ainda numa outra concretização preferida do invento a MBL e/ou variantes de MBL pode ser armazenada a temperaturas próximas de 37°C. A estabilidade de MBL e/ou variantes de MBL pode ser adicionalmente dependente da natureza da composição farmacêutica. Por exemplo, a estabilidade de MBL e/ou variantes de MBL pode ser diferente quando a composição farmacêutica é uma solução, uma suspensão ou matéria seca.

Homólogos funcionais

Os homólogos funcionais de polipéptidos de acordo com o presente invento destinam-se a compreender uma qualquer sequência polipeptídica que é capaz de realizar essencialmente a mesma função ou parcialmente a mesma função que um polipéptido de uma sequência predeterminada especifica.

Por conseguinte, os homólogos funcionais de acordo com o presente invento compreendem polipéptidos com uma sequência de aminoácidos, que partilha, pelo menos, alguma homologia com uma sequência polipeptídica predeterminada como aqui realçado abaixo.

Os homólogos funcionais de MBL humana compreendem, de preferência, polipéptidos que partilham, pelo menos, alguma homologia com os polipéptidos identificados por SEQ ID NO:l. Os homólogos funcionais de MASP-1 humana compreendem, de preferência, polipéptidos que partilham, pelo menos, alguma homologia com os polipéptidos identificados por SEQ ID NO: 2. Os homólogos funcionais de MASP-2 humana compreendem, de 26

ΕΡ 1 344 533 /PT preferência, polipéptidos que partilham, pelo menos, alguma homologia com os polipéptidos identificados por SEQ ID NO: 3. Os homólogos funcionais de MASP-3 humana compreendem, de preferência, polipéptidos que partilham, pelo menos, alguma homologia com os polipéptidos identificados por SEQ ID NO: 4 . Por exemplo, tais polipéptidos são, pelo menos , cerca de 40 por cento, tal como, pelo menos, cerca de 50 por cento homólogos, por exemplo, pelo menos, cerca de 60 por cento homólogos, tal como, pelo menos, cerca de 70 por cento homólogos, por exemplo, pelo menos, cerca de 75 por cento homólogos, tal como, pelo menos, cerca de 80 por cento homólogos, por exemplo, pelo menos, cerca de 85 por cento homólogos, tal como, pelo menos, cerca de 90 por cento homólogos, por exemplo, pelo menos, 92 por cento homólogos, tal como, pelo menos, 94 por cento homólogos, por exemplo, pelo menos, 95 por cento homólogos, tal como, pelo menos, 96 por cento homólogos, por exemplo, pelo menos, 97 por cento homólogos, tal como, pelo menos, 98 por cento homólogos, por exemplo, pelo menos, 99 por cento homólogos às sequências polipeptidicas predeterminadas aqui realçadas acima. A homologia pode ser calculada, de preferência, por um qualquer algoritmo adequado ou por implementações computorizadas de tais algoritmos, por exemplo, CLUSTAL no programa PC/Gene de Intelligenetics ou GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG). A homologia entre as sequências de aminoácidos pode ser adicionalmente calculada pela ajuda de matrizes bem conhecidas tais como, por exemplo, qualquer um de BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 e BLOSUM 90.

Os homólogos funcionais podem compreender uma sequência de aminoácidos que compreende, pelo menos, uma substituição de um aminoácido por qualquer outro aminoácido. Uma tal substituição pode ser, por exemplo, uma substituição de aminoácidos conservativa ou pode ser uma substituição não conservativa. 27

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Uma substituição de aminoácidos conservativa é uma substituição de um aminoácido num grupo predeterminado de aminoácidos por um outro aminoácido no mesmo grupo, em que os aminoácidos nos grupos predeterminados exibem caracteristicas similares ou substancialmente similares. No significado do termo "substituição de aminoácidos conservativa" como aqui aplicado, um aminoácido pode ser substituído por um outro nos grupos de aminoácidos caracterizados por terem i) cadeias laterais polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr e Cys) ii) cadeias laterais não polares (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro e Met) iii) cadeias laterais alifáticas (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile) iv) cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro) v) cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp) vi) cadeias laterais ácidas (Asp, Glu) vii) cadeias laterais básicas (Lys, Arg, His) viii) cadeias laterais amida (Asn, Gin) ix) cadeias laterais hidroxi (Ser, Thr) x) cadeias laterais contendo enxofre (Cys, Met) e xi) aminoácidos que são ácidos monoamino-dicarboxílicos ou ácidos monoamino-monocarboxílico-monoamidocarboxílicos (Asp, Glu, Asn, Gin).

Os homólogos funcionais de acordo com o presente invento podem compreender mais do que uma de tais substituições, tal como, por exemplo, duas substituições de aminoácidos, por exemplo, três ou quatro substituições de aminoácidos, tal como cinco ou seis substituições de aminoácidos, por exemplo, sete ou oito substituições de aminoácidos, tal como de 10 a 15 substituições de aminoácidos, por exemplo, de 15 a 28

ΕΡ 1 344 533 /PT 25 substituições de aminoácidos, tal como de 25 a 30 substituições de aminoácidos, por exemplo , de 30 a 40 substituições de aminoácidos, tal como de 40 a 50 substituições de aminoácidos, por exemplo , de 50 a 75 substituições de aminoácidos, tal como de 75 a 100 substituições de aminoácidos, por exemplo, mais do que 100 substituições de aminoácidos. A adição ou deleção de um aminoácido pode ser uma adição ou deleção de 2 a 5 aminoácidos, tal como de 5 a 10 aminoácidos, por exemplo, de 10 a 20 aminoácidos, tal como de 20 a 50 aminoácidos. No entanto, as adições ou deleções de mais de 50 aminoácidos, tal como as adições de 50 a 200 aminoácidos, estão também compreendidas no presente invento.

Os polipéptidos de acordo com o presente invento, incluindo quaisquer variantes e seus homólogos funcionais, podem, numa concretização, compreender mais de 5 resíduos de aminoácidos, tal como mais de 10 resíduos de aminoácidos, por exemplo, mais de 20 resíduos de aminoácidos, tal como mais de 25 resíduos de aminoácidos, por exemplo, mais de 50 resíduos de aminoácidos, tal como mais de 75 resíduos de aminoácidos, por exemplo, mais de 100 resíduos de aminoácidos, tal como mais de 150 resíduos de aminoácidos, por exemplo, mais de 200 resíduos de aminoácidos.

Podem ser tidos em consideração factores adicionais aquando da determinação de homólogos funcionais de acordo com o significado aqui utilizado. Por exemplo, os homólogos funcionais podem ser capazes de associação com anti-soros que são específicos para os polipéptidos de acordo com o presente invento.

Os péptidos com alquilações N-terminais e esterificações C-terminais estão também incluídos no presente invento. Os homólogos funcionais compreendem também polipéptidos pós-traducionalmente modificados, por exemplo, polipéptidos glicosilados. 29

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Aditivos farmaceuticamente aceitáveis

As composições farmacêuticas contendo MBL ou variantes de MBL podem ser preparadas por uma qualquer técnica convencional, por exemplo, como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 1995, editado por E.W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edição, Easton, Pa.

Os aditivos farmaceuticamente aceitáveis podem ser um qualquer aditivo farmaceuticamente aceitável convencionalmente utilizado, que deve ser seleccionado de acordo com a formulação especifica, via de administração pretendida, etc. Por exemplo, os aditivos farmaceuticamente aceitáveis podem ser qualquer um dos aditivos mencionados em Nema et ai., 1997. Além disso, o aditivo farmaceuticamente aceitável pode ser um qualquer aditivo aceite da "lista de ingredientes inactivos" da FDA, que está disponível, por exemplo, no endereço da Internet http://www.fda.gov/cder/drug/iig/default.htm.

Nalgumas concretizações do presente invento, é desejável que a composição farmacêutica compreenda um agente isotónico. Em particular, quando a composição farmacêutica é preparada para administração por injecção ou perfusão é, frequentemente desejável que seja adicionado um agente isotónico.

Por conseguinte, a composição pode compreender, pelo menos, um aditivo farmaceuticamente aceitável que é um agente isotónico. A composição farmacêutica pode ser isotónica, hipotónica ou hipertónica. No entanto, prefere-se frequentemente que uma composição farmacêutica para perfusão ou injecção seja essencialmente isotónica, quando é administrada. Por conseguinte, para armazenamento, a composição farmacêutica pode ser, de preferência, isotónica ou hipertónica. Se a composição farmacêutica for hipertónica para armazenamento, ela pode ser diluída para se tornar uma solução isotónica antes da administração. 0 agente isotónico pode ser um agente isotónico iónico tal como um sal ou um agente isotónico não iónico tal como um 30 ΕΡ 1 344 533 /PT hidrato de carbono.

Exemplos de agentes isotónicos iónicos incluem, mas não estão limitados a, NaCl, CaCl2, KC1 e MgCl2. Exemplos de agentes isotónicos não iónicos incluem, mas não estão limitados a, manitol e glicerol.

Está também contido no presente invento que, pelo menos, um aditivo farmaceuticamente aceitável seja um tampão. Para algumas finalidades, por exemplo, quando a composição farmacêutica se destina a perfusão ou injecção, é frequentemente desejável que a composição compreenda um tampão, que é capaz de tamponar uma solução a um pH no intervalo de 4 a 10, tal como 5 a 9, por exemplo, 6 a 8.

No entanto, noutras concretizações do invento, a composição farmacêutica pode não compreender qualquer tampão ou apenas quantidades micromolares de tampão. 0 tampão pode ser seleccionado, por exemplo, a partir do grupo constituído por tampão TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato e trietanolamina. Assim, o tampão pode ser K2HPO4, Na2HPC>4 ou citrato de sódio. O tampão TRIS é conhecido sob vários nomes diferentes, por exemplo, trometamina, incluindo trometamina USP, THAM, Trizma, Trisamina, Tris amino e trometamol. A designação TRIS abrange todas as designações anteriormente mencionadas. O tampão pode ser adicionalmente seleccionado, por exemplo, a partir de tampões USP compatíveis para utilização parentérica, em particular, quando a formulação farmacêutica é para utilização parentérica. Por exemplo, o tampão pode ser seleccionado a partir do grupo constituído por ácidos monobásicos tais como acético, benzóico, glucónico, glicérico e láctico, ácidos dibásicos tais como aconítico, adípico, ascórbico, carbónico, glutâmico, málico, succínico e tartárico, ácidos polibásicos tais como cítrico e fosfórico e bases tais como amónia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e TRIS. 31

ΕΡ 1 344 533 /PT

Em concretizações preferidas do presente invento, as composições farmacêuticas de acordo com o presente invento não contêm estabilizantes, em particular, prefere-se que as composições farmacêuticas não contenham proteína contendo estabilizantes, ainda mais preferivelmente, que as composições farmacêuticas não contenham proteína contendo estabilizantes e deterqentes. As formulações farmacêuticas nas quais o inqrediente activo é uma proteína ou um péptido compreendem, em geral, um ou mais estabilizantes. Os referidos estabilizantes são frequentemente uma ou mais proteína(s) ou um ou mais detergente(s). É frequentemente desejável reduzir a quantidade de aditivos numa composição farmacêutica. Assim, as composições farmacêuticas preferidas de acordo com o presente invento não contêm qualquer proteína e/ou detergente.

No entanto, noutras concretizações do invento, as composições farmacêuticas podem compreender, pelo menos, um aditivo farmaceuticamente aceitável que é um estabilizante. 0 estabilizante pode ser, por exemplo, um detergente, um aminoácido, um ácido gordo, um polímero, um álcool poli-hídrico, um ião metálico, um agente de redução, um agente quelante ou um antioxidante, no entanto, pode também ser utilizado no presente invento um qualquer outro estabilizante adequado. 0 estabilizante pode ser seleccionado, por exemplo, a partir do grupo constituído por poloxâmeros, Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80, Brij, iões metálicos, aminoácidos, polietilenoglicol, Triton, EDTA e ácido ascórbico.

Adicionalmente, o estabilizante pode ser seleccionado a partir do grupo constituído por aminoácidos tais como glicina, alanina, arginina, leucina, ácido glutâmico e ácido aspártico, tensioactivos tais como polisorbato 20, polisorbato 80 e poloxâmero 407, ácidos gordos tais como fosfatidilcolinametanolamina e acetiltriptofanato, polímeros tais como polietilenoglicol e polivinilpirrolidona, álcool poli-hídrico tal como sorbitol, manitol, glicerina, sacarose, glucose, propilenoglicol, etilenoglicol, lactose e trealose, antioxidantes tais como ácido ascórbico, cisteína HC1, 32

ΕΡ 1 344 533 /PT tioglicerol, ácido tioglicólico, tiossorbitol e glutationa, agentes de redução tais como vários tióis, agentes quelantes tais como sais de EDTA, ácido glutâmico e ácido aspártico e iões metálicos tais como Ca++, Ni++, Mg++ e Mn++.

Outros exemplos de antioxidantes e agentes de redução úteis no presente invento incluem acetona-bissulfito de sódio, ascorbato, bissulfito de sódio, hidroxi-anisol butilado, hidroxitolueno butilado, cisteína/cisteinato HC1, ditionito de sódio, ácido gentisico, ácido gentísico-etanolamina, glutamato monossódico, formaldeído-sulfoxilato de sódio, metabissulfito de potássio, metabissulfito de sódio, monotioglicerol, gaiato de propilo, sulfito de sódio e tioglicolato de sódio. A composição farmacêutica de acordo com o invento pode compreender também um ou mais agente(s) crioprotector(es). Em particular, quando a composição compreende proteína seca por congelação ou a composição deva ser armazenada congelada, pode ser desejável adicionar um agente crioprotector à composição farmacêutica. 0 agente crioprotector pode ser um qualquer agente crioprotector útil, por exemplo, o agente crioprotector pode ser seleccionado a partir do grupo que consiste em dextrano, glicerina, polietilenoglicol, sacarose, trealose e manitol.

Por conseguinte, os aditivos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender um ou mais seleccionado(s) a partir do grupo constituído por sal isotónico, sal hipertónico, tampão e estabilizantes. Adicionalmente, os aditivos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender um ou mais seleccionado(s) a partir do grupo constituído por agentes isotónicos, tampão, estabilizantes e agentes crioprotectores. Por exemplo, os aditivos farmaceuticamente aceitáveis compreendem glucose-mono-hidrato, glicina, NaCl e polietilenoglicol 3350.

Num outro aspecto, o invento refere-se a uma composição de MBL compreendendo um ou mais catiões. 33

ΕΡ 1 344 533 /PT A adição de catiões a uma solução de MBL pode resultar, surpreendentemente, numa estabilidade aumentada de MBL e/ou variantes de MBL. As composições compreendem catião bivalente, de preferência, no intervalo de 0,01mM a lOOOmM, mais preferivelmente no intervalo de 0,05mM a 500mM, ainda mais preferivelmente no intervalo de 0,lmM a lOOmM, ainda mais preferivelmente no intervalo de 0,2mM a 50mM, ainda mais preferivelmente no intervalo de 0,3mM a 25mM, ainda mais preferivelmente no intervalo de 0,5mM a lOmM, tal como no intervalo de 0,5mM a 5mM, por exemplo, no intervalo de 0,5mM a 2mM, tal como próximo de lmM. 0 catião é, de preferência, um catião bivalente e, por conseguinte, o invento refere-se a uma composição de MBL compreendendo um ou mais catião(ões) bivalente(s). 0 catião bivalente é, de preferência, um catião bivalente metálico. Por exemplo, o catião bivalente pode ser seleccionado a partir do grupo constituído por Ca++, Ni++, Mg++ e Mn++. No entanto, o catião bivalente é, de preferência, Ca++. 0 Ca++ pode ser adicionado à solução como um qualquer sal adequado, por exemplo, como CaCl2.

Numa concretização preferida, a composição de MBL é como acima descrita relativamente ao conteúdo de MBL.

Condição clínica

Um certo número de condições clínicas pode ser tratado utilizando as composições farmacêuticas de acordo com o presente invento. No entanto, podem ser tratadas, em particular, as condições seguintes: 1. Infecções

2. Deficiência em MBL 3. Condições de imunocompromisso

As infecções podem ser, por exemplo, uma infecção por bactérias, fungos, vírus, parasitas. Por exemplo, infecção por uma ou mais bactéria(s) seleccionada(s) a partir do grupo constituído por Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter calcoaceticus, de preferência, A. anitratus, A. haemolyticus, A. alcaligenes e A. lwoffii, Actinomyces israelii, Aeromonas 34 ΕΡ 1 344 533 /PT hydrophilia, espécie Alcaligenes, de preferência, A. faecalis, A. odorans e A. denitrificans, Arizona hinshawii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacteroides fragilis, Bacteroides melaninogenicus, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, espécie Brucella, de preferência, B. abortus, B. suis, B. melitensis e B. canis, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter fetus ssp. intestinalis, Campylobacter fetus ssp. jejuni, espécie Chlamydia, de preferência, C. psittaci e C. trachomatis, Chromobacterium violaceum, espécie Citrobacter, de preferência, C. freundii e C. diversus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium, de preferência, C. ulcerans, C. haemolyticum e C. pseudotuberculosis, Coxiella burnetii, Edwardsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter, de preferência, E. cloacae, E. aerogenes, E. hafniae (também denominada Hafnia alvei) e E. agglomerans, Erysipelothrix rhusiopathiae, Escherichia coli, Flavobacterium meningosepticum, Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardenerella vaginalis, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, espécie Helicobacter, espécie Klebsiella, de preferência, JC. pneumoniae, K. ozaenae ou if. rhinoscleromatis, espécie Legionella, Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, espécie Moraxella, de preferência, M. lacunata e M. osloensis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, espécie Mycoplasma, de preferência, M. pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, espécie Nocardia, de preferência, IV. asteroides e IV. brasiliensis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Peptococcus magnus, Plesiomonas shigelloides, Pneumococos, espécies Proteus, de preferência, P. mirabilis, P. vulgaris, P. rettgeri e P. morganii (também denominadas Providencia rettgeri e Morganella morganii, respectivamente), espécie Providencia, de preferência, P. alcalifaciens, P. stuartii e P. rettgeri (também denominada Proteus rettgeri), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mallei, Pseudomonas pseudomallei, Rickettsia, Rochalimaia henselae, espécie Salmonella, de preferência, S. enteridis, S. typhi e S. derby, e mais preferivelmente, espécie Salmonella do tipo Salmonella DT104, espécie Serratia, de preferência, S. marcescens, Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. boydii e S. 35

ΕΡ 1 344 533 /PT sonnei, Spirillum minor, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptobacillus moniliformis, Estreptococos, de preferência, S. faecalis, S. faecium e S. durans, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema carateum, Treponema pallidum, Treponema pertenue, de preferência, T. pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica e Yersinia pestis.

As condições de imunocompromisso incluem uma qualquer deficiência funcional de um ou mais componente(s) do sistema imune, por exemplo, um ou mais componente(s) do sistema imune celular, tal como, por exemplo, células imunes ou um ou mais componente(s) do sistema imune humoral. A deficiência pode ser causada por falta do componente ou pela presença de quantidades reduzidas do componente ou pode ser devida a alterações funcionais do componente ou partes do componente.

Num exemplo, a condição de imunocompromisso pode ser deficiência em MASP.

Indivíduo em necessidade de tratamento com MBL 0 indivíduo em necessidade de tratamento com MBL ou de um medicamento compreendendo MBL de acordo com o invento pode ser um qualquer indivíduo, por exemplo, pode ser um indivíduo que sofra de uma condição clínica ou um indivíduo em risco de adquirir uma condição clínica. 0 indivíduo é, de preferência, um ser humano.

Numa concretização preferida do presente invento, o indivíduo sofre de uma das condições clínicas aqui descritas acima. Numa outra concretização preferida, o indivíduo está em risco aumentado de adquirir uma condição clínica como aqui descrito acima.

Por exemplo, o indivíduo pode ter risco aumentado de adquirir uma infecção. 0 risco aumentado pode ter várias razões diferentes, no entanto, o risco aumentado está frequentemente associado a deficiência funcional num ou mais componente(s) do sistema imune. A deficiência funcional do 36

ΕΡ 1 344 533 /PT sistema imune pode ser uma deficiência no sistema imune celular e/ou no sistema imune humoral.

Os componentes do sistema imune celular envolvem, por exemplo, neutrófilos, células T, células B, basófilos e fagócitos. A deficiência funcional pode ser cursada por um número reduzido de uma ou mais das referidas células ou por mau funcionamento de uma ou mais das referidas células.

Os componentes do sistema imune humoral incluem, por exemplo, a via do complemento e a via do complemento de lectina. Por conseguinte, numa concretização do invento, o indivíduo é um indivíduo com uma deficiência funcional em MBL. Por exemplo, o indivíduo pode ter um nível sérico subnormal de MBL.

Um nível sérico subnormal de MBL refere-se a uma concentração de MBL no soro, que é inferior à concentração sérica normal de MBL. Por exemplo, o nível sérico de MBL pode ser <2000 ng/ml, tal como <1500 ng/ml, por exemplo <1000 ng/ml, tal como <900 ng/ml, por exemplo <800 ng/ml, tal como <700 ng/ml, por exemplo <600 ng/ml, tal como <500 ng/ml, por exemplo <400 ng/ml, tal como <300 ng/ml, por exemplo <200 ng/ml tal como <100 ng/ml.

Exemplos

Os exemplos seguintes ilustram concretizações seleccionadas do presente invento e não devem ser vistos como limitantes do invento.

Exemplo 1

Formulação de MBL

Conteúdo

MBL

Tampão Tris NaCl

Concentração

1 mg/ml lOmM, pH 7,4 140mM

purificada o gene MBL A MBL é MBL humana recombinante preparada e como descrito no pedido PCT WO00/70043. Em resumo, 37 ΕΡ 1 344 533 /PT humano genómico foi amplificado por PCR e inserido num vector pREP9 (cat.no. V009-50, Invitrogen). As células HEK 293EBNA foram transfectadas com a construção e o meio de cultura das células transfectadas com MBL/pREP9 foi passado sobre uma coluna de pérolas Fractogel TSK HW-75 (cat.no. 14985, Merck KgaA, Darmstadt, Alemanha) , que tinha sido acoplada a manose e tinha sido pré-lavada em 15 ml de glicina 0,1M (pH 3,0) e equilibrada em TBS/Tween-20 a 0,05% (v/v), CaCl2 2mM. A coluna foi lavada em 75 ml de TBS, CaCl2 2mM. A MBL recombinante é eluida num tampão contendo tampão Tris lOmM e NaCl 140mM no último passo de purificação. Subsequentemente, a formulação é filtrada de vírus sobre um filtro Planova que consiste em 150 camadas e que conduz a elevada retenção de vírus (7 logs).

Existem vários filtros Planova sendo seleccionados os filtros de tamanho 75N e 35N para filtraçao de vírus da solução de MBL. 0 75N e 35N foram seleccionados após um estudo da recuperação de MBL utilizando filtros Planova com diferente tamanho de poro. Os filtros de 15N e 20N estão comercialmente disponíveis, no entanto, o tamanho do poro é demasiadamente pequeno para filtração de MBL. O filtro de 75N vai apenas filtrar vírus maiores tal como o HIV e opera mais como um pré-filtro do que um filtro de remoção de vírus. 0 Planova 35N vai remover vírus de tamanho maior do que 35 nm, o que inclui reovírus mas não vírus mais pequenos como polio-e parvovírus. Para vírus mais pequenos, assume-se que seja eficaz para inactivação do vírus, um passo de tratamento acídico durante a purificação de MBL.

Em primeiro lugar, a solução de MBL é passada através do filtro de 75N e em segundo lugar o filtrado é, em seguida, passado através do filtro de 35N. As duas filtrações são realizadas como filtrações finais. Para a escala em laboratório, utiliza-se um filtro de 0,01 m2. Na escala de produção piloto, utiliza-se um filtro de 0,3 m .

Finalmente, a solução de MBL é diluída em tampão Tris lOmM e NaCl 140mM até uma concentração final de 1 mg/ml, filtrada por esterilização sobre um filtro de 0,22 μιη e transformada em alíquotas de 2,2 ml. 38

ΕΡ 1 344 533 /PT

Esta formulação é adequada para administração parentérica. Em particular, pode-se administrar 1 aliquota a uma criança (dependendo da idade), podendo-se administrar 3 aliquotas a um adulto.

Exemplo 2

Formulação de MBL

Conteúdo MBL Tampão Tris NaCl Manitol

Em 1 ml da formulação: 1 mg 1.2 mg 5, 8 mg 7.3 mg A MBL é MBL humana recombinante preparada e purificada como descrito no pedido PCT WO00/70043. A MBL recombinante é eluida num tampão contendo 1,2 mg/ml de tampão Tris e 5,8 mg/ml de NaCl no último passo de purificação. Subsequentemente, adicionam-se à solução de MBL 7,3 mg/ml de manitol. A formulação é filtrada por esterilização antes da utilização.

Esta formulação é adequada para administraçao parentérica.

Exemplo 3

Formulação de MBL

Conteúdo MBL Tampão Tris NaCl Manitol Tween-80

Em 1 ml da formulação: 1 mg 1.2 mg 5,8 mg 7.3 mg 0,1 mg A MBL é MBL humana recombinante preparada e purificada como descrito no pedido PCT WO00/70043. A MBL recombinante é eluida num tampão contendo 1,2 mg/ml de tampão Tris e 5,8 mg/ml de NaCl no último passo de purificação. Subsequentemente, adicionam-se à solução de MBL 7,3 mg/ml de manitol e 0,1 mg de Tween-80. A formulação é filtrada por 39

ΕΡ 1 344 533 /PT esterilização e o virus filtrado (ver exemplo 1) antes da utilização.

Esta formulação é adequada para administração parentérica.

Exemplo 4

Formulação de MBL

10 mg/ml de MBL Tris lOmM, pH =7,4 NaCl 140mM A MBL recombinante é preparada como descrito no exemplo 1. A MBL é depois concentrada utilizando um dispositivo de filtração que expõe a proteína a 3500xG. A formulação é filtrada por esterilização e o vírus filtrado (ver exemplo 1) antes da utilização. A formulação é adequada para administração parentérica. Exemplo 5

MBL: 1 mg/ml Tampão Tris: lOmM NaCl: 140mM CaCl2: 0,lmM A MBL recombinante é preparada como descrito no exemplo 1. O CaCl2 é adicionado numa concentração final de lmM. A formulação é filtrada por esterilização e o vírus filtrado (ver exemplo 1) antes da utilização. A formulação é adequada para administração parentérica. Exemplo 6

MBL: 5 mg/ml Tampão Tris: lOmM NaCl: 140mM CaCl2: lmM 40

ΕΡ 1 344 533 /PT A MBL recombinante é preparada como descrito no exemplo 1. A MBL é depois concentrada utilizando um dispositivo de filtração que expõe a proteína a 3500xG. O CaCl2 é adicionado numa concentração final de lmM. A formulação é filtrada por esterilização e o vírus filtrado (ver exemplo 1) antes da utilização. A formulação é adequada para administração parentérica. Exemplo 7

MBL: 10 mg/ml Tampão Tris: lOmM NaCl: 14 OmM CaCl2: lmM A MBL recombinante é preparada como descrito no exemplo 1. A MBL é depois concentrada utilizando um dispositivo de filtração que expõe a proteína a 3500xG. O CaCl2 é adicionado numa concentração final de lmM. A formulação é filtrada por esterilização e o vírus filtrado (ver exemplo 1) antes da utilização. A formulação é adequada para administração parentérica. Exemplo 8

Estabilidade de formulações farmacêuticas compreendendo MBL A MBL recombinante foi formulada como uma solução líquida e testada quanto à estabilidade em material de armazenamento aceitável para armazenamento de proteína líquida. Testaram-se três formulações diferentes com concentrações diferentes de MBL e testou-se uma formulação quanto ao efeito estabilizante de iões cálcio.

Uma formulação a 1 mg/ml sem qualquer excipiente estabilizante de proteína mostrou estabilidade surpreendentemente elevada quando armazenada no congelador (-20°C) e a frio ( + 4°C) durante 12 meses. Não foi medida qualquer diminuição de actividade nem alterações na cadeia polipeptídica quando investigada por espectrometria de massa. 41

ΕΡ 1 344 533 /PT Não foram observadas alterações no conteúdo em proteína por análise de aminoácidos ou cromatografia de permuta aniónica. Não foram observados produtos de degradação por coloração de Coomassie em MBL reduzida ou por manchas Western de MBL não reduzida.

Observou-se, por cromatografia de exclusão de tamanhos, um pequeno pico de frente, que foi provavelmente causado por MBL agregada, correspondente a apenas aproximadamente 1% do conteúdo total de MBL. Os resultados obtidos para uma formulação de MBL superior (10 mg/ml e 5 mg/ml) indicam a possibilidade de formação de agregado causada pelo passo de concentração stressante mais do que pelo armazenamento. A adição de iões cálcio mostrou um efeito dramaticamente estabilizante sem quaisquer alterações na actividade após 2 meses de armazenamento a +37°C.

INTRODUÇÃO

Foram desenvolvidas três formulações farmacêuticas compreendendo lectina de ligação a manose recombinante (rMBL) e introduzidas em material de armazenamento aceitável para utilização farmacêutica. O enchimento foi realizado assepticamente utilizando apenas frascos estéreis, tampas de borracha e realizado numa câmara de ar laminar. O tipo de formulação, material de armazenamento e processo de enchimento tornaram, por conseguinte, a preparação altamente representativa de um produto de fármaco MBL para utilização clínica. Estas formulações foram testadas quanto à estabilidade por armazenamento a diferentes temperaturas e tempos de incubação. O equipamento de armazenamento foi monitorizado a todas as temperaturas.

Foram estudadas as formulações de MBL seguintes: - PE0238: MBL a 1 mg/ml em Tris lOmM, NaCl 140mM e pH = 7,4. - PE0305: MBL a 10 mg/ml em Tris lOmM, NaCl 140mM e pH = 7,4. - PE0407: MBL a 5 mg/ml em Tris lOmM, NaCl 140mM, CaCl2 lmM e pH = 7,4.

Todas as referências utilizadas nestes estudos foram mantidas a -80°C e aceites como estáveis quando utilizadas. 42

ΕΡ 1 344 533 /PT

MÉTODOS

Teste de activação de C4 0 teste de activação de C4 foi realizado como descrito no exemplo 9 aqui abaixo. 0 teste de activação de C4 mede a capacidade da MBL para se ligar a MASP (proteases associadas a proteína de ligação a manose) e após ligação a um alvo de hidrato de carbono, activa as MASP. 0 complexo MBL/MASP cliva subsequentemente C4 e inicia a via da lectina de activação do complemento. A activação de C4 é, por conseguinte, uma medição da potência biológica de MBL.

Este teste é o principal teste indicador de estabilidade para MBL.

Cromatografia de Exclusão de Tamanhos (SEC) A SEC é uma análise cromatográfica realizada numa coluna Superose 6 (Amersham Biosciences) como descrito no exemplo 10 aqui abaixo; a MBL e outros componentes são separados por volume molecular, o qual para proteínas globulares é proporcional à massa molecular. A análise por SEC é utilizada para verificação da estrutura de massa elevada de MBL. Enquanto que os oligómeros de massa elevada eluem cedo num cromatograma, os não oligómeros eluem tarde no cromatograma. Além disso, podem ser detectados agregados maiores do que a MBL oligomérica, se presentes na amostra. Finalmente, a análise pode também ser utilizada para quantificar o conteúdo de MBL.

Espectrometria de Massa (MALDI-MS)

Inicialmente, a amostra é reduzida e purificada de acordo com um procedimento genérico para remover componentes de não proteína e limitar o sinal de fundo. A MALDI-MS é realizada para verificar o perfil de massa da cadeia polipeptídica de MBL e para identificar potenciais produtos de degradação da cadeia polipeptídica. 43

ΕΡ 1 344 533 /PT

RESULTADOS

Teste de activação de C4 PE0238: 0 teste de activação de C4 indica actividade idêntica para a formulação a 1 mg/ml, quando armazenada durante 12 meses a -20 e +4 graus C, relativamente à referência. Os resultados são apresentados na figura 1 como uma curva de seis pontos com valores de CE50 de 105% para o armazenamento a +4 graus e 104% para o armazenamento a -20 graus, quando comparado com a referência de 100%. PE0305: A actividade inicial medida é de 94% relativamente à referência padrão para a formulação a 10 mg/ml. Após 2½ meses a actividade diminui para aproximadamente 80% para as amostras congeladas e arrefecidas e para 36% para a amostra a 37°C. Após 5 meses a actividade é ainda próxima de 80% para as amostras congeladas e arrefecidas, sendo medida uma quebra para 14,3% para a amostra a +37°C. Os resultados são obtidos pelas curvas de estabilidade da activação de C4 e indicados como valores de CE50 na tabela 1. Apenas as alterações superiores a -15% são consideradas significativas.

Tipo de -20aC +42C +37aC armazenamento T = 0 meses 94% (N=l) Igual a -20°C Igual a -20°C T = 2½ meses 81% (N=l) 78% (N=l) 36% (N=l) T = 5 meses 81,7% ± 4,7 80,3% ± 7,6 14,3% ± 1,5 (N=3) (N=3) (N=3)

Tabela 1. Activação de C4 em amostras de estabilidade. A análise a T=0 é um único cálculo. A actividade é calculada em % de CE50 relativamente a um padrão de MBL. As medições em triplicado são ilustradas com variações padrão. PE0407: A formulação a 5 mg/ml foi testada quanto à actividade e, surpreendentemente, observou-se apenas uma diminuição muito pequena de actividade para a amostra armazenada a +37 graus e quando comparada à amostra congelada não se observaram quaisquer alterações. As actividades 44

ΕΡ 1 344 533 /PT medidas sao de 91% para a amostra congelada, 92 para a amostra arrefecida e 94 para a amostra a +37 graus C. Incubou- -se a +37°C, um controlo sem cálcio que mediu 19% de actividade. Os resultados são obtidos pelas curvas de activaçao de C4 e indicados na tabela 2 como valores de CE50.

Tipo de armazenamento —20fiC 0 01 + +37SC Controlo a 37SC T = 2 meses 91% 92% 94% 19%

Tabela 2. Dados de activação de C4 em amostras de estabilidade a 5 mg/ml comparados ao N105-11A de referência, CE5 0 = 10 0 %.

Dados de SEC PE0238: A formulação a 1 mg/ml foi analisada para detecção de alteraçõs na massa molecular. A referência elui a 20,4 minutos como um único pico. Para o armazenamento a frio, um pequeno pico de frente elui a 15 minutos, pico de frente correspondente a aproximadamente 1% do conteúdo total de MBL. Para o armazenamento por congelação, o pico é idêntico à referência padrão sem detecção de pico de frente. A figura 2 ilustra os cromatogramas SEC do padrão de referência no topo seguido pela amostra de estabilidade a 1 mg/ml mantida a +4 graus e a -20 graus. Detecta-se um pequeno pico de frente na amostra mantida fria correspondente a 1% do conteúdo total de MBL. PE0305: Os dados de SEC da formulação a 10 mg/ml indicam a produção de um pico de frente. A quantidade de MBL no pico de frente é calculada por comparação com o conteúdo total de MBL e ilustrada na tabela 3 como pico de frente em % de MBL total.

De acordo com a tabela 3, são detectados picos de frente em todas as amostras correspondentes a 3 até 5% de MBL total para o armazenamento a temperaturas de congelação e frio. A +37 graus, observa-se 40% após 2½ meses estando presente 56% no pico de frente após 5 meses de armazenamento. 45

ΕΡ 1 344 533 /PT

Tipo de -20aC +4 2C +37aC armazenamento T = 2½ meses 3,5% ± 1,6 5,3% ± 0,1 39,5% ±3,0 (N=2) (N=2) (N=2) T = 5 meses 4,1% ± 1,6 3,4% ± 2,1 56,5% ± 16,1 (N=2) (N=2) (N=2)

Tabela 3. A quantidade de MBL presente no pico de frente em % de MBL total. Todas as medições são em duplicado. PE0407: Os picos de frente são observados na formulação a 5 mg/ml com quantidades entre 1 e 3%. Um controlo sem cálcio e incubado a +3 7 graus era o conteúdo de MBL no pico de frente medido a 62%.

Tipo de armazenamento -20aC +4aC +37aC Controlo a 37aC T = 2 meses 2% (N=l) 1% (N=l) 3% (N=l) 62% (N=l)

Tabela 4. A quantidade de MBL presente no pico de frente em % de MBL total. Todas as medições são medições únicas.

Dados de EM PE0238: As análises de espectrometria de massa em MBL reduzida indicam uma cadeia polipeptidica de MBL intacta durante os 12 meses de armazenamento a -20 e +4 graus, não se observando alterações após 6 meses de armazenamento a +37 graus. Os espectrogramas de EM são ilustrados na figura 3. A MBL não aparece como um único pico devido aos perfis diferentes de hidroxilação e glicosilação, resultando normalmente num total de sete picos com o pico principal próximo de 25450 Da. Os dados não indicam desglicosilação ou alterações polipeptídicas com o tempo de armazenamento. A figura 3 apresenta picos similares para a referência e as amostras de 12 meses não indicam alterações na cadeia polipeptidica de MBL durante o armazenamento. 46

ΕΡ 1 344 533 /PT

DISCUSSÃO A formulação a 1 mg/ml é estável durante 12 meses sob condições de armazenamento por congelação sem quaisquer alterações na activação de C4, sem detecção de agregados e sem alterações na cadeia polipeptidica. Entre as outras análises realizadas estão AIEC para o conteúdo, manchas Western não reduzidas para distribuição de tamanhos, coloração de Coomassie para detecção de produtos de degradação e análise de aminoácidos para verificar o conteúdo. Nenhuma destas análises indica qualquer alteração após 12 meses de armazenamento a temperaturas de congelação e frio. Aproximadamente 99% da MBL total elui similarmente à MBL de referência após 12 meses de armazenamento à temperatura de frio.

Para a formulação a 10 mg/ml detecta-se uma diminuição na activação de C4 para todas as amostras analisadas de aproximadamente 80% após 2½ e 5 meses de armazenamento à temperatura de congelação e frio, o que indica que a MBL, uma vez concentrada a 10 mg/ml, é estável. O valor de activação de C4 medido ao tempo zero é de 94%. As análises de SEC indicam uma quantidade de agregado próxima de 4% após 2½ e 5 meses de armazenamento à temperatura de congelação e frio. A quantidade de agregado é constante com a temperatura e tempo de armazenamento o que indica que o agregado pode estar presente desde o inicio do estudo nas formulações concentradas sendo causado pelo passo de concentração mais do que pelo armazenamento. Qualquer formulação superior a 1 mg/ml foi preparada por concentração utilizando um dispositivo de filtração que expõe a proteína a 3500xG. Um passo de processo extremamente stressante para qualquer proteína e um tratamento geralmente conhecido por causar agregação de proteínas. A formulação a 5 mg/ml tem resultados de activação de C4 entre 91 e 94% quando comparada à referência para o armazenamento por congelação, a frio e até a +3 7 graus. Uma formulação de controlo sem cálcio colocada a +37 graus mediu 19% de actividade após dois meses de armazenamento. A SEC detecta agregação com quantidades correspondentes a 1 a 3% do conteúdo total de MBL para amostras congeladas e frias e 62% 47 ΕΡ 1 344 533 /PT para o controlo a +37 graus. As amostras nao são analisadas por Maldi-MS.

Os dados dos três estudos de estabilidade indicam todos a MBL como uma proteína excepcionalmente estável no armazenamento por congelação e frio. A conclusão final é a de que foi desenvolvida uma formulação de MBL líquida a 1 mg/ml, altamente estável, para utilização parentérica, sem quaisquer excipientes de estabilização. A adição de cálcio tem um efeito dramaticamente estabilizante na formulação concentrada. Uma formulação a 5 mg/ml armazenada durante dois meses a +37 graus sem qualquer perda de actividade é excepcional para formulações de proteína.

Exemplo 9

Teste de activação de C4

Revestimento de Placas FluoroNunc com Manano

As placas de microtitulação FluoroNunc sao revestidas com 100 μΐ/cavidade de uma solução contendo 10 μρ/πιΐ de Manano (Sigma-Aldrich, pó #M7504) dissolvido em tampão de NaCC>3 50mM, pH 9,6, durante a noite a 20 í 4°C, numa câmara humidificada. As placas são lavadas duas vezes em TBS (Tris (lOmM), NaCl (150mM), pH 7,4) antes do bloqueio das placas durante 1 hora a 20 í 4°C, com 200 μΐ por cavidade de tampão TBS suplementado com 1 mg/ml de HSA (Statens Serum Institute, Copenhaga). Cada cavidade é lavada três vezes com tampão de TBST.

Teste de activação de C4 A MASP é purificada a partir de um indivíduo deficiente em MBL sem anticorpos anti-Manano. O padrão de referência de rMBL é originário de um material de referência de rMBL purificado que foi pré-diluído em tampão LISA (Tris/Base (20mM), NaCl (150mM), CaCl2 (lOmM), HSA a 1 mg/ml, Triton X-100 (0,05%), pH 7,4) até uma concentração final de 100 μρ/ιηΐ e armazenado a -80 graus Celsius. 48

ΕΡ 1 344 533 /PT Ο padrão de rMBL e as amostras de teste são pré-diluídos a 5 μ9/ιη1 em tampão LISA. 0 padrão de rMBL e as amostras pré-diluídos são misturados com MASP num volume a 1:1 e incubados durante 10 min a 37 graus Celsius. O factor do complemento C4 é purificado a partir de sangue recente e armazenado congelado em C4, NaCl 1M, Tris 20mM, β-amino-hexanosiro 50mM, EDTA 5mM, NaN3 a 0,02% p/v, pH 7,4. O C4 é descongelado em gelo e diluído a 1:2000 em tampão BI (Barbital (16mM), NaCl (580mM), CaCl2 (8mM), MgCl2 (4mM), pH 7,4. Cat. No. 210050 Bie Berntsen). O complexo rMBL:MASP pré-diluído e as amostras de teste são diluídos a 1:10 no tampão C4:B1 sendo preparada uma série de diluições de diluições a 2 vezes. A placa revestida com manano é colocada em gelo e as amostras são aplicadas na placa. A reacção é iniciada quando as amostras são transferidas para a incubadora a 37 graus

Celsius. A placa é incubada durante 90 min a 37 graus Celsius numa incubadora controlada e lavada três vezes em tampão TBST/Ca2+ (Tris (lOmM), NaCl (150mM), Tween-20 (0,05% p/v), CaCl2 (lOOmM), pH 7,4) numa máquina de lavar placas. Adicionam-se 100 μΐ por cavidade de anticorpo anti-C4 humano marcado com biotina (anti-C4 humano de cabra, de DAKO) (1 μg/ml) diluído a 1:1000 em tampão TBST/Ca2+ e incuba-se durante 90 min a 25 graus Celsius numa torre de aquecimento. As placas são lavadas três vezes em tampão TBST/Ca2+ numa máquina de lavar placas. Diluem-se 100 μΐ por cavidade de solução de Európio-estreptavidina (Wallac 1244-360) a 1:1000 em tampão de diluição Európio (Tris (lOmM), NaCl (150mM), Tween-20 (0,05%), EDTA (25μΜ)) e incuba-se durante 60 min a 25 graus Celsius numa torre de aquecimento. As placas são lavadas três vezes em tampão TBST/Ca2+ numa máquina de lavar placas. Adicionam-se, por cavidade, 100 μΐ de solução de Intensificação (Wallac 1244-105) e as amostras são agitadas durante 5 min num agitador de placas. As amostras são deixadas repousar durante aproximadamente 5 min e inseridas num Wallac Victor 2d Multicounter 1420. A fluorescência de Eu3+ é medida utilizando o programa Európio padrão. 49

ΕΡ 1 344 533 /PT

Os dados obtidos a partir da leitura do teste devem ser registados como se segue. A concentração de MBL no eixo do x e as contagens de Európio (o cpm) no eixo dos y. A concentração de MBL deve ser representada como o log natural enquanto que o Európio deve ser os dados lineares.

Para a análise de dados e cálculos de CE50 utilizar a equação de coeficiente de Hill e 4 parâmetros. A potência relativa da amostra de rMBL é determinada a partir do padrão de referência de rMBL como se segue:

Potência relativa = (CE50 padrão de referência/CE50 teste)*100 Exemplo 10

Cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC)

Todas as amostras para análise devem estar isentas de precipitados visíveis e devem ser preparadas em frascos de HPLC utilizando tampas com septos. A solução de proteína é aplicada na coluna Superose à temperatura ambiente num tampão à base de Tris (pH = 7,4). A coluna Superose 6 HR10/30 é distribuída pré- acondicionada por Amersham Biosciences. A cromatografia é realizada de acordo com a especificação abaixo: Tipo de Resina Superose 6 Tamanho da Resina Área 0,78 cm2, Altura 30 cm Temperatura 25°C Fluxo de Solvente 38cm/h (0,5ml/min) durante toda a cromatografia Perfil de Isocrático; 40 ml de tampão de eluição por Gradientes corrida, correspondente a um tempo de corrida de 80 min Detecção 280 nm (detecção da proteína) Sensibilidade: Intervalo Auxiliar=2, Intervalo=l, Resposta=4 (importante!) Tempo de corrida 80 min Frequência de Amostragem 5 Hz (cada 0,2 s) 50

ΕΡ 1 344 533 /PT

Solventes

Tampão de Tris (0,1M) eluição NaCl (1,4M) (STOCK) NaN3 pH = (0,01% p/v) 7,4 (20°C)

Tampão de Tris (1OmM) eluição NaCl (140mM) NaN3 (0,01% p/v) pH = 7,4 (20°C) Tampão de HC1 (0,1M) regeneração (Ácido) Tampão de NaOH (0,5M) regeneração (Alcalino) O Tris (24,2 g) , NaCl (163,6 g) e 2,0 ml de azida de sódio (10%), são dissolvidos em H20 (ad 2000 ml). Durante o processo, o pH é ajustado com HC1 5M. Tempo de armazenamento calculado: Longo O tampão de eluição (STOCK) (200 ml) é diluído em água (ad 2000 ml). O pH na solução final deve ser controlado. Tempo de armazenamento calculado: Médio O HC1 (5M, 10 ml) é dissolvido em H20 (ad 500 ml). Tempo de armazenamento calculado: Longo O NaOH (20 g) é dissolvido em H20 (ad 1000 ml). Tempo de armazenamento calculado: Longo

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53 ΕΡ 1 344 533 /PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Natlmmune <120> Composições farmacêuticas compreendendo lectina de ligação a manose <130> P 625 DKO0 <160> 4 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 248

<212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1

Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Vai Ala 15 10 15

Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Vai Thr Cys Glu Asp Ala Gin Lys Thr Cys 20 25 30

Pro Ala Vai Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly 35 40 45

Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gin 50 55 60

Gly Leu Arg Gly Leu Gin Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80

Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gin Lys Gly Asp 85 90 95

Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg 100 105 110

Ile

Lys Ala Leu Gin Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe !15 120 125 54

ΕΡ 1 344 533 /PT

Ser Leu Gly 130 Lys Gin Vai Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu 135 140 Ile Met Thr 145 Phe Glu Lys Vai Lys Ala Leu Cys Vai Lys Phe Gin Ala 150 155 160 Ser Vai Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gin Asn 165 170 175 Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu 180 185 190 Gly Gin Phe 195 Vai Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp 200 205 Asn Glu Gly 210 Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Vai Leu 215 220 Leu Leu Lys 225 Asn Gly Gin Trp Asn Asp Vai Pro Cys Ser Thr Ser His 230 235 240 Leu Ala Vai Cys Glu Phe Pro Ile 245 <210> 2 <211> 699 <212> PRT <213> Homo <400> 2 Sapiens Met Arg Trp 1 Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser Lys 5 10 15 Ala Ser Ala His Thr Vai Glu Leu Asn Asn Met Phe Gly Gin Ile Gin 20 25 30 Ser Pro Gly 35 Tyr Pro Asp Ser Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Vai Thr Trp 40 45 Asn Ile Thr 50 Vai Pro Asp Gly Phe Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met His 55 60

Asn Ile Thr Vai 50 EP 1 344 533 /PT 55

Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu 65 70 Cys Glu Tyr Asp Tyr Vai Lys Vai 75 80 Glu Thr Glu Asp Gin Vai Leu Ala 85 Thr Phe Cys Gly Arg Glu Thr Thr 90 95 Asp Thr Glu Gin Thr Pro Gly Gin 100 Glu Vai Vai Leu Ser Pro Gly Ser 105 110 Phe Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser 115 120 Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg Phe 125 Thr Gly Phe Asp Ala His Tyr Met 130 135 Ala Vai Asp Vai Asp Glu Cys Lys 140 Glu Arg Glu Asp Glu Glu Leu Ser 145 150 Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 155 160 Ile Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys 165 Arg Phe Gly Tyr Ile Leu His Thr 170 175 Asp Asn Arg Thr Cys Arg Vai Glu 180 Cys Ser Asp Asn Leu Phe Thr Gin 185 190 Arg Thr Gly Vai Ile Thr Ser Pro 195 200 Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys 205 Ser Ser Glu Cys Leu Tyr Thr Ile 210 215 Glu Leu Glu Glu Gly Phe Met Vai 220 Asn Leu Gin Phe Glu Asp Ile Phe 225 230 Asp Ile Glu Asp His Pro Glu Vai 235 240 Pro Cys Pro Tyr Asp Tyr Ile Lys 245 Ile Lys Vai Gly Pro Lys Vai Leu 250 255

Gly Pro Phe Cys Gly Glu Lys Ala Pro Glu Pro Ile Ser Thr Gin Ser 260 265 270 His Ser Vai Leu Ile Leu Phe His 275 280 Ser Asp Asn Ser Gly Glu Asn Arg 285

56 ΕΡ 1 344 533 /PT

Gly Trp Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ala Gly 290 295 Asn Glu Cys Pro Glu Leu 300 Gin Pro Pro Vai His Gly Lys Ile Glu Pro 305 310 Ser Gin Ala Lys Tyr Phe 315 320 Phe Lys Asp Gin Vai Leu Vai Ser Cys Asp 325 330 Thr Gly Tyr Lys Vai Leu 335 Lys Asp Asn Vai Glu Met Asp Thr Phe Gin 340 345 Ile Glu Cys Leu Lys Asp 350 Gly Thr Trp Ser Asn Lys Ile Pro Thr Cys 355 360 Lys Ile Vai Asp Cys Arg 365 Ala Pro Gly Glu Leu Glu His Gly Leu Ile 370 375 Thr Phe Ser Thr Arg Asn 380 Asn Leu Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Lys 385 390 Tyr Ser Cys Gin Glu Pro 395 400 Tyr Tyr Lys Met Leu Asn Asn Asn Thr Gly 405 410 Ile Tyr Thr Cys Ser Ala 415 Gin Gly Vai Trp Met Asn Lys Vai Leu Gly 420 425 Arg Ser Leu Pro Thr Cys 430 Leu Pro Vai Cys Gly Leu Pro Lys Phe Ser 435 440 Arg Lys Leu Met Ala Arg 445 Ile Phe Asn Gly Arg Pro Ala Gin Lys Gly 450 455 Thr Thr Pro Trp Ile Ala 460 Met Leu Ser His Leu Asn Gly Gin Pro Phe 465 470 Cys Gly Gly Ser Leu Leu 475 480 Gly Ser Ser Trp Ile Vai Thr Ala Ala His 485 490 Cys Leu His Gin Ser Leu 495 Asp Pro Lys Asp Pro Thr Leu Arg Asp Ser 500 505 Asp Leu Leu Ser Pro Ser 510

Leu Leu Ser Pro Ser 510 57

ΕΡ 1 344 533 /PT

Asp Phe Lys Ile Ile Leu Gly Lys His Trp Arg Leu Arg Ser Asp Glu 515 520 525

Asn Glu Gin His Leu Gly Vai Lys His Thr Thr Leu His Pro Lys Tyr 530 535 540

Asp Pro Asn Thr Phe Glu Asn Asp Vai Ala Leu Vai Glu Leu Leu Glu 545 550 555 560

Ser Pro Vai Leu Asn Ala Phe Vai Met Pro Ile Cys Leu Pro Glu Gly 565 570 575

Pro Gin Gin Glu Gly Ala Met Vai Ile Vai Ser Gly Trp Gly Lys Gin 580 585 590

Phe Leu Gin Arg Phe Pro Glu Thr Leu Met Glu Ile Glu Ile Pro Ile 595 600 605

Vai Asp His Ser Thr Cys Gin Lys Ala Tyr Ala Pro Leu Lys Lys Lys 610 615 620

Vai Thr Arg Asp Met Ile Cys Ala Gly Glu Lys Glu Gly Gly Lys Asp 625 630 635 640

Ala Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Vai Thr Leu Asn Arg Glu 645 650 655

Arg Gly Gin Trp Tyr Leu Vai Gly Thr Vai Ser Trp Gly Asp Asp Cys 660 665 670

Gly Lys Lys Asp Arg Tyr Gly Vai Tyr Ser Tyr Ile His His Asn Lys 675 680 685

Asp Trp Ile Gin Arg Vai Thr Gly Vai Arg Asn 690 695 <210> 3 <211> 686

<212> PRT <213> Homo Sapiens

ΕΡ 1 344 533 /PT 58 <400> 3 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly 1 5 Leu Leu Cys Gly Ser Vai Ala Thr 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu 20 Pro Vai Phe Gly Arg Leu Ala Ser 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala 35 40 Asn Asp Gin Glu Arg Arg Trp Thr 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg 50 55 Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys 65 70 Glu Tyr Asp Phe Vai Lys Leu Ser 75 80 Ser Gly Ala Lys Vai Leu Ala Thr 85 Leu Cys Gly Gin Glu Ser Thr Asp 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp 100 Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp 115 120 Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala 130 135 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gin Vai 140

Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160

Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Vai Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys 180 Ser Gly Gin Vai Phe Thr Gin Arg 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu 195 200 Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 205 EP 1 344 533 /PT 59 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser 210 215 Leu Glu Glu Gly Phe Ser Vai Ile 220 Leu Asp Phe Vai Glu Ser Phe Asp 225 230 Vai Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile 245 Gin Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro 260 His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 265 270 Thr Vai Thr Ile Thr Phe Vai Thr 275 280 Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 285 Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr 290 295 Ala His Ala Cys Pro Tyr Pro Met 300 Ala Pro Pro Asn Gly His Vai Ser 305 310 Pro Vai Gin Ala Lys Tyr Ile Leu 315 320 Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys 325 Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gin 330 335 Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe 340 Thr Ala Vai Cys Gin Lys Asp Gly 345 350 Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala 355 360 Cys Ser Ile Vai Asp Cys Gly Pro 365

Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Vai Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly 370 375 380 Vai Thr Thr Tyr Lys Ala Vai Ile 385 390 Gin Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 395 400 Tyr Thr Met Lys Vai Asn Asp Gly 405 Lys Tyr Vai Cys Glu Ala Asp Gly 410 415

Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Vai Cys Glu Pro 420 425 430 60

ΕΡ 1 344 533 /PT

Vai Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly 435 440 445

Gin Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gin Vai Leu Ile Leu Gly 450 455 460

Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn Trp Vai Leu Thr 465 470 475 480

Ala Ala His Ala Vai Tyr Glu Gin Lys His Asp Ala Ser Ala Leu Asp 485 490 495

Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His Tyr Thr Gin Ala 500 505 510

Trp Ser Glu Ala Vai Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Asp Ala Gly 515 520 525

Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn Lys Vai Vai Ile 530 535 540

Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Glu Ser 545 550 555 560

Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly Trp Gly Leu Thr 565 570 575

Gin Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Vai Asp Ile Pro Ile 580 585 590

Vai Asp His Gin Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Pro Pro Tyr Pro 595 600 605

Arg Gly Ser Vai Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly 610 615 620

Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly 625 630

Asp Ser Gly Gly Ala Leu Vai Phe Leu 635 640

Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Vai Gly Gly Ile Vai Ser Trp Gly 645 650 655 61

ΕΡ 1 344 533 /PT

Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gin Tyr Gly Vai Tyr Thr Lys 66 0 665 670 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 675 680 685 <210> 4 <211> 728 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Met Arg Trp Leu Leu Leu Tyr Tyr Ala Leu Cys Phe Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala His Thr Vai Glu Leu Asn Asn Met Phe Gly Gin Ile 20 25 30 Ser Pro Gly Tyr Pro Asp Ser Tyr Pro Ser Asp Ser Glu Vai Thr 35 40 45 Asn Ile Thr Vai Pro Asp Gly Phe Arg Ile Lys Leu Tyr Phe Met 50 55 60 Phe Asn Leu Glu Ser Ser Tyr Leu Cys Glu Tyr Asp Tyr Vai Lys 65 70 75 Glu Thr Glu Asp Gin Vai Leu Ala Thr Phe Cys Gly Arg Glu Thr 85 90 95 Asp Thr Glu Gin Thr Pro Gly Gin Glu Vai Vai Leu Ser Pro Gly 100 105 110 Phe Met Ser Ile Thr Phe Arg Ser Asp Phe Ser Asn Glu Glu Arg 115 120 125 Thr Gly Phe Asp Ala His Tyr Met Ala Vai Asp Vai Asp Glu Cys 130 135 140 Glu Arg Glu Asp Glu Glu Leu Ser Cys Asp His Tyr Cys His Asn 145 150 155 80 160 EP 1 344 533 /PT 62

Ile Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys 165 Arg Phe Gly Tyr Ile Leu His Thr 170 175 Asp Asn Arg Thr Cys Arg Vai Glu 180 Cys Ser Asp Asn Leu Phe Thr Gin 185 190 Arg Thr Gly Vai Ile Thr Ser Pro 195 200 Asp Phe Pro Asn Pro Tyr Pro Lys 205 Ser Ser Glu Cys Leu Tyr Thr Ile 210 215 Glu Leu Glu Glu Gly Phe Met Vai 220 Asn Leu Gin Phe Glu Asp Ile Phe 225 230 Asp Ile Glu Asp His Pro Glu Vai 235 240 Pro Cys Pro Tyr Asp Tyr Ile Lys 245 Ile Lys Vai Gly Pro Lys Vai Leu 250 255 Gly Pro Phe Cys Gly Glu Lys Ala 260 Pro Glu Pro Ile Ser Thr Gin Ser 265 270 His Ser Vai Leu Ile Leu Phe His 275 280 Ser Asp Asn Ser Gly Glu Asn Arg 285

Gly Trp Arg Leu Ser Tyr Arg Ala Ala Gly Asn Glu Cys Pro Glu Leu 290 295 300 Gin Pro Pro Vai His Gly Lys Ile 305 310 Glu Pro Ser Gin Ala Lys Tyr Phe 315 320 Phe Lys Asp Gin Vai Leu Vai Ser 325 Cys Asp Thr Gly Tyr Lys Vai Leu 330 335 Lys Asp Asn Vai Glu Met Asp Thr 340 Phe Gin Ile Glu Cys Leu Lys Asp 345 350 Gly Thr Trp Ser Asn Lys Ile Pro 355 360 Thr Cys Lys Ile Vai Asp Cys Arg 365

Ala Pro Gly Glu Leu Glu His Gly Leu Ile Thr Phe Ser 370 375 380

Thr Arg Asn EP 1 344 533 /PT 63

Asn Leu Thr Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Lys Tyr Ser Cys Gin Glu Pro 385 390 395 400

Tyr Tyr Lys Met Leu Asn Asn Asn Thr Gly Ile Tyr Thr Cys Ser Ala 405 410 415 Gin Gly Vai Trp Met Asn Lys 420 Vai Leu Gly Arg Ser Leu Pro Thr Cys 425 430 Leu Pro Glu Cys Gly Gin Pro 435 Ser Arg Ser Leu Pro Ser Leu Vai Lys 440 445 Arg Ile Ile Gly Gly Arg Asn 450 455 Ala Glu Pro Gly Leu Phe Pro Trp Gin 460 Ala Leu Ile Vai Vai Glu Asp 465 470 Thr Ser Arg Vai Pro Asn Asp Lys Trp 475 480 Phe Gly Ser Gly Ala Leu Leu 485 Ser Ala Ser Trp Ile Leu Thr Ala Ala 490 495 His Vai Leu Arg Ser Gin Arg 500 Arg Asp Thr Thr Vai Ile Pro Vai Ser 505 510 Lys Glu His Vai Thr Vai Tyr 515 Leu Gly Leu His Asp Vai Arg Asp Lys 520 525 Ser Gly Ala Vai Asn Ser Ser 530 535 Ala Ala Arg Vai Vai Leu His Pro Asp 540 Phe Asn Ile Gin Asn Tyr Asn 545 550 His Asp Ile Ala Leu Vai Gin Leu Gin 555 560 Glu Pro Vai Pro Leu Gly Pro 565 His Vai Met Pro Vai Cys Leu Pro Arg 570 575 Leu Glu Pro Glu Gly Pro Ala 580 Pro His Met Leu Gly Leu Vai Ala Gly 585 590

Trp Gly Ile Ser Asn Pro Asn Vai Thr Vai Asp Glu Ile Ile Ser Ser 595 600 605 64

ΕΡ 1 344 533 /PT

Gly Thr Arg Thr Leu Ser Asp Vai Leu Gin Tyr Vai Lys Leu Pro Vai 610 615 620

Vai Pro His Ala Glu Cys Lys Thr Ser Tyr Glu Ser Arg Ser Gly Asn 625 630 635 640

Tyr Ser Vai Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Tyr Glu Gly Gly 645 650 655

Lys Asp Thr Cys Leu Gly Asp Ser Gly Gly Ala Phe Vai Ile Phe Asp 660 665 670

Asp Leu Ser Gin Arg Trp Vai Vai Gin Gly Leu Vai Ser Trp Gly Gly 675 680 685

Pro Glu Glu Cys Gly Ser Lys Gin Vai Tyr Gly Vai Tyr Thr Lys Vai 690 695 700

Ser Asn Tyr Vai Asp Trp Vai Trp Glu Gin Met Gly Leu Pro Gin Ser 705 710 715 720

Vai Vai Glu Pro Gin Vai Glu Arg 725

Lisboa

Claims

ΕΡ 1 344 533 /PT 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo aditivos farmaceuticamente aceitáveis e a) pelo menos, 300 μρ/ιηΐ de proteína total, em que a lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL constitui, pelo menos, 35% (p/p) da proteína total; e em que não se adiciona à referida composição qualquer proteína contendo estabilizante; ou b) pelo menos, 1000 μρ/ιηΐ de lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL em que as variantes de MBL são polipéptidos, pelo menos, 75% homólogos à SEQ ID NO:l.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição é uma solução de proteína.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição é uma suspensão de proteína.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 e 3, em que a solução ou suspensão está congelada.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição é uma composição seca, compreendendo proteína seca por congelação.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que a referida composição seca é capaz de ser reconstituída numa solução.
7 . Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 6, em que a referida solução ou suspensão é adequada para administração por injecção ou perfusão.
8 . Composição de acordo com qualque: r uma das reivindicações 2, 3 e 6, em que a referida solução ou suspensão é adequada para administraçao como injecção em bólus. ΕΡ 1 344 533 /PT 2/5
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 6, em que a referida solução ou suspensão é adequada para administração por injecção ou perfusão intravenosa.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 6, em que a referida solução ou suspensão é adequada para administração por injecção subcutânea.
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 6, em que a referida solução ou suspensão é adequada para administração por injecção intramuscular.
12. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende, pelo menos, 750 μρ/ιηΐ de material contendo proteína ou seus sais.
13. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a MBL ou sais de MBL constitui, pelo menos, 50% (p/p) da proteína total.
14. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína total compreende adicionalmente uma ou mais protease serina associada a MBL (MASP).
15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que a MASP é seleccionada a partir do grupo constituído por MASP-1 de SEQ ID NO: 2, MASP-2 de SEQ ID NO: 3, MASP-3 de SEQ ID NO: 4 e seus equivalentes funcionais, pelo menos, 75% homólogos às sequências respectivas.
16. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a MBL é MBL sérica humana que ocorre naturalmente, purificada.
17. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a MBL foi recombinantemente produzida.
18. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que mais de 50% da MBL é maior do que 200 kDa como determinado por SDS-PAGE de não redução. ΕΡ 1 344 533 /PT 3/5
19. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que, pelo menos, um aditivo farmaceuticamente aceitável é um agente isotónico.
20. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que, pelo menos, um aditivo farmaceuticamente aceitável é um tampão.
21. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que não se adiciona qualquer proteína contendo estabilizante à referida composição.
22. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende adicionalmente um catião bivalente.
23. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que o catião bivalente é Ca2+.
24. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que os aditivos farmaceuticamente aceitáveis compreendem um ou mais seleccionado(s) a partir do grupo constituído por sal isotónico, sal hipertónico e tampão.
25. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que os aditivos farmaceuticamente aceitáveis compreendem um ou mais seleccionado(s) a partir do grupo constituído por agentes isotónicos, tampão e agentes crioprotectores.
26. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que os aditivos farmaceuticamente aceitáveis compreendem glucose-mono-hidrato, glicina, NaCl e polietilenoglicol 3350.
27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 20, 24 e 25, em que o tampão é capaz de tamponar uma solução a um pH no intervalo de 6 a 8.
28. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 20, 24 e 25, em que o tampão é seleccionado a partir do grupo constituído por tampão TRIS, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato e trietanolamina. ΕΡ 1 344 533 /PT 4/5
29. Composição de acordo com a reivindicação 19, em que a composição é isotónica, hipotónica ou hipertónica.
30. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 24 e 25, em que o agente isotónico é seleccionado a partir do grupo constituído por NaCl, CaCl2/· KC1, MgCl2, manitol e glicerol.
31. Composição de acordo com a reivindicação 25, em que o referido agente crioprotector é seleccionado a partir do grupo constituído por dextrano, polietilenoglicol, sacarose, trealose e manitol.
32. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a composição foi esterilizada.
33. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que a composição foi submetida a um passo de redução de vírus.
34. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição não compreende detergentes.
35. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição não compreende estabilizantes.
36. Composição farmacêutica compreendendo aditivos farmaceuticamente aceitáveis; e lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL; e, pelo menos, um catião bivalente; em que as variantes de MBL são polipéptidos, pelo menos, 75% homólogos à SEQ ID NO:l.
37. Composição de acordo com a reivindicação 36, em que a composição compreende catião bivalente no intervalo de 0,001 mM a 1000 mM.
38. Composição de acordo com a reivindicação 36, em que o catião bivalente é Ca2+.
39. Composição de acordo com a reivindicação 36, em que a concentração de lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL é de, pelo menos, 1 mg/ml. ΕΡ 1 344 533 /PT 5/5
40. Processo de preparação de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, compreendendo os passos de a) Fornecimento da lectina de ligação a manano (MBL) e/ou variantes de MBL, em que as variantes de MBL são polipéptidos, pelo menos, 75% homólogos à SEQ ID NO:l; b) Mistura da referida MBL e/ou variantes de MBL com aditivos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, com catiões bivalentes c) e, assim, obtenção de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39.
41. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição clinica num indivíduo em sua necessidade, em que a condição clinica é seleccionada a partir do grupo constituído por infecções, deficiência em MBL e condições de imunocompromisso.
42. Utilização de acordo com a reivindicação 41, em que a condição clínica é uma infecção.
43. Utilização de acordo com a reivindicação 41, em que o indivíduo é um ser humano.
44. Utilização de acordo com a reivindicação 41, em que o indivíduo é um ser humano que sofre de um risco aumentado de adquirir uma infecção.
45. Utilização de acordo com a reivindicação 41, em que o indivíduo é um ser humano com nível sérico de MBL subnormal. Lisboa,