KR20200104314A

KR20200104314A - Lag-3 항체 약학 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200104314A
Application number: KR1020207018644A
Authority: KR
Inventors: 팅팅 우; 하오 리; 순 리우; 야얀 푸
Original assignee: 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드; 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-09-03
Also published as: EP3714901A4; RU2771384C2; CA3085656A1; US20220031842A1; CN111356476B; CN111356476A; TW201927337A; AU2018391217A1; RU2020118313A3; WO2019120269A1; EP3714901A1; BR112020011664A2; JP2021506922A; RU2020118313A

Abstract

림프구-활성화 유전자 3(LAG-3) 항체 약학 조성물 및 이의 용도가 개시된다. 약학 조성물은 아세트산염 완충액 또는 히스티딘염 완충액에 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 약학 조성물은 또한 당류, 비 이온성 계면활성제 및 기타 부형제를 포함할 수 있다.

Description

LAG-3 항체 약학 조성물 및 이의 용도

본 발명은 약학 제제의 분야에 속하며, 특히 본 발명은 LAG-3 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 및 약제로서의 이의 용도에 관한 것이다.

LAG-3 또는 CD215로도 알려져 있는 림프구 활성화 유전자-3은 면역 세포의 다양한 기능 및 생존 주기를 음성적으로(negatively) 조절할 수 있는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. 연구에 따르면 LAG-3은 바이러스 감염, 자가면역 질환 및 종양 유도성 면역계 기능 장애에서 중요한 역할을 한다. 질병의 예후를 개선하기 위해, LAG-3의 기능에 영향을 주면 이들 질병의 발생 동안 면역 기능 장애의 상태를 개선할 수 있다.

면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원으로서, LAG-3은 세 개의 영역인 세포 외 도메인, 막관통 영역 및 세포질 도메인으로 구성된다. 1990년에 Triebel 등(J Exp Med, 1990, 171(5): 1393-405)에 의해 최초로 발견된 성숙 LAG-3 분자는 70 kDa의 상대 분자량을 갖는 470개의 아미노산으로 구성된다. 연구진은 CTLA-4 및 PD-1과 같이 LAG-3이 음성적인 공동 자극 분자이며, 이의 활성화는 림프구의 기능을 음성적으로 조절할 수 있음을 발견하였다. 구조적으로, LAG-3은 CD4와 밀접하게 관련되지만, 이의 기능은 CD4의 기능과 상반된다. 구체적으로, LAG-3 분자는 CD4 분자와 높은 유사성을 가지며, 둘 다 MHC-II(주요 조직 적합성 복합체) 클래스 분자에 결합할 수 있다. 그러나 MHC-II 분자에 대한 LAG-3의 결합능은 CD4의 결합능보다 높다. 따라서, LAG-3은 CD4+T 림프구에 의해 유도된 TCR 활성화에 개입하고, T 림프구의 활성화를 억제한다(Curr Opin Immunol, 2009, 21(2):179-86; Eur J Immunol, 2003, 33 (4): 970-9). 시험관 내 연구에서, LAG-3은 항원 유도성 T 림프구의 증식을 억제할 수 있는 것으로 나타났다. LAG-3의 차단은 T 림프구의 활성화 및 증식을 개선하고, 제1형 헬퍼 T 세포(Th1)에 의해 분비되는 사이토카인을 개선할 것이다. Huang 등은 활성화된 CD4+ Treg 세포 표면에서 LAG-3의 수준이 현저하게 증가되었고, LAG-3이 CD4+ Treg가 최대의 면역 억제 효과를 발휘할 수 있게 하는데 필수적인 조건임을 보여주었다(Immunity, 2004, 21 (4): 503-13). 또한, 항-LAG-3 항체는 CD4+ 및 CD8+T 림프구의 항상성도 유지하며, LAG-3의 차단은 종양 세포를 살상하는 CD8+ T 림프구의 능력을 현저하게 향상시킬 것이다(J Clin Invest, 2007, 117 (11): 3383-92). 또한, 질병에 관한 일부 연구에서 LAG-3이 질병의 발생 및 진행을 조절하는 데 중요한 역할을 함이 밝혀졌다. Gandhi 등은 인간 림프종 조직의 T 림프구 내 LAG-3의 발현 수준이 T 림프구 기능 장애와 연관이 있으며, LAG-3⁺ T 림프구의 제거가 림프구에 의해 종양 세포를 제거하는 능력을 현저하게 향상시킬 수 있음을 확인시켜 주었다(Blood, 2006, 108 (7): 2280-9). 결과는 LAG-3이 면역 세포의 표면 상에서 중요한 억제 분자이며, T 림프구에 대하여 현저하게 음성적인 조절 효과를 가짐을 보여준다.

LAG-3은 T 림프구, B 림프구, NK 세포, Treg 세포 및 DC 세포 상에서 주로 발현된다(Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5744-9. Eur J Immunol, 2005, 35 (7): 2081-8; J Immunol, 2009, 182 (4): 1885-91). LAG-3은 면역억제 분자의 클래스이며, TCR의 공동 수용체를 구성하는 성분 중 하나이다. 이것은 T 림프구에 의해 유도되는 TCR 활성화에 개입하고, T 림프구의 활성화에서 음성적인 조절 역할을 한다. 일부 질병에서, LAG-3의 발현이 증가하였고, 상응하는 면역 억제가 관찰되었다. Gandhi 등은 호지킨 림프종 환자의 혈액 및 종양 조직의 림프구에서 LAG-3이 높게 발현되고; 특이적 CD8+ T 세포의 기능이 종양 조직 내에서 명백하게 손상되며; LAG-3-양성 T 세포를 제거할 경우, 항-종양 기능이 회복되고 사이토카인 분비가 증가함을 발견하였다. 저자들은 LAG-3의 발현이 특이적 T 세포에 의한 면역 기능의 음성적 조절과 관련이 있으며, LAG-3 분자의 기능 억제가 T 세포의 항-종양 효과를 증진시키므로, LAG-3 분자가 종양 면역요법을 위한 잠재적인 표적일 수 있다고 추측하였다(Blood, 2006, 108 (7): 2280-9).

현재, 항원-특이적 T 세포 반응을 자극함으로써 T 세포의 항-종양 효과를 증진시키고 종양에 대한 환자 자신의 면역 반응을 최대화하며, 이어서 종양 세포를 살상하는 목적을 달성하는 것인, LAG-3에 대한 단일클론 항체 연구에 참여 중인 BMS 및 Novartis와 같은 몇몇 다국적 제약 회사가 있다.

그러나 항체 약물은 큰 분자량, 복잡한 구조, 분해에 취약함, 고분자화됨, 또는 원치 않는 화학적 변형으로 인해 불안정하다. 투여에 적합한 항체를 제조하고 저장 및 이후의 사용 중에 안정성을 유지하기 위해서는 안정적인 항체 약물의 제형에 대한 연구가 특히 중요하다.

예를 들어, WO2018204374, WO2010019570, WO2014008218, WO9530750, WO2004078928, WO2008132601, WO2014140180, WO2015138920 등 여러 회사가 현재 LAG3 항체 및 이의 제형을 개발하고 있지만, 새로운 LAG3 항체 제형에 중점을 두는 연구는 거의 없다. 투여에 더욱 적합한 LAG3을 포함하는 약학 조성물(제형)을 개발할 필요성은 여전하다.

본 발명은 LAG3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 완충액을 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 완충액은 아세트산염 완충액, 히스티딘 완충액, 시트르산염 완충액, 숙신산염 완충액 또는 트리스(Tris) 완충액으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 아세트산염 완충액은 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, 아세트산-아세트산 칼륨 완충액, 아세트산-히스티딘염 완충액, 아세트산-아세트산 칼슘 완충액 및 아세트산-아세트산 마그네슘 완충액으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액이다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 히스티딘 완충액은 히스티딘-염산 완충액, 히스티딘-아세트산 완충액, 히스티딘-인산 완충액, 히스티딘-황산 완충액으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 히스티딘-염산 완충액이다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 시트르산염 완충액은 시트르산-시트르산 나트륨 완충액이고; 숙신산염 완충액은 숙신산-숙신산 나트륨 완충액이다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 1 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 40 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 40 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 40 mg/ml, 바람직하게는 약 10 mg/ml 내지 30 mg/ml, 바람직하게는 약 20 mg/ml 내지 30 mg/ml이다. 비 제한적인 예로서, LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 약 40 mg/ml, 41 mg/ml, 42 mg/ml, 43 mg/ml, 44 mg/ml, 45 mg/ml, 46 mg/ml, 47 mg/ml, 48 mg/ml, 49 mg/ml, 50 mg/ml, 51 mg/ml, 52 mg/ml, 53 mg/ml, 54 mg/ml, 55 mg/ml, 56 mg/ml, 57 mg/ml, 58 mg/ml, 59 mg/ml 또는 60 mg/ml, 가장 바람직하게는 50 mg/ml이다.

대안적인 구현예에서, 완충액의 농도는 약 5 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 15 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 25 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 25 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 25 mM, 바람직하게는 약 15 mM 내지 25 mM, 바람직하게는 약 20 mM 내지 25 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 20 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 15 mM이다; 비 제한적인 예로서, 완충액의 농도는 약 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM, 22 mM, 24 mM, 26 mM, 28 mM 또는 30 mM, 가장 바람직하게는 10 mM이다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 완충액의 pH 값은 약 5.0 내지 7.5, 바람직하게는 약 5.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 6.0 내지 7.5, 바람직하게는 약 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 7.0 내지 7.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 약 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 약 6.0 내지 7.0, 바람직하게는 약 6.5 내지 7.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 약 5.5 내지 6.5, 바람직하게는 약 6.0 내지 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 6.0, 바람직하게는 약 5.5 내지 6.0, 바람직하게는 약 5.0 내지 5.5이다. 비 제한적인 예로서, 완충액의 pH 값은 대안적으로 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 6.0, 훨씬 더 바람직하게는 5.5 또는 6.0일 수 있다.

또한, 대안적인 구현예에서, 약학 조성물은 당류 및 계면활성제 중 하나 이상으로부터 선택되는 보조제를 더 포함한다.

대안적인 구현예에서, 당류는 이당류이고, 바람직하게는 트레할로스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨이고, 더욱 바람직하게는 수크로스이다. 대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 당류의 농도는 약 30 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 90 mg/ml, 35 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 55 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 65 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 75 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 85 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 55 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 65 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 75 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 85 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 55 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 65 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 75 mg/ml 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 55 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 65 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 75 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 55 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 65 mg/ml 내지 70 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 65 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 65 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 65 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 65 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 65 mg/ml, 바람직하게는 약 55 mg/ml 내지 65 mg/ml, 바람직하게는 약 60 mg/ml 내지 65 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 55 mg/ml 내지 60 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 55 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 55 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 55 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 55 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 55 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 45 mg/ml 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 45 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 45 mg/ml, 바람직하게는 약 40 mg/ml 내지 45 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 40 mg/ml, 바람직하게는 약 35 mg/ml 내지 40 mg/ml, 바람직하게는 약 30 mg/ml 내지 35 mg/ml이다; 비 제한적인 예로서, 약학 조성물에 포함되는 당류의 농도는 약 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml 또는 90 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 70 mg/ml 내지 80 mg/ml, 가장 바람직하게는 75 mg/ml이다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은 계면활성제를 더 포함한다. 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴리하이드록실 탄화수소, 트리톤, 도데실술폰산나트륨, 라우릴술폰산나트륨, 옥틸글리코시드 나트륨, 라우릴-술포베타인, 미리스틸-술포베타인, 리놀레일-술포베타인, 스테아릴-술포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우라미도프로필-베타인, 코카아미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스타미도프로필-베타인, 팔미토일프로필-베타인, 이소스테아라미도프로필-베타인, 미리스타미도프로필-디메틸아민, 팔미토일프로필-디메틸아민, 이소스테아라미도프로필-디메틸아민, 메틸코코아실 나트륨, 메틸올레일 타우린 나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 더욱 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 계면활성제의 농도는 약 0.02 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.5 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.6 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.7 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 약 0.02 mg/ml 내지 0.7 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 0.7 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 0.7 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 0.7 mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 mg/ml 내지 0.7 mg/ml, 바람직하게는 약 0.5 mg/ml 내지 0.7 mg/ml, 바람직하게는 약 0.6 mg/ml 내지 0.7 mg/ml, 바람직하게는 약 0.02 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.5 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 바람직하게는 약 0.02 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.4 mg/ml 내지 0.5 mg/ml, 바람직하게는 약 0.02 mg/ml 내지 0.4 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 0.4 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 0.4 mg/ml, 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 0.4 mg/ml, 바람직하게는 약 0.02 mg/ml 내지 0.3 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 0.3 mg/ml, 바람직하게는 약 0.2 mg/ml 내지 0.3 mg/ml, 바람직하게는 약 0.02 mg/ml 내지 0.2 mg/ml, 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 0.2 mg/ml, 바람직하게는 약 0.02 mg/ml 내지 0.1 mg/ml이다. 비 제한적인 예로서, 약학 조성물에 포함되는 계면활성제의 농도는 약 0.2 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.35 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.45 mg/ml 또는 0.5 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.3 mg/ml 내지 0.5 mg/ml이다.

일 구현예에서, 약학 조성물은 아래의 i) 또는 ii)에 제시된 바와 같은 성분을 포함한다:

i) (a) 1 mg/ml 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.02 mg/ml 내지 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80; 바람직하게는, 약학 조성물은

(e) 40 mg/ml 내지 80 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (f) 10 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.2 내지 5.8, (g) 70 mg/ml 내지 80 mg/ml의 수크로스, 및 (h) 0.4 mg/ml 내지 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하거나; 또는

ii) (a) 1 mg/ml 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 0.05 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80; 바람직하게는, 약학 조성물은

(e) 45 mg/ml 내지 60 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (f) 10 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.5 내지 6.0, (g) 60 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및 (h) 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 LAG3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함??다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은

(a) 1 mg/ml 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 아세트산염 완충액, 바람직하게는 pH 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.02 mg/ml 내지 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은

(a) 40 mg/ml 내지 80 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM 내지 30 mM의 아세트산염 완충액, pH 약 5.0 내지 6.0, (c) 60 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.1 mg/ml 내지 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은

(a) 50 mg/ml 내지 60 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.2 내지 5.8, (c) 70 mg 내지 80 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.4 mg/ml 내지 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은

(a) 약 50 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.5, (c) 약 75 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 약 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥣과(murine) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 쥣과 LAG3 항체는 서열번호 5에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 6에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 인간화 LAG-3 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25 중 어느 하나에 기재되어 있거나, 또는 이에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 가지고; 그리고

여기에서 경쇄 가변 영역은 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 27 또는 서열번호 28 중 어느 하나에 기재되어 있거나, 또는 이에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, LAG-3 항체의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25에 기재된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 LAG3 인간화 항체는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함한다:

1) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;

2) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;

3) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역;

4) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역;

5) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;

6) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;

7) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역;

8) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역;

9) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;

10) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;

11) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역;

12) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역;

13) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;

14) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;

15) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역; 및

16) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 인간화 LAG-3 항체는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 여기에서 중쇄 불변 영역은 바람직하게는 서열번호 38에 기재되어 있고, 경쇄 불변 영역은 바람직하게는 서열번호 39에 기재되어 있다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 인간화 LAG-3 항체의 중쇄는 서열번호 40에 기재되어 있거나, 또는 서열번호 40에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖고, 경쇄는 서열번호 41에 기재되어 있거나, 또는 서열번호 41에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체의 중쇄는 서열번호 40에 기재된 중쇄 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, LAG-3 항체의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 41에 기재된 항체 경쇄에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.

일 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH 5.5)을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013 및 10 mM의 숙신산-숙신산 나트륨 완충액(pH 6.0)을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013 및 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(pH 6.0)을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 mM의 숙신산-숙신산 나트륨(pH 6.0) 및 0.1 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 mM의 숙신산-숙신산 나트륨(pH 6.0) 및 70 mg/ml의 수크로스를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5), 60 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 mM의 히스티딘-아세트산(pH 6.0), 60 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 구현예에서, 약학 조성물은 1 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 내지 30 mM의 히스티딘-아세트산(pH 5.5), 75 mg/ml의 수크로스 및 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.2 내지 5.8), 75 mg/ml의 수크로스 및 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 60 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5), 60 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 내지 60 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5), 30 내지 90 mg/ml의 수크로스 및 0.4-0.5 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu229-013, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5), 75 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각각 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 각각 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은

(a) 1 mg/ml 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 0.05 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은

(a) 45 mg/ml 내지 60 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 약 10 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염화수소나트륨 완충액, pH 약 5.0 내지 6.0, (c) 60 mg 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물은

(a) 약 50 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.0, (c) 약 75 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 약 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥣과 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 쥣과 LAG3 항체는 서열번호 7에 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 기재된 경쇄 가변 영역을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 인간화 LAG-3 항체는 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33 또는 이에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37 또는 이에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37에 기재된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, LAG-3 항체의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33에 기재된 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 인간화 LAG3 항체는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함한다:

1) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;

2) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;

3) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;

4) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역;

5) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역;

6) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;

7) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;

8) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;

9) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역;

10) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역;

11) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;

12) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;

13) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;

14) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역;

15) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역;

16) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;

17) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;

18) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;

19) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역; 및

20) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 키메라 항체 또는 인간화 항체의 중쇄는 인간 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 더 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG4로부터 유래된 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 38에 기재된 중쇄 불변 영역을 포함하고; 키메라 항체 또는 인간화 항체의 경쇄는 인간 κ, λ 사슬로부터 유래된 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 더 포함하고, 바람직하게는 서열번호 39에 기재된 경쇄 불변 영역을 포함한다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 인간화 LAG-3 항체의 중쇄는 서열번호 42에 기재되어 있거나, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖고, 경쇄는 서열번호 43에 기재되어 있거나, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.

대안적인 구현예에서, 위의 약학 조성물에 포함되는 LAG-3 항체의 중쇄는 서열번호 42에 기재된 중쇄 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, LAG-3 항체의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 43에 기재된 항체 경쇄에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.

일 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005 및 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(pH 6.0)을 포함한다.

일 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005 및 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(pH 5.0)을 포함한다.

일 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005 및 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(pH 6.5)을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005 및 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH 5.5)를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH 5.5), 75 mg/ml의 수크로스 및 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH 5.5), 75 mg/ml의 트레할로스, 및 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH 5.5), 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(pH 6.0), 75 mg/ml의 수크로스, 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 10 mM의 히스티딘- 염산 완충액(pH 6.5), 75 mg/ml의 수크로스, 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(pH 5.5), 75 mg/ml의 수크로스, 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 구현예에서, 약학 조성물은 45 내지 60 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(pH 5.5), 75 mg/ml의 수크로스, 및 0.2 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 약 50 mg/ml의 LAG3 항체 Hu303-005, 약 10 mM의 히스티딘-염산 완충액(약 pH 6.0), 약 75 mg/ml의 수크로스, 및 약 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함한다.

본 발명은 또한 LAG-3 항체 또는 항원 결합 단편을 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, LAG-3 항체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 전술한 약학 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는, LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법을 제공한다.

LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법의 대안적인 구현예에서, 동결건조는 사전 동결 단계, 1차 건조 단계 및 2차 건조 단계를 포함한다.

LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법의 대안적인 구현예에서, 1차 건조는 -5℃ 내지 -20℃, 바람직하게는 -10℃의 온도에서 수행된다.

본 발명은 또한 전술한 LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법에 의해 제조된 LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형을 제공한다.

일부 구현예에서, 동결건조 제형은 적어도 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월 동안 2 내지 8℃에서 이의 안정성을 유지한다. 일부 구현예에서, 동결건조 제형은 적어도 7일, 적어도 14일 또는 적어도 28일 동안 40℃에서 이의 안정성을 보유한다.

본 발명은 또한 위의 동결건조 방법에 의해 제조된 LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형을 제공한다.

본 발명은 또한 동결건조 제형을 재구성하여 위의 약학 조성물을 수득할 수 있는 것을 특징으로 하는 LAG3 항체를 포함하는 동결건조 제형을 제공한다.

본 발명은 또한 LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형으로부터 재구성된 용액을 제조하는 방법을 제공하며, 이는 전술한 동결건조 제형을 재구성하는 단계를 포함하고, 여기에서 재구성을 위한 용매는 주사용수, 생리식염수 또는 글루코스 용액으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형으로부터 수득 가능한 재구성된 용액을 제공하며, 이는 LAG-3 항체를 포함하는 동결건조 제형으로부터 재구성된 용액을 제조하는 방법에 의해 제조된다.

본 발명은 또한 LAG3 항체를 포함하는 재구성된 용액을 제공하며, 재구성된 용액은 다음 성분을 더 포함한다:

(a) 1 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.02 내지 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80.

(a) 40 내지 80 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.2 내지 5.8, (c) 70 내지 80 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.4 내지 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80.

(a) 50 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.5, (c) 75 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80.

(a) 1 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.05 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80.

(a) 45 내지 60 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.5 내지 6.0, (c) 60 내지 80 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.2 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80.

(a) 50 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 6.0, (c) 75 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80.

본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 안정한 약학 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 물품 또는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 바이알은 중성 붕규산 유리로 제조된 주사용 바이알이다.

전술한 본 발명의 약학 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성된 용액은 약제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 LAG-3과 관련된 질병 또는 상태를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 전술한 약학 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성된 용액의 용도를 제공하며, 질병 또는 상태는 병원성 T 세포를 수반하는 질병 또는 상태이고, 바람직하게는 암이다. 암은 난소암, 흑색종, 전립선암, 장암, 위암, 식도암, 유방암, 폐암, 신장암, 췌장암, 자궁암, 간암, 방광암, 자궁경부암, 구강암, 뇌암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 및 골수종과 만성 및 급성 백혈병을 포함하는 혈액 악성 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 치료학적 유효량의 전술한 약학 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성된 용액을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 LAG-3과 관련된 질병 또는 상태의 치료 및 예방 방법을 제공하며, 여기에서 질병 또는 상태는 병원성 T 세포를 수반하는 질병 또는 상태이고, 바람직하게는 암이다. 암은 난소암, 흑색종, 전립선암, 장암, 위암, 식도암, 유방암, 폐암, 신장암, 췌장암, 자궁암, 간암, 방광암, 자궁경부암, 구강암, 뇌암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 및 골수종과 만성 및 급성 백혈병을 포함하는 혈액 악성 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 전술한 약학 조성물 또는 동결건조 제형 또는 동결건조 제형의 재구성된 용액을 함유하는 용기를 포함하는 물품을 제공한다.

본 개시에서 기술된 다양한 구현예 중 하나의, 일부의 또는 모든 특징은 추가로 조합되어 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 본 발명의 추가 구현예를 형성할 수 있다. 본 발명의 위의 구현예 및 조합에 의해 얻어진 기타 구현예를 다음의 상세한 설명에 의해 추가로 설명한다.

용어

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 특정 기술 및 과학 용어를 아래에 구체적으로 정의한다. 본 명세서에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다.

"완충액"은 이의 컨쥬게이트 산-염기 성분으로 인해 pH 변화에 저항성이 있는 완충액을 지칭한다. pH를 적절한 범위로 조절하는 완충액의 예는 아세트산염 완충액, 숙신산염 완충액, 글루콘산염 완충액, 히스티딘 완충액, 옥살산염 완충액, 젖산염 완충액, 인산염 완충액, 시트르산염 완충액, 타르타르산염 완충액, 푸마르산염 완충액, 글리실글리신 및 기타 유기산 완충액을 포함한다.

"히스티딘 완충액"은 히스티딘 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 히스티딘 완충액의 예는 히스티딘 염산염 완충액, 히스티딘-아세트산염 완충액, 히스티딘-인산염 완충액, 히스티딘-황산염 완충액 등을 포함하며, 바람직하게는 히스티딘 염산염 완충액이다. 히스티딘 염산염 완충액은 히스티딘 및 염산에 의해 또는 히스티딘 및 히스티딘 염산염에 의해 제조된다.

"시트르산염 완충액"은 시트르산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 시트르산염 완충액의 예는 시트르산-시트르산 나트륨 완충액, 시트르산-시트르산 칼륨 완충액, 시트르산-시트르산 칼슘 완충액, 시트르산-시트르산 마그네슘 완충액 등을 포함한다. 바람직한 시트르산염 완충액은 시트르산-시트르산 나트륨이다.

"숙신산염 완충액"은 숙신산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 숙신산염 완충액의 예는 숙신산-숙신산 나트륨 완충액, 숙신산-숙신산 칼륨 완충액, 숙신산-숙신산 칼슘 완충액 등을 포함한다. 바람직한 숙신산염 완충액은 숙신산-숙신산 나트륨 완충액이다.

"인산염 완충액"은 인산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 인산염 완충액의 예는 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨 완충액, 및 인산수소이나트륨-인산이수소칼륨 완충액 등을 포함한다. 바람직한 인산염 완충액은 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨 완충액이다.

"아세트산염 완충액"은 아세트산염 이온을 포함하는 완충액을 지칭한다. 아세트산염 완충액의 예는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, 아세트산-히스티딘 완충액, 아세트산-아세트산 칼륨 완충액, 아세트산-아세트산 칼슘 완충액, 아세트산-아세트산 마그네슘 완충액 등을 포함한다. 바람직한 아세트산염 완충액은 아세트산-아세트산 나트륨 완충액이다.

"트리스 완충액"은 트리스 염기로도 알려져 있는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트리즈마, 트리스아민, THAM, 트로메타민, 및 트로메타몰을 포함하는 완충 용액을 지칭한다. 트리스 완충액의 유효 완충 범위는 pH 7.0 내지 9.2이고, 트리스 염기 수용액의 pH는 약 10.5이다. 일반적으로, 염산을 첨가하여 pH를 원하는 값으로 조정하여 상기 pH의 완충액을 얻는다.

본 발명의 "당류"는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당류 알코올, 환원 당류, 비환원 당류 등을 포함하는, 통상적인 조성 (CH₂O)_n 및 이의 유도체를 포함한다. 이는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세롤, 에리스리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리디오스, 멜레지토스, 멜리트리오스, 만노트리오스, 스타키오스, 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 이소말툴로스 등으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 당류는 비환원 이당류, 더욱 바람직하게는 수크로스이다.

"점도 조절제"는 제형의 점도를 조정하기 위해 첨가되는 통상적인 약학적 물질이다. 본원에 언급된 점도 조절제는 주로 무기 염 및 아미노산 염을 지칭하며, 여기에서 무기 염은 바람직하게는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 아세트산 칼슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 아미노산 염은 바람직하게는 아르기닌 염산염, 히스티딘 염산염, 글리신 염산염 및 히스티딘 아세트산염 등으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

"약학 조성물"은 본원에 기술된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로/약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 및 다른 화학적 성분을 포함하는 혼합물을 지칭하며, 다른 화학적 성분은 예를 들어, 생리학적으로/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제이다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 대한 투여를 촉진하는 것으로, 이는 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여 생물학적 활성을 발휘한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "약학 조성물" 및 "제형"은 상호 배타적이지 않다.

본 발명에서 약학 조성물의 용액 형태와 관련하여, 달리 명시되지 않는 한, 그 안에 포함된 용매는 물이다.

"동결건조 제형"은 액체 형태 또는 용액 형태의 약학 조성물 또는 제형을 진공 동결건조시켜 수득된 제형 또는 약학 조성물을 지칭한다.

본 개시의 동결건조는 사전 동결, 1차 건조 및 2차 건조를 포함한다. 사전 동결의 목적은 생성물을 냉동시켜 결정질 고체를 얻는 것이다. 사전 동결을 위한 온도 및 속도는 두 가지의 중요한 공정 파라미터이다. 본 발명에서, 사전 동결을 위한 온도는 -45℃로 설정되고, 사전 동결을 위한 속도는 1℃/분으로 설정된다. 1차 건조는 동결건조의 주요 단계인 주 건조라고도 알려져 있다. 목적은 생성물의 형태를 유지하고, 생성물에 대한 손상을 최소화하면서 생성물로부터 얼음을 제거하는 것이다. 1차 동결의 온도 및 진공도가 적절하지 않으면, 생성물이 붕괴될 수 있다. 더 높은 온도 및 진공도는 동결건조의 효율성을 가속화할 것이지만, 동시에 생성물 붕괴의 위험을 증가시킬 것이다. 본 발명의 1차 건조를 위한 온도는 당해 분야의 통상적인 온도, 예를 들어 -30℃ 내지 0℃일 수 있다. 2차 건조는 분석 건조라고도 알려져 있으며, 도달 진공도(ultimate vacuum)(0.01 mbar) 및 온도 증가(20 내지 40℃)에 의해 생성물로부터 결합된 물을 제거하기 위한 1차 단계이다. 대부분의 생물학적 생성물은 온도에 민감하므로, 2차 건조를 위한 온도는 온도 범위의 저점, 즉 25℃에 있도록 선택된다. 동결건조 지속시간은 냉동고, 동결건조 제형의 용량, 및 동결건조제를 포함하는 용기와 관련이 있다. 당업자는 동결건조 지속시간을 조절하는 방법을 잘 알고 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 값을 지칭하며, 이는 부분적으로 값의 측정 또는 결정 방법에 따라 다를 것이다(즉, 측정 시스템의 한계). 예를 들어, "약"은 당해 분야에서 각각의 실행에 대해 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 나타낼 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "필수적으로 포함하는"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있다. 예를 들어, 약 5.5의 pH는 pH 5.5 ± 1.1을 의미한다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 이 용어는 최대 10배 또는 최대 5배의 값을 지칭할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 값이 본 출원 및 청구범위에 언급되어 있을 때, "약" 또는 "필수적으로 포함하는"의 의미는 그 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 추정되어야 한다.

본 발명의 약학 조성물은 안정된 효과를 달성할 수 있다: 항체는 저장 후 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 유지할 수 있고; 바람직하게는, 약학 조성물은 저장 후 이의 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 실질적으로 유지한다. 저장 수명은 일반적으로 약학 조성물의 미리 정해진 저장 수명에 기초하여 선택된다. 현재 단백질 안정성을 측정하기 위한 다수의 분석 기술이 있으며, 이는 선택된 온도에서 선택된 시간 동안 저장한 후 안정성을 측정할 수 있다.

안정적인 항체 약학 제형은 다음 조건에서 현저한 변화가 관찰되지 않는 것이다: 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 더욱 바람직하게는 1년, 훨씬 더 바람직하게는 최대 2년 동안 냉장 온도(2 내지 8℃)에서의 저장. 또한, 안정한 액체 제형은 예를 들어, 1개월, 3개월 및 6개월 동안 25℃의 온도에서, 또는 1개월 동안 40℃에서 저장 시 원하는 특성을 나타내는 액체 제형을 포함한다. 전형적으로, 안정성에 대한 허용 가능한 기준은 다음과 같다: SEC-HPLC에 의해 평가 시, 전형적으로 약 5% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 항체 단량체가 분해된다. 약학적 항체 제형은 시각적 분석에 의해 무색이거나, 또는 투명 내지 약간 유백색이다. 제형의 농도, pH 및 삼투압은 ±5% 이하의 변화를 갖는다. 전형적으로, 약 5% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 절단(truncate)이 관찰된다. 전형적으로, 약 5% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 응집이 형성된다.

항체는 색 및/또는 투명성의 육안 검사 시 또는 UV 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정 시, 응집, 침전 및/또는 변성의 현저한 증가를 나타내지 않을 경우, 약학 제형에서 "이의 물리적 안정성을 유지한다"고 간주된다. 단백질 입체구조의 변화는 형광 분광법(단백질의 3차 구조를 결정함) 및 FTIR 분광법(단백질의 2차 구조를 결정함)에 의해 평가될 수 있다.

항체는 현저한 화학적 변경을 나타내지 않을 경우, 약학 제형에서 "이의 화학적 안정성을 보유한다"고 간주된다. 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변경된 형태를 검출하고 정량화함으로써 평가될 수 있다. 단백질의 화학적 구조를 종종 변경하는 분해 공정은 가수 분해 또는 절단(크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE와 같은 방법으로 평가함), 산화(질량 분광분석법 또는 MALDI/TOF/MS와 함께 펩티드 맵핑과 같은 방법으로 평가함), 탈아미드화(이온 교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 포커싱, 펩티드 맵핑, 이소아스파르트산 측정과 같은 방법으로 평가함) 및 이성질화(이소아스파르트산 함량 측정, 펩티드 맵핑 등으로 평가함)를 포함한다.

주어진 시간에서의 항체의 생물학적 활성이 약학적 제제가 제조되었을 때 나타난 생물학적 활성의 미리 결정된 범위 내에 있는 경우, 항체는 약학 제형에서 "이의 생물학적 활성을 보유한다"고 간주된다. 항체의 생물학적 활성은 예를 들어, 항원 결합 분석에 의해 결정될 수 있다.

용어 "LAG-3"은 림프구 활성화 유전자-3을 지칭한다. 용어 "LAG-3"은 변이체, 이소형, 상동체, 오르소로그 및 파라로그를 포함한다. 용어 "인간 LAG-3"은 Uniprot No. P18627의 인간 LAG-3의 완전한 아미노산 서열과 같은 인간 LAG-3의 서열을 지칭한다. LAG-3은 당해 분야에서, 예를 들어 CD215로도 공지되어 있다. 인간 LAG-3 서열은 Uniprot No. P18627의 인간 LAG-3과 다를 수 있다. 예를 들어, 인간 LAG-3은 보존된 돌연변이 또는 비 보존 영역 내 돌연변이를 가지며, 이는 Uniprot No. P18627의 인간 LAG-3의 그것과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다. 예를 들어, 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 그것이 LAG-3의 세포 외 도메인에 에피토프를 갖는 것으로 구성되며, 여기에서 에피토프는 본원에 개시된 항체에 의해 특이적으로 결합되거나, 또는 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 MHC 클래스 II 분자에 대한 이의 결합에 있다.

특정 인간 LAG-3 서열은 일반적으로 Uniprot No. P18627의 인간 LAG-3에 대한 아미노산 서열에서 적어도 90%의 동일성을 가질 것이며, 다른 종(예를 들어, 쥣과)으로부터의 LAG-3 아미노산 서열과 비교할 때 인간 아미노산 서열로 확인된 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에 있어서, 인간 LAG-3은 Uniprot No. P18627의 LAG-3에 대한 아미노산 서열에서 적어도 85% 또는 심지어 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 LAG-3 서열은 Uniprot No. P18627의 LAG-3 서열과 10개 이하의 아미노산의 차이를 나타낼 것이다. 특정 구현예에서, 인간 LAG-3 서열은 Uniprot No. P18627의 인간 LAG-3 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산의 차이를 나타낼 수 있다. 동일성(%)은 본 명세서에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 아미노산에 대한 단일 문자 부호 및 3문자 부호는 J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968)에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 "항체"는 두 개의 동일한 중쇄 및 두 개의 동일한 경쇄 사이에서 사슬 내 이황화 결합에 의해 서로 연결된 네 개의 펩티드 사슬 구조인 면역글로불린을 지칭한다.

본 발명에서, 본 발명의 항체 경쇄는 인간 또는 쥣과의 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 항체 중쇄는 인간 또는 쥣과의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있다.

항체 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 인접한 약 15개의 아미노산 서열은 매우 가변적이며, 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있고; C 말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정적이며, 불변 영역으로 알려져 있다. 가변 영역은 세 개의 과가변 영역(HVR) 및 네 개의 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 항체의 특이성을 결정하는 세 개의 과가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 각각의 중쇄 가변 영역(HCVR)은 세 개의 CDR 영역 및 네 개의 FR 영역으로 구성되며, 순차적 순서는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 다음의 순서이다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 경쇄의 세 개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 세 개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다.

본 발명의 항체는 쥣과 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체를 포함하며, 바람직하게는 인간화 항체이다.

본 발명의 용어 "쥣과 항체"는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 제조된 인간 LAG-3에 대한 단일클론 항체를 지칭한다. 제조하는 동안, 시험 대상체에게 LAG-3 항원 주사를 놓은 다음, 원하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다.

용어 "키메라 항체"는 쥣과 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합하여 형성되는 항체이며, 키메라 항체는 쥣과 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 완화할 수 있다. 키메라 항체를 구축하기 위하여, 특정 쥣과 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 구축한 다음, 가변 영역 유전자를 마우스 하이브리도마 세포로부터 클로닝한다. 이후, 인간 항체의 불변 영역 유전자를 원하는 대로 클로닝한다. 쥣과의 가변 영역 유전자를 인간 불변 영역 유전자와 결찰하여 인간 벡터 내로 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성하고, 최종적으로 키메라 항체 분자를 진핵 또는 원핵 산업 시스템에서 발현시킨다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, LAG-3 키메라 항체의 경쇄는 인간 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 더 포함한다. LAG-3 키메라 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 더 포함한다.

CDR 이식 항체로도 알려져 있는 "인간화 항체"라는 용어는 인간 항체의 가변 영역 프레임워크 내로 쥣과 CDR 서열을 이식하여 생성된 항체, 즉, 상이한 유형의 인간 생식세포주 항체 프레임워크 서열로부터 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 많은 쥣과 단백질 성분을 보유하는 키메라 항체에 의해 유도되는 강한 항체 반응의 단점들을 극복한다. 이러한 프레임워크 서열은 생식세포주 항체 유전자 서열을 아우르는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식세포주 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포주 서열 데이터베이스(웹 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase에서 이용 가능함)에서 찾을 수 있고, Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.에서도 찾을 수 있다. 면역원성의 감소와 함께 활성의 감소를 피하기 위하여, 인간 항체의 가변 영역의 프레임워크 서열은 활성을 유지하기 위하여 최소한의 역돌연변이 또는 복귀 돌연변이를 겪는다. 또한, 본 발명의 인간화 항체는 CDR 친화도 성숙이 파지 디스플레이에 의해 수행되는 인간화 항체를 포함한다.

본 발명에서 용어 "항-LAG-3 항체", "항-LAG-3", "LAG-3 항체" 및 "LAG-3에 대한 항체 결합"은 충분한 친화도로 LAG-3에 결합할 수 있는 항체를 지칭하며, 그 결과 이 항체는 LAG-3을 표적으로 하는 진단제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "LAG-3에 대한 결합"은 인간 LAG-3과 상호 작용할 수 있음을 지칭한다.

용어 "특이적으로 결합하는"은 당해 분야에서 이용 가능한 기술, 예컨대 경쟁적 ELISA, BIACORE® 분석, 또는 KINEXA® 분석에 의해 결정된다. 예를 들어, 이 용어는 또한 본 발명의 항체의 항원 결합 도메인이 여러 항원에 의해 보유되는 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에 적용 가능하다. 이러한 경우, 항원 결합 도메인을 보유하는 항체는 이러한 에피토프를 보유하는 다수의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.

용어 "경쟁적 결합"은 본 발명의 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 인간 LAG-3 세포 외 영역 에피토프(항원 결정기라고도 지칭됨) 또는 이의 부분을 인식하고 이 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 본 발명의 단일클론 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체는, 본 발명의 단일클론 항체에 의해 인식되는 인간 LAG-3의 아미노산 서열을 인식하고 이에 결합하는 항체를 지칭한다.

용어 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는, 예를 들어 비아코어(BIACORE) 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술을 이용하여 결정 시, 대략 10^-7 M 미만, 예를 들어 대략 10^-8 M, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만 또는 훨씬 더 낮은 값의 해리 평형 상수(KD)로 LAG-3에 결합한다.

본 발명에 언급된 "항원 결합 단편"은 항원 결합 활성을 갖는 Fab 단편, Fab’ 단편, 또는 F(ab’)2 단편 및 인간 LAG-3에 결합하는 scFv 단편, 및 항-LAG-3 항체 VH 및 VL에 의해 형성된 인간 LAG-3에 결합할 수 있는 기타 단편을 지칭한다; 이는 서열번호 9, 10, 11, 15, 16, 17 및 12, 13, 14, 18, 19 및 20으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명에 기술된 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 포함한다. Fv 단편은 불변 영역 없이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이는 모든 항원 결합 부위를 보유하는 최소한의 항체 단편이다. 일반적으로, Fv 항체는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하며, 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다. 또한, 상이한 링커를 사용하여 2개의 항체의 가변 영역을 연결하여 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 Fv(scFv)로 지칭되는 폴리펩티드 사슬을 형성할 수 있다.

용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 항원에 위치한 부분을 지칭한다.

"보존적 변경" 또는 "보존적 교체 또는 치환"은 유사한 특징(예컨대, 전하, 곁사슬 크기, 소수성/친수성, 백본 구조 및 견고성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 단백질의 아미노산을 치환하는 것을 지칭하며, 그 결과 단백질의 생물학적 활성을 바꾸지 않고 변경이 빈번하게 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비필수 영역의 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 바꾸지 않음을 인식한다(예를 들어, Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed) 참조). 또한, 구조적으로나 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 파괴할 가능성이 낮다.

"아미노산 동일성"은 두 개의 단백질 또는 두 개의 폴리펩티드 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 비교되는 두 서열에서의 한 위치를 동일한 아미노산 잔기가 차지할 때, 예를 들어 두 개의 폴리펩티드 각각의 한 위치를 동일한 아미노산 잔기가 차지할 때, 이 분자들은 그 위치에서 동일하다. 서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로, 이는 각각 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-45] 및 문헌[Altschul et al., (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center of Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 공개적으로 이용 가능하다.

항체 및 항원-결합 단편의 제조 및 정제 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 인간 프레임워크 영역(FR)을 비 인간 유래 CDR 영역에 도입하도록 유전자 조작된다. 인간 FR 생식세포주 서열은 IMGT 인간 항체 가변 영역 생식세포주 유전자 데이터베이스를 비교함으로써, 웹사이트 http://imgt.cines.fr을 통해 ImMunoGeneTics(IMGT)의 MOE 소프트웨어를 이용함으로써, 또는 문헌[The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351]로부터 입수할 수 있다.

본 발명의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 종래의 방법에 의해 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열을 클로닝하여 GS 발현 벡터 내로 재조합할 수 있다. 그런 다음, 재조합된 면역글로불린 발현 벡터를 CHO 세포에 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 당해 분야에 잘 알려진 더욱 권장되는 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은 전형적으로 Fc 영역의 고도로 보존된 N 말단에서 항체의 글리코실화를 초래할 것이다. 안정한 클론은 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 항체의 발현을 통해 수득할 수 있다. 양성 클론은 생물 반응기에서 항체 생산을 위한 무혈청 배양 배지에서 증폭될 수 있다. 항체가 분비된 배양 배지는 종래의 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 조정된 완충액으로 평형화시킨 단백질 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼에 의해 정제를 편리하게 수행할 수 있다. 컬럼을 세척하여 비특이적 결합 성분을 제거한다. 결합된 항체를 pH 구배에 의해 용리시키고, 항체 단편을 SDS-PAGE로 검출한 다음, 수집한다. 일반 기술을 이용하여 항체를 여과하고 농축할 수 있다. 또한, 가용성 혼합물 및 다량체는 분자 체 또는 이온 교환을 포함한 일반 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 수득된 생성물은 즉시 예를 들어, -70℃에서 냉동될 수 있거나, 동결건조될 수 있다.

"투여" 및 "치료"는, 동물, 인간, 실험 대상, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체와 외인성 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물을 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는 예를 들어, 치료적, 약물동역학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약을 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라, 유체가 세포와 접촉하고 있는 경우 시약을 유체와 접촉시키는 것도 포함한다. "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단법, 결합 화합물에 의한, 또는 또 다른 세포에 의한, 예를 들어 세포의, 시험관 내(in vitro) 및 생체 외(ex vivo) 처리를 의미한다. "치료"는, 인간, 수의학, 또는 연구 대상에 적용되는 바와 같이, 연구 및 진단적 응용에 대한 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치를 지칭한다.

"치료하다"는 치료제, 예컨대, 본 발명의 임의의 결합 화합물을 포함하는 조성물을, 치료제가 공지된 치료적 활성을 갖는 하나 이상의 질병 증상을 나타내는 환자에게 체내로 또는 체외로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 치료제는 치료되는 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질병 증상을 완화시켜 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 이러한 증상의 퇴행을 유도하거나 이러한 증상의 진행을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. ("치료학적 유효량"으로도 지칭되는) 임의의 특정 질병 증상을 완화시키기에 효과적인 치료제의 양은 인자, 예컨대 환자의 질병 상태, 연령, 및 체중, 환자의 건강 상태, 행동, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설 속도, 약물 조합 등, 그리고 약물이 환자에서 원하는 반응을 유도하는 능력에 따라 다를 수 있다. 질병 증상이 완화되었는지는 의료진 또는 다른 숙련된 보건의료 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상적 측정에 의해 평가하여 그 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가할 수 있다. 본 발명의 구현예(예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)가 각각의 관심 질병 증상을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 스튜던트 t 검정, 카이 제곱 검정, 맨-휘트니에 따른 U 검정, 크루스칼 왈리스 검정(H 검정), 존키어-테르프스트라 검정 및 윌콕슨 검정과 같은 당해 분야에 공지된 임의의 통계적 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의미한 수의 환자에서 관심있는 표적 질병 증상을 완화시켜야 한다.

"유효량"은 의학적 상태의 증상 또는 징후를 개선하거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 용이하게하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의 대상체에 대한 유효량은 인자, 예컨대 치료될 상태, 환자의 일반적인 건강 상태, 투여 경로 및 용량 및 부작용의 중증도에 따라 다를 수 있다. 유효량은 현저한 부작용 또는 독성 효과를 막는 최대 용량 또는 투여 프로토콜일 수 있다.

"Tm 값"은 단백질의 열적 변성 온도, 즉 단백질의 절반이 풀리고 단백질의 공간 구조가 파괴되는 온도를 지칭한다. 따라서, Tm 값이 높을수록, 단백질의 열 안정성이 높을 것이다.

도 1: 인간화 항-LAG-3 항체는 SEB에 의해 활성화된 T 림프구로부터 IL-2 사이토카인의 분비를 증진시킨다. 결과는 인간화 LAG-3 항체 후보물질인 Hu229-013 및 Hu303-005가 활성화된 T 림프구로부터의 사이토카인 IL-2의 분비를 다양한 정도로 증진시켜, 약물 농도 따른 용량-효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.
도 2: U-87MG 종양 보유 마우스에서 종양 부피에 대한 인간화 항-LAG-3 항체의 효과. 결과는 투여 후 14일째에, LAG-3 항체 Hu229-013 6mpk 및 Hu303-005 6mpk 둘 다 종양 억제에 특정 영향을 미치며, 종양 억제율은 각각 27.25%(p<0.05) 및 34.94%(p<0.01)였고, 대조군과 비교하여 유의미한 차이가 있었음(hIGg 대비 p<0.001)을 보여준다.
도 3: 40℃에서 항체 Hu229-013의 CE 순도를 보여주는 경향도이다.
도 4: 40℃에서 항체 Hu229-013의 IEC 중성 피크를 보여주는 경향도이다.
도 5: 40℃에서 항체 Hu303-005의 비-환원 CE를 보여주는 경향도이다.
도 6: 40℃에서 항체 Hu303-005의 iCE 주요 피크를 보여주는 경향도이다.
도 7: Hu303-005의 진탕 SEC 결과를 보여주는 경향도이다.
도 8: 0℃에서 항체 Hu303-005의 IEC 및 40℃에서 이의 IEC 사이의 차이값을 보여주는 적합화 결과이다.
도 9: 0℃에서 항체 Hu303-005의 CE 순도 및 40℃에서 이의 CE 순도 사이의 차이값을 보여주는 적합화 그래프이다.
도 10: 25℃ 및 40℃에서 항체 Hu303-005 제형의 iCE/CE/DLS를 보여주는 적합 결과이다.

본 발명은 LAG3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 아세트산염 완충액 또는 히스티딘염, 수크로스 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 안정한 약학 조성물(제형)을 제공하며, 이 약학 조성물(제형)은 투여에 더욱 적합하다.

실시예

본 발명을 다음의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서, 특정 조건이 설명되지 않는 경우, 실험은 일반적으로 종래의 조건이나 물질 또는 제품 제조사가 제안한 조건 하에 수행된다. 시약 공급원이 명시적으로 제공되지 않은 경우, 시약은 상업적으로 이용 가능한 종래의 시약이다.

실시예 1. LAG-3 항원 및 항체의 제조

1. 단백질 설계 및 발현

UniProt 림프구 활성화 유전자 3 단백질(인간 LAG-3, UniProt: P18627)을 본원에서 LAG-3의 주형으로서 사용하였고, 검출에 사용되는 항원 및 단백질의 아미노산 서열을 설계하였으며, 선택적으로 상이한 라벨을 LAG-3 단백질에 융합한 다음, pHr 벡터(사내 생산함) 또는 pTT5 벡터(Biovector, Cat#: 102762) 또는 pTargeT 벡터(Promega, A1410) 내로 클로닝하였다. 본 발명의 항원 단백질 및 검출 단백질을 293 세포에서 일시적으로 발현시키거나 CHO-S에서 안정적으로 발현시켜, 정제하여 수득하였다. 다음의 LAG-3 항원은, 특별히 지시되지 않은 경우, 인간 LAG-3을 지칭한다.

Flag 태그가 있는 LAG-3 세포 외 도메인: 마우스의 면역화를 위한 LAG-3-Flag.

MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGDYKDDDDK

서열번호 1

비고: 밑줄 친 부분은 신호 펩티드를 나타내며, 이탤릭체 부분은 Flag-태그 서열을 지칭한다.

LAG-3의 전장: 마우스의 면역화 및 검출을 위하여 LAG-3을 과발현하는 세포주를 구축하는 데 사용됨.

MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL

서열번호 2

비고: 신호 펩티드 + 세포 외 영역 + 막관통 영역 + 세포 내 영역

LAG-3 세포 외 영역 및 hIgG1 Fc의 융합 단백질: 검출을 위한 LAG-3-Fc

MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGDDDDKGSGSGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 3

비고: 밑줄 친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이중으로 밑줄 친 부분은 링커를 나타내며, 이탤릭체 부분은 Fc를 나타낸다.

LAG-3 세포 외 영역 및 mIgG2a Fc의 융합 단백질: 검출을 위한 LAG-3-mFc

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서열번호 4

비고: 밑줄 친 부분은 신호 펩티드를 나타내고, 이중으로 밑줄 친 부분은 링커를 나타내며, 이탤릭체 부분은 mFc를 나타낸다.

2. LAG-3 관련 재조합 단백질, 하이브리도마 항체 및 재조합 항체의 정제

1). Flag 태그를 갖는 LAG-3-Flag 재조합 단백질의 정제 단계

샘플을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하고, 적절한 부피로 농축하였다. 그 후, 플래그 친화도 컬럼을 0.5 × PBS로 평형화시키고, 2-5배의 컬럼 부피로 세척하였다. 불순물을 제거한 후, 세포에 의해 발현된 상청액을 컬럼에 로딩하였다. A280 판독치가 기준선으로 감소될 때까지 컬럼을 0.5 × PBS로 세척하였다. 컬럼을 PBS로 세척하고, 불순물 단백질을 세척하여 제거한 다음, 표적 단백질을 수집하였다. 표적 단백질을 100 mM의 글리신(pH 3.0)으로 용리시키고, 추가 시험관 내 활성화 및 정제를 위해 수집하였다.

2). 하이브리도마, 재조합 항체 및 Fc 융합 단백질의 정제

세포에 의해 발현된 상청액을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하고, 하이브리도마에 의해 발현된 상청액을 단백질 G 컬럼에 의해 정제하고, 재조합 항체 및 Fc 융합 단백질 발현 상청액을 단백질 A 컬럼에 의해 정제하였다. A280 판독치가 기준선으로 감소될 때까지 컬럼을 PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 100 mM의 아세트산(pH 3.0)으로 용리시키고, 1 M 트리스(Tris)-HCl(pH 8.0)로 중화시켰다. 용리된 샘플을 적절하게 농축하고, PBS로 평형화시킨 겔 크로마토그래피 Superdex200(GE)을 이용하여 더 정제하고, 응집물을 나타내는 피크를 제외시키고, 샘플을 수집하고, 사용하기 위해 분취하였다.

실시예 2. 항-인간 LAG-3 하이브리도마 단일클론 항체의 제조

1. 면역화

항-인간 LAG-3 단일클론 항체를 마우스를 면역화하여 생성하였다. 6주령의 암컷 실험용 SJL 흰 마우스(Beijing Charles River Lab Animal Technology Co., Ltd., 동물 생산 면허 번호: SCXK (Beijing) 2012-0001). 급이 환경: SPF 수준. 마우스를 구입한 후, 12/12시간의 명암 주기, 20-25℃의 온도 및 40-60%의 습도의 실험실에서 1주일간 동물을 머물게 하였다. 환경에 적응시킨 마우스를 다음의 계획에 따라 면역화하였다. 면역 항원은 Flag 태그를 갖는 LAG-3의 세포 외 도메인(서열번호 1)이었다.

계획 A: 마우스를 TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma 카탈로그 번호: T2684) 및 Thermo Imject® Alum(Thremo 카탈로그 번호: 77161)으로 교차 면역시켰다. 항원 대 보조제(TiterMax® Gold Adjuvant)의 비율은 1:1이었고, 항원 대 보조제(Thermo Imject® Alum)의 비율은 3:1이었으며, 용량은 50 μg/마우스(1차 면역화) 및 25 μg/마우스(부스터 면역화)였다. 항원을 유화시킨 후, 마우스에 제0일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일 및 제42일에 접종하였다. 제0일에, 마우스당 50 μg의 유화시킨 항원을 마우스의 몇몇 부위에 피하(s.c.) 주사하였다. 제7일에, 마우스당 25 μg을 마우스에 복강 내(i.p.) 주사하였다. 제14일, 제28일, 제35일 및 제42일에, 등의 혹 및 복부의 부종 상태에 따라 항원을 등 또는 복강 내로 주사하는 것을 선택하였다. 제21일, 제35일, 제49일에 혈액 샘플을 채취하였고, 마우스 혈청 내 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 7회의 면역화 후, 비장세포 융합을 위하여 플랫폼이 되는 경향이 있는 더 높은 혈청 항체 역가를 가진 마우스를 선택하였다. 비장세포 융합 3일 전에 식염수로 제형화된 항원 용액을 마우스당 50 μg을 i.p. 주사하여 부스터 면역을 수행하였다.

계획 B: 마우스를 QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)로 면역시켰다. 항원 대 보조제의 비율은 1:1이었고, 25 μg/마우스(1차 면역화/부스터 면역화)였다. 항원 및 보조제를 신속하게 혼합하여 제0일, 제21일 및 제35일의 접종에 사용하였다. 제0일에, 마우스당 25 μg의 항원을 뒤쪽 종아리 근육(i.m.)을 통해 마우스에 주사하였다. 제21일 및 제35일에, 마우스당 25 μg의 주사를 같은 방식으로 반복하였다(세 번째 면역화의 수행 여부는 항체 역가에 따라 다름). 제28일 및 제42일에 혈액 샘플을 수집하였다. 마우스 혈청 내 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. 비장세포 융합을 위하여 플랫폼이 되는 경향이 있는 더 높은 혈청 항체 역가를 가진 마우스를 선택하였다. 비장세포 융합 3일 전에 식염수로 제형화된 항원 용액을 마우스당 50 μg을 i.p. 주사하여 부스터 면역을 수행하였다.

2. 비장세포 융합

최적화된 PEG 매개성 융합 절차를 이용하여 비장 림프구를 골수종 Sp2/0 세포(ATCC®CRL-8287^TM)와 융합시켜 하이브리도마 세포를 수득하였다. 수득된 융합 하이브리도마 세포를 완전 배지(20% FBS, 1 x HAT 및 1 x OPI를 함유하는 DMEM 배지)에 0.5-1 × 10⁶/ml의 밀도로 재현탁시키고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 100 μl를 시딩하였다. 37℃, 5% CO₂에서 3-4일 동안 항온처리한 후, 웰당 100 μl의 HAT 완전 배지를 보충하고, 배양을 3-4일 동안 유지시켜 바늘 모양의 클론을 형성하였다. 상청액을 제거하고, 웰당 200 μl의 HT 완전 배지(20% FBS, 1×HAT, 1×OPI를 함유하는 RPMI-1640 배지)를 추가하고, 5% CO₂, 37℃에서 3일 동안 배양한 다음, ELISA 분석에 의해 검출하였다.

3. 하이브리도마 세포의 스크리닝

하이브리도마 배양 상청액을 하이브리도마 세포의 성장 밀도에 따라 결합 ELISA에 의해 검출하였다. 결합 ELISA에 의해 검출된 양성 웰의 세포 상청액에 대해 세포 차단 실험을 수행하였다. 결합 및 차단 실험에 대하여 모두 양성인 세포를 증폭시키고, 신속히 동결보존하였으며, 단일의 세포 클론을 수득할 때까지 세포를 2 내지 3회 서브클로닝시켰다.

각각의 서브클로닝 절차 후, 세포를 대상으로 LAG-3 결합 ELISA 및 세포 차단 분석을 수행하였다. 위의 스크리닝 실험에 의해 하이브리도마 클론을 수득하고, 무혈청 세포 배양법에 의해 항체를 더 제조한 다음, 시험예에서의 사용을 위해 정제 실시예에 따라 정제하였다.

4. 양성 하이브리도마 클론의 시퀀싱

양성 하이브리도마의 서열을 클로닝하는 공정은 다음과 같다: 대수 성장기에서 하이브리도마 세포를 수집하고, 트리졸(Trizol)(Invitrogen 카탈로그 번호 15596-018)로 제조업체의 설명서에 따라 RNA를 추출한 다음, PrimeScript™ 역전사효소 키트(Takara, 카탈로그 번호 2680A)로 역전사를 수행하였다. 역전사에 의해 수득된 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Ig-Primer Set, Novagen, TB326 Rev.B 0503)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 시퀀싱 회사에서 시퀀싱을 수행하였다. 하이브라도마 클론 mAb229의 DNA 서열에 상응하는 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 서열번호 5, 6 및 서열번호 7, 8에 각각 제시하였다.

mAb229-VH

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTSVTVSS

서열번호 5

mAb229-VL

DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWITPWTFGGGTKLEIK

서열번호 6

mAb303-VH

EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCKASGYTLTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTAYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMEINSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGTGTTVTVSS

서열번호 7

mAb303-VL

DIQMTQSPSSLSASLGERVILTCRASQDIGSRLNWLQQGPDGTFKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDFSLTISSLESEDFVDYYCLQLASSPPTFGGGTKLEIK

서열번호 8.

[표 1]

각각의 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역 서열

수득된 양성 클론을 대상으로 인간 LAG-3에 대한 결합의 ELISA 분석(단백질 결합 활성에 대한 EC50 값의 결과를 표 2에 나타냄), 인간 LAG-3을 과발현하는 CHO-s 세포에 대한 결합의 ELISA 분석(세포 결합 활성에 대한 EC50 값의 결과를 표 2에 나타냄), 및 LAG-3 항원과 Daudi 세포 사이의 결합의 차단에 대한 분석(차단 활성에 대한 EC50 값의 결과를 표 2에 나타냄), 및 인간 LAG-3 단백질에 대한 친화도에 대한 분석(결과를 표 3에 나타냄)을 수행하였다.

[표 2]

쥣과 LAG-3 항체의 시험관 내 활성

[표 3]

쥣과 LAG-3 항체의 친화도

표 2에 나타낸 결과는 LAG-3 항체 mAb229 및 mAb303 모두 인간 LAG-3 단백질에 대하여 우수한 결합 활성을 나타냈음을 입증한다. LAG-3 항체 mAb229 및 mAb303은 또한 전장의 인간 LAG-3 단백질을 과발현하는 CHO-S 세포에 대하여 우수한 결합 활성을 보여주었다. LAG-3 항체 mAb229 및 mAb303 모두 인간 LAG-3 항원의 Daudi 세포와의 결합을 현저하게 차단하였다.

표 3에 나타낸 결과는 본 발명의 LAG-3 항체 mAb229 및 mAb303이 인간 LAG-3 단백질에 대하여 더 강한 결합 활성 및 친화도를 보여주었음을 입증한다.

실시예 3. 쥣과 항-인간 LAG-3 하이브리도마 단일클론 항체 mAb229의 인간화

MOE 소프트웨어에 대해 IMGT 인간 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식세포주 유전자 데이터베이스를 정렬시키는 것을 통해, mAb229에 대하여 높은 상동성을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식세포주 유전자를 주형으로서 선택하였고, 쥣과 항체로부터 유래된 CDR을 상응하는 인간 출처의 주형 내로 이식하여 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서의 가변 영역 서열을 형성하였다. 아미노산 잔기를 확인하고 Kabat 넘버링 시스템에 따라 주석을 달았다.

1. 하이브리도마 클론 mAb229의 인간화를 위한 프레임워크의 선택

쥣과 항체 mAb229를 인간화하기 위한 경쇄 주형은 IGKV1-39*01 및 hjk4.1이고, 인간화를 위한 중쇄 주형은 IGHV7-4-1*01 및 hjh6.1이며, 인간화 가변 영역의 서열은 다음과 같다:

Hu229VH-CDR 이식편

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT TSGMS WVRQAPGQGLEWMG WINTYSGVPTYADDFKG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR DNYDARDVYYYAMDY WGQGTTVTVSS

서열번호 21

Hu229VL-CDR 이식편

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASENIYSNLA WYQQKPGKAPKLLIY AATNLAD GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHFWITPWT FGGGTKVEIK

서열번호 22

비고: 순서는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4이고, 이탤릭체의 서열은 FR 서열을 나타내며, 밑줄 친 서열은 CDR 서열을 나타낸다.

2. 하이브리도마 클론 mAb229를 위한 주형 선택 및 복귀 돌연변이 설계에 대해서는 아래 표 4를 참조한다:

[표 4]

mAb229를 위한 주형 선택 및 복귀 돌연변이 설계

비고: 예를 들어, I48V는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 48번 위치에서 I로부터 V로의 복귀 돌연변이를 나타낸다. 이식됨은 쥣과 항체 CDR이 인간 생식세포주 FR 서열 내로 이식되었음을 나타낸다.

[표 5]

쥣과 항체 mAb229의 인간화를 위한 서열 조합

비고: 이 표는 상이한 돌연변이의 다양한 서열 조합을 보여준다. 예를 들어, Hu229-005는 두 개의 돌연변이(경쇄 HumAb229_VL.1A 및 중쇄 HumAb229_VH.1)가 인간화 쥣과 항체 Hu229-005에 존재함을 나타내며, 나머지는 동일한 방식으로 설명될 수 있다.

인간화 항체 mAb229의 서열은 다음과 같다:

Hu229VH.1(Hu229VH-CDR 이식편과 동일함)

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS

서열번호 21

Hu229VH.1A

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVRQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS

서열번호 23

Hu229VH.1B

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS

서열번호 24

Hu229VH.1C

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSS

서열번호 25

Hu229VL.1(Hu229VL-CDR 이식편과 동일함)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK

서열번호 22

Hu229VL.1A

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK

서열번호 26

Hu229VL.1B

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK

서열번호 27

Hu229VL.1C

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIK

서열번호 28

실시예 4. 쥣과 항-인간 LAG-3 하이브리도마 단일클론 항체 mAb303의 인간화

MOE 소프트웨어에 대해 IMGT 인간 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식세포주 유전자 데이터베이스를 정렬시키는 것을 통해, mAb303에 대하여 높은 상동성을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식세포주 유전자를 주형으로서 선택하였고, 쥣과 항체로부터 유래된 CDR을 상응하는 인간 출처의 주형 내로 이식하여 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서의 가변 영역 서열을 형성하였다. 아미노산 잔기를 확인하고, Kabat 넘버링 시스템에 따라 주석을 달았다.

1. 하이브리도마 클론 mAb303의 인간화를 위한 프레임워크의 선택

쥣과 항체 mAb303를 인간화하기 위한 경쇄 주형은 IGKV1-39*01 및 hjk4.1이고, 인간화를 위한 중쇄 주형은 IGHV1-3*01 및 hjh6.1이며, 인간화 가변 영역의 서열은 다음과 같다:

Hu303VH-CDR 이식편

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT DYYMN WVRQAPGQRLEWMG VINPYNGDTAYNQKFKG RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR DDGYYDYYFDV WGQGTTVTVSS

서열번호 29

Hu303VL-CDR 이식편

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGSRLN WYQQKPGKAPKLLIY ATSTLDS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC LQLASSPPT FGGGTKVEIK

서열번호 30

2. 하이브리도마 클론 mAb303의 주형 선택 및 복귀 돌연변이 설계에 대해서는 아래 표 6를 참조한다:

[표 6]

하이브리도마 클론 mAb303의 인간화를 위한 복귀 돌연변이

비고: 예를 들어, L46R은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 46번 위치에서 L로부터 R로의 복귀 돌연변이를 나타낸다. 이식됨은 쥣과 항체 CDR이 인간 생식세포주 FR 서열 내로 이식되었음을 나타낸다.

상이한 돌연변이의 서열 조합은 다음과 같다:

[표 7]

쥣과 항체 mAb303의 인간화를 위한 서열 조합

비고: 이 표는 상이한 돌연변이의 다양한 서열 조합을 보여준다. 예를 들어, Hu303-005는 두 개의 돌연변이(경쇄 HumAb303_VL.1A 및 중쇄 HumAb303_VH.1)가 인간화 쥣과 항체 Hu303-005에 존재함을 나타내며, 나머지는 동일한 방식으로 설명될 수 있다.

인간화 항체 mAb303의 서열은 다음과 같다:

Hu303_VH.1 (Hu303VH-CDR 이식편과 동일)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS

서열번호 29

Hu303_VH.1A

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS

서열번호 31

Hu303_VH.1B

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS

서열번호 32

Hu303_VH.1C

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTDYYMNWVRQAPGQRLEWIGVINPYNGDTAYNQKFKGRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSS

서열번호 33

Hu303_VL.1 (Hu303VL-CDR 이식편과 동일)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKLLIYATSTLDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

서열번호 30

Hu303_VL.1A

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSTLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

서열번호 34

Hu303_VL.1B

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

서열번호 35

Hu303_VL.1C

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGKAFKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

서열번호 36

Hu303_VL.1D

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQDIGSRLNWLQQKPGGAFKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIK

서열번호 37

실시예 5. 재조합 및 인간화 항체의 제조

항체를 각 가변 영역과 조합하여 인간 중쇄 IgG4/경쇄 카파로부터 유래된 불변 영역으로 구축하였고, IgG4 항체의 안정성을 증가시키기 위하여 Fc에 S228P 돌연변이를 만들었다. 당해 분야에 공지된 기타 돌연변이 또한 이의 성능을 증가시키는 데 사용될 수 있다.

중쇄 불변 영역:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호 38

경쇄 불변 영역:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 39

Hu229-013의 중쇄 아미노산 서열:

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTSGMSWVKQAPGQGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYYCARDNYDARDVYYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호 40

Hu229-013의 경쇄 아미노산 서열:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWITPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 41

Hu303-005의 중쇄 아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQRLEWMGVINPYNGDTAYNQKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYDYYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

서열번호 42

Hu303-005의 경쇄 아미노산 서열:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSTLDSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLASSPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 43

1. 재조합 항체의 분자 클로닝

가변 영역 코딩 유전자의 서열을 하이브리도마 스크리닝로부터 수득된 양성 항체 분자를 시퀀싱하여 수득하였다. 수득된 서열에 따라 프라이머를 설계하고, 시퀀싱 유전자를 주형으로 사용하고, 다양한 항체 VH/VK 유전자 단편을 PCR에 의해 구축한 다음, 상동 재조합에 의해 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 hIgG4/hkappa 불변 영역 (CH1-FC/CL) 단편을 가짐)을 이용하여 재구성하여 전장의 재조합 항체를 위한 발현 플라스미드 VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr을 구축하였다.

2. 인간화 항체의 분자 클로닝

설계된 인간화 항체 서열을 대상으로 코돈 최적화를 수행하였으며, 인간 코돈 선호도를 갖는 코딩 서열을 생성하였다. 프라이머를 설계하고, 항체의 다양한 VH/VK 유전자 단편을 PCR에 의해 구축한 다음, 상동 재조합에 의해 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 hIgG4/hkappa 불변 영역 (CH1-FC/CL) 단편을 가짐)을 이용하여 재구성하여 전장의 인간화 항체를 위한 발현 플라스미드 VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr을 구축하였다.

3. 재조합 및 인간화 항체의 발현 및 정제

항체 경쇄 및 중쇄의 분리된 발현을 위한 플라스미드로 HEK293E 세포를 1:1.2의 비율로 공동 형질감염시켰다. 6일 후에 발현 상청액을 수집하고, 고속 원심분리에 의해 불순물을 제거한 다음, 단백질A 컬럼에 의해 정제하였다. A280 판독치가 기준선으로 감소될 때까지 컬럼을 PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 산성 용리 완충액(pH 3.0-pH 3.5)으로 용리시키고, 1 M 트리스-HCl(pH 8.0-9.0)로 중화시켰다. 용리액을 적절하게 농축시키고, PBS로 평형화시킨 겔 크로마토그래피 Superdex200(GE)에 의해 더 정제하였다. 응집물을 나타내는 피크를 제외시키고, 단일 피크를 수집하고, 사용을 위하여 분취하였다.

본 발명의 항체의 성능 및 이점을 아래와 같은 생화학적 시험 방법으로 검증하였다.

실시예 6. 인간 LAG-3 단백질에 대한 LAG-3 항체의 결합에 대한 ELISA 분석

인간 LAG-3 단백질에 대한 항-LAG-3 항체의 결합 능력을 ELISA 분석에 의해 검출하였다. Fc 또는 mFc 태그를 갖는 LAG-3 융합 단백질을 미세적정 플레이트에 코팅된 항-Fc 또는 항-mFc 항체에 결합시킴으로써 96-웰 미세적정 플레이트에 고정시키고, 항체 추가 후 신호의 강도를 이용하여 LAG-3에 대한 항체의 결합 활성을 결정하였으며, 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.

염소 항-인간 Fc 항체(Jackson Immuno Research, 카탈로그 번호 109-005-008) 또는 염소 항-마우스 Fc 항체(Sigma, 카탈로그 번호 M3534-1ML)를 pH 7.4의 PBS 완충액(Sigma, 카탈로그 번호 P4417-100TAB)을 이용하여 2 μg/ml의 농도로 희석시키고, 50 μl/웰의 부피로 96-웰 플레이트에 첨가한 다음, 플레이트를 37℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 항온처리하였다. 액체를 버린 후, 플레이트를 PBS 중 5%의 탈지유(Bright Dairy, 탈지유 분말)를 함유하는 200 μl/웰의 차단 용액으로 차단하고, 37℃의 인큐베이터에서 2.5시간 동안 또는 4℃에서 밤새(16~18시간) 항온처리하였다. 차단 후, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05% 트윈-20을 함유하는 PH 7.4의 PBS)으로 5회 세척하였다. LAG-3-Fc 융합 단백질(서열번호 3, 사내 생산함) 또는 LAG-3-mFc 융합 단백질(서열번호 4, 사내 생산함)을 샘플 희석액(1%의 BSA를 함유하는 PH 7.4의 PBS)으로 1 μg/ml로 희석하고 각 웰에 50 μl/웰로 첨가하였다. 그런 다음, 플레이트를 37℃의 인큐베이터에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트의 반응 용액을 버리고, 플레이트를 PBST로 6회 세척한 다음, 샘플 희석액으로 희석된 50 μl/웰의 다양한 농도의 시험 대상 항체(하이브리도마 정제된 항체 또는 인간화 항체)를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 샘플 희석액으로 희석된 HRP-표지된 염소 항-마우스(Jackson Immuno Research, 카탈로그 번호 115-035-003) 또는 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, 카탈로그 번호 109-035-003) 100 μl/웰을 추가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 6회 세척한 후, 50 μl/웰의 TMB 발색 기질(KPL, 카탈로그 번호 52-00-03)을 각 웰에 추가하고, 실온에서 5-15분 동안 항온처리하고, 50 μl/웰의 1 M H₂SO₄를 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm의 파장에서 OD 값을 NOVOStar 마이크로플레이트 판독기로 판독한 다음, 인간 LAG-3에 대한 LAG-3 항체의 결합의 EC50 값을 계산하였다. 결과를 표 8에 나타내었다. 데이터는 본 발명에서 스크리닝 방법에 의해 수득된 모든 인간화 항체가 인간 LAG-3 단백질에 대하여 우수한 결합 활성을 나타냄을 보여주었다.

[표 8]

결합 분석에서 후보 항체의 EC50 값의 결정

실시예 7. 인간 LAG-3을 과발현하는 CHO-S 세포와 LAG-3 항체의 결합 분석

LAG-3 단백질을 과발현하는 CHO-S 세포에 대한 항-LAG-3 항체의 결합 능력을 결합 분석에 의해 검출하였다. 전장의 LAG-3 플라스미드(사내 생산됨, 서열번호 2)를 전기천공법에 의해 CHO-S 세포에 형질감염시키고, 스트레스 하에서 2주의 스크리닝 후 LAG-3의 발현 수준을 검출하였다. LAG-3을 과발현하는 세포를 96-웰 플레이트의 바닥에 고정시키고, 항체 첨가 후에 신호의 강도를 이용하여 LAG-3을 과발현하는 CHO-S 세포에 대한 항체의 결합 활성을 결정하였으며, 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.

100 μl/웰의 세포를 96-웰 플레이트에 4 × 10⁵/ml의 밀도로 시딩하고 밤새 항온처리하였다. 상청액을 버리고, 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 4%의 PFA(100 μl/웰)로 실온에서 30분 동안 고정시킨 다음, 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 액체를 버린 후, 플레이트를 PBS에 희석된 5%의 탈지유(Bright Dairy, 탈지유 분말)를 함유하는 200 μl/웰의 차단 용액으로 차단하고, 37℃에서 2.5시간 동안 항온처리하였다. 차단 후, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05% 트윈-20을 함유하는 PH 7.4의 PBS)으로 5회 세척하고, 샘플 희석액으로 희석시킨 50 μl/웰의 상이한 농도의 시험 대상 항체(하이브리도마 정제된 항체 또는 인간화 항체)를 첨가한 다음, 37℃의 인큐베이터에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 샘플 희석액에 희석된 HRP-표지된 염소 항-마우스(Jackson Immuno Research, 카탈로그 번호 115-035-003) 또는 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, 카탈로그 번호 109-035-003) 100 μl/웰을 추가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 6회 세척한 후, 50 μl의 TMB 발색 기질(KPL, 카탈로그 번호 52-00-03)을 각 웰에 추가하고, 실온에서 5~15분 동안 항온처리하고, 50 μl의 1 M H₂SO₄를 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm의 파장에서 OD 값을 NOVOStar 마이크로플레이트 판독기로 판독한 다음, LAG-3을 과발현하는 CHO-S 세포에 대한 LAG-3 항체의 결합의 EC50 값을 계산하였다.

실시예 8. Daudi 세포에 대한 LAG-3 항원의 결합을 차단하는데 있어서의 항-LAG-3 항체에 대한 분석

Daudi 세포(중국 과학원 세포 은행으로부터 구입한 인간 백혈병 세포)를 96-웰 플레이트에 3 × 10⁵/웰의 밀도로 시딩하였다. 1000 rpm에서 원심분리 후, 상청액을 버린 다음 플레이트를 4%의 PFA로 실온에서 30분 동안 고정시켰다. 고정 용액을 버린 후, 플레이트를 PBS로 4회 세척하고, 플레이트를 PBS에 희석된 5%의 탈지유(Bright Dairy, 탈지유 분말)를 함유하는 200 μl/웰의 차단 용액으로 차단하고, 37℃에서 2.5시간 동안 항온처리하였다. 차단 후, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05% 트윈-20을 함유하는 PH 7.4의 PBS)으로 5회 세척하고, 비오틴 표지된(비오틴 표지 키트, Dojindo Chemical, 카탈로그 번호 LK03) LAG-3-Fc 융합 단백질(사내 생산됨, 서열번호 3) 및 구배 농도의 시험 대상 항체의 혼합물 50 μl/웰을 첨가한 다음(이때, 비오틴 표지된 LAG-3-Fc 융합 단백질은 동일한 희석액(1% BSA를 함유하는 PH7.4의 PBS)으로 0.4 μg/ml의 최종 농도로 희석하고, 1시간 동안 사전 혼합함), 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 반응 용액을 버리고, 항온처리 후에 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 샘플 희석액으로 희석된 50 μl/웰의 HRP 표지된 스트렙타비딘(Sigma, 카탈로그 번호 S2438)을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후, 50 μl/웰의 TMB 발색 기질(KPL, 카탈로그 번호 52-00-03)을 각 웰에 추가하고, 실온에서 5~15분 동안 항온처리하고, 50 μl의 1 M H₂SO₄를 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm의 파장에서 OD 값을 NOVOStar 마이크로플레이트 판독기로 판독한 다음, Daudi 세포에 대한 항원의 결합을 차단하는데 있어서의 LAG-3 항체의 활성을 계산하였다. 결과를 표 9에 나타내었다. 데이터는 본 발명에서 스크리닝 방법에 의해 수득된 모든 인간화 항체가 Daudi 세포에 대한 인간 LAG-3 항원의 결합을 현저하게 차단함을 보여주었다.

[표 9]

차단 분석에서 후보 항체의 IC50 값의 결정

실시예 9. LAG-3 항체의 친화도에 대한 비아코어(BIAcore) 분석

1. 마우스 항-포획 항체를 마우스 항-포획 키트(Cat. #BR-1008-38, GE)의 설명서에서 제안된 방법에 따라 CM5 바이오칩(Cat. # BR-1000-12, GE)에 공유 결합시켜, 시험 대상 항체를 친화도를 통해 포획하였다. 그런 다음, LAG-3-Flag 항원(사내 생산됨, 서열번호 1)을 바이오칩의 표면을 통해 흘려 주고, 반응 신호를 비아코어 기기를 사용하여 실시간으로 검출하여 결합 및 해리 곡선을 획득하였으며, 친화도 값을 적합화에 의해 획득하였다. 위의 표 2 참조. 실험에서 각 해리 주기를 완료한 후, 마우스 항-포획 키트 내에 제공된 재생 용액으로 바이오칩을 세척하고 재생시켰다. 결과는 LAG-3 항체 mAb229 및 mAb303이 인간 LAG-3 단백질에 대하여 우수한 결합 활성 및 친화도를 보임을 입증한다.

2. 인간 항-포획 항체를 인간 항-포획 키트(Cat. #BR-1008-39, GE)의 설명서에서 제안된 방법에 따라 CM5 바이오칩(Cat. # BR-1000-12, GE)에 공유 결합시켜, 시험 대상 항체를 친화도를 통해 포획하였다. 그런 다음, LAG-3-Flag 항원(사내 생산됨, 서열번호 1)을 바이오칩의 표면을 통해 흘려 주고, 반응 신호를 비아코어 기기를 사용하여 실시간으로 검출하여 결합 및 해리 곡선을 획득하였으며, 친화도 값을 적합화에 의해 획득하였다. 아래 표 10 참조. 실험에서 각 해리 주기를 완료한 후, 인간 항-포획 키트 내에 제공된 재생 용액으로 바이오칩을 세척하고 재생시켰다. 결과는 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 항체가 인간 LAG-3 단백질에 대하여 우수한 결합 활성 및 친화도를 보임을 증명한다.

[표 10]

항-LAG-3 항체의 친화도

실시예 10. PBMC-T 림프구의 활성화

LAG-3 항체가 T 림프구를 활성화하는 데 미치는 영향을 연구하기 위하여, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수집하고 정제하였다. 황색포도구균 장독소 B(Staphylococcus aureus enterotoxin B, SEB)의 슈퍼-항원(super-antigen)으로 시험관 내에서 72시간 동안 자극시킨 후, IL-2 사이토카인의 분비 수준을 측정하였다. 실험 공정을 아래에 간략하게 설명한다:

갓 분리하고 정제한 PBMC를 96-웰 세포 배양 플레이트에 약 1 × 10⁵/웰의 세포 밀도로 시딩하고, 100 ng/ml의 SEB 슈퍼-항원 자극제를 첨가하고, 구배 희석된 항체 샘플(배지로 희석됨) 또는 블랭크 대조군으로서 배지를 동시에 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 항온처리하고, 세포 배양 상청액을 수집하였다. 배양 상청액 내 분비된 IL-2의 수준을 ELISA(BD, CAT # 550611)에 의해 측정하였다. 상세한 절차는 제조업체의 매뉴얼에 나타나 있다.

결과를 도 1에 나타내었다. 인간화 LAG-3 항체인 Hu229-013 및 Hu303-005 모두는 약물 농도에 의존적인 용량-효과로 활성화된 T 림프구에 의해 분비된 사이토카인 IL-2의 수준을 상이한 정도로 향상시킬 수 있다.

실시예 11. LAG-3 항체에 의한 피하 접종된 U-87MG 종양의 억제

이 연구에서는, 인간화 항 LAG-3 항체가 U-87 MG 종양 보유 마우스의 종양 부피에 미치는 영향을 측정하였다.

100 μl의 인간 신경교종 U87 MG 세포(3.5×10⁶ 세포)를 NOD-SCID 마우스(Changzhou Cavion Experimental Animal Co., Ltd.로부터 구입)의 오른쪽 늑골에 피하 접종하였다. 10 내지 14일 후에 종양이 40 mm³까지 자랐을 때, 체중 또는 종양 부피가 너무 크거나 적은 마우스를 제외하고 마우스를 무작위로 세 개의 군으로 나누었다: 종양 부피에 따라(군 나누기 및 용량은 표 11에 나타내었음), 이소형이 매치된 hIgG의 대조군, 인간화 LAG-3 후보 항체 Hu229-013의 군, 및 인간화 LAG-3 후보 항체 Hu303-005의 군(각 군당 8마리의 마우스, D0). CD3 항체에 의해 자극된 PBMC를 종양 조직 내로 5×10⁵ 세포/60 μl로 주사하였고, 시험 대상 항체의 주사는 1주일에 3회, 총 6회, i.p. 주사를 통해 시작하였다. 마우스를 1주일에 2회 종양 부피에 대해 측정하였고, 데이터를 기록하였다. 종양 부피(V)를 다음과 같이 계산하였다:

종양 부피(TV)=1/2×L_long×L_short ²,

각 군의 종양 부피를 평균 ± 표준 오차(평균 ± SEM)로 나타내고, Graphpad Prism 5 소프트웨어로 도표화하고, 이원 분산분석의 통계 분석으로 분석하였으며, 종양 억제율을 다음 식에 따라 계산하였다:

종양 증식율(T/C)(%) = (T-T₀/C-C₀) × 100%

종양 억제율(%) TGI = 1- T/C(%)

결과를 표 11 및 도 2에 나타내었다. 투여 14일 후에 LAG-3 항체 Hu229-013 6 mpk 및 Hu303-005 6 mpk 모두는 특정 항-종양 효과를 가지며, 종양 억제율은 각각 27.25%(p < 0.05) 및 34.94%(p < 0.01)였다. 대조군에 비해 유의한 차이가 있었다(hIGg 대비 p < 0.001).

[표 11]

마우스에 피하 접종된 U-87MG 종양에 미치는 인간화 항-LAG-3 항체의 영향

비고: D0: 최초 투여; 이원 분산분석에 의해 hIGg 대비 * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001.

실시예 12. 마우스에서의 인간화 항-LAG-3 항체 Hu229-013 및 Hu303-005의 PK 분석

18 g 내지 22 g의 18마리의 ICR 수컷 마우스를 Sippr-BK Lab Animal Co., Ltd.로부터 구입하였다. 급이 기간 동안, 마우스는 물과 식이에 자유롭게 접근할 수 있었으며, 마우스를 12/12시간의 명암 주기 조절와 함께 16~26℃의 온도 및 40~70%의 상대 습도의 실험실 환경에 3일 이상 적응시켰다. ICR 마우스에게 번호를 부여하고, 실험 하루 전날에 상이한 군(각 군당 3마리)으로 무작위로 나누었다. 실험 당일, 두 군의 마우스에는 인간화 후보 항체 (Hu229-013)를 각각 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량으로 정맥 내 주사하였다; 다른 두 군의 마우스에는 인간화 후보 항체 (Hu303-005)를 각각 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량으로 정맥 내 주사하였다. 정맥 내 주사의 용량은 20 ml/kg이었다.

혈액 샘플을 투여 후 15분, 8시간, 1일, 2일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일 및 35일의 시점에서 수집하였다. 매번 약 0.1 ml의 전혈을 항응고제 없이 원심분리관에 넣고, 4℃에서 30분간 둔 다음, 1000 g에서 15분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 EP관에 피펫팅하고, -80℃에서 보관하였다.

약물의 혈청 농도를 ELISA에 의해 측정하고, T1/2 및 다른 주요 파라미터를 Winnolin 소프트웨어에 의해 계산하였다. 주요 약물동력학적 파라미터를 표 12에 나타내었다:

[표 12]

마우스에서의 Hu229-013 및 Hu303-005의 약물동력학적 파라미터

마우스에서 인간화 LAG-3 항체인 Hu229-013 및 Hu303-005의 생체 내 노출은 유사하였고, 3 mg/kg 및 10 mg/kg의 용량에서 이들 두 항체의 노출량 및 피크 농도는 용량이 증가함에 따라 선형의 상관 관계가 있어, 선형의 약물동력학적 특징을 보여주었다.

항체 약학 조성물(제형)의 제조를 위한 예시적인 공정

단계 1: LAG-3 항체를 포함하는 제형의 모액(stock solution)을 0.22 μm의 PVDF 필터 사이로 통과시키고, 멸균 시험을 위해 여과액을 샘플링하고, 여과액을 수집한다.

단계 2: 로딩 부피를 5.3 ml로 조정하고, 여과액을 6 ml의 마개가 있는 바이알에 로딩하고; 로딩 절차의 시작시, 로딩 절차 중 및 종료시에 각각 샘플링하여 부피 차이를 검출한다.

단계 3: 캡핑기를 사용하여 알루미늄 캡을 캡핑한다.

단계 4: 부정확한 로딩과 같은 결함이 있는지를 확인하기 위하여 육안 검사를 수행한다. 라벨을 출력하고, 바이알에 라벨을 붙인다. 종이 트레이의 라벨을 인쇄하고, 종이 트레이를 접고, 바이알을 종이 트레이에 넣고, 라벨을 종이 트레이에 붙인다.

항체 약학 조성물의 제조를 위한 예시적인 공정

단계 1: Hu303-005를 포함하는 제형의 모액을 0.22 μm의 PVDF 필터 사이로 통과시키고, 멸균 시험을 위해 여과액을 샘플링하고, 여과액을 수집한다.

단계 2: 로딩 부피를 5.3 ml로 조정하고, 여과액을 20 ml의 바이알에 로딩하고, 바이알에 플러그 절반을 누르고, 모액을 동결건조하고, 고무 플러그로 바이알을 밀봉한다.

단계 3: 캡핑기를 사용하여 알루미늄 캡을 캡핑한다.

단계 4: 동결 중 붕괴와 같은 결함이 있는지를 확인하기 위하여 육안 검사를 수행한다. 라벨을 출력하고, 바이알에 라벨을 붙인다. 종이 트레이의 라벨을 인쇄하고, 종이 트레이를 접고, 바이알을 종이 트레이에 넣고, 라벨을 종이 트레이에 붙인다.

실시예 13. LAG-3 항체 제형을 위한 완충액 시스템의 스크리닝

LAG-3 항체 Hu229-013 또는 Hu303-005 제형을 pH 5.0~7.5의 일련의 10 mM 완충액에 50 mg/mL의 단백질 농도로 제조하였으며, 각 제형을 여과하고, 마개가 있는 바이알에 첨가하고, 바이알을 캡핑하고, 밀봉하였다. 샘플을 대상으로 40℃의 고온, 진탕과 같은 강제 분해 시험을 수행하고, 외관, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 비 환원 도데실 황산 나트륨(CE-SDS)-모세관 전기영동 및 이온 교환 크로마토그래피(IEC), 또는 모세관 등전점 포커싱 전기영동-전체 컬럼 영상화 검출(iCIEF)에 의해 평가하였다. 결과를 표 13-1 및 표 13-2에 나타내었고, 통계 분석 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.

[표 13-1]

Hu229-013 완충액 시스템에 대한 스크리닝 결과

비고: 0.01 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 첨가하여 진탕 D12 샘플을 제조하였고, 다른 샘플은 폴리소르베이트 80을 함유하지 않았다; D는 X일(day)을 나타낸다.

[표 13-2]

Hu303-005 완충액 시스템에 대한 스크리닝 결과

비고: D는 X일(day)을 나타낸다; N/A는 검출되지 않았음을 의미한다.

결과는 다음을 보여주었다:

(1) 항체 Hu229-013은 아세트산-아세트산 나트륨(AA) 시스템에서 최고의 외관을 나타내었고, 숙신산-숙신산 나트륨(SA) 및 히스티딘 염산(His-HCl) 시스템이 그 뒤를 이었다. 40℃ CE, IEC 순도는 아세트산-아세트산 나트륨(AA)(pH 5.5), 숙신산-숙신산 나트륨(SA)(pH 6.0), 시트르산-시트르산 나트륨(CA)(pH 6.0), 히스티딘 염산(His)(pH 6.0) 시스템에서 더 높았다. 외관 및 CE, IEC 결과를 고려하면, LAG-3 항체 Hu229-013은 AA(pH 5.5), SA(pH 6.0), His-HCl(pH 6.0) 시스템에서 상대적으로 안정적이었다. 도 3 및 도 4 참조.

(2) 항체 Hu303-005의 진탕 외관은 pH가 더 낮을 때 외관이 더 나았으며, 완충액 시스템 히스티딘-염산염(His-HCl) 및 아세트산-아세트산 나트륨(AA)이 우수하였음을 보여주었다. CE-SDS(비 환원) 및 iCIEF는 40℃에서의 가속화 조건 하에서 현저한 감소를 나타내며, 이때, CE-SDS 데이터는 pH 6.0이 우수하였으며, 완충액 시스템 아세트산-아세트산 나트륨, 히스티딘-염산(His-HCl) 및 인산염 시스템이 우수하였음을 보여주었다. iCE 데이터는 더 높은 pH에서 중성 피크가 덜 감소되었음을 보여주었다. 도 5 및 도 6 참조. 전반적인 고려 후 바람직한 완충액 시스템은 10 mM의 His-HCl(pH 6.0)이다.

실시예 14. LAG-3 항체 제형을 위한 보조제 스크리닝

(1) LAG-3 Hu229-013 제형을 아래에 나타낸 바와 같이, 다양한 농도의 계면활성제 및 당류로, 10 mM 숙신산-숙신산 나트륨 완충액(pH 6.0) 중에 50 mg/mL의 단백질 농도로 제조하였다. 결과를 표 14-1에 나타내었다.

1) 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 20(PS20)

2) 0.1 mg/mL의 폴리소르베이트 80(PS80)

3) 70 mg/mL의 수크로스

4) 70 mg/mL의 트레할로스

5) 50 mg/mL의 만니톨

6) 50 mg/mL의 소르비톨

(2) 항체 Hu303-005 제형을 아래에 나타낸 바와 같이, 다양한 농도의 계면활성제 및 당류로, 10 mM 아세트산(나트륨)(pH 5.5) 중에 50 mg/mL의 항체 농도로 제조하였다. 결과를 도 7 및 표 14-2에 나타내었다.

1) 75 mg/mL의 수크로스 +0.2 mg/mL의 PS80

2) 75 mg/mL의 트레할로스 +0.2 mg/mL의 PS80

3) 0.05 mg/mL의 폴리소르베이트 20(PS20)

4) 0.05 mg/mL의 폴리소르베이트 80(PS80)

5) 0.2 mg/mL의 PS20

6) 0.2 mg/mL의 PS80

7) 0.4 mg/mL의 PS20

8) 0.4 mg/mL의 PS80

각 제형을 여과하고, 마개가 있는 바이알에 첨가하고, 바이알을 캡핑하고 밀봉하였다. 샘플을 대상으로 40℃의 고온, 반복된 동결-해동, 진탕과 같은 강제 분해 시험을 수행하였다. 결과를 표 14 및 도 7에 나타내었다.

[표 14-1]

Hu229-013의 안정성에 미치는 상이한 보조제의 영향

비고: D는 X일(day)을 나타낸다.

[표 14-2]

Hu303-005의 안정성에 미치는 상이한 보조제의 영향

비고: D는 X일(day)을 나타낸다.

결과는 다음을 보여주었다:

(1) PS80 진탕군에서 항체 Hu229-013 제형의 외관이 PS20 진탕군에서보다 우수하였고; 1회 동결 및 해동 후, 소수의 입자가 수크로스군에서 나타났고, 다수의 입자가 트레할로스군에서 나타났으며; 다른 군들 사이에서는 차이가 없었다. 따라서, 보조제는 바람직하게는 폴리소르베이트 80 및 수크로스였다.

(2) 항체 Hu303-005 제형의 외관이 트레할로스군에서 약간 더 나았으나, SEC 결과는 수크로스군이 약간 더 나았음을 보여주었다. 전체적으로, 수크로스군과 트레할로스군 사이에 뚜렷한 차이는 없었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 외관 및 SEC 데이터는 PS80이 PS20보다 우수하고, 폴리소르베이트 함량의 증가가 외관 및 SEC 안정성을 현저히 개선할 수 있음을 보여주었다. 따라서, PS80이 바람직하며, PS 농도는 0.2 mg/ml을 초과해야 한다.

실시예 15. LAG-3 항체의 안정성 평가

(1) 60 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함하는 LAG-3 항체 Hu229-013 제형을 아래에 나타낸 바와 같이 다양한 완충액 중에 50 mg/mL의 단백질 농도로 제조하였다:

1) 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(AA)(pH 5.5);

2) 10 mM의 히스티딘-아세트산(His-AA)(pH 6.0);

3) 10 mM의 히스티딘-염산(His-HCl)(pH 6.0);

4) 10 mM의 숙신산-숙신산 나트륨(SA)(pH 6.0).

(2) 75 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/mL의 PS 80을 포함하는 Hu303-005 제형을 아래에 나타낸 바와 같이 다양한 완충액 중에 50 mg/mL의 단백질 함량으로 제조하였다:

1) 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(AA)(pH 5.5)

2) 10 mM의 히스티딘-염산(His-HCl)(pH 6.0)

3) 10 mM의 히스티딘-염산(His-HCl)(pH 6.5).

각 제형을 여과하고, 마개가 있는 바이알에 로딩하고, 바이알을 캡핑하고 밀봉하였다. 제조된 샘플을 25℃ 또는 4℃에 놓고 안정성을 관찰하였다. 검출 항목은 외관, SEC, IEC 또는 iCE, CE-SDS(비 환원)였다.

[표 15-1]

Hu229-013의 안정성 결과

비고: M3.5는 3.5개월을 의미함.

[표 15-2]

4℃에서 Hu303-005의 안정성 결과

비고: M은 개월을 나타내고, N/A는 불검출을 나타낸다.

결과는 다음을 보여주었다:

(1) LAG-3 항체 Hu229-013은 10 mM의 AA(pH 5.5), 10 mM의 His-AA(pH 6.0) 시스템에서 더 안정적이었다.

(2) 3개월 동안 4℃에 위치시킨 후, 항체 Hu303-005의 CE는 His-HCl(pH 6.5)군에서 약간 감소되었고, 항체의 iCE는 AA(pH 5.5) 및 His-HCl(pH 6.5)군에서 약간 변경되었으며, 항체는 His-HCl(pH 6.0)에서 가장 안정적이었다.

실시예 16. LAG-3 항체 제형의 최적화

완충액의 종류, pH 및 이온 강도를 더 최적화하기 위하여, 항체 Hu229-013의 농도를 50 mg/ml으로 설정하고, DOE 실험을 JMP 소프트웨어로 설계하였다. 일련의 제형을 RSM 모델을 이용하여 수득하였다. IEC, CE(비 환원) 및 미세유체 영상화(MFI)를 강제 분해 방법에서 평가 지수로 사용하였다. 최소제곱법에 의해 결과를 통계적으로 분석하였다. DOE 파라미터를 표 16에 나타내었다. 시험 제형 및 결과를 표 17 및 표 18에 나타내었다.

[표 16]

DOE 설계 인자 및 수준

[표 17]

Hu229-013를 위한 DOE 설계 제형

[표 18]

DOE 제형의 스크리닝 결과

비고: M1은 1개월을 의미하고, D는 X일(day)을 의미한다.

강제 분해에서 얻은 데이터를 대상으로 적합화를 수행하였고, 결과는 다음을 보여주었다: LAG-3 항체 Hu229-013은 10~30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(AA) 완충액 또는 히스티딘-아세트산 완충액(His-AA) 시스템, pH 5.2~5.8에서 양호한 안정성을 보여주었다. 바람직하게는, 완충액 시스템은 10~30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(AA), pH 5.5이다.

실시예 17. LAG-3 항체 제형의 안정성 시험

60 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함하는 LAG-3 Hu229-013 제형을 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5) 완충액에 60 mg/mL의 단백질 농도로 제조하였다.

제형을 여과하고, 마개가 있는 바이알에 첨가하고, 바이알을 캡핑하고 밀봉하였다. 제조된 샘플을 4℃에 놓고 안정성을 관찰하였다. 검출 항목은 외관, SEC, IEC, CE-SDS(비 환원)를 포함한다.

[표 19]

Hu229-013의 안정성 결과

결과는 Hu229-013 제형이 4℃에서 9개월 동안 이의 안정성을 보유하였음을 보여주었다.

실시예 18. LAG-3 항체 제형의 최적화

(1) Hu229-013 제형에 포함된 성분의 최적화

단백질, 수크로스 및 폴리소르베이트 80의 농도를 더 최적화하기 위하여, 완충액을 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5)로 설정하였다. DOE 실험 설계를 JMP 소프트웨어로 수행하였다. RSM 모델을 사용하여 일련의 제형을 수득하였고, IEC 및 CE(비 환원)를 강제 분해 방법에서 평가 지수로 사용하였다. 최소제곱법에 의해 결과를 통계적으로 분석하였다. DOE 파라미터를 표 20에 나타내었다. 시험 결과를 표 21에 나타내었다. 통계 분석 결과를 도 8, 도 9, 및 표 21에 나타내었다.

[표 20]

DOE 설계 인자 및 수준

[표 21]

DOE 설계 제형 및 스크리닝 결과

다양한 강제 분해로부터 얻은 데이터를 대상으로 적합화를 수행하였고, 결과는 다음과 같았다:

D0에서의 IEC 값과 40℃에서의 ICE 값 사이의 차이값을 대상으로 적합화를 수행하였다. R² > 0.98, P < 0.06으로, 모델은 유효하였고, 결과를 도 8에 나타내었다. D0에서의 CE 순도값과 40℃에서의 CE 순도값 사이의 차이값을 대상으로 적합화를 수행하였다. R² > 0.99, P < 0.05으로, 모델은 유효하였고, 결과를 도 9에 나타내었다. 40℃ IEC의 적합화 결과는 더욱 바람직한 제형이 40 내지 60 mg/ml의 단백질 농도, 30 내지 90 mg/ml의 당류 농도, 및 0.4 내지 0.5 mg/ml의 PS80 농도임을 보여주었다. 40℃ CE의 적합화 결과는 더욱 바람직한 제형이 50 내지 80 mg/ml의 단백질 농도, 30 내지 90 mg/ml의 당류 농도, 및 0.1 내지 0.5 mg/ml의 PS80 농도임을 보여주었다. 따라서, 가장 바람직한 범위는 50 내지 60 mg/ml의 단백질 농도, 30 내지 90 mg/ml의 수크로스 농도, 및 0.4 내지 0.5 mg/ml의 PS80 농도이다.

(2) Hu303-005 항체 제형에 포함된 성분의 최적화

수크로스 농도를 75 mg/ml로 설정하고, 10 mM의 His 완충액의 pH 값, 단백질 농도 및 폴리소르베이트 농도를 변수로서 사용하여 DOE 실험을 설계하였다. RSM 모델을 사용하여 일련의 제형을 수득하였다. 제형을 표 22에 나타내었다. iCIEF, CE(비 환원) 및 DLS를 강제 분해 방법에서 평가 지수로 사용하였다. 최소제곱법에 의해 결과를 통계적으로 분석하였다. 결과를 표 23 및 도 10에 나타내었다.

[표 22]

항체 Hu303-005 제형을 위한 DOE 제형의 스크리닝

[표 23]

Hu303-005 항체 제형의 DOE 제형의 스크리닝 결과

강제 분해로부터 얻은 데이터를 대상으로 적합화를 수행하였고, 25℃ 및 40℃에서의 iCIEF/CE/DLS 데이터를 대상으로 적합화를 잘 수행하였으며, 모델은 유효하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.

결과는 고온 하에서 pH의 증가가 입자 크기 및 중성 피크를 증가시킬 것임을 보여주었다. iCIEF의 변화율은 온도의 감소와 함께 둔화될 것이다. CE 데이터는 pH 6.0에서 가장 우수하였다. 이전의 실험 결과(10 mM His(pH 6.0)에서 더 안정적임)를 조합하여, 가장 바람직한 pH는 6.0인 것으로 결정된다; 40℃에서 얻은 CE 데이터는 45 내지 60 mg/ml의 단백질 농도가 더욱 바람직함을 나타내었으므로, 가장 바람직하게는 농도는 50 mg/ml이다; 다양한 조건 하에서의 단백질 안정성에 미치는 폴리소르베이트 농도의 영향을 보여주는 결과, 및 다른 실험에서의 폴리소르베이트 농도의 스크리닝 결과(0.2 mg/ml 초과의 농도가 더욱 바람직하였음)를 조합하여, PS80 농도는 0.3 mg/ml로 설정된다; 이 실시예 및 다른 실시예에서 Hu303-005 항체 액체 제형의 경우, iCIEF는 고온 조건에서 현저한 감소를 보여주었으며, 동결건조 제형으로 제형화되는 것이 고려된다. 동결건조 제형의 양호한 성형성 및 적합한 삼투압을 보장하기 위하여, 수크로스 농도는 75 mg/ml로 설정된다.

실시예 19. LAG-3 항체 제형의 동결건조

Hu303-005의 동결건조 제형을 75 mg/ml의 수크로스, 및 0.4 mg/ml의 PS80을 포함하는 10 mM의 히스티딘-염산, pH 5.5 또는 6.0에 50 mg/ml의 단백질 농도로 제조하였다. 동결건조 절차는 다음과 같았다:

[표 24]

동결건조 절차

샘플을 4℃ 및 25℃에 놓고 안정성을 관찰하였다. 다양한 시점에서 샘플을 취하고, 적절한 양의 주사용수로 재구성하였다. 결과를 표 25 및 표 26에 나타내었다. 결과는 25℃에서의 가속화 시험 중에, 4℃에서 M3 동안의 장기 보관 중에, Hu303-005 제형의 다양한 지수의 현저한 변화가 없었으며, 안정성이 양호하였음을 보여주었다.

[표 25]

4℃에서 Hu303-005 동결건조 제형의 안정성 결과

[표 26]

25℃에서 Hu303-005 동결건조 제형의 안정성 결과

동시에, 동결건조 항체 Hu229-013의 재구성 용액의 안정성을 결정하였다. LAG-3 항체 제형을 75 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하는, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨(pH 5.5) 중에 50 mg/ml의 단백질 농도로 제조하였다. 항체를 2 mL의 바이알에 1.1 mL/바이알로 채우고, 동결건조 상자에 위치시키고, 동결건조시켰다. 동결건조 전과 후에 샘플을 비교하여 안정성을 관찰하였다. 결과는 동결건조 전과 후에 항체 Hu229-013의 품질에 변화가 없었으며, 동결건조 제형은 저장 중에 양호한 안정성을 가졌음을 보여주었다.

실시예 20. 동결건조 공정의 파라미터의 최적화

50 mg/ml의 항체 Hu303-005, 10 mM의 히스티딘-염산(pH 6.0), 75 mg/ml의 수크로스 및 0.4 mg/ml의 PS80을 포함하는 제형을 제조하고 동결건조하였다. Hu303-005 붕괴가 일어난 온도는 동결건조 현미경으로 측정 시 약 -19℃였다. 1차 건조 온도는 동결건조 공정의 중요한 파라미터이다. 따라서, 1차 건조 공정 중 선반 온도를 조심스럽게 최적화하였다. 동결건조 파라미터를 표 27에 나타내었다. 그 결과를 표 28에 나타내었다. 각 온도에서의 동결건조 분말의 외관은 요건을 충족하였다. 그러나 -5℃에서 재구성 후 소수의 입자가 외관에서 나타났다. 따라서, 1차 건조를 위한 선반 온도를 -10℃로 설정하였다.

[표 27]

1차 건조 중의 선반 온도를 스크리닝하기 위한 동결건조 파라미터

[표 28]

상이한 공정에 의해 수득된 동결건조 샘플의 재구성 전과 후의 외관 비교

최종 동결건조 공정은 다음과 같았다:

[표 29]

동결건조 공정

^*1차 건조 및 2차 건조 시간은 구체적인 배치 및 압력 상승 시험에 따라 다르다.

실시예 21. 기타 대안적인 제형

본 발명은 또한 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 안정적인 약학 제형을 제공한다:

(1) 90 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 80 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 15 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.5;

(2) 90 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 80 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 15 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 6.5;

(3) 90 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 50 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 25 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.5;

(4) 70 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 50 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.5;

(5) 70 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 80 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 15 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.2;

(6) 40 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 75 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 6.0;

(7) 55 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 75 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.7;

(8) 30 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 70 mg/ml의 수크로스, 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.5;

(9) 20 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 70 mg/ml의 수크로스, 0.2 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.4;

(5) 15 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 85 mg/ml의 수크로스, 0.1 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 25 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.6;

(11) 50 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 85 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 25 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.8;

(12) 50 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 75 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 25 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 6.0;

(13) 55 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 90 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.3;

(14) 50 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu229-013, 90 mg/ml의 수크로스, 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 5.0;

(15) 90 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu303-005, 75 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 6.0;

(16) 90 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu303-005, 75 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 5.5;

(17) 75 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu303-005, 75 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 5.0;

(18) 1 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu303-005, 75 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 5 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 6.0;

(19) 70 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu303-005, 30 mg/ml의 수크로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 5 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 6.0;

(20) 50 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu303-005, 60 mg/ml의 트레할로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 6.0;

(21) 50 mg/ml의 LAG-3 항체 Hu303-005, 90 mg/ml의 트레할로스, 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80, 10 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 6.0.

<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD. SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> LAG-3 ANTIBODY PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF <130> P20-055-INP-GC <150> CN 201711408330.4 <151> 2017-12-22 <160> 43 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LAG-3 extracellular domain with a Flag tag: LAG-3-Flag <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(442) <400> 1 Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp 1 5 10 15 Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val 20 25 30 Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile 35 40 45 Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln 50 55 60 His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu 65 70 75 80 Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro 85 90 95 Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln 115 120 125 Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro 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(1)..(5) <223> mAb303 HCDR1 <400> 12 Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(17) <223> mAb303 HCDR2 <400> 13 Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <223> mAb303 HCD3 <400> 14 Asp Asp Gly Tyr Tyr Asp Tyr Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <223> mAb229 LCDR1 <400> 15 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(7) <223> mAb229 LCDR2 <400> 16 Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(9) <223> mAb229 LCDR3 <400> 17 Gln His Phe Trp Ile Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(11) <223> mAb303 LCDR1 <400> 18 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser 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Sequence <220> <223> Hu229VL.1C <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu303_VH.1 <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(120) <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg 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Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Ala Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu303_VL.1C <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Phe Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Ala Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu303_VL.1D <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Phe Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Ala Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region, S228P mutation <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(327) <400> 38 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kappa light chain constant region <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(107) <400> 39 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 40 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain amino acid sequence of Hu229-013 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(451) <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Tyr Asp Ala Arg Asp Val Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 130 135 140 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 195 200 205 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 210 215 220 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys 450 <210> 41 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain amino acid sequence of Hu229-013 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(214) <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ile Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 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Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 43 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain amino acid sequence of Hu303-005 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(214) <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Ala Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 완충액을 포함하는 약학 조성물로서,
완충액은 아세트산염 완충액, 히스티딘 완충액, 시트르산염 완충액, 숙신산염 완충액 및 트리스 완충액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
아세트산염 완충액은 아세트산-아세트산 나트륨 완충액으로부터 선택되고; 히스티딘 완충액은 히스티딘-염산 완충액 및 히스티딘-아세트산 완충액으로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 시트르산염 완충액은 시트르산-시트르산 나트륨 완충액이고; 숙신산염 완충액은 숙신산-숙신산 나트륨 완충액이고; 바람직하게는, 완충액은 히스티딘-염산 완충액, 또는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액인 것인, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 농도는 1 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 40 mg/ml 내지 60 mg/ml, 더욱 바람직하게는 50 mg/ml인 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
완충액은 약 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 약 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
완충액의 농도는 5 mM 내지 30 mM, 바람직하게는 10 mM 내지 30 mM인 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
보조제를 더 포함하며, 보조제는 당류 및 계면활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
제6항에 있어서,
당류는 이당류, 바람직하게는 트레할로스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨, 더욱 바람직하게는 수크로스인 것인, 약학 조성물.
제7항에 있어서,
수크로스의 농도는 30 mg/ml 내지 90 mg/ml, 바람직하게는 60 mg/ml 내지 90 mg/ml, 더욱 바람직하게는 75 mg/ml인 것인, 약학 조성물.
제6항에 있어서,
계면활성제는 폴리소르베이트이며, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 및 폴리소르베이트 20으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 폴리소르베이트 80인 것인, 약학 조성물.
제9항에 있어서,
계면활성제의 농도는 0.02 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 바람직하게는 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.3 mg/ml 내지 0.5 mg/ml인 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
다음의 i) 또는 ii)에 나타낸 성분:
i) (a) 1 mg/ml 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 및 (d) 0.02 mg/ml 내지 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80; 또는
ii) (a) 1 mg/ml 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 0.05 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하고,
바람직하게는, 약학 조성물은
(e) 40 mg/ml 내지 80 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (f) 10 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.2 내지 5.8, (g) 70 mg/ml 내지 80 mg/ml의 수크로스, 및 (h) 0.4 mg/ml 내지 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하거나; 또는
약학 조성물은
(e) 45 mg/ml 내지 60 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (f) 10 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.5 내지 6.0, (g) 60 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (h) 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화 LAG-3 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25 중 어느 하나에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 24 또는 서열번호 25에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고; 그리고
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 27 또는 서열번호 28 중 어느 하나에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 22, 서열번호 26, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 것인, 약학 조성물.
제12항에 있어서,
(a) 1 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산염 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.02 mg/ml 내지 0.8 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하며;
바람직하게는, 약학 조성물은
(e) 40 mg/ml 내지 80 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (f) 10 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.2 내지 5.8, (g) 70 mg/ml 내지 80 mg/ml의 수크로스, 및 (h) 0.4 mg/ml 내지 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하고;
더욱 바람직하게는, 약학 조성물은
(i) 약 50 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (j) 10 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.5, (k) 약 75 mg/ml의 수크로스, 및 (l) 약 0.4 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 약학 조성물.
제13항에 있어서,
인간화 LAG3 항체는 다음에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것인, 약학 조성물:
1) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;
2) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;
3) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역;
4) 서열번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역;
5) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;
6) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;
7) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역;
8) 서열번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역;
9) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;
10) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;
11) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역;
12) 서열번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역;
13) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;
14) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변 영역;
15) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 경쇄 가변 영역; 및
16) 서열번호 25의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 경쇄 가변 영역.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화 LAG-3 항체는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 바람직하게는 서열번호 38에 기재되어 있고, 경쇄 불변 영역은 바람직하게는 서열번호 39에 기재되어 있는 것인, 약학 조성물.
제15항에 있어서,
인간화 LAG-3 항체의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 40에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 40에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖고, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 41에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 41에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화 LAG-3 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33 중 어느 하나에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고; 그리고
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37 중 어느 하나에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 30, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 37에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 것인, 약학 조성물.
제17항에 있어서,
(a) 1 mg/ml 내지 90 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 5 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.0 내지 6.5, (c) 30 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 0.05 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하며;
바람직하게는, 약학 조성물은
(e) 45 mg/ml 내지 60 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (f) 약 10 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.5 내지 6.0, (g) 60 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (h) 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하고;
더욱 바람직하게는, 약학 조성물은
(i) 약 50 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (j) 10 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 6.0, (k) 약 75 mg/ml의 수크로스, (l) 약 0.3 mg/ml의 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인, 약학 조성물.
제18항에 있어서,
인간화 LAG3 항체는 다음에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것인, 약학 조성물:
1) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;
2) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;
3) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;
4) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역;
5) 서열번호 29의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역;
6) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;
7) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;
8) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;
9) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역;
10) 서열번호 31의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역;
11) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;
12) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;
13) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;
14) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역;
15) 서열번호 32의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역;
16) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변 영역;
17) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 34의 경쇄 가변 영역;
18) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 35의 경쇄 가변 영역;
19) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 36의 경쇄 가변 영역; 및
20) 서열번호 33의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 37의 경쇄 가변 영역.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화 LAG-3 항체는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 바람직하게는 서열번호 38에 기재되어 있고, 경쇄 불변 영역은 바람직하게는 서열번호 39에 기재되어 있는 것인, 약학 조성물.
제20항에 있어서,
인간화 LAG-3 항체의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 42에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 42에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖고, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 43에 기재되어 있거나, 또는 서열은 서열번호 43에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 제조 방법으로서,
LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 완충액과 혼합하는 단계를 포함하며, 완충액은 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, 히스티딘-염산 완충액, 시트르산-시트르산 나트륨 완충액, 숙신산-숙신산 나트륨 완충액 및 트리스 완충액으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, 또는 히스티딘-염산 완충액인 것인, 약학 조성물의 제조 방법.
LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 동결건조 제형의 제조 방법으로서,
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는 것인, 동결건조 제형의 제조 방법.
제23항에 있어서,
동결건조는 사전 동결 단계, 1차 건조 단계, 및 2차 건조 단계를 순서대로 포함하는 것인, 동결건조 제형의 제조 방법.
제24항에 있어서,
1차 건조는 -5℃ 내지 -20℃, 바람직하게는 -10℃의 온도에서 수행되는 것인, 동결건조 제형의 제조 방법.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 동결건조 제형.
LAG3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 동결건조 제형으로서,
동결건조 제형은 재구성되어 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 수득할 수 있는 것을 특징으로 하는, 동결건조 제형.
LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 재구성된 용액의 제조 방법으로서,
제26항 또는 제27항의 동결건조 제형을 재구성하는 단계를 포함하고, 재구성을 위한 용매는 바람직하게는 주사용수인 것인, 재구성된 용액의 제조 방법.
제28항의 방법에 의해 제조된 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 재구성된 용액.
제29항에 있어서,
다음의 성분을 포함하는 재구성된 용액:
i) (a) 40 mg/ml 내지 80 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM 내지 30 mM의 아세트산-아세트산 나트륨 완충액, pH 약 5.2 내지 5.8, (c) 70 mg/ml 내지 80 mg/ml의 수크로스, 및 (d) 0.4 mg/ml 내지 0.5 mg/ml의 폴리소르베이트 80; 또는
ii) (a) 45 mg/ml 내지 60 mg/ml의 LAG-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, (b) 10 mM 내지 30 mM의 히스티딘-염산 완충액, pH 약 5.5 내지 6.0, (c) 60 mg/ml 내지 90 mg/ml의 수크로스 또는 트레할로스, 및 (d) 0.2 mg/ml 내지 0.6 mg/ml의 폴리소르베이트 80.
약제로서의, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물 또는 제26항 또는 제27항에 따른 동결건조 제형 또는 제29항 또는 제30항에 따른 재구성된 용액.
LAG-3과 관련된 질병 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물, 또는 제26항 또는 제27항에 따른 동결건조 제형, 또는 제29항 또는 제30항에 따른 재구성된 용액의 용도로서,
질병 또는 상태는 병원성 T 세포를 수반하는 질병 또는 상태, 바람직하게는 암이고; 암은 난소암, 흑색종, 전립선암, 장암, 위암, 식도암, 유방암, 폐암, 신장암, 췌장암, 자궁암, 간암, 방광암, 자궁경부암, 구강암, 뇌암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 및 골수종, 만성 및 급성 백혈병을 포함하는 혈액 악성 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 용도.
LAG-3과 관련된 질병 또는 상태의 치료 및 예방 방법으로서,
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 약학 조성물 또는 제26항 또는 제27항에 따른 동결건조 제형, 또는 제29항 또는 제30항에 따른 재구성된 용액의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하며,
질병 또는 상태는 병원성 T 세포를 수반하는 질병 또는 상태, 바람직하게는 암이고; 암은 난소암, 흑색종, 전립선암, 장암, 위암, 식도암, 유방암, 폐암, 신장암, 췌장암, 자궁암, 간암, 방광암, 자궁경부암, 구강암, 뇌암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 및 골수종, 만성 및 급성 백혈병을 포함하는 혈액 악성 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, LAG-3과 관련된 질병 또는 상태의 치료 및 예방 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물 또는 제26항 또는 제27항에 따른 동결건조 제형 또는 제29항 또는 제30항에 따른 재구성된 용액을 포함하는 용기를 포함하는 물품.