KR20150059813A - 질환 표시자로서의 면역글로불린 절단 단편, 및 그의 검출 및 결합을 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로테아제의 정교화와 관련된 질환 과정을 탐지하기 위한 항체 조성물 및 이 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 시약은 그러한 단백질분해 절단의 결과인 IgG 분해 생성물을 평가하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 항원 결합성을 보유하지만 이펙터 기능을 손실한 IgG 분해 생성물에 면역특이적인 처리제의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 진단 및 예후 표시자와, 그의 검출을 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 환자에서 자연적 병력(natural history of disease)을 모니터하는 방법에 관한 것이다.
의학에서, 바이오마커는 질환의 진행 또는 치료의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있는 생화학적 물질, 즉 진단 또는 예후 표시자이다. 자연적 병력 및 질환 조절을 효과적으로 반영하는 한 가지 바이오마커는 당뇨병 환자에서 혈당 조절에 있어서의 헤모글로빈 A1c이다. 혈청에서 HbA1c의 긴 반감기로 인하여, HbA1c는 혈중 포도당이 이상적 수준에서 이탈한 최근의 기록 및 그러한 이탈의 지속기간의 최근 기록으로서의 역할을 한다. 전신성 염증 상태의 현재 사용되는 바이오마커는 C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP)이다 (문헌[Pepys MB et al. J. Clin. Invest. 111; 1805-1812, 2003]). CRP는 매우 다양한 급성 염증 상태에 응답하여 생성되는 급성기 반응물이다. CRP는 염증에서 먼 부위로부터 스스로 이동하는 TNF와 IL-6을 비롯한 사이토카인 시그널에 응답하여 간에서 합성된다. 혈청에서의 CRP의 증가가 감염, 뇌졸중, 혈관 질환, 심근경색 및 몇몇 다른 급성 염증성 질병에서 발생한다.
순환 면역글로불린, 및 특히 IgG 클래스의 항체들이 주요 혈청 단백질이다. 인간 프로테아제는 염증성 질환, 증식성 질환, 전이성 질환, 및 감염성 질환과 관련됨이 잘 알려져 있다. 인간 프로테아제, 예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinase, MMP) 및 호중구 엘라스타아제는, 세균 프로테아제, 예를 들어, 글루타밀 엔도펩티다아제 (스타필로코커스 아우레우스(Staph. aureus)) 또는 연쇄상구균(스트렙토코커스 피오제네스(Strep. pyogenes))의 면역글로불린 분해 효소가 하는 것처럼, 각 프로테아제에 독특한 잔기에서 IgG 중쇄 폴리펩티드를 절단한다. 상기 중쇄 내의 절단 부위는 경첩 도메인(hinge domain)으로 불리는 영역 주위에 밀집되어 있으며, 여기에서 두 중쇄의 사슬간 다이설파이드 결합이 나타난다. 경첩부 아래의 영역은 Fc 영역을 구성하며 IgG의 이펙터(effector) 기능에 책임이 있는 결합 부위를 포함한다. 미생물의 경우, 경첩부 아래의 절단에 의한 Fc 도메인의 단백질 분해적 방출이 그렇지 않으면 그 병리학적 세포의 표적화 및 사멸을 유도할 기능들을 효과적으로 중화시키는 한은, 프로테아제 발현은 유기체가 옵소닌작용(opsonization)을 피하도록 하는 잠재적인 부속 발병 경로이다(문헌[Rooijakkers et al. Microbes and Infection 7: 476-484, 2005]). 따라서, 특정 프로테아제의 정교화(elaboration)는 암, 염증 및 감염성 질환을 비롯한 수많은 질환 상태를 나타낼 수 있다.
그 IgG 분해는 절단된 경첩 도메인에 결합하는 천연 IgG 자가항체의 존재에 의해 입증되는 바와 같이 병리학적 생체내(in vivo) 환경에서 향상된다(문헌[Knight et al., 1995]; [Nasu et al., 1980]; 문헌[Persselin and Stevens, 1985], 문헌[Terness, et al. 1995 J Imunol. 154: 6446-6452]). 이들 자가항체는 또한 몇몇 프로테이나아제(파파인 및 펩신 포함)에 의해 생성된 Fab 및 F(ab')2 단편에 결합하며, F(ab')2 분자에서 C-말단 잔기로 남아 있는 하부 경첩 도메인에 특히 강한 반응성을 갖는다(문헌[Terness et al., 1995]). 실제 절단 산물의 검출이 보고되었으나 (문헌[Fick et al., 1985]; 문헌[Goldberg and Whitehouse. 1970]; 문헌[Waller, 1974]), 다양한 단편들의 신속한 제거에서 생기는 혈청 중의 낮은 농도로 인하여 또는 혈액 및 조직 중의 다량의 온전한 면역글로불린 중에서 당해 단편들을 검출함에 있어서의 기술적 문제로 인하여, 이들 단편이 바이오마커로서의 역할을 하도록 하는 확고한 분석법은 개발되지 않았다. 인간 호중구 엘라스타아제로 절단된 Fc 도메인의 검출을 위한 특이적 항체가 제조되었으며 (문헌[Eckle, et al. 1988. Adv. Exp. Med. Biol. 240: 531-534]), 이 항체는 류마티스 관절염 환자의 윤활액에서 0.62 ug/㎖의 중앙값 농도에서 Fc를 직접 검출하였으나 다른 유형의 관절 질환을 가진 환자로부터의 윤활액에서는 검출하지 못했다.
따라서, 대상의 체액 또는 혈액에서 IgG 절단 산물(들)의 유형 및 양을 평가하는 능력은 특정 질환 활성의 바이오마커로 사용될 수 있다. 그러한 결정을 위한 특정 시약 및 방법은 의학적 진단 및 예후 분석을 위한 유용한 도구를 제공할 것이다.
본 발명은 프로테아제의 정교화와 관련된 질환 과정을 탐지하기 위한 시약 및 시약의 용도에 관한 것이며, 이들 프로테아제는 질환 병리학의 표현일 뿐만 아니라 숙주의 면역학적 방어를 제한하는 약제(agent)이기도 하다.
본 발명의 일 태양에서, 본 시약 및 분석에서의 시약의 사용은 질환 병리학에 관련된 표적에 대해 특이적인 항-질환 항체를 검출한다. 본 시약은 그러한 단백질분해 절단의 결과인 IgG 분해 생성물을 평가하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 1) 생리적 조건 하에서 온전한 포유류 IgG에 비견되는 분자량을 가지며, 2) 변성이나 비-환원성인 조건 하에서 항원 결합 단편과 32 kDa 단편을 포함하는 두 단편으로 분리가능하며, 3) 시험관내(in vitro) 분석에서 ADCC 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 IgG 절단 산물의 검출에 관한 것이다. 본 발명의 IgG 절단 산물을 검출하는 방법의 일 태양에서는, 절단 산물을 검출할 수 있는 특이적 시약이 제공되며, 이 시약은 상기 절단 산물에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항체이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, IgG 절단 산물의 검출에 유용한 시약을 생성하기 위한 서열이 제공되며 이 서열은 본 발명의 항-IgG 절단 산물 시약의 선택, 패닝(panning), 및 면역화에 유용하다. 일 태양에서, 본 서열은 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단 측에 있는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 인간 IgG 경첩 영역 서열들로부터 선택된 적어도 5개의 연속 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 당해 서열은 서열 번호 5 내지 서열 번호 11의 서열 및 그의 N 말단 절단물로부터 선택된다. 다른 태양에서, 인간 IgG 분자의 단백질분해 절단 부위에 기반한 펩티드 면역원을 디자인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 항-IgG 절단 산물 항체의 재조합 생성을 위한 핵산 서열, 벡터, 및 숙주 세포를 비롯하여 본 발명의 항-IgG 절단 산물 항체의 제조 방법이 제공된다. 항-IgG 절단 산물 항체를 제조하는 방법의 다른 태양에서, 그 혈청이 본 발명의 항체의 공급원인 면역 숙주 동물이 제공되며, 그로부터의 시약이 개시된 방법 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 발명의 항-IgG 절단 산물 항체를 포함하는 항-IgG 절단 산물의 검출 키트가 제공된다.
본 발명의 추가 실시 형태는 IgG 절단 산물에 이펙터 기능을 복구시키기 위하여 특이적 항-IgG 절단 항체를 투여하여 환자를 치료하는 방법이다.
본 시약 및 분석에서의 시약의 사용은 질환 병리학에 관련된 표적에 대해 특이적인 항-질환 항체를 검출한다.
<도 1>
도 1은 경첩부에 대한 그들의 관계를 보여주는 전형적인 포유류 IgG 클래스 항체의 다양한 도메인들과, Fab, F(ab')2, 및 Fc로 정의된 펩신 및 파파인 절단 산물을 도시한다.
<도 2>
도 2는 37℃에서 1% (w/w)의 인간 MMP-3 (A), 연쇄상구균 IdeS (B), 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 I (C) 및 인간 호중구 엘라스타아제 (D)에 의한, 인간 IgG1κ 항체, Mab1의 각각의 프로테이나아제 분해 동안 4개의 개별적인 애질런트 바이오사이징(Agilent Biosizing) 모세관 전기영동 분석을 젤 이미지로 보여준다. 각 젤 상의 표준물(레인 1)은 온전한 인간/쥐과 키메라 IgG1 및 공지의 절단 단편에 해당한다.
<도 3>
도 3은 경첩 영역 주위의 인간 IgG1 중쇄의 서열을 보여주며; 주요 단백질분해 절단의 위치가 화살표로 표시된다.
<도 4>
도 4는 창상 삼출물에 의한 바이오티닐화된 쥐과/인간 IgG 분해의 시간 과정을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
<도 5>
도 5는 세 가지 상이한 프로테아제 MMP-3, V8, 및 IdeS에 의한 콘쥬게이션된 F(ab')2의 분해 생성물, TCPPCPAP, MMP-3 절단 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 14, TCPPCPAPE, 글루타밀 엔도펩티다아제 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 15, 및 TCPPCPAPELLG, IdeS 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 18로 면역화된 토끼에서 생성된 항혈청의 상대적 특이성을 보여주는 그래프이다. Mab3 IgG1κ의 F(ab')2 단편을 가진 세 가지의 개별적인 토끼 다클론 항-경첩 펩티드 항체 제제의 ELISA 반응성. F(ab')2 단편을 인간 재조합 MMP-3, 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 I 및 스트렙토코커스 피오제네스(Strep. pyogenes)로부터의 재조합 IdeS로 생성하였다. 혼합된 풀(pool)의 토끼 항체 제제는 Mab3 F(ab')2 단편 각각과 거의 동등한 반응성을 보여주었다. 막대는 세 개의 반복(replicate) 웰들의 평균 ± 표준 편차에 해당한다.
<도 6>
도 6은 항체 분해물을 이용한 토끼 다클론 항체 제제의 웨스턴 블롯 반응성을 보여준다. 온전한 Mab3 인간 IgG1 또는 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 또는 IdeS로 부분적으로 분해된 Mab3 인간 IgG1을 SDS-PAGE로 분리한 후 면역블롯팅하였다. (A) 항-인간 IgG (H+L) [레인 1-4] 또는 항…LLG 토끼 다클론 [레인 6-10]으로 블롯팅. (B) 항…PAP [레인 2-5] 또는 항…APE [레인7-10]로 블롯팅. 패널 A의 레인 5 및 패널 B의 레인 6까지 블롯을 절단한 후 항체를 이용하여 인큐베이션하여 개별 항혈청에 의한 검출을 허용하였다.
<도 7>
도 7은 5명의 RA 환자로부터의 윤활액에서의 IgG 분해 분석에 의해 샘플 상에서 RAH-1 시약을 이용하여 현상되고 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 및 IdeS를 이용한 단클론 IgG1의 시험관내 단백질분해 소화물로부터의 샘플과 비교한 웨스턴 블롯이다.
<도 8>
도 8은 다양한 단백질분해 절단 단편, 온전한 IgG, scIgG 및 F(ab')2의 시간에 따른 혈청 농도를 보여주며; 이는 생쥐 내로의 특정 정제 단편의 주사 후, 염소 항-인간 IgG (H+L)를 이용하여 측정하였다.
<도 9>
도 9는 정상 인간 혈청 샘플 군에서의 값과 비교한, 표시된 질환으로 진단된 환자들로부터의 인간 혈청 샘플에서 시약 RAH-1에 의해 검출된 scIgG의 개별 값들의 점 그래프이며 여기서 선은 각 군에서의 평균 값을 나타낸다.
<도 10>
도 10은 ELISA의 개선된 버전을 이용하여 시약 RAH-1로 검출한, 류마티스 관절염(RA)을 가진 10명의 개인 및 동일한 수의 건강한 정상 대조군의 희석된 혈청 중의 scIgG의 농도를 보여주며; RA 군에서 "(2)"는 두 명의 개별 개인에서 동일한 값이 얻어졌음을 나타낸다.
<도 11>
도 11은 펩티드 유사체로서 인간 IgG1 경첩부로부터의 절단 단편 및 특정된 잔기(도 3 참고)에서 종결되는 항체 단편을 표적화하는 토끼 단클론 항체의 상대적 반응성을 보여준다.
<도 12>
도 12는 펩티드 유사체를 절단하도록 제조된 토끼 다클론(rb poly)과 비교한, IgG1을 IdeS로 분해하여 생성된 F(ab')2에 보체-의존성 세포 용해(CDC)를 복구시킴에 있어서 인간 IgG1 경첩부의 절단 단편을 표적화하는 세 가지 상이한 토끼 단클론 항체의 농도 의존성을 보여준다.
도 1은 경첩부에 대한 그들의 관계를 보여주는 전형적인 포유류 IgG 클래스 항체의 다양한 도메인들과, Fab, F(ab')2, 및 Fc로 정의된 펩신 및 파파인 절단 산물을 도시한다.
<도 2>
도 2는 37℃에서 1% (w/w)의 인간 MMP-3 (A), 연쇄상구균 IdeS (B), 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 I (C) 및 인간 호중구 엘라스타아제 (D)에 의한, 인간 IgG1κ 항체, Mab1의 각각의 프로테이나아제 분해 동안 4개의 개별적인 애질런트 바이오사이징(Agilent Biosizing) 모세관 전기영동 분석을 젤 이미지로 보여준다. 각 젤 상의 표준물(레인 1)은 온전한 인간/쥐과 키메라 IgG1 및 공지의 절단 단편에 해당한다.
<도 3>
도 3은 경첩 영역 주위의 인간 IgG1 중쇄의 서열을 보여주며; 주요 단백질분해 절단의 위치가 화살표로 표시된다.
<도 4>
도 4는 창상 삼출물에 의한 바이오티닐화된 쥐과/인간 IgG 분해의 시간 과정을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
<도 5>
도 5는 세 가지 상이한 프로테아제 MMP-3, V8, 및 IdeS에 의한 콘쥬게이션된 F(ab')2의 분해 생성물, TCPPCPAP, MMP-3 절단 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 14, TCPPCPAPE, 글루타밀 엔도펩티다아제 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 15, 및 TCPPCPAPELLG, IdeS 부위에 해당하는 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 18로 면역화된 토끼에서 생성된 항혈청의 상대적 특이성을 보여주는 그래프이다. Mab3 IgG1κ의 F(ab')2 단편을 가진 세 가지의 개별적인 토끼 다클론 항-경첩 펩티드 항체 제제의 ELISA 반응성. F(ab')2 단편을 인간 재조합 MMP-3, 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 I 및 스트렙토코커스 피오제네스(Strep. pyogenes)로부터의 재조합 IdeS로 생성하였다. 혼합된 풀(pool)의 토끼 항체 제제는 Mab3 F(ab')2 단편 각각과 거의 동등한 반응성을 보여주었다. 막대는 세 개의 반복(replicate) 웰들의 평균 ± 표준 편차에 해당한다.
<도 6>
도 6은 항체 분해물을 이용한 토끼 다클론 항체 제제의 웨스턴 블롯 반응성을 보여준다. 온전한 Mab3 인간 IgG1 또는 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 또는 IdeS로 부분적으로 분해된 Mab3 인간 IgG1을 SDS-PAGE로 분리한 후 면역블롯팅하였다. (A) 항-인간 IgG (H+L) [레인 1-4] 또는 항…LLG 토끼 다클론 [레인 6-10]으로 블롯팅. (B) 항…PAP [레인 2-5] 또는 항…APE [레인7-10]로 블롯팅. 패널 A의 레인 5 및 패널 B의 레인 6까지 블롯을 절단한 후 항체를 이용하여 인큐베이션하여 개별 항혈청에 의한 검출을 허용하였다.
<도 7>
도 7은 5명의 RA 환자로부터의 윤활액에서의 IgG 분해 분석에 의해 샘플 상에서 RAH-1 시약을 이용하여 현상되고 MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8) 및 IdeS를 이용한 단클론 IgG1의 시험관내 단백질분해 소화물로부터의 샘플과 비교한 웨스턴 블롯이다.
<도 8>
도 8은 다양한 단백질분해 절단 단편, 온전한 IgG, scIgG 및 F(ab')2의 시간에 따른 혈청 농도를 보여주며; 이는 생쥐 내로의 특정 정제 단편의 주사 후, 염소 항-인간 IgG (H+L)를 이용하여 측정하였다.
<도 9>
도 9는 정상 인간 혈청 샘플 군에서의 값과 비교한, 표시된 질환으로 진단된 환자들로부터의 인간 혈청 샘플에서 시약 RAH-1에 의해 검출된 scIgG의 개별 값들의 점 그래프이며 여기서 선은 각 군에서의 평균 값을 나타낸다.
<도 10>
도 10은 ELISA의 개선된 버전을 이용하여 시약 RAH-1로 검출한, 류마티스 관절염(RA)을 가진 10명의 개인 및 동일한 수의 건강한 정상 대조군의 희석된 혈청 중의 scIgG의 농도를 보여주며; RA 군에서 "(2)"는 두 명의 개별 개인에서 동일한 값이 얻어졌음을 나타낸다.
<도 11>
도 11은 펩티드 유사체로서 인간 IgG1 경첩부로부터의 절단 단편 및 특정된 잔기(도 3 참고)에서 종결되는 항체 단편을 표적화하는 토끼 단클론 항체의 상대적 반응성을 보여준다.
<도 12>
도 12는 펩티드 유사체를 절단하도록 제조된 토끼 다클론(rb poly)과 비교한, IgG1을 IdeS로 분해하여 생성된 F(ab')2에 보체-의존성 세포 용해(CDC)를 복구시킴에 있어서 인간 IgG1 경첩부의 절단 단편을 표적화하는 세 가지 상이한 토끼 단클론 항체의 농도 의존성을 보여준다.
약어
Ab = 항체, ADCC =항체-의존성 세포-매개 세포독성; CDC =보체 유도된 세포독성; HNE =인간 호중구 엘라스타아제; IdeS = 에스. 피로제네스의 면역글로불린 분해 효소; Ig = 면역글로불린; Mab = 단클론 항체; MMP = 매트릭스 메탈로프로테이나아제; scIgG = 단일 절단 IgG; SA = 스트렙타비딘; V8 =스타필로코커스 아우레우스 유래의 글루타밀 엔도펩티다아제 I.
정의
항체 단편; Fab, F(ab')2, 및 Fc는 IgG 항체의 단백질분해 절단 산물을 설명하는 용어이며 이들은 중쇄 사이(코어 경첩 영역)의 다이설파이드 결합의 환원에 의해 추가로 해리될 수 있다. 전통적인 단백질분해에 의해 생성된 항체 단편은 하기를 포함한다: Fab (예를 들어, 파파인 분해에 의해), Fab' (예를 들어, 펩신 분해 및 부분적 환원에 의해) 및 F(ab')2 (예를 들어, 펩신 분해에 의해), facb (예를 들어, 플라스민 분해에 의해), pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의해), Fd (예를 들어, 펩신 분해, 부분적 환원 및 재응집에 의해)(여기서 환원은 사슬간 연결을 형성하는 시스테인 잔기 사이의 다이설파이드 결합을 제거한다(도 1 참고)). Fc 단편이 파파인 절단 단편으로 설명되었으며 파파인은 인간 IgG1을 잔기 224(EU 넘버링)에서 절단하며 이 잔기는 경첩부에 대해 N-말단이므로, Fc 단편은 경첩부 및 중쇄간의 다이설파이드 결합을 보유하는 것으로 가정되지만, 항체에서 중쇄 CH2-CH3 2량체 간의 고도의 회합으로 인하여, 2량체 구조는 다이설파이드 (경첩) 결합의 부재하에서도 보유된다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Fc"는 공유 결합되든지 그렇지 않든지 간에 중쇄 CH2-CH3 절편의 회합에 의해 형성된 2량체 구조를 말한다. 비공유적으로 회합된 Fc는 세제와 같은 변성제의 존재 하에서 CH2-CH3 단량체로 해리되는 그의 능력에 의해 다이설파이드 결합된 Fc로부터 구별될 수 있음이 이해될 것이다.
용어 "단백질분해", "단백질분해 절단", "프로테아제", 및 "단백질분해 효소"는 상호교환가능하게 사용되며, 폴리펩티드 사슬을 절단하여 둘 이상의 단편을 생산할 수 있는 약제, 예를 들어 효소를 의미하는데, 여기서 효소는 보통 온도 하에서 그리고 생리적 조건 또는 생리적으로 양립가능한 조건 하에서 작용한다. 생리적 조건은 건강한 상태이든지 병에 걸린 상태이든지 간에 살아있는 포유류의 신체에서 자연적으로 발견되는 임의의 온도, 완충물질, 양이온, 음이온, 기질, 촉매, pH, 보조인자 등을 포함한다. 그러나, 프로테아제는 임의의 유형의 생명 형태일 수 있는 병원체로부터와 같이 비-포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다.
"scIgG" 또는 "단일 절단 IgG"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 이종이량체 구조를 가진 임의의 면역글로불린 클래스 G 분자를 의미하며, 여기서 중쇄 중 하나는 단일 중쇄 상에서 단백질분해 절단된 한편 두 번째 중쇄는 온전하게 남아 있다.
N-말단 잔기로부터 C-말단 잔기로 씌어진 아미노산 서열과 관련하여 "상류(upstream)"는 주어진 잔기로부터 N-말단을 향한 서열 내 잔기를 의미한다. 역으로, 아미노산 서열과 관련하여 "하류(downstream)"는 주어진 잔기로부터 C-말단을 향한 서열 내 잔기를 의미한다.
하위구조(substructure)에 의한 항체 기능
일반적으로, 면역글로불린, 항체는 약 100개의 아미노산을 포함하는 연속적인 폴리펩티드 사슬의 영역들로 이루어지며 이는 특징적으로 접힌 구형 도메인(globular domain)을 보여주며 상이한 요소들의 구조를 나타낸다. 각각 100개의 아미노산의 영역은 약 10 내지 11 kDa인 구형 도메인을 나타낸다. 면역감마글로불린(IgG)의 경우, 이들 도메인은 절편들로 함께 그룹화되는데(grouped); Fab 절편은 중쇄 가변 영역과 인접한 중쇄 제1 불변 영역(CH1)에 다이설파이드 결합을 통해 연결된 단쇄 내의 경쇄 불변 영역에 연결된 경쇄 가변 영역으로 이루어지며; Fc는 경첩 영역에서 두 개 또는 세 개의 다이설파이드 결합을 통해 연결된 두 개의 인접한 중쇄 불변 영역 (CH2 및 CH3)으로 이루어진다. 연구에 의하면 파파인 및 펩신과 같은 프로테아제가 당해 절편들 사이에 있는 부위에서 우선적으로 항체를 절단함이 밝혀졌다. 두 개의 동일한 Fab 절편이 경첩 영역을 통해 하나의 Fc 절편에 연결되고, 그에 따라 Y형 형태의 150 kDa 구조를 형성한다(도 1 참고). 파파인을 이용하여 생성된 Fab 절편은 전형적으로 46 kDa의 분자량을 가지며, 비-환원된 F(ab')2는 전형적으로 90-100 kDa의 분자량을 가지며, 글리코실화되지 않고 비-환원된 Fc는 약 50-60 kDa의 겉보기 분자량을 가질 것이다. 그러나, 각각의 항체 종, 및 종 내의 항체의 각 하위클래스는 약간 상이하므로, 절단의 정확한 성질 및 위치와 절단 산물은 변화가 많다.
항원은 경쇄와 중쇄의 각 쌍의 가변성 도메인 내의 항원 결합 부위를 통해 항체에 결합한다(도 1). 이펙터 분자 또는 세포로 알려진 다른 분자는 분자의 나머지 내의 다른 부위, 즉, 항원 결합 부위 이외의 다른 부위에 결합하며, 항체의 이 부분은 보다 비가변성인 면역글로불린 서열인, 항체의 "불변 부분"을 포함하며, 그러한 부위는 특히 경쇄의 말단부를 넘어 연장하는 중쇄 부분으로 구성되는 Fc 영역 내에 위치한다.
항체는 이펙터 분자의 결합에 의해 매개되는 몇몇 이펙터 기능을 가진다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 항체에의 결합은 보체 시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌작용 및 용해(보체-매개 세포독성 또는 CDC로 불리는 과정)에서 중요하다. 보체의 활성화는 염증 응답을 촉진하며 또한 자가면역 과민성에 연루될 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위가 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (에타 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)을 비롯한 상이한 항체 클래스에 대해 특이적인 많은 Fc 수용체가 있다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에의 항체의 결합은, 항체-코팅된 입자의 탐식(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거(clearance), 킬러 세포(killer cell)에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 즉 ADCC로 불림), 염증 매개체의 방출, 태반 통과(placental transfer) 및 면역글로불린 생성의 조절을 비롯한 많은 중요하고 다양한 생물학적 응답을 일으킨다.
경첩 도메인 주위의 서열은 IgG 아이소타입(isotype) (서열 번호 1 내지 서열 번호 4) 사이에서 그리고 포유류 종 사이에서 일반적으로 보존된다. IgG1 (서열 번호 1) 및 IgG3 (서열 번호 1) 아이소타입은 Fcγ 수용체(들)에의 결합을 위한 그리고 Fc 이펙터 기능을 위한 구조적 모티프인 Leu-Leu 쌍을 포함한다. 전형적으로 두 개의 비-시스테인 잔기에 의해 분리된 시스테인을 적어도 포함하는 "경첩 코어"의 하류의 다른 잔기가 또한 보존된다.
본 출원인은 이종이량체 분자의 전체 조성을 파괴하지 않으면서, IgG를 포함하는 두 개의 중쇄 폴리펩티드 중 하나에서 단백질분해가 일어날 때, 인간 IgG1의 절단 산물인 scIgG가 인간 및 세균 프로테아제에 의해 형성됨을 발견하였다. 둘째, 본 출원인은 인간 중쇄 불변 영역-함유 IgG 분자에 대한 단백질분해 공격의 동력학적 분석을 통해, scIgG가 생체내 단백질분해의 보다 풍부한 생성물일 가능성이 높은 것으로 결정하였다. IgG의 단백질분해 동안 F(ab')2에 이르는 단백질분해 중간체로서의 scIgG의 존재는 이전에 MMP-3 효소에 대해 주목되었다(문헌[Gearing AJH et al, Immunol. Lett. 81: 41-48, 2002] ). 연쇄상구균 프로테아제, IdeS에 의한 IgG의 절단은 또한 크기-배제 크로마토그래피에 의해 온전한 IgG를 닮은 생성물을 생성함이 주목되었다(문헌[Vincents B et al, Biochemistry 43: 15540-15549, 2004]). 그러나, 이 중간체의 기능적 특성화는 보고되지 않았으며 생물학적 샘플에서 scIgG를 검출하는 방법도 제공되지 않았다.
본 출원인은 추가로 생체내에서 scIgG가 수 일 내지 수 개월의 기간에 걸친 질환 활성의 평가와 양립가능한 혈청 반감기를 나타내며, 그럼으로써 잠재적이거나 억제된 질환 과정의 마커로서 scIgG의 사용을 가능하게 하거나, 또는 최근의 자연적 이력 및 응답 또는 질환으로부터의 회복을 이해하기 위해 사용될 수 있음을 입증하였다.
요약하면, 본 출원인은 생리적 조건 하에서 단백질분해 절단의 동력학에 의하면 단백질분해적으로 절단된 IgG의 더 큰 비율이 F(ab')2와 같은 다중 절단 사건의 생성물인 종보다는 scIgG 형태로 됨을 발견하였다 (도 1 참고). 많은 프로테아제를 시험하는 과정에서, 온전한 IgG에서 중쇄 불변 영역의 첫 번째 절단이 두 번째보다 더 신속하게 진행되며, 이는 한 번 절단된 종의 일시적인 축적으로 귀결되는 것으로 결정되었다. 이러한 단일 절단 버전의 IgG 분자는 많은 방식(예를 들어 분자 크기, 항원 결합, 단백질 A/G에 의해 인식되는 능력)에서 그의 온전한 모분자와 구별될 수 없다.
본 발명에 따라 본 출원인은 F(ab')2 및 scIgG를 비롯한 단백질분해 절단 산물의 검출에 적합한 시약을 생성하였다. 본 발명의 절단 부위 유사 펩티드를 이용하여 생성된 본 발명의 시약은 인간 IgG1 절단 산물을 인식하지만 온전한 IgG는 인식하지 못한다.
본 출원인은 추가로 항원 결합 특이성을 보유한 IgG 절단 산물을 인식하는 항체가 절단된 IgG에 CDC 및 ADCC와 같은 이펙터 기능을 회복시킬 수 있음을 입증하였다.
단백질분해 효소 및 질환 관련성
본 출원인은 시험관 내에서 효소 패널을 이용하여 생성된 것들과 크기가 유사한, scIgG를 비롯한 항체 절단 산물이 류마티스 관절염을 가진 환자로부터의 윤활액과 같은 염증성 삼출물에서 검출가능함을 입증한다. 추가로, scIgG는 국소화된 단백질분해 활성이 당해 병리학의 공지 특징인 많은 질환을 가진 환자들의 혈청에서 검출될 수 있다. 이들 질환 상태에서 scIgG는 건강한 정상 지원자에서보다 농도가 더 높으며 또한 덜 중증인 염증성 질환을 가진 환자들의 혈청에서보다 더 높다.
scIgG의 검출은 경첩 다이설파이드에서 또는 그 주위에서 절단 중쇄 내의 새로 노출된 에피토프에 특이적으로 결합하지만 온전한 비-절단 IgG 분자와는 반응하지 않는 친화성-정제된 다클론 항체(토끼)의 생성에 의해 가능해졌다. 혈청 내의 scIgG의 검출의 확인은 온전한 IgG와 유사한 그의 연장된 순환 수명에 의해 지지된다. 병을 가진 개인의 체액 또는 혈액에서 scIgG를 검출하는 능력은 잠재적으로 신규한 바이오마커의 전략이다. 토끼 외의 다른 종의 항체 (예를 들어, 생쥐, 쥐, 및 낙타)가 사용될 수 있으며, 예를 들어 다클론 또는 단클론 항체가 인간 IgG1 절단 산물에 결합하는 능력을 보유하지만 온전한 IgG를 인식하지 못하는 특정한 항체 결합 영역 서열을 코딩하는 항체 유전자를 클로닝함으로써 생성된 단클론 항체가 본 발명의 시약으로 포함됨이 이해될 것이다. 예를 들어, 항체 도메인 라이브러리로부터 선발됨으로써, 항체를 생성하는 다른 방법이 당업자에게 잘 알려져 있으며 이는 본 발명의 항체의 공급원으로 사용될 수 있다.
항체 시약
본 발명의 항체는 본 발명의 실시에 유용한 항체를 증대시키거나 선발하기 위해 본 출원인이 디자인한 기준 및 면역원을 이용하여 당업계에 잘 알려진 몇몇 방식으로 제조될 수 있다.
일 태양에서, 항체는 관찰된 절단 단편 또는 그로부터 유도된 절단 부위 유사 펩티드로 동물을 면역화하여 제조된 하이브리도마로부터 편리하게 얻는다. 따라서, 항체는 F(ab')2 및 scIgG, 또는 그것의 N-말단 절단물 또는 구조적 유사체를 비롯한 항체 절단 단편으로 동물을 면역화하거나 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 일 실시 형태에서, 항체를 생성하기 위해 사용된 펩티드는 서열 번호 5 내지 서열 번호 11에 나타낸 IgG1의 14-머 펩티드 단편으로부터 선택되며, 여기서 폴리펩티드 또는 펩티드의 C-말단 잔기는 잔기 절단 쌍의 표 1에 나타낸 절단 부위의 상류(N-말단 측) 잔기를 나타낸다. 경첩 모티프, 예를 들어 IgG1의 -T-C-P-P-C- (서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 11)를 포함하는 단편은 시스테인 잔기(C)가 예를 들어 알라닌(A) 잔기로 대체되지 않았다면, 다이설파이드 결합 형성으로 인하여 다량체가 될 것이다.
구체적 실시 형태에서, 항체는 MMP-3 절단 부위의 아미노 말단 측 상의 아미노산 서열에 해당하는 8-머 펩티드(TCPPCPAP, 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 14), 또는 글루타밀 엔도펩티다아제 부위 (TCPPCPAPE, 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 15); 또는 IdeS 부위 (TCPPCPAPELLG, 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 18)에 해당하는 연장된 펩티드를 이용하여 생성된다. 면역원으로 사용될 경우, 당해 펩티드들은 N-말단을 통해 또는 부가된 링커 잔기 또는 펩티드를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) (KLH)에 공유 결합에 의해 편리하게 부착될 수 있다.
따라서 항체는 당업계에 잘 알려진 임의의 하이브리도마 기술을 이용하여 얻을 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참고하며, 이들 각각은 전체적으로 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 항체는 인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류, 또는 임의의 그 조합과 같은 그러나 이로 한정되지 않는 임의의 포유류를 포함하거나 이로부터 유래될 수 있으며 단리된 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화 및/또는 CDR-그래프팅된 항-인테그린 항체, 면역글로불린, 절단 산물 및 다른 특정 부분 및 그 변이체를 포함한다.
파지-디스플레이된(Phage-displayed) 항체 라이브러리가 또한 scIgG 및 다른 항체 단편에 원하는 특이성을 가진 신규 결합 도메인을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 유용한 항체 또는 다른 결합체를 증대시키거나 선발함에 있어서, 이 목적을 위해 사용되는 특정 시약이 본 발명의 추가 태양이다. 본 목적을 위해 개발된 특정 면역원 또는 시험 시약은 도 3에 나타낸 바와 같이 잔기 SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFP (서열 번호 1)를 포함하지만 이로 한정되지 않는, IgG1의 경첩 코어 주위의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다. 단백질분해 효소와 접촉시에 항체 단편을 생성하는 다른 인간 아이소타입 항체의 경첩 영역은 또한 효소적 절단 산물에 대한 항체 또는 다른 결합 분자를 생성, 선발 또는 시험할 목적을 위해 유사체의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 인간 IgG4 중쇄의 유사 영역은 잔기 TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPSCPA PEFLGGPSVF LF (서열 번호 2)를 포함하며 IgG2 및 IgG3에 대해서는 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 나타낸 바와 같다. 각각의 경우에서, 본 펩티드는 프로테아제 절단 부위의 아미노 말단 측에 있는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 인간 IgG 경첩 영역 서열로부터 선택된 적어도 5개의 연속 아미노산으로 이루어진다. 일 태양에서, 항체 생성을 위해 사용되는 특정 면역원 또는 펩티드는 잔기 -T-C-P-P-C-로 정의된, IgG1의 경첩 코어를 적어도 포함한다. 구체적 실시 형태에서, 당해 펩티드는 서열 TCPPCPAPELLG (서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 18)를 가진 인간 IgG1 하부 경첩 및 이웃한 CH2 도메인의 12-머 펩티드 유사체이다.
효소적 절단 산물에 대한 항체 또는 다른 결합 분자를 생성, 선발 또는 시험하는 데 유용한 펩티드 단편을 생성하는 일반적 방법은 a) 실시예 1에서 특정 프로테아제에 의해 예시되고 표 1에 나타낸 바와 같은 프로테아제에 의해 절단된 항체 중쇄의 잔기들 쌍의 N-말단 잔기를 확인하고, b) N-말단 잔기가 정의된 서열의 C-말단이 되는 그 절단 부위로부터 5-14 또는 그 이상의 상류의 잔기를 정의하고, c) 원하는 목적(들)에 충분한 양의 펩티드를 생성하는 것이다. 개시된 것들과 같은 펩티드는 서열 번호 5 내지 서열 번호 11 또는 그의 N-말단 절단물로부터 선택되는 것들이다. 펩티드는 결합을 시험할 목적을 위해, 또는 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 결합체를 선발하는 데 사용하기 위한 면역원 또는 패닝 표적으로서, 표지되거나, 콘쥬게이션되거나 또는 가교결합되거나 또는 다른 것과 또는 아쥬반트(adjuvant)와 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 일 태양에서, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 부분 또는 그 변이체를 포함하는, 전술한 특정 펩티드 또는 그에 대한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나, 이 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 본 발명에서 개시된 바와 같이 scIgG에 대해 특이성을 가진 적어도 하나의 단리된 단클론 항체를 코딩하는 단리된 핵산 및 이 단리된 핵산을 포함하는 핵산 벡터, 및/또는 이 단리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 선택적으로 이. 콜라이(E. Coli), COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 그의 임의의 유도체, 불멸화된 또는 형질전환된 세포로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 또한 본 발명의 적어도 하나의 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 시험관내, 생체내, 또는 원위치(in situ)의 조건 하에서 항체를 코딩하는 핵산을 번역시켜, 펩티드 또는 항체가 검출가능한 또는 회수가능한 양으로 발현되도록 하는 단계를 포함한다.
사용 방법
본 발명의 시약은 질환 과정이 단백질분해 활성 및 단백질분해 효소, 프로테아제를 자극하거나, 그 결과이거나, 그를 야기하거나, 또는 다르게는 그와 관련될 때 질환 병리학을 탐지하는 데 있어서 유용하다. 그러한 질환과 과정은 감염, 뇌졸중, 혈관 질환, 심근경색 및 몇몇 다른 급성 및 만성 염증성 질병을 촉발시키거나 악화시키거나, 이들 질환에 의해 생성되거나, 이들 질환에서 생기는 것들을 포함한다. 본 출원인은 단백질분해 활성의 특히 유용한 한 가지 바이오마커가 scIgG이며, 이것은 전술한 질병 중 일부에서 증가된 수준으로 검출됨을 입증하였다. scIgG는 병리학 또는 병리학적 과정 또는 감염의 부위에서 국소적으로 생성되므로, scIgG는 질환 부위에서 특정 조직 또는 세포 유형의 연루의 게이지로서 그러한 과정의 독특하고 특정한 마커를 제공한다.
본 발명의 방법의 일 실시 형태에서, 샘플은 프로테아제 수준 상승을 특징으로 하는 질환을 가진 것으로 의심되거나, 그 질환을 가졌거나, 또는 그 질환이 치료되었던 대상으로부터 얻어진다. 샘플은 질환에 의해 자극된 프로테아제와 혈청 IgG 집단 사이의 접촉에서 생기는 것으로 알려진 IgG 절단 단편에 대해 특이성을 가진, 항체 제제와 같은, 결합 약제와 접촉된다.
본 발명의 방법은 소정 질환 또는 상태로 이전에 진단된 환자가 질환의 진행 위험이 있는지(예를 들어, 암 전이, 공격적 종양 성장, 지속적 감염 등)를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 예를 들어, 암 환자에서, scIgG의 검출은 단백질분해 효소, 특히 MMP의 정교화를 포함하는 것으로 알려진 전이성 퍼짐을 포함하는 진전된 질환 진행을 나타내는 데 유용할 수 있다. 일부 태양에서, 신생물성 질환에서는 이들 기작이 일반적으로 염증 과정, 조직 복구, 및 치유와 공유된다(문헌[Coussens, L.M. and Werb, Z. 2002. Nature 420 (19): 860-867]). 다른 연구는 예를 들어, 지질 강하가 심장 및 혈관 사건, 예를 들어, 혈전증의 위험의 감소, 및 MMP-2 및 MMP-9와 같은 MMP의 감소 둘 모두와 상관이 있으며, 이들 효소는 동맥경화반(atherosclerotic plaque)에 의해 생성됨을 보여주었다(문헌[Deguchi, J, Maanori, A., Ching-Hsuan, T. et al. 2006 Circulation 114: 555-62]). 따라서, 본 발명의 방법은 특히 중증 관절염 증후군(RA, 강직성 척추염), 소정 암(특히 염증성 유방암), 중증 관상 동맥 세팅(coronary arterial setting)(심근 경색 및 울혈성 심부전) 및 천식과 같은 기타 질환을 가진 환자에게 적용가능하지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 방법은 병리생리학이 분비된 프로테아제의 향상된 수준 상승을 특징으로 하지 않는 다른 병리학에 의해 IgG에 작용할 수 있는 프로테아제를 포함하거나 이 프로테아제를 유도하거나 또는 프로테아제가 IgG를 절단하지 않는 질환 및 상태를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 개시된 시약을 사용하는 방법이 절단된 단편의 검출에 대해 특이적인 한편, 절단된 단편의 보다 특이적인 분석은 절단된 항체의 가변 영역의 결합 특이성의 분석을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 선택성과 단편화된 항체 검출을 조합하는 고체상 분석은 소정 항원 및 프로테아제가 대상에서 동시 국소화되는지를 결정하고 그럼으로써 단백질분해 활성 부위에서 조직, 질환, 또는 병리학의 성질에 관한 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
혈액 채취는 건강하거나 아픈 대상인 인간 또는 동물로부터의 조직 샘플링의 가장 빈번히 실시되는 형태이다. scIgG가 전신적으로 발견되며 형성 부위, 즉, 프로테아제 활성 부위로 제한되지 않는 한은, 그것은 특정 구획에 국소화될 수 있는 질환 활성에 대한 리포터 마커이다. 한 가지 그러한 구획이 윤활액이다. 따라서, 혈액 또는 혈청 수집물은 본 발명에 의해 제공되는 시약과 방법을 이용하여 초기 질환을 탐지하기 위한 편리하고 실현가능한 공급원을 제공한다. 대안적으로, RA 윤활액, 폐 삼출물, 생검체 등과 같은 국소적 세팅의 샘플링은 또한 진단을 포함하는 임의의 단계에서 환자에게 또는 진행된 질환을 가진 환자에서 적용될 수 있다. 절단된 항체 단편은 직접 염색(면역조직화학적 방법)에 의해 그러한 조직 샘플에서 또는 샘플로부터 유래된 분획화된 샘플에서 검출될 수 있다.
혈액을 비롯한 조직 샘플은 임의의 잔여 활성 프로테아제를 억제하도록 처리되어야 한다. 금속의 킬레이팅화(예를 들어 EDTA)는 효과적으로 MMP를 억제한다. 요오도아세트아미드는 시스테인 프로테아제(예를 들어 IdeS)를 차단하며, 세린 프로테아제는 DFP 및 유사한 화합물로 차단될 수 있다. 활성 프로테아제는 윤활액에 존재하며 그에 따라 처리되어야 한다. 샘플은 또한 분석 시간까지 동결된 채로 유지될 수 있다. 일단 샘플이 적절히 처리되면, 본 발명의 scIgG 특이적 시약은 당업자에게 공지되었거나 아직도 개발되어야 할, ELISA, 비드-기반 포맷, RIA와 같은 임의의 항체-기반 기술에서 이용될 수 있다.
본 발명의 항-IgG 단백질분해 절단 단편 시약은 연구 또는 진단 용도를 위해 그리고 완충액과 같은 다른 시약 및 온전한 인간 IgG 및 공지된 양의 절단된 IgG와 같은 표준물과 함께, 대상으로부터의 조직 샘플 수확물에서의 IgG 단백질분해 절단 단편의 측정 및 원할 경우 정량에 대한 설명서와 함께 상업적 판매를 위해, 키트로 패키징될 수 있다.
경첩 펩티드 절단 단편에 대해 면역특이적인 본 발명의 항체는 항원 결합 도메인을 보유한 효소적 절단 IgG의 나머지, 예를 들어 Fab, F(ab')2, scIgG에 결합할 수 있으며, 따라서 온전한 Fc-영역을 제공함으로써 Fc-관련 결합 특징 및 수반되는 이펙터 기능을 회복시킨다. 따라서, 본 명세서에서 교시된 방법에 의해 생성되거나 생체내에서 효소적으로 생성된 항체 단편에 결합하는 특성을 가진 항체는 치료용 분자로서 유용할 수 있다. 본 발명의 항-IgG 절단 단편 항체는 환자 - 여기서, 질환은 IgG의 질환 유도된 단백질분해 절단을 특징으로 함 - 를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 태양에서, 항-IgG 절단 단편 항체는 표적 특이적 결합 능력을 보유한 항체 단편에 이펙터 기능을 회복시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명을 일반적으로 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태가 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.
실시예 1: 인간 IgG 중쇄의 절단 분석
매트릭스 메탈로프로테이나아제, 카텝신, 인간 호중구 엘라스타아제(HNE), 및 선택된 병원체 효소, 예를 들어, 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 (V8 프로테아제), 및 연쇄상구균의 면역글로불린 분해 효소(IdeS)에 의한 인간 IgG 중쇄의 단백질분해를 연구하였다.
인간 IgG 중쇄를 포함하는 정제된 단클론 항체를 개시된 프로테아제와 접촉시키고 다양한 접촉 기간에 걸쳐 샘플링을 실시하였다. 샘플에서 단편화는 시험관내 바이오사이징을 위한 애질런트 마이크로플루이딕스(microfluidics) "랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)" 기술을 이용하여 평가하였다 (문헌[Goetz H et al. Biochemical and Biophysical Methods 60; 281-293, 2004]).
항체 기질. 단클론 항체는 완전한 인간 항체, 재조합 인간화 쥐과 항체 또는 인간/쥐과 키메라 항체 - 인간 불변 도메인과 IgG1카파 클래스/서브클래스 및 종의 경첩 영역을 보유함 - 였다: Mab1은 병원체에 결합하는 인간 IgG1이며, Mab2 (항-사이토카인)는 인간 불변 영역과 경첩 도메인을 보유한 인간/쥐과 키메라 IgG1 항체이며, Mab3은 CDR-그래프팅된 인간화 IgG1이다. 모든 항체는 카파 경쇄를 함유한다.
단백질분해 효소 및 시험 방법. 인간 프로-MMP-2, MMP-7 및 프로-MMP-9를 케미콘 인터내셔널(Chemicon International) (미국 캘리포니아주 테메큘라)로부터 입수하여 사용전에 16시간 동안 37℃에서 1 mM p-아미노페닐머큐릭 아세테이트 (APMA; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 칼바이오켐(CalBiochem))를 이용하여 인큐베이션함으로써 활성화하였다 (문헌[March et. al., 1991]). 활성 재조합 인간 MMP-12는 알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 입수하였다. 재조합 MMP-1은 히데아키 나가세(Hideaki Nagase) 박사로부터의 관대한 선물이었다. 인간 프로-MMP-3은 경첩 및 헤모펙신 도메인 대신 히스티딘 태그를 이용하여 HEK 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 프로-MMP-3 변이체는 개시한 대로 25분 동안 55℃에서 인큐베이션하여 활성화시켰다 (문헌[Koklitis et al., 1991]). 카텝신 B, D, G, S 및 프로테이나아제 3은 아텐스 리서치 앤드 테크놀로지(Athens Research & Technology) (미국 조지아주 아텐스)로부터 입수하였다. 응고 효소 트롬빈, F.Xa, F.IXa, F.XIIa 및 칼레크레인, 및 플라스민 및 플라스미노겐은 엔자임 리서치 래보러토리즈(Enzyme Research Laboratories) (미국 인디애나주 사우스 벤드)로부터 구매하였다. 조직 플라스미노겐 활성자(액티바아제(Activase))는 제넨테크(Genentech) (미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)의 제품이었다. 스트렙토키나아제 및 활성화된 단백질 C는 시그마(Sigma) (미국 미주리주 세인트루이스)로부터 입수하였다. 스타필로키나아제는 어피니티 바이오리에이전츠(Affinity BioReagents) (미국 콜로라도 골든)로부터 입수하였다. 스타필로코커스 아우레우스 V8 글루타밀 엔도펩티다아제 I은 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology) (미국 일리노이주 록빌)로부터 입수하였다. 스트렙토코커스 피오제네스의 재조합 면역글로불린 분해 효소(IdeS)는 유니버시티 오브 룬트(스웨덴 룬트)의 라스 뵤르크(Lars Bjorck) 박사가 제공하였다.
정제된 IgG의 프로테이나아제 분해는 인산염 완충된 염수(PBS)에서 pH 7.5에서 실시하거나, 또는 메탈로프로테이나아제의 경우 37℃에서 트리스-완충된 염수의 완충액에서 실시하였다. 염화칼슘은 MMP-12에 대해서는 1 mM로 그리고 MMP-3에 대해서는 10 mM로 메탈로프로테이나아제 반응물에 포함시켰으며; 그렇지 않으면 첨가제를 사용하지 않았다. 항체 농도는 전형적으로 1 또는 2 ㎎/㎖이었으며 반응은 IgG에 대해 1% (w/w) 비로 효소를 첨가하여 시작하였다. 분취물 (10-20 ㎕)을 표시된 시간에 제거하고 20 mM EDTA (메탈로프로테이나아제 인큐베이션)로 또는 1 mM 요오도아세트아미드(시스테인 프로테이나아제)로 조정하거나, 신속히 동결함으로써 반응을 중단시켰다.
IgG1 경첩부 내의 주요 단백질분해 절단 위치를 정제된 Fc 단편(MMP-3 및 MMP-12)의 N-말단 서열결정 및/또는 정제된 Fab (호중구 엘라스타아제, 플라스민) 및 F(ab')2 (카텝신 G, 글루타밀 엔도펩티다아제 및 IdeS) 단편의 고해상도 질량 분광 분석에 의해 효소-생성 단편에 대해 확인하였다. 단편화는 애질런트 마이크로플루이딕스 "랩-온-어-칩" 기술을 이용하여 평가하였다.
결과. 조사한 프로테이나아제 목록 및 인간 IgG1의 단백질분해 절단의 주요 생성물의 분석 결과가 표 1에 제시된다. 몇몇 효소는 사용된 조건 하에서 IgG1을 단편화시키지 않았다. 활성 프로테이나아제 중에서, 개시된 조건 하에서의 상대적인 비활성은 하기와 같았다: IdeS > MMP-12 > MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 > 호중구 엘라스타아제 > 카텝신 G, 플라스민 > MMP-2, MMP-9 > MMP-7.
도 2는 단백질분해 효소 처리 전 및 처리 동안 IgG의 바이오사이징 분석을 도시한다. MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 I 및 IdeS는 각각 단계적 방식으로 IgG1을 절단하는 것으로 관찰되었다 (각각 도 2A, 2B 및 2C). 각각의 경우에, 약 135,000 Da의 초기 중간체가 생성되었으며 이것은 그 후 약 100,000 Da의 종으로 전환되었다. 아마도 Fc 단량체인, 약 35 kDa의 단편 또한 이들 반응 동안 형성되었다. 젤 이동에 의해 측정한 분자량 (35 kDa)은 211 내지 215 잔기인 중쇄 단편 아미노산 서열(중쇄의 C-말단의 잔기 232와 237 사이 내지 447번째 잔기)에 의해 예상된 것보다 크지만 CH2 도메인 내의 당화(glycosylation) 부위를 함유한 단편과 일치하였다. 온전한 IgG (160,000 Da)의 사라짐은 MMP-3 및 글루타밀 엔도펩티다아제 I에서는 몇 시간의 기간에 걸쳐 일어났으며, 이들 조건 하에서 IdeS에서는 일분 이하 내에 일어났다. 모든 분해는 개시한 바와 같이 비견되는 조건 하에서 실시하였다.
135 kDa 중간체는 하부 경첩 도메인에서 중쇄 중 하나에서 단일 단백질분해 절단으로부터 생성되는 것으로 밝혀졌다. 비-변성 조건 하에서, 중간체는 크기 배제 크로마토그래피에서의 이동과 같이, 소정의 물리적 특성 면에서 온전한 IgG와 구별할 수 없다(데이터는 나타내지 않음). 그러나 SDS 젤에서, 그리고 본 발명의 모세관 전기영동 시스템에서, Fc 영역의 절단 단편(중쇄의 CH2-CH3 도메인)은 당해 구조의 나머지로부터 분리되어 감소된 크기의 중간체를 보여준다(135 kDa). 이 종의 크기는 기어링(Gearing) (2002 상기)에 의해 보고된 단일 절단 IgG와 일치한다. IgG1과 세 가지 효소의 인큐베이션을 연장하면 scIgG 중간체가 F(ab')2 단편과 Fc로 전환되었다.
시험된 상이한 단클론 IgG1-기반 기질이 IgG1을 절단하는 능력을 나타내는 효소들 중에서, 단일-절단 중간체로의 초기 절단이 상대적으로 신속하며, F(ab')2 로의 두번째 절단이 발생하는 데는 연장된 시간이 필요하다는 일관된 발견이 있었다. 인간 호중구 엘라스타아제(HNE)를 이용한 Mab1의 분해가 또한 도 2D에 나타내어져 있다. HNE는 상부 경첩부에서 IgG를 절단하여 Fab 단편 및 상응하는 다이설파이드-연결된 Fc 2량체를 생성한다는 점에서 상기 세 효소와 상이하였다.
IgG1 경첩부 내의 주요 단백질분해 절단 위치는 정제된 Fc 단편 (MMP-3 및 MMP-12) 및/또는 정제된 Fab (호중구 엘라스타아제, 플라스민) 및 F(ab')2 (카텝신 G, 글루타밀 엔도펩티다아제 및 IdeS) 단편의 고해상도 질량 분광 분석에 대해 확인하였다. 인간 IgG1 경첩 영역의 아미노산 서열이 도 3에 제시되며, 이때 확인된 효소 절단 위치가 표시된다. 상부 경첩부를 절단하는 프로테이나아제를 이용하여 분해를 연장하면 두 개의 Fab 단편이 생성되었으며; 하부 경첩부(코어 경첩 다이설파이드 결합 아래)에서 절단하는 효소는 F(ab')2를 생성하였다.
효소 절단의 우세한 부위는 각각, F(ab')2 또는 Fc 단편 내의 카르복시- 및 아미노-말단 잔기 둘 모두의 분석에 기초하여 인간 MMP-3 및 -12, 인간 카텝신 G, 인간 HNE, 포도상구균 글루타밀 엔도펩티다아제 I 및 연쇄상구균 IdeS를 비롯한 각 효소에 대해 식별하거나 확인하였다(표 1). 연장된 인큐베이션 동안 일부 경우에 두 번째 절단 부위가 관찰되었으며(예를 들어 카텝신 G 및 HNE), 이들이 이들 효소 제제에서 소수의 프로테이나아제 오염의 결과인지 표시된 프로테이나아제에 있어서의 대안적인 절단 부위인지는 확실하지 않았다. IgG에서 MMP-12 및 HNE 절단 부위는 이전에는 보고되지 않았다. 다른 프로테이나아제의 경우, 확인된 주요 IgG 절단 위치는 이전에 보고된 결과와 일치하였다 (문헌[Chuba, 1994]; 문헌[Diemel et al., 2005]; 문헌[Gearing et al., 2002]; 문헌[Vincents et al., 2004]; 문헌[Yamaguchi et al., 1995]).
절단 위치는 효소들 간에 약간 다르며; 단백질분해는 각각 MMP-3, V8 및 IdeS에 있어서 프롤린-245, 글루탐산-246 및 글리신-249 뒤에 일어난다. 절단 위치에서의 이들 차이는 모세관 전기영동 바이오사이징 시스템(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))을 이용하여 검출가능한 분자량에 영향을 주지 않는다. MMP-3, V8 및 IdeS를 이용한 더 긴 인큐베이션 시간은 F(ab')2 단편으로의 완전한 전환을 허용한다. HNE에 의한 IgG1의 분해는 히스티딘 236에서 코어 경첩 다이설파이드 앞에서(시스테인 238 및 241) 절단하여 Fab 생성물 및 다이설파이드 연결된 Fc를 생성하므로 다른 프로테아제와 다르다 (도 2D 참고).
절단 부위는 EU 넘버링에 기초하며 도 3과, 인간 IgG1 클래스 항체의 Ser219 내지 Phe243을 포함하는 서열 번호 1에 나타낸 잔기에 관련된다. 몇몇 프로테이나아제는 경첩 도메인 아래에서 IgG1을 절단하였으며, 약간 상이한 길이의 F(ab')2 단편을 생성하였다 (Ala231 내지 Gly237에 걸침). 이 연구에서 특성화된 IgG-분해 프로테이나아제의 다수는 염증 부위에서(HNE, 카텝신 G, MMP-12), 종양 또는 창상-치유 환경에서(MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, 및 플라스민), 그리고 감염 부위에서 (글루타밀 엔도펩티다아제, IdeS) 발현되거나 풍부한 것으로 보고되었다 (문헌[Dollery et al., 2003]; 문헌[Kilian et al., 1996]; 문헌[Rooijakkers et al., 2005]; 문헌[Shonbeck et al., 1999]; 문헌[Shapiro, 1999]; 문헌[Sukhova et al., 1998]; 문헌[van Kempen et al., 2006]; 문헌[Vincents et al., 2004]). 많은 경우에, 특정 프로테이나아제의 세포외 발현이 주로 숙주 IgG에 대해 유도될 가능성은 낮으며; 오히려, 그들의 생성은 질환의 생리학과 관련된다 (예를 들어 종양 환경에서 매트릭스 메탈로프로테이나아제). 그럼에도 불구하고, 이들시험관내, 정제 효소/단클론 항체 분해 연구는 인간 IgG가 인간 질환에 잠재적 관련성을 가진 많은 프로테이나아제에 저항성이 아님을 나타냈다.
IgG1을 F(ab')2 (대부분)로 전환시킨 효소의 경우, 절단은 매우 특이적이며 자기 제한적이었다(Fc 도메인을 작은 펩티드로 감소시키는 펩신 분해와 다름). IdeS를 제외하고, 이들 세포외 프로테이나아제 대부분을 이용한 IgG1 절단 속도는 일반적으로 그 최적 조건 하에서(예를 들어, pH 4.0) 펩신을 이용하여 나타나는 것보다 느렸다. F(ab')2로의 단백질분해 단편화는 2단계 과정으로 단일-절단 중간체를 통해 진행하였다. IgG1의 단일-절단 중간체는 MMP-3을 이용한 (문헌[Gearing et al., 2002]) 그리고 IdeS를 이용한 (문헌[Vencents et al., 2004]) IgG의 분해 동안 가능한 중간체로서 이전에 제안되었다. 본 연구에서는, 단일-절단 중간체로의 첫 번째 절단이, F(ab')2를 생성하는 두 번째의 더 느린 절단에 비하여 상대적으로 신속하게 일어남이 일관되게 관찰되었다. 본 발명에서 보고된 연구는 IgG1에 집중되었으며 이는 IgG1이 인간 순환계에서 IgG의 주요 아이소타입이기 때문이다. 제한된 수의 다른 인간 아이소타입 실험을 실시하여 MMP-3 및 IdeS에 대한 상대적인 민감성을 결정하였다. 이들에서 IgG4는 민감성이 IgG1에 비견되는 한편, IgG2 및 IgG3은 이들 조건 하에서 더욱 저항성인 것으로 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음) IgA, IgM, IgE, IgD 분해의 비견되는 조사는 행해지지 않았다.
모든 정보는 표 1에 요약되며, 여기서 "응집 프로테이나아제"는 F.XIIa, FIXa, F.Xa, 트롬빈 및 활성화된 단백질 C를 포함하였으며; 플라스민은 플라스미노겐 활성자를 이용하여 공동 인큐베이션한 플라스미노겐이었으며; tPA, 스트렙토키나아제 및 스타필로키나아제; "플라스미노겐 활성자 단독"은 플라스미노겐이 없으며; 및 MMP는 활성 형태로서 또는 재료에서 상세히 설명된 프로-효소로서 얻은 재조합 프로테이나아제였으며; "없음"은 24시간 내에 검출가능한 절단이 없음을 나타낸다. 표시된 곳을 제외하고는 모든 효소는 인간 효소였다. 잔기 표기는 IgG1 항체 중쇄에 대한 EU 넘버링 시스템에 대한 것이며 여기서 서열 번호 1의 25개의 잔기들은 완전한 성숙 중쇄의 잔기 219 내지 243에 해당한다.
실시예 2: 염증성 삼출물에서 IgG의 절단
염증성 삼출물 및 다른 그러한 유체는 염증 및 창상 치유와 관련된 단백질분해 효소를 보유한 것으로 예상된다. 이 목적을 위하여, 창상 유체의 샘플을 에티콘 인크(Ethicon Inc)로부터 입수하였다.
먼저, 인간 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체 기질을 임의로 바이오티닐화시켰다. 10 마이크로리터의 바이오티닐화된 기질 항체를 190 마이크로리터의 창상 유체에 첨가하고 37℃에서 8-24 시간 동안 인큐베이션하였다. 특정 시간에서, 샘플을 제거하였다. 출발 IgG 및 다양한 시간으로부터의 샘플을 별도의 웰에서 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) 젤에 적용하고 SDS PAGE에 처하였다. 분리된 밴드를 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 0.1% 트윈(Tween) 20 및 10% 차단 등급 밀크("블로토(Blotto)")를 함유한 0.1 M 트리스 완충 염수로 차단한 후, 아비딘(AVIDIN)-D -서양고추냉이 퍼옥시다아제 시약 및 이어서 TMB(막) 기질을 이용하여 블롯을 현상시켰다.
도 4에 나타낸 젤 이미지에 의해 입증되는 바처럼, 8시간까지 온전한 IgG의 손실이 있었으며 F(ab')2 및 Fab 표준물과 크기가 유사한 밴드가 나타났다. 이 실험의 결과는 염증성 유체에서 효소에 의한 IgG의 단백질분해가 몇 시간의 기간에 걸쳐 일어나며 정제된 효소를 이용한 시험관내 단백질분해에 의해 생성되는 단편에 해당하는 단편을 생성함을 나타낸다.
실시예 3: 시약의 제조
내인성 프로테아제에 의해 생성된 숙주 (환자) 항체 단편의 존재의 결정은 절단된 IgG에 선택적으로 결합하지만 온전한 IgG에는 결합하지 않는 시약을 필요로 한다. 절단된 성분의 확인과, 정상 집단에 비교할 때 질환을 가진 환자로부터의 샘플들에서의 단편 함량 사이의 정량적 차이는 시약을 이용하여 평가될 수 있어야 한다.
미지의, 그러나 소량일 가능성이 있는, 상대적으로 고농도의 온전한 IgG를 함유한 용액 중의 IgG 단편을 검출하기는 어렵다. scIgG가 가능한 IgG 절단 단편으로 주목되었지만 (상기 문헌[Gearing 2002]), 인간 샘플에서의 정량화는 이전에 실시되지 않았다. 이 목적을 위하여, 온전한 IgG가 아닌 절단된 IgG에 대해 고도의 특이성을 가진, 필요한 특이성을 가진 시약을 토끼에서 생성시켰다.
3개의 콘쥬게이션된 그리고 점진적으로 더 긴, 인간 IgG1 경첩부의 단쇄 펩티드 유사체를 면역화를 위해 사용하였다(인비트로겐 코포레이션에서). MMP-3 절단 부위의 아미노 말단 측 상의 아미노산 서열에 해당하는 8-머 펩티드를 N-말단을 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 공유 결합에 의해 부착시켰다(TCPPCPAP, 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 14). 글루타밀 엔도펩티다아제 부위 (TCPPCPAPE, 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 15) 및 IdeS 부위 (TCPPCPAPELLG, 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 18)에 해당하는 연장된 펩티드를 면역원으로서 별도로 제조하였다. 뉴질랜드 토끼(면역원 당 2마리)를, 완전 프로인트 아쥬반트(complete Freund's adjuvant) 중의 0.2 ㎎의 콘쥬게이션된 펩티드를 피하 주사하여 면역화하고 14, 42 및 56일에 불완전 프로인트 아쥬반트 중의 0.1 ㎎ 항원으로 세 번 더 재부스팅하였다(reboosted). 혈청을 4, 8 및 10주에 수집하고 항체 정제를 위하여 면역원마다 풀링하였다(pooled). 면역 역가(immune titer)는 고체상 항원 펩티드에 기반한 ELISA에 의해 모니터하였다.
항체의 친화성 정제는 활성화된 지지체 상에 고정된 각각의 펩티드 항원을 이용하였다. 동일 항원으로 면역화된 두 토끼로부터의 항혈청을 풀링하고 항원 컬럼에 통과시킨 후 컬럼을 철저하게 세척하였다. 특이적 항체를 각각 3M KSCN 및 0.1M 글리신, pH 2.5를 이용하여 저 친화성 및 고 친화성 풀로 용출시켰다. 두 풀은 구별할 수 없는 결합 특징을 생성하였으며 이는 상호교환가능하게 사용하고/하거나 풀링하였다. 다음, 결합된 항체의 세 가지 별도 용출 풀을 두 번째 친화성 흡착 단계 - 이번에는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(Mab3)을 포함하는 온전한 항체를 함유한 컬럼 상에서 - 에 처하였다. 두 번째 친화성 크로마토그래피 단계의 목적은 온전한 IgG를 인식할 수 있는 바람직하지 못한 항체를 제거하는 것이었다. 그러나, IgG 컬럼에 토끼 항체가 거의 또는 전혀 흡착되지 않았으며, 이는 항체 집단이 노출된 카르복시 말단을 가진 "절단된" 서열에만 반응성임을 시사하는 것이다.
개별적인 친화성-정제된 토끼 항-펩티드 항체를 ELISA에 의해 그들이 인간 IgG의 효소적으로 생성된 단편 및 온전한 IgG에 결합하는 능력에 대해 시험하였다 (도 5). 서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 14에 콘쥬게이션된 KLH ( MMP-3 부위 유사체)로 면역화된 토끼로부터의 정제된 항체는 온전한 IgG에 결합하지 않았으며 MMP-3으로 IgG를 분해하여 생성된 scIgG 및 F(ab')2에 대해 매우 특이적이었다. 이 항체 제제는 V8 프로테아제 또는 IdeS를 이용하여 생성된 scIgG 및 F(ab')2에 대해 최소의 반응성을 나타냈다. 대조적으로, V8-절단 부위 경첩 펩티드 유사체(서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 15) 및 IdeS-절단 부위 경첩 펩티드 유사체(서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 18)로 면역화된 토끼로부터 얻은 항체는 이들 두 효소 중 어느 하나에 의해 생성된 scIgG 및 F(ab')2에 대해 교차반응성 결합 프로파일을 나타냈다. 그러나, 이들 제제는 MMP-3 분해된 생성물에 대해 최소의 반응성을 나타냈다. 온전한 IgG에 결합한 항체 제제 중 어느 것도 그리고 항체 제제 중 어느 것도 도 6에 나타낸 바처럼 세 가지 상이한 효소에 의해 생성된 F(ab')2 및 scIgG를 비롯한 단편들과 비견될만한 반응성을 갖지 않았다.
항-경첩부 시약의 의도한 용도는 질환 특이적 조직에 존재하는 효소에 의해 생체내 배경에서 복합적으로 생성되거나 또는 질환 특이적 세포 유형 또는 세포 집단, 예를 들어, 침윤성 대식세포 또는 호중구에 의해 생성되는 scIgG 및 F(ab')2 (및 다른 잠재적 단편)의 검출이다. 잠재적인 IgG 단편의 적절한 커버를 위하여, 절단 부위 인식의 프로파일이 가능한 넓은 것이 바람직하게 생각되었다. 이러한 이유로, 세 가지 토끼 항체 풀의 각각의 혼합물을 후속 웨스턴 블롯팅 및 혈청-기반 ELISA 시험에 사용하기 위해 각 성분 0.33 ㎎/㎖(전체 = 1 ㎎/㎖)로 제조하였다. 풀링된 이 시약을 RAH-1로 칭한다.
실시예 4: 단쇄 절단 면역글로불린 분석
절단된 인간 IgG에는 결합할 수 있으나 온전한 인간 IgG에는 결합하지 않는 RAH-1을 포획 시약으로 사용하여 혈청 내의 scIgG를 검출하기 위해 이용한 신규 분석법을 하기에서 상세히 설명된다.
화학발광 ELSIA를 이용하여, 눈크(Nunc) 화학발광 96-웰 플레이트의 영역을 PBS 중의 10 ㎎/㎖의 RAH-1로 코팅하였다. 플레이트의 나머지는 코팅하지 않았다 (1X PBS 단독). 플레이트를 하룻밤 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 200 ㎖/웰의 케미콘 인터내셔널(Chemicon International)의 케미블로커(ChemiBLOCKER) (C# 2160)를 플레이트에 첨가하고 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 차단 완충액을 웰로부터 흡입시키고 표준물과 샘플을 플레이트에 첨가하였다. V8로 분해된 scIGg인 표준물 Mab3을 연속적인 4배 희석을 이용하여 1% 카제인과 3% BSA를 함유한 PBS 중의 50 ㎎/㎖로 시작하여 두 벌로 첨가하였다. 질환 혈청 샘플을 동일한 완충액에서의 1:50 희석으로 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 토끼를 비롯한 다양한 동물에 대해 최소의 교차반응성을 갖는, 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research)의 HRP 콘쥬게이션된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 당나귀 항-인간 IgG (H+L)의 1: 6000 희석액을 모든 웰에 첨가하였다. 이것은 1% 카제인과 3% BSA를 가진 PBS 희석액으로 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 완전히 세척하고 100 ㎖/웰의 HRP 기질 (로쉐(Roche)의 BM 화학발광 POD, 582 950)을, 발광 판독기에서 플레이트를 판독하기 몇 초전에 첨가하였다.
표준 곡선상의 0 ng/㎖ scIgG 웰로부터의 평균 발광을 RAH-1 코팅에 노출되었던 모든 웰로부터 차감하였다. 이 차감은 이차 항체의 RAH-1과의 임의의 비-특이적 반응성을 조절한다. 이어서, RAH 비-코팅 웰상의 각 공여체에 대한 값을 RAH 코팅 웰의 사전-조절 값으로부터 차감하였다. 이것은 플레이트에 대한 혈청 내의 임의의 비-특이적 반응성을 설명한다.
실시예 5: 질환 관련 단백질분해 활성을 탐지하기 위한 시약의 사용
다른 염증성 유체인, 류마티스 관절염(RA)을 가진 환자의 윤활액에서 IgG 단편을 검출하는 능력에 대해 RAH-1 시약을 시험하였다.
RA 환자로부터의 윤활액 샘플 수집물을 바이오리클라메이션(Bioreclamation)으로부터 구매하였다. 샘플을 LDS 샘플 완충액에서 1:5로 희석하고 각 샘플 10 마이크로리터를 4-12% 비스-트리스 젤 상에 로딩하였다. RAH-1의 반응성에 대한 대조군으로서, 온전한 IgG (Mab3), 또는 프로테아제 분해된 IgG (MMP-3, 글루타밀 엔도펩티다아제 및 IdeS를 이용한 Mab3의 부분 분해물)를 또한 젤 상에 로딩하였다. SDS PAGE 후, 젤을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 블로토로 차단하였다. 이어서 막을 블로토 중의 RAH-1의 1:2,500 희석액을 이용하여 인큐베이션하고, 0.1% 트윈 20을 함유한 0.1M 트리스 완충 염수(pH 7.5)로 세척하고 염소 항-토끼 IgG (H&L) 서양고추냉이 퍼옥시다아제 콘쥬게이트의 1:5,000 희석액을 이용하여 인큐베이션하였다. 이어서 TMB 막을 이용하여 블롯을 현상시켰다. 도 7에 나타낸 바처럼, RAH-1 제제는 온전한 IgG와 반응하지 않았으나, 모든 3가지의 프로테아제 분해물로부터 scIgG, F(ab')2 가능하게는 Fab'를 검출하였다. RA 환자로부터의 모든 5개의 윤활액 샘플에 대해, 대략적인 scIgG, F(ab')2 및 Fab'의 크기에서 밴드가 검출되었으며, 이는 RA를 가진 개인으로부터의 윤활액 내에 이들 단백질분해 단편이 존재함을 시사한다.
실시예 6: 질환을 모니터하기 위한 시약의 사용
혈액 혈장 또는 혈청은 생물학적 유체 또는 조직 추출물, 예를 들어 윤활액보다 바이오마커 시험을 위해 더 편리하다. 그러나, 윤활액의 이점은, 이것이 프로테아제가 활성이고 IgG 단편이 실시예 2에 개시된 바처럼 축적되는 것으로 예상될 수 있는 자가-함유형의 그리고 국소적인 환경이라는 것이다. 그럼에도 불구하고, 시험에 있어서의 혈청의 용이함과 유행은 혈청을 IgG 분해 생성물을 비롯한 바이오마커를 위한 상당히 더 큰 가능성을 갖는 샘플 조직이 되게 한다.
혈청의 상이한 유형과 공급원에서 IgG 단편에 대한 시험을 시작하기 전에, 단백질분해된 IgG 단편 중 있다면 어느 것이 그것의 축적과 정량화를 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 순환하는지를 확립하는 것이 바람직하였다. 이 문제에 답하기 위하여, 비교용 약물동력학적 연구(comparative pharmacokinetic study)를 디자인하였다. 생쥐에서의 하기 PK 실험은 인간 IgG가 일반적으로 10-20일의 최종 반감기를 나타내는 이전에 보고된 몇몇 유사한 연구에서 모델링하였다.
분획화된 단백질분해 생성물, Mab2 IgG1, 및 scIgG 및 F(ab')2 - MMP-3을 이용하여 생성함 - 를 하기와 같이 제조하였다. 20 밀리그램 양의 Mab2 IgG를 실시예 1에 개시된 바처럼 열-활성화된 MMP-3로 분해하였다. 분해는 10mM CaCl2를 함유한 트리스-완충된 염수(pH 7.5)중의 Mab2의 4 ㎎/㎖ 용액에 37℃에서 효소를 첨가하여 시작하였다. 48시간에 20 mM의 최종 농도로 EDTA를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 애질런트 바이오-사이징 분석(8862-67)에 기초하면, 남아 있는 온전한 IgG는 없었으며 scIgG, F(ab)2 및 Fc의 퍼센트는 24%, 41% 및 36%였다. 종료된 분해물을 2단계 정제에 처하여 Fc 단편을 제거하고 정제된 scIgG 및 F(ab)2를 분리하였다. 제1 단계에서, 분해물을 단백질 A-세파로즈를 이용한 크로마토그래피에 처하였다. 컬럼으로부터의 미결합 물질은 F(ab)2 단편을 함유하였으며 검출가능한 온전한 IgG 또는 scIgG는 없었다. 0.1M 시트르산나트륨(pH 3.5)을 이용하여 컬럼을 처리한 결과, Fc-함유 성분, Fc 단편 및 scIgG의 혼합물이 용출되었다. 1/10 부피의 2M 트리스(pH 7.0)를 첨가하여 분획물을 즉시 pH 7.0으로 중화시켰다. 중화된 물질을 약 1㎖로 농축시키고 인산염-완충된 염수(pH 7.5) 내로 투석시켰다. 수퍼덱스(Superdex) 200에서의 크기 배제 크로마토그래피(컬럼 부피 = 100 ㎖)에 의해 scIgG로부터 Fc 단편을 분리하였다. 두 개의 피크가 컬럼으로부터 용출되었으며, 그 후 이를 앞서 설명된 애질런트 바이오사이징 기술을 이용하여 scIgG의 젤 밴드 위치에 부합하는 135 kDa으로 확인되었으며 더 낮은 분자량의 피크는 약 35 kDa의 Fc 단량체 단편으로 확인되었다. 정제된 scIgG 및 F(ab)2 성분은 액티클린에톡스(ActicleanEtox) (0.5㎖ 젤/5 ㎖ 각 단백질 용액)와 접촉시켜 생쥐에서의 허용가능한 정맥내 주사를 위한 AALAC 규격대로 내독소를 감소시켰다 (<40 EU/㎏).
이 연구를 위하여, 동등한 밀리그램 양(1.9 ㎎/㎏)의 온전한 생쥐-인간 키메라 단클론 항체, Mab2 IgG1, 및 scIgG 및 F(ab')2 - MMP-3을 이용하여 생성함 - 를 후술하는 바처럼 시험하였다.
21마리의 암컷 Balb/c 생쥐 (에이스 애니멀즈(Ace Animals))의 군을 pK 연구를 위해 이용하였다. 기준선 대조군으로 사용하기 위하여, 실험 전에 세 마리의 무작위로 선택된 생쥐로부터 심장 천공을 통해 말단 혈액을 채취하였다. 남은 18마리의 암컷 Balb/c 생쥐를 칭량하고 6개의 동등한 군에 두었다. 두 군에는 온전한 Mab2 IgG1을 주사하고, 두 군은 MMP-3으로 생성된 Mab2 scIgG1를 주사하고 두 군은 MMP-3으로 생성된 Mab2 F(ab')2를 주사하였다. 모든 주사는 0.19 ㎎/㎖로 개별 동물 중량에 기초하여 10 ㎖/㎏의 일정한 투여량 부피로 복강내 주사하였다. 따라서, 각 동물은 0일에 1.9 ㎎/㎏의 용량을 받았다. 두 군 중 첫 번째로부터 1시간, 24시간, 7일, 21일, 35일에 약 80 ul의 혈액을 수집하고 두 번째 군으로부터 5시간, 48시간, 14일 및 28일에 혈액을 수집하였다. 혈청 샘플을 시험 때까지 20℃에서 보관하였다.
수집된 혈청의 IgG 및 IgG 단편 농도를 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 정량하였다. 잭슨 이뮤노-리서치의 PBS중의 0.5 ug/㎖ 희석액: 염소 항-인간 IgG - F(ab')2 단편 특이적(소, 말 및 생쥐 혈청 단백질과 최소의 교차반응성을 가짐)- 를 이용하여 코스타(Costar) 3369 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 PBS/카제인/BSA로 차단하였다. 차단 후, 표준물과 샘플을 PBS/1%카제인/3%BSA에 첨가하였다. 표준물은 하기의 연속 희석액을 포함하였다: 1000 ng/㎖ 에서 시작한 쥐과/인간 IgG1, 쥐과/인간 scIgG1 MMP-3 또는 쥐과/인간 F(ab')2 MMP-3. 각 시점에서 샘플을 PBS/1%카제인/3%BSA에서 1:10에서 1:163,840까지 연속 희석하였다 . 항-인간 포획 항체로 코팅된 플레이트에 결합된 인간 IgG를 50ul/웰 - 잭슨 이뮤노-리서치 - 의 염소 항-인간 IgG (H+L) (소, 말 및 생쥐 혈청 단백질에 최소의 교차반응성을 가짐; 109-035-083)로 검출하고 RT에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 완전히 세척하고 50ul/웰 O-페닐렌다이아민 기질에 약 10분 동안 노출시키고 50 ul/웰 3M HCL로 중단시키고 490-650nm에서 판독하였다. 결과는 도 8에 나타내어져 있다.
생쥐 PK 실험의 결과는 scIgG가 연장된 순환 수명을 보유하지만, F(ab')2는 그렇지 않음을 나타낸다. 생쥐에서 F(ab')2의 매우 빠른 제거는 인간에서 이 단편의 빠른 사라짐과 일치한다 (문헌[Roskos LK et al. Drug Dev. Res. 61: 108-120, 2004]). 이들 결과는 scIgG를 바이오마커 목적에 있어서 가장 풍부하고, 오래-생존하며, 유용한 IgG의 단백질분해 성분으로 지적한다.
실시예 7: 질환에서 단백질분해 효소
scIgG가 유용한 질환 바이오마커가 되기 위해서는, 건강한 사람에 비교할 때 규정된 질환 카테고리 내의 환자로부터 얻은 샘플에서 이것이 차등적 양을 나타내야 한다.
질환을 가진 개인으로부터의 혈청의 상업적 공급원은 제노믹스 콜래보러티브(Genomics Collaborative) (지금은 세라케어 라이프 사이언시즈 인크(SeraCare Life Sciences Inc.))로 확인되었다. 각각의 8가지 질환 내의 10명의 상이한 개인으로부터의 적은 부피의 혈청(300 마이크로리터)을 구매하였다. 질환 카테고리는 류마티스 관절염, 골관절염, 천식, 제1형 당뇨병, 유방암, 폐암, 심근경색, 및 울혈성 심부전이었다. 또한, 28명의 연령-매치되고 성별-매치되는 정상의 건강한 지원자로부터의 혈청을 대조군으로서 이 공급자로부터 입수하였다.
실시예 4에 개시된 분석을 이용하여, 샘플을 분석하였으며 결과는 도 9에 나타내어져 있다. RAH-1 시약의 선택성에 기초하여, 분석은 공지의 특이적 프로테아제에 의해 생성된 것들과 비견되는 IgG 절단 산물이 명확히 검출가능하며 염증성 자가면역 질환인 류마티스 관절염에 대한 건강한 또는 정상 공여체에서 유지된 수준보다 높음을 입증하였다. 대조적으로, 골관절염을 가진 환자는 정상 개인의 샘플의 수준과 유사하며 그 범위 내인 수준을 나타냈다.
실시예 8: 변형된 단쇄 절단 IgG 분석
혈청에서 scIgG의 검출을 위해 시약 RAH-1을 이용한, 고체상 분석, ELISA가 실시예 4에 개시되었다. scIgG 농도의 검출 범위를 최적화하기 위하여, 혈청 샘플 특이적 변화를 행하였다.
사용된 플레이트는 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 PBS(pH 7.2) 중의 5 ㎍/㎖ 농도의 토끼 다클론 항체(RAH-1)로 코팅된 (100 ㎕/웰) 이뮤론(Immulon) 4 HBX 플레이트(VWR)였다. 그 후, 플레이트를 자동 플레이트 세척기에서 PBS, 0.05% 트윈 (시그마)으로 3회 세척한다. 모든 샘플과 표준물을 1%BSA, 0.05% 트윈을 함유한 PBS로 희석한다. 항-IgG Fc-바이오틴 (유에스바이올로지칼스(USBIologicals), 미국 매사추세츠주 스왐프스콧)이 혈청 희석액 내의 scIgG 표준물 또는 미지의 scIgG의 검출 수단이다.
플레이트는 교반하면서 실온에서 15분 동안 200 ㎕의 수퍼블록(SuperBlock) (피어스(Pierce))을 이용하여 차단하고 이어서 자동 플레이트 세척기에서 PBS, 0.05% 트윈으로 플레이트를 3회 세척한다.
표준 물질; Mab1 프로테아제 분해 생성물을 600 ng/㎖ (100 ㎕/웰, 3배 희석액)로 시작하여 두 벌의 웰에 첨가한다. 혈청 샘플을 (적절한 경우) 1:100, 1:200, 1:400 등으로 희석한다. 샘플을 동시에 두 벌로 첨가하고 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 자동 플레이트 세척기에서 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척한다.
1:20,000의 IgG Fc 바이오틴 희석액(분석 완충액 중에 적절하게 희석)을 모든 웰(100 ㎕/웰)에 첨가하고 진탕기에서 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션한 후 자동 플레이트 세척기에서 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척한다.
SA-HRP (서양고추냉이 퍼옥시다아제에 콘쥬게이션된 스트렙타비딘, 시그마, PBS, 0.05% 트윈, 1% BSA 중의 1:30,000 희석액으로 사용됨)를 모든 웰 (100 ㎕/웰)에 첨가하고 진탕기에서 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션한 후 자동 플레이트 세척기에서 PBS, 0.05% 트윈으로 3회 세척한다.
마지막으로, 제조사(시그마)에 의해 제공된 100 ㎕의 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, 퍼옥시다아제 기질)를 각 웰에 첨가하고 색상 현상을 위해 약 10분 동안 인큐베이션시킨다. 반응을 75 ㎕의 1 N H2S04로 중단시키고 450 nm에서 플레이트를 판독한다.
상기 ELISA 포맷을 이용하면, 정상인 건강한 혈청에서 크게 개선된 선형성과 scIgG의 스파이크 회수성이 이 분석에 의해 입증되었다. 분석물의 희석의 선형성은 1:100으로 희석하고 이어서 150 ng/㎖ 및 300 ng/㎖의 농도의 Mab1로 스파이크하고, 추가로 0, 25, 75, 100% 혈청 농도로 희석한 두 혈청 풀에서 결정하였다. 각 샘플 희석액을 세 벌로 분석하였으며 평균 분석물 회수율을 계산하였다. 각 샘플 풀에 있어서의 관찰(y-축) 대 예상(x-축) 분석물 회수율 결과의 그래프로부터 R2 상관계수를 계산함으로써 선형성을 평가하였다. R2 값은 샘플 1 저(Low) 0.9983; 샘플 1 고(High) 0.9913; 샘플 2 저 0.9852; 샘플 2 고 0.973이었으며; 희석 선형성은 모든 희석액에 있어서 100%였다.
실시예 9: 혈청 내의 단쇄 절단 IgG의 검출
RA 환자로부터의 혈청을 배타적으로 사용하여 실시예 4의 결과를 추가로 연구하였으며 여기서는 이 환자 군으로부터의 일부 혈청 샘플은 대조군에 비교할 때 눈에 띄게 높은 scIgG를 가졌다.
류마티스 관절염(RA)을 가진 10명의 대상 및 10명의 연령- 및 성별-매치되는 건강한 개인으로부터의 혈청 샘플을 제노믹스 콜래보러티브로부터 입수하였다. 실시예 8에 개시된 변형된 분석을 이용하여, 샘플을 분석하였으며 결과가 도 10에 나타내어져 있다. 결과는 RA를 가진 10명의 대상 중 4명이 >60 ㎍/㎖의 혈청 scIgG 농도를 드러냄을 나타냈다. 건강한 대조군에서는, scIgG 농도는 <8.2 ㎍/㎖ 내지 52.7 ㎍/㎖ 범위였다. 이 비교를 위한 샘플은 질환의 단계, 치료 요법 등에 대해 엄격하게 선택되지 않았다. 따라서, 건강한 그리고 질환-관련된 혈청 scIgG의 추가 구별이 잘-제어된 그리고 전망하여 디자인된 임상 시험으로부터의 환자의 종적 분석에서 발생할 수 있는 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 이들 상업적 샘플에 대한 본 분석은 상승된 scIgG 농도가 질환을 가진 환자에서 검출될 수 있음을 시사한다.
실시예 10: 항-경첩 IgG 단클론 항체의 제조
제조 및 인간 환자에서의 잠재적인 사용을 위해, 절단된 IgG에는 결합하지만 온전한 IgG에는 결합하지 않는 단클론 항체와 같은 규정된 분자를 생성하는 것이 바람직할 것이다. 하기 절차는 그러한 분자를 생성하는 방법을 나타낸다.
인간 IgG1 하부 경첩부 및 인접 CH2 도메인의 12-머 펩티드 유사체가 면역원이었다: TCPPCPAPELLG (서열 번호 1의 잔기 7 내지 잔기 18). 자연 발생 시스테인을 알라닌으로 대체하여 변이체 TAPPAPAPELLG를 얻었다. N-말단 시스테인을 부가하여 자유 설프하이드릴에 대한 반응을 위한 표준적인 화학적 방법에 의해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에의 콘쥬게이션을 가능하게 하였다. 최종 면역원은 KLH-CTAPPAPAPELLG였다.
뉴질랜드 흰 토끼 (3)를 다수의 피하 부위(5)를 이용하여 완전 프로인트 아쥬반트 중의 0.5 ㎎ KLH 펩티드로 면역화시켰다. 동물을 총 4번의 추가 면역화를 위해 3주 간격으로 불완전 프로인트 아쥬반트 중의 0.25 ㎎ 면역원으로 부스팅하였다.
샘플 펩티드의 BSA-콘쥬게이션된 버전에 대한 혈청 항체 역가를 표준 ELISA 방법에 의해 면역화 과정 동안 모니터하였다. 동물 (2)을 역가 데이터에 기초하여 비장절제술을 위하여 선택하였다. 토끼 하이브리도마는 토끼 융합 파트너 세포와 융합된 비장-유래 림프구로부터 생성하였다 (문헌[Spieker-Polet, 1995 PNAS USA 92: 9348 - 9352]). 다중 플레이트에서의 융합 후 2-3주에 세포 성장을 조사하였다.
양성 하이브리도마를 BSA-면역원 펩티드 콘쥬게이트로 코팅된 플레이트에서의 ELISA를 통해 스크리닝하였다. 각 융합체로부터의 다수의 양성 클론이 확인되었다. 추가 스크리닝은 온전한 IgG1 및 IgG1의 효소적으로 생성된 다양한 F(ab')2 단편에의 결합에 관련되었다. 이들 스크리닝 및 반대-스크리닝 전략으로부터, 면역원 펩티드에의 그리고 F(ab')2 단편에의 결합의 강한 선택성에 기초하여 3개의 클론을 선발하였으며, 이때 말단은 면역원 펩티드의 말단 또는 그 근처였으며 온전한 IgG1에는 최소로 결합되었다. 양성 하이브리도마를 서브클로닝하고 확장시켰다.
토끼 IgG를 고정된 단백질 A에서의 크로마토그래피를 비롯한 표준 방법에 의해 개별 세포 상청액으로부터 정제하였다. 인간 IgG1 경첩부의 펩티드 유사체, 및 온전한 IgG 및 IdeS 및 MMP-3 효소를 이용하여 단일 또는 이중 절단된 Mab를 이용하여 생성된 정제된 IgG F(ab')2 단편에의 결합에 대한 정제된 토끼 IgG의 특이성을 표준 ELISA 프로토콜에서 시험하였다. 요약하면, 표준 펩티드 화학에 의해 합성되고 N-말단에서 바이오티닐화된 펩티드를 스트렙타비딘-코팅된 웰에서 포획하였다. 10 ㎍/㎖의 IgG 및 단편들로 직접 코팅하였다. 토끼 mAb의 결합은 잘-특성화된 염소 항-토끼 IgG Fc-서양고추냉이 퍼옥시다아제 및 OPD 기질 시스템에 의해 검출하였다.
토끼 mAb 91-2에 대한 ELISA 결과가 도 11에 나타내어져 있다. 서열 번호 1의 잔기 16-22 (L-L-G-G-P-S-V-F)에서 종결되는 하부 경첩 펩티드에 대한 결합의 명확한 선택성이 있었다. 서열 번호 1의 3-16 (D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E-L-)에 의해 포함되는 상부 경첩부, 코어 경첩부 또는 초기 하부 경첩부의 절편들에 해당하는 상류 잔기에의 결합은 거의 또는 전혀 없었다. MMP-3 생성 F(ab')2 단편 및 scIgG 단편에의 결합은 무시할 정도였다(서열 번호 1의 잔기 14와 잔기 15 사이의 MMP-3 절단 부위의 펩티드 유사체 (P-A-P*E-L-L)에의 결합 부족과 일치). 대조적으로, Ides-생성 F(ab')2 단편 및 scIgG에는 상당한 결합이 있었다. 따라서, 토끼 mAb 결합 특이성은 그것이 유도된 면역원에 잘 부합하였다. 직접 코팅된 rb (토끼) IgG가 양성 대조군이었다.
보체 분석.
CD20(ATCC)를 발현하는 림프아구양 B-세포주인 WIL2-S 세포를 CDC 분석을 위한 표적 세포로 사용하였다. 50 ㎕의 세포를 RPMI, 5% 열-불활성화 FBS, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루브산나트륨, 페니실린 (500 U/㎖), 스트렙토마이신 (500 U/㎖), 2mM L-글루타민 중에서 8 X 104세포/웰의 최종 농도를 위해 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 추가의 50 ㎕를 다양한 농도의 항체를 포함하는 또는 항체를 포함하지 않는 웰에 첨가하였으며 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 10% 토끼 보체(인비트로겐)를 웰에 첨가하고 플레이트를 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 모든 샘플을 세 벌로 실시하였다. 플레이트를 3분 동안 200g에서 원심분리하고 50 ㎕의 상청액을 제거하여 플레이트를 분리하고 LDH 세포독성 검출 키트(로쉐)로 CDC를 측정하였다. 스펙트라(Spectra) 맥스 플러스(max Plus) 384 (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 데이타를 트리톤(Triton) X-100 (시그마 알드리치)을 이용하여 최대 세포독성에 대하여 정상화시키고 단지 세포 및 보체 단독을 함유한 최소 대조군에 대하여 정상화시켰다.
도 12는 3개의 토끼 항-경첩 mAb가 CD20에 결합하는 항체의 F(ab')2 단편의 고정 농도의 존재 하에서 적정될 때 표적 세포에 보체 의존성 세포 용해를 회복시킬 수 있었음을 보여준다. 토끼 mAb가 보다 효과적이었으며, 다클론 토끼 항-경첩 mAb 제제(앞서 설명된 혈청 scIgG를 위한 동일한 검출 시스템의 성분)보다 낮은 농도에서 그러하였다. CD20에 대한 온전한 항체가 예상대로 활성을 가졌으나, 그것의 F(ab')2 단편 및 scIgG 버전은 단독으로는 활성을 갖지 않았다. 토끼 항-경첩 mAb는 세포-결합 F(ab')2 단편의 부재 하에서 세포 용해를 유도할 수 없었다. 이들 결과는 단클론 항-경첩 항체가 다르게는 불활성인 IgG1 단백질분해 절단 산물에 대해 보체-매개 이펙터 기능을 재구성시킬 수 있음을 확립한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Centocor, Inc.
<120> IMMUNOGLOBULIN CLEAVAGE FRAGMENTS AS DISEASE INDICATORS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND BINDING SUCH
<130> CEN5192PCT
<140> TO BE ASSIGNED
<141> 2008-08-04
<150> 60/955162
<151> 2007-08-10
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 2
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
1 5 10 15
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
20 25 30
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
35 40
<210> 3
<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
1 5 10 15
Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
20 25 30
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser
1 5 10 15
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
20 25 30
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
35 40
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
1 5 10
Claims (4)
- 서열 번호 5 내지 서열 번호 11의 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 인간 IgG 프로테아제 절단 부위 펩티드.
- 제1항에 있어서, N-말단을 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH)에 공유 결합에 의해 부착된 펩티드.
- 제1항의 펩티드로 면역화된 동물.
- 제3항에 있어서, 토끼인 동물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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