PT2188306T - Fragmentos de clivagem de imunoglobulinas como indicadores de doença e composições para deteção e ligação relacionadas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"FRAGMENTOS DE CLIVAGEM DE IMUNOGLOBULINAS COMO INDICADORES DE DOENÇA E COMPOSIÇÕES PARA DETEÇÃO E LIGAÇÃO RELACIONADAS" ANTECEDENTES TÉCNICOS DA INVENÇÃO Campo Técnico da Invenção A invenção relaciona-se com indicadores de diagnóstico e prognóstico e métodos e reagentes para a sua deteção. A invenção adicionalmente relaciona-se com métodos de monitorização da história natural da doença num paciente.

Descrição do Estado da Técnica Relacionado

Em medicina, um biomarcador é uma substância bioquimica que pode ser usada para medir o progresso da doença ou os efeitos do tratamento, ou seja, um indicador de diagnóstico ou prognóstico. Um biomarcador que eficazmente reflita a história natural da doença e o controlo da doença é a hemoglobina Ale para controlo glicémico em pacientes diabéticos. Devido ao tempo de meia-vida de HvAlc no soro, ele serve como um registo recente do desvio da glucose sanguínea face aos níveis ideais assim como a duração desses desvio. Um biomarcador atualmente usado para condições inflamatórias sistémicas é a proteína C-reativa (CRP) (Pepys MB et al. J. Clin. Invest. Ill; 1805-1812, 2003) . CRP é um reagente de fase aguda que é produzido em resposta a uma grande variedade de condições inflamatórias agudas. CRP é sintetizado no fígado em resposta a sinais de citocinas incluindo TNF e IL-6 que por sua vez migram do local distante de inflamação. Um aumento no nível de CRP sérica ocorre aquando da infeção, derrame, doença vascular, enfarte do miocárdio e outros diversos distúrbios inflamatórios.

Imunoglobulinas circulantes, e especificamente aqueles anticorpos da classe IgG, são importantes proteínas séricas. É bem conhecido que as protéases humanas estão associadas com doenças inflamatórias, proliferativas, metástica, e infeciosas. Proteases humanas tais como as metaloproteinases da matriz (MMPs) e a elastase neutrofílica clivam o polipéptido da cadeia pesada de IgGs num resíduo específico para cada protease; à semelhança de protéases bacterianas tais como a glutamil endopeptídase (Staph, aureus) ou a enzima decompositora de imunoglobulina de estreptococos (Strep, pyogenes). Os locais de clivagem na cadeia pesada encontram-se agrupados em redor da região designada como domínio charneira, onde a ligação dissulfeto entre as cadeias de duas cadeias pesadas ocorre. A região abaixo do domínio charneira constitui a região Fc e compreende os locais de ligação responsáveis pelas funções executoras de IgG. No caso de microorganismos, a expressão de protéases é uma via de virulência adjuvante potencial permitindo que os organismos evitem a opsonização (Rooijakkers et al. Microbes and Infection 7: 476-484, 2005) desde que a libertação proteolítica do domínio Fc por clivagem abaixo do domínio charneiras efetivamente neutralize as funções que de outro modo levariam ao direcionamento e eliminação dessa célula patológica. Assim, a elaboração de protéases específicas pode ser representativa de uma miríade de estádios de doença incluindo cancro, inflamação e doenças infeciosas.

Essa decomposição de IgG é aumentada em ambientes patológicos ín vivo como evidenciado pela presença de autoanticorpos de IgG naturais que se ligam ao domínio charneira clivado (Knight et al., 1995; Nasu et al., 1980; Persselin and Stevens, 1985, Temess, et al. 1995 J Imunol. 154: 6446-6452). Esses autoanticorpos também se ligam aos fragmentos Fab e F(ab')2 gerando por várias proteinases (incluindo papaina e pepsina), com uma reatividade particularmente forte para o dominio charneira inferior permanecendo como resíduos terminal-C em moléculas F(ab')2 (Temess et al., 1995) . A deteção dos atuais produtos de clivagem foi reportado (Fick et al., 1985; Goldberg and Whitehouse, 1970; Waller, 1974) mas um ensaio robusto que poderia permitir que esses fragmentos servissem como biomarcadores não foi ainda desenvolvido, possivelmente devido às baixas concentrações no soro resultando da rápida eliminação dos vários fragmentos ou a problemas técnicos na deteção dos fragmentos entre a grande quantidade de imunoglobulinas intactas no sangue e nos tecidos. Um anticorpo específico foi preparado (Eckle, et al. 1988.

Adv. Exp. Med. Biol. 240: 531-534) para a deteção do domínio Fc clivado da elastase neutrofílica humana, que detetou Fc a uma concentração média de 0,62 ug/ml diretamente no fluído sinovial de pacientes com artrite reumatoide mas não no fluído sinovial de pacientes com outros tipos de doenças articulares.

Welschof et al. (1997) PNAS 94:1902-1907 descreve um domínio de ligação ao antigénio de um autoanticorpo IgG-anti(Fab')2 humano.

Gearing et al. (2002) Immunology Letters 81(1):41-48 descreve a clivagem seletiva de IgG humana por metaloproteinases da matriz.

Schmidt et al. (2007) Biopolymers 88(4):556 descreve uma abordagem peptídica sintética para a elucidação de pontos da reatividade de autoanticorpos naturais um fragmentos proteolíticos de IgG humano.

Ryan et al. (2008) Molecular Immunology 45:1837-1846 descreve a proteólise de IgGs purificadas por enzimas humanas e bacterianas in vitro.

Assim, a capacidade para avaliar o tipo e quantidade de produtos de clivagem de IgG nos fluidos corporais ou sangue de sujeitos poderia ser usada como um biomarcador da atividade de uma doença especifica. Reagentes e métodos especificos para tais determinações forneceriam ferramentas úteis para ensaios médicos de diagnóstico e prognóstico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece uma composição de anticorpo que compreende pelo menos um anticorpo que especificamente se liga a um produto de clivagem da protease de IgG caracterizado por, a) possuir um peso molecular que é comparável ao de uma IgG mamífera intacta sob condições não-desnaturantes e b) ser separável em dois fragmentos que compreendem um fragmento de ligação ao antigénio de 135 kDa e um fragmento contendo CH2 sob condições desnaturantes mas não-redutoras e c) onde o reagente não reage com IgG intacta, e onde o referido anticorpo especificamente se liga a um local de clivagem específica da protease em IgGl humana produzida por IdeS, TCPPCPAPELLG. A invenção adicionalmente fornece um análogo peptídico do local de clivagem da protease IgG humana consistindo de TCPPCPAPELLG covalentemente ligado à hemocianina da espécie Megathura crenulata via o terminal-N. A invenção adicionalmente fornece um método de preparação do anticorpo da invenção usando um animal não-humano imunizado com o análogo peptídico da invenção, onde o reagente é purificado a partir do soro do referido animal por pré-absorção na matriz de afinidade de IgG humana. A invenção adicionalmente fornece um método de deteção de um processo de uma doença num sujeito por análise de uma amostra tecidular do sujeito, onde o referido método compreende a deteção pela composição do anticorpo da invenção de uma IgG clivada proteoliticamente por IdeS caracterizada por a) possuir um peso molecular que é comparável ao de uma IgG mamifera intacta sob condições fisiológicas e b) ser separável em dois fragmentos que compreendem um fragmento de ligação ao antigénio de 135 kDa e um fragmento contendo CH2 sob condições desnaturantes mas não-redutoras. A invenção adicionalmente fornece um kit incluindo um reagente para deteção de um marcador da doença num tecido de um sujeito, cujo reagente compreende pelo menos um anticorpo que especificamente se liga a uma IgG clivada, cujo anticorpo é capaz de detetar um produto de clivagem de IgG caracterizado por a) possuir um peso molecular que é comparável ao de uma IgG mamifera intacta sob condições desnaturantes e b) ser separável em dois fragmentos que compreendem um fragmento de ligação ao antigénio contendo CH2 sob condições desnaturantes mas não-redutoras e c) onde o reagente não reage com IgG intacta, e onde o referido anticorpo se liga especificamente a um local de clivagem especifico da protease em IgGl humana produzida por IdeS, TCPPCPAPELLG. A invenção adicionalmente fornece a composição de anticorpo da invenção para uso em terapia. A invenção relaciona-se com reagentes e uso dos reagentes para deteção de um processo de uma doença associada com a elaboração de protéases, cujas protéases são manifestações da patologia da doença, assim como agentes que limitam as defesas imunológicas do hospedeiro. Num outro aspeto da invenção, os reagentes e o uso dos reagentes num ensaio, deteta anticorpos anti-doença, cujos anticorpos são específicos para alvos relacionados com a patologia da doença. Os reagentes são dirigidos à avaliação do produto de decomposição de IgG que é o resultado dessa clivagem proteolítica.

Numa outra forma de realização, os métodos da presente publicação são direcionados para a deteção de um produto de clivagem de IgG que é caracterizado por 1) possuir um peso molecular que é comparável ao de uma IgG mamífera intacta sob condições fisiológicas e 2) ser separável em dois fragmentos que compreende um fragmento de ligação ao antigénio e um fragmento de 32 kDa sob condições desnaturantes mas não-redutoras e 3) não exibir atividade ADC num ensaio in vitro. Num aspeto do método de deteção do produto de clivagem de IgG da invenção, um reagente específico capaz de detetar o produto de clivagem é fornecido, cujo reagente é pelo menos um anticorpo capaz de se ligar ao referido produto de clivagem.

Numa outra forma de realização da presente publicação, as sequências para a produção dos reagentes úteis para a deteção do produto de clivagem de IgG são fornecidas, sendo úteis para a imunização, rastreio, e seleção do reagente do produto de clivagem de IgG da presente publicação. Num aspeto, a sequência é selecionada do grupo consistindo de pelo menos 5 aminoácidos contíguos selecionados das sequências da região charneira da IgG humana de SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4 que se encontram no lado do terminal amino de um local de clivagem da protease.

Numa outra forma de realização, as sequências são selecionadas daquelas das SEQ ID NOs. 5-11 e extremidades terminal-N relacionadas. Num outro aspeto, um método de desenho de um agente imunogénico peptidico baseado no local de clivagem proteolítico de uma molécula de IgG humana é fornecido.

Aqui divulgados estão métodos de preparação de um produto de clivagem anti-IgG da presente invenção incluindo sequências de ácidos nucleicos, vetores, e células hospedeiras para a produção recombinante de anticorpos do produto de clivagem anti-IgG. Num outro aspeto do método de produção de anticorpos do produto de clivagem anti-IgG, animais hospedeiros imunes são divulgados em que o soro dos animais é uma fonte de anticorpos da presente invenção a partir dos quais o reagente é preparado por métodos descritos ou conhecidos do estado da técnica.

Numa outra forma de realização da invenção, um kit de deteção de um produto de clivagem anti-IgG é fornecido compreendendo anticorpos de um produto de clivagem anti-IgG da invenção.

Aqui também divulgado está um método de administração de um anticorpo especifico para o produto de clivagem anti-IgG para tratar um paciente de forma a restaurar as normais funções executoras a um produto de clivagem de IgG.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS PERSPETIVAS DAS FIGURAS FIG. 1 representa os vários dominios de um anticorpo de classe IgG mamifera tipica mostrando a sua relação com a a região charneira e os produtos de clivagem da pepsina e papaina definidos como Fab, F(ab')2, e Fc.

Fig. 2 mostra quatro análises individuais de eletroforese microcapilar Agilent Biosizing enquanto imagens de géis a diferentes momentos temporais durante diferentes digestões por ação da proteinase de um anticorpo IgGlK humano, Mabl, por 1 % p/p de MMP-3 humana (A) , IdeS estroptocócica (B) , glutamil endopeptídase I estafilocócica (C) e elastase neutrofilica humana (D) a 37 °C. Padrões em cada gel (linha 1) correspondem a um IgGl quimérico humano/murino intacto e fragmentos de clivagem conhecidos.

Fig. 3 mostra a sequência da cadeia pesada de IgGl humana em redor da região charneira; as posições das principais clivagens proteoliticas são indicadas por setas.

Fig. 4 é um Western Blot mostrando a degradação em função do tempo da IgG murina/humana bioatinilada pela ação do exsudado de uma ferida.

Fig. 5 é um gráfico mostrando a especificidade relativa do anti-soro gerado em coelhos imunizados com o produto de degradação F(ab')2 conjugado de três diferentes proteases: MMP-3, V8, e IdeS TCPPCPAP, residuos 7-14 da SEQ ID NO: 1 correspondendo ao local de clivagem MMP-3, TCPPCPAPE, residuos 7-15 da SEQ ID NO: 1 correspondendo ao local da glutamil endopeptídase, e TCPPCPAPELLG, resíduos 7-18 da SEQ ID NO: 1 correspondendo ao local IdeS. A reatividade ELISA de três preparações de anticorpos peptídicos anti-região-charneira policlonais de coelho individuais com fragmentos F(ab')2 de Mab3 IgGlK. Os fragmentos F(ab')2 foram gerados com MMP-3 recombinante humano, glutamil endopeptídase I estafilocócica e IdeS recombinante de Strep, pyogenes. Uma mistura de preparações de anticorpos de coelhos demonstrou reatividades praticamente equivalentes às dos fragmentos Mab3 F(ab')2. As barras de erro correspondem à média ± desvio padrão de três poços-réplica .

Fig. 6 Reatividade Western Blot de preparações de anticorpos policlonais de coelho com fragmentos digeridos de anticorpos. IgGl humano Mab3 intacto ou que foi previamente digerido com MMP-2, glutamil endopeptidase (V8) e IdeS fi separado por SDS-PAGE por imunoblotting. (A)

Marcação com IgG anti-humano (H+L) [linhas 1-4] ou anti...L LK de coelho policlonal [linhas 6-10]. (B) Marcação com

Anti...P AP [linhas 2-5] ou anti...A PE [linhas 7-10] . Os géis marcados foram cortados antes de incubação com anticorpos na linha 5 do painel A e linha 6 do painel B para permitir a deteção do anti-soro individual.

Fig. 7 é um Western blot desenvolvido usando o reagente RAH-1 em amostras de uma análise de degradação de IgG no fluído sinovial de 5 pacientes de RA e comparado com amostras de digeridos proteolíticos in vitro de um anticorpo IgGl monoclonal com MMP-2, glutamil endopeptidase (V8) e IdeS.

Fig. 8 mostra a concentração sérica em função do tempo de vários fragmentos de clivagem proteolíticos, IgG intacta, IgGsc e F(ab')2; após injeção dos fragmentos purificados especificados em ratinhos, medida usando a IgG (H+L) de cabra anti-humano.

Fig. 9 é um gráfico de dispersão de valores individuais de sdgG detetada pelo reagente RAH-1 em amostras de soro humano provenientes de pacientes diagnosticados com as doenças como indicadas como comparadas aqueles de um grupo de amostras de soro humano normal onde as linhas indicam valores médios de cada grupo.

Fig. 10 mostra a concentração de sdgG em soro diluído de 10 indivíduos com artrite reumatoide (RA) e um número equivalente de controlos normais, saudáveis, detetados com reagente RAH-1 usando uma versão melhorada de ELISA; "(2)" no grupo RA significa que o mesmo valor foi obtido em dois indivíduos separados.

Fig. 11 mostra a reatividade relativa de fragmentos de clivagem direcionados a anticorpos monoclonais de coelho da região charneira IgGl humana como análogos peptídicos e um fragmentos de anticorpos terminando no resíduo especificado (ver Fig. 3).

Fig. 12 mostra a dependência da concentração de três diferentes fragmentos de clivagem direcionados a anticorpos monoclonais de coelho da região charneira de IgGl humana na restauração da lise celular dependente de complemento (CDC) para F(ab')2 criado por digestão de IgGl com IdeS comparativamente a um anticorpo policlonal de coelho preparado para clivagem de análogos peptídicos (poli rb).

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTA DE SEQUÊNCIAS

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Abreviaturas

Abs = anticorpos, ADC = citotoxicidade celular dependente de anticorpos; CDC = citotoxicidade dependente do complemento; ; HNE = elastase neutrofilica humana; IdeS = enzima decompositora de imunoglobulina proveniente de S. pyrogenes; Ig = imunoglobulina; Mab = anticorpo monoclonal; MMP = metaloprotease da matriz; sdgG = IgG clivada; SA = estreptavidina; V8 = glutamil endopeptidase I proveniente de Staph, aureus.

Definições

Fragmentos de anticorpos; Fab, F(ab')2, e Fc são termos descrevendo produtos de clivagem proteolitica de anticorpos IgG que podem adicionalmente ser dissociados por redução de liações dissulfeto entre as cadeias pesada (a região charneira central). Exemplos de fragmentos de anticorpos clássicos gerados proteoliticamente incluem: Fab (p.ex., por digestão com papaina), Fab' (p.ex., por digestão com pepsina e redução parcial) e F(ab')2 (p.ex., por digestão com pepsina), facb (p.ex., por digestão com plasmina), pFc' (p.ex., por digestão com plasmina ou pepsina), Fd (p.ex., por digestão com pepsina, redução parcial e reagregação), onde a redução remove a ligação dissulfeto entre os resíduos cisteína que formam as ligações inter-cadeia (referência à Figura 1) . Uma vez que o fragmento Fc foi descrito como um fragmento de clivagem de papaína e que cliva a IgGl humana no resíduo 224 (sistema de numeração EU) , que é terminal-N relativamente à região charneira, o fragmento Fc é assumido como retendo a região charneira e as ligações dissulfeto entre as cadeias pesadas, contudo, devido ao elevado grau de associação entre os dímeros CH2CH3 de cadeia pesada no anticorpo, uma estrutura dimérica é retida mesmo na ausência de ligações (charneira) dissulfeto. Assim, como aqui usado, "Fc" refere-se à estrutura dimérica formada pela associação de segmentos CH2-CH3 de cadeia pesada, quer estejam ligados covalentemente ou não. Será entendido que Fc ligado não covalentemente pode ser distinguido do Fc ligado via ligação dissulfeto devido à sua capacidade para sofrer dissociação em monómeros CH2-CH3 na presença de um desnaturante tal como um detergente.

Os termos "proteolítico", "clivagem proteolítica", "protease", e "enzima proteolítica" são usados intercambiavelmente e designam um agente, p.ex., enzima, que é capaz de clivar uma cadeia polipeptídica produzindo dois ou mais fragmentos, onde a enzima atua sob uma temperatura normal e sob condições fisiológicas ou condições compatíveis com o ambiente fisiológico. Condições fisiológicas incluem qualquer temperatura, tampão, catião, anião, substrato, catalisador, pH, cofator, ou semelhante que é naturalmente encontrado no organismos de um mamífero vivo, esteja este com saúde ou com doença. Contudo, a protease pode ser derivada de uma fonte não-mamífera tal como um agente patogénico que pode ser qualquer tipo de forma de vida.

Por "scIgG" ou "IgG clivada" entende-se quaisquer moléculas de imunoglobulina classe G possuindo uma estrutura heterodimérica compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, onde uma das cadeias pesada foi sujeita a clivagem proteolitica numa única cadeia pesada enquanto a segunda cadeia pesada permanece intacta.

Por "a montante" relativamente a uma sequência aminoacidica escrita do terminal-N para o resíduo do terminal-C entende-se os resíduos numa sequência em direção ao terminal-N de um dado resíduo. Por outro lado, por "a jusante" relativamente a uma sequência aminoacidica entende-se os resíduos a sequência em direção ao terminal-C de um dado resíduo.

Funções de Anticorpos por Subestrutura

No geral, imunoglobulinas, anticorpos, consistem de regiões de cadeias polipeptídicas contínuas compreendendo aproximadamente 100 aminoácidos que apresentam um domínio globular caracteristicamente compactado e representam diferentes elementos da estrutura. Cada 100 das regiões aminoacídicas representa um domínio globular que possui 10-11 kDa. Para imunogamaglobulinas (IgGs), estes domínios encontram-se agrupados conjuntamente em segmentos; o segmento Fab é composto por uma cadeia leve variável ligada a uma região constante da cadeia leve numa cadeia simples ligada através de uma ligação dissulfeto à primeira região constante da cadeia pesada (CHI) que é contígua com a região variável da cadeia pesada; Fc é composto por duas regiões constantes contíguas da cadeia pesada (CH2 e CH3) ligadas através de duas ou três ligações dissulfeto na região charneira. Estudos demonstram que protéases, tais como papaína e pepsina, preferencialmente clivam anticorpos em locais que se encontram entre os segmentos. Dos segmentos Fab idênticos ligados através da região charneira a um segmento Fc, assim, formam uma configuração em forma de "Y" da estrutura de 150 kDa (ver Fig. 1) . Os segmentos Fab gerados usando papaina tipicamente possuem um peso molecular de 46 kDa, F(ab')2 não-reduzido tipicamente gera um peso molecular de 90-100 kDa, e Fc não-reduzido, não-glicosilado, possui um peso molecular aparente de 50-60 kDa. Contudo, como em cada uma das espécies de anticorpos, e em cada subclasse de anticorpos incorporada numa espécie, é ligeiramente diferente, a natureza exata e localização da clivagem e dos produtos da clivagem são variáveis. O antigénio liga-se a anticorpos através de um local de ligação ao antigénio nos domínios variáveis de cada par de cadeias leve e pesada (Fig. 1) . Outras moléculas, conhecidas como moléculas ou células executoras, ligam-se a outros locais na fração remanescente da molécula, i.e., outros locais que são os locais de ligação ao antigénio, e esta fração do anticorpo inclui as sequências de imunoglobulina mais conservadas, "a fração constante" de um anticorpo, tais locais sendo localizados particularmente na região Fc constituída pelas porções das cadeias pesadas estendendo-se até aos segmentos terminais das cadeias leves.

Os anticorpos possuem várias funções executoras mediadas pela ligação de moléculas executoras. Por exemplo, a ligação da componente Cl do complemento a anticorpos ativa o sistema complemento. A ativação do complemento é importante na opsonização e lise de agentes patogénicos celulares (um processo designado por citotoxicidade mediada pelo complemento ou CDC) . A ativação do complemente estimula a resposta inflamatória e pode também estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Adicionalmente, anticorpos ligam-se a células através da região Fc, com um local recetor de Fc na região Fc do anticorpo ligando-se a um recetor Fc (FcR) numa célula. Existe um número de recetores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpos, incluindo IgG (recetores gama), IgE (recetores eta) , IgA (recetores alfa) e IgM (recetores mu) . A ligação do anticorpo aos recetores Fc nas superfícies celulares despoleta um número de respostas biológicas diversas e importantes incluindo digestão e destruição de partículas revestidas com anticorpos, eliminação de complexos imunitários, lise de células-alvo revestidas com anticorpos por células killer (também designada por citotoxicidade celular mediada por anticorpos, ou ADC), libertação de mediadores inflamatórios, controlo e transferência placentária da produção de imunoglobulinas.

As sequências em redor dos domínios charneira são conservadas entre os isótipos IgG (SEQ ID NO: 1-4) e geralmente entre espécies mamíferas. 0 isótipo IgGl (SEQ ID NO: 1) e IgG3 (SEQ ID NO: 1) compreendem um par Leu-Leu que é um motivo estrutural para a ligação a recetores Fcy e para funções executoras de Fc. Outros resíduos a jusante da "região charneira" que tipicamente compreendem pelo menos uma cisteína separada por dos resíduos não-cisteína são também conservados.

Os requerentes desta invenção descobriram que um produto de clivagem, scIgG, da IgGl humana é formado por proteases humanas e bacterianas quando a proteólise ocorre em um dos dois polipéptidos de cadeia pesada que compreendem uma IgG, ao mesmo tempo que não decompõem a composição geral da molécula heterodimérica. Em segundo lugar, os requerentes determinaram através de análise cinética do ataque proteolítico em moléculas IgG contendo regiões constantes de cadeias pesadas humanas, que scIgG é presumivelmente o produto mais abundante de proteólise in vivo. A existência de sdgG como um intermediário proteolitico conduzindo à geração de F(ab')2 durante a proteólise de IgG foi demonstrada previamente para a enzima MMP-3 (Gearing AJH et ai, Immunol. Lett. 81: 41-48, 2002). A clivagem de IgG por uma protease estreptocócica, IdeS, foi também demonstrada produzir um produto assemelhando-se a IgG intacta por cromatografia por exclusão de tamanho (Vincents Bet al, Biochemistry 43: 15540-15549, 2004). Contudo, nenhumas caracterizações funcionais deste intermediário foram reportadas nem métodos para a deteção de sdgG nas amostras biológicas fornecidas.

Os requerentes demonstraram adicionalmente que, in vivo, scIgG, exibe um tempo de meia-vida no soro compatível com a avaliação da atividade da doença ao longo de um período de vários dias a meses, assim permitindo o uso de sdgG como um marcador de processos de doença latentes ou suprimidos, ou podendo ser usado para conhecer a história natural recente e resposta ou recuperação de uma doença.

Brevemente, os requerentes descobriram que a cinética da clivagem proteolítica sob condições fisiológicas leva a uma maior proporção de IgG clivada proteoliticamente estando na conformação sdgG do que espécies que são produtos de múltiplos eventos de clivagem, tais como F(ab')2 (ver Fig. 1) . No processo de teste de um grande número de proteases, foi determinado que a primeira clivagem de uma região constante da cadeia pesada numa IgG intacta acontece mais rapidamente do que a segunda, uma sequência que leva a uma acumulação temporal de espécies clivadas uma única vez. Esta versão de clivagem única da molécula de IgG é indistinguível da sua parente intacta de muitas formas (p.ex., tamanho molecular, ligação ao antigénio, capacidade de ser reconhecida pela proteína A/G).

Em concordância com a invenção, os requerentes geraram reagentes adequados para a deteção de produtos de clivagem proteolítica incluindo F(ab')2 e scIgG. Os reagentes da invenção foram gerados usando péptidos análogos do local de clivagem da invenção, reconhecendo produtos de clivagem IgGl humana mas não reconhecendo IgG intacta.

Os requerentes demonstraram adicionalmente que anticorpos reconhecendo produtos de clivagem IgG retendo especificidade de ligação ao antigénio podem restaurar funções executoras tais como CDC e ADC à IgG clivada.

Enzimas Proteoliticas e Associação de Doença

Os requerentes demonstraram que produtos de clivagem de anticorpos, incluindo scIgGs, semelhantes em tamanho daquelas geradas com painel enzimático in vitro, são detetáveis em exsudados inflamatórios tais como fluido sinovial de pacientes com artrite reumatoide. Adicionalmente, scIgG pode ser detetada no soro de pacientes com um número de doenças em que a atividade proteolitica localizada é uma conhecida caracteristica da patologia. A scIgG nesses estádios de doenças encontra-se em concentrações maiores do que em voluntários saudáveis e é também maior no soro de pacientes com doenças inflamatórias menos graves. A deteção de scIgG foi tornada possível pela produção de anticorpos policlonais purificados por afinidade (coelho) que especificamente se ligam a epítopos prontamente expostos na cadela pesada clivada no local ou na proximidade das ligações dissulfeto das regiões charneira, mas não reagindo com as moléculas de IgG intactas, não-clivadas. Apoio confirmatório para a deteção de scIgG no soro é o seu tempo de circulação prolongado semelhante ao da IgG intacta. A capacidade para detetar scIgG em fluídos corporais ou sangue de de indivíduos adoentados é uma estratégia de marcação potencialmente nova. Será entendido que outras espécies de anticorpos além de anticorpos de coelho (tais como anticorpos de ratinho, rato e camelo) podem ser usados e anticorpos monoclonais produzidos, por exemplo, por clonagem de um gene de anticorpo para uma sequência específica da região de ligação de anticorpo em que anticorpos monoclonais ou policlonais retêm a capacidade de se ligarem a produtos de clivagem de IgGl humana mas que não reconhecem IgG intacta são englobados como reagentes da invenção. Outros métodos de produção de anticorpos, p.ex., por seleção de bibliotecas de domínios de anticorpos, são bem conhecidos por aqueles habilitados no estado da técnica e podem ser usados como uma fonte dos anticorpos da invenção.

Reagentes de Anticorpos

Os anticorpos desta invenção podem ser preparados de vários modos bem conhecidos do estado da técnica usando critérios e agente imunogénicos desenvolvidos pelos requerentes para estimular a produção ou seleção de anticorpos úteis na prática da invenção.

Num aspeto, os anticorpos são convenientemente obtidos a partir de hibridomas preparados por imunização de um animal com os fragmentos de clivagem observados ou os péptidos análogos do local de clivagem relacionados. Assim, os anticorpos podem ser obtidos por imunização de animais ou rastreio de bibliotecas de anticorpos com fragmentos de clivagem de anticorpos incluindo F(ab')2 e scIgG, ou truncamentos ou análogos estruturais relacionados. Numa forma de realização, os péptidos usados para a produção de anticorpos são selecionados de fragmentos peptidicos 14-mer de IgGl representados na SEQ ID NO: 5-11, onde o residuo terminal-C do polipéptido ou péptido representa a o residuo a montante (lado terminal-N) do local de clivagem como representado na Tabela 1 dos pares de clivagem do residuo. Fragmentos compreendendo o domínio de charneira, p.ex., -T-C-P-P-C- de IgGl (resíduos 7-11 da SEQ ID NO: 1), serão multimérico devido à formação de ligações dissulfeto, a não ser que os resíduos de cisteína (C) tenham sido substituídos com p.ex., resíduos de alanina (A).

Numa forma de realização específica, o anticorpo é gerado usando um péptido 8-mer correspondendo à sequência de aminoácidos no lado terminal amino do local de clivagem de MMP-3 (TCPPCPAP, resíduos 7-14 da SEQ ID NO: 1), ou péptidos estendidos correspondendo ao local da glutamil endopeptidase (TCPPCPAPE, resíduos 7-15 da SEQ ID NO: 1); ou o local IdeS (TCPPCPAPELLG, resíduos 7-18 da SEQ ID NO: 1) . Quando usados como agente imunogénicos, os péptidos podem convenientemente ser ligados a hemocianina da espécie Megathura crenulata (KLH) através do terminal-N ou através de um resíduo ou péptido de ligação adicionado.

Os anticorpos podem assim ser obtidos usando qualquer uma das técnicas de hibridoma bem conhecidas do estado da técnica, ver, p.ex., Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (19972001) . Urn anticorpo da invenção pode incluir ou pode ser derivado de qualquer mamífero, tal como mas não estando limitado a um humano, um ratinho, um coelho, um rato, um roedor, um primata, ou qualquer combinação relacionada e inclui anticorpos anti-integrina humanizados e/ou CDR-transplantados, quiméricos, de mamíferos, roedores, primaras, humanos isolados, imunoglobulinas, produtos de clivagem e outras frações específicas e variantes relacionadas.

Bibliotecas de anticorpos fágicos podem também ser usados para identificar novos domínios de ligação com a especificidade desejada para sdgG e outros fragmentos de anticorpos.

Na produção ou seleção de anticorpos ou outros agentes de ligação úteis na presente invenção, os reagentes específicos usados para este propósito são um aspeto adicional da invenção. Os agentes imunogénicos ou reagentes de testes específicos desenvolvidos para este propósito são caracterizados por compreenderem resíduos em redor da região charneira de IgGl, incluindo, mas não estando limitados aos resíduos SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFP (SEQ ID NO: 1) como representado na Fig. 3. As regiões charneira de outros anticorpos isotípicos humanos que produzem fragmentos de anticorpos após contacto com enzimas proteolíticas podem também servir como fontes de compostos análogos para propósitos de criação, seleção ou teste de anticorpos ou outras moléculas de ligação a produtos de clivagem enzimáticos. Uma região análoga da cadeia pesada de IgG4 humana inclui resíduos TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPSCPA PEFLGGPSVF LF (SEQ ID NO: 2) e para IgG2 e IgG3 como representado nas SEQ ID NOS: 3 e 4, respetivamente. Em cada um dos casos, os péptidos consistem de pelo menos 5 aminoácidos contíguos selecionados de sequências da região charneira IgG humana da SEQ ID NO: 1, 2, 3, ou 4 que se encontram no lado terminal amino do um local de clivagem proteolitico. Num aspeto, o agente imunogénico ou péptido especifico usado para a produção de anticorpos compreendem pelo menos a região charneira de IgGl, definida como os residuos -T-C-P-P-C-. Numa forma de realização especifica, o péptido é um análogo peptídico 12-mer da região charneira inferior de IgGl humana e juntando o domínio CH2 possuindo a sequência TCPPCPAPELLG (resíduos 7-18 da SEQ ID NO: 1).

Um método genérico para a criação de fragmentos peptídicos úteis na criação, seleção ou teste de anticorpos ou outras moléculas de ligação a produtos de clivagem enzimática é útil para a) identificar o resíduo terminal-N de um par de resíduos de uma cadeia pesada de anticorpo clivada por uma protease como exemplificado pelas proteases específicas do Exemplo 1 e representado na Tabela 1, b) definir a partir de 5-14 ou mais resíduos a montante daquele local de clivagem onde o resíduo terminal-N irá tornar-se o terminal-C da sequência definida e c) produzir o péptido em quantidades suficientes para os propósitos desejados. Péptidos tais como aqueles descritos são aqueles selecionado da SEQ ID NO: 5-11 ou truncamentos terminal-N relacionados. Os péptidos podem ser marcados, conjugados ou entrecruzados ou usados em mistura uns com os outros ou com adjuvantes para propósitos de ligação de teste ou como agente imunogénicos ou alvos de rastreio para uso p.e.x, na seleção de agentes de ligação a partir de uma biblioteca fágica.

Aqui divulgados, num aspeto, estão moléculas de ácidos nucleicos isolados compreendendo, sequências complementares, ou hibridizantes de, um polinucleótido codificando os péptidos ou anticorpos específicos acima mencionados, compreendendo pelo menos uma sequência, domínio, fração ou variante relacionada específica. A presente publicação engloba ácidos nucleicos isolados codificando pelo menos um anticorpo monoclonal isolado possuindo especificidade para sdgG como aqui descrita e um vetor de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico isolado, e/ou uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica compreendendo o ácido nucleico isolado A célula hospedeira pode opcionalmente ser pelo menos uma selecionada de células E. Coli, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, de mieloma, de linfoma, de levedura, de inseto ou de planta, ou qualquer derivado, célula transformada ou imortalizada relacionada. Também divulgado está um método para a produção de pelo menos um anticorpo da publicação, compreendendo a tradução do ácido nucleico codificante do anticorpo sob condições in vitro, in vivo ou in situ, de tal forma que o péptido ou anticorpo é expresso em quantidades detetáveis ou recuperáveis. Métodos de Uso

Os reagentes da invenção são úteis na deteção de patologias de doenças quando o processo da doença invoca, é o resultado de, causa, ou encontrasse de algum modo associado com a atividade proteolitica e enzimas proteoliticas, proteases. Tais doenças e processos incluem aqueles precipitando ou agravando, produzidos por ou resultando de infeção, derrame, doença vascular, enfarte do miocárdio e vários outros distúrbios inflamatórios crónicos e agudos. Os requerentes desta invenção demonstraram que um biomarcador particularmente útil da atividade proteolitica é sdgG, que é detetado em niveis aumentados em alguns dos distúrbios acima mencionados. Uma vez que sdgG é gerado localmente no local da patologia ou do processo patológico ou infeção, sdgG fornece um marcados especifico e único de tais processos como uma medida do envolvimento de tecidos específicos ou tipos celulares no local da doença.

Numa forma de realização do método da invenção, uma amostra é obtida de um sujeito suspeito de possuir, ou tendo possuindo, ou tendo sido tratado para uma doença caracterizada por níveis elevados de proteases. A amostra é contactada com um agente de ligação, tal como uma preparação de anticorpos, possuindo especificidade para fragmentos de clivagem de IgG conhecidos por resultarem do contacto entre a protease estimulada pela doença e uma população de IgG sérica. 0 método da invenção pode ser usado para avaliar se pacientes previamente diagnosticados com uma doença ou condição se encontram em risco de uma doença avançada (p.ex., metástases cancerígenas, crescimento tumoral agressivo, infeção persistente etc.).

Nalguns casos, por exemplo num paciente de cancro, a deteção de sdgG pode ser útil para indicar uma progressão da doença avançada envolvendo espalhamento metástico que é conhecido por envolver a elaboração de enzimas proteolíticas, especialmente NMPSs. Nalguns aspetos, a doença neoplásica partilha estes mecanismos geralmente com processos inflamatórios, reparação de tecidos, e cura (Coussens, L.M. and Werb, Z. 2002. Nature 420 (19) : 860-867). Outros estudos demonstraram que, por exemplo, a diminuição nos níveis lipídicos correlaciona-se tanto com uma redução no risco de eventos cardíacos e vasculares, p.ex., trombose e com uma redução nas MMPs tais como MMP-2 e MMP-9 e que aquelas enzimas são produzidas por placas ateroscleróticas (Deguchi, J, Maanori, A., Ching-Hsuan, T. et al. 2006 Circulation 114: 555-62). Assim, os métodos da invenção são particularmente aplicáveis mas não limitados a pacientes com graves síndromes artríticos (RA, espondilite anquilosante), certos cancros (especialmente cancro da mama inflamatório) , configurações arteriais coronárias graves (enfarte do miocárdio e insuficiência cardíaca congestiva) e outras doenças tais como asma. 0 método da invenção pode ser usado para distinguir essas doenças e condições em que a patofisiologia envolve ou induz proteases capazes de atuar em IgG de outras patologias não caracterizadas por níveis aumentados de proteases secretadas ou onde as proteases não clivam IgG.

Assim, enquanto o método de utilização de reagentes aqui descritos são específicos para a deteção de fragmentos clivados, outras análises específicas dos fragmentos clivados poderiam incluir uma análise da especificidade de ligação das regiões variáveis do anticorpo clivado. Por exemplo, um ensaio de uma fase sólida que combina a seletividade de ligação ao antigénio com a deteção de anticorpos fragmentados poderia ser usada para determinar de certos antigénios e proteases se encontram co-localizadas num sujeito assim fornecendo informação acerca da natureza do tecido, doença, ou patologia no local da atividade proteolítica. 0 isolamento de sangue é a forma mais frequentemente praticada de amostragem de tecido de sujeitos, humanos ou animais, saudáveis ou doentes. Desde que sdgG seja encontrado sistemicamente, e não esteja restringido ao local de formação, isto é, o local da atividade proteolítica, é um marcador repórter para a atividade da doença que pode estar localizada em compartimentos específicos. Um desses compartimentos é o fluído sinovial. Assim, a recoleção de sangue ou soro fornece uma fonte conveniente e exequível para a deteção de doenças precoces usando os reagentes e métodos fornecidos pela presente invenção. Alternativamente, a amostragem das configurações locais tais como fluído sinovial RA, exsudados pulmonares, biópsias e semelhantes poderia também ser aplicada a pacientes em qualquer estádio incluindo diagnóstico ou em pacientes com uma doença avançada. Fragmentos de anticorpo clivados podem ser detetados nessas amostras tecidulares por marcação direta (métodos imunohistoquimicos) ou em amostras fracionadas derivadas das amostras.

Amostras tecidulares, incluindo sangue, deveriam ser tratadas de forma a inibir quaisquer proteases residuais ativas. A quelação de metais (p.ex., EDTA) inibe eficazmente MMPS. Iodoacetamida bloqueia proteases cisterna (p.ex., IdeS), proteases de serina podem ser bloqueadas com DFP e compostos similares. Proteases ativas encontram-se presentes no fluido sinovial e deverão ser processadas concordantemente. Amostras podem também ser mantidas congeladas até ao momento do ensaio. Uma veze tendo sido as amostras apropriadamente processadas, os reagentes específicos para sdgG da invenção podem ser usados em quaisquer técnicas baseadas em anticorpos tais como ELISA, formatos de ensaio relacionados com microesferas, RIAs, conhecidos por aqueles habilitados no estado da técnica, ou ainda por desenvolver.

Os reagentes de fragmentos de clivagem proteolíticos anti-IgG da invenção podem ser empacotados num kit para uso em investigação ou diagnóstico e para venda comercial conjuntamente com outros reagentes tais como agentes tamponizantes e padrões tais como IgG humana intacta e quantidades conhecidas de IgG clivado conjuntamente com instruções para a medição e, se desejado, quantificação dos fragmentos de clivagem proteolítica de IgG em amostras tecidulares recolhidas de pacientes.

Anticorpos da invenção imunoespecificos para fragmentos de clivagem peptídicos da região charneira são capazes de ligação a fragmentos clivados enzimaticamente de IgG que retêm dominios de ligação ao antigénio, p.ex, Fab, F(ab')2, scIgG, e assim restaurar as caracteristicas de ligação Fc e funções executoras associadas ao fornecer uma região-Fc intacta. Assim, os anticorpos criados pelos métodos aqui descritos ou possuindo a propriedade de ligação a fragmentos de anticorpos criados enzimaticamente in vivo podem ser úteis como moléculas terapêuticas. Os anticorpos de fragmentos de clivagem anti-IgG da presente invenção podem ser usados para tratar pacientes em que uma doença caracterizada por clivagem proteolitica de IgG. Num aspeto, os anticorpos de fragmentos de clivagem anti-IgG podem ser usados para restaurar as funções executoras para os fragmentos de anticorpo que retêm capacidade de ligação especifica direcionada.

Além de ter sido descrita a invenção em termos genéricos, as formas de realização da invenção irão ser adicionalmente divulgadas nos seguintes exemplos.

EXEMPLO 1: ANÁLISE DA CLIVAGEM DA CADEIA PESADA DA IgG HUMANA A proteólise da cadeia pesada da IgG humana por metaloproteinases da matriz, catepsinas, elastase neutrofilica humana (HNE), e enzimas patogénicas selecionadas tais como glutamil endopeptidase estafilocócica (V8 protease), e enzima decompositora de imunoglobulina proveniente de estreptococus (IdeS) foi estudada.

Um anticorpo monoclonal purificado compreendendo uma cadeia pesada da IgG humana foi contactado com as proteases descritas e a amostragem foi conduzida ao longo de várias durações de contacto. Um fragmentação nas amostras foi avaliada usando a tecnologia "lab-on-a-chip" de microfluidica Agilent para bioamostragem de tamanho in vitro (Goetz H et al. Biochemical and Biophysical Methods 60; 281-293, 2004) .

Substratos de Anticorpo. Anticorpos monoclonais utilizados foram ou anticorpos totalmente humanos, anticorpos murinos humanizados recombinantes ou anticorpos quiméricos humanos/murinos possuindo dominios constantes humanos e regiões charneira da classe/subclasse IgGl kappa e espécies: Mabl é uma IgGl humana que se liga a um agente patogénico, Mab2 (anti-citocina) é um anticorpo IgGl quimérico humano/murino possuindo regiões constantes humanas e dominio charneira, e Mab3 é uma IgGl humanizada CDR-transplantada. Todos os anticorpos continham uma cadeia leve kappa.

Enzimas proteolíticas e Métodos de teste. pro-MMP-2, MMP-7 e pro-MMP-9 humanos foram obtidos da empresa Chemicon International (Temecula, CA) e foram ativados por incubação com 1 mM acetato p-aminofenilmercúrico (ΑΡΜΑ; CalBiochem, San Diego, CA) durante 16 horas a 37°C antes de uso (Marcy et al., 1991). MMP-12 ativo humano recombinante foi obtido a partir da empresa R&D Systems. MMP-1 recombinante foi uma oferta generosa do Dr. Hideaki Nagase. pro-MMP-3 humano foi transientemente expresso em células HEK com um segmento histidina no lugaz dos dominios de charneira e hemopexina. A variante pro-MMP-3 foi ativada por incubação a 55 °C durante 25 minutos como descrito (Koklitis et al., 1991). Catepsinas B, D, G, S e proteinase 3 foram obtidas a partir de Athens Research & Technology (Athens, GA). As enzimas de coagulação trombina, F.Xa, F.IXa, F.XIIa e calicreína, assim como plasmina e plasminogénio, foram adquiridas a partir de Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN) . 0 ativador de plasminogénio tecidular (Ativase) foi o produto de Genentech (South San Francisco, CA) . Estreptocinase e proteína C activada foram obtidas a partir de Sigma (St. Louis, MO). Estafilocinase foi obtida a partir de Affinity BioReagents (Golden, CO). Glutamil endopeptidase I proveniente de Staph, aureus V8 foi obtida a partir de Pierce Biotechnology (Rockville, IL) . Enzima decompositora recombinante de imunoglobulina proveniente de Streptococus pyogenes (IdeS) foi fornecida por Dr. Lars Bjorck da Universidade de Lund (Lund, Sweden).

As digestões de proteinase de IgGs purificadas foram realizadas a pH 7,5 em tampão fosfato salino (PBS= ou, para as metaloproteinase, em tampão Tris salino a 37 °C. Cloreto de cálcio foi incluído nas reações de metaloproteinase a lmM para MMP-12 e 10 mM para MMP-3; de outra forma nenhuns aditivos foram usados. As concentrações de anticorpos foram tipicamente 1 ou 2 mg/mL e as reações foram iniciadas por adição da enzima a 1% (peso/peso) a IgG. Alíquotas (10-20 pL) foram removidas em tempos indicados e as reações foram paradas ou com ajuste a 20 mM de EDTA (incubações com metaloproteinases) ou com ajuste a 1 mM de iodoacetamidade (cisteína proteinases) ou por rápido congelamento.

As principais posições de clivagem proteolítica na região charneira de IgGl foram identificadas para fragmentos gerados enzimaticamente por sequenciação do terminal-N do fragmento Fc purificado (MMP-3 e MMP-12) e/ou análises espectrométricas de massa de alta resolução do Fab purificado (elastase neutrofílica, plasmina) e fragmentos F(ab')2 (catepsina G, glutamil endopeptidase e IdeS). Um fragmentoação foi avaliada usando a tecnologia "lab-on-a-chip" de microfluidica Agilent.

Resultados. Uma lista de proteinases que foram examinadas e os resultados da análise dos produtos primários da clivagem proteolitica da IgGl humana encontram-se representados na Tabela 1. Várias enzimas não fragmentaram IgGl sob as condições usadas. Entre as proteinases ativas, as atividades especificas relativas nas condições descritas foram: IdeS > MMP-12 > MMP-3, glutamil endopeptidase > elastase neutrofilica > catepsina G, plasmina > MMP-2, MMP-9 > MMP-7. A Figura 2 representa análises de bioamostragem de tamanho de IgG antes ou durante o tratamento enzimático proteolitico. MMP-3, glutamil endopeptidase I e IdeS foram, cada uma, demonstradas clivar IgGl de um modo faseado (Figuras 2A, 2B e 2C, respetivamente) . Em cada caso, um intermediário precoce de aproximadamente 135 000 Da foi gerado tendo sido subsequentemente convertido numa espécie de aproximadamente 100 000 Da. Um fragmento de aproximadamente 35 kDa, presumivelmente o monómero Fc, foi também formado durante estas reações. O peso molecular (35 kDa) medido por migração em gel é maior do que o previsto pela sequência aminoacidica do fragmento da cadeia pesada que poderia ser de 211 a 215 residuos (entre o residuo 232 e 237 até ao residuo 447 no terminal-C da cadeia pesada) mas consistente com o fragmento contendo o local de glicosilação no domínio CH2. O desaparecimento da IgG intacta (160 000 Da) ocorreu ao longo de um período de várias horas com MMP-3 e glutamil endopeptidase I, e num minuto ou menos com IdeS sob essas condições. Todas as digestões foram realizadas sob condições comparáveis às descritas. 0 intermediário de 135 kDa foi descoberto resultar de uma única clivagem proteolitica numa das cadeias peadas do dominio charneira inferior. Sob condições não-desnaturantes, o intermediário é indistinguível da IgG intacta em certas propriedades fisicas, tais como a migração em cromatografia de exclusão por tamanho (dados não representados) . Contudo, em géis SDS, e no presente sistema de electroforese microcapilar, o fragmento de clivagem da região Fc (dominios CH2-CH3 da cadeia pesada) separam-se do resto da estrutura para revelar o intermediário de tamanho reduzido (135 kDa) . 0 tamanho desta espécie é consistente com uma IgG clivada uma única vez como reportado por Gearing (2002 supra). Incubação prolongada de IgGl com as três enzimas resultou na conversão do intermediário sdgG no fragmento F(ab')2 e Fc.

Entre as enzimas exibindo a capacidade de clivarem IgGl dos diferentes substratos testados baseados em anticorpos IgGl monoclonais, foi uma descoberta consistente que a clivagem inicial até ao intermediário clivado uma única vez foi relativamente rápida, e tempos adicionais foram requeridos para a segunda clivagem em F(ab')2 ocorrer. Também representado na Figura 2D está uma digestão de Mabl com elastase neutrofilica humana (HNE). HNE difere das três enzimas acima descritas no sentido que clivou IgG na região charneira superior para produzir o fragmento Fab e um dimero Fc ligado através de uma ligação dissulfeto.

As principais posições de clivagem proteoliticas na região charneira IgGl foram identificadas para o fragmento Fc purificado (MMP-3 e MMP-12) e/ou análises espectrométricas de alta resolução do Fab purificado (elastase neutrofilica, plasmian) e fragmentos F(ab')2 (catepsina G, glutamil endopeptidase e IdeS). A sequência aminoacidica da região charneira de IgGl humana encontra-se apresentada na Figura 3, com as posições identificadas das clivagens enzimáticas indicadas. Digestão posterior com proteinases que clivaram a região charneira superior produziu dois fragmentos Fab; enzimas que clivaram a região charneira inferior (abaico das ligações dissulfeto na região charneira básica) produziu F(ab')2.

Os locais dominantes de clivagem enzimática foram identificados ou conformados para cada enzima incluindo MMP-3 e MMP-12 humana, catepsina G humana, HNE humana, glutamil endopeptidase I estafilocócica e IdeS estreptocócica com base na análise de ambos os resíduos do terminal carboxilo e terminal amino nos fragmentos F(ab')2 ou Fc, respetivamente (Tabela 1). Locais de clivagem secundários foram observados em alguns casos durante incubações prolongadas (p.ex., catepsina G e HNE), e foi incerto se estas são locais de clivagem alternativos para a proteinase indicado ou o resultado da presença de contaminantes menores, de proteinase, nestas preparações enzimáticas. Os locais de clivagem MMP-12 e HNE em IgG não foram reportados previamente. Para outras proteinases, as principais posições de clivagem de IgG identificadas são concordantes com resultados previamente reportados (Chuba, 1994; Diemel et al., 2005; Gearing et al., 2002; Vincents et al., 2004; Yamaguchi et al., 1995).

As posições de clivagem diferem levemente entre as enzimas; com proteólise ocorrendo após prolina-245, glutamato-246 e glicina-249 para MMP-3, V8 e IdeS, respetivamente. Estas diferenças na posição de clivagem não impactam o peso molecular como detetável usando o sistema de bioamostragem de tamanho eletroforético microcapilar (Agilent Technologies). Tempos de incubação maiores com MMP-3, V8 e IdeS permitem a conversão completa para fragmentos F(ab')2. A digestão de IgGl por HNE difere de outras proteases uma vez que cliva antes das ligações dissulfeto da região charneira central (cisternas 238 e 241) na histidina 236 para produzir um produto Fab e Fc ligado via ligação dissulfeto (ver Fig. 2D).

Os locais de clivagem são baseados no sistema de numeração EU e relacionam-se com os residuos representados na Fig. 3 e SEQ ID N0:1 que engloba desde Ser219 até Phe243 de um anticorpo de classe IgGl humana. Várias proteinases clivaram IgGl abaixo do dominio charneira e produziram fragmentos F(ab')2 de comprimentos ligeiramente diferentes (variando de Ala231 a Gly237) . Muitas das proteinases decompositoras de IgG caracterizadas neste estudo foram reportadas como sendo expressas, ou sendo abundantes, em locais de inflamação (HNE, catepsina G, MMP-12), no tumor ou no ambiente relacionado com o restabelecimento de uma ferida (MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, plasmina), e em locais de infeção (glutamil endopeptidase, IdeS) (Dollery et al., 2003; Kilian et al., 1996; Rooijakkers et al., 2005; Schonbeck et al., 1999; Shapiro, 1999; Sukhova et al., 1998; van Kempen et al., 2006; Vincents et al., 2004)). Para muitos casos, é improvável que a expressão extracelular de proteinase especificas seja primariamente dirigida a IgG hospedeiro; em vez disso, a sua elaboração está associada com a fisiologia da doença (p.ex. metaloproteinases da matriz no ambiente circundante do tumor). Em todo o caso, estes estudos in vitro, envolvendo a degradação de anticorpos monoclonais/enzimas purificadas indicaram que IgGs humanos não são resistentes a um número de proteinases com potencial relevância para doenças humanas.

Para enzimas que converteram IgGl em F(ab')2 (a maioria), as clivagens foram altamente especificas e auto-limitantes (ao contrário da digestão com pepsina que reduz o dominio

Fc a péptidos pequenos. Com a exceção de IdeS, as taxas de clivagem de IgGl com a maioria destas proteinases extracelulares foi geralmente inferior à observada com pepsina sob as suas condições ótimas (p.ex., pH 4,0) . A fragmentação proteolítica em F(ab')2 prosseguiu via intermediários clivados uma única vez num processo de dois passos. O intermediário clivado uma única vez de IgGl foi previamente proposto como um possível intermediário durante a digestão de IgGs com MMP-3 (Gearing et al., 2002) e com IdeS (Vincents et al., 2004). Nos presentes estudos, foi consistentemente observado que a primeira clivagem para o intermediário clivado uma única vez ocorreu relativamente rápido quando comparado com uma segunda clivagem, mais lenta, que gera F(ab')2. Os estudos aqui reportados focaram-se em IgGl uma vez que é o isótipo predominante de IgG na circulação humana. Um número limitado de outras experiências com isótipos humanos foi realizado para determinar suscetibilidades relativas para MMP-3 e IdeS. Nestes foi observado que IgG4 foi comparável em suscetibilidade a IgGl, enquanto que IgG2 E iGg3 se revelaram mais resistentes sob estas condições (dados não representados). Investigações comparáveis de degradação de IgA, IgM, IgE, IgD não foram realizadas.

Toda a informação se encontra sumarizada na Tabela 1, onde "Proteinases de coagulação" incluíam F.XIIa, FIXa, F.Xa, trombina e proteína activada; plasmina foi co-incubada com plasminogénio graças a ativadores de plasminogénio; tPA, estreptocinase e estafilocinase; "ativadores de plasminogénio isolados" são-no sem plasminogénio; e os MMPs foram proteinases recombinantes obtidas ou como a forma ativa ou a pro-enzima como detalhado na seção "Materiais"; e "Nenhuma" denota nenhuma clivagem detetável e, 24 horas. Exceto quando indicado em contrário, todas as enzimas eram humanas. As designações dos resíduos estão aplicadas segundo sistema de numeração EU para a cadeia pesada do anticorpo IgGl onde os 25 residuos da SEQ ID NO: 1 correspondem aos residuos dec219 até 243 da cadeia pesada madura completa.

Tabela 1.

(1) Barrett A. J., Rawlings N. D. and Woessner J. F. (Eds.), Handbook of Enzimas proteoliticas Vol. 1,

Elsevier, Amsterdam, 2004. (2) Barrett A. J., Rawlings N. D. and Woessner J. F.(Eds.), Handbook of Enzimas proteoliticas Vol. 2,

Elsevier, Amsterdam, 2004. (3) Powers, JC . . "Enzimas proteoliticas and Disease

Treatment" 1982. In: Feeney and Whitaker (eds).

Modification of Proteins: Food, Nutritional, and

Pharmacological Aspects. Advances in Chemistry Series 198. ACS, Washington, D.C. 1982 pp 347-367. (4) Tchetverikov I., Ronday Η. K., van El B., Kiers G. H., Verzijl N., TeKoppele J. M., Huizinga T. W. J. , DeGroot J. and Hannemaaijer R. , 2004. MMP Profile in paired serum and synovial fluid samples of patients with rheumatoid arthritis. Ann . Rheum.Dis. 63, 881883. (5) Vincents B., von Pawel-Rammingen U., Bjorck L. and

Abrahamson M., 2004. Enzymatic characterization of the

streptococcal endopeptidase, IdeS, reveals that it is a cysteine protease with strict specificity for IgG cleavage due to exosite binding. Biochemistry 43, 15540- 15549. (6) Sun H., Ringdahl U., Homeister J.W., Fay W.P., Engleberg N.C., Yang A.Y., Rozek L.S., Wang X., Sjobring U., Ginsburg D., 2004. Plasminogen is a critical host pathogenicity factor for group A estreptocócica infection. Science. 305, 1283-1286.

EXEMPLO 2: CLIVAGEM DE IgG NUM EXSUDADO INFLAMATÓRIO

Exsudados inflamatórios e outros fluídos são esperados possuírem enzimas proteolíticas associadas com a inflamação e tratamento de feridas. Para este propósito, amostras de fluído de feridas foram obtidas a partir de Ethicon Inc.

Primeiro, um substrato de anticorpo, que compreende domínios constantes da cadeia pesada foi bioatinilado aleatoriamente. Dez microlitros do anticorpo de substrato bioatinilado do anticorpo de substrato bioatinilado foram adicionados a 190 microlitros do fluído da ferida e incubados a 37°C durante 8-24 horas. Em tempos específicos, amostras foram removidas. A IgG inicial e as amostras dos vários momentos foram aplicadas em poços separados a um gel 4-12% gel Bis-Tris e sujeitas a SDS-PAGE. As bandas separadas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e, após bloqueio com 0,1M de tampão Tris salino contendo 0,1% Tween 20 e 10% de leite de bloqueio ("Blotto"), a marcação foi desenvolvida usando reagente AVIDINA-D-peroxidase de Armoracia rusticana seguida por substrato TMB (membranA).

Como evidenciado pela imagem do gel representada na Figura 4, existiu uma perda de IgG intacta por 8 hr e o surgimentos de bandas similares em tamanho aos padrões F(ab')2 e Fab. Os resultados desta experiencia indicam que a proteólise de IgG por enzimas numa fluido inflamatório ocorre ao longo de um período de várias horas e produz fragmentos que correspondem com fragmentos produzidos por proteólise in vitro com enzimas purificadas.

EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE REAGENTES A determinação da presença de fragmentos de anticorpo no hospedeiro (paciente), fragmentos produzidos por proteases endógenas requer um reagente que seletivamente se liga à IgG clivada mas não à IgG intacta. Ambas as identificações do componente clivado e a diferença quantitativa entre o conteúdo do fragmento em amostras de pacientes com doenças e população normal deverão ser capazes de ser avaliadas usando o reagente. A deteção de quantidades desconhecidas, mas presumivelmente pequenas de fragmentos IgG em soluções contendo concentrações relativamente altas de IgG intacta é difícil. Embora sdgG tenham sido identificada como um possível fragmento de clivagem de IgG (Gearing 2002 supra), a sua quantificação em amostras humanas não foi previamente realizada. Para este propósito, reagentes com a necessária especificidade foram desenvolvidos em coelhos com um elevado grau de especificidade para IgG clivada mas não IgG intacta.

Três análogos peptídicos conjugados, e progressivamente mais longos de cadeia simples da região charneira da IgGl humana foram usados para imunização (na Invitrogen Corporation). Um péptido de 8-mer correspondendo à sequência de aminoácidos no lado terminal amino do local de clivagem de MMP-3 foi covalentemente ligado à hemocianina da espécie Megathura crenulata (KLH) através do terminal-N (TCPPCPAP, resíduos 7-14 da SEQ ID NO: 1). Péptidos alongados correspondendo ao local da glutamil endopeptidase (TCPPCP APE, resíduos 7-15 da SEQ ID NO: 1) e do local IdeS (TCPPCPAPELLG, resíduos 7-18 da SEQ ID NO: 1) foram separadamente preparados como agente imunogénicos. Coelhos Nova Zelândia (dois por agente imunogénico) foram imunizados por injeção subcutânea de 0,2 mg de péptido conjugado em adjuvante de Freund completo e reforçadas com 0,1 mg de antigénio em adjuvante de Freund incompleto nos dias 14, 24 e 56. O soro foi recolhido às 4, 8 e 10 semanas e armazenado segundo agente imunogénico para purificação de anticorpo. Os títulos imunológicos foram monitorizados por um ELISA baseado no péptido antigénico de fase sólida.

Purificação por afinidade de anticorpos empregou os respetivos antigénios peptídicos imobilizados num suporte ativado. O anti-soro de dois coelhos imunizados com o mesmo antigénio foi armazenado e passado através da coluna de antigénio, após o que a coluna foi extensamente lavada. Anticorpos específicos foram eluídos enquanto espécies de baixa afinidade e espécies de elevada afinidade usando 3M KSCN e 0,1M glicina, pH 2,5, respetivamente. As duas frações geraram características de ligação indistinguíveis e foram usadas intercambiavelmente e/ou armazenadas. As três frações eluídas separadamente de anticorpos foram subsequentemente sujeita a um segundo passo de adsorção por afinidade, desta vez numa coluna contendo um anticorpo intacto compreendendo as regiões contantes da cadeia pesada da IgGl humana (Mab3) . O objetivo do segundo passo de cromatografia de afinidade foi a remoção de anticorpos indesejáveis que pudessem reconhecer IgG intacta. Contudo, pouco ou nenhum anticorpo de coelho foi adsorvido à coluna de IgG, sugerindo que a população de anticorpos foi reativa apenas com a sequência "clivada" com o seu terminal carboxilo exposto.

Os anticorpos anti-peptidicos individuais de coelho purificados por afinidade foram testados para a sua capacidade para se ligarem a fragmentos gerados enzimaticamente de IgG humana assim como IgG intacta por ELISA (Fig. 5) . Os anticorpos purificados dos coelhos imunizados com KLH conjugado aos resíduos 7-14 da SEQ ID NO: 1 (o análogo do local MMP-3) não se ligaram à IgG intacta e foram altamente específicos para sdgG e F(ab')2 produzido por digestão de IgG com MMP-3. Esta preparação de anticorpos apresentou reatividade mínima relativamente a sdgG e F(ab')2 produzidos com a protease V8 ou IdeS. Em contraste, os anticorpos obtidos de coelhos imunizados com o análogo peptídico da região charneira no local de clivagem V8 (resíduos 7-15 da SEQ ID NO: 1) e o análogo peptídico da região charneira do local de clivagem de IdeS (resíduos 7-18 da SEQ ID NO: 1) apresentaram um perfil de ligação com reatividade cruzada para scIgGs e F(ab')2 produzidos por qualquer uma dessas duas enzimas. Contudo, essas preparações mostraram uma reatividade mínima para os produtos digeridos MMP-3. Nenhuma das preparações de anticorpos foi comparavelmente reativa com os fragmentos, incluindo F(ab')2 e scIgG, produzidos por três diferentes enzimas como representado na Figura 6. 0 uso pretendido do reagente anti-região charneira é a deteção de scIgGs e F(ab')2 (e outros fragmentos potenciais) que são produzidos em complexas configurações in vivo por enzimas presentes em tecidos específicos da doença ou produzidos por tipos celulares ou populações de células específicas da doença, p.ex., macrófagos infiltrantes ou neutrófilos. Para uma ótima cobertura de potenciais fragmentos de IgG, foi considerado preferível possuir um perfil tão amplo de reconhecimento de locais de clivagem quanto possível. Por esta razão, uma mistura de cada uma das três frações de anticorpos foi preparada a 0,33 mg/mL de cada componente (total = 1 mg/mL) para uso em Western blots e testes de ELISA baseados em soro subsequentes. Este reagente foi denominado de RAH-1.

EXEMPLO 4: ENSAIO DE IMUNOGLOBULINA CLIVADA DE CADEIA SIMPLES 0 novo ensaio empregado para deteção de sdgG em soro usando, como reagente de captura, o RAH-1 capaz de se ligar a IgG humana clivada, mas nenhuma IgG humana intacta é descrita em maior detalhe como se segue.

Usando um ELISA para quimioluminescência, regiões de uma microplaca de 96-poços para quimioluminescência Nunc foram revestidas com RAH-1 a 10 mg/ml em PBS. O resto da placa foi deixado por revestir (IX PBS isoladamente). As placas foram incubadas a 4°C overnight. As placas foram lavadas e 200 ml/poço de Chemicon International's ChemiBLOCKER (C# 2160) foi adicionado às placas e incubado a 37°C durante 30 minutos. O tampão de bloqueio foi aspirado dos poços e os padrões e as amostras foram adicionados à placa. O Mab3 padrão, sdgG digerido com V8, foi adicionado em duplicado começando a 50 mg/ml em PBS contendo 1% caseína e 3% BSA usando diluições seriais de 4x. As amostras de soro do paciente doente foram adicionadas a uma diluição 1:50 no mesmo tampão. As placas foram lavadas e uma diluição 1:6000 de Jackson Immuno Research's HRP conjugado com fragmento F(ab')2 AffiniPure de burro anti-humano IgG (H+L) que apresente reatividade cruzada a vários animais incluindo coelho foi adicionado a todos os poços. Isto foi adicionado numa diluição de PBS com 1% Caseína e 3% BSA e incubado a 37°C durante uma hora. As microplacas foram lavadas abundantemente e 100/poço de substrato HRP (Roche's BM Chemiluminescence POD, 582 950) foi adicionado segundos antes da placa ser lida num leitor de quimioluminescência. A luminescência média de 0 ng/ml de poços sdgG na curva padrão foi subtraída de todos os poços que foram expostos ao revestimento com RAH-1. Esta subtração contabiliza qualquer reatividade não específica secundária com RAH-1. Depois, o valor de cada doador em poços não-revestidos com RAH foi subtraído do valor previamente ajustado de poços revestidos com RAH. Tal contabiliza para qualquer reatividade não-específica no soro para a placa-

EXEMPLO 5: USO DE REAGENTE PARA DETECTAR ACTIVIDADE PROTEOLÍTICA ASSOCIADA A DOENÇAS 0 reagente RAH-1 foi testado quanto à sua capacidade para detetar fragmentos de IgG noutro fluido inflamatório, o fluído sinovial de um paciente com artrite reumatoide (RA) .

Uma coleção de amostras de fluído sinovial de pacientes com RA foi adquirida comercialmente a partir da empresa Bioreclamation. Amostras foram diluídas 1:5 em tampão de amostra LDS e 10 microlitros de cada amostra carregados num gel 4-12% Bis-Tris. Como um controlo para a reatividade de RAH-1, IgG intacta (Mab3), ou IgG digerida por proteases (digestão parcial de Mab3 com MMP-3, glutamil endopeptidase e IdeS) foi igualmente carregada no gel. Após SDS-PAGE, o gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose e bloqueado com Blotto. A membrana foi então incubada com uma diluição 1:2500 de RAH-1 em Blotto, lavada com 0,1M de tampão Tris salino, pH 7,5 contendo 0,1% Tween 20 e incubado com uma diluição 1:5000 de conjugado IgG de cabra anti-coelho (H&L) peroxidase de Armoracia rusticana. A marcação foi então desenvolvida usando uma membrana TMB. Como representado na Fig. 7, a preparação RAH-1 não reagiu com a IgG intacta, mas detetou scIgG, F(ab')2 possivelmente Fab' de todas as três digestões proteolíticas. Para todas as cinco amostras de fluido sinovial de pacientes de RA, uma banda foi detetada para um tamanho aproximado de scIgG, F(ab')2 e Fab', sugerindo que estes fragmentos proteoliticos estivessem presentes no fluido sinovial de indivíduos com RA.

EXEMPLO 6: USO DO REAGENTE PARA MONITORIZAR A DOENÇA

Plasma do sangue ou soro é mais conveniente para testes de biomarcadores do que fluídos biológicos ou extratos tecidulares, tais como o fluído sinovial. Contudo, a vantagem do fluído sinovial é que é se encontra restringido e o ambiente local em que as proteases são ativas e em que os fragmentos IgG poderão ser esperados de se acumularem como descrito no EXEMPLO 2. Em todo o caso, a facilidade e prevalência do soro para testes torna-o um tecido/amostra consideravelmente mais provável para biomarcadores, incluindo produtos de clivagem de IgG.

Antes de iniciar o teste para fragmentos IgG em diferentes tipos e fontes de soro, foi desejável estabelecer quais os fragmentos de IgG proteolizados que poderiam circular por um período de tempo suficiente para permitir a sua acumulação e quantificação. Para responder a esta questão, um estudo farmacocinético comparativo foi desenhado. A seguinte experiência PK em ratinhos foi modelada em vários estudos similares previamente reportados nos quais IgGs humanas geralmente exibem tempos de meia-vida terminal de 10-20 dias.

Produtos de proteólise fracionados, Mab2 IgGl, e o sdgG e F(ab')2 gerados com MMP-3, foram preparados como se segue. Uma quantidade de 20 miligramas de Mab2 IgG foi digerida com MMP-3 ativado por calor como descrito no EXEMPLO 1. A digestão foi iniciada por adição de enzima a uma solução de 4 mg/ml DE Mab2 em tampão Tris alino contendo 10 mM de CaCl2, pH 7,5 a 37°C. A reação foi terminada através da adição de EDTA a uma concentração final de 20 mM às 48 horas. Não foi observada nenhuma IgG intacta e a percentagem de sdgG, F(ab)2 e Fc foi de 24% 41% e 36%, respetivamente, com base numa bioanálise de tamanho Agilent (8862-67). A fração digerida terminada foi sujeita a uma purificação de dois passos para remover o fragmento Fc e para separar sdgG e F(ab)2 purificados. No primeiro passo, a fração digerida foi sujeita a cromatografia usando proteína A-sefarose. O material não-ligado da coluna continha o fragmento F(ab)2 e nenhuma IgG intacta ou sdgG detetável. Tratamento da coluna com 0,1M de citrato de sódio, pH 3,5, resultou na eluição de uma mistura de componentes contendo Fc, o fragmento Fc e scIgG. As frações foram imediatamente neutralizadas a pH 7 através da adição de 1/10 do volume de Tris 2M, pH 7,0. O material neutralizado foi concentrado até aproximadamente lmL e dialisada em tampão fosfato salino, pH 7.5. O fragmento Fc foi separado de sdgG por cromatograf ia de exclusão por tamanho numa coluna Superdex 200 (volume da coluna = 100 mL) . Dois picos eluíram da coluna, que foram subsequentemente identificados usando a técnica de bioensaio de tamanho Agilent previamente descrita como fragmentos de 135 kDa colocados na posição de banda do gel de sdgG e um pico com menor peso molecular identificado como o fragmento de monómero Fc de aproximadamente 35 kDa. Os componentes sdgG e F(ab)2 purificados foram contactados com ActicleanEtox (0,5mL de gel por 5 mL de cada solução de proteina) para reduzir os niveis de endotoxina a especificações AALAC para permitir injeção intravenosa em ratinhos (<40 EU/kg) .

Para este estudo, a quantidade em miligramas equivalente (1,9 mg/kg) de anticorpo monoclonal quimérica murino-humano intacto, Mab2 IgGl, e os fragmentos sdgG e F(ab')2 gerados com MMP-3 foi testada como abaixo descrito.

Um grupo de vinte e um ratinhos Balb/c fêmeas (Ace Animais) foi usado para o estudo pK. Sangramentos terminais foram realizados através de punção cardiaca de três ratinhos selecionados aleatoriamente da experiencia servindo como controlos de base. Os remanescentes ratinhos Balb/c fêmea foram pesados e colocados em seis grupos iguais. Dois grupos foram injetados com Mab2 IgGl, dois grupos com Mab2 scIgGl produzido com MMP-3 e dois grupos com Mab2 F(ab')2 produzido com MMP-3. Todas as injeções foram i.p. a um volume de dosagem constante de 10 ml/kg baseado no peso individual do animal a 0,19 mg/ml. Desta forma, cada animal recebeu uma dose de 1,9 mg/kg no dia zero Aproximadamente 80 pL de sangue foi recolhido às 1 h, 24 h, 7 d, 21 d, 35 d do primeiro de dois grupos e às 5 h, 48 h, 14 d e 28 d do segundo grupo. As amostras de soro foram armazenadas a 20°C até serem testadas.

As concentrações de IgG e de fragmentos de IgG do soro recolhido foram quantificadas através de um ensaio de imunoadsorção competitiva enzimática (ELISA). Uma diluição 0,5 pg/ml em PBS da Jackson Immuno-research: IgG de cabra anti-humano, especifica para o fragmento F(ab')2 (com reatividade cruzada minima para proteínas do soro bovino, equino e murino) foi usada para revestir microplacas Costar 3369. As placas foram bloqueadas com PBS/caseina/BSA. Após bloqueio, os padrões e amostras foram adicionados em PBS/1% caseina/3% BSA. Os padrões incluíram diluições seriais dos seguintes: uma IgGl murina/humana, scIgGl MMP-3 murina/humana ou F(ab')2 MMP-3 murina/humana começando a 1000 ng/ml. Cada amostra do ponto de amostragem foi diluída serialmente de 1:10 até 1: 163 840 em PBS/1% caseína/3% BSA. As IgGs humanas ligadas às placas revestidas com o anticorpo de captura anti-humana foram detetadas com 50 μΐ/poço de Jackson Immuno-research: IgG de cabra anti-humano (H+L) (com reatividade cruzada mínima relativamente a proteínas do soro bovino, equino e murino; 109-035-083) e incubar durante uma hora à RT. As microplacas foram abundantemente lavadas e expostas a 50 pL/poço de substrato O-fenilenediamina durante aproximadamente 10 minutos e neutralizada com 50 μΐ/poço de HC1 3M e lidas a 490-650 nm. Os resultados estão representados na Figura 8.

Os resultados da experiência PK murina indicam que o sdgG possui um tempo de vida de circulação prolongado, mas que F(ab')2 não. A eliminação muito rápida de F(ab')2 no ratinho é consistente com o rápido desaparecimento deste fragmento em humanos (Roskos LK et al. Drug Dev. Res. 61: 108-120, 2004). Estes resultados apontam sdgG como a mais abundante, com maior tempo-de-vida, e componente proteolítica útil de IgG para efeitos de biomarcação.

EXEMPLO 7: ENZIMAS PROTEOLITICAS NA DOENÇA

De forma a sdgG ser um útil biomarcador de doença, ela deverá exibir quantidade diferencial em amostras obtidas de pacientes em categorias de doença definidas comparativamente a pessoas saudáveis.

Um soro pertencente a indivíduos doentes, adquirido comercialmente, foi identificado como Genomics Collaborative (agora SeraCare Life Sciences Inc.).Pequenos volumes (300 microlitros) de soro de 10 indivíduos diferentes em cada uma de 8 doenças foram adquiridos. As categorias das doenças foram artrite reumatoide, osteoartrite, asma, diabetes tipo I, cancro da mama, cancro do pulmão, enfarte do miocárdio, e insuficiência cardiaca congestiva. Adicionalmente, soro de 28 voluntários saudáveis normais com idade e género equivalentes foi obtido desta mesma empresa como controlos.

Usando o ensaio como descrito no EXEMPLO 4, as amostras foram analisados e os resultados representados na Fig. 9. O ensaio, baseado na seletividade do reagente RAH-1, demonstrou que os produtos de clivagem de IgG comparáveis aos produzidos por proteases especificas conhecidas são claramente detectáveis e acima dos niveis mantidos em dadores saudáveis ou normais para uma doença autoimune inflamatória, artrite reumatoide. Em contraste, pacientes com osteoartrite apresentaram niveis que foram muito similares e na gama daqueles das amostras de indivíduos normais.

EXEMPLO 8: ENSAIO MODIFICADO DE IgG CLIVADA DE CADEIA SIMPLES

Um ensaio de fase sólida, ELISA, usando o reagente RAH-1 para deteção de sdgG no soro foi descrito no EXEMPLO 4. De forma a otimizar a gama de deteção para concentrações de sdgG em amostras de soro, mudanças especificas foram feitas.

As placas usadas foram placas Immulon 4 HBX (VWR) revestidas com anticorpos policlonais de coelho (RAH-1) a uma concentração de 5 pg/mL em PBS pH 7,2 (100 pL por poço) através da selagem e incubação da placa durante 1 hora à temperatura ambiente. Logo depois, a placa é lavada 3X com PBS, 0,05% Tween (Sigma) ou com um dispositivo automático de lavagem de placa. Todas as amostras e padrões são diluidos com PBS contendo 1 %BSA, 0,05% Tween. Fc-Biotina Anti-IgG (USBiologicals, Swampscott, MA) é o meio de deteção de padrões de sdgG ou amostras de sdgG nas diluições de soro. A placa é bloqueada usando 200 pL de SuperBlock (Pierce) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT) com agitação e depois lavagem da microplaca 3X com PBS, 0,05% Tween num dispositivo automático de lavagem de placa. O material convencional; produto da digestão com protease Mabl é adicionado em duplicado a poços começando desde os 600 ng/mL (100 pL por poço, 3 diluições seriais). As amostras de soro foram diluídas 1:100, 1:200, 1:400, etc. como apropriado). Amostras são adicionadas em duplicado ao mesmo tempo e incubadas durante uma hora à RT numa incubadora com agitação seguida por lavagem 3X com PBS, 0,05% Tween num dispositivo automático de lavagem de placa. A diluição IgG Fc Biotina de 1:20 000 (diluição apropriada em tampão de ensaio) é adicionada a todos os poços (100 pL por poço e incubada durante uma hora à RT numa incubadora com agitação seguida por lavagem 3X com PBS, 0,05% Tween num dispositivo automático de lavagem de placa. A adição de SA-HRP (Estreptavidina conjugada com peroxidase de Armoracia rusticana, Sigma, usada a uma diluição 1:30 000 em PBS, 0,05% Tween, 1 % BSA) é adicionada a todos os poços (100 pL por poço e incubada durante uma hora à RT numa incubadora com agitação seguida por lavagem de 3X com PBS, 0,05% Tween num dispositivo automático de lavagem de placa.

Finalmente, 100 pL de TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina, um substrato da peroxidase) como fornecida pelo fabricante (Sigma) é adicionado a cada poço e permitida incubar durante aproximadamente 10 minutos para desenvolvimento de cor. A reação é parada com 75 pL de IN H2SO4 e a leitura da placa é efetuada a 450 nm.

Usando o formato de ensaio ELISA acima descrito, o ensaio apresentou uma linearidade grandemente melhorada e picos de recuperação de sdgG em soro normal, saudável. A linearidade da diluição do ensaio foi determinada em duas frações de soro, diluídas 1:100 e depois incubadas com Mabl a concentrações de 150 ng/mL e 300 ng/mL, e adicionalmente diluída a concentrações de 0, 25, 75, e 100% soro. Cada diluição da amostra foi analisada em triplicado e as taxas de recuperação do analito foram calculadas. A linearidade foi avaliada através do cálculo de um coeficiente de correlação R2 de um gráfico dos resultados de recuperação do analito observados (eixo das ordenadas) versus e esperados (eixo das abcissas) para cada fração de amostra. Os valores de R2 foram: Amostra 1 baixo 0,9983; Amostra 1 alto 0,9913; Amostra 2 baixo 0,9852; Amostra 2 alto 0,973; e a linearidade de diluição foi de 100% para todas as diluições.

EXEMPLO 9: DETEÇÃO DE IgG CLIVADO DE CADEIA SIMPLES NO SORO

Soro de pacientes de RA foi usado exclusivamente de forma a adicionalmente estudar os resultados no EXEMPLO 4 onde algumas amostras séricas deste grupo de pacientes apresentavam niveis notavelmente mais elevados de sdgG comparativamente com os controlos.

Amostras de soro de 10 pacientes com artrite reumatoide (RA) e de 10 indivíduos saudáveis com idades e género equivalentes foram obtidos a partir da empresa Genomics Collaborative. Usando o ensaio modificado descrito no EXEMPLO 8, as amostras foram analisadas e os resultados representados na Fig. 10. Os resultados indicam que 4 dos 10 sujeitos com RA apresentaram concentrações de sdgG séricas > 60yg/mL. No grupo de controlo com indivíduos saudáveis, as concentrações de sdgG variaram de <8,2yg/mL a 52,7 yg/mL. As amostras para esta comparação não foram selecionadas rigorosamente para o estádio da doença, regimes de tratamento, etc. Assim, pode ser antecipado que a discriminação adicional de sdgG sérica em indivíduos saudáveis e doentes pode ocorrer em análises longitudinais de pacientes de ensaios clínicos bem controlados e desenhados prospectivamente. Contudo, os presentes ensaios nessas amostras comerciais sugerem que concentrações elevadas de scIgGs podem ser detetadas em pacientes com doença.

EXEMPLO 10: PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS IgG ANTI-REGIÃO CHARNEIRA

Seria desejável produzir uma molécula definida, tal como um anticorpo monoclonal para a produção e potencial uso em pacientes humanos que se liga a IgG clivada e não a IgG intacta. 0 seguinte procedimento representa um método para a produção de tal molécula.

Um análogo peptidico 12-mer da região charneira inferior da IgGl humana e combinada com o dominio CH2 foi o agente imunogénico: TCPPCPAPELLG (resíduos 7-18 da SEQ ID NO: 1). As cisteínas de ocorrência natural foram substituídas por alaninas para originar a variante TAPPAPAPELLG. Uma cisteína terminal-N foi adicionada para permitir a conjugação à hemocianina da espécie Megathura crenulata (KLH) por métodos químicos convencionais para a reação a sulfidrilos livres. 0 agente imunogénico final foi KLH-CTAPPAPAPELLG.

Coelhos brancos Nova Zelândia (3) foram imunizados com 0,5 mg péptido KLH em adjuvante de Freund completo usando múltiplos locais subcutâneos (5) . Os animais foram reforçados com 0,25 mg de agente imunogénico em adjuvante de Freund incompleto em intervalos de três semanas para um total de quatro imunizações adicionais.

Os títulos de anticorpo sérico para uma versão conjugada com BSA do mesmo péptido foram monitorizados durante o curso da imunização por métodos se ELSA convencionais. Os animais (2) foram escolhidos para esplenectomia com base nos dados dos títulos. Hibridomas de coelho foram gerados a partir de linfócitos derivados do baço fundidos com células parceiras de fusão de coelho (Spieker-Polet, PNAS USA 92: 9348-9352, 1995). 0 crescimento celular foi examinado 2-3 semanas após a fusão em múltiplas placas.

Hibridomas positivos foram rastreados via ELISA em placas revestidas com o conjugado peptídico BSA-agente imunogénico. Múltiplos clones positivos de cada fusão foram identificados. Rastreio adicional envolvendo a ligação a IgGl intacta e vários fragmentos F(ab')2 de IgGl gerados enzimaticamente. Desse rastreio e dessa tática de contra-rastreio, 3 clones foram escolhidos com base na forte seletividade de ligação ao péptido imunogénico e aos fragmentos F(ab')2 com sequências terminais ou próximas do terminal do péptido imunogénico e com ligação minima à IgGl intacta. Os hibridomas positivos foram subclonados e expandidos.

IgG de coelho foi purificada a partir dos sobrenadantes de células individuais por métodos estandardizados incluindo cromatografia em proteína A imobilizada. A especificidade das IgGs de coelho purificadas para ligação aos análogos peptídicos da região charneira de IgGl humana, assim como a IgG intacta e fragmentos F(ab')2 de IgG purificada criados usando Mabs clivados uma ou duas vezes usando enzimas IdeS e MMP3 foram testados em protocolos ELISA convencionais. Brevemente, os péptidos que foram sintetizados por química peptídica convencional e que foram bioatinilados N-terminalmente foram capturados em poços revestidos com estreptavidina. A IgG e fragmentos foram diretamente revestidos a 10 yg/mL. Ligação de mAbs de coelho foi detetada pelo sistema bem conhecido Fc IgG de cabra anti coelho-peroxidase de Armoracia rusticana sistemas de substrato OPD.

Os resultados de ELISA para mAb 91-2 são representados na Fig. 11. Existe uma calara seletividade de ligação para péptidos da região charneira inferior terminando nos residuos 16-22 da SEQ ID NO: 1 (L-L-GG-P-S-V-F) . Existe pouca ou nenhuma ligação dos residuos a montante correspondendo a esses segmentos da região charneira superior, região charneira central ou região charneira inferior precoce englobada por 3-16 da SEQ ID NO: 1 (D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E-L-). Existiu uma ligação negligenciável ao MMP-3 gerada pelo fragmento F(ab')2 e pelo fragmento sdgG (em concordância com a falta de ligação ao análogo peptidico do local de clivagem de MMP-2 entre os residuos 14 e 15 da SEQ ID NO: 1 (P-A-P*E-L-L) . Em contraste, existiu uma ligação substancial ao fragmento F(ab')2 degenerado e sdgG. Assim, a especificidade de ligação ao mAb de coelho foi considerada positiva para o agente imunogénico para o qual foi ativada. IgG rb (coelho) revestida diretamente foi um controlo positivo.

Ensaio do Complemento Células WIL2-S, uma linha de células-B linfoblastóides expressando CD20 (ATC), foram usadas como células-alvo para ensaios CDC. 50pL de células foram adicionadas aos poços de microplacas de 96-poços para uma concentração final de 8 X 104 células por poço em RPMI, 5% de FBS inativado por calor, 0,1 mM de aminoácidos não-essenciais, lmM de piruvato de sódio, penicilina (500 U/ml), estreptomicina (500 U/ml), 2mM L-glutamina. Um volume adicional de 50 pL foi adicionado aos poços com ou sem anticorpos de várias concentrações e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas. 50 pL de complemento de coelho 10% (Invitrogen) foram adicionados aos poços e as placas foram incubadas durante 20 minutos a 37°C. Todas as amostras foram realizadas em triplicado. As placas foram centrifugadas a 200g durante 3 minutos e 50 pL de sobrenadante foi removido para separar as placas e CDC doi medida com o kit de deteção de citotoxicidade com LDH (Roche) . A absorvância foi medida usando um espectrofotómetro Spectra max Plus 384 (PerkinElmer). Os dados foram normalizados à citotoxicidade máxima com Triton X-100 (Sigma-Aldrich) e o controlo mínimo contendo apenas células e complemento isoladadamente. A Figura 12 mostra que os 3 mAbs anti-região charneira do coelho foram capazes de restaurar a lise celular dependente do complemento nas células-alvo quanto tituladas na presença de uma concentração fixa do fragmento F(ab')2 de um anticorpo que se liga a CD20. Os mAbs de coelho revelaram-se mais eficazes, e, a concentrações mais baixas do que uma preparação de mAb anti-região charneira de coelho policlonal (um componente do mesmo sistema de deteção para a sdgG sérica descrita anteriormente) . 0 anticorpo intacto para CD20 foi ativo, como esperado, mas o seu fragmento F(ab')2 e a versão de sdgG não foram ativos isoladamente. Os mAbs anti-região charneira de coelho não foram capazes de dirigir a lise celular na ausência do fragmento F(ab')2 de ligação à célula. Estes resultados estabelecem que anticorpos monoclonais anti-região charneira podem reconstituir a função executora mediada pelo complemento a outros produtos inativos de IgGl clivados proteoliticamente

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES

1. Uma composição de anticorpo que compreende pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a um produto de clivagem proteolítica de IgG caracterizado por, a) possuir um peso molecular que é comparável ao de uma IgG mamífera intacta sob condições desnaturantes e b) ser separável em dois fragmentos que compreendem um fragmento de ligação ao antigénio contendo CH2 sob condições desnaturantes mas não-redutoras e c) onde o reagente não reage com IgG intacta, e onde o referido anticorpo se liga especificamente a um local de clivagem específico da protease em IgGl humana produzida por IdeS, TCPPCPAPELLG.

2. A composição do anticorpo da reivindicação 1, onde o referido anticorpo é: i) Um anti-soro policlonal; ou ii) Pelo menos um anticorpo monoclonal.

3. Um análogo peptídico do local de clivagem proteolítica da IgG humana consistindo de TCPPCPAPELLG covalentemente ligado à hemocianina da espécie Megathura crenulata via o terminal-N.

4. Um método de preparação da composição de anticorpo da reivindicação 1 usando um animal não-humano humanizado com o análogo peptídico de acordo com a reivindicação 3, onde o reagente é purificado a partir do soro do referido animal por pré-absorção numa matriz de afinidade da IgG humana.

5. Um método para a deteção de um processo de uma doença num sujeito por análise de uma amostra tecidular do sujeito, onde o referido método compreende a deteção pela composição de anticorpo da reivindicação 1 da uma IgG clivada proteoliticamente por IdeS caracterizada por a) possuir um peso molecular que é comparável ao de uma IgG mamífera intacta sob condições fisiológicas e b) ser separável em dois fragmentos que compreendem um fragmento de ligação ao antigénio contendo CH2 sob condições desnaturantes mas não-redutoras.

6. 0 método da reivindicação 5, onde a doença é selecionada de uma doença artrítica, uma doença maligna, uma doença infeciosa, e uma doença vascular, especialmente onde a doença é artrite reumatoide, por exemplo onde a doença é artrite reumatoide e a amostra é fluído sinovial.

7. 0 método da reivindicação 5, onde a amostra é sangue ou um produto de fracionamento relacionado.

8. 0 método da reivindicação 5, onde a deteção é realizada em amostras tecidulares diferentes de uma fração sanguínea.

9. 0 método da reivindicação 5, onde o procedimento de deteção é selecionado do grupo consistindo de ELISA, marcação imunohistoquímica, e Western blotting.

10. Um kit incluindo um reagente para deteção de um marcador de doença num tecido de um sujeito, cujo reagente compreende pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a IgG clivada, cujo anticorpo é capaz de detetar um produto de clivagem proteolitica de IgG caracterizado por a) possuir um peso molecular que é comparável ao de uma IgG mamífera intacta sob condições desnaturantes e b) ser separável em dois fragmentos que compreendem um fragmento de ligação ao antigénio contendo CH2 sob condições desnaturantes mas não-redutoras e c) onde o reagente não reage com IgG intacta, e onde o referido anticorpo se liga especificamente a um local de clivagem específico da protease em IgGl humana produzida por IdeS, TCPPCPAPELLG.

11. A composição do anticorpo da reivindicação 1 ou reivindicação 2 para uso em terapia.