EA025220B1 - Фрагменты расщепления иммуноглобулинов в качестве индикаторов заболеваний, реагенты для их детекции и применения таких реагентов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к реагентам на основе антител и их применению для детекции патологических процессов, ассоциированных с выработкой протеаз. Реагенты направлены на определение продукта разрушения IgG, который является результатом такого протеолитического расщепления. Изобретение дополнительно связано с применением лекарственного средства, иммуноспецифичного к продуктам разрушения IgG, сохранившим антиген-связывание, но потерявшим эффекторные функции.

Description

Область техники

Изобретение относится к диагностическим и прогностическим индикаторам, реагентам для их детекции и их применениям.

Описание материалов, используемых при экспертизе заявки

В медицине биологический маркер (биомаркер) представляет собой биохимическое вещество, которое можно использовать для оценки развития заболевания или эффектов лечения, т.е. диагностический или прогностический индикатор. Одним биомаркером, который эффективно отражает течение заболевания и контроль заболевания, является гемоглобин А1с (НЬЛ1с), используемый для контроля гликемии у диабетиков. Благодаря своему большому времени полужизни в сыворотке НЬА1с служит в качестве актуального показателя отклонения уровня глюкозы в крови от нормальных значений, а также для определения продолжительности такого отклонения. Используемым на сегодняшний день биомаркером системных воспалительных процессов является С-реактивный белок, СРБ (Рерук М.В. с) а1., ί. С1т. 1пуск1. 111; 1805-1812, 2003). СРБ представляет собой агент острофазового ответа, синтезируемый в ответ на разнообразные острые воспалительные состояния. СРБ синтезируется в печени в ответ на цитокиновые сигналы, включая фактор некроза опухолей и интерлейкин-6, которые сами мигрируют от отдаленного участка воспаления. Увеличение содержания СРБ в сыворотке возникает при инфекции, инсульте, сосудистых заболеваниях, инфаркте миокарда и некоторых других острых воспалительных заболеваниях.

Циркулирующие иммуноглобулины и, конкретно, антитела, принадлежащие к 1дО-классу, являются основными сывороточными белками. Хорошо известно, что протеазы человека ассоциированы с воспалительными, пролиферативными, метастатическими и инфекционными заболеваниями. Протеазы человека, такие как матриксные металлопротеазы (ММР) и нейтрофильная эластаза, расщепляют полипептид тяжелой цепи 1дС по аминокислотному остатку, уникальному для каждой протеазы, подобно действию бактериальных протеаз, таких как глутамилэндопептидаза (81арй. аигеик) или иммуноглобулинразрушающий фермент стрептококков (§1гер. руодепек). Участки расщепления в тяжелой цепи собраны вокруг области, называемой шарнирным доменом, в котором образуются дисульфидные связи между двумя тяжелыми цепями. Область ниже шарнирной составляет Рс-область и содержит участки связывания, отвечающие за эффекторные функции молекулы 1дО. В случае микроорганизмов экспрессия протеаз является потенциальным дополнительным фактором вирулентности, позволяющим организмам избежать опсонизации (Кооуаккетк е1 а1., МктоЬек апб 1пГесОоп 7: 476-484, 2005), поскольку протеолитическое высвобождение Рс-домена в результате расщепления ниже шарнирной области эффективно нейтрализует функции, которые иначе привели бы к обнаружению и уничтожению этой патологической клетки. Поэтому выработка специфических протеаз может свидетельствовать о множестве патологических состояний, включая раковые, воспалительные и инфекционные заболевания.

Эта деградация 1дО усиливается в патологическом окружении ίη νί\Ό. о чем свидетельствует присутствие природных аутоантител к 1дО, которые связывают расщепленный шарнирный домен (КшдШ е1 а1., 1995; Иаки е1 а1., 1980; РегккеНп апб 81еуепк, 1985, Тегпекк е1 а1., 1995 1. 1ттипо1. 154: 6446-6452). Эти аутоантитела также связывают РаЬ и Р(аЬ')₂-фрагменты, генерируемые некоторыми протеиназами (включая папаин и пепсин), обладая особенно сильной реактивностью в отношении нижней части шарнирного домена, остающейся в качестве С-концевых остатков Р(аЬ')₂-молекул (Тегпекк е1 а1., 1995). Детекция данных продуктов расщепления уже была опубликована (Рюк е1 а1., 1985; Оо1бЬетд апб ^ННеНоике, 1970; ^а11ет, 1974), но до сегодняшнего момента не был разработан надежный метод анализа, который позволил бы этим фрагментам служить в качестве биомаркеров, возможно, вследствие их низкой концентрации в сыворотке, являющейся результатом быстрого выведения различных фрагментов, или вследствие технических проблем при детекции фрагментов в условиях большого количества интактных иммуноглобулинов в крови и тканях. Было получено специфическое антитело (Еск1е е1 а1., 1988. Α6ν. Ехр. Меб. Вю1. 240: 531-534) для детекции отщепляемого нейтрофильной эластазой человека Рс-домена, которое детектирует Рс при медианной концентрации 0,62 мкг/мл напрямую в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом, но не в синовиальной жидкости пациентов с другими типами суставных заболеваний.

Поэтому способность определять тип и количество продуктов расщепления 1дО в жидкостях тела или крови субъектов можно использовать в качестве биомаркера активности определенного заболевания. Специфические реагенты и способы для такого определения будут представлять собой полезный инструмент для диагностических и прогностических медицинских анализов.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к реагентам и применению реагентов для детекции патологического процесса, ассоциированного с выработкой протеаз, которые являются проявлением патологии заболевания, а также являются агентами, ограничивающими иммунную защиту организма-хозяина. Реагенты предназначены для определения продуктов разрушения 1дО, являющихся результатом такого протеолитического расщепления.

В другом варианте осуществления изобретение направлено на детекцию продукта расщепления !дО, который отличается тем, что:

- 1 025220

1) имеет молекулярный вес, сравнимый с интактным 1дО млекопитающих при физиологических условиях; и

2) разделяется на два фрагмента, которые включают в себя антиген-связывающий фрагмент и фрагмент 32 кД при денатурирующих, но невосстановительных условиях; и

3) не проявляет АОСС-активность (антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность) в анализе ίη νίίτο. Один аспект способа определения продукта расщепления 1дО по изобретению касается специфического реагента, способного детектировать продукт расщепления, причем этот реагент представляет собой по меньшей мере одно антитело, способное связывать указанный продукт расщепления.

Изобретение раскрывает последовательности для получения реагентов, пригодных для детекции продукта расщепления 1дО, которые можно использовать для иммунизации, пэннинга и отбора реагента к продукту расщепления 1дО по изобретению. В частности, такая последовательность может выбрана из группы, состоящей из по меньшей мере 5 последовательных аминокислот, выбранных из последовательностей шарнирной области 1дО человека 8ЕО ГО N0: 1, 2, 3 или 4, которые находятся на Ν-концевой стороне сайта расщепления протеазы. Более конкретно, указанные последовательности выбраны из 8Е0 ГО Νο§: 5-11 и их укороченных с Ν-конца вариантов.

Дополнительным вариантом изобретения является применения антител, специфичных к продукту расщепления 1дО, для лечения пациента с целью восстановления эффекторных функций у продукта расщепления 1дО.

Перечень фигур с краткими пояснениями

На фиг. 1 изображены различные домены типичного антитела 1дО класса млекопитающих, показано их взаимное расположение с шарнирным доменом и показаны продукты расщепления пепсином и папаином, обозначенные РаЬ, Р(аЬ')₂ и Ре;

на фиг. 2 показаны четыре индивидуальных анализа с помощью микрокапиллярного электрофореза (АдПеШ) (в виде изображений геля в различных временных точках) расщепления антитела 1дО1к человека, МаЬ1, каждой из протеаз (1 вес.%): ММР-3 человека (А), стрептококковой Ие8 (В), стафилококковой глутамилэндопептидазой I (С) и нейтрофильной эластазой человека (И) при 37°С. Стандарты на каждом геле (дорожка 1) соответствуют интактному химерному 1дО1 человека/мыши и известным продуктам расщепления;

на фиг. 3 - последовательность тяжелой цепи 1дО1 человека в районе шарнирной области; основные позиции расщепления протеазами указаны стрелками;

фиг. 4 представляет собой вестерн-блот, на котором показана временная динамика деградации биотинилированного 1дО человека/мыши раневым экссудатом;

фиг. 5 - график, показывающий относительную специфичность антисыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных конъюгированным продуктом деградации, Р(аЬ')₂, трех различных протеаз ММР-3, У8, и Ие8: ТСРРСРАР, остатки 7-14 8Е0 ГО N0:1, соответствующие участку расщепления ММР-3, ТСРРСРАРЕ, остатки 7-15 8Е0 ГО N0:1, соответствующие участку расщепления глутамилэндопептидазы, и ТСРРСРАРЕЕЬО, остатки 7-18 8Е0 ГО N0:1, соответствующие участку расщепления Ие8. Приведена реактивность трех индивидуальных препаратов кроличьих поликлональных антител к пептиду шарнирной области в твердофазном иммуносорбентном анализе (ЕЬ18А) с Р(аЬ')₂-фрагментами МаЬ3 1дО1к. Р(аЬ')₂-фрагменты получали с помощью рекомбинантной ММР-3 человека, стафилококковой глутамилэндопептидазы I и рекомбинантной Ие8 из 81гер. руодепек. Объединенные препараты кроличьих антител демонстрировали практически одинаковую реактивность с каждым из Р(аЬ')₂-фрагментов МаЬ3. Столбцы соответствуют среднему ± стандартное отклонение для трех повторяющихся лунок;

на фиг. 6 показана реактивность на вестерн-блоте препаратов кроличьих поликлональных антител с продуктами расщепления антител. Проводили разделение МаЬ3 (1дО1 человека), интактных или частично расщепленных ММР-3, глутамилэндопептидазой (У8) или Ие8 с последующим иммуноблоттингом. (А) Блоттинг с использованием антител к полноразмерным иммуногаммаглобулинам (1дО (Н+Ь)) человека [дорожки 1-4] или кроличьих поликлональных антител к ...ЕЬО [дорожки 6-10]. (В) Блоттинг с использованием антител к ...РАР [дорожки 2-5] или к ...АРЕ [дорожки 7-10]. Для детекции каждой индивидуальной антисывороткой мембраны разрезали перед инкубированием с антителами по дорожке 5 (на вкладке (А)) и по дорожке 6 (на вкладке (В));

на фиг. 7 - вестерн-блот, проявленный с использованием реагента КАН-1, образцов из исследования деградации 1дО в синовиальной жидкости 5 пациентов с ревматоидным артритом (РА) в сравнении с образцами протеолитического расщепления ίη νίίτο моноклональных 1дО1 протеазами ММР-3, глутамилэндопептидазой (У8) и Ие8;

на фиг. 8 - динамика во времени сывороточной концентрации различных фрагментов протеолитического расщепления (интактных 1дО, кс1дО (однократно расщепленных 1дО) и Р(аЬ')₂) после инъекции данных очищенных фрагментов в мышь, измеренной с использованием козьих антител к 1дО (Н+Ь) человека;

фиг. 9 представляет собой точечную диаграмму индивидуальных значений, детектируемых реагентом РАН-1 в образцах сыворотки пациентов, имеющих указанные заболевания, в сравнении с значениями, полученными для группы образцов нормальной сыворотки человека, где линии указывают среднее

- 2 025220 значение для каждой группы;

на фиг. 10 показана концентрация кс1дС в разведенной сыворотке 10 индивидуумов с РА и равного числа здоровых, нормальных контрольных субъектов, которую определяли с помощью реагента КАН-1 с использованием улучшенной версии ЕЫ8А; (2) в группе РА означает, что одна и та же величина была получена для двух отдельных индивидуумов;

на фиг. 11 - относительная реактивность кроличьего моноклонального антитела к фрагментам расщепления шарнирной области в виде пептидных аналогов и фрагментов антител, оканчивающихся на указанные остатки (см. фиг. 3);

на фиг. 12 - концентрационная зависимость трех различных кроличьих моноклональных антител к фрагментам расщепления шарнирной области 1дС1 человека при восстановлении комплементзависимого клеточного лизиса (СЭС) в ответ на Р(аЬ')₂, образующиеся при расщеплении 1дС1 протеазой 1бе8, в сравнении с кроличьими поликлональными антителами, полученными на пептидные аналоги продуктов расщепления (кроличьи поликлональные антитела).

Краткое описание к списку последовательностей

5Εζ) Ю N0:	ОПИСАНИЕ
1	Шарнирная область 1дС1 человека
2	Шарнирная область 1дС4 человека
3	Шарнирная область 1дО2 человека
4	Шарнирная область 1дСЗ человека
5	Пептид, образующийся при расщеплении ммр-3 и ммр-12
6	Пептид, образующийся при расщеплении глутамилзндопептидазой I и катепсинсм 3
7	Пептид, образующийся при расщеплении 1с1е$
8	Пептид, образующийся при расщеплении плазмином
9	Пептид, образующийся при расщеплении ΗΝΕ
10	Пептид, образующийся при расщеплении ММР-7 и пепсином
11	Пептид, образующийся при расщеплении папаином

Подробное описание изобретения

Сокращения.

АЬк - антитела; АЭСС - антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность; СЭС комплементнаправленная цитотоксичность; ΗΝΕ - нейтрофильная эластаза человека; Иек - фермент, деградирующий иммуноглобулины, из 8. руодепек; 1д - иммуноглобулин; МаЬ - моноклональное антитело; ММР - матриксная металлопротеаза; кс1дС - однократно расщепленный 1дО; 8А - стрептавидин; У8 глутамилэндопептидаза I из 81арН. аигеик.

Определения.

Фрагменты антител; РаЬ, Р(аЬ')₂ и Рс являются терминами, описывающими продукты протеолитического расщепления 1дС, которые могут дополнительно диссоциировать при восстановлении дисульфидных связей между тяжелыми цепями (в центре шарнирной области). Фрагменты антител, получаемые классическим протеолизом, включают: РаЬ (например, расщеплением папаином), РаЬ' (например, расщеплением пепсином и частичным восстановлением) и Р(аЬ')₂ (например, расщеплением пепсином), ГасЬ (например, расщеплением плазмином), рРс' (например, расщеплением пепсином или плазмином), Рб (например, расщеплением пепсином, частичным восстановлением и повторной агрегацией), где восстановление удаляет дисульфидную связь между цистеиновыми остатками с образованием связей внутри цепи (см. фиг. 1). Поскольку Рс-фрагмент описан как фрагмент, образующийся при расщеплении папаином, который расщепляет 1дС1 человека по остатку 224 (ЕИ-нумерация), Ν-концевому остатку шарнирного домена, считается, что в Рс-фрагменте сохраняются шарнирный домен и дисульфидные связи между тяжелыми цепями, однако благодаря высокой степени ассоциации между СН2-СН3 димерами тяжелой цепи в антителе, димерная структура сохраняется даже в отсутствие дисульфидных (шарнирных) связей. Поэтому используемый в настоящем описании термин Рс относится к димерной структуре, образованной ассоциацией СН2-СН3части тяжелой цепи, независимо от того связаны ли они ковалентно или нет. Очевидно, что нековалентно связанные Рс можно отличить от ковалентно связанных по своей способности диссоциировать на СН2СНЗ-мономеры в присутствии денатурирующих агентов, таких как детергент.

Термины протеолитический, протеолитическое расщепление, протеаза и протеолитический фермент используются взаимозаменяемо и обозначают агент, например фермент, способный расщеплять полипептидную цепь с образованием двух или более фрагментов, где фермент действует при нормальной температуре и при физиологических условиях или условиях, сравнимых с физиологическими. Физиологические условия включают любые температуру, буфер, катион, анион, субстрат, катализатор, рН, кофактор и т.п., которые в природе можно обнаружить в организме живого млекопитающего, здоро- 3 025220 вого или больного. Однако источником протеазы может быть не млекопитающее, например патоген, который может представлять собой любую живую форму.

Под 8с1дО или однократно расщепленным 1дО подразумеваются любые молекулы иммуноглобулинов класса О, содержащие две тяжелые цепи и две легкие цепи, где одна из тяжелых цепей подвергается протеолитическому расщеплению с образованием одиночной тяжелой цепи, в то время как вторая тяжелая цепь остается интактной.

Расположенными выше в отношении аминокислотной последовательности, приведенной от Νконцевого до С-концевого остатка, называют остатки в последовательности в направлении к Ν-концу от данного остатка. И наоборот, расположенные ниже в отношении аминокислотной последовательности означает остатки в последовательности в направлении к С-концу от данного остатка.

Роль субструктуры в функциях антител.

В общем, иммуноглобулины, антитела состоят из областей непрерывной полипептидной цепи, включающей в себя приблизительно 100 аминокислот, которые свернуты в характерный глобулярный домен и представляют различные элементы структуры. Каждые 100 аминокислотных остатков представляют глобулярный домен, вес которого составляет около 10-11 кД. В случае иммуногаммаглобулинов (1дО) эти домены сгруппированы вместе в фрагменты; РаЬ-фрагмент состоит из вариабельной области легкой цепи, соединенной в одной цепи с константной областью легкой цепи, которая связана через дисульфидные связи с первой константной областью (СН1) тяжелой цепи, которая примыкает к вариабельной области тяжелой цепи; Рс состоит из двух непрерывных константных областей тяжелой цепи (СН2 и СН3), связанных через две или три дисульфидные связи в шарнирной области. Исследования показали, что протеазы, такие как папаин и пепсин, предпочтительно расщепляют антитела по сайтам, которые находятся между фрагментами. Два идентичных РаЬ-фрагмента, соединенные через шарнирную область с одним Рс-фрагментом, таким образом, образуют конформацию структуры в форме буквы Υ с весом 150 кД (см. фиг. 1). РаЬ-фрагменты, образуемые папаином, обычно имеют молекулярный вес 46 кД, молекулярный вес невостановленного Р(аЬ')₂ обычно составляет 90-100 кД, а негликозилированный, невостановленный Рс будет иметь предполагаемый молекулярный вес приблизительно 50-60 кД. Однако поскольку каждый вид антител и каждый подкласс антител немного отличаются, то точные местоположение сайта расщепления и продукты расщепления отличаются друг от друга.

Антитела связывают антиген через антиген-связывающий сайт в вариабельных доменах каждой пары легкой и тяжелой цепей (фиг. 1). Другие молекулы, известные как эффекторные молекулы или клетки, связывают другие сайты на оставшейся части молекулы, т.е. за пределами антиген-связывающих сайтов, и эта часть антитела включает более инвариантные последовательности иммуноглобулина, константную часть антитела, причем такие сайты расположены, конкретно, в Рс-области, которую составляют части тяжелых цепей, выступающих за концы легких цепей.

Антитела имеют несколько эффекторных функций, опосредованных связыванием с эффекторными молекулами. Например, связывание антител с С1-компонентом комплемента активирует систему комплемента. Активация комплемента важна при опсонизации и лизисе клеточных патогенов (процессе, называемом комплемент-опосредованной цитотоксичностью или СБС). Активация комплемента стимулирует воспалительный ответ и может также участвовать в аутоиммунной гиперчувствительности. Кроме того, антитела связываются с клетками за счет связывания клеточным Рс-рецептором сайта Рс-рецептора в Рс-области. Существует ряд Рс-рецепторов, специфичных к различным классам антител, включая 1дО (гамма-рецепторы), 1дЕ (эта-рецепторы), 1дА (альфа-рецепторы) и 1дМ (мю-рецепторы). Связывание антител с Рс-рецепторами на клеточной поверхности запускает ряд важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, выведение иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней клетками-киллерами (называемый антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью, или АЭСС), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и контроль продукции иммуноглобулинов.

Последовательности вокруг шарнирного домена консервативны для 1дО-изотипов (8ЕО ГО ΝΟ: 1-4) и в целом среди видов млекопитающих. Изотипы 1дО1 (8ЕО ГО ΝΟ: 1) и 1дО3 (8ЕО ГО ΝΟ: 1) содержат пару Ееи-Ееи, являющуюся структурным мотивом для связывания с рецептором (рецепторами) Рсу и для Рс-эффекторных функций. Другие остатки, расположенные ниже центральной части шарнира, которая обычно содержит, по меньшей мере, цистеин, отделенный двумя остатками (не цистеинами), тоже являются консервативными.

Авторами изобретения было найдено, что продукт расщепления 1дО1 человека, 8с1дО, образуется в результате действия бактериальных протеаз и протеаз человека, когда протеолиз проходит по одной из двух тяжелых цепей в составе 1дО, при этом не разрушая общую композицию гетеродимерной молекулы. Во-вторых, авторы изобретения с помощью кинетического анализа протеолитической атаки на молекулы 1дО человека, содержащие константные области тяжелой цепи, определили, что 8с1дО, вероятно, является наиболее распространенным продуктом протеолиза ίη νίνο. Существование 8с1дО в качестве промежуточного продукта, приводящего к Р(аЬ')₂ в ходе протеолиза 1дО, был отмечено ранее для фермента ММР3 (Оеаппд А.ТН. е1 а1., 1ттипо1. Ьей. 81: 41-48, 2002). Также было отмечено, что расщепление 1дО стрептококковой протеазой, Ие8, дает продукт, напоминающий 1дО в гель-фильтрации (Ушсейк В е1 а1., Βίο- 4 025220 сНстМгу 43: 15540-15549, 2004). Однако не было опубликовано функциональных характеристик промежуточного продукта и не было предоставлено способов детекции 8с1дО в биологических образцах.

Авторы изобретения также продемонстрировали, что ίη νίνο время полужизни 8с1дО в сыворотке согласуется с оценкой активности болезни в течение периода времени от нескольких дней до месяцев, тем самым они показали возможность использования 8с1дО в качестве маркера латентных или супрессированных патологических процессов, или возможность применения для оценки текущего состояния болезни и ответа на лечение или выздоровления.

Вкратце, авторы изобретения обнаружили, что кинетика протеолитического расщепления при физиологических условиях приводит к тому, что большая часть протеолитически расщепленного 1дО находится в конформации 8с1дО, а не в виде продуктов множественного расщепления, таких как Р(аЬ')₂ (см. фиг. 1). При тестировании большого числа протеаз было установлено, что первое расщепление константной области тяжелой цепи в интактном 1дО протекает быстрее второго, в результате чего происходит временное накопление такого однократно расщепленного продукта. Эта однократно расщепленная версия молекулы 1дО неотличима от интактной исходной молекулы по многим параметрам (например, размеру молекулы, связыванию антигена, способности быть распознаваемой белком А/О).

В соответствии с изобретением авторы получили реагенты, подходящие для детекции продуктов протеолитического расщепления, включая Р(аЬ')₂ и 8с1дО. Реагенты по изобретению, полученные с использованием пептидов-аналогов сайта расщепления по изобретению, узнают продукты расщепления 1дО1 человека, но не узнают интактный 1дО.

Авторы изобретения дополнительно продемонстрировали, что антитела, узнающие продукты расщепления 1дО, сохраняющие антиген-связывающую специфичность, могут восстанавливать эффекторные функции, такие как СЭС и АОСС, у расщепленных 1дО.

Протеолитические ферменты и их связь с заболеваниями.

Авторами изобретения было продемонстрировано, что продукты расщепления антител (включая 8с1дО), аналогичные по размеру продуктам, полученным расщеплением ίη νίΐτο с помощью ряда протеаз, детектируются в воспалительных эксудатах, таких как синовиальная жидкость, пациентов с ревматоидным артритом. Кроме того, 8с1дО можно детектировать в сыворотке пациентов с рядом заболеваний, для которых локальная протеолитическая активность является известным характерным признаком патологии.

Концентрация 8с1дО при таких болезненных состояниях выше, чем у здоровых добровольцев, а также выше концентрации 8с1дО в сыворотке у пациентов с менее тяжелым воспалительным заболеванием.

Возможность детекции 8с1дО дало создание аффинно-очищенных поликлональных антител (кроличьих), которые специфически связывают новоэкспонированные эпитопы в расщепленной тяжелой цепи в районе или около дисульфидных связей в шарнирной области, но которые не реагируют с интактной, нерасщепленной молекулой 1дО. Детекции 8с1дО в сыворотке дополнительно способствует их продолжительный срок жизни в кровотоке, аналогично интактным 1дО. Возможность детектировать 8с1дО в жидкостях тела или крови больных индивидуумов представляет собой потенциально новую биомаркерную стратегию. Следует понимать, что можно использовать антитела других видов, кроме кролика (таких как мышь, крыса и верблюд), а также можно получить моноклональные антитела (например, клонированием гена антитела, кодирующего последовательность связывающей области определенного антитела), причем поликлональные или моноклональные антитела, которые сохраняют способность связывать продукты расщепления 1дО1 человека, но не узнают интактные 1дО, охвачены в качестве реагентов по изобретению. Другие способы получения антител, например отбор из библиотеки доменов антител, хорошо известны специалистам в данной области, и их можно использовать в качестве источника антител по изобретению.

Антитела-реагенты.

Антитела по этому изобретению можно получить несколькими путями, хорошо известными в данной области, используя критерии и иммуногены, разработанные авторами изобретения для получения или отбора антител, пригодных для применения изобретения на практике.

В одном аспекте антитела удобно получать из гибридом, полученных иммунизацией животного фрагментами, получаемыми при расщеплении, или полученными на их основе пептидными аналогами сайта расщепления. Поэтому антитела можно получить иммунизацией животных или скринингом библиотек антител, используя фрагменты расщепления антител, включая Р(аЬ')₂ и 5с1дО. или их укороченные с Ν-конца или структурные аналоги. В одном варианте осуществления изобретения пептиды, используемые для создания антител, выбраны из 14-членных пептидных фрагментов 1дО1, представленных в 8ЕО ГО ΝΟ: 5-11, где С-концевой остаток полипептида или пептида представляет остаток, расположенный выше (с Ν-концевой стороны) сайта расщепления между парой расщепляемых аминокислотных остатков (как показано в таблице). Фрагменты, содержащие шарнирный мотив 1дО1, например -Т-С-Р-Р-С(остатки 7-11 в 8Е0 ГО ΝΟ: 1), будут мультимерными вследствие образования дисульфидных связей, если цистеиновые остатки (С) не заменены на остатки аланина (А).

В конкретном варианте осуществления изобретения антитело получают, используя 8-членный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности на амино-концевой стороне сайта расщепления ММР-3 (ТСРРСРАР, остатки 7-14 в 8Е0 ГО ΝΟ: 1), или более длинные пептиды, соответствующие сайту расщепления глутамилэндопептидазы (ТСРРСРАРЕ, остатки 7-15 в 8Е0 ГО ΝΟ: 1); или сайту рас- 5 025220 щепления 1йеЗ (ТСРРСРАРЕЬЬО, остатки 7-18 в ЗЕС ГО N0: 1). При использовании в качестве иммуногенов пептиды можно ковалентно присоединить к гемоцианину улитки (КЬН) через Ν-конец или через добавленные линкерный остаток или пептид.

Таким образом, антитела можно получить, используя любую из гибридомных методик, хорошо известных в данной области, см., например, Аи8иЬе1, е! а1., ей., Сиггеи! Рто!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойи \УПеу & §ои8, 1ис., ΝΥ, ΝΥ (1987-2001); ЗатЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1оши§: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, 2^ий ЕЙ1Пои, Со1й Зрпид НагЬог, ΝΥ (1989); Наг1о\у аий Ьаие, АийЬоФек: а ЬаЬога!оту Маииа1, Со1й Зрттд НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдаи, е! а1., еЙ8., Сиггеи! Рто!осок ш 1ттиио1оду, 1ойи \УПеу & Зоиз, 1ис., ΝΥ (1994-2001); СоШдаи е! а1., Сиггеи! Рто!осок ш Рто!еш Зс1еисе, 1ойи \УПеу & Зои8, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2001), полностью включенные в настоящее описание путем ссылки. Антитело по изобретению может включать последовательность (или может быть получено) от любого млекопитающего, такого как, но не ограниченного этим, человек, мышь, кролик, крыса, грызун, человекообразные обезьяны или любая их комбинация, и включает выделенные человеческие, приматов, грызунов, млекопитающих, химерные, гуманизированные и/или СГОВ-пересаженные антиинтегриновые антитела, иммуноглобулины, продукты расщепления и их другие определенные части и варианты.

Для идентификации новых связывающих доменов с желаемой специфичностью к 8с1дО и другим фрагментам антител можно также использовать фаговые библиотеки антител.

Дополнительным аспектом изобретения являются специфические реагенты, используемые для получения или отбора антител или других связывающих агентов, пригодных в настоящем изобретении. Специфические иммуногены или тестовые реагенты, разработанные для этой цели, отличаются содержанием остатков, расположенных вокруг центра шарнирного домена 1§О1, включающих, но не ограниченных этим, остатки ЗСЭКТНТСРР СРАРЕЕЬССР ЗУРЬРР (ЗЕС ГО Ν0: 1), показанные на фиг. 3. Шарнирные области других изотипов антител человека, которые дают фрагменты антител при контакте с протеолитическими фрагментами, могут также служить в качестве источников аналогов для создания, отбора или тестирования антител или других связывающих молекул к продуктам ферментативного расщепления. Аналогичная область тяжелой цепи 1§О4 человека включает остатки ТСNУ^НКР3N ТКУОКВУЕЗК ΥСРРСРЗСРА РЕРЬССРЗУР ЬР (ЗЕС ГО Ν0: 2), а для 1§О2 и 1§О3 - остатки, приведенные в ЗЕС ГО Ν03: 3 и 4 соответственно. В каждом случае пептиды состоят из по меньшей мере 5 последовательных аминокислот, выбранных из последовательностей шарнирной области 1§О человека (ЗЕС ГО Ν0: 1, 2, 3 или 4), которые расположены на аминоконцевой стороне сайта расщепления протеазы. В одном аспекте специфические иммуноген или пептид, используемые для получения антител, содержат по меньшей мере один центр шарнирного домена 1§О1, определенный как остатки -Т-С-Р-Р-С-. В определенном варианте осуществления изобретения пептид представляет собой 12-членный пептидный аналог нижней части шарнирного домена 1§О1 человека и примыкающего СН2-домена, имеющего последовательность ТСРРСР АРЕРЬС (остатки 7-18 в ЗЕС ГО Ν0: 1).

Общий способ создания пептидных фрагментов, пригодных для получения, селекции или тестирования антител к продуктам ферментативного расщепления или других связывающих их молекул, включает в себя: а) идентификацию Ν-концевого остатка из пары остатков тяжелой цепи антитела, расщепляемых протеазой, как показано на примере конкретных протеаз в примере 1 и в таблице, Ь) определение 5-14 (или большего числа) остатков, расположенных выше сайта расщепления, в которых идентифицированный Ν-концевой остаток становится С-концом данной последовательности и с) получение пептида в количестве, достаточном для желаемых целей. Данному описанию соответствуют пептиды, выбранные из ЗЕС ГО Ν0: 5-11, или их варианты, укороченные с Ν-конца. Пептиды могут нести метку, быть конъюгированными или перекрестно сшитыми, или их можно использовать в виде смеси одного пептида с другим, или в виде смеси с адъювантами для тестирования связывания или в качестве иммуногенов или мишеней в пэннинге для применения, например, в качестве селективных связывающих агентов при отборе из библиотеки фагового дисплея.

В одном аспекте настоящее изобретение дополнительно касается выделенных молекул нуклеиновых кислот, включающих в себя полинуклеотид (или полинуклеотид, комплементарный ему или гибридизующийся с ним), кодирующий вышеупомянутые определенные пептиды или антитела к ним, содержащие по меньшей мере одну указанную последовательность, домен, часть или их вариант. Настоящее изобретение охватывает выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие по меньшей мере одно выделенное моноклональное антитело, имеющее специфичность к 8с1дО, описанным в настоящем документе, нуклеотидный вектор, включающий в себя выделенную нуклеиновую кислоту, и/или прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, содержащую выделенную нуклеиновую кислоту. Клетка-хозяин, необязательно, может представлять собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из клеток Е. сой, С0З-1, С0З-7, НЕК293, ВНК21, СН0, ВЗС-1, Нер С2, 653, ЗР2/0, 293, НеЬа, миеломы, лимфомы, дрожжей, насекомых или растений или любой их производной, бессмертной или трансформированной клетки. Также изобретение касается способа получения по меньшей мере одного антитела по изобретению, включающего в себя трансляцию кодирующей антитело нуклеиновой кислоты ш уйто, ш У1уо или ш 8Йи, так что пептид или антитело экспрессируются в количестве, достаточном для детекции или выделения.

- 6 025220

Способы применения.

Реагенты по изобретению пригодны для детекции патологии заболевания, когда патологический процесс вызывает, является результатом, причиной или как-либо еще ассоциирован с протеолитической активностью и протеолитическими ферментами, протеазами. Такие заболевания и процессы включают процессы, ускоряющие или ухудшающие, возникающие или образующиеся в результате инфекции, инсульта, сосудистого заболевания, инфаркта миокарда и нескольких других острых и хронических воспалительных заболеваний. Авторами изобретения было продемонстрировано, что одним особенно полезным биомаркером протеолитической активности является 8с1дС, повышенный уровень которого детектируется при некоторых из вышеупомянутых заболеваний. Поскольку 8с1дС образуется локально в месте патологии или патологического процесса инфекции, то 8с1дС является уникальным и специфическим маркером таких процессов в качестве индикатора участия конкретных тканей или типов клеток в месте, затронутым болезнью.

В одном варианте осуществления способа по изобретению образец получают от субъекта, у которого подозревают наличие, подозревают наличие в прошлом, или которого лечат от заболевания, отличающегося повышенным содержанием протеаз. Образец вводят в контакт со связывающим агентом, таким как препарат антител, имеющим специфичность к фрагментам расщепления 1§С, которые, как известно, возникают в результате контакта между активируемой заболеванием протеазой и популяцией сывороточных 1дС.

Способ по изобретению можно использовать для оценки, существует ли у пациентов с ранее диагтестированным заболеванием или состоянием риск развития заболевания (например, метастазирования, агрессивного роста опухоли, персистирующей инфекции и т.д).

В некоторых случаях, например у раковых пациентов, детекция 8с1дС может быть полезна для индикации развития поздних стадий заболевания, включая распространение метастаз, которое, как известно, включает выработку протеолитических ферментов, особенно, металлопротеаз. В некоторых аспектах неопластические заболевания имеют общие механизмы, обычно, с воспалительными процессами, восстановлением тканей и заживлением (Сои88еи8 Ь.М. апй \УсгЬ. Ζ. 2002. Ыа1иге 420 (19): 860-867). В других исследованиях было показано, что, например, снижение концентрации липидов коррелирует как со снижением риска сердечно-сосудистых явлений, например тромбоза, так и со снижением уровня ММР, таких как ММР-2 и ММР-9, а также было показано, что эти ферменты синтезируются в атеросклеротических бляшках (ОедисЫ 1., Маапоп А., СЫпд-Нкиап Т. е! а1., 2006 С1гси1айоп 114: 555-62). Поэтому способы по изобретению в особенности подходят для применения, но не ограничены этим, у пациентов с тяжелыми артритическими синдромами (ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит), некоторыми видами рака (особенно воспалительным раком молочной железы), тяжелыми коронарно-артериальными состояниями (инфарктом миокарда и застойной сердечной недостаточностью) и другими заболеваниями, такими как, например, астма. Способ по изобретению можно использовать для разделения заболеваний и состояний, при которых патофизиологический процесс включает или вызывает появление протеаз, способных действовать на 1§С, от других патологий, которые не отличаются повышенным уровнем секретируемых протеаз, или при которых протеазы не расщепляют 1§С.

Поэтому, хотя способ применения реагентов, описанных в настоящем документе, специфично детектирует расщепляемые фрагменты, более специфичный анализ расщепленных фрагментов может включать анализ специфичности связывания вариабельных областей расщепленного антитела. Например, твердофазный анализ, который объединяет антиген-связывающую селективность с детекцией фрагментированного антитела, можно использовать для того, чтобы определить наличие колокализации определенных антигенов и протеаз у субъекта, тем самым получая информацию о природе ткани, заболевания или патологии в месте протеолитической активности.

Забор крови является наиболее часто применяемой на практике формой получения образцов от субъектов, человека или животных, здоровых или больных. Поскольку 8с1дС обнаруживается в системном кровообращении и не ограничен местом образования, т.е. местом активности протеаз, он представляет собой репортерный маркер активности болезни, ограниченной определенными отделами организма. Одним таким отделом является синовиальная жидкость. Поэтому забор крови или сыворотки предоставляет удобный и целесообразный источник для детекции ранних стадий заболевания с использованием реагентов и способов, предоставленных в настоящем изобретении. В качестве альтернативы у пациентов с любой стадией заболевания (включая диагностику и поздние стадии заболевания) также можно отбирать образцы из локальных отделов организма, как, например, синовиальную жидкость при ревматоидном артрите, легочный эксудат, образцы биопсии и т.д. Фрагменты расщепленных антител в таких образцах тканей можно детектировать прямым окрашиванием (иммуногистохимические способы), или детекцию можно проводить в фракциях предварительно разделенных образцов.

Образцы тканей, включая кровь, должны быть обработаны для ингибирования любых остаточных активных протеаз. Хелатирование металлов (например, с помощью ΕΌΤΑ) эффективно ингибирует металлопротеазы. Иодацетамид блокирует цистеиновые протеазы (например, 1йе8); сериновые протеазы можно блокировать ΌΡΡ и аналогичными соединениями. В синовиальной жидкости присутствуют активные протеазы, и их следует обрабатывать соответственно. Образцы также можно хранить замороженными до проведения анализа. После соответствующей обработки образцов можно использовать специ- 7 025220 фичные к кс1дС реагенты по изобретению в методиках на базе антител, таких как ЕЫ§Л, методы с иммобилизацией на носителях в виде шариков, радиоиммунный анализ, которые известны специалистам в данной области, или которые будут разработаны в будущем.

Реагенты к фрагменту протеолитического расщепления 1дС по изобретению могут быть упакованы в виде набора для исследовательского или диагностического применения и для коммерческих продаж совместно с другими реагентами, такими как буферы и стандарты, такие как интактные 1дС человека и известные количества расщепленных 1дС. вместе с инструкциями по измерению, и, по желанию, с инструкциями по количественному определению фрагментов протеолитического расщепления 1дС в образцах ткани, собранных у субъектов.

Антитела по изобретению, иммуноспецифичные к фрагментам расщепления шарнирного пептида, способны связывать остатки ферментативно расщепленных 1дС, сохраняющие антиген-связывающие домены (например, Рай, Р(аЬ')₂, кс1дС), и таким образом восстанавливать Рс-зависимые характеристики связывания и сопутствующие эффекторные функции, обеспечивая интактную Рс-область. Поэтому антитела, созданные способами, изложенными в настоящем описании, или способные связывать ферментативно образуемые фрагменты антител ίη νίνο, могут быть полезны в качестве терапевтических молекул. Антитела к фрагментам расщепления 1дС по настоящему изобретению можно использовать для лечения пациентов, заболевание которых отличается тем, что в результате этого заболевания индуцируется протеолитическое расщепление 1дС. В одном аспекте антитела к фрагментам расщепления 1дС можно использовать для восстановления эффекторных функций у фрагментов антител, которые сохраняют способность специфически связывать мишень.

Кроме общего описания изобретения варианты его осуществления дополнительно будут раскрыты в следующих примерах.

Пример 1. Анализ расщепления тяжелой цепи 1дС человека.

Было проведено изучение протеолиза тяжелой цепи 1дС человека матриксной металлопротеазой, катепсинами, нейтрофильной эластазой человека (ΗΝΕ) и отдельными патогенными ферментами, такими как стафилококковая глутамилэндопептидаза (протеаза У8) и фермент стрептококков, разрушающий иммуноглобулины (Ие8).

Очищенное моноклональное антитело, содержащее тяжелую цепь 1дС человека, вводили в контакт с указанными протеазами и через различные промежутки времени отбирали образцы. Фрагментацию образцов оценивали и использованием микрокапиллярной технологии БаЬ-оп-а-сййр от компании АдйеШ для определения размера биологических молекул ίη νίίτο (Сое!/ Η. е1 а1., Вюсйетюа1 апй Вюрйубаса1 МеЛойк 60; 281-293, 2004).

Антитела, испольэуемые в качестве субстратов.

Моноклональные антитела представляли собой или антитела человека, или рекомбинантные гуманизированные мышиные антитела или химерные антитела человека и мыши, имеющие константные домены и шарнирные области антитела 1дС1каппа человека: МаЬ1 представляет собой 1дС1, которые связывают патоген, МаЬ2 (анти-цитокиновое) представляет собой химерное (человек/мышь) антитело 1дС1, имеющее константные области и шарнирную область антитела человека, а МаЬ3 представляет собой СЭК-пересаженное гуманизированное 1дС1. Все антитела содержат легкую цепь каппа.

Протеолитические ферменты и способы тестирования.

Проферменты рго-ММР-2, ММР-7 и рго-ММР-9 получили от компании Сйетюоп 1п1егпайопа1 (Тетеси1а, СА) и перед использованием активировали инкубацией с 1 мМ ацетатом п-аминофенилртути (АРМА; Са1Вюсйет, §ап О1едо, СА) в течение 16 ч при 37°С (Магсу е! а1., 1991). Рекомбинантную активную протеазу ММР-12 человека получили от Ρ.&Ό БуЧепъ. Рекомбинантная ММР-1 была любезно предоставлена доктором Хидеаки Нагейз. Профермент рго-ММР-3 человека транзиентно экспрессировали в клетках НЕК с гистидиновым тагом вместо шарнирного и гемопексинового доменов. Вариант профермента рго-ММР-3 активировали инкубацией при 55°С в течение 25 мин, как было описано ранее (Кокййк е! а1., 1991). Катепсины В, Ό, С, δ и протеиназа 3 были получены от Л1йеп5 Кекеагсй & Тесйпо1оду (А!йеп8, СА). Коагуляционные ферменты тромбин, фактор Ха (Р.Ха), фактор 1Ха (Р.1Ха), фактор Х11а (Р.Х11а) и калликреин, а также плазмин и плазминоген были куплены в Еп/уте Кекеагсй БаЬогаЮпек Щои!й Вепй, ΙΝ). Тканевый активатор плазминогена (Активаза) являлся продуктом СепеШесй ЩоШй δаη Ртапс18со, СА). Стрептокиназа и активированный белок С были получены от δ^дта (δί. йошк, МО). Стафилокиназа была получена от Айтпйу ВюКеадепШ (Со1йеп, СО). Глутамилэндопептидаза I (У8) из δίарй. аигеик была получена от Р1егсе Вю1есйпо1оду (КоскуШе, 1Ь). Рекомбинантный фермент, разрушающий иммуноглобулины, из δύ^ρ^^^^ руодепек (^δ) был предоставлен доктором Ларсом Бьорком из Университета Лунда (йипй, δ\\ι^π).

Протеолиз очищенных 1дС проводили при рН 7,5 в фосфатно-солевом буфере (ΡΒδ) или (для металлопротеаз) в Тпк-солевом буфере при 37°С. В реакции, содержащие металлопротеазы, включали хлорид кальция в концентрации 1 мМ для ММР-12 и 10 мМ для ММР-3; в других случаях не использовали никаких добавок. Концентрация антител обычно составляла 1 или 2 мг/мл, и реакции инициировали добавлением фермента до 1 вес.% от веса 1дС. В указанных временных точках отбирали акликвоты реакции (10-20 мкл) и реакции останавливали или добавлением ЕИТА до 20 мМ (инкубация с металлопротеаза- 8 025220 ми) или добавлением иодацетамида до 1 мМ (цистеиновые протеазы), или быстрым замораживанием.

Для полученных ферментативным расщеплением фрагментов основные позиции протеолитического расщепления в шарнирном домене 1дС1 были определены Ν-концевым секвенированием очищенного Рс-фрагмента (ММР-3 и ММР-12) и/или масс-спектрометрическим анализом с высоким разрешением очищенных фрагментов РаЬ (нейтрофильная эластаза, плазмин) и Р(аЬ')₂ (катепсин С, глутамилэндопептидаза и Ие8). Фрагментацию оценивали, используя микрокапиллярную технологию ЬаЬ-оп-а-сЫр от компании Адйеп!.

Результаты.

В таблице представлен список исследованных протеиназ и результаты анализа первичных продуктов протеолитического расщепления 1дС1 человека. Некоторые ферменты не расщепляли 1дС1 на фрагменты при используемых условиях. У активных протеиназ относительная специфическая активность (при описанных условиях) распределялась следующих образом: Ие8>ММР-12>ММР-3, глутамилэндопептидаза>нейтрофильная эластаза>катепсин С, плазмин>ММР-2, ММР-9>ММР-7.

На фиг. 2 приведен анализ молекулярного веса 1дС перед и в течение воздействия протеолитического фермента. Расщепление 1дС1 каждой из ММР-3, глутамилэндопептидазы I и Ие8 происходило ступенчатым образом (фиг. 2А, 2В и 2С соответственно). В каждом случае возникал ранний интермедиат с весом приблизительно 135000 Д, который впоследствии превращался в фрагменты весом приблизительно 100000 Д. В ходе этих реакций также образуется фрагмент весом приблизительно 35000 Д, скорее всего, Рсмономер. Молекулярный вес (35 кД), измеренный с помощью миграции в геле, был выше веса фрагмента, предсказанного по аминокислотной последовательности тяжелой цепи, которая составляет от 211 до 215 остатков (начиная с остатков 232 и 237 и до 447-го остатка на С-конце тяжелой цепи), но соответствовал весу фрагмента, содержащего сайт гликозилирования в СН2-домене. Исчезновение интактного 1дС (160000 Д) происходило за несколько часов для ММР-3 и глутамилэндопептидазы I и за минуту или меньше для Ие8 при этих условиях. Все реакции расщепления проводили при сравнимых условиях, как описано.

Было обнаружено, что интермедиат 135 кД является результатом однократного протеолитического расщепления одной из тяжелых цепей в нижней части шарнирного домена. При неденатурирующих условиях интермедиат неотличим от интактного 1дС по некоторым физическим свойствам, таким как миграция в гель-хроматографии (данные не показаны). Однако на содержащих ДСН гелях и в настоящей системе микрокапиллярного электрофореза продукт расщепления Рс-области (СН2-СН3-домены тяжелой цепи) отделяется от остальной структуры, высвобождая интермедиат меньшего размера (135 кД). Размер этого фрагмента согласуется с однократно расщепленным 1дС, опубликованным Сеаппд (2002, 8ирга). Более продолжительная инкубация 1дС1 с тремя ферментами приводила к превращению интермедиата 8с1дС в фрагменты Р(аЬ')₂ и Рс.

Для ферментов, способных расщеплять тестируемые различные субстраты на основе моноклональных 1дС1, были получены согласующиеся данные о том, что первоначальное расщепление до однократно-расщепленного интермедиата происходило относительно быстро, а для второе расщепление до Р(аЬ')2 требовало большего времени. Также на фигуре Ό показано расщепление МаЬ1 нейтрофильной эластазой человека (ΗΝΕ). ΗΝΕ отличалась от трех вышеприведенных ферментов тем, что расщепляла 1дС в верхней части шарнирного домена, в результате давая РаЬ-фрагмент и соответствующий связанный дисульфидными мостиками Рс-димер.

Основные позиции протеолитического расщепления шарнирного домена 1дС1 были идентифицированы по Рс-фрагменту (для протеаз ММР-3 и ММР-12) и/или масс-спектрометрическим анализом с высоким разрешением очищенных фрагментов РаЬ (для нейтрофильной эластазы, плазмина) и Р(аЬ')2 (для катепсина С, глутамилэндопептидазы и Ие8). Аминокислотная последовательность шарнирной области 1дС1 человека представлена на фиг. 3, где указаны идентифицированные позиции расщепления ферментами. Более продолжительное расщепление протеиназами, расщепляющими по сайтам в верхней части шарнирного домена, приводило к двум РаЬ-фрагментам; ферменты, которые расщепляли по сайтам в нижней части шарнирного домена (ниже дисульфидных связей в центре шарнирного домена), давали Р(аЬ')2-фрагменты.

Сайты, преимущественно расщепляемые ферментами, идентифицировали или подтверждали для каждого фермента (включая ММР-3 и ММР-12 человека, катепсин С человека, ΗΝΕ человека, стафилококковую глутамилэндопептидазу I и стрептококковую Ме8) на основе анализа как карбокси-, так и аминоконцевого остатка в Р(аЬ')₂- или Рс-фрагменте соответственно (таблица). В некоторых случаях в ходе более продолжительного времени инкубации наблюдали вторичные сайты расщепления (например, для катепсина С и ΗΝΕ) и не было ясно, были ли эти сайты альтернативными сайтами расщепления для указанной протеиназы или являлись результатом минорных загрязнений этих препаратов ферментов другими протеиназами. Сайты расщепления ММР-12 и ΗΝΕ в 1дС1 не были опубликованы ранее. Для других протеиназ идентифицированные основные позиции расщепления 1дС согласовались с ранее опубликованными результатами (СЬиЬа, 1994; Э1ете1 е! а1., 2005; Сеаппд е! а1., 2002; Утсепй е! а1., 2004; УатадисЫ е! а1., 1995).

Позиции, по которым проходит расщепление, немного отличаются для разных ферментов; протеолиз проходит после остатков пролина-245, глутаминовой кислоты-246 и глицина-249 для ММР-3, У8 и Ие8 соответственно. Эти различия в положении сайта расщепления не влияют на молекулярный вес,

- 9 025220 определяемый с использованием микрокапиллярной электрофоретической системы (Адйеи! ТееЬио1од1ез). Более продолжительное время инкубации с ММР-3, У8 и ЫеЗ позволяло получить полное превращение в Р(аЪ')2-фрагменты. Расщепление 1дС1 с помощью ΗΝΕ отличается от воздействия других протеаз, поскольку этот фермент расщепляет перед дисульфидными связями, расположенными в центре шарнирного домена (образуемыми цистеинами 238 и 241), по гистидину 238, давая в результате РаЪфрагмент и связанные дисульфидными связями Ре (см. фиг. 2Ώ).

Сайты расщепления даны на основе Εϋ-нумерации и относятся к остаткам, показанным на фиг. 3 и

219 243

ЗЕр ГО ΝΟ: 1, которая охватывает последовательность от 8ег до РЬе антитела 1дС1-класса человека. Некоторые протеиназы расщепляют 1§С1 ниже шарнирного домена и дают Р(аЪ')2-фрагменты, немного отличающиеся по длине (на участке, простирающемся от А1а до С1у ). Было опубликовано, что многие из разрушающих 1дС протеиназ, описанных в этом исследовании, экспрессируются или широко распространены в местах воспаления (ΗΝΕ, катепсин С, ММР-12), опухолях или окружении заживающих ран (ММР-2, ММР-3, ММР-7, ММР-9, плазмин), а также в местах инфекции (глутамилэндопептидаза, ЫеЗ) (Оо11егу е! а1., 2003; КШап е! а1., 1996; Кооуаккегз е! а1., 2005; ЗсЬопЪеск е! а1., 1999; Зйарйо, 1999; Зикйоуа е! а1., 1998; уап Кетреп е! а1., 2006; Утсеп!з е! а1., 2004). Во многих случаях маловероятно, что внеклеточная экспрессия определенных протеиназ в первую очередь направлена против 1дС хозяина; скорее, их синтез связан с физиологией болезни (например, экспрессия матриксных металлопротеиназ в окружении опухоли). Тем не менее данные исследования т уйго деградации моноклональных антител очищенными ферментами указывают на то, что иммуноглобулины человека не устойчивы к действию ряда протеиназ, что имеет потенциальную значимость в отношении заболеваний человека.

Для ферментов, превращающих 1дОТ в Р(аЪ')2 (большая часть), расщепление является высоко специфичным и самоограниченным (в отличие от расщепления пепсином, при котором Рс расщепляется до маленьких пептидов). За исключением ЫеЗ скорость расщепления 1дОТ большинством этих внеклеточных протеиназ обычно меньше скорости расщепления пепсином в оптимальных условиях (например, рН 4,0). Протеолитическая фрагментация до Р(аЪ'Д происходит в две стадии. Ранее, в качестве возможного интермедиата в ходе расщепления иммуноглобулинов с помощью ММР-3 (Оеаппд е! а1., 2002) и ЫеЗ (УтсепВ е! а1., 2004) был предложен однократно расщепленный интермедиат. В настоящем исследовании систематически наблюдали, что первое расщепление до однократно расщепленного интермедиата происходило относительно быстро по сравнению с вторым, более медленным расщеплением, которое давало Р(аЪ'Д. Опубликованные в настоящем документе исследования были сфокусированы на 1дС1, так как он является преимущественным изотипом 1дС в кровотоке человека. Было проведено ограниченное количество экспериментов с участием других изотипов иммуноглобулинов человека для определения восприимчивости к ММР-3 и ЫеЗ. В этих исследованиях было показано, что восприимчивость 1дС4 была сравнима с 1дС1, в то время как 1дС2 и 1дС3 были более устойчивыми при этих условиях (данные не приведены). Сравнительные исследования деградации 1дА, 1дМ, 1дЕ и Ι^Ώ не проводились.

Вся информация обобщена в таблице, в которой коагулирующие протеиназы включали Р.Х11а, Р1Ха, Р.Ха, тромбин и активированный белок С; плазмин представлял собой плазминоген, инкубированный с активаторами плазминогена, !РА, стрептокиназой и стафилокиназой; только активаторы плазминогена означало отсутствие плазминогена; а ММР представляли собой рекомбинантные протеиназы, полученные или в активной форме, или в виде профермента, что подробно описано в разделе Материалы; и Нет означало отсутствие детектируемого расщепления в течение 24 ч. Если не указано особо, все ферменты были ферментами человека. Обозначение остатков дано по ЕИ-системе нумерации для тяжелой цепи 1дС1-антитела, где 25 остатков ЗΕ^ ГО ΝΟ: 1 соответствует остаткам с 219 по 243 полноразмерной зрелой тяжелой цепи.

Фермент	Источник	Тип протеиназы	Ассоциированное	Расщепляемый	Основной
	заболевание (ссылка)	сайт	продукт
Катепсин 3	Гранулы нейтрофилов человека	Сериновая эндопептидаза	Эмфизема, идиопатический фиброз легких, ревматоидный артрит (2, 3)	З1и233-Ьеи234	Г(аЬ')2+Гс
Катепсин В					Нет
Катепсин Ώ					Нет
Нейтрофильная эластаза (ΗΝΕ, эластаза лейкоцитов, полиморфонуклеарная (ПМН) эластаза	нейтрофилы		Амилоидоз, эмфизема легких, фиброз почек, синдром острой дыхательной недостаточности, ревматоидный артрит, опухолевая инвазия (2, 3)	ТЬг223-Н13224	ГаЬ+Гс
Панкреатическая эластаза			Панкреатит (3)
Протеиназа 3 (миелобластин)					Нет

- 10 025220

Триптаза	тучные клетки		Анафилактический шок, фиброз (2)		Нет
Химаза	тучные клетки		Воспаление, сердечнососудистые заболевания (2, 3)		Нет
Калликреин					Нет
Коагуляционные протеиназы					Нет
Плазмин (фибринолизин)			Клеточная миграция (например, клеток опухолей) (2), стрептококковая инфекция (6)	Ьу2223-ТПг224	Нет
Только активаторы плазминогена					Нет
Интерстициальная коллагеназа (ММР-1)	Фибробласты, ходроциты человека	Металлоэндопе птидаза	Ревматоидный артрит, остеоартроз, воспалительные заболевания кишечника, идиопатический фиброз легких, аневризмы (1)		Нет
Желатиназа А (ММР- 2)	опухолевые клетки, фибробласты		Инвазивные опухоли (1)	(З1и2оо-Ьеи2·^	К(аЬ')2+Кс
Стромелизин (ММР-3)	фибробласты, хондроциты, остеокласты, макрофаги		Ревматоидный артрит, остеоартроз, атеросклеротические бляшки, болезнь Крона, колит, некоторые опухоли (1, 4)	С1и233-Ьеи234	Г(аЬ’)2+Вс
Матрилизин (ММР-7)	гландулярные эпителиальные клетки		Инвазивные опухоли (1, 4)	Ьеи2з4-Ьеи235	Г (аЬ')2+Пс
Коллагеназа 2 (ММР- 8)	нейтрофилы		Воспаление, ревматоидный артрит, остеоартроз (1, 4)		Нет
Желатиназа В (ММР- 9)	нормальные и опухолевые клетки, активированн ые моноциты, нейтрофилы, Т-клетки		Воспаление, аневризма аорты, синдром острой респираторной недостаточности, ожоги, ревматоидный артрит, остеоартроз, воспалительные и опухолевые инфильтраты (1, 4)	Ьеи234-Ьеи235	К(аЬ')2+Кс
Металлоэластаза макрофагов (ММР-12)	макрофаги		Воспаление, разрушение тканей при сверхэкспрессии, аневризмы, атеросклеротические бляшки (1)	Рго232-С1и233	К(аЬ')2+Кс
Катепсин 3		Цистеиновая эндопептидаза			Нет

- 11 025220

Глутамилэндопептидаза I (С1и У8- протеаза)	5£арЬ. аигеиа	Сериновая эндопептидаза	Инфекция ЗСарЪ. Аигеиз (2)	С1и233-Ьеи234	К(аЬ')2+Гс
Разрушающий иммуноглобулины фермент стрептококков (1Ле5)	ЗСгер. руодепез	Сериновая эндопептидаза	Инфекция ЗЬгер. Руодепез (5)	С1и236-С1у237	Г(аЬ')2+Гс

(1) Ваггеее А. Л., ЕамЫпдз Ν. Ώ. апс! Ноеззпег Л. Γ.(Εά8.), НапЬЬоок οί Ргоеао1уе1с Епгутез νοί. 1, ΕΙεβνίΘΓ, АтзеегсЗат, 2004.

(2) Ваггеее А. 1., ВаиЫпдз Ν. Э. апс! Иоеззпег 3. Е.(Ес!з.), Еапс!Ьоок οί Ргоеео1уе1с Епгутез νοί. 2, Е1зеу1ег, АтзкегсЗат, 2004.

(3) Рсмегз, ЛС Ргоеео1уе1с Епгутез апс! Эхзеазе Тгеаетепе” 1982. 1п: Ееепеу апс! МЫЪакег (еДз) .

Μοάίίίο^ίίοη о£ Ргоеехпз: Εοοά, Ыиег1е1опа1, апс! Ркагт.асо1од1са1 Азреоез. АсЫапсез ίη Скетхзегу ЗегГез 198. АСЗ, ИазЫпдкоп, Э.С. 1982 рр 347-367.

(4) ТсЬе£уег1коу I., ЕопДау Н. К., уап Е1 В., Каегз С. Η., νβΓζί;]1 Ν., ТеКорре1е Л. М., Еигггпда Т.

И. Л., ЭеСгоое Л. апс! НаппетааПег В., 2004. ММР Рго£Пе ίη раггес! зегит апс! зупоУ1а1 ίΐιιίά затр1ез о£ ра-Ыепкз νίΜι гкеитаеогс! агкЬг1е1з. Апп .Вкеит. ΏΪ3. 63, 881-883.

(5) 71псепез В., νοη Раме1-Р.атт1пдеп и., В^огск Ь. апс! АЬгакатзоп М., 2004. Епгутакас скагасеегхгаехоп о£ еке з£гер£ососса1 епс!орере1с!азе, ШеЗ, геуеа1з екае ίί. ίε а сузееапе ргоееазе тлПек зегхсе зресхПсИсу £ог 1дО с1еауаде с!ие ко ехозИсе ЫпсПпд. Вхоскетхзегу 43, 15540-15549, (6) Зип Н., К1пдЛак1 и., Нотехзеег Л.М., Гау И.Р., Епд1еЬегд И.С., Уапд Α.Υ., Ео^ек Ь.З., Иапд X.,

ЗзоЬгапд и., ОИпзЪигд ϋ., 2004. Р1азт1подеп ίε а сг1е1са1 козе раекодепгсТеу £асеог £ог дгоир А зегереососса1 ίηίβοΕίοη. Зсгепсе. 305, 1283-1286.

Пример 2. Расщепление 1дО воспалительным экссудатом.

Предполагается, что воспалительные экссудаты и другие подобные жидкости будут содержать протеолитические ферменты, ассоциированные с воспалением и заживлением ран. Для этой цели от компании Е1Ысоп 1пс. были получены образцы раневых жидкостей.

В первую очередь проводили случайное биотинилирование антител (субстрата), которые содержали константные домены тяжелой цепи человека. Десять микролитров биотинилированных антителсубстрата добавляли к 190 мкл раневой жидкости и инкубировали при 37°С в течение 8-24 ч. В указанные временные точки проводили отбор образцов. Исходные 1дП и образцы через различные промежутки времени наносили на отдельные лунки 4-12% В1з-Тпз-геля и проводили ДСН-ПААГЭ. Разделенные полосы переносили на нитроцеллюлозную мембрану и после блокирования 0,1М Тпз-солевым буфером (ТВ8), содержащим 0,1% Тмееп 20 и 10% молока для блокирования (Βίοΐΐο), блот проявляли, используя реагент ΑνΙΟΙΝ-Ώ, конъюгированный с пероксидазой хрена, с последующим добавлением ТМВсубстрата.

Как видно из изображения геля, приведенного на фиг. 4, через 8 ч наблюдались потеря интактного 1дП и появление полос, аналогичных по размеру Р(аЬ')2- и РаЬ-стандартам. Результаты этого эксперимента указывают на то, что протеолиз 1дП ферментами в воспалительной жидкости происходит за несколько часов и дает фрагменты, соответствующие фрагментам, полученным протеолизом т νΐΐΓο с использованием очищенных ферментов.

Пример 3. Получение реагента.

Для определения присутствия фрагментов антител хозяина (человека), продуцируемых эндогенными протеазами, требуется реагент, который селективно связывают расщепленные 1дП, но не интактные 1дП. Применение реагента должно позволять как идентификацию расщепленного компонента, так и оценку количественной разницы между содержанием фрагмента в образцах, полученных от больных пациентов, по сравнению с нормальным содержанием.

Детекция неизвестных, но, вероятно, небольших количеств фрагментов 1дП в растворах, содержащих относительно высокие концентрации интактных 1дП, является трудной задачей. Хотя было отмечено, что зс1дП является возможным фрагментом расщепления 1дП (Оеаппд 2002, зирга), его количественное определение в образцах человека ранее не проводилось. Для этой цели реагенты с необходимой специфичностью (имеющие высокую степень специфичности в отношении расщепленного, а не интактного 1дП) получали в кроликах.

Для иммунизации (в компании ΙηνΐΐΓο^η Согрогайоп) использовали три конъюгированных, отличающихся по длине одноцепочечных пептидных аналога шарнирной области 1дП1 человека. 8-членный пептид, соответствующий последовательности аминокислот на аминоконцевой стороне сайта расщепления ММР-3, ковалентно присоединяли к гемоцианину улитки (КБН) через Ν-конец (ТСРРСРАР, остатки 7-14 в 8Ε^ ΙΙ) ΝΟ: 1). Более длинные пептиды, соответствующие сайтам расщепления глутамилэндопептидазой (ТСРРСРАРЕ, остатки 7-15 в 8Ε^ ΙΌ ΝΟ: 1) и Ые8 (ТСРРСРАРЕББО, остатки 7-18 в 8Ε^ ΙΏ ΝΟ: 1), приготавливали в качестве отдельных иммуногенов. Проводили иммунизацию новозеландских кроликов (по два животных на иммуноген) подкожной инъекцией 0,2 мг конъюгированного пептида в полном адъюванте Фрейнда, а повторную иммунизацию проводили три раза 0,1 мг антигена в неполном адъюванте Фрейнда на 14-, 42- и 56-й день. Сыворотку собирали через 4, 8 и 10 недель и объединяли собранные образцы по каждому антигену для очистки антител. Иммунные титры контролировали с помощью ΕΕΙ8Α с антигенным пептидом на твердой фазе.

- 12 025220

Для аффинной очистки антител использовали соответствующие пептидные антигены, иммобилизованные на активированной подложке. Объединяли антисыворотку от двух кроликов, иммунизированных одним антигеном, и пропускали через колонку с антигеном, после чего колонку интенсивно промывали. Специфические антитела элюировали в виде низкоаффинных и высокоаффинных пулов, используя 3М КЗСЦ и 0,1М глицин, рН 2,5 соответственно. Два пула имели практически одинаковые характеристики связывания, и их использовали взаимозаменяемо и/или объединяли. Три отдельно элюированных пула связавшихся антител затем подвергали второй стадии аффинной адсорбции, на этот раз, на колонке, содержащей интактное антитело, включающего в себя константные области тяжелой цепи 1§О1 человека (МаЬЗ). Целью второй аффинной хроматографии было удаление нежелательных антител, которые могут узнавать интактные 1§О. Однако на колонку с 1§О сорбировалось немного антител или они не сорбировались вообще, что позволяло предположить, что популяция антител имела реактивность только в отношении расщепленной последовательности с ее экспонированным карбоксильным концом.

С помощью ЕЫЗА проводили тестирование индивидуальных аффинно-очищенных кроличьих антител к пептидам на их способность связывать ферментативно полученные фрагменты 1§О человека, а также интактные 1§О (фиг. 5) Очищенные антитела от кроликов, иммунизированных конъюгированными с КЬН остатками 7-14 в ЗЕЦ ГО N0: 1 (аналог сайта расщепления ММР-3), не связывали интактные 1§О и были высоко специфичны в отношении 8с1д0 и Р(аЬ')₂, полученных расщеплением 1§0 с помощью ММР-3. Этот препарат антител имел минимальную реактивность с 8с1д0 и Р(аЬ')₂, полученными расщеплением протеазами У8 или ЫеЗ. В отличие от этого, антитела, полученные от кроликов, иммунизированных пептидным аналогом сайта расщепления шарнирного домена протеазой У8 (остатки 7-15 в ЗЕЦ ГО N0: 1) и пептидным аналогом сайта расщепления шарнирного домена протеазой ЫеЗ (остатки 7-18 в ЗЕО ГО N0: 1) показывали перекрестное связывание с фрагментами 8с1д0 и Р(аЬ')₂, полученными с помощью любого из этих двух ферментов. Однако эти препараты имели минимальную реактивность в отношении продуктов расщепления с помощью ММР-3. Ни один из этих препаратов не связывал интактные 1§0, и ни один из этих препаратов антител не обладал сравнительной реактивностью с фрагментами, включая Р(аЬ')₂ и 8с1дО, продуцированными тремя другими ферментами, как показано на фиг. 6.

Предполагаемым применением реагента к шарнирному домену является детекция фрагментов 8с1дО и Р(аЬ')₂ (и других потенциальных фрагментов), которые продуцируются в комплексном окружении ίη νίνο ферментами, присутствующими в затронутых болезнью тканях, или продуцируются связанными с болезнью типами или популяциями клеток, например инфильтрующими макрофагами или нейтрофилами. Для оптимального перекрытия потенциальных фрагментов 1§0 было решено, что предпочтительно иметь наиболее широкий из возможных профилей узнавания сайтов расщепления. По этой причине была получена смесь каждого из трех пулов кроличьих антител с концентрацией каждого компонента 0,33 мг/мл (общая концентрациям мг/мл) для использования в дальнейшем в Вестерн-блоттинге и ЕЬ1ЗА на основе сыворотки. Этот объединенный реагент был назван КАН-1.

Пример 4. Метод анализа однократно расщепленных иммуноглобулинов.

Далее подробно описан новый метод анализа, применяемый для детекции 8с1дО в сыворотке, с использованием в качестве захватывающего реагента КАН-1, способного связывать расщепленные 1§0 человека, но не интактные 1§0 человека.

Для хемилюминесцентного ЕЬ1ЗА часть 96-луночных планшетов для хемилюминесцентного анализа (Ципс) покрывали КАН-1 с концентрацией 10 мг/мл в РВЗ. Остальную часть планшета оставляли непокрытой антителами (только 1хРВЗ). Планшеты инкубировали при +4°С в течение ночи. Планшеты промывали и добавляли 200 мкл/лунку блокирующего агента СЬетШЬОСКЕК от компании СЬетюоп 1Щегпа1юпа1 (кат. № 2160) и инкубировали при 37°С 30 мин. Блокирующий буфер аспирировали из лунок и в планшет добавляли стандарты и образцы. Стандарт МаЬ3, расщепленный У8 8с1дО, добавляли в дупликатах, начиная от 50 мг/мл в РВЗ, содержащем 1% казеин и 3% ВЗА, используя 4-кратные серийные разведения. Образцы сыворотки больных добавляли в разведении 1:50 в том же буфере. Планшеты промывали и в каждую лунку добавляли конъюгированный с НКР аффинно-очищенный Р(аЬ')₂-фрагмент ослиных антител к 1§О (Н+Ь) человека (от компании Ьюкюп 1ттипо КекеагсЬ) в разведении 1:6000, которое имело минимальную перекрестную реактивность с иммуноглобулинами различных животных, включая кролика. Эти антитела добавляли разведенными в РВЗ с 1% казеина и 3% БСА и инкубировали при 37°С 1 ч. Планшеты тщательно промывали и 100 мкл/лунку субстрата для НКР добавляли (ВМ СЬетйитшексепсе РОЭ, КосЬе, кат.№ 582950) за секунды перед измерением люминесценции в флуориметре.

Из величины, полученной для каждой лунки, которая была покрыты КАН-1, вычитали среднюю люминесценцию для лунок с 0 нг/мл 8с1дО на стандартной кривой. Это вычитание является контролем любой неспецифической реактивности вторичных антител с КАН-1. Затем, из ранее скорректированных величин для лунок, покрытых КАН, вычитали величину, полученную для образцов от каждого донора на лунках, не покрытых КАН-1. Это учитывает любую неспецифическую реактивность сыворотки с планшетом.

Пример 5. Использование реагента для детекции протеолитической активности, ассоциированной с болезнью.

Проводили тестирование реагента КАН-1 на его способность детектировать фрагменты 1§О в другой воспалительной жидкости, синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (РА).

- 13 025220

Коллекция образцов синовиальной жидкости пациентов с РА была приобретена в компании Βίοгес1ашайоп. Образцы разводили 1:5 в буфере для образцов (ЬО8) и 10 мкл каждого образца наносили на 4-12% Βίδ-Τήδ-гель. Также (в качестве контроля реактивности КАН-1) на гель наносили интактные 1дС (МаЬЗ) или расщепленные протеазами 1дС (МаЬЗ, частично расщепленные ММР-3, глутамилэндопептидазой и Ие8). После ДСН-ПААГЭ образцы из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану и блокировали мембрану с помощью Β1οΐΐο. Затем мембрану инкубировали с КАН-1 (разведение 1:2500 в Β1οΐΐο), промывали 0,1ΜΤΒ8, рН 7,5, содержащим 0,1% Тетееп 20, и инкубировали с козьими антителами к 1дС (Н+Ь) кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (в разведении 1:5000). Блот затем проявляли с субстратом ТМВ. Как показано на фиг. 7, препарат КАН-1 не реагирует с интактными 1дС, но детектирует кс1дС, Р(аЬ')₂ и, возможно, РаЬ' во всех трех образцах, расщепленных протеазами. В случае всех пяти образцов синовиальной жидкости пациентов с РА детектировались полосы на уровне, приблизительно соответствующем размерам кс1дС, Р(аЬ')₂ и РаЬ', что позволяло предположить, что эти протеолитические фрагменты присутствуют в синовиальной жидкости индивидуумов с РА.

Пример 6. Использование реагента для наблюдения за течением заболевания.

Плазма или сыворотка крови являются более удобными для тестирования биомаркеров, чем биологические жидкости или экстракты тканей, такие как синовиальная жидкость. Однако преимущество синовиальной жидкости заключается в том, что она присутствует там, где протеазы являются активными, и является их окружением, в котором можно ожидать накопление фрагментов 1дС, как описано в примере

2. Тем не менее удобство и распространенность сыворотки для тестирования делает ее значительно более вероятным образцом ткани для биомаркеров, включая продукты разрушения 1дС.

Перед началом тестирования присутствия фрагментов 1дС в различных типах и источниках сыворотки желательно установить, какой (при наличии таковых) из протеолитически расщепленных фрагментов 1дС будет находится в кровотоке в течение периода времени, достаточного для его накопления и количественного определения. Для ответа на этот вопрос было разработано сравнительное фармакокинетическое исследование. Следующий фармакокинетический эксперимент на мышах был смоделирован на базе нескольких аналогичных исследований, опубликованных ранее, в которых 1дС человека в среднем имели конечное время полужизни 10-20 дней.

Фракционированные продукты протеолиза, МаЬ2 1дС1, а также кс1дС и Р(аЬ')₂ полученные с помощью ММР-3, получали, как указано ниже. МаЬ2 1дС в количестве 20 мг расщепляли активированной нагреванием ММР-3, как описано в примере 1. Расщепление инициировали добавлением фермента к раствору МаЬ2 с концентрацией 4 мг/мл в Ττίδ-солевом буфере, содержащем 10 мМ СаС1₂, рН 7,5, при 37°С. Реакцию останавливали добавлением ΕΌΤΛ до конечной концентрации 20 мМ через 48 ч. В реакции не оставалось интактных 1дС, а содержание кс1дС, Р(аЬ)₂ и Рс составляло 24, 41 и 36% соответственно, исходя из анализа на микрокапиллярной системе АдПей (8862-67). Остановленные реакции расщепления очищали в две стадии для удаления Рс-фрагмента и отделения очищенных кс1дС и Р(аЬ)₂. На первой стадии проводили хроматографию продуктов реакции на белок А-сефарозе. Материал, не связавшийся с колонкой, содержал Р(аЬ)₂-фрагмент и не содержал детектируемых интактных 1дС или кс1дС. Промывка колонки 0,1М цитратом натрия, рН 3,5, приводила к элюции смеси содержащих Рс компонентов: Рсфрагмента и кс1дС. Фракции немедленно нейтрализовали до рН 7,0 добавлением 1/10 объема Ττίδ-буфера (2М, рН 7,0). Нейтрализованный материал концентрировали до объема приблизительно 1 мл и диализовали против фосфатно-солевого буфера, рН 7,5. Рс-фрагмент отделяли от кс1дС гель-фильтрацией на 8ирегбех 200 (объем колонки = 100 мл). С колонки элюировали два пика, которые далее идентифицировали с помощью описанной ранее микрокапиллярной технологии АдПепЕ как фрагмент 135 кД, соответствующий положению полосы кс1дС в геле, и пик с меньшим молекулярным весом, идентифицированный как мономерный Рс-фрагмент с весом приблизительно 35 кД. Очищенные компоненты кс1дС и Р(аЬ)₂ приводили в контакт с АсБс1еап Εΐοχ (0,5 мл геля на 5 мл раствора каждого белка) для уменьшения содержания эндотоксина до величины, допустимой для внутривенных инъекций мышам (<40 ЭЕ/кг) по инструкции ΛΛΛ^ΛС (Ассоциации по оценке и аккредитации условий содержания лабораторных животных).

В этом исследовании эквивалентное по весу количество (1,9 мг/кг) интактных химерных (мышь/человека) моноклональных антител, МаЬ2 1дС1, и кс1дС и Р(аЬ')₂, полученных с помощью ММР3, тестировали, как описано ниже.

В фармакокинетическом исследовании использовали группу из 21 самок мышей Βа1Ь/с (Асе Ашта1к). Терминальный забор крови осуществляли пункцией сердца у трех случайным образом выбранных мышей перед экспериментом, и эти образцы служили в качестве контролей базовой линии. Оставшихся восемнадцать самок мышей Βа1Ь/с взвешивали и помещали в шесть равных групп. Двум группам вводили с помощью инъекции интактные МаЬ2 1дС1, двум группам -МаЬ2 кс1дС1, полученные с помощью ММР-3, и двум группам - МаЬ2 Р(аЬ')₂, полученные с помощью ММР-3. Все инъекции проводили внутрибрюшинно с постоянным объемом дозы 10 мл/кг в зависимости от веса индивидуального животного при концентрации 0,19 мг/мл. Поэтому каждое животное получало 1,9 мг/кг дозы в нулевой день. Собирали приблизительно 80 мкл крови от первой из двух групп через 1, 24 ч, 7, 21, 35 дней, и от второй группы - через 5, 48 ч, 14 и 28 дней. До тестирования образцы сыворотки хранили при 20°С.

Определяли концентрации 1дС и фрагментов 1дС в собранной сыворотке с помощью твердофазного

- 14 025220 иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Для покрытия планшетов (Сок1аг, кат. № 3369) использовали разведение 0,5 мкг/мл в РВ8 козьих антител к 1дО человека (специфичных к Р(аЬ')₂-фрагменту) с минимальной перекрестной реактивностью к бычьим, лошадиным и мышиным сывороточным белкам. Планшеты блокировали раствором казеина и БСА в РВ8. После блокирования добавляли стандарты и образцы в 1% казеине и 3% БСА в РВ8. Стандарты включали серийные разведения (начиная с концентрации 1000 нг/мл) следующих антител: химерного (человек/мышь) 1дО1, химерного (человек/мышь) кс1дО1, полученного с помощью ММР-3, или химерного (человек/мышь) Р(аЬ')₂, полученного с помощью ММР-3. Образец для каждой временной точки серийно разводили от 1:10 до 1:163840 в РВ8/1% казеин/3% БСА. 1дО человека, связавшиеся с лунками, покрытыми захватывающим антителом к иммуноглобулинам человека детектировали, добавляя 50 мкл на лунку козьих антител к 1дО (Н+Ь) человека Цасккоп 1ттипо-гекеагсЬ, кат. № 109-035-083) с минимальной перекрестной реактивностью к бычьим, лошадиным и мышиным сывороточным белкам и инкубируя в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты тщательно промывали и добавляли 50 мкл на лунку субстрата 0-фенилендиамина на приблизительно 10 мин, и реакцию останавливали добавлением 50 мкл на лунку 3М НС1 и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при 490-650 нм. Результаты показаны на фиг. 8.

Результаты фармакокинетического эксперимента на мышах указывают на то, что кс1дО обладает продолжительным временем жизни в кровотоке в отличие от Р(аЬ')₂. Быстрое выведение Р(аЬ')₂ у мышей согласуется с быстрым исчезновением этого фрагмента у людей (Роккок Ь.К. еί а1., Эгид. Эеу. Рек. 61: 108-120, 2004). Эти результаты указывают на то, что кс1дО является наиболее распространенным, долгоживущим и пригодным протеолитическим компонентом 1дО для использования в качестве биомаркера.

Пример 7. Протеолитические ферменты при заболеваниях.

Для того чтобы кс1дО считался пригодным в качестве биомаркера заболевания, его количество в образцах от пациентов с определенными категориями заболеваний должно отличаться от его содержания в образцах от здоровых людей.

Коммерческим источником сыворотки от больных индивидуумов была выбрана компания Оепотюк СоПаЬогаИуе (в настоящее время 8егаСаге Ы£е 8аепсек 1пс.). Были приобретены небольшие объемы (по 300 мкл) сыворотки 10 различных индивидуумов для каждого из 8 заболеваний. Категории заболеваний были следующими: ревматоидный артрит, остеоартроз, астма, диабет I типа, рак молочной железы, рак легких, инфаркт миокарда и застойная сердечная недостаточность. Кроме того, в качестве контроля у того же поставщика была приобретена сыворотка от 28 соответствующих по возрасту и полу здоровых волонтеров.

Анализ образцов проводили с использованием метода, описанного в примере 4, и результаты представлены на фиг. 9. С помощью этого метода анализа, основанного на селективности реагента РАН-1, было продемонстрировано, что при воспалительном аутоиммунном заболевании, ревматоидном артрите, продукты расщепления 1дО, аналогичные тем, что образуются в результате воздействия известных специфичных протеаз, детектируются хорошо и на уровне выше, чем у здоровых или нормальных доноров. В отличие от этого у пациентов с остеоартрозом уровень содержания этих продуктов расщепления был в пределах значений для образцов от здоровых индивидуумов.

Пример 8. Модифицированный метод анализа расщепленного по одной цепи 1дО.

В примере 4 был описан твердофазный метод анализа, ЕЫ8А, с использованием реагента РАН-1 для детекции кс1дО в сыворотке. Для оптимизации пределов детекции концентрации кс1дО в образцах сыворотки в метод были внесены определенные изменения.

Использовали планшеты 1тти1оп 4 НВХ (от компании У\УК). которые покрывали кроличьими поликлональными антителами (РАН-1) в концентрации 5 мкг/мл в РВ8, рН 7,2 (100 мкл на лунку), герметично запечатывая и инкубируя планшеты в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого планшет промывали 3хРВ8, 0,05% Туееп (81дта) с использованием устройства для автоматического промывания планшетов. Все образцы и стандарты разводили в РВ8, содержащем 1% БСА, 0,05% Туееп. Средством детекции кс1дО-стандартов или неизвестного количества кс1дО в сыворотке были биотинилированные антитела к Рс фрагменту 1дО (ап11-1дО Рс-Вюйп (и8Вю1одюа1к, 8уатрксой, МА)).

Планшет блокировали с использованием 200 мкл реагента 8ирегВ1оск (Р1егсе) в течение 15 мин при комнатной температуре на качалке и затем промывали планшет 3хРВ8, 0,05% Туееп на устройстве для автоматического промывания планшетов.

Стандарт, продукт расщепления антитела МаЬ1 протеазой, добавляли в лунки в дупликатах, начиная с концентрации 600 мг/мл (100 мкл на лунку, 3-кратные разведения). Образцы сыворотки разводили 1:100, 1:200, 1:400 и т.д., в зависимости от ситуации. Образцы сыворотки добавляли в дупликатах в то же время и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре на качалке с последующим 3х промыванием РВ8, 0,05% Туееп на устройстве для автоматического промывания планшетов.

Во все лунки добавляли 100 мкл на лунку 1дО Рс-ВюЬп в разведении 1:20000 (соответственно разведенных в буфере для анализа) и инкубировали один час при комнатной температуре на качалке с последующим 3х промыванием РВ8, 0,05% Туееп на устройстве для автоматического промывания планшетов.

- 15 025220

Во все лунки добавляли 100 мкл на лунку 8А-НКР (стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена, 81дта) в разведении 1:30000 РВ§, 0,05% Т\уееп, 1% БСА, и инкубировали один час при комнатной температуре на качалке с последующим 3х промыванием РВ§, 0,05% Т\уееп на устройстве для автоматического промывания планшетов.

В конце в каждую лунку добавляли 100 мкл ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина, пероксидазного субстрата), в том виде, как его поставляет изготовитель (§1дта) и инкубировали около 10 мин для появления цвета. Реакцию останавливали 75 мкл 1Ν Н₂§0₄ и измеряли поглощение при 450 нм.

При использовании приведенного выше формата ЕЫ§А метод демонстрировал значительно улучшенные линейность и степень извлечения кс1дО в здоровой, нормальной сыворотке. Линейность разведения в методе определяли в двух пулах сыворотки, разведенных 1:100, к которой затем добавляли МаЬ1 до концентрации 150 и 300 нг/мл и дополнительно разводили до концентраций 0, 25, 75 и 100% сыворотки. Проводили анализ каждого образца разведения в трипликатах и вычисляли среднее извлечение анализируемого вещества. Линейность оценивали, вычисляя коэффициент корреляции К2 из графика наблюдаемых (ось у) относительно ожидаемых (ось х) результатов восстановления анализируемого вещества для каждого пула образцов. Значения К2 составляли: образец 1, низкая концентрация 0,9983; образец 1, высокая концентрация 0,9913; образец 2, низкая концентрация 0,9852; образец 2, высокая концентрация 0,973; а линейность разведения была 100% для всех разведений.

Пример 9. Детекция расщепленного по одной цепи 1дО в сыворотке.

Сыворотку пациентов с РА использовали только для дополнительного исследования результатов в примере 4, где некоторые образцы сыворотки из группы пациентов имели заметно более высокий уровень содержания кс1дО по сравнению с контрольной группой.

Образцы сыворотки от 10 субъектов с ревматоидным артритом (РА) и от 10 совпадающих по возрасту и полу здоровых индивидуумов были получены от компании Сепописк Со11аЬога!Ше. Анализ образцов был проведен с использованием модифицированного метода, описанного в примере 8, и результаты показаны на фиг. 10. Результаты показали, что у 4 из 10 субъектов с РА концентрация кс1дС в сыворотке превышала 60 мкг/мл. В группе здоровых контролей концентрация кс1дС находилась в диапазоне от <8,2 до 52 мкг/мл. Образцы для этого сравнения не отбирались по строгому соответствию стадии заболевания, схемам лечения и т.д. Поэтому можно ожидать, при проведении долговременного анализа сыворотки пациентов из хорошо контролируемых и проспективных клинических исследований может возникнуть большее отличие между содержанием кс1дС в сыворотке здоровых и больных людей. Однако данные настоящих анализов этих коммерческих образцов позволяют предположить, что у больных пациентов можно детектировать повышенную концентрацию кс1дС.

Пример 10. Получение моноклонального антитела к шарнирному домену 1дС.

Было бы желательно получить для изготовления и потенциального применения у больных людей определенную молекулу, такую как моноклональное антитело, которая связывает расщепленные 1дС и не связывает интактные 1дС. Следующая методика представляет способ получения такой молекулы.

Иммуногеном являлся 12-членный пептидный аналог нижней части шарнирного домена 1дС1 и прилегающего СН2-домена: ТСРРСРАРЕЬЬС (остатки 7-18 в §ЕЦ ГО N0: 1). Природные цистеины были заменены аланинами, что давало вариант ТАРРАРАРЕЬЬС. На Ν-конец был добавлен цистеин для конъюгирования с гемоцианином улитки (КЬН) стандартными химическими способами для реакции со свободными сульфгидрильными группами. Конечным иммуногеном являлся КЬН-СТАРРАРАРЕЬЬС.

Новозеландских белых кроликов (3) иммунизировали 0,5 мг пептида с КЬН в полном адъюванте Фрейнда подкожно в несколько мест (5). Повторную иммунизацию проводили 0,25 мг иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда с трехнедельными интервалами, всего было проведено 4 дополнительных иммунизации.

Наблюдение за титром сывороточных антител к конъюгированной с БСА версией того же пептида в ходе иммунизации проводили стандартными методами ЕЫ8А. Для спленэктомии были выбраны животные (2) на основе данных о титре. Кроличьи гибридомы получали из лимфоцитов селезенки, слитых с партнерским клетками для слияния (8р1екег-Ро1еЬ 1995 РNΑ§ ЬЗА 92: 9348-9352). Рост клеток проверяли каждые 2-3 недели после слияния в нескольких планшетах.

Скрининг положительных гибридом проводили с помощью ЕЫ8А на планшетах, покрытых конъюгатом иммуногенного пептида с БСА. Для каждого слияния были идентифицированы множество положительных клонов. Дальнейший скрининг включал связывание с интактными 1дС1 и различными полученными с помощью ферментов Р(аЬ')₂-фрагментами 1дС1. В результате этих стратегий скрининга и вычитательного скрининга были отобраны 3 клона на основе сильного избирательного связывания с иммуногенным пептидом и с Р(аЬ')2-фрагментами, у которых иммуногенный пептид располагается на конце или близко к концу, и с минимальным связыванием с интактным 1дС1. Положительные гибридомы субклонировали и размножали.

Очистку кроличьих 1дС проводили из супернатантов индивидуальных клеток стандартными способами, включая хроматографию на иммобилизованном белке А. Специфичность очищенных кроличьих 1дС в отношении связывания с пептидными аналогами шарнирного домена 1дС1, а также с интактными 1дС и очищенными Р(аЬ')₂-фрагментами 1дС, полученными в результате однократного или двойного

- 16 025220 расщепления ферментами ИеЗ и ММР-3 МаЬ-антител, тестировали с помощью стандартных протоколов ЕЫЗА. Кратко, пептидами, синтезированными с помощью стандартных методов пептидной химии и биотинилированными по Ν-концу, покрывали лунки, уже покрытые стрептавидином. 1дС и фрагменты использовали для покрытия лунок напрямую в концентрации 10 мкг/мл. Связывание с кроличьими моноклональными антителами детектировали с помощью подробно описанной системы из конъюгированных с пероксидазой хрена козьих антител к 1дС (Рс-фрагменту) кролика и субстрата О-фенилендиамина.

Результаты ЕЫЗА для кроличьего моноклонального антитела 91-2 (тАЬ 91-2) показаны на фиг. 11. Ясно показана избирательность связывания с пептидами нижней части шарнирного домена, оканчивающимися на остатки 16-22 в ЗЕС ГО N0: 1 (Ь-Ь-С-С-Р-З-У-Р). Связывание с расположенными выше остатками, соответствующими фрагментам из верхней части шарнирного домена, центральной части шарнирного домена или начала нижней части шарнирного домена, входящим в остатки 3-16 в ЗЕС ГО N0: 1 (Ό-Κ-Т-Н-Т-С-Р-Р-С-Р-А-Р-Е-Ь-), практически отсутствовало или было минимальным. Связывание с полученными с помощью ММР-3 Р(аЬ')₂-фрагментом и 5с1дС-фрагментом было незначительным (что согласуется с отсутствием связывания с пептидными аналогами сайта расщепления ММР-3 между остатками 14 и 15 в ЗЕС ГО N0: 1 (Р-А-Р*Е-Ь-Ь). В отличие от этого наблюдалось сильное связывание с фрагментами Р(аЬ')₂ и 5с1дС, полученными в результате расщепления ИеЗ. Таким образом была подтверждена специфичность связывания кроличьих тАЬ к иммуногену, на который их получали. В качестве положительного контроля служили лунки, напрямую покрытые 1дС кролика.

Реакция комплементзависимой цитотоксичности.

В качестве клеток-мишеней в реакции комплементзависимой цитотоксичности (СЭС) использовали клетки ^1Ь2-З, лимфобластоидной В-клеточной линии, экспрессирующей СЭ20 (АТСС (Американская коллекция типовых культур)). В лунки 96-луночного планшета добавляли 50 мкл клеток до конечной концентрации 8х10⁴ клеток на лунку в среде КРМ1 с 5% инактивированной нагревом РВЗ (фетальной бычьей сыворотки), 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, пенницилином (500 ед./мл), стрептомицином (500 ед./мл), 2 мМ Ь-глутамином. В лунки добавляли еще 50 мкл среды с антителами в различных концентрациях или без них и планшеты инкубировали при комнатной температуре 2 ч. В лунки добавляли 50 мкл 10% раствора кроличьей системы комплемента (Иуйтодеи) и планшеты инкубировали 20 мин при 37°С. Анализ всех образцов проводили в трипликатах. Планшеты центрифугировали при 200 д в течение 3 мин, и отбирали по 50 мкл супернатанта в отдельные планшеты, и проводили измерение СЭС, используя набор для определения цитотоксичности на основе определения активности лактат-дегидрогеназы (ЬЭН суИИхюйу 0е1есОоп ΚίΙ (КосЬе)). Поглощение измеряли на спектрофотометре Зрес1та тах Р1и5 384 (Ретк1иЕ1тет). Данные нормализовали на максимальную цитотоксичность с Ттйои Х-100 (З1дта А1Пг1сП) и минимальную цитотоксичность в контрольных лунках, содержащих только клетки и систему комплемента.

На фиг. 12 показано, что 3 кроличьих моноклональных антитела к шарнирному домену способны восстанавливать комплементзависимый клеточный лизис клеток-мишеней при титровании в присутствии фиксированной концентрации Р(аЬ')₂-фрагмента антитела, которое связывает СЭ20. Кроличьи моноклональные антитела были более эффективными и действовали при более низких концентрациях, чем препараты поликлональных кроличьих антител к шарнирному домену (описанные ранее компоненты такой же системы детекции для сывороточных 5с1дС). Как и ожидалось, интактное антитело к СЭ20 было активным, но его Р(аЬ')₂-фрагмент и 5с1дС-версия совсем не имели активности. Кроличьи моноклональные антитела к шарнирному домену не были способны направлять лизис клеток в отсутствие связывающего клетки Р(аЬ')₂-фрагмента. Эти результаты доказывают, что моноклональные антитела к шарнирному домену могут восстанавливать опосредованные комплементом эффекторные функции в ином случае неактивных продуктов протеолитического расщепления 1дС1.

- 17 025220

Список последовательностей

<110>	СепЬосог, 1пс.
<12 0	ФРАГМЕНТЫ РАСЩЕПЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРОВ
ЗАБОЛЕВАНИЙ	И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И СВЯЗЫВАНИЯ ТАКИХ ФРАГМЕНТОВ
<130	СЕИ5192РСТ
< 14 0>	ТО ВЕ А551СЫЕ0
<14 1>	2003-03-04
<150>	60/955162
<151>	2007-08-10
<160	11
<1 7 0>	РаЬепЫп νθΕδίοη 3.5
<210	1
<211>	25
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното зархегг
<4 00>	1

Зег	Су5	Азр	Ъуз	ТЬг	ΗΪ3	ТЬг	Суз	Рго	Рго Суз	Рго А1а Рго С1и Ъеи
1				5					10	15
Ъеи	01у	С1у	Рго	Зег	Уа1	РЬе	Ъеи	РЬе
			20					25

<210 2 <211> 41 <212> БЕЛОК <213> Ногтю Зар1епз <400 2

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

ΗΪ3

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ъуз

Агд

1

5

10

15

Уа1

С1и

Зег

Ъуз

Туг

С1у

Рго

Рго

Суз

Рго

Зег

Суз

Рго

А1а

Рго

С1и

20

25

30

РЬе

Ъеи

С1у

С1у

Рго

Зег

Уа 1

РЬе

Ьей

35

40

<2Ю> 3 <211> 41 <212> БЕЛОК <213> Ногтю зар1епз <400> 3

ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Н1з Ьуз Рго Бег Азп ТЬг Ъуз \7а1 Азр Ъуз ТЬг 15 10 15

Уа1	С1и	Агд	Ъуз 20	Суз Суз Уа1	С1и	Суз Рго Рго Суз 25	Рго А1а Рго Рго 30
Уа1	А1а	С1у	Рго	Зег	Уа1	РЬе	Ьей	РЬе
		35					40

<210> 4 <2Ы> 40 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 4

5ег

Суз

Азр

ТНг

Рго

Рго

Рго

Суз

Рго

Агд

Суз

РГО

СЬи

Рго

Ьуз

Бег

1

5

10

15

Суз

Азр

ТНг

Рго

Рго

Рго

Суз

Рго

Агд

Суз

Рго

АЬа

Рго

СЬи

Ьеи

Ьеи

20

25

30

С1у

С1у

Рго

Бег

УаЬ

РНе

Ьеи

РНе

35

40

<210 5 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 5

Бег Суз Азр Ьуз ТНг Нхз ТНг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго 1 5 10 <210> б <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> б

Суз Азр Ьуз ТНг Нхз ТНг Суз Рго Рго Суз Рхо АЬа Рго СЬи 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 7

ТНг Нхз ТНс Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго С1и Ьеи Ьеи СЬу 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 8

ТНг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ьуз Уа1 СЬи Рхо Ьуз Зег Суз Азр Ьуз 1 5 ' 10 <210> 9 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 9

Ьуз Уа1 Азр Ьуз Ьуз УаЬ СЬи Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТНг 1 5 10

<210>	10
<211>	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Ноте» :
<400>	10
Азр Ьуз	ί ТНг ]

<210>	11
<211 >	14
<212>	БЕЛОК
<213>	Ното	зарЬегз
< 4 С 0>	11
УаЬ Аэр	» Ьуз	Ьуз Уа1 СЬи Рго Ьуз	Зег Суз Азр Ьуз ТЬг НЬз
1		5	10

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Реагент для детекции патологического процесса, ассоциированного с выработкой протеаз, где указанный реагент содержит эффективное количество по меньшей мере одного антитела, специфически связывающего продукт одиночного расщепления 1§О протеазой, отличающийся тем, что:

   a) имеет молекулярный вес 135 кД и

   b) представляет собой результат одиночного протеолитического расщепления одной из тяжелых цепей в нижней части шарнирного домена молекулы 1§О, где антитело не вступает в реакцию с интактным 1дО и где такое антитело получают иммунизацией животного или скринингом библиотеки антител с использованием полипептида, включающего пептидный аналог продукта расщепления, полученный:

   ί) идентификацией Ν-концевого остатка из пары остатков тяжелой цепи антитела, расщепленных протеазой;

   ίί) идентификацией пептидной последовательности, содержащей по меньшей мере пять последовательных аминокислотных остатков, расположенных выше сайта расщепления протеазой, где Ν-концевой остаток сайта расщепления протеазой станет С-концом данной последовательности; и ίίί) получением раствора пептида в количестве, достаточном для иммунизации или скрининга.
2. 2. Реагент по п.1, который содержит поликлональное антитело.
3. 3. Реагент по п.1, который содержит моноклональное антитело.
4. 4. Реагент по п.1, который специфически связывает сайт специфического расщепления протеазы в 1дО1 человека, продуцируемый протеазой, выбранной из группы, состоящей из ММР-3, ММР-7, ММР12, ΗΝΕ, плазмина, катепсина О, пепсина, 1йе8 или глутамилэндопептидазы I из 81арй. аигеик.
5. 5. Реагент по п.1, который содержит по меньшей мере одно антитело, специфически связывающее полипептид, включающий в себя по меньшей мере 5 последовательных аминокислот, выбранных из последовательностей шарнирного домена 1дО человека §ЕЦ ГО N0: 1, 2, 3 или 4, которые расположены выше аминоконцевой стороны сайта расщепления протеазы.
6. 6. Реагент по п.5, в котором полипептид содержит, по меньшей мере, центр шарнирного домена 1дО1, определенный как остатки -Т-С-Р-Р-С- (остатки 7-11 в §ЕЦ ГО N0: 1).
7. 7. Реагент по п.5, в котором пептид представляет собой 12-членный пептидный аналог нижней части шарнирного домена 1дО1 человека и прилегающий СН2-домен, имеющий последовательность ТСРРСРАРЕЬЬО (остатки 7-18 в 8ЕЦ ГО N0: 1).
8. 8. Реагент по п.1, который специфически связывает пептидный аналог продукта расщепления, включающий в себя пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 5-11 и ее укороченных с Оконца вариантов, содержащий по меньшей мере 5 аминокислот и содержащий аминокислотные последовательности, расположенные выше ^концевой стороны сайта протеолитического расщепления 1§О.
9. 9. Реагент по п.1, который специфически связывает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 5-11.
10. 10. Реагент по п.1, который специфически связывает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из (а) пептида, содержащего последовательность аминокислот на аминоконцевой стороне сайта расщепления 1дО1 протеазой ММР-3 (ТСРРСРАР, остатки 7-14 в 8ЕЦ ГО N0: 1), (Ь) или пептида, содержащего сайт расщепления 1дО1 глутамилэндопептидазой (ТСРРСРАРЕ, остатки 715 в 8ЕЦ ГО N0: 1); или (с) пептида, содержащего сайт расщепления 1дО1 протеазой 1йе8 (ТСРРСРАРЕЬЬО, остатки 7-18 в 8ЕЦ ГО N0: 1).
11. 11. Применение реагента по п.1 для лечения субъекта, имеющего патологическое состояние, отличающееся высвобождением протеаз, способных расщеплять 1§О.
12. 12. Применение по п.11, где антитело узнает специфический сайт расщепления протеазы 1дО1 человека, продуцируемый протеазой, выбранной из группы, состоящей из ММР-3, ММР-7, ММР-12, Н№/ плазмина, катепсина О, пепсина, 1йе8 или глутамилэндопептидазы I из 81арй. аигеик.
13. 13. Применение реагента по п.1 для восстановления эффекторной функции антитела, используемого для лечения патологического состояния, в котором антитело, используемое для лечения патологического состояния, подвергается расщеплению одной или более протеазами.