TW201402605A - 經蛋白酶調控之抗體 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提供特異結合至組織因子路徑抑制因子(TFPI)的經蛋白酶調控之抗體。該等抗體可用於治療出血性病症，諸如血友病。

Description

經蛋白酶調控之抗體
本申請案主張在2012年3月30日提出申請之編號第61/617,837號的權益，其以其整體併入本文作為參考資料。
本揭示內容中引用的全部文件以其整體併入本文作為參考資料。
本申請案以參考的方式併入在2012年3月26日做成並命名為"029730127sequencelisting.txt"的64kb文字檔，其為本申請案的序列表。
本發明之技術領域為治療血友病以及其他凝血機能病變。
一些技術可用於製造抗體。舉例而言，噬菌體抗體技術可用來生成抗體(Knappik et al.,J.Mol.Biol.296：57-86,2000)。另一種獲得抗體的方法是如同WO 91/17271以及WO 92/01047中所述從B細胞篩選DAN圖書館。在這些方法中，製造其中成員在其外表面展示不同抗體之噬菌體圖書館。抗體通常表現為Fv或Fab片段。展示抗體的噬菌體是針對結合至選定蛋白質而藉由親和力增富來進行篩選。抗體也可以使用三源雜交瘤方法學來製造(例如Oestberg et al.,Hybridoma 2：361-367,1983；U.S.專利第4,634,664號；U.S.專利第4,634,666號)。
經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體可以使用化學方法合成其胺基酸序列來製造，諸如使用固相技術藉由直接肽合成(例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154,1963；Roberge et al.,Science 269：202-204,1995)。蛋白質合成可以使用手動操作技術或藉由自動化來執行。抗體片 段可視情況使用化學方法來分開合成且合併以製造全長分子。
編碼抗體的cDNA分子可利用標準分子生物學技術，使用mRNA作為模版做出。之後，cDNA分子可以使用技藝中所熟知且揭露於諸如Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)之手冊中的分子生物學技術來進行複製。諸如PCR的擴增技術可用於獲得多核苷酸的額外複本。或者，可使用合成化學技術來合成編碼經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體的多核苷酸。說明其他可用分子生物學技術(包括製備抗體)的一般性文本為Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,Inc.)；Sambrook,et al.,(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabel et al.[Eds.],Current Protocols,a joint venture between Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(supplemented through 2000))；Harlow et al.,(Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988),Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins(1998))；以及Harlow,et al.(Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
本揭示內容提供經蛋白酶調控的抗體，其特異結合至組織因子路徑抑制因子(TFPI)。該等抗體可用於治療出血性病症，諸如血友病。在一些具體例中，經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體可以被凝血酶及/或胞漿素所切割。藉由在一開始抑制TFPI，此等經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體促進凝血酶及/或胞漿素生成，其等依次切割抗體並移除或顯著降低該等抗體對TFPI的結合活性。這個負向回饋容許抗體在安全的治療窗內促進凝血。
1.經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體
本文揭示之經蛋白酶調控的抗體特異結合至TFPI；亦即，它們以比其對不相干抗原(例如BSA、酪蛋白)的結合親和力還高的親和力(例如高出至少兩倍)結合至TFPI。術語「組織因子路徑抑制因子」或「TFPI」如本文所用意指細胞天然表現之人類TFPI的任何變體、同型體或物種同系物。
在一些具體例中，經蛋白酶調控的抗體以至少約105M-1至約1012M-1(例如，105M-1、105.5M-1、106M-1、106.5M-1、107M-1、107.5M-1、108M-1、108.5M-1、109M-1、109.5M-1、1010M-1、1010.5M-1、1011M-1、1011.5M-1、1012M-1)的親和力結合至TFPI。抗體結合至抗原的親和力(Kd)可以使用技藝中熟知的任何方法來分析，包括(例如)用於定量結合至表現某種抗原之細胞的抗體的免疫分析(諸如酵素連結免疫分析(ELISA))、生物分子交互作用分析(BIA)(例如Sjolander & Urbaniczky；Anal.Chem.63：2338-2345,1991；Szabo,et al.,Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705,1995)，以及螢光活化細胞分選(FACS)。BIA是一種用於即時分析生物特異性交互作用而不需標記任何交互反應物的技術(例如BIACORETM)。光學現象表面電漿共振(SPR)的變化可用作為生物分子即時交互作用的指標。
經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體可使用實質上全長免疫球蛋白分子(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE、IgA)、其抗原結合片段(諸如Fab或F(ab’)2)或含有抗原結合位點的建構物(諸如scFv、Fv或雙抗體)來建構，其能夠特異結合至TFPI。術語「抗體」也包括能夠指向抗體互補決定區(CDR)插入與天然抗體中發現者相同活性結合構型的其他蛋白質摺疊體，以使得使用這些嵌合蛋白質所觀察到之對TFPI的結合維持在相對於CDR衍生而來之天然抗體的TFPI結合活性。
「單離抗體」如本文所用係實質上不含其他具有不同抗原特異性的抗體之抗體(例如，結合至TFPI的單離抗體係實質上不含結合至 TFPI以外之抗原的抗體)。但是，結合至人類TFPI之抗原決定位、同型體或變體的單離抗體可對其他相關抗原(例如來自其他物種，例如TFPI物種同系物)具有交叉反應性。單離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學品。
本文揭示之經蛋白酶調控的抗體經工程化而包含被一或多個蛋白酶所辨識的蛋白酶切割位點。如本文所用，「蛋白酶切割位點」意指一個被某個蛋白酶所辨識並切割的胺基酸序列。在一些具體例中，蛋白酶切割位點位於其可變區與恆定區之間。在一些具體例中，經蛋白酶調控抗-TFPI抗體包括一或多個可被凝血酶、胞漿素及/或因子Xa切割的蛋白酶切割位點。在一些具體例中，除了蛋白酶切割位點以外，經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體之可變區與恆定區間的胺基酸序列包含多肽連接子(例如在第1圖中所示)。連接子可以是單獨一個胺基酸或多肽序列(例如至多100個胺基酸)。舉例而言，連接子可以是GGGGS(SEQ ID NO：149)。其他可供使用的連接子包括彼等顯示於SEQ ID NO：151-176中者。在其他具體例中，不存在連接子，且切割位點本身被插入可變區與恆定區之間。
就凝血酶而言，已確定至少兩個最佳切割位點：(1)X1-X2-P-R-X3-X4(SEQ ID NO：147)，其中X1與X2為疏水性胺基酸，而X3與X4為非酸性胺基酸；以及(2)GRG。凝血酶在精胺酸殘基之後特異地切割。胞漿素也切割兩個前述切割位點，但是特異性較於凝血酶為低。其他可供使用的凝血酶切割位點如SEQ ID NO：1-60所提供。其他可供使用的胞漿素切割位點如SEQ ID NO：12、47、48、53，以及61-130所提供。在一些具體例中，切割位點為LVPRGS(SEQ ID NO：137)。
在一些具體例中，使用因子Xa切割位點，諸如I-(E或D)-G-R(SEQ ID NO：148)。其他可供使用的因子Xa切割位點提供於SEQ ID NO：29、59以及61-69中。其他凝血酶與FXa切割位點或序列可以在由Bianchini所編寫的先前公開文件[Bianchini EP et al 2002 JBC]找到。一種經蛋白酶調控的抗體可包含超過一個蛋白酶切割位點。
除了切割位點以外，蛋白酶的第二結合位點(所謂外結合位 點(exosite))可被引入經蛋白酶調控的TFPI抗體中，以使得切割更有效率。凝血酶的外結合位點可以來自於蛋白酶受質或抑制因子(諸如PAR1、纖維蛋白原以及水蛭素)的原有外結合位點。外結合位點也可以是原有外結合位點的衍生物。
經蛋白酶調控的TFPI抗體可以合成或重組的方式製造。一些技術可用於製造抗體。舉例而言，噬菌體抗體技術可用來生成抗體(Knappik et al.,J.Mol.Biol.296：57-86,2000)。另一種獲得抗體的方法是如同WO 91/17271以及WO 92/01047中所述從B細胞篩選DAN圖書館。在這些方法中，製造其中成員在其外表面展示不同抗體之噬菌體圖書館。抗體通常表現為Fv或Fab片段。展示抗體的噬菌體是針對結合至選定蛋白質而藉由親和力增富來進行篩選。抗體也可以使用三源雜交瘤方法學來製造(例如Oestberg et al.,Hybridoma 2：361-367,1983；U.S.專利第4,634,664號；U.S.專利第4,634,666號)。
抗體也可以純化自任何表現抗體的細胞，包括已經編碼抗體之表現建構物所轉染的宿主細胞。宿主細胞可以培養在表現抗體的條件下。經純化抗體可使用技藝中已知方法，而與其他可能與細胞中的抗體締合之細胞組分(諸如某些蛋白質、醣或脂質)分離。此等方法包括，但不限於尺寸排除層析、硫酸銨分離、離子交換層析、親合力層析以及製備型凝膠電泳。製備物的純度可以藉由技藝中已知的任何方法來評估，諸如SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。經純化抗體的製備物可含有超過一種抗體。
或者，經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體可以使用化學方法合成其胺基酸序列來製造，諸如使用固相技術藉由直接肽合成(例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154,1963；Roberge et al.,Science 269：202-204,1995)。蛋白質合成可以使用手動操作技術或藉由自動化來執行。抗體片段可視情況使用化學方法來分開合成且合併以製造全長分子。
經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體也可以建構成「單鏈Fv(scFv)形式」，其中蛋白酶切割位點被插入scFv之輕鏈可變區與重鏈可變區間的肽連接子或在肽連接子附近。就抗原結合而言，由於肽連接子對於將scFv 的兩個可變區約束在一起為必需的，肽連接子或側邊區的切割容許所欲的蛋白酶失活或向下調節scFv結合至其抗原。SEQ ID NO：179的胺基酸序列(其可由SEQ ID NO：180所編碼)是呈scFv形式之經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體的一個實例。
在一些具體例中，經蛋白酶調控之TFPI抗體可以「IgG形式」來建構，其具有兩個結合位點，且可在重鏈、輕鏈或兩者上包含一、二、三或四個蛋白酶切割位點。在各個情況下，蛋白質切割位點的一側或兩側可以是連接子。另外，在各個情況下，切割位點可以是相同或不同的。「IgG-連接子1」(實施例5)以及「IgG-連接子2」為呈IgG形式之經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體：
2.負向回饋
經蛋白酶調控的抗體可包括因為抗體功能而被向上調節或生成之蛋白酶的蛋白酶切割位點。此等蛋白酶接而可以切割經蛋白酶調控的抗體，從而提供負向回饋環，該負向回饋環可用以預防經蛋白酶調控之抗體的過度活性。
舉例而言，可被凝血酶及/或胞漿素切割的經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體能夠表現出這樣的一種負向回饋效應。此等經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體促使凝血酶及/或胞漿素生成。凝血酶及胞漿素復而切割經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體並移除或顯著降低其對TFPI的結合活性。這個負向回饋容許抗體在安全治療窗內促進凝血。
3.多核苷酸
本揭示內容亦提供編碼經蛋白酶調控之抗體的多核苷酸。此等多核苷酸可用於例如製造大量抗體供治療使用。
編碼抗體的cDNA分子可利用標準分子生物學技術，使用mRNA作為模版做出。之後，cDNA分子可以使用技藝中所熟知且揭露於諸如Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)之手冊中的分子生物學技術來進行複製。諸如PCR的擴增技術可用於獲得多核苷酸的額外複本。或者，可使用合成化學技術來合成編碼經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體的多核苷酸。
為表現編碼抗體的多核苷酸，該多核苷酸可插入至表現載體中，該表現載體含有插入編碼序列轉錄及轉譯的必須要素。可使用習於技藝者所熟知的方法來建構含有編碼抗體及適當轉錄與轉譯控制要素的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術，以及活體內基因重組。此等技術描述於例如Sambrook,et al.(1989)及in Ausubel,et al.,(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,1995)中。
不同表現載體/宿主系統可用於容納與表現編碼抗體的序列。此等包括，但不限於微生物，諸如經重組噬菌體、質體或黏質體DNA表現載體轉形的細菌；經酵母菌表現載體轉形的酵母菌；經病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經病毒表現載體(例如花椰菜鑲嵌病毒、CaMV；菸草鑲嵌病毒，TMV)轉形的植物細胞系統；或細菌表現載體(例如Ti或pBR322質體)或動物細胞系統。
控制要素或調節序列係載體的彼等非轉譯區-增強子、啟動子、5’與3’非轉譯區-，它們與宿主細胞蛋白質交互作用而執行轉錄與轉譯。此等要素在強度及特異性上有所不同。視載體系統及宿主而定，可使用任一數目的適當轉錄及轉譯要素(包括構成性及誘導性啟動子)。舉例而言，當選殖至細菌系統中時，可使用誘導性啟動子。在昆蟲細胞中可使用桿狀病毒多角體蛋白啟動子。衍生自植物細胞基因體的啟動子或增強子(例如熱休克、RUBISCO及儲存蛋白基因)或衍生自植物病毒的啟動子或 增強子(例如病毒啟動子或前導序列)可選殖至載體中。在哺乳動物細胞系統中，可使用來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。若需要生成含有多個編碼抗體之核苷酸序列複本的細胞株，則可使用帶有適當可篩選標記之以SV40或EBV為主的載體。
說明其他可用分子生物學技術(包括製備抗體)的一般性文本為Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,Inc.)；Sambrook,etal.,(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)Vol.1-3)；Current Protocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabel et al.[Eds.],Current Protocols,a joint venture between Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.(supplemented through 2000))；Harlow et al.,(Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988),Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins(1998))；以及Harlow,et al.(Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。
4.醫藥組成物
經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體可以醫藥組成物的形式提供，該醫藥組成物包含醫藥上可接受的載體。該醫藥上可接受的載體較佳為非熱原性。含有經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體的醫藥組成物可單獨投與或與至少一種其他藥劑組合一起投與，該至少一種其他藥劑為穩定化合物，其可在任何無菌、生物可相容醫藥載體(包括，但不限於食鹽水、緩衝食鹽水、右旋糖與水)中被投與。可採用各種水性載體，例如0.4%食鹽水、0.3%甘油以及類似者。此等溶液為無菌且通常不含特定物質。此等溶液可以藉由傳統已知的滅菌技術(例如過濾)來進行消毒。若需要的話，該等組成物可包含醫藥上可接受的輔助物質(諸如pH調節劑及緩衝劑等)以接近生理條件。依據所選投與的特定模式，經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體在醫藥組成物中的濃度可廣泛地改變，亦即以重量計從少於約0.5%，通 常在或至少約1%到至多15或20%，且主要是基於流體體積、黏度等來選擇。參見美國專利第5,851,525號。若需要的話，超過一種的不同經蛋白酶調控的抗-TFPI抗體可包含於醫藥組成物中。
除了活性成分以外，醫藥組成物可包含適當的醫藥上可接受載體，其包含有助於將組成物加工成可在醫藥上使用之製備物的賦形劑與助劑。醫藥組成物可藉由任一數目的路徑投與，包括，但不限於口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、脊椎內、鞘內、腦室內、穿皮、皮下、腹膜內、鼻內、非經腸、局部、舌下或直腸方式。
在醫藥組成物已製備之後，它們可以被置放在適當容器中並標示供治療指定病況用。此等標記可包括投與的數量、頻率及方法。
5.方法
包含一或多種經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體的醫藥組成物可單獨投與給患者，或與其他藥劑、藥物或凝血因子組合一起投與給患者以治療血友病或其他凝血機能病變。「經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體的治療有效劑量」意指能促進凝血或減少出血時間之經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體數量。決定治療有效劑量充分在習於技藝者的能力之中。
治療有效劑量可以在最初於細胞培養物分析或在動物模型(通常為大鼠、小鼠、兔、狗或豬)中進行評估。動物模型也可以用來決定投與的適當濃度範圍以及途徑。此等資訊接而用來決定在人類體內的可用投與劑量以及路徑。
經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體之治療效力以及毒性(亦即ED50(在50%群體中有效治療的劑量)以及LD50(對50%群體致死的劑量))可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中進行測定。毒性對治療效用的劑量比為治療指標，且可表示為比率LD50/ED50。
表現高治療指標的醫藥組成物較佳。由細胞培養物分析與動物研究所得到的數據可用於調配某個供人類使用的劑量範圍。在此等組成物中所含有的劑量較佳落在循環濃度包括ED50微不足道或無毒性的範圍內。劑量可在這個範圍內變化，端視所用劑型、患者的敏感性以及投與 路徑而定。
確切劑量將由臨床醫師按照與需要治療的患者相關之因素來決定。調整劑量以及投藥以提供足夠程度的經蛋白酶調控之TFPI抗體或維持所要效用。可能納入考量的因素包括疾病狀態的嚴重性、個體的整體健康、個體的年齡、體重與性別、飲食、投藥時間及頻率、藥物組合、反應敏感性以及對治療的耐受性/反應。可每3至4天、每週或每兩週一次投與長效醫藥組成物，端視特定調配物的半衰期與廓清率而定。
在一些具體例中，經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體的治療有效活體內劑量在約5μg至約100mg/kg患者體重、約1mg至約50mg/kg患者體重、約10mg至約50mg/kg患者體重的範圍內。
包含經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體的醫藥組成物的投藥模式可以是任何將抗體遞送給主體的適當途徑(例如皮下、肌肉內、靜脈內或鼻內投藥)。
在一些具體例中，在沒有其他治療劑存在下投與經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體。在一些具體例中，與其他藥劑(諸如藥物或凝血因子)組合一起投與經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體以增強凝血酶的初始生產，同時確保凝血酶濃度維持在可能於某些帶有凝血機能病變的人中造成血栓的範圍以下。可在投與其他藥劑之前、之後或實質上同時間投與經蛋白酶調控之抗-TFPI抗體。
本說明書中並無應被視為限制本揭示內容的範疇。所有出現的實施例具有代表性且非限制性。上述具體例可修飾或變化，如習於技藝者依據上述教示所領會到。因此，應理解在申請專利範圍及其等效範圍內，本文揭示的具體例可以具體說明者以外的其他方式實施。
第1圖 經蛋白酶調控之抗體的一個具體例的圖式。VH，重鏈可變區；VL，輕鏈可變區；CH，重鏈恆定區；CL，輕鏈恆定區。
第2圖 在有或沒有凝血酶消化的情況下，兩種經蛋白酶 調控之抗-TFPI Fab片段(「Fab-1」及「Fab-2」)的西方墨點分析。
第3圖 在有或沒有凝血酶消化的情況下，顯示依據ELISA分析之Fab-1及Fab-2的組織因子路徑抑制因子(TFPI)結合的圖式。
第4圖 在有或沒有凝血酶消化的情況下，顯示Fab-1(Fab1)及Fab-2(Fab2)之TFPI結合的BIACORETM測量的圖式。
第5圖 在HEK293 6E細胞中表現之純化IgG抗體的SDS-PAGE。
第6圖 親代IgG(「親代IgG」；上)及IgG2-連接子1(下)的西方墨點分析。道1，以凝血酶(1單位)消化；道2，無蛋白酶(對照)；道3，以牛胞漿素消化；道4，以腸激酶(0.02μg)消化；道5，以牛因子Xa(1μg)消化；道6，以蛋白裂解酶(MTSP)(0.5μg)消化；道7，以尿激酶(uPA)(0.25μg)消化；道8，以人類鼻病毒3C蛋白酶(HRV 3C)(2單位)消化。
第7圖 在有或沒有凝血酶消化的情況下，顯示依據ELISA分析之IgG的TFPI結合的圖式。
第8圖 在有或沒有凝血酶消化的情況下，顯示親代IgG及IgG-連接子1之TFPI結合的BIACORETM測量的圖式。
第9圖 顯示在人類蛋白酶存在的情況下，IgG-連接子1及WT抗體的蛋白酶消化的西方墨點分析。
實施例1 建構經蛋白酶調控之抗-TFPI Fab片段
兩種經蛋白酶調控之抗-TFPI Fab(「Fab-1」與「Fab-2」)是以SEQ ID NO：177(重鏈)與SEQ ID NO：178(輕鏈)中所示的抗-TFPI抗體序列為基礎。兩種Fab均具有被插入至兩者可變域C端的凝血酶/胞漿素蛋白酶切割位點LVPRGS(SEQ ID NO：137)。Fab-1中的切割位點兩側為(Gly)4Ser連接子。Fab-2僅有六胺基酸切割位點，不存在連接子。凝血酶與胞漿素會切割LVPRGS(SEQ ID NO：137)之Arg(R)殘基的C端。 編碼Fab的DNA是藉由GenScript針對細菌表現使用最佳密碼子合成。於下表中確認Fab的胺基酸及DNA序列。
以限制酶BsaI及HindIII(New England Biolabs)消化Fab編碼區。使用瓊脂糖凝膠純化DNA片段並次選殖至pBADmycHisA(Invitrogen)中。使用標準技術接合所選殖的DNA並進行轉形。藉由DNA定序確認陽性選殖株並使用BL21大腸桿菌表現。
實施例2 經凝血酶切割的Fab的西方墨點分析
在37℃下以0、2或10單位的凝血酶(Novagen)消化約2.5μg的經粗略純化Fab-1與Fab-2歷時1小時。消化物在4-15%CRITEREONTM TGXTM凝膠(Bio-Rad)上運行。將蛋白質轉移至硝基纖維素膜並使用抗-人類Fab抗體(Southern Biotech)偵測。
Fab-1與Fab-2切割的西方墨點分析顯示於第2圖中。將所有樣品還原。就兩種Fab而言，當以凝血酶處理時均觀察到在約12kDA處的帶。在沒有凝血酶消化的情況下樣品中不存在此等帶，表示小尺寸的蛋白質為凝血酶切割的產物。
實施例3 經凝血酶切割的Fab-1與Fab-2的TFPI ELISA
在23℃下以2單位的經生物素化凝血酶(Novagen)消化約2.5μg的部分純化Fab-1與Fab-2隔夜。將卵白素瓊脂糖珠粒(100μL)加至 消化物中以耗盡凝血酶。經消化的Fab樣品被施加至捕獲瓊脂糖珠粒/凝血酶複合物的管柱。洗出液含有經消化的Fab。
在4℃下將MAXISORP® 96孔盤(Nunc)塗覆1μg/mL的於PBS中的TFPI隔夜。在室溫下於5%無脂乳粉PBS/0.5% TWEEN-20®(PBS-T)中阻斷該盤歷時1小時。將未經消化與經消化的Fab-1及Fab-2的連續兩倍稀釋物添加至井中(100μL/井)並在室溫下培育1小時。以PBS-T洗滌盤五次。添加二級HRP-接合抗-Fab抗體(100μL的1：10,000稀釋物)供使用AMPLEX® Red(Invitrogen)溶液偵測。如第3圖中所示，凝血酶切割顯著降低TFPI結合的訊號。
實施例4 經凝血酶消化的Fab-1與Fab-2的BIACORETM測量
在23℃下以2單位的經生物素化凝血酶(Novagen)消化約2.5μg的經粗略純化Fab-1與Fab-2隔夜。將卵白素瓊脂糖珠粒(100μL)加至消化物中以耗盡凝血酶。經消化的Fab樣品被施加至捕獲瓊脂糖珠粒/凝血酶複合物的管柱。洗出液含有經消化的Fab。
關於BIACORETM分析，使用胺偶合以100相對單位(RU)的目標濃度將人類TFPI(American Diagnostica)固定，且將抗體注射至移動相中。HBS-p用作為運作緩衝液。參考通道是使用空白固定來製備，其中表面經活化但接而在沒有任何固定蛋白質的情況下不活化。進行手動操作以測量Fab的升高RU以及緩衝液對照。
如第4圖中所示，不具有可切割連接子的親代Fab生成24.6RU，與未經消化的Fab-1(25.6RU)以及Fab2(27.9RU)相當。在凝血酶切割後，Fab-1與Fab-2的結合訊號降低達超過50%，表示經切割的Fab-1以及Fab-1不僅喪失恆定域，還喪失對TFPI的結合活性。
實施例5 IgG表現以及純化
依據SEQ ID NO：177(重鏈)以及SEQ ID NO：178(輕鏈)中所示的親代抗-TFPI抗體序列建構經蛋白酶調控的抗-TFPI免疫球蛋白分子「IgG-連接子1」。為促進分子選殖，在重鏈編碼序列中引入一個BlpI位點。相較於Fab-1中的蛋白酶可切割連接子的位置，BlpI位點的引入將IgG-連接子1的連接子位置向恆定區搬動了兩個胺基酸。
以建構的IgG表現載體轉染HEK293 6E細胞，並收取含有IgG抗體的培養物上清液。使用MABSELECT SURETM的親和力管柱接著SUPERDEXTM 200層析純化抗體。SDS-PAGE上的經純化IgG-連接子1顯示於第5圖中。
實施例6 親代IgG與IgG-連接子1的西方墨點分析
以凝血酶、牛胞漿素、牛因子Xa、蛋白裂解酶(MTSP)、尿激酶(uPA)或人類鼻病毒3C蛋白酶(HRV 3C)消化經純化的親代IgG與IgG-連接子1(0.5μg)。在37℃下將抗體與蛋白酶一起培育1小時。消化物在4-20% CRITEREONTM TGXTM凝膠(Bio-Rad)上運行。將蛋白質轉移至硝基纖維素膜上並使用抗-人類IgG重鏈與輕鏈抗體(Pierce)偵測。IgG2及IgG2-連接子1的西方墨點分析顯示於第6圖中。還原所有的樣品。
完整IgG在還原條件下產生兩條帶。兩條帶對應於重鏈(50kD)以及輕鏈(25kD)。經消化的抗體IgG-連接子1相對於未經消化的抗體顯示分子量變動。使用下列蛋白酶來消化抗體：凝血酶、胞漿素、牛因子Xa、MTSP以及uPA。經消化的IgG-連接子1抗體顯示重鏈的分子量從50kD變動至37kD。這個尺寸變動與重鏈喪失VH域相關。也有25kD輕鏈的分子量變動至約16kDa的微弱帶，其表示VL域從輕鏈切割下來。蛋白酶不切割親代IgG，表示分子量喪失是因為蛋白酶消化被工程化至抗體中的切割位點。
實施例7 經凝血酶消化之親代IgG及IgG-連接子1的TFPI-結合ELISA
在37℃下將某個微生物的全長抗體(親代IgG以及IgG-連接子1)以1單位生物素化凝血酶(Novagen)消化歷時1小時。接著將50μL的卵白素瓊脂糖珠粒添加至消化物中以耗盡凝血酶。經消化的IgG樣品被施加至捕獲瓊脂糖珠粒/凝血酶複合物的管柱。洗出液含有經消化的IgG。
在4℃下將MAXISORP® 96孔盤(Nunc)塗覆1μg/mL的於PBS中的TFPI隔夜。在室溫(RT)下於5%無脂乳粉PBS/0.5% TWEEN-20®(PBS-T)中阻斷該盤歷時1小時。將未經消化與經消化的親代IgG與IgG-連接子1的連續兩倍稀釋物添加至井中(100μL/井)並在室溫下培育1小時。以PBS-T洗滌盤五次。添加二級HRP-接合抗-Fab抗體(100μL的1：10,000稀釋物)供使用AMPLEX® RED(Invitrogen)溶液偵測。
TFPI結合ELISA的結果顯示於第7圖中。顯示因為凝血酶消化IgG-連接子1而喪失TFPI結合。未經消化的IgG-連接子1的TFPI結合類似於未經消化及經凝血酶消化之親代IgG的TFPI結合。
實施例8 親代IgG及IgG-連接子1的BIACORETM分析
使用胺偶合套組(GE HealthCare)將CM4感測晶片固定低密度的人類TFPI。使用不同濃度的抗體進行親代IgG及IgG-連接子1的動力學分析，接著以pH 1.5甘胺酸緩衝液再生。在37℃下以1單位的生物素化凝血酶(Novagen)消化呈濃度為1μg的親代IgG及IgG-連接子1抗體歷時1小時。在有消化或沒有消化的情況下將抗體注射至BIACORETM系統中供TFPI-結合分析之用。下圖顯示注射45μL的6.25μg/ml抗體或對照樣品所產生的訊號。
在動力學分析中，親代IgG及IgG2-連接子1分別具有1.536x106/Ms及1.902 x 106/Ms的締合速率(ka)。兩種抗體在30分鐘內不具有可測得的解離。這表示插入連接子1不會顯著改變抗體的結合活性。
凝血酶切割對抗體的影響顯示於第8圖中。凝血酶消化略微降低親代IgG對TFPI的結合，而凝血酶消化降低IgG2-連接子1對TFPI的結合從20RU至5RU，降低75%。
實施例9 經蛋白酶/凝血因子處理之IgG-連接子1及親代IgG的西方墨點分析
使用下列人類蛋白酶/凝血因子來消化80nM的IgG-連接子1及WT抗體：凝血酶(0.1μM)、胞漿素(0.1μM)、因子VIIa(0.01μM)、因子IXa(0.089μM)、因子Xa(13μM)、因子XIa(0.031μM)、因子XIIIa(0.03μM)。經處理的材料在4-15% CRITEREONTM TGX凝膠(Bio-Rad)上運行。將蛋白質轉移至硝基纖維素膜上並使用抗-人類IgG抗體(Pierce)偵測。
人類凝血酶、胞漿素及因子Xa消化IgG-連接子1，如出現37kDa帶所示凝血酶消化最為具有效率(第9圖)。蛋白酶未切割親代IgG，表示分子量喪失是因為蛋白酶消化被工程化至抗體中的切割位點。
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<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 68
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 69
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 70
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 71
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 72
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 73
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 74
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 75
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 76
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 77
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 78
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 79
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 80
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 81
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 82
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 83
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 84
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 85
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 86
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 87
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 88
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 89
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 90
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 91
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 92
<210> 93
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 93
<210> 94
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 94
<210> 95
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 95
<210> 96
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 96
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 97
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 98
<210> 99
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 99
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 100
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 101
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 102
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 103
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 104
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 105
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 106
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 107
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 108
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 109
<210> 110
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 110
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 111
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 112
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 113
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 114
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 115
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 116
<210> 117
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 117
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 118
<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 119
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 120
<210> 121
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 121
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 122
<210> 123
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 123
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 124
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 125
<210> 126
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 126
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 127
<210> 128
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 128
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 129
<210> 130
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 130
<210> 131
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-1輕鏈
<400> 131
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點以及連接子
<400> 132
<210> 133
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-1重鏈
<400> 133
<210> 134
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼Fab-1的序列
<400> 134
<210> 135
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2輕鏈
<400> 135
<210> 136
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2重鏈
<400> 136
<210> 137
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶切割位點
<400> 137
<210> 138
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab-2編碼序列
<400> 138
<210> 139
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-linker 1,Light chain amino acid sequence
<400> 139
<210> 140
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子1、重鏈胺基酸序列
<400> 140
<210> 141
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子1、輕鏈DNA序列
<400> 141
<210> 142
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子1、重鏈DNA序列
<400> 142
<210> 143
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2、輕鏈胺基酸序列
<400> 143
<210> 144
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2、重鏈胺基酸序列
<400> 144
<210> 145
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2、輕鏈DNA序列
<400> 145
<210> 146
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2-連接子2、重鏈DNA序列
<400> 146
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶切割位點
<221> 變體
<222> (1)...(2)
<223> Xaa=疏水性胺基酸
<221> 變體
<222> (5)...(6)
<223> Xaa=非酸性胺基酸
<400> 147
<210> 148
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子Xa切割位點
<221> 變體
<222> (2)...(2)
<223> Xaa=Glu或Asp
<400> 148
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 149
<210> 150
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：133的胺基酸95-152
<400> 150
<210> 151
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 151
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 152
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 153
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 154
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 155
<210> 156
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 156
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 157
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 158
<210> 159
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 159
<210> 160
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 160
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 161
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 162
<210> 163
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 163
<210> 164
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 164
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 165
<210> 166
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 166
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 167
<210> 168
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 168
<210> 169
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 169
<210> 170
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 170
<210> 171
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 171
<210> 172
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 172
<210> 173
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 173
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 174
<210> 175
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 175
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胺基酸連接子
<400> 176
<210> 177
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
<210> 178
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
<210> 179
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶可切割抗-TFPI scFv抗體
<400> 179
<210> 180
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白酶可切割抗-TFPI scFv抗體編碼序列
<400> 180

Claims (17)

  1. 一種特異結合至組織因子路徑抑制因子(TFPI)的經蛋白酶調控之抗體，其包含一可變域、一恆定域以及一將該可變域接合至該恆定域的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含一蛋白酶切割位點。
  2. 如申請專利範圍第1項之經蛋白酶調控之抗體，其中該蛋白酶切割位點為凝血酶切割位點。
  3. 如申請專利範圍第1項之經蛋白酶調控之抗體，其中該蛋白酶切割位點為胞漿素切割位點。
  4. 如申請專利範圍第1項之經蛋白酶調控之抗體，其中該蛋白酶切割位點為因子Xa切割位點。
  5. 如申請專利範圍第1項之經蛋白酶調控之抗體，其包含選自由下列所組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133的胺基酸1-239、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136的胺基酸1-229、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：143及SEQ ID NO：144。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之經蛋白酶調控之抗體，其中該胺基酸序列進一步包含一胺基酸連接子。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之經蛋白酶調控之抗體，其為全長抗體。
  8. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之經蛋白酶調控之抗體，其為抗體片段。
  9. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至8項中任一項之經蛋白酶調控之抗體，以及醫藥上可接受的載劑。
  10. 一種編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項之經蛋白酶調控之抗體的單離核酸分子。
  11. 一種治療凝血機能病變的方法，其包含對有需要的患者投與治療有效量之如申請專利範圍第1至8項中任一項之經蛋白酶調控之抗體。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中凝血機能病變為血友病。
  13. 一種調節抗-TFPI抗體之促凝血活性的方法，其包含將一蛋白酶切割位點加至該抗-TFPI抗體中。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該蛋白酶切割位點為凝血酶切割位點。
  15. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該蛋白酶切割位點為胞漿素切割位點。
  16. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該蛋白酶切割位點為因子Xa切割位點。
  17. 一種促進凝血酶或胞漿素生成的方法，其包含使TFPI與如申請專利範圍第1至8項中任一項之經蛋白酶調控之抗體接觸。
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