JP7223069B2 - プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1(pai-1)に対する抗体及びその使用 - Google Patents
プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1(pai-1)に対する抗体及びその使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、米国仮出願第61/865,451号(2013年8月13日出願)、及び欧州特許出願第14305757.8号(2014年5月22日出願)(これらはそれら全体として参照により本明細書に加入される)に対する優先権を主張する。
プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1型(PAI-1)は、プラスミン生成に関与する鍵とな
るセリンプロテアーゼである組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA)及びウロキナーゼ
型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)の主要阻害剤である。PAI-1は、血管コンパートメントにおけるプラスミノーゲン活性化を阻害することにより線維素溶解を調節する。線維素溶解は、凝固カスケードの活性化により形成されるフィブリン血栓を分解するための緊密に協調したプロセスである。凝固/線維素溶解バランスの調節不全は、出血又は血栓性疾
患のような異常な止血事象をもたらす。PAI-1はまた、受容体に結合したプラスミノーゲ
ンがウロキナーゼ受容体(uPAR)に結合したウロキナーゼにより主に活性化される細胞周囲コンパートメント(血管内及び組織の)におけるプラスミノーゲン活性化の鍵となる調節因子である。細胞周囲タンパク質分解を阻害することにより、PAI-1は、細胞外マトリッ
クス(ECM)分解、増殖因子活性化及びECMからの放出、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)活性化並びに細胞アポトーシスのような多数の細胞昨日を調節する。近年、PAI-1のプロテアーゼ非依存性効果が、(ビトロネクチン、ヘパリン、グリコサミノグリカンのよ
うな)補因子、uPAR-ウロキナーゼ複合体又は細胞受容体(LRP:低密度リポタンパク質受容
体関連タンパク質)又は接着/脱接着、遊走、増殖及び細胞内生物活性のような細胞機能に影響を及ぼすインテグリンとのその相互作用により同定された。これらの細胞機構及び抗線維素溶解効果により、PAI-1の病原性の役割が、腫瘍成長及び転移、線維症、急性心筋
梗塞並びにアテローム性動脈硬化症、肥満及び糖尿病のような代謝障害において確立されてきた。
エクソンからなり、そして12,169bのサイズを有する(非特許文献1)。PAI-1は、SERPIN(
セリンプロテアーゼ阻害剤)スーパーファミリーからの約50kDa(379アミノ酸)の単鎖糖タ
ンパク質であり、これは活性コンホメーションで合成されるがビトロネクチン(Vn)が存在しない場合は自発的に潜在性になる。PAI-1の主要補因子であるビトロネクチンは、表面
上に露出された約20個のアミノ酸である反応性中心ループ(RCL)を有する活性コンホメーションを安定化させる。PAI-1の2つの主要な標的(tPA及びuPA)の阻害の機構は自殺阻
害である。PAI-1のRCL領域は、ベイトペプチド結合(R346-M347、P1-P’1とも呼ばれる)を有し、これはこのセリンプロテアーゼについての切断部位を有する。tPA又はuPAとのミカエリス複合体を最初に形成し、次いで触媒三残基はベイトペプチド結合と反応してアシル-酵素複合体を形成し、これがP1-P’1ペプチド結合の切断後に強いコンホメーション変化を誘導する。コンホメーション変化は、プロテアーゼはアシル酵素としてPAI-1と共有結
合したまま、切断されたRCLのβ-ストランドへの挿入を生じる。非生理的環境下で、このアシル-酵素複合体の加水分解は、切断されたPAI-1及び遊離活性プロテアーゼの放出を誘導し得る(非特許文献2)。
出され得る:(1) 潜在(latent)コンホメーション、(2)活性コンホメーション、又は(3)基質コンホメーション(図1を参照のこと)。PAI-1は、潜在性移行(latency transition)を1.5~3倍減少させるビトロネクチンとの非共有結合複合体(Kd約1nM)として主に見出され
る。ビトロネクチンに対する潜在的か、切断されたか又は複合体化したPAI-1の親和性は
有意に減少される。マトリックス結合ビトロネクチンもまた、PAI-1とともに細胞周囲の
空間に局在化する。内皮細胞、単球、マクロファージ及び血管平滑筋細胞はこのPAI-1を
合成し、次いでこれが血小板(α顆粒で)により潜在形態で大量に貯蔵され得る。PAI-1は
、溶液中でtPA及びuPAの速く特異的な阻害剤(二次速度定数106~107M-1s-1を有する)で
あるが、フィブリン又はそれらの細胞受容体のいずれかに結合したプロテアーゼに対して不活性である。トロンビン、プラスミン、活性化プロテインCのような他のプロテアーゼ
もまたPAI-1により阻害されるが効率はより低い。
在コンホメーションのマウスPAI-1構造が、Dewildeら(非特許文献8)により解明され、そしてRCL位置におけるヒトPAI-1との差異、ゲート領域及びα-ヘリックスAの位置を明らかにした。PAI-1における構造/機能の関係は、この多機能セルピンの様々な活性に関与するドメインの位置を特定するために600より多い変異体タンパク質を使用することにより調べられた(非特許文献9による概説)。
皮細胞を含むほとんど全ての細胞型により合成され得るので、その発現は、生理的(例えば、血漿PAI-1レベルの概日変動)及び病理的条件(例えば、肥満、代謝症候群、インスリ
ン抵抗性、感染、炎症性疾患、癌)下で大いに変動する。PAI-1は急性期タンパク質と考えられている。PAI-1 mRNA発現の転写調節は、いくつかのサイトカイン及び成長因子(例え
ば、TGFβ、TNFα、EGF、FGF、インスリン、アンギオテンシンII及びIV)、ホルモン(例えば、アルドステロン、グルココルチコイド、PMA、高グルコース)並びにストレス因子(例
えば、低酸素、反応性酸素種、リポ多糖類)により誘導される。
5%の増加を誘導する。4G/4G多型は、心筋梗塞(非特許文献10)、特定の型の肺線維症(特発性間質性肺炎)(非特許文献11)に関連付けられており、そして4G/4G遺伝子型ドナー群は、間質性線維症及び尿細管萎縮に起因する移植腎喪失についての独立した危険因子である(非特許文献12)。
リン抵抗性症候群及び肥満のような代謝障害へのその関与はよく認識されている。PAI-1
はいくつかの器官の線維化促進(profibrotic)因子としても知られており、線維性組織
において過剰発現されることが示されている(すなわち、肝臓、肺、腎臓、心臓、腹部癒
着、皮膚:瘢痕又は強皮症)(非特許文献13により概説される)。PAI-1ノックアウト(KO)
マウスは、肝臓(胆管結紮又は生体異物)、腎臓(一側尿管閉塞モデル(UUO))、肺(ブレオマイシン吸入)のような様々なモデルにおいて線維症から保護されるが(非特許文献14;非
特許文献15;非特許文献16)、一方で心臓においてこの欠失は誘導された線維症から保護されるが(非特許文献17)、年齢依存性心選択的線維症になりやすい(非特許文献18)
。siRNAによるPAI-1発現の下方調節(非特許文献19)又は化学化合物による阻害(非特許
文献20;非特許文献21)は、肺線維症を減少させると報告されたが、一方で野生型のPAI-1過剰発現(非特許文献22)又はビトロネクチン結合のみを保持するがtPA阻害剤機能を保持しないPAI-1変異体は肺線維症を増悪させる(非特許文献23)。
、非特許文献32及び非特許文献33を参照のこと)腎線維症から保護される。対照的に
、PAI-1過剰発現マウスは、より重症の線維症及びUUO後の増加したマクロファージ動員を示す(非特許文献34;非特許文献35)。非阻害性(Non-inhibitory)PAI-1変異体(PAI-1
R)は、ラットにおける実験的糸球体腎炎(thy1)において、尿タンパク質発現及び糸球体
マトリックス蓄積を減少させることにより線維症の発生からマウスを保護することが示された(非特許文献36)。PAI-1をブロックするペプチドは、コラーゲン3、4及びフィブロ
ネクチン蓄積をUUOマウスにおいて阻害する(非特許文献37)。
発現を調節しようとする集中した研究の焦点であった。化学化合物(Suzuki et al., Expert Opin. Investig. Drugs 20:255, 2011)、モノクローナル抗体(Gils and Declerk, Thromb Haemost; 91:425, 2004)、ペプチド、変異体(Cale and Lawrence, Curr. Drug Targets 8:971, 2007)、siRNA又はアンチセンスRNAがその様々な機能を阻害するか又はその発
現を調節するために設計されてきた。しかし、集中した研究にもかかわらず、PAI-1の治
療的に有効なモジュレーターを開発する問題はなお解決されないままである。従って、PAI-1媒介ヒト病理の処置における使用のための、PAI-1活性を阻害する新規な薬剤の必要性が当該分野において存在する。
一局面において、ヒトプラスミノーゲン活性化因子1型(PAI-1)に特異的に結合する単
離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示され、ここで抗体は重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号6のCDR1(配列番号34)、CDR2(配列番号33)、及びCDR3(配列番号32)を含む]、並びに軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号7のCDR1(配列番
号37)、CDR2(配列番号36)、及びCDR3(配列番号35)を含む]を含む。さらなる局面におい
て、重鎖は、配列番号6を含む重鎖可変領域を含み、かつ軽鎖は、配列番号7を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号6と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号7と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。全ての同一性%近似
値は、最小同一性%を示し;記載される値よりも高い同一性%もまた本開示に包含される。
ームワーク領域、配列番号37を含む軽鎖CDR1領域、配列番号36を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号35を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロー
ナル抗体が本明細書で開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号6の重鎖
フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号7のフレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク
領域を含む。
列番号20)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号3のCDR1(配列番
号25)、CDR2(配列番号24)、及びCDR3(配列番号23)を含む]を含む。さらなる局面におい
て、重鎖は、配列番号2を含む重鎖可変領域を含み、かつ軽鎖は、配列番号3を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号2と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号3と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
ーナル抗体が本明細書で開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号26の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号3のフレームワーク領域
と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
する単離されたモノクローナル抗体が本明細書で開示され、ここで抗体は重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号4のCDR1(配列番号28)、CDR2(配列番号27)、及びCDR3(配列番号26)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号5のCDR1(配列番号31)、CDR2(配列番号30)、及びCDR3(配列番号29)を含む]を含む。さらなる局面において、重鎖は、配列番号4を含む重鎖可変領域を含み、かつ軽鎖は、配列番号5を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号4と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号5と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
フレームワーク領域、配列番号31を含む軽鎖CDR1領域、配列番号30を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号29を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノク
ローナル抗体が本明細書において開示される。特定の局面において、抗体重鎖は配列番号4の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%
同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号5のフレームワー
ク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
する単離されたモノクローナル抗体が本明細書で開示され、ここで該抗体は、重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号8のCDR1(配列番号40)、CDR2(配列番号39)、及びCDR3(配列番号38)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号9のCDR1(配列
番号43)、CDR2(配列番号42)、及びCDR3 (配列番号41)を含む]を含む。さらなる局面において、重鎖は、配列番号8を含む重鎖可変領域を含み、かつ軽鎖は、配列番号9を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号8と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号9と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
ームワーク領域、配列番号43を含む軽鎖CDR1領域、配列番号42を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号41を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロー
ナル抗体が本明細書で開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号8の重鎖
フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号9のフレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク
領域を含む。
する単離されたモノクローナル抗体が本明細書で開示され、ここで該抗体は、重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号10のCDR1(配列番号52)、CDR2(配列番号51)、及びCDR3(配列番号50)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号11のCDR1(配
列番号55)、CDR2(配列番号54)、及びCDR3(配列番号53)を含む]を含む。さらなる局面に
おいて、重鎖は、配列番号10を含む重鎖可変領域を含み、かつ軽鎖は、配列番号11を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号10と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は配列番号11と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
、配列番号51を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号50を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号55を含む軽鎖CDR1領域、配列番号54を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号53を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロ
ーナル抗体が本明細書で開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号10の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号11のフレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
する単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示され、ここで該抗体は、重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号12のCDR1(配列番号58)、CDR2(配列番号57)、及びCDR3(配列番号56)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号13のCDR1(配列番号61)、CDR2(配列番号60)、及びCDR3(配列番号59)を含む]を含む。さらなる局面において、重鎖は、配列番号12を含む重鎖可変領域を含み、かつ軽鎖は、配列番号13を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号12と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号13と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
列番号57を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号56を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号61を含む軽鎖CDR1領域、配列番号60を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号59を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナ
ル抗体が本明細書において開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号12の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号13のフレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
する単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示され、ここで該抗体は、重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号14のCDR1(配列番号64)、CDR2(配列番号63)、及びCDR3(配列番号62)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号15のCDR1(配列番号67)、CDR2(配列番号66)、及びCDR3(配列番号65)を含む]を含む。さらなる局面において、重鎖は、配列番号14を含む重鎖可変領域を含み、かつ軽鎖は、配列番号15を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号14と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号15と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
、配列番号63を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号62を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号67を含む軽鎖CDR1領域、配列番号66を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号65を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロ
ーナル抗体が本明細書において開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号14の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号15のフレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
する単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示され、ここで該抗体は、重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号16のCDR1(配列番号70)、CDR2(配列番号69)、及びCDR3(配列番号68)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号17のCDR1(配列番号73)、CDR2(配列番号72)、及びCDR3(配列番号71)を含む]を含む。
、配列番号69を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号68を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号73を含む軽鎖CDR1領域、配列番号72を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号71を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロ
ーナル抗体が本明細書において開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号16の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号17のフレームワーク領域99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
する単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示され、ここで該抗体は、重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号80のCDR1(配列番号46)、CDR2(配列番号45)、及びCDR3(配列番号44)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号81のCDR1(配列番号49)、CDR2(配列番号48)、及びCDR3(配列番号47)を含む]を含む。
配列番号81を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号80と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号81と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
番号45を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号44を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号49を含む軽鎖CDR1領域、配列番号48を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号47を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル
抗体が本明細書において開示される。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号80の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号81のフレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
る単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示され、ここで該抗体は、重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号18のCDR1(配列番号76)、CDR2(配列番号75)、及びCDR3(配列番号74)を含む]、及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号19のCDR1(配列番号79)、CDR2(配列番号78)、及びCDR3(配列番号77)を含む]を含む。さらなる局面において、重鎖は、重鎖配列番号18を含む可変領域を含み、軽鎖は、配列番号19を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる局面において、重鎖可変領域は、配列番号18と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつ軽鎖可変領域は、配列番号19と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
番号79を含む軽鎖CDR1領域、配列番号78を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号77を含む軽鎖CDR3領域を含む、単離されたモノクローナル抗体。特定の局面において、抗体重鎖は、配列番号18の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、
又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ抗体軽鎖は、配列番号19のフレ
ームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。
番号146を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号32を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレー
ムワーク領域、配列番号37を含む軽鎖CDR1領域、配列番号145を含む軽鎖CDR2領域、及び
配列番号35を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロー
ナル抗体が本明細書において開示される。
抗体が本明細書において開示される。
列番号35を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナ
ル抗体が本明細書において開示される。
列番号35を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナ
ル抗体が本明細書において開示される。
番号33を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号32を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号37を含む軽鎖CDR1領域、配列番号145を含む軽鎖CDR2領域、及び配
列番号35を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナ
ル抗体が本明細書において開示される。
ここで軽鎖可変領域は、配列番号7のCDR1(配列番号37)、CDR2(配列番号36)、及びCDR3(配列番号35)を含む]を含む単離されたモノクローナル抗体とPAI-1上の本質的に同じエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示される。
配列番号75を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号74を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号79を含む軽鎖CDR1領域、配列番号78を含む軽鎖CDR2領域、並びに配列番号77を含む軽鎖CDR3領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロ
ーナル抗体が本明細書において開示される。
において開示され、ここで該抗体は:(a)配列番号82を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号91を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(b)配列番号83を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号92を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(c)配列番号84を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント; (d)配列番号85を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しく
はその抗原結合フラグメント、及び配列番号91を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(e)配列番号85重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(f)配列番号86を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号94を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(g)配列番号87を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号95を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(h)配列番号88を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号96を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(i)配列番号89を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号97を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(j)配列番号90を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号98を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(k)配列番号86を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(l)配列番号86を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメ
ント、及び配列番号95を含む軽鎖可変領域有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;(m)配列番号89を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;又は(n)配列番号89を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメント、及び配列番号95を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメントを含む。さらなる局面において、ヒト化重鎖可変領域は、以前に開示されたヒト重鎖可変領域のいずれかと99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつヒト化軽鎖可変領域は、以前に開示されたヒト軽鎖可変領域のいずれかと99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示される。特定の局面において、単離されたモノクローナル重鎖は、配列番号86の重鎖フレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、かつ単離されたモノクローナル抗体軽鎖は、配列番号93のフレームワーク領域と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である軽鎖フレームワーク領域を含む。特定の他の局面において、単離されたモノクローナル抗体重鎖は、配列番号86の重鎖フレームワーク領域と95%同一である重鎖フレームワーク領域を含み、か
つ単離されたモノクローナル抗体軽鎖は、配列番号93のフレームワーク領域と95%同一で
ある軽鎖フレームワーク領域を含む。
書で開示され、ここで該抗体は、配列番号154を含む重鎖可変領域を有する重鎖、又はそ
の抗原結合フラグメント;及び配列番号153を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、又はその抗原結合フラグメントを含む。別の局面において、ヒトPAI-1に特異的に結合するヒト化モ
ノクローナル抗体が本明細書において開示され、ここで該抗体は、配列番号155を含む重
鎖可変領域を有する重鎖、又はその抗原結合フラグメント、及び配列番号153を含む軽鎖
可変領域を有する軽鎖、又はその抗原結合フラグメントを含む。さらなる局面において、ヒト化重鎖可変領域は、以前に開示されたヒト重鎖可変領域のいずれかと99%、98%、97%
、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一であり、かつヒト化軽鎖可変領域は、以
前に開示されたヒト軽鎖可変領域のいずれかと99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、又は90%同一である。
書において開示され、ここで該抗体は、配列番号158を含むポリペプチドに結合する。別
の実施態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号158を含むポリペプチ
ドのフラグメントに結合する。さらに別の実施態様において、PAI-1に特異的に結合する
単離されたモノクローナル抗体は、配列番号156及び/又は配列番号158を含むポリペプチドに結合する。別の実施態様において、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロー
ナル抗体は、配列番号156、配列番号158、及び/又は配列番号157を含むポリペプチドに
結合する。なお別の実施態様において、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクロー
ナル抗体は、配列番号1の残基160、262、296-297、300~307、及び/又は310~316に対する特異的結合親和性を含む。特定の実施態様において、本明細書に開示される単離されたモノクローナル抗体は、 配列番号1の少なくとも残基311、312、及び313(D-Q-E)と相互作用する。特定の実施態様において、抗体により結合されるPAI-1はヒトPAI-1である。他の実施態様において、抗体により結合されるPAI-1はヒトPAI-1の活性形態である。
ノクローナル抗体は、配列番号161を含むポリペプチドに結合する。なお他の実施態様に
おいて、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号159及び/又は配列番号161を含むポリペプチドに結合する。なお他の実施態様において、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号159、配列番号160、及び/又は配列番号161を含むポリペプチドに結合する。な
お別の実施態様において、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体は、
カニクイザル(cyno)-PAI-1(配列番号162)の残基44~64及び/又は残基307~321に対す
る特異的結合親和性を含む。特定の実施態様において、抗体により結合されるPAI-1はカ
ニクイザル-PAI-1である。他の実施態様において、抗体により結合されるPAI-1は、カニ
クイザル-PAI-1の潜在形態である。
る単離されたモノクローナル抗体が本明細書において開示される。一実施態様において、本明細書において開示される単離されたモノクローナル抗体のうちのいずれかと結合について競合するか、かつ/又は競合的に阻害する、単離されたモノクローナル抗体が本明細
書において開示される。特定の実施態様において、単離されたモノクローナル抗体は、競合するか又はヒトPAI-1への結合を競合的に阻害する。特定の実施態様において、単離さ
れたモノクローナル抗体は、競合するか又は配列番号156、配列番号157、及び/若しくは配列番号158を含むポリペプチドへの結合を競合的に阻害する。別の実施態様において、
単離されたモノクローナル抗体は、競合するか、又は配列番号159、配列番号160、及び/若しくは配列番号161を含むポリペプチドへの結合を競合的に阻害する。一実施態様にお
いて、単離された抗体は、配列番号156、157、及び/又は158を含むポリペプチドへの結
合について、(a)重鎖フレームワーク領域、配列番号34を含む重鎖CDR1領域、配列番号33
を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号32を含む重鎖CDR3領域;並びに(b)軽鎖フレームワーク領域、配列番号37を含む軽鎖CDR1領域、配列番号145を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号35を含む軽鎖CDR3領域を含む単離されたモノクローナル抗体と競合する。
投与することを含む。
を、経口的に、注射用液剤により非経口的に、吸入により、又は局所的に投与することを含む、プラスミン生成を回復する方法が本明細書において開示される。本明細書に開示される非経口投与としては、静脈内、点滴、動脈内、腹腔内、筋内、皮下、直腸又は膣、静脈内、動脈内、皮下、及び筋内の非経口投与形態が挙げられる。いくつかの実施態様において、患者又は他の被験体への投与は、複数回投与を含む。別の局面において、プラスミン生成を回復させる方法は、増加したレベルの線維化組織を含む状態の治療的処置を促進する。いくつかの局面において、この状態は線維症を特徴とする。いくつかの局面において、状態は、線維症、皮膚線維症、全身性硬化症、肺線維症、特発性肺線維症、間質性肺疾患、及び慢性肺疾患である。他の局面において、プラスミン生成は、肝線維症、慢性腎臓病を含む腎線維症、血栓症、静脈血栓症及び動脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢肢虚血、播種性血管内凝固血栓症、血栓溶解を伴うか若しくは伴わない急性虚血発作、又はステント再狭窄の治療的処置を促進する。
I-1抗体の使用が本明細書に開示される。
書において開示され、ここで抗体は肺線維症を阻害する。特定の実施態様において、抗体は、被験体の肺における線維症を阻害する。特定の実施態様において、抗体は、特発性肺線維症(IPF)を有する被験体の肺において線維症を阻害する。いくつかの実施態様におい
て、本明細書において開示される単離されたモノクローナル抗体は、被験体においてフィブリン分解の増加を誘導する。特定の実施態様において、抗体は、被験体の血漿中のフィブリン分解を増加させる。いくつかの他の実施態様において、本明細書において開示される単離されたモノクローナル抗体は、被験体の肺におけるコラーゲン蓄積を阻害する。いくつかの実施態様において、被験体はIPFを有する。いくつかの他の実施態様において、
本明細書において開示される単離されたモノクローナル抗体は、被験体の気管支肺胞洗浄液(BALF)中のD-ダイマーレベルを増加させる。いくつかの実施態様において、被験体はIPFを有する。いくつかの他の実施態様において、本明細書において開示される単離された
モノクローナル抗体は、PAI-1に特異的に結合し、ここで抗体は、被験体における線維症
に起因した肺質量増加を阻害する。一実施態様において、被験体はIPFを有する。
を処置するための医薬の製造のための、薬学的有効量のPAI-1抗体の使用が本明細書にお
いて開示され、ここで状態は特発性肺線維症である。
に、注射用液剤により非経口的に、吸入により、又は局所的に投与することを含む、プラスミン生成を回復する方法が本明細書において開示され、ここでプラスミン生成は、特発性肺線維症の治療的処置を促進する。
書において開示され、ここで抗体は、被験体において線維素溶解活性を回復する。特定の実施態様において、抗体は、急性虚血発作を有する被験体において線維素溶解活性を回復する。急性虚血発作は、血栓溶解を伴っていても伴っていなくてもよい。いくつかの実施態様において、単離されたモノクローナル抗体は血餅溶解を回復する。特定の実施態様において、抗体はインビトロで血餅溶解を回復する。なお他の実施態様において、抗体はインビトロで約2nMのIC50で血餅溶解を回復する。
書において開示され、ここで抗体は、被験体におけるフィブリン分解(fibrin breakdown)を回復する。いくつかの実施態様において、被験体は急性虚血発作を有する。
明細書において開示され、ここで状態は血栓溶解を伴うか又は伴わない急性虚血発作である。
体を、経口的に、注射溶液剤により非経口的に、吸入により、又は局所的に投与することを含む、プラスミン生成を回復する方法が本明細書において開示され、ここでプラスミン生成は、血栓溶解を伴うか又は伴わない急性虚血発作の治療的処置を促進する。
書において開示され、ここで抗体は、被験体において癒着(adhesions)の形成を阻害す
る。いくつかの実施態様において、癒着形成は手術又は外傷の後である。いくつかの実施態様において、被験体における癒着形成は腹部である。他の実施態様において、癒着形成は、被験体の肩部、骨盤、心臓、脊椎、手、及び他の身体領域において発生する。
用が本明細書に開示され、ここで状態は腹部癒着形成である。
体を、経口的に、注射溶液剤により非経口的に、吸入により、又は局所的に投与することを含む、プラスミン生成を回復する方法が本明細書において開示され、ここでプラスミン生成は、癒着形成の処置又は予防を促進する。いくつかの実施態様において、被験体における癒着形成は腹部である。
書において開示され、ここで抗体は結晶化された抗体である。一実施態様において、モノクローナル抗体A44のFab’フラグメントを含む単離された結晶が本明細書において開示され、ここでFab’フラグメントは、軽鎖配列 配列番号7及び重鎖配列 配列番号6からなる。別の実施態様において、軽鎖配列 配列番号93及び重鎖配列 配列番号86を含むFab’
フラグメントを含む単離された結晶が本明細書において開示される。一実施態様において、単離された結晶は、アシメトリックな単位セル寸法 a=105Å、b=152 Å及びc=298Åを含む。一実施態様において、単離された結晶はP212121空間群に属する。別の実施態様に
おいて、単離された結晶は、x線回折の3.3Å分解能を含む。一実施態様において、単離された結晶は、結晶化された抗体の生物学的活性を保持する。いくつかの実施態様において、単離された結晶は、結晶化された抗体の可溶性の対応するものよりもインビボでより大
きな半減期を有する。
又は封入する少なくとも1つの薬学的賦形剤を含む医薬組成物が本明細書において開示される。
複合体を用いて哺乳動物を免疫することを含む、PAI-1に対する抗体を生成する方法が本
明細書において開示される。
キュベートする工程; (c)ELISAプレートをtPAとともにインキュベートする工程;(d)標識
した抗tPA抗体とともにELISAプレートをインキュベートする工程;及び(e)標識された抗tPA抗体により発せられるOD405を測定する工程を含み;ここでポジティブな記録(reading)
は、PAI-1抗体がPAI-1に結合するがPAI-1とtPAとの間の共有結合の形成をブロックするということを示し、かつネガティブな記録は、PAI-1抗体がPAI-1とのtPAの相互作用をブロ
ックすることを示す。
体を使用する逆スクリーニング方法を含む。他の実施態様において、スクリーニング方法は、リガンドとして又は固定されたビトロネクチンに対して遊離PAI-1を使用する順方向
(forward)スクリーニングアッセイを含む、又は(comprises or)。特定の実施態様に
おいて、この方法は、PAI-1/ビトロネクチン複合体に対する抗体の親和性を決定するために適用される。いくつかの実施態様において、この方法は:ビトロネクチンを表面に固定
する工程;表面に固定されたビトロネクチンとPAI-1を接触させ、それにより複合体を形成する工程;複合体を含む表面を抗体と接触させる工程;複合体に結合した抗体を未結合の抗体と分離する工程;複合体に結合した抗体を検出し、そして複合体に結合した抗体のレベ
ルを分析して、複合体に対する抗体の親和性を決定する工程を含む。
本発明は、ヒトPAI-1に特異的に結合してPAI-1の生物学的機能を調節する抗体及びそのフラグメントを提供する。このような抗体は、PAI-1関連疾患又は障害(例えば、線維症)
を処置するために特に有用である。本発明はまた、医薬組成物、さらにはPAI-1抗体をコ
ードする核酸、組み換え発現ベクター及びこのような抗体、又はそのフラグメントを製造するための宿主細胞を提供する。インビトロ又はインビボのいずれかで、PAI-1を検出す
るため、又はPAI-1活性を調節するために本明細書に開示される抗体を使用する方法もま
た本発明に包含される。
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語が最初に定義される。
又はそれからなるペプチドを指す:
VHHPPSYVAHLASDFGVRVFQQVAQASKDRNVVFSPYGVASVLAMLQLTTGGETQQQIQAAMGFKIDDKGMAPALRHLYKELMGPWNKDEISTTDAIFVQRDLKLVQGFMPHFFRLFRSTVKQVDFSEVERARFIINDWVKTHTKGMISNLLGKGAVDQLTRLVLVNALYFNGQWKTPFPDSSTHRRLFHKSDGSTVSVPMMAQTNKFNYTEFTTPDGHYYDILELPYHGDTLSMFIAAPYEKEVPLSALTNILSAQLISHWKGNMTRLPRLLVLPKFSLETEVDLRKPLENLGMTDMFRQFQADFTSLSDQEPLHVAQALQKVKIEVNESGTVASSSTAVIVSARMAPEEIIMDRPFLFVVRHNPTGTVLFMGQVMEP (配列番号1)、又はそ
のフラグメント。
重鎖定常領域(CH又はCH)を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3を
含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL又はVLと省略される)及び軽鎖定常領域(CL又はCL)と省略される。軽鎖定常領域は1つのドメイン(CL1)を含む。VH及びVL領域は、より保存され
たフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域が組み入れられた、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分され得る。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキ
シ末端へと以下の順序で配置された3つのCDR及び4つのFRから構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
換え遺伝子操作技術を使用して誘導され得る。抗原結合部分の非限定的な例としては:(i)Fabフラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント;(iii)Fdフラグメント;(iv)Fvフラグメント;(v)単鎖Fv(scFv)分子;(vi)dAbフラグメント;及び(vii)抗体の超可変性領域(例えば、単離された相補性決定領域(CDR))を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。他の操作された分子、例えば二特異性抗体(diabodies)、三特異性抗体(triabodies
)、四特異性抗体(tetrabodies)及びミニボディ(minibodies)もまた表現「抗原結合
フラグメント」内に包含される。
ドの両方の可変領域内に見られる不連続な抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Kabat et al.、J. Biol. Chem. 252、6609-6616 (1977)及びKabat et al.、Sequences of protein of immunological interest. (1991)、及びChothia et al.、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及びMacCallum et al.、J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)により記載されており、 ここで定義は、互いに対して比較した場合のアミノ酸残基の重複又は
サブセットを含む。Kabat定義は配列変動性に基づく。全ての種の全てのIG及びTR V領域
についてのIMGT一意的番号付けは、可変領域の構造の高い保存に依存する(Lefranc、Mp et al.、Dev comp. Immunol. 27:55-77、2003)。5,000より多くの配列を整列した後に設定されるIMGT番号付けは、フレームワーク及びCDRの定義を考慮にいれ、かつ組み合わせる
。Clothia定義は、構造的ループ領域の位置に基づく。接触定義(MacCallum et al.)は、
複合体結晶構造及び抗体-抗原相互作用の分析に基づく。上記に引用された参考文献の各
々により定義されるとおりにCDRを包含するアミノ酸残基は、比較のために示される。本
明細書に開示される一実施態様において、用語「CDR」は、Kabat定義により定義されるCDRである。本明細書に開示される別の実施態様において、CDRはIMGTにより定義されるCDR
である。
基を含む(例えば、CDRの接触定義を使用して)。従って、可変領域フレームワークは、約100~120アミノ酸長であるが、CDRの外側のアミノ酸しか含まない。
アミノ酸置換」、すなわち、抗原、すなわちPAI-1への抗体の結合を無効にしないアミノ
酸改変を包含する。保存的置換は、その位置でのアミノ酸残基の極性又は電荷に対してほとんど影響がないか又は全く影響がないような、ネイテイブでない残基でのネイテイブアミノ酸残基の置換である。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基のいずれかの他の非極性残基での置き換えから生じる。さらに、ポリペプチド中のいずれかのネイテイブ残基はまた、以前に「アラニンスキャニング変異誘発」(Cunningham et al.、Science 244:1081-85 (1989))について記載されたように、アラニンで置換され得る。保存的
アミノ酸置換は、1つのクラスのアミノ酸の、同じクラスのアミノ酸による置換を含み、この場合、クラスは一般的な物理化学的アミノ酸側鎖特性、及び例えば標準的Dayhoff頻
度交換マトリックス(frequency exchange matrix)又はBLOSUMマトリックスにより決定
される、天然に見いだされる相同タンパク質中の高い置換頻度により定義される。アミノ酸側鎖の6つの一般的なクラスが分類されており、これには以下が含まれる:クラスI(Cys);クラスII(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly);クラスIII(Asn、Asp、Gln、Glu);クラスIV(His、Arg、Lys);クラスV(Ile、Leu、Val、Met);及びクラスVI(Phe、Tyr、Trp)。例えば、別の
クラスIIIの残基、例えばAsn、Gln、又はGluの代わりにAspを用いることは、保存的置換
である。従って、PAI-1抗体中の予測非必須アミノ酸残基は、同じクラスからの別のアミ
ノ酸残基で置き換えられる。抗原結合を除去しないアミノ酸保存的置換を同定する方法は当該分野で周知である(例えば、Brummell et al.、Biochem. 32:1180、1993; Kobayashi et al. Protein Eng. 12:879、1999;及びBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412、1997を参照のこと)。保存的アミノ酸置換についての一般的な規則を以下の表1に示す。
は、(a)例えば、シート若しくはらせんコンホメーションのような、置換の領域における
分子骨格の構造、(b)標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の体積を維持することに対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することにより達成され得る。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づくグループにわけられ得る:
1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;及び
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
る抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を指す。この用語はまた、非特異的抗原についてのその親和性よりも少なくとも2倍高い親和性で抗原に結合する抗体又はその抗原結
合フラグメントの能力を包含し指す。
合され得る。特定のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自己複製することができる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベク
ター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の
際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を方向づけることができる。このようなベクターは、本明細書で「組み換え発現ベクター」(又
は単純に、「発現ベクター」)と呼ばれる。一般に、組み換えDNA技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。用語「プラスミド」及び「ベクター」は、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、発現ベクターのこのような他の形態、例
えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随
伴ウイルス)を含むことを意図され、これらは等価な機能を果たす。
結合部位を有するポリシストロニック系の仕様を含む。さらに、それらの染色体にDNAを
組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする1つ又はそれ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主へ原栄養性、殺生物剤抵抗性(例えば、抗生物質)又は銅のような重金属に対する抵抗性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させようとするDNA配列に直接連結されても、
同時形質転換により同じ細胞中に導入されてもいずれでもよい。さらなるエレメントもまた、mRNAの最適な合成のために必要とされ得る。これらのエレメントとしては、シグナル配列、スプライスシグナル、さらには転写プロモーター、エンハンサー、及び終止シグナルが挙げられ得る。特定の実施態様において、クローンされた可変領域遺伝子は、上で考察されたように合成の、重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子(例えばヒト)と一緒に発現ベクター中に挿入される。
れると、発現ベクターは適切な宿主細胞中に導入され得る。すなわち、宿主細胞が形質転換され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の様々な技術により達成され得る。これらとしては、限定されないが、トランスフェクション(電気泳動及びエレク
トロポレーションを含む)、原形質融合、リン酸カルシウム沈降、細胞融合、エンベロー
プ(enveloped)DNAを用いた細胞融合、マイクロインジェクション、及びインタクトなウイルスでの感染が挙げられる。Ridgway、A. A. G.「Mammalian Expression Vectors」 Chapter 24.2、pp. 470-472 Vectors、Rodriguez and Denhardt、Eds. (Butterworths、Boston、Mass. 1988)を参照のこと。本明細書に開示される実施態様は、エレクトロポレーションによる宿主へのプラスミド導入である。形質転換された細胞を、軽鎖及び重鎖を産生するために適した条件下で増殖させ、そして重鎖又は軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例となるアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイム
ノアッセイ(RIA)、又は蛍光活性化セルソーター分析(FACS)、免疫組織化学などが挙げら
れる。
するために広い意味で使用されるものとする。
同遺伝子をコードするベクターを用いて形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からのポリペプチドの単離のための方法の記載において、用語「細胞」及び「細胞培養物」は、そうではないと明確に特定されていなければ、抗体の供給源を示すために交換可能に使用される。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、沈降した全細胞から、又は培地及び懸濁した細胞の両方を含有する細胞培養物からのいずれかを意味し得る。
、重症度を低減、もしくは寛解するため、又はこのような処置が存在しない場合に期待される生存を超える被験体の生存を延長させるために、被験体、例えばPAI-1関連疾患若し
くは障害(例えば、線維性疾患)を有するか又はこのような疾患若しくは障害にかかりや
すい被験体に、本明細書に開示される抗体又は抗原結合フラグメントを投与することを使用する。
、PAI-1に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの量を指す。治療有効量は、処置
される被験体及び疾患状態、被験体の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに依存して変化し、これらは当業者により容易に決定され得る。投与のための投薬量は、本明細書において開示される抗体又はその抗原結合フラグメント例えば、約1ng~約10,000mg、約1μg~約5,000mg、約1mg~約1,000mg、約10mg~約100mgの範囲に及び得る。投薬計
画は、最適な治療応答を生じるように調整され得る。有効量はまた、抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかの毒性又は有害な効果(すなわち、副作用)が最少にされるか有益な効果がそれを上回る量である。
「the」は、そうではないと明確に指示されていなければ、複数の言及を含むということ
をここで指摘する。
一局面において、本発明は、ヒトPAI-1に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラ
グメントを提供する。本明細書に開示される例となるVH、VL及びCDRアミノ酸配列及びヌ
クレオチド配列は表2に示される。表2に示されるCDR領域はIMGTにより定義される。
共鳴(SPR)ベースの競合アッセイを含む通例の競合結合アッセイを使用して同定され得る
。
特定の実施態様において、本明細書に開示される抗PAI-1抗体は、1つ又はそれ以上の
改変を含み得る。本明細書に開示される抗PAI-1抗体の改変された形態は、当該分野で公
知のいずれかの技術を使用して製造され得る。
特定の実施態様において、本明細書に開示される抗PAI-1抗体、又はその抗原結合フラ
グメントは、当該分野で認識された技術を使用して免疫原性を減少させるために改変される。例えば、抗体又はそのフラグメントは、キメラ化(chimerized)、ヒト化(humanized)、又は脱免疫化(deimmunized)され得る。
。例えば、Morrison、Science 229:1202、1985; Oi et al.、BioTechniques 4:214、1986; Gillies et al.、J. Immunol. Methods 125:191、1989;米国特許第5,807,715号;同第4,816,567号;及び同第4,816,397号(これらはそれらの全体として参照により本明細書に加
入される)を参照のこと。「キメラ抗体」の製造のために開発された技術(Morrison et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851、1984; Neuberger et al.、Nature 312:604、1984;
Takeda et al.、Nature 314:452、1985)は、上記分子の合成に使用され得る。例えば、
マウス抗PAI-1抗体分子の結合特異性をコードする遺伝子配列は、適切な生物学的活性の
ヒト抗体分子由来の配列と一緒に融合され得る。本明細書で使用されるキメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種由来である分子、例えばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体である。
、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変更するか又は改善するために、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換される。これらのフレームワー
ク置換は、当該分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDR及びフレームワーク残基の相互作用のモデリング並びに特定の位置
における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較により同定される。例えば、Queen et al.、U.S. Patent No. 5,585,089; Riechmann et al.、Nature 332:323、1988(これらはそれら全体として参照に本明細書に加入される)を参照のこと。抗体は、例
えば、CDR-グラフティング(EP 239,400;国際公開第WO 91/09967号;米国特許第5,225,539
号;同第5,530,101号;及び同第5,585,089号)、ベニアリング(veneering)又はリサーフェイシング(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596;Padlan、Molecular Immunology 28:489、1991; Studnicka et al.、Protein Engineering 7:805、1994; Roguska. et al.、PNAS 91:969、1994)、並びに鎖シャッフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332
号)を含む当該分野で公知の様々な技術を使用してヒト化することができる。
ションを実行することにより得ることができる。タンパク質のMDシミュレーションはコンピュータで行われ、そして原子の互いとの物理的相互作用を計算することにより、一定期間にわたる全てのタンパク質原子の動きを決定することが可能になる。MDシミュレーションの出力は、シミュレーションの期間にわたる調べられたタンパク質の軌跡である。軌跡は、タンパク質コンホメーションの集合であり、スナップショットとも呼ばれ、これはシミュレーションの期間にわたって周期的に、例えば1ピコ秒(ps)ごとにサンプリングされる。スナップショットの集合を分析することにより、タンパク質アミノ酸残基の可動性を定量することができる。従って、可動性残基は、その中にその残基が存在するポリペプチドの状況で異なるコンホメーションの集合に適合するものである。MD法は当該分野で公知であり、例えばBrooks et al. 「Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics、Structure and Thermodynamics」(Wiley、New York、1988)を参照のこと。Amber(Case
et al. J. Comp. Chem. 26:1668、2005; Brooks et al. J. Comp. Chem. 4:187、1983;
及びMacKerell et al.(1998) 「The Encyclopedia of Computational Chemistry」 vol. 1:271-177、Schleyer et al.、eds. Chichester: John Wiley & Sonsを参照のこと)又はI
mpact(Rizzo et al. J. Am. Chem. Soc.; 122:12898、2000を参照のこと)のようないくつかのソフトウェアは、MDシミュレーションを可能にする。
相互作用領域の集合を生じる様々なコンホメーションに適合し得る。従って、抗体は、改変された抗体により示されるコンホメーションの集合及び認識領域の集合がヒト抗体により適合されるものと可能な限り似るように、フレームワークからの多数の残基を改変することによりヒト化され得る。これは、限られた数の残基を:(1)親mAbの相同性モデルを構
築し、MDシミュレーションを実行すること;(2)可動性残基を分析すること、及び非ヒト抗体分子の最も可動性の残基の同定、さらには異質性又は分解反応のもとである可能性のある残基又はモチーフを同定すること;(3)親抗体と最も類似した認識領域の集合を示すヒト抗体を同定すること;(4)変異しようとする可動性残基、異質性及び分解の基でありかつ変異もされる可能性のある残基又はモチーフを決定すること;並びに(5)既知のT細胞又はB細胞エピトープの存在をチェックすることにより改変することにより達成され得る。可動性残基は、本明細書において教示されるように暗溶媒モデルを使用してMD計算を使用して見出され得、これはシミュレーションの期間にわたる水溶媒のタンパク質原子との相互作用を説明する。
行われ得る。また、親mAbの動力学を生殖系列標準構造のライブラリの動力学と比較する
ことによっても行われ得る。CDR残基及び隣接する残基は、抗原についての高親和性が保
存されることを確実にするために検索から排除される。次いで可動性残基は置き換えられる。
が酸素ラジカルから生じ得るので露出されたメチオニン、Asp-Proジペプチドの結合のよ
うな酸に不安定な結合のタンパク質分解切断(Drug Dev. Res. 61:137、2004)、露出した
アスパラギン残基とそれに続く小さいアミノ酸、例えばGly、Ser、Ala、H is、Asn又はCysとともに見られる脱アミド部位(J. Chromatog. 837:35、2006)及びN-グリコシル化部位
、例えばAsn-X-Ser/Thr部位を含む。典型的には、露出したメチオニンはLeuで置換され、露出したアスパラギンはグルタミン若しくはアスパラギン酸で置き換えられ、又はそれに続く残基が変更される。グリコシル化部位(Asn-X-Ser/Thr)については、Asn又はSer/Thr
残基が変更される。
ング法と異なり、B細胞媒介及びT細胞媒介の両方の免疫原性応答がこの方法により対処される。この方法はまた、CDRグラフティング(米国特許第5,530,101号)で観察されることがある活性喪失の問題を回避する。さらに、安定性及び溶解性の問題もまた、操作及び選択の過程で考慮され、低免疫原性、高抗原親和性及び改善された生物物理学的特性について最適化された抗体を生じる。
合フラグメントの免疫原性を減少させるために使用され得る。本明細書で使用される用語「脱免疫」は、T細胞エピトープを改変するための抗体、又はその抗原結合フラグメント
の変更を含む(例えば、国際公開第WO9852976A1号、同第WO0034317A2号)。例えば、出発抗体由来のVH及びVL配列が分析され得、そして相補性決定領域(CDR)及び配列内の他の鍵と
なる残基に関連してエピトープの位置を示すヒトT細胞エピトープ「マップ」が、各V領域から生成され得る。T細胞エピトープマップからの個々のT細胞エピトープは、最終抗体の活性を変更する危険性の低い代替のアミノ酸置換を同定するために分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む様々な代替のVH及びVL配列が設計され、そしてこれらの配列は、本明細書に開示される診断方法及び処置方法における使用のために様々なPAI-1特異的抗
体又はそのフラグメントにその後組み込まれ、次いで機能について試験される。典型的には、12と24との間の変異抗体が生成され、試験される。次いで、改変されたV領域及びヒ
トC領域を含む完全な重鎖及び軽鎖遺伝子が発現ベクター中にクローンされ、そしてそれ
に続くプラスミドが完全抗体の産生のために細胞株に導入される。次いで抗体を、適切な生化学的アッセイ及び生物学的アッセイにおいて比較し、そして最適な改変体を同定する。
本明細書に開示される抗PAI-1抗体は、1つ又はそれ以上のエゲクター機能を媒介する抗体定常領域(例えば、IgG定常領域、ヒトIgG定常領域、ヒトIgG1又はIgG4定常領域)を含み得る。例えば、抗体定常領域に対する補体のC1成分の結合が補体系を活性化し得る。補体の活性化は、オプソニン作用及び細胞病原体の溶解において重要である。補体の活性化はまた炎症応答を刺激し、そして自己免疫過敏性にも関与し得る。さらに、抗体は、抗体Fc領域上のFc受容体結合部位が細胞上のFc受容体(FcR)に結合して、Fc領域を介して様々な
細胞上の受容体に結合する。IgG(ガンマ受容体)、IgE(イプシロン受容体)、IgA(アルファ受容体)及びIgM(ミュー受容体)を含む様々なクラスの抗体に特異的な多数のFc受容体がある。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、貪食及び抗体被覆粒子の分解、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解(抗体依存性細胞介在性細胞
傷害、又はADCCと呼ばれる)、炎症性メディエータの放出、経胎盤伝達(placental transfer)及び免疫グロブリン産生の制御を含む多数の重要かつ多様な生物学的応答を誘発す
る。特定の実施態様において、本明細書に開示される抗体又はそのフラグメントは、Fc-
ガンマ受容体に結合する。代替の実施態様において、本明細書に開示される抗PAI-1抗体
は、1つ若しくはそれ以上のエフェクター機能(例えば、ADCC活性)を欠いているか又はFc
受容体に結合することができない定常領域を含み得る。
なくとも1つのアミノ酸が欠失されているか、そうでなければ、ほぼ同じ免疫原性の完全な未変更抗体と比較した場合に、減少若しくは増強されたエフェクター機能、非共有結合で二量体化する能力、身体中の特定の部位に(例えば、腫瘍の部位又は特定期間に)局在
化する増加した能力、減少した血漿半減期、又は増加した血清半減期のような望ましい生化学的特徴を生じるように変更された抗PAI-1抗体を含む。例えば、本明細書に記載され
る診断及び処置方法における使用のための、特定の抗体、又はそのフラグメントは、免疫グロブリン重鎖と類似するが、1つ又はそれ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠く
ポリペプチド鎖を含むドメイン欠失抗体である。例えば、特定の抗体において、改変された抗体の定常領域の1つのドメイン全体が欠失され、例えば、CH2ドメインの全て又は一
部が欠失される。
域(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の2つ又はそれ以上由来の定常領域)を含む。他の実施態様において、抗PAI-1抗体は、キメラヒンジ(すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメイン由来のヒンジ部分、例えば、IgG4分子由来の上部ヒンジドメイン及びIgG1中間ヒンジドメインを含むヒンジ)を含む。一実施態様において、抗PAI-1抗体は、ヒトIgG4分子由来のFc領域また他はその部分及びその分子のコアヒンジ領域におけるSer228Pro変異(Kabat番号付け)を含む。
ー機能を増加するか又は減少させるように変異され得る。例えば、定常領域ドメインの欠失又は不活化(点変異又は他の手段による)は、循環する改変された抗体のFc受容体結合を減少させ得、それにより腫瘍局在化を増加させる。他の場合、本発明と一致する定常領域の改変は、補体結合を緩和し、従って結合した細胞毒の血清半減期及び非特異的結合を減少させるかもしれない。定常領域のさらに他の改変は、ジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を改変するために使用され得、増加した抗原特異性又は可動性に起因して増強された局在化を可能にする。腫瘍局在化、体内分布及び血清半減期のような、改変の得られた生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティ及び他の生化学的効果は、過度の実験なしに、周知の免疫学的技術を使用して容易に測定及び定量され得る。
を指す。例えば、ここでFcドメインはヒトIgG1抗体由来であり、上記ヒトIgG1 Fcドメイ
ンのFc変異体は、上記Fcドメインと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。
の実施態様において、Fc変異体は、CH3ドメイン又はその一部に位置するアミノ酸位置に
置換を含む。別の実施態様において、Fc変異体は、CH4ドメイン又はその部分に位置する
アミノ酸位置に置換を含む。
減少又は増強)を付与することが公知であるいずれかの当該分野で認められたFc変異体を使用し得る。上記Fc変異体は、例えば、国際PCT公開WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、及びWO06/085967A2又は米国特許第5,648,260号;同第5,739,277号;同第5,834,250号;同第5,869,046号;同第6,096,871号;同第6,121,022号;同第6,194,551号;同第6,242
,195号;同第6,277,375号;同第6,528,624号;同第6,538,124号;同第6,737,056号;同第6,821,505号;同第6,998,253号;及び同第7,083,784号、(これらは各々、参照により本明細書に加入される)に開示されるアミノ酸置換のいずれか1つを含み得る。1つの例となる実施態様において、本明細書に開示される抗体は、EU位置268にアミノ酸置換(例えば、H268D
又はH268E)を含むFc変異体を含み得る。別の例となる実施態様において、本明細書に開示される抗体は、EU位置239におけるアミノ酸置換(例えば、S239D又はS239E)又はEU位置332におけるアミノ酸置換(例えば、I332D又はI332Q)を含み得る。
を示す。一実施態様において、変更されたFcRn結合を有する抗体は、Fcドメインの「FcRn結合ループ」内に1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有するFcドメインを含む。FcRn結合ループは、アミノ酸残基280~299(Kabat番号付けに従う)から構成される。FcRn結合活性
を変更した例となるアミノ酸置換は、国際PCT公開第WO05/047327号(参照により本明細書に加入される)に開示される。特定の例となる実施態様において、本明細書に開示される抗体、又はそのフラグメントは、以下の置換の1つ又はそれ以上を有するFcドメインを含む:V284E、H285E、N286D、K290E及びS304D(Kabat番号付け)。
カンの減少したグリコシル化を含む。別の実施態様において、抗体は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列NXT又はNXSを含有するN-連結グリコシル化モチーフの近傍又はそのグリコシル化モチーフ内にアミノ酸置換を有する。特定の実施態様において、抗体は、アミノ酸位置228又は299(EU番号付け)にアミノ酸置換を含むFc変異体を含む。より特定の実施態様において、抗体は、S228P及びT299A変異(EU番号付け)を含むIgG1又はIgG4定常領域を含む。
そのフラグメント(例えば、「アグリ」抗体)と呼ばれ得る。理論には拘束されないが、
「アグリ」抗体、又はそのフラグメントは、インビボで改善された安全性及び安定性プロフィールを有し得ると考えられている。例となるアグリ抗体、又はそのフラグメントは、IgG4抗体の脱グリコシル化(aglycosylated)Fc領域を含み、これはFc-エフェクター機能を欠いており、それによりPAI-1を発現する正常重要臓器に対するFc媒介毒性についての
可能性を除去する。さらに他の実施態様において、本明細書に開示される抗体又はそのフラグメントは、変更されたグリカンを含む。例えば、抗体は、Fc領域のAsn297におけるN-グリカン上のフコース残基の減少した数を有し得、すなわち、脱フコシル化(afucosylated)される。別の実施態様において、抗体は、Fc領域のAsn297におけるN-グリカン上に変更された数のシアル酸残基を有し得る。
本明細書に開示される抗PAI-1抗体は、共有結合がその同族エピトープへの抗体の特異
的結合を妨げないように、抗体への分子の共有結合により改変され得る。例えば、限定としてではなく、本明細書に開示される抗体又はそのフラグメントは、グリコシル化、アセチル化、ペグ化(pegylation)、リン酸化、アミド化、保護/ブロック基による誘導体化
、タンパク質分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などにより改変され得る。多数の化学修飾のいずれかが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化などを含むがこれらに限定されない公知の技術により行われ得る。さらに、誘導体は、1つ又はそ
れ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
するイムノアッセイにおける使用のために異種ポリペプチドに融合され得る。例えば、一実施態様において、PEGは本明細書に開示される抗PAI-1抗体に結合されてそれらのインビボでの半減期を増加させることがきる(Leong、S. R.、et al.、Cytokine 16:106、2001; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531、2002;又はWeir et al.、Biochem. Soc. Transactions 30:512、2002)。
めのペプチドのようなマーカー配列に融合され得る。特定の実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ-ヒスチジンペプチド、例えば、とりわけpQEベクター(QIAGEN、Inc.、9259 Eton Avenue、Chatsworth、Calif.、91311)で提供されるタグであり、これら
の多くは市販されている。例えば、Gentz et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824、1989に記載されるように、ヘキサ-ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「HA」タグ(Wilson et al.、Cell 37:767、1984)、及び「フラッグ」タグが挙げられる。
子の治療特性を改善するため、標的検出を容易にするため、又は患者の画像化又は治療のために、様々分子のうちの少なくとも1つに結合されてもよい。本明細書に開示される抗PAI-1抗体は、精製が行われる場合、精製の前又は後のいずれかに標識されても結合体化
されてもよい。特に、本明細書に開示される抗PAI-1抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペ
プチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物応答調節剤、医薬品、又はPEGに結合
され得る。
により容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、様々な陽電子放出断層撮影を使用する陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明に従う診断法としての使用のための抗体に結合され得る金属イオンについては米国特許第4,741,900号を
参照のこと。適切な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げ
られ;適切な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンが挙げられ;適切な蛍光物質の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが挙げられ;
発光物質の非限定的な例としては、ルミノールが挙げられ;生物発光物質の非限定的な例
としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ;そして適切な放
射性物質の非限定的な例としては、125I、131I、111In又は99Tcが挙げられる。
胞毒(例えば、放射性同位体、細胞傷害性薬物、又は毒素)治療剤、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答調節物質、医薬品、免疫学的活性リガンド(例えば、リンホカイン又は得られた分子が腫瘍細
胞及びT細胞のようなエフェクター細胞の両方に結合する他の抗体)、又はPEGに結合され
得る。
、開示された組成物は、薬物又はプロドラッグにカップリングされた、抗体又はそのフラグメントを含み得る。本明細書に開示されるなお他の実施態様は、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)又はジフテリア毒素のような特定の生体毒素又はそれらの細胞傷害性フラグメントに結合された抗体又はそのフラグメントの使用を含む。どの結合した抗体又は結合していない抗体を使用するかという選択は、癌の種類及び段階、補助処置の使用(例えば、化学療法又は外部放射)並びに患者の状態に依存する。当然のことながら、当業者は、本明細書中の教示を考慮してこのような選択を容易に行い得る。
上記のように単離した遺伝子材料を操作して本明細書に開示される抗PAI-1抗体を得た
後、特許請求される抗体、又はそのフラグメントの望ましい量を製造するために使用され得る宿主細胞中への導入のための発現ベクターに典型的には遺伝子を挿入する。
トは、ポリシストロニック構築物を使用して発現され得る。このような発現系において、抗体の重鎖及び軽鎖のような複数の目的の遺伝子産物が、単一のポリシストロニック構築物から産生され得る。これらの系は、内部リボソーム進入部位(IRES)を有利に使用して、真核生物宿主細胞において比較的高レベルの本明細書に開示されるポリペプチドを得る。適合IRES配列は、米国特許第6,193,980号(参照により本明細書に加入される)に開示さ
れる。当業者は、このような発現系が本出願において開示される全範囲のポリペプチドを効率的に産生するために使用され得るということを理解するだろう。
細胞株を決定することができる。例となる宿主細胞株としては、限定されないが、DG44及びDUXB11(チャイニーズハムスター卵巣系統、DHFRマイナス)、HELA(ヒト子宮頸癌)、CVI(サル腎臓系統)、COS(SV40 T抗原を含むCVIの誘導体)、R1610(チャイニーズハムスター線
維芽細胞) BALBC/3T3(マウス線維芽細胞)、HAK(ハムスター腎臓系統)、SP2/O(マウス骨髄腫)、BFA-1c1BPT(ウシ内皮細胞)、RAJI(ヒトリンパ球)、293(ヒト腎臓)が挙げられる。一実施態様において、細胞株は、それらから発現された抗体の変更されたグリコシル化、例えば脱フコシル化(afucosylation)を提供する(例えば、PER.C6.RTM.(Crucell)又はFUT8-ノックアウトCHO細胞株(Potelligent.RTM.細胞)(Biowa、Princeton、N.J.))。一実施態
様において、NS0細胞が使用され得る。CHO細胞は、特定の具体的な実施態様において使用され得る。宿主細胞株は、典型的には商業サービス、American Tissue Culture Collection又は公開された文献から入手可能である。
、細菌又は酵母又は植物細胞のような、発現された非哺乳動物細胞であり得る。この関連で、当然のことながら、様々な細菌のような単細胞非哺乳動物微生物もまた形質転換され得る;すなわち、培養又は発酵において増殖することができるもの。形質転換の影響を受
けやすい細菌としては、腸内細菌科(enterobacteriaceae)、例えば大腸菌(Escherichia coli)又はサルモネラ(Salmonella)の系統;バチルス科(Bacillaceae)、例えば枯草菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);連鎖球菌(Streptococcus)、及びインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のメンバーが挙げられる。さらに当然のことながら、細菌で発現された場合、ポリペプチドは封入体の一部になり得る。ポリペプチドは、単離され、精製され、次いで機能性分子へと組み立てられなければならない。
核生物微生物の中で最も一般的に使用される。酵母類における発現のために、例えば、プラスミドYRp7(Stinchcomb et al.、Nature、282:39 (1979); Kingsman et al.、Gene、7:141 (1979); Tschemper et al.、Gene、10:157 (1980))が一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファンにおいて成長する能力を欠く酵母の変異株についての選択マーカーを生じるTRP1遺伝子を既に含有している、例えばATCC番号44076又はPEP4-1(Jones、Genetics、85:12 (1977))。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrpl障害(lesion)の存在は、トリプトファンの存在しない場合の成長により形質転換を検出するために有効な環境を提供する。
別の局面において、本発明は、抗PAI-1抗体、またはそのフラグメントを含む医薬組成
物を提供する。
、リン酸又はクエン酸緩衝液)、界面活性剤(例えばポリソルベート)、場合により安定剤(例えばヒトアルブミン)などを含み得る。しかし、本明細書における教示と適合する他の
方法において、ポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達することができ、それにより患部組織の治療剤への曝露を増加させる。
液が挙げられる。本発明において、薬学的に許容しうる担体としては、限定されないが、0.01~0.1M(例えば0.05M)リン酸緩衝液又は0.8%食塩水が挙げられる。他の一般的な非経
口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補給剤、電解質補給剤、例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなどが挙げられる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどのような保存料及び他の添加剤も存在し得る。より詳細には、注射使用に適した医薬組成物としては、滅菌水性液剤(水
溶性の場合)又は注射用液剤若しくは分散の即時製剤のための分散及び滅菌粉末が挙げら
れる。このような場合、組成物は無菌でなくてはならず、そして容易な注射可能性(syringability)が存在する程度まで流動性であるべきである。これは製造及び貯蔵の条件下
で安定であるべきであり、そして一実施態様において、細菌及び真菌のような微生物の夾雑作用に対して守られる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリ
セロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、及びそれら
の適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。特定の実施態様において、等張剤、例えば糖類、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムが組成物中に含まれる。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウ
ム及びゼラチンを組成物中に含めることによって起こり得る。
組み合わせた抗体)を必要量で、必要に応じて、本明細書に列挙された成分のうちの1つ又は組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込み、続いて滅菌ろ過することにより製造され得る。一般的に、分散は、基本的な分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他成分を含有する滅菌ビヒクル中に、活性化合物を加えることにより製造される。滅菌注射用液剤の製造のための滅菌粉末の場合、製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり得、これにより、活性成分と、その前もって滅菌ろ過した溶液からのさらなる望ましい成分との粉末が得られる。注射用の製剤を処理し、アンプル、バッグ、瓶、シリンジ又はバイアルのような容器中に充填し、そして当該分野で公知の方法に従って無菌条件下で密封する。さらに、製剤は、同時係属の米国出願第09/259,337号及び米国出願第09/259,338号(これらはそれぞれ参照により本明細書に加入される)に記載されるようなキットの形態で包装され販売され得る。このような製造品は、一実施態様において、添付の組成物が自己免疫障害又は新生物障害に罹患しているか又はそれらの素因を有する被験体を処置するために有用であるということを示すラベル又は添付文書を有する。
、2週間ごとに1回又は1月に1回又は3~6ヶ月ごとに1回の投与を伴う。例となる投薬ス
ケジュールは、連続した日に1~10mg/kg若しくは15mg/kg、一日置きに30mg/kg、又は毎週60mg/kgを含む。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する2つ又はそれ以上
のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投薬量は示された範囲内であり得る。
態で複数回投与され得る。なお別の実施態様において、本明細書において開示される抗体又はそのフラグメントは、非結合体化形態で投与され、次いで結合体化形態で、又はその逆で投与され得る。
される。一部の患者は、彼らの寿命の残りの間処置を受け続ける。
が細胞毒-薬物結合分子に使用される)が、疾患の進行が減少されるか又は終結するまで、そして特定の実施態様では、患者が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで必要とされることがある。その後、患者は予防的養生法を施され得る。
イルス粒子で変化する。
デバイスとして投与される。
、約5と約75mCiとの間の範囲に及び、そして一実施態様では、約10と約40mCiの範囲に及
ぶ。131I標識抗体の有効単回処置非骨髄切除(non-marrow ablative)投薬量は、約5と約70mCiとの間の範囲に及び、そして一実施態様では、約5と約40mCiとの間の範囲に及ぶ。131I標識抗体の有効単回処置切除投薬量(Effective single treatment ablative dosages)(すなわち、自家骨髄移植を必要とし得る)は、約30と約600mCiとの間の範囲に及び、そして一実施態様では約50と約500mCi未満との間の範囲に及ぶ。キメラ改変抗体と併せて、マウス抗体と比べてより長い循環半減期のために、ヨウ素-131標識キメラ抗体の有効単回処置非骨髄切除投薬量は、約5と約40mCiとの間の範囲に及び、そして一実施態様では、約30mCi未満である。例えば、111In標識についての画像化基準は、典型的には約5mCi未満である。
そして類似した目的のために使用されてきた。なお他の放射性同位体が画像化のために使用される。例えば、本発明の範囲と適合するさらなる放射性同位体としては、限定されな
いが、123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd
、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211A 213Biが挙げられる。この点において、アルファ、ガンマ、及びベータ放射体は、全て本発明に適合性である。さらに、本開示を考慮して、当業者は、どの放射性核種が選択された処置経過に適合するかを過度の実験をすることなく容易に決定することができると考えられる。この目的のために、臨床診断において既に使用されたさらなる放射性核種としては、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、
の他に111Inが挙げられる。抗体はまた、標的化免疫療法における可能性のある使用のた
めの様々な放射性核種で標識されている(Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111、1987)。これらの放射性核種としては、188Re及び186Reの他により低い程度で199Au及び67Cuが挙げられる。米国特許第5,460,785号は、このような放射性同位体に関するさらな
るデータを提供し、そして本明細書に参照により加入される。
ポリペプチド種を含むカクテルが特に有効であるというこを証明し得るということをさらに理解するだろう。
本明細書に開示される抗PAI-1抗体又はそのフラグメントは、PAI-1活性を拮抗するために有用である。従って、別の局面において、本発明は、それを必要とする被験体に、本明細書に開示される1つ又はそれ以上の抗PAI-1抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を投与することにより、PAI-1関連疾患又は障害を処置するための方法を提供す
る。
肝臓若しくは肺線維症のような病態生理学的状態、又は腹部癒着形成が挙げられる。
膜症、化学性腹膜炎、放射線療法、異物反応、及び継続的な外来腹膜透析により引き起こされることも示された。腹膜損傷は、フィブリン沈着をもたらす局所炎症応答を引き起こす。組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)の減少並びにプラスミノーゲン活性化因子阻
害剤PAI-1及びPAI-2の増加により引き起こされる腹膜線維素溶解活性における外傷後の機能不全は、沈着されたフィブリンを可能にして永久癒着へと組織化されると考えられている。
術)においてのみ使用について制限を有し、開腹術で使用することができない。可能性の
ある処置の探索は継続している。
。例えば、ポリペプチドの治療活性量は、被験体の疾患状態(例えば、ステージI対ステージIV)、年齢、性別、医学的合併症(例えば、免疫抑制状態又は疾患)及び体重、並びに被
験体において所望の応答を誘発する抗体の能力のような因子によって変化し得る。投薬計画は、最適な治療応答を提供するために調整され得る。例えば、いくつかの分割用量が毎日投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急状態により示されるに従って比例的に減少されてもよい。しかし一般に、有効投薬量は、1日あたり体重1キログラムあたり約0.05~100ミリグラムの範囲、一実施態様では1日あたり体重1キログラムあたり約0.5~10ミリグラムの範囲であると期待される。
項目1. (a) 重鎖フレームワーク領域及び重鎖可変領域、[該重鎖可変領域は、配列番号34を含む重鎖CDR1領域、配列番号33を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号32を含む重鎖CDR3領域を含む];並びに
(b) 軽鎖フレームワーク領域及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号37を
含む軽鎖CDR1領域、配列番号145を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号35を含む軽鎖CDR3領
域を含む]
を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
(b) 軽鎖フレームワーク領域及び配列番号93を含む軽鎖可変領域
を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
(b) 項目2の抗体の軽鎖可変領域と少なくとも95%同一である軽鎖可変領域
を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
列番号34を含む重鎖CDR1領域、配列番号33を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号32を含む重鎖CDR3領域を含む];並びに
(b) 軽鎖フレームワーク領域及び軽鎖可変領域、[該軽鎖可変領域は、配列番号37を
含む軽鎖CDR1領域、配列番号36を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号35を含む軽鎖CDR3領域を含む]
を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
は:
(a) 配列番号82を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号91を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(b) 配列番号83を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号92を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(c) 配列番号84を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(d) 配列番号85を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号91を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(e) 配列番号85を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(f) 配列番号86を含む重鎖可変領域を有する、若しくはその抗原結合フラグメント、
及び配列番号94を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(g) 配列番号87を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号95を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(h) 配列番号88を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号96を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(i) 配列番号89を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号97を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(j) 配列番号90を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号98を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(l) 配列番号86を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号95を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;
(m) 配列番号89を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号93を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント;又は
(n) 配列番号89を含む重鎖可変領域を有する重鎖、若しくはその抗原結合フラグメン
ト、及び配列番号95を含む軽鎖可変領域を有する軽鎖、若しくはその抗原結合フラグメント
を含む。
可変領域、
(b) 配列番号28を含む重鎖CDR1領域、配列番号27を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号26を含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号31を含む軽鎖CDR1領域、配
列番号30を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号29を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域、
(c) 配列番号40を含む重鎖CDR1領域、配列番号39を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号38を含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号43を含む軽鎖CDR1領域、配
列番号42を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号41を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域、
(d) 配列番号46を含む重鎖CDR1領域、配列番号45を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号44を含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号49を含む軽鎖CDR1領域、配
列番号48を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号47を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域、
(e) 配列番号52を含む重鎖CDR1領域、配列番号51を含む重鎖CDR2領域、及びを配列番号50含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号55を含む軽鎖CDR1領域、配
列番号54を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号53を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域、
(f) 配列番号58を含む重鎖CDR1領域、配列番号57を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号56を含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号61を含む軽鎖CDR1領域、配
列番号60を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号59を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域、
(g) 配列番号64を含む重鎖CDR1領域、配列番号63を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号62を含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号67を含む軽鎖CDR1領域、配
列番号66を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号65を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域、
(h) 配列番号70を含む重鎖CDR1領域、配列番号69を含む重鎖CDR2領域、及び配列番号68を含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号73を含む軽鎖CDR1領域、配
列番号72を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号71を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域;
又は
(i) 配列番号76を含む重鎖CDR1領域、配列番号75を含む重鎖CDR2領域、並びに配列番号74を含む重鎖CDR3領域を含む重鎖可変領域;並びに配列番号79を含む軽鎖CDR1領域、
配列番号78を含む軽鎖CDR2領域、及び配列番号77を含む軽鎖CDR3領域を含む軽鎖可変領域を含む、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
ピトープに結合する、PAI-1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
分野の技術範囲内で使用され得る。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(本明細書では「Sambrookら、1989」); DNA Cloning:A Practical Approach、Volumes I及びII(D.N. Glover編1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編1984);Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J.Higgins編(1985)];Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins編(1984)];Animal Cell Culture [R.I. Freshney編(1986)]; Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press、(1986)];B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Inc. (1994)を参照のこと。
ヒト(h)及びカニクイザル(cyno)活性PAI-1(グリコシル化形態又は非グリコシル化形態)に対して交差反応性であり、かつPAI-1の阻害活性を中和してプラスミンの下流産生を回
復し、それにより腎臓、肝臓若しくは肺線維症の処置のための有効な治療(therapeutic
)又は腹部癒着形成及びケロイド瘢痕形成の予防となる抗体が開発された。モノクローナル抗体によるPAI-1阻害機能の中和は、3つの機構の分類に入ると記載されている:(1)立
体障害によりtPA若しくはuPAに対してPAI-1をブロックする、(2)PAI-1を潜在(latent)
コンホメーションへと変換する、又は(3)PAI-1を基質(substrate)コンホメーションへ
と変換する。
PAI-1は、ビトロネクチンに対するサブナノモル(subnanomolar)の親和性でのその結
合により安定化された活性コンホメーションで細胞から分泌される。PAI-1は、37℃で数
分以内、室温で数時間以内に活性コンホメーションから潜在コンホメーションへと自発的コンホメーション変化を受ける。ビトロネクチンに結合されると、PAI-1はコンホメーシ
ョン変化により抵抗性となり、これにより活性コンホメーションのPAI-1の半減期が数分
から数時間へと延長される。免疫された動物における活性コンホメーションPAI-1半減期
を延長させるために、そしてマウス免疫系が活性PAI-1コンホメーションを認識するのを
可能にするために、ビトロネクチン及びPAI-1の複合体を免疫化に使用した。
グ番号IGLYHPAI-A)から購入した。ビトロネクチン(カタログ番号IHVN)及びtPA(カタログ
番号HTPA-TC)もInnovative Researchから購入した。免疫原を製造するために、PAI-1をビトロネクチンと1:1モル比で1時間室温にて、又はtPAと1:1モル比で15分間37℃にてイ
ンキュベートした。全ての免疫原を、滅菌食塩水を希釈剤として使用して準備した。
当該分野で公知の標準的ハイブリドーマ製造プロトコルを実施して抗体を製造した。文献に以前に記載された標準的なアプローチは、PAI-1のみ又はPAI-1/tPA複合体を使用した。本発明者らは、代わりにPAI-1の活性コンホメーションに対する抗体を生成した。PAI-1/ビトロネクチン複合体をPAI-1に対する抗体の生成への新しいアプローチとして使用した。抗体を生成するために、以下に概要を説明した三本の柱からなる方策を取った:
(1) 融合パートナーとしてマウス骨髄腫細胞株を用いた融合のためのマウス脾細胞を得てハイブリドーマを製造するための、PAI-1/ビトロネクチン複合体を用いたマウスの古典的免疫化;
(2) 融合パートナーとしてマウス骨髄腫細胞株を用いた融合のためのマウス脾細胞を得てハイブリドーマを製造するための、PAI-1/tPA複合体を用いたマウスの古典的免疫化;及び
(3) 融合パートナーとしてマウス骨髄腫細胞株を用いた融合のためのマウス脾細胞を得てハイブリドーマを製造するための、PAI-1のみを用いたマウスの古典的免疫化。
ド028)であった。0日目に、9匹のマウスを、PAI-1単独、Vn/PAI-1又はtPA/PAI-1複合体を用いてリン酸緩衝化食塩水(PBS)中で腹腔内で免疫した。マウスあたり抗原合計10ugを
、マウスあたり総体積200μlで1:1体積対体積比のSigma Adjuvant System (Sigmaカタログ番号6322)と混合した。14日目に、マウスを同じ量の抗原で追加免疫し、そして0
日目と同じように準備した。21日目に、PAI-1特異的抗体価評価のために血液サンプルを
採取した。PAI-1/tPA複合体で免疫したマウスは、PAI-1に対する非常に低い特異的反応性及び高い抗tPA力価を示し、そして下流融合には使用されなかった。
わち、Vn又はtPAのいずれか)に対して最も低い力価を有するがマウス及びラットPAI-1オ
ルソログに対する最も高い力価を有するマウスを融合のために選択した。融合に選択したマウスを、上記のように、マウスあたり総体積200μlで1:1の比のSigma Adjuvant System(Sigmaカタログ番号6322)と混合したマウスあたり抗原合計10ugとしてPAI-1のみ又はPAI-1/Vn複合体でPBS中で追加免疫した。55日目に、マウスをCO2チャンバにより屠殺し、
血液を心臓穿刺により集め、そして脾臓をハイブリドーマ産生のために採取した。他の4匹のマウスは後の時点に同じ手順を受けた(最初のマウスを融合に使用した2~4ヶ月後)。
れなかった(表3)。表3に示される血清力価に基づいて、PAI-1に対して高い特異的力価を有する合計5匹のマウスを融合のために選択した。
PAI-1に対して最も高い特異的力価を有する5匹のマウスを融合のために選択した。融
合の日に、マウスをCO2チャンバで屠殺し、血液を心臓穿刺により集め、そして脾臓を取
り出し、無血清ハイブリドーマ融合培地(IMDM; Iscoveの変法ダルベッコ培地500ml (HyClone SH30259.01)10mlを含有するペトリ皿に置いた。脾細胞を線維弾性膜から鉗子により
絞り出し、そして無血清IMDM 10mlで2回洗浄した(初期スピンを含む)。
合し、そして970rpmで10分間(低速スピン)遠心沈殿させて軟らかいペレットを形成した。75mM Hepes 50%質量/体積、Rocheカタログ番号783641(10783641001)中の予熱した(37℃)1ml PEG(PEG 1500)を1分間にわたって細胞ペレットに1滴ずつ滴下し、そして細胞をPEGの液滴を加えるごとに混合した。ペレットをPEGとともにさらに1分間インキュベートし、続いて、10のうち最初の1mlが30秒間にわたって加えられるように無血清IMDM培地10mlを1分間にわたって加えた。生存能を保存するために細胞を10分間970rpmで低速スピ
ンにかけた。融合した細胞を96ウェルプレートに選択培地(200ml Gibco Hybridoma (SFM 番号12045)、20ml 10% HyClone SuperLow IgG Defined FBS(番号SH30898.03)、2mlペニシリン/ストレプトマイシン、4ml(ハイブリドーマ融合及びクローニング栄養補助剤(Roche Diagnostics 11 363 735 001 (50X))及びHAT 4ml(ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミ
ジン)(Sigma-Aldrich 番号HO262(50X))中200ulでプレーティングした。約10~14日後、又はウェル中のの培地が黄色に変わったときに融合はスクリーニングの準備が整った。次いで発生したハイブリドーマからの上清を、PAI-1及びPAI-1/Vn複合体に結合している
抗体の存在についてELISA(実施例2)により試験した。
清スクリーニングのための結合ELISA
選択された5匹のマウスの脾臓からの各融合は、第一段階一次スクリーンとしてPAI-1/Vn複合体への結合についてスクリーニングする必要がある約5000クローンを生じた。ハイブリドーマ上清の一次スクリーニングを、PAI-1又はPAI-1-ビトロネクチン複合体のいず
れかに対してELISAを使用して並行して行い、ビトロネクチンに複合体化したPAI-1に特異的に結合するハイブリドーマを選択した。ELISAに使用した材料は以下である:Immulon 4 HBX ELISAプレート(Dynax カタログ番号N0541216);ヒトモノマービトロネクチン 5ug/ml(Innovative Research カタログ番号IHVN);グリコシル化ヒトPAI-1(活性形態)(Molecular Innovations カタログ番号GLYHPAI-A);いくつかの融合の非グリコシル化マウスPAi-1(Molecular Innovations カタログ番号MPAI-A);HRP-ヤギ抗マウスIgG(H+L)である二次抗体(Jackson ImmunoResearch Labs 番号115-035-166);及びABTS基質:Roche Diagnostics(番号11
204 521 001)。
a) 33B8、PAI-1に対するマウスモノクローナル阻害抗体(IgG1; Innovative Research カタログ番号IMA-33B8);
b) 33H1、PAI-1に対するマウスモノクローナル阻害抗体(IgG1; Innovative Research
カタログ番号IMA-33H1);
c) 31C9、PAI-1に対するマウスモノクローナル非阻害抗体(IgG1; Innovative Research
カタログ番号IMA-31C9);及び
d) 1B7.11、IgG1アイソタイプ対照抗体(抗TNP mAb-ATCC(カタログ番号TIB-191)から購
入したハイブリドーマ細胞株から自社で製造
であった。
ィングされたプレート;翌日、プレートを1時間200ul PBS (BSA/PBS)中1%ウシ血清アルブミンでブロックした;プレートを200ul/ウェルPBSで4回洗浄した;1%BSA/PBS中2ug/mlの活性PAI-1をプレートに50ul/ウェルで加え、そして1時間インキュベートした;プレートを200ul/ウェルPBSで4回洗浄した;1%BSA/PBS中の抗体希釈物又は、元の96ウェルプレートからのハイブリドーマ上清をELISAプレートに50ul/ウェルで加えた;プレートを1時間室
温(RT)でインキュベートした;プレートを200ul/ウェルPBSで4回洗浄した; 1%BSA/PBS中
のHRP-抗マウスIgG 50ul 1:2000を加え、そして1時間室温でインキュベートした;プレートを200ul/ウェル PBSで4回洗浄した;ABTS基質(1つの丸剤を5mlに溶解)を50ul/ウェル
でプレートに加え、次いでプレートをBioTek Synergy HT機器でOD405を使用して読み取った。結合ELISAにおける抗体滴定のための典型的標準曲線を図2に示す。抗体31C9、33B8
及び33H1は陽性対照としての役目を果たし、そしてIgG1は陰性対照としての役目を果たした。表4は、生成された約5000のクローンのうち、675クローンがPAI-1及びPAI-1/Vnの両
方への結合について陽性であったことを示す。次いでこれらのクローンをPAI-1親和性に
ついてスクリーニングした。
低いオフレート(off-rate)を有する高親和性抗体のさらなる選択をBiacoreにより行
った。Biacoreハイブリドーマ上清スクリーニングを:(1)抗マウス固定化抗PAI-1抗体を使用する逆スクリーニング、又は(2)遊離PAI-1をリガンドとして若しくは固定化Vnに対して使用する順(forward)スクリーニングアッセイ
使用した機器は、実時間での生体分子相互作用分析(BIA)のために設計されたBIACORE 2000又はBIACORE 3000(GE Healthcare)であった。使用したセンサーチップは、表面上にカルボキシメチル化デキストランマトリックスを有するCM5チップ(GE Healthcare)であった。各センサーチップは4つの平行なフローセル(Fc)を有していた。全てのフローセルを、チップ製造についての製造者のプロトコルに従って標準的なアミンカップリングにより抗マウスIgG Fc mAbとカップリングした。
リドーマ上清を、フローセルFc2~Fc4のうちの1つのフローセル上に注入し、そしてハイブリドーマ上清中のIgGは、抗マウスIgG Fc mAbによりチップ表面に捕捉されただろうが
、Fc1は参照細胞上にそのまま残っていた。次いでPBS中のヒトPAI-1タンパク質をFc1~Fc4に注入した。PBS緩衝液もまたブランクとしてチップ表面に注入した。Fc1及びブランク
緩衝液実行のシグナルを差し引いた後、上清からの抗体のPAI-1タンパク質に対する結合
親和性(KD)/解離速度(kd)を分析し、そしてScrubber 2ソフトウェアを使用してランク付
けした。
質をCM5チップフローセルFc1~Fc4に固定した。ヒト又はカニクイザルPAI-1を全てのフローセル上に捕捉した。次いでろ過した選択されたハイブリドーマ上清を、Fc1を除いてフ
ローセルあたり1つの捕捉されたPAI-1上に注入し、Fc1は参照フローセルとして保存した。PBS緩衝液もブランクとしてチップ表面上に注入した。Fc1及びブランク緩衝液実行のシグナルを差し引いた後、ハイブリドーマ上清中の抗体のビトロネクチン捕捉PAI-1に対す
る結合親和性を、Scrubber 2ソフトウェア(バージョン2.0a、2005; BioLogic Software、BioLogic Software Rty Ltd.、116 Blamey Court、Campbell、ACT 2612 Australia)を使
用して分析しランク付けした。
ローンのみを、機能的発色アッセイのために選択した。
機能性抗体の選択を可能にするために、新しいELISAを、PAI-1に結合するだけの抗体を、tPA阻害剤としてPAI-1の機能をブロックした抗体(機能性ELISA)に対して識別すること
を可能にするために開発した。
ンからのハイブリドーマ上清を同定するために、新しい機能性ELISAでスクリーニングし
た。機能性ELISAの設計は以下のとおりである:(1)抗体がPAI-1に結合するが、抗体結合はPAI-1とtPAとの間の共有結合の形成をブロックしない場合、その抗tPA抗体は、PAI-1を通じてプレートに結合したtPAに結合し、そして陽性記録を生じる;(2)抗体がPAI-1をブロックし、それによりPAI-1コンホメーションを変化させるか又は立体障害のいずれかによりtPA相互作用をブロックする場合、その抗tPA抗体はプレートに結合することができず、記
録は陰性(より低いOD405)である。並行して、ハイブリドーマ上清を、実施例2に記載さ
れるELISAにおいてPAI-1に対する結合について試験した。ハイブリドーマ上清中の抗体の量は未知であるので、対照記録より低いもの(すなわち、アイソタイプ対照記録より低い)は、目的の抗体の同定とみなされた。上清中の変化する抗体濃度に起因して、いくつか
の場合のブロッキングは部分的にしかなかった。
レートを1時間200ul 1%BSA/PBSでRTにてブロックし、そして200ul/ウェル PBSで4回洗浄した。精製された抗体希釈物及びハイブリドーマ上清を、50ul/ウェルでウェルに加え
、そして15分間インキュベートした。プレートを200ul/ウェル PBSで4回洗浄した。二本
鎖tPA(Innovative Research カタログ番号HTPA-TC)を1ug/mlでプレートに50ul/ウェルで加え、そして30分間RTでインキュベートした。プレートを200ul/ウェル PBSで4回洗浄した。抗tPA HRP結合体化抗体(Life Span Technologies、カタログLS-C39721)を1:3000希釈でプレートに加え、そして45分間インキュベートした。プレートを200ul/ウェル PBSで4回洗浄した。ABTS基質(5ml中に1つの錠剤を溶解;Roche Diagnostics 番号11 204 521 001)を50ul/ウェルでプレートに加え、そして発色のための時間を取った。プレートをBioTek Synergy HT機器でOD405を使用して読み取った。IgGアイソタイプ対照より低い値のODはPAI-1へのtPA結合のブロッキングを示す。
す。
ロックする能力を示した。ハイブリドーマ上清からのデータに基づいて、ハイブリドーマを配列決定及び中規模抗体製造のために選択した。D4は非グリコシル化PAI-1に十分に結
合しなかったが、これはグリコシル化PAI-1へのそのBiacore結合に基づいて精製及び配列
決定のために選択された。精製された抗体を、親和性動力学についてBiacoreで、そして
市販の抗体と比較した効力について発色及び細胞アッセイにおいてさらに特徴付けした。
一連の融合から精製された特異的標的に対する抗体は同じ配列を有し得る。抗体生成の初期段階で抗体遺伝子配列決定を行うことにより、いずれかの重複した可能性のある抗体を除去し、そして正確な抗体遺伝子配列が抗体選択及びヒト化さらにはキメラ抗体構築を導いた。
列を、5’-RACE cDNA配列決定により決定し、そしてN末端タンパク質配列決定により確認した。
を使用して製造した。5’-RACEプロトコルを、製造者の指示に従って実行した。VH及びVL鎖cDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりSMARTerTMキットで供給される5’-プライマー並びに以下に記載される3’VH及びVL遺伝子特異的プライマーを使用して別々に増幅し
た:
重鎖3’-プライマー: 5’-TATGCAAGGCTTACAACCACA -3’ (配列番号105)
軽鎖3’-プライマー: 5’-CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAG -3’ (配列番号106)
に従って実行した。細菌を形質転換するために、反応混合物をコンピテントなE. coli細
胞に加え、そして氷上で20分間インキュベートした。E.coli細胞及び反応混合物の入ったチューブを、42℃で40秒間加熱し、そしてリット(lit)のSOC培地250マイクロリットルを加えた。E.coliを37℃で60分間振盪しながら300rpmでインキュベートした後、細菌を、1mlあたり100マイクログラムのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上に広げ、続いて37℃で終夜インキュベートした。
してプラスミドDNA製造のために1mlあたり100マイクログラムのアンピシリンを含有するLB培地で増殖させた。プラスミドDNAを、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN、カタロ
グ番号27104)を使用して製造者の指示に従って単離した。ハイブリドーマのVH及びVL IgG遺伝子をSanger法により配列決定し、そしてCDRを接触(Contact)定義(MacCallumら)を
使用して決定した。
アッセイにおいて市販の抗体と比較した効力について特徴づけした。
精製した抗体を、PAI-1をブロックする能力について発色アッセイで試験した。PAI-1はtPA機能を阻害し、従って、PAI-1をブロックする抗体はtPA機能の回復を生じるだろう。
発色アッセイは、1つ又はそれ以上のペプチド結合を加水分解することによりそれらの天
然の基質(タンパク質及びペプチド)に作用するタンパク質分解酵素を利用する。この方法は、通常は、特定のアミノ酸に隣接するペプチド結合のみが切断されるという意味で高度に特異的である。発色基質は、タンパク質分解酵素と反応して定量可能な色の形成を生じるペプチドである。発色基質は合成により製造され、そして酵素の天然基質の選択性と類似した選択性を有するように設計される。酵素切断後に放出された場合に色を生じる化学基が発色基質のペプチド部分に結合される。色の変化は分光測定で追跡することができ、そしてタンパク質分解活性に比例する。
固定tPA濃度を用いたPAI-1滴定)を使用して測定した。PAI-1滴定曲線を分析してtPA活性
をブロックするPAI-1についてのIC50を決定した。その後、曲線から計算したIC80を、PAI-1ブロッキング機能を中和しtPA 酵素活性を回復する能力についてのさらなる抗体照合のために選択した。等体積(25ul)のtPA(14nM)(Innovative Research、カタログ番号IHTPA-TC)及びグリコシル化(活性形態)ヒトPAI-1(Molecular Innovations、カタログ番号GLYHPAI-A)又は非グリコシル化(活性形態)マウスPAI-1(Molecular Innovations カタログ番号IMPAI)を混合し、そして108nMで開始したPAI-1の3倍段階希釈及び固定濃度のtPAを使用してインキュベートした。全てのタンパク質希釈を1%BSA/PBSで作製した。混合物を96ウェ
ルマイクロタイタープレートのウェルで15分間室温でインキュベートした。次いで、製造者の指示に従って希釈した200ul発色基質S2288(1.25mM)(Chromogenix、カタログ番号S-820852)をウェルに加え、そして2時間にわたる10分毎の405nmでのOD405吸光度変化を
記録して残留tPA活性を測定した。対照のために、バックグラウンドをtPAの不在下で測定し(酵素反応無し)、陽性対照はPAI-1無し(100% tPA活性)であり、そして陰性対照はtPAの10倍過剰のPAI-1であった(tPA活性の完全なブロック)。33B8、A44、33H1及びIgG1についての代表的な曲線については図4を参照のこと。
活性PAI-1 12.5ul(56nM)を、等体積の、1% BSA(Sigma、カタログ番号A3059)を含有するPBS(Invitrogen、カタログ番号14190-144)又は2uMで開始した抗体の段階3倍希釈のいずれ
かとともにインキュベートした。対照及び未知の抗体を、3nM PAI-1及びtPAを混合物に加えて、0.1~300nMの範囲に及ぶ濃度(5倍希釈)でインキュベートした。全ての成分を10倍濃度で室温にてインキュベートし、そしてさらに、tPAによる切断の際に透明から黄
色へと変色するtPA基質S2288で10倍希釈した。サンプルをOD 405で2時間10分ごとに37℃で読み取った。この混合物を、抗体-抗原複合体形成を達成するために、96ウェルマ
イクロタイタープレートのウェル中で30分間室温にて反応させた。次いで、tPA 25ul(tPA活性のIC80に対応する14nM)をウェルに加え、そして15分間室温でインキュベートした
。最後に、製造者の指示に従って希釈した200ul 1.25mM基質S2288をこの混合物に加えた
。405nmにおける吸光度変化を記録して、残留tPA活性を2時間10分毎に測定した。10
0パーセントPAI-1活性を、抗体の存在しない場合に観察されたPAI-1活性として定義する。抗体によるPAI-1活性の中和を、抗体の存在下で測定された残留PAI-1活性から計算した。対照は、アイソタイプ対照(陰性)としてのIgG1並びに陽性対照としての33H1 mAb及び33B8 mAbであった。B28、E16、E21、A75及びIgG1についての代表的な曲線については図5を参照のこと。
ともにインキュベートした。この混合物を96ウェルマイクロタイタープレートのウェル中で30分間室温にて反応させた。次いで、tPA(14nM)25ulをウェルに加え、そして15
分間室温でインキュベートした。反応を終わらせるために、200 ul tPA基質S2288(Chromogenix) (1.25mM)を混合物に加えた。オルソログPAI-1はMolecular Innovationsから入手
した:マウスPAI-1(野生型活性フラクション;カタログ番号MPAI);ラットPAI-1(野生型活性フラクション;カタログ番号RPAI);及びウサギPAI-1(安定変異体;カタログ番号RbPAI-I91L) カニクイザルPAI-1(活性カニクイザルPAI-1)をE.coliにおいて自家製造した。Biacore
スクリーニングにおけるウサギ及びラットオルソログの不十分なオフレート(データ示さ
ず)のために、これらのオルソログに対する抗体のスクリーニングは行わなかった。
)及びヒトPAI-1阻害機能の両方をブロックする能力を示し、約14の抗体は中程度から強
いブロッキング活性を有していた。A39及びB28は、これら2つの抗体がグリコシル化hPAI-1をブロックしたがヒト又はカニクイザル非グリコシル化PAI-1に対して活性を有してい
なかったという点で独特のプロフィールを有していた。C26を除いて抗体はどれもマウスPAI-1活性を有効にブロックすることができなかった(ヒトPAI-1の10倍以内)。
モノクローナル抗体は、3つの異なる機構によりPAI-1を阻害することができる:a)立体障害により、b)結合の際にPAI-1を潜在コンホメーションへと変換することにより、及びc)阻害剤の代わりにtPAコンホメーションの基質へとPAI-1を変換することにより(「基質コンホメーション」)。PAI-1はセリンプロテアーゼとの相互作用の際にtPAと共有結合する
。
で染色してタンパク質、複合体及びPAI-1の切断形態を可視化した。公知の作用機構を有
する対照モノクローナル抗体を比較器(comparators)として使用した。33B8はPAI-1を潜在コンホメーションへと変換することが知られており、そして33H1はPAI-1を基質コンホ
メーションに変換することが知られている。このアッセイは、基質コンホメーションを確実に同定し得るが。潜在コンホメーション又は立体障害を区別することができない。代表的なSDSゲルを図8、9及び10に示す。
に変換することによりPAI-1活性をブロックする。A39及びB109は、異なる作用機構を有するが、アッセイは、これらの抗体がPAI-1を活性コンホメーションから潜在コンホメーシ
ョンに変化させることによりPAI-1活性をブロックするのか立体障害によりブロックする
のかを区別することができなかった。
動力学測定において、抗体を逆に25℃で評価した。逆アッセイにおいて、PAI-1抗体を
、CM5チップ上に準備された抗マウスIgG Fc抗体に捕捉させ、続いて40nMで始めてPAI-1タンパク質(ヒト又はカニクイザル)の段階2倍希釈を行う。大量輸送制限を避けるために高
流量を選択した。2000秒間を解離時間にとって選択した抗体の遅いオフレートに適応させた。抗体-PAI-1結合の各回の後にチップをグリシン-HCl、pH1.7緩衝液により再生させた。動力学データ分析を、Biacore BIAevaluationソフトウェアを使用して行った。セ
ンサーグラム(sensorgrams)を、参照フローセル値及びブランク緩衝液値を差し引くこ
とにより二重参照した。センサーグラムを、局所Rmaxを用いたシミュレートした動力学(simulated kinetics)1:1(Langmuir)モデルを使用することによりフィッティングした。
試験した抗体についてのデータを以下の表9に示す。
トロネクチンタンパク質をフローセル Fc1-Fc4においてアミンカップリングによりCM5チ
ップ上に固定した。次いで、ヒトPAI-1を、リガンドとしてフローセルFc2-Fc4においてビトロネクチン表面に捕捉した。Fc1は参照セルとして保存された。抗体を40nMから開始し
て2倍希釈し、Fc1-4に注入した。動力学的データ分析を、Biacore BIAevaluationソフトウェアを使用して行った。センサーグラムは、最初に参照セル値及びブランク緩衝液値を差し引くことにより二重参照され、次いで1:1(Langmuir)モデルによりフィッティングし
、全体Rmaxとともに使用した。
初代ヒト細胞による下流プラスミン産生を回復する各抗体の能力をさらに調べるために、プラスミン生成アッセイを使用した。発色アッセイにおいて高い有効性及びBiacoreに
おいて良好な親和性を示した抗体のみをこのアッセイにおいて使用し試験した。
PAA(A11-152))中20000細胞/ウェルで37℃にて5% CO2下でプレーティングした。2日目に、PAI-1活性を中和するために、抗体を組み換えPAI-1(Molecular Innovation、カタログ
番号IGLYHPAI-A、組み換えグリコシル化ヒトPAI-1、最終濃度 5nM)とともに15分間室温でプレインキュベートした。同時に、tPA (Molecular Innovations (カタログ番号HTPA-TC)、レッドフェノール(red phenol)を含まないDMEM中5nM)を細胞とともに15分間37℃でインキュベートした。未結合のtPAを洗浄した後、PAI-1/mAb混合物を細胞に加え、次いで残留tPA活性を、添加及びglu-プラスミノーゲン/基質混合物(Glu-Pg:Sigmaカタログ番
号9001-91-6;0.5μM最終濃度)及びプラスミン発色基質:(CBS00.65 Stago カタログ番号00128、0.5mM最終濃度)により測定した。
、Thermofisher)を使用した45秒毎のA405/492の動力学的読み取りにより検出した。Bioliseソフトウェア(Thermofischer)は、発色基質切断の最大速度を計算した:プラスミン生成はVmaxで表される:1分あたりのA405/492nmの最大速度(mDO/分)を計算した。次いでPAI-1阻害を、参照(100%阻害)としてtPA単独及びPAI-1(mAb無し、阻害無しとして)を用いて
計算し、そしてBiostat speedソフトウェアを使用してプロットしてIC50及びImaxを計算
した。
優れた結合活性及びブロッキング活性を有する抗PAI-1抗体の選択された群を、Biacore競合アッセイにおけるそれらの潜在的な結合エピトープについて調べた。アッセイにおいて、新しく同定された抗体のほかに、ヒトPAI-1上の既知の結合部位を有するいくつかの
市販の抗PAI-1抗体を、ヒトPAI-1タンパク質に対する結合について競合するように設定した。各抗体を、CM5チップのフローセル上に標準的アミンカップリング反応を使用して固
定した。クローンB28を除く全ての試験した抗体は、アミンカップリング後に結合部位活
性を保持していた。ヒトPAI-1タンパク質を、チップ上に固定された抗体に捕捉し、続い
て各抗体を検体として注入した。固定された抗体とヒトPAI-1上の異なる結合部位を有す
る検体抗体のみが、Biacoreにおいてさらなる結合シグナルを示す。競合実験を各固定抗
体について2回繰り返し、そして結果を以下の表に示す。
結合することができない。従って、C45は、A44がPAI-1上で結合する同じ結合部位につい
て競合し(表12において「c/c」と示される)、又はPAI-1に結合しているA44は、PAI-1へのC45の結合を妨げる。この分析は、実験が逆順に繰り返された場合に裏付けられる。具
体的には、C45が固定された抗体であり、そしてPAI-1に結合する場合、検体抗体としてのA44は、C45に結合したPAI-1に結合することができない(表12において「c/c」と示される)。同様の分析において、A71及びA75はPAI-1上の同じ部位について競合する。Biacore分析により、A44及びC45、さらにはA71及びA75が、PAI-1に結合する場合に互いに競合するか
又は互いに妨害するということが裏付けられた。
結合することができる(表12において「b/b」と示される)。これは逆実験において確認
される。PAI-1が固定された33H1又は固定された33H8に結合される場合、A44はなおPAI-1
に結合することができる。従って、市販の抗体33H1及び33B8は、PAI-1へのA44の結合と競
合せず、妨害もしない。
ち、33B8)の捕捉されたPAI-1タンパク質への結合をブロックしたが;固定された抗体の位
置を検体抗体と交換した場合(例えば、チップ上の対を反転させる)、抗体対はもはやPAI-1への結合について互いに競合しない。例えば、B109がPAI-1に結合した固定化された抗体である場合、33B8はPAI-1に結合することができなかった。しかし、33B8がPAI-1に結合している固定された抗体である場合、B109はPAI-1に結合することができなかった。この結
果に関する1つの可能な説明は、固定された抗体がPAI-1に結合される場合、PAI-1は第二の又は検体抗体にとって都合の悪いコンホメーションへと変わり得、そして検体抗体の結合を妨げるということである(例えば、B109が固定された抗体であり、かつ33B8が検体抗
体である場合)。しかし、抗体対が逆の場合、固定抗体はPAI-1のコンホメーションが比較的変化しないような様式で結合し得、従って、検体抗体が結合したPAI-1に結合すること
が可能となる(すなわち、検体抗体B109は、固定された抗体33B8により結合したPAI-1に結合することができる)。従って、33B8とB109との間で観察された競合は、PAI-1上で重複した結合部位に起因するのではなく、B109に結合した場合のPAI-1におけるコンホメーショ
ン変化に起因するようであった。
表13は、実行した5つの融合から最も活性なモノクローナル抗体を特徴づけるインビトロデータの要約を示す。これらのデータに基いて、A44はBiacoreにおいて最も高い親和性を有しながら、発色アッセイ及びプラスミン生成において最も有効であったので、A44を
ヒト化のために選択した。
PAI-1に対するA44マウス抗体の配列モチーフをヒト化し、安定化し、そして最適化するために以下で考察されるいくつかのアプローチが取られた。
使用したヒト化プロトコルは、PCT/US08/74381(US20110027266)(その全体として参照
により本明細書に加入される)に記載されている。マウスA44の可変軽(VL)及び可変重(VH)配列を、 Molecular Operating Environment(MOE; v. 2010.10; Chemical Computing Group)で抗PAI-1 A44 軽鎖(LC)及び重鎖(HC)の相同性モデルを構築するために使用した。以下のテンプレートを使用した: 軽鎖フレームワーク - 1D5I(フレームワーク領域において94%同一性)、重鎖フレームワーク - 3KSO(フレームワーク領域において96%同一性)、L1 -
1D5I (94%同一性)、L2 - 1D5I (94%同一性)、L3 - 1AXS (72%同一性)、H1 - 1IC7 (82%
同一性)、H2 - 1MBU (68%同一性)及びH3 - 2WDB (62%同一性)。Trpが最初の残基であるため、H3ループは特にモデル作成が困難であった。2WDBもまた、より短いループであるが、ループの開始にTrp及びH3ループの末端に同じPhe-Asp-Tyr配列を有する。Glu-105(LC)及
びHis-99の側鎖を再構築し、そしてその後のモデルを、MOEに実装されている標準的手順
を使用してエネルギー最小化した。Generalized Born暗溶媒中1.1ナノ秒(ns)間500Kの温度でのタンパク質骨格に対する制限を用いて、マウスA44の最小3D相同性モデルの分子動力学(MD)シミュレーションを続いて行った。10の多様なコンホメーションをこの最初のMD実行から100ピコ秒(ps)ごとに最後の1ns間抽出した。次いでこれらの
多様なコンホメーションを、タンパク質骨格に対する制限なく、300Kの温度で2.3ns間MD
シミュレーションにかけた。次いで、10のMD実行のそれぞれについて、MD軌道(trajectory)からの最後の2,000スナップショット(1psごとに1つ)を使用して、各マウスA44ア
ミノ酸について、参照medoid位置と比較したその平均二乗偏差(root mean square deviations)(rmsd)を計算した。所定のアミノ酸の10の別々のMD実行での平均rmsdを全てのA44マウスアミノ酸の全体平均rmsdと比較することにより、アミノ酸が、MDの間に見られるように、T細胞受容体と相互作用し、免疫応答の活性の原因であるように考えられるほど十
分に可動性であるかどうかを決定する。37アミノ酸を、CDR及びその周辺5オングストロームの近辺を除いて、マウスA44抗体において可動性と同定した。
ヒト生殖系列軽鎖(vk1、vk2、vk3、vk4、vlambda1、vlambda2、vlambda3)及び7つの最も一般的なヒト生殖系列重さ(vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)を系統的に組み合わ
せることにより構築した。vk1-vh2ヒト生殖系列抗体は、マウスA44抗体の可動性アミノ酸と比較して、その可動性アミノ酸の0.58 4D類似性を示した;従って、vk1-vh2生殖系列抗
体を、可動性アミノ酸に焦点を合わせてA44抗体をヒト化するために使用した。vlambda3-vh4ヒト生殖系列は、第二の最も高い4D類似性、0.57を示し、そしてまたA44抗体のヒト化のための基礎として使用された。マウスA44とvk1-vh2アミノ酸との対になったアミノ酸会合のために、2つの配列を、2つの対応する相同性モデルのアルファ炭素の最適3D重ねあ
わせに基づいて整列させた。マウスA44とvlambda3-vh4との間の対になったアミノ酸会合
を、同様の方法で行った。図13は、マウスA44 軽鎖のvk1及びvlambda3との整列を示す。
図14は、マウスA44重鎖のvh2及びvh4との整列を示す。
a) 知識ベースのアプローチ
それらのそれぞれの標準(canonical)配列に対して低い発生頻度を有する軽鎖及び重
鎖のアミノ酸(CDRを除く)は、最も頻繁に見いだされるアミノ酸(ΔΔGth>0.5kcal/mol
に変異されることを提案された;(E. Monsellier、H. Bedouelle. J. Mol. Biol. 362、2006、p. 580-593))。このLC及びHCについてのコンセンサス変異の最初のリストは、最も近いヒト生殖系列(vk1-vh2)中に見いだされるアミノ酸に限られていた。CDRの周辺付近(5オングストローム「Vernier」帯(J. Mol. Biol. 224、1992、p. 487-499))における提案さ
れた変化は、考慮から外された。これにより、LCにおける2つの安定化変異(表15を参照
のこと)及びHCにおける5つの安定化変異(表16を参照のこと)が生じる。他の基準は、抗PAI-1 A44抗体の潜在的安定化についてこれらの変異を検討するために考慮された。これらの基準は、表面でのヒドロパシーの都合の良い変化又は変異体の分子動力学ベースの推定される安定化であった。また、さらなる安定化変異は、文献(E. Monsellier & H. Bedouelle、J. Mol. Biol.、362、2006、p. 580-593; B.J. Steipe et al. J. Mol. Biol、1994、240、188-192)において成功したと報告しており、考慮したが(表17及び18を参照のこと)、さらなる変異は示唆されなかった。
3D及びMDベースのアプローチは以前に報告されている(Seco J.、Luque F.J.、Barril X.、J. Med. Chem. 2009 Apr 23:52(8):2363-71; Malin Jonsson et al.、J. Phys. Chem.
B 2003、107:5511-5518)。抗体の疎水性領域は、二成分溶媒(水中20%イソプロパノール
、20ns産生(production)シミュレーション)におけるFabの分子動力学シミュレーションを分析することにより明確に同定された。Schrodingerのmaestroソフトウェア(v. 8.5.207)内の疎水性表面マップを使用したさらなる分析を完了した。これら2つの方法により分析されたタンパク質表面は非常に親水性であった。これら両方の技術を用いても、表面上のいずれかの疎水性パッチに寄与する残基は存在せず、従って抗凝集変異は示唆されなかった。
グラフティング技術を使用するヒト化は以前に報告されている(P. T. Jones、P.H. Dear、J. Foote、M.S. Neuberger、G. Winter、Nature 1986、321:522-525)。ヒト化は、抗PAI1 A44可変ドメイン軽鎖及び重鎖に最も近い2つのヒト生殖系列を同定することにより
開始した。これは、系統的に列挙された全てのヒト生殖系列に対してBLAST検索を行うこ
とにより行った(カッパ及びラムダ鎖についてのV及びJドメイン;重鎖についてのV、D及びJドメインの全ての可能な組み合わせ)。BLAST検索を、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)により提供されるSequence Information Retrieval and Analysis (SIRA)サービスに連結されたインターネットアプリケーションを使用して行った。
及び67%の配列同一性で同定された。内部VBASE生殖系列を使用して、軽鎖はV I-O18(約64%同一性)遺伝子座に近いことが見出され、そして重鎖はVH4サブファミリーの4-30(約69%同一性)に近いことが見出された。CDR領域(Kabatに基づく)及びVernier残基は、mA44 軽
鎖(A44LC)及びIGVK1-33-01_IGKJ4-01(IGVK1)について斜字で示される。J. Mol. Biol.、1992、224、487において定義されるVernier残基は、下線を引かれる。ヒト化変異(ボール
ド体)は、上で定義されるCDR及びVernier帯残基(マウスにおいても下線を引かれる)を除いて、2つの整列された配列の対比較を行うことにより得られた。マウス軽鎖からのT46L及びQ69T並びにマウス重鎖におけるM2V(Vernier帯残基)を、グラフティングアプローチによりヒト化の一部として大部分保存されたヒト生殖系列配列に変異させた(LC5a、HC5a)。別の変異体において、これらの3つのVernier帯残基を、元のマウス配列において見られ
るように保持した(LC5b、HC5b)。
の6-01遺伝子座に近いことが見出された。CDR領域(Kabatに基づく)及びVernier領域は斜
字で示される。Vernier領域(J. Mol. Biol.、1992、224、487において定義されるとおり)及び下線を引かれる(and underlined)。ヒト化変異は、上で定義されボールド体で示されるCDR及びVernier帯の残基(マウスにおいても下線を引かれる)を除いて、2つの整列された配列の対比較を行うことにより得られた。
以下の配列モチーフを検討した:Asp-Pro(酸に不安定な結合)、Asn-X-Ser/Thr (グリコ
シル化、X=Pro以外のいずれかのアミノ酸)、Asp-Gly/Ser/Thr (スクシンイミド/可動性領域におけるiso-asp形成)、Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (露出した脱アミド部位)、及びMet(露出した領域における酸化)。マウス抗PAI1 A44のVL及びVHドメインは、2つの潜在的な
グリコシル化部位を有する:LC中のN52RS(CDR2において)及びHC中のN72TS。1つの露出し
た脱アミド部位がHCのCDR1中に存在する(N31G)。3つの潜在的なスクシンイミド形成部位が、元のマウス配列において同定されている:LC中のD56G(CDR2の末端)、及びD27S(CDR1において)及びHC中のD89T。LCの問題のあるモチーフ、N52RS及びD56Gは、両方ともCDR2にある。これらの変異はCDRに発生するので、これらは以下の2つの提案された操作された配
列における変異により対処された(LC2及びLC4)。N52を保存的にGlnに変異させ、そしてD56をGluに変異させた。4つの既存の問題のある残基がHCにあった。最初の2つはCDR1に発生する:潜在的スクシンイミド形成部位、D27S、及び脱アミド部位N31G。2つのさらなる
問題のあるモチーフもまた、第三のフレームワーク領域に存在する。CDR1において、スクシンイミドの形成を避けるためにD27をEに変異させたが、N31はQに変更した。N72及びD89をそれぞれQ及びEに変更した。これらの問題のあるモチーフは、以下に記載される操作された配列HC2a及びHC4において対処された。HC2b変異体は、N31G脱アミド部位の変異のみ
を含む。
Emami H.、Hoof I.、Salimi N.、Damle R.、Sette A.、Peters B. The immune epitope database 2.0 Nucleic Acids Res. 2010、Jan、38 (Database issue):D854-62. Epub 2009、Nov 11)に対して配列類似性について除去して(blasted)、配列がどれもいずれの公知のヒトB又はT細胞エピトープも含有していないということを確実にした(BLAST検索により得られた結果についてのカットオフとして70%の配列同一性を使用し、そしてヒト種からの結果のみを考慮した)。DeClerckら(国際公開第WO 2002034776号)は、PAI-1のエピト
ープに結合する抗体を開示し、それらはどれも本明細書に開示されるエピトープには問題がある。
鎖にわたり約71%の同一性を有する。対照配列は、質量分析により確認されていない部分的配列であった。結合データはこのペプチドについて報告されていない。このエピトープは、提案された全てのLV変異体で見られた。潜在的に問題のあるエピトープは、同様の検索がHCについて行われた場合に同定されなかった。
CDRを太字で強調し、そしてVernier領域に(Foote及びWinter、J. Mol. Biol.、1992、224:487-499により定義されるとおり)下線を引いた。
4Dヒト化及びグラフティングアプローチを、最も近い2つのヒト生殖系列配列に適用した
a) 操作された軽鎖配列
LC1aは、最も近い生殖系列配列vk1を使用して4Dヒト化法から誘導された7つの変異を含有する。LC1bは、2番目に近いヒト生殖系列配列vl3に対する4Dヒト化から誘導された12の変異を有する。LC2は、LC1aと比較してCDR2において2つのさらなる変異を含有する
。これらの変異は、潜在的グリコシル化部位(N52RS)及び潜在的スクシンイミド形成部位(
D56G)に対処する。LC3は、さらなる2つの安定化変異を含む、最も近い生殖系列配列に対する4Dヒト化からの変異を含有する。LC4は、ヒト化、安定化及び不要なモチーフ変異を組み合わせる。CDR及びvernier帯は斜字であり、vernier残基は下線を引かれ、ヒト化変
異はボールド体であり、問題のあるモチーフは二重取り消し線であり、そして安定化変異は下の枠に示される。図16及び17は変異の要旨を示す。
。このペプチドは、それが試験された全てのHLA-DR対立遺伝子に対してIC50 >100,000nM
を有すると報告されている。LC1b胚性インデックス=IGKV1-33-01_IGKJ4-01 [VκI-O18]で67%。
た。
LC2胚性インデックス=IGKV1-33-01_IGKJ4-01 [VκI-O18]で76%。
った。LC3胚性インデックス=IGKV1-33-01_IGKJ4-01 [VκI-O18]で78%。
った。LC4胚性インデックス=IGKV1-33-01_IGKJ4-01 [VκI-O18]で78%。
胚性インデックス=IGKV1-33-01_IGKJ4-01 [VκI-O18]で85%。
LC5b胚性インデックス=IGKV1-33-01_IGKJ4-01 [VκI-O18]で83%。
。このペプチドは、それが試験された全てのHLA-DR対立遺伝子に対してIC50 >100,000 nM
LC5cを有すると報告された。胚性インデックス=IGKV3-11-02_IGKJ4-01 [VκIII-L6]で79%。全ての軽鎖変異の図表は図15に示される。
HC1aは、最も近いヒト生殖系列配列に対する4Dヒト化法から誘導された8つの変異を
含有する。HC1bは、2番目に近い生殖系列配列に対する4Dヒト化法から誘導された6つ
の変異を含有する。HC2aは、不要な配列モチーフに対処するために、HC1aと比較した場合に4つのさらなる変異を含有する。HC2bはCDR1における脱アミド部位(N31G)に対処するのみである。HC3は、さらなる5つの安定化変異を含むHC1aからのヒト化変異を含有する。HC4は、HC1aからのヒト化変異、HC3からの安定化変異及びHC2aからの問題のあるモチーフ
に対処する変異を含有する。CDR及びvernier帯は斜字で、vernier残基は下線を引かれ、
ヒト化変異はボールド体であり、問題のあるモチーフは二重取り消し線であり、そして安定化変異は下の枠に示される。
胚性インデックス=IGHV4-31-03_IGHD6-25-01_IGHJ4-02で70%。
グラフティングのために、軽鎖の3つのバージョン(LC5a、LC5b、LC5c)及び重鎖の3つのバージョン(HC5a、HC5b、HC5c)を作製した。LC5aは、最も近いヒト生殖系列配列に対するグラフティングから誘導される16の変異を含み、かつマウスCDR及びマウスVernier帯残基の大部分を保持する。2つのマウスVernier残基T46及びN69は、いずれのヒト生殖系
列配列にも存在せず、保存的に変異された。LC5bは、最も近いヒト生殖系列配列に対するグラフティングから誘導された14の変異を含有し、そしてマウスCDR及び全てのマウスVernie帯残基を保持していた。LC5cは、二番目に近いヒト生殖系列配列へのグラフティン
グから誘導された22の変異を含有し、そしてマウスCDR及び全てのマウスVernier帯残基を保持していた。
、非常に低い傾向でヒト生殖系列配列のこの位置に出現する。HC5bは、最も近いヒト生殖系列配列へのグラフティングから誘導された20の変異を含有し、そしてマウスCDR及び
全てのマウスVernier帯残基を保持する。HC5cは、2番目に近いヒト生殖系列配列へのグ
ラフティングから誘導された23の変異を含有し、そしてマウスCDR及び全てのマウスVernier帯残基を保持する。
・ LC1axHC1a (最も近い生殖系列配列に基づいて4Dヒト化に対処する変異)
・ LC1bxHC1b (2番目に近い生殖系列配列に基づいて4Dヒト化に対処する変異)
・ LC2xHC2a (4Dヒト化及び不要な配列に対処する変異)
・ LC2xHC2b (4Dヒト化及び不要な配列に対処する変異)
・ LC1axHC2b (4Dヒト化及び不要な配列に対処する変異)
・ LC3xHC3 (4Dヒト化及び安定化に対処する変異)
・ LC4xHC4 (4Dヒト化、不要な配列及び安定化に対処する変異)
・ LC5axHC5a (グラフティングによるヒト化、CDRの保持、及び3つの保存的Vernier
改変の組み込みに対処する変異)
・ LC5bxHC5b (グラフティングによるヒト化CDR及びVernier領域の保持に対処する変異)
・ LC5cxHC5c (グラフティングによるヒト化CDR及びVernier領域の保持に対処する変異)
上の実施例において示されたコンピュータによるモデリングに基いて、10の変異体を生成した(4Dヒト化による変異体1~8及びCDRグラフティングによる変異体9~10;変異体3
及び10は、2番目に近い生殖系列に対して生成された)。ヒト化A44の軽鎖及び重鎖DNAの
可変領域をHEK293発現のために準備した。タンパク質を、対応するDNAのpXLプラスミド(New England Biolabs;HCについてはNheI/Eco47III、LCについてはNheI/BsiWI)へのクロー
ニングのあとに生成した。ヒト化配列は、HEK発現に最適化されたコドン及びGeneArt(Life Technologiesの子会社)により合成された遺伝子であった。得られたプラスミドを、同
時トランスフェクトし、そしてFreeStyleTM293発現系(Invitrogen、カタログ番号K9000-01)において一過性発現させた。変異体3及び10は不十分にしか発現せす、さらに続行しな
かった。全ての他の変異体は発現され、プロテインAカラムを使用して精製された。分析
用ゲルは、変異体6及び9における軽鎖並びに変異体5及び7における重鎖の部分的グリコシル化(約5~10%)を示した(データは示さず)。残りの8つの変異体を、hPAIを使用する発色アッセイ及びヒトグリコシル化PAIを使用するヒト星状細胞におけるプラスミン生
成アッセイにおいて試験した。結果を表23に示す。
示す。
のヒト化変異体は、カニクイザルPAI-1及びヒトPAI-1の両方に対して親和性を示し、そしてPAI-1はビトロネクチンと許容しうる範囲内で複合体化した。親A44と比較して、ヒト化は抗体親和性を変化しないようであった。 ヒト化変異体の親和性及び有効性は発色アッセイ及びBiacoreアッセイにおいて有意に異ならなかったが、細胞アッセイにおいてプラ
スミン生成を回復する変異体の能力は、いくつかの変異体について親マウス抗体よりも有意に低かった(以下の発色アッセイ及び細胞アッセイの比較をまとめた表27を参照のこ
と)。ヒト化変異体11~14を、細胞アッセイにおいてPAI-1をブロックする能力について
試験した。
ヒト化変異体11~14のさらなるスクリーニングを、内因的に産生されたヒトPAI-1
を使用してヒト血漿及びヒト線維性肝臓サンプルから行った。 PAI-1活性を、96ウェ
ルプレートに固定されたウロキナーゼと安定な複合体を形成するこのセルピンの能力を測定することにより評価した。未結合のPAI-1を洗浄した後、uPA-PAI-1複合体を、ポリクローナル抗PAI-1抗体の使用により検出した。次いで、結合したポリクローナル抗PAI-1抗体(これはサンプル中の活性PAI-1に比例する)を、二次抗体に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ(Molecular Innovation Cat. No. HPAIKT)を使用して検出した。様々な濃度のA44ヒト化変異体を、ヒト又はカニクイザル組み換えPAI-1(0.31nM最終濃度)のいずれかと
室温で15分間インキュベートし、次いで上記のELISAを使用してuPA-PAI-1複合体により機能的活性PAI-1について試験した。サンプルをヒトPAI-1標準と比較した。高活性PAI-1
レベルを有する高BMI患者からのヒト血漿を4倍希釈し、そして増加する量のA44ヒト化変異体とともにインキュベートした。残りの活性PAI-1レベルを、ELISAにより検出されたuPA-PAI-1複合体を使用して決定した。カニクイザル組み換えPAI-1中和もまた、プラスミン生成により試験して交差反応性を確認した。
プルを、セラミックビーズ(Cat No 03961-1-003、Bertin Technology、France)を入れた
乾燥チューブ中でPrecellysホモジナイザー(Bertin Technology、France;4℃、6800rpmで2x30秒)を使用してホモジナイズし、次いで1ml/gの溶解緩衝液(NaCl TBS中1.5M-Tris緩衝液0.1M Tris+0.15M NaCl pH7.4)を使用して溶解した。4℃で5000gにて10分間の遠心分離
後に、上清中の肝臓溶解物を採取し、そして-80℃で凍結して貯蔵した。標準的BCAアッセイを使用した総タンパク質濃度並びに活性及び総PAI-1レベル(Mol Innov カタログ番号HPAIKT及びカタログ番号MPAIKT-TOTにより提供されるUK-PAI複合ELISAにより決定される)を、Biostat Calibrationソフトウェアを使用してA450nmに対して標準ヒトPAI-1濃度をプロットすることにより製造者の指示に従って行った。2.5nMの活性PAI-1まで希釈された肝臓溶解物とともにインキュベートした増加する濃度のA44ヒト化変異体を、以前に記載され
るように評価してデータを分析した。PAI-1活性の阻害(mAbを用いないPAI-1活性は0%阻害であり、IgG1ではPAI-1の有意でかつ用量依存性の阻害は発生しなかった)を各mAb濃度に
ついて計算した。PAI-1活性の阻害パーセントをmAb濃度の関数としてプロットし、そしてIC50を決定し、ImaxはBiostat speedソフトウェアを使用した。データを図17及び表29
に示す。
グラフティング技術を使用したヒト化は以前に報告されている(P. T. Jones、et al.、Nature 1986、321:522-525)。抗PAI1マウス抗体APGのヒト化は、独国特許出願第DE200015
3251号からのマウス軽鎖(配列番号148)及びマウス重鎖(配列番号149)で開始した;このマ
ウス抗体はDebrock et al.、Biochimica et Biophysica Acta、1337(2):257-266 (1997)
にも記載されている。マウス抗体のHC及びLC鎖の生殖系列及び基準クラスを同定することにより、それぞれmuIGHV1-39及びmuIGKV14-111が得られた。次に、抗PAI1 APG可変ドメイン軽鎖及び重鎖に近いヒト生殖系列のリストを同定し、そして同一性パーセントによりランク付けした。両方の工程は、系統的に列挙される全てのヒト生殖系列に対してBLAST検
索を実行することにより行われた(カッパ及びラムダ鎖についてのV及びJドメイン;重鎖についてのV、D及びJドメインの全ての可能な組み合わせ)。BLAST検索を、http://www.imgt.org.で提供されるIMGT/DomainGapAlignツールを使用して実行した(Ehrenmann、et al. Cold Spring Harbor Protocols 2011.6 (2011)を参照のこと)。最も近いヒト生殖系列は、抗PAI1 APG可変ドメイン軽鎖及び重鎖に対してそれぞれ67.4%及び63.3%の配列同一性を有すると同定された。IMGTデータベースを使用して、軽鎖はHuIGKV1-33に近いことが見出され、そして重鎖はHuIGHV1-46に近かった。適合する基準クラスを有する抗PAI1 APG可変ドメイン重鎖に対して最も近いヒト生殖系列は、62.2%の配列同一性を有するHuIGHV7-4-1であると見出された。
のこと)。Foote、et al. J. Mol. Biol. 224(2):487-99 (1992)において定義されるVernier残基は下線を引かれる。上で定義されたCDR及びVernier帯残基(mAPG配列においても下
線を引かれる、表30)を除いて、2つの整列された配列の対比較を行うことによりヒト化
変異(ボールド体)を得た。マウスAPG抗体に対してさらなる操作は行わなかった。これら
のヒト化抗体をAPGv2及びAPGv4と名付けた。
4Dヒト化及びグラフティングアプローチを、上記のヒト生殖系列配列マッチに適用した。操作された軽鎖配列については、APGv2はヒトIGKV1-33生殖系列に接合されたマウス軽
鎖CDRを含有する(IGKV1-33-01_IGKJ2-01を用いてAPGv2胚性インデックス=94%)。操作された重鎖配列については、APGv2及びAPGv4は、それぞれヒトIGHV7-4-1及びIGHV1-46生殖系
列に接合されたマウス重鎖CDRを含有する(APG_VH2胚性インデックス=IGHV7-4-1-02_IGHD6-25-01_IGHJ4-02で91%;APG_VH4胚性インデックス=IGHV1-46-01_IGHD6-25-01_IGHJ4-02)で91%。上の表30を参照のこと。
グラフティングのために、1つのバージョンの軽鎖(APGv2_VL2; 配列番号153)及び2つのバージョンの重鎖(APGv2_VH2; 配列番号154及びAPGv4_VH4; 配列番号155)を作製した。APG_VL2は、最も近い生殖系列配列へのグラフティングから誘導された15の変異を含有し
、マウスCDR及びVernier帯残基を保持する。APG_VH2は、適合する基準クラスを有する最
も近い生殖系列配列へのグラフティングから誘導された21の変異を含有し、マウスCDR及
びVernier帯残基を保持する。APG_VH4は、最も近いヒト生殖系列配列へのグラフティングから誘導された20の変異を含有し、マウスCDR及びVernier帯残基を保持する。このグラフティングプロトコルについてのCDRの限界設定は、文献において利用可能な様々な異な
る定義に大まかに基づく。
・ APG_VL2xAPG_VH4(CDR及びVernier領域を保持するグラフティングによりヒト化に
対処する変異)
2つのmAPG変異体は、このヒト化キャンペーンの間に生成され、これらはAPGv2及びAPGv4と名付けられた。これらの変異体を発現させ、そして以下に記載されるいくつかのインビトロアッセイにおいて特徴付けした。
ヒトグリコシル化PAI-1(GLYHPAI-A、Molecular Innovation)に対する親和性を、マウスAPG及び2つのヒト化変異体(APGv2及びAPGv4)についてBiacore 2000機器(GE Healthcare
、Uppsala、Sweden)を使用して表面プラズモン共鳴(SPR)により調べた。
ヒト抗Fc(抗ヒトIgG (Fc)抗体及び抗マウスIgG抗体キット、GE Healthcare)の捕捉のための通常のアミンカップリングを使用して準備した。全てのモノクローナル抗体(mAb)を、HBS-EPランニングバッファを使用して5nMに希釈した。各々の精製されたmAbを、3分間異
なるフローセル表面上に捕捉した。ヒトPAI-1を様々な濃度(2.5、5、10、20及び40nM)で
注入し、中間に短い解離時間及び最後に長い解離時間を用いた(接触時間:120秒、短い解
離:90秒;長い解離:1800秒、流量:50μl/分)。各回の抗体-PAI-1結合後にグリシン-HCl、pH1.7緩衝液によりチップを再生した。動力学データ分析を、Biacore BIAevaluationソフトウェアを使用して行った。センサーグラムを、参照フローセル値及びブランク緩衝液値を差し引くことにより二重参照した。センサーグラムを、局所Rmaxを用いたシミュレートした動力学1:1(Langmuir)モデルを使用してフィッティングした。(図19を参照のこと)。3つのAPG抗体についてのデータを表31に示す。
マウスAPG並びにヒト化変異体APGv2及びAPGv4を、本明細書に開示される機能性アッセ
イに従って、PAI-1をブロックするそれらの能力についてスクリーニングした(例えば、上位の実施例6及び9を参照のこと)。手短には、PAI-1活性を、96ウェル上に固定されたウロキナーゼと安定な複合体を形成するこのセルピンの能力により評価した。未結合のPAI-1を洗浄した後、uPA-PAI-1複合体を、ポリクローナル抗PAI-1抗体を使用することによ
り検出した。次いで、結合したポリクローナル抗PAI-1抗体(サンプル中の活性PAI-1に比
例する)を、二次抗体に結合された西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して製造者の指示
に従って検出した(Molecular Innovation、カタログ番号HPAIKT)。
繊維素溶解系は、脳卒中を有する患者においてしばしば変化する。血餅溶解アッセイは、フィブリン分解の程度を測定することにより線維素溶解活性を決定するために使用され得る。一般的には、Lindgren、A. et al. Stroke 27:1066-1071 (1996)を参照のこと。血餅溶解アッセイは他所で詳細に記載されている。例えば、Beebe、et al. Thromb. Res. 47:123-8 (1987); Tilley et al.、J. Vis. Exp.67:e3822を参照のこと。
決定した。手短には、ここで適用されるアッセイは、tPA及び血餅溶解を阻害することが
知られている濃度のPAI-1の存在下で組織因子/Ca2+の混合物を使用して血餅形成を誘導する。フィブリン重合は、340nmでの吸光度測定により検出された比濁法(turbidimetry)
の増加を誘導する。抗体が血餅溶解を回復する能力を、正常ヒト血小板欠乏血漿と、増加する濃度の抗体をインキュベートすることにより決定した。
、Molecular Innovation)を最終濃度3nMまで加え、そしてさらに10分間インキュベートした。次いでt-PA(sctPA、Molecular Innovation)を、最終濃度1nMまで加えた。血餅形成を、カルシウムアッセイ緩衝液(CaCl2)中7.5mMの最終濃度に希釈された組織因子(Innovin(R)、Siemens Healthcare Diagnostics、Marburg、Germany)を含む活性化混合物により誘導した。
を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して計算した。抗体処理後の血餅溶解の回復を、以下の計算に従って決定した:
、アイソタイプIgG1は回復しなかった(図22を参照のこと)。A44V11は、100nMで103%のImaxとともに2nMのIC50を示した(図23を参照のこと)。
を参照のこと)。APGv2は、2.1nMのIC50及び114%のImaxを100nMで示した。APGv4は、2.8nMのIC50及び116%のImaxを100nMで示した(図25を参照のこと)。血餅溶解データを以下の表
33にまとめる。
PAI-1の中和に対する抗体A44V11の効果を、肺細胞ベースの系で調べた。TGFβは、最も協力で広範な線維形成促進性サイトカインであると考えられた。TGFβは、PAI-1発現を誘導し、そしてt-PA及びプラスミンの活性、さらには培養されたマウス胚線維芽細胞(NIH3T3細胞)におけるコラーゲン分解を誘導することが示された。Liu、R-M. Antioxid Redox Signal. 10(2): 303-319 (2008)を参照のこと。ATCC (Manassas、Virginia)からの初代肺
線維芽細胞系統LL29(CCL-134)及びLL97A(CCL-191)を、12ウェルプレートで1ウェルあたり200,000細胞で終夜プレーティングした。細胞を、A44V11抗体又はアイソタイプコントロ
ール(IgG)及びTGFβ(R&D Systems、Minneapolis、Minn.、カタログ番号100-B-001)とともに5ng/mlの濃度で48時間インキュベートした。48時間後、細胞上清を採取し、そしてウェスタンブロットによりPAI-1形態の検出のためにウサギpAb抗PAI-1(abcam、ab66705)
を用いて分析した。
た細胞は、この二重線形成を示さない(図26、レーン6)。この研究は、A44V11での初代ヒ
ト肺細胞の処理が、内因性PAI-1基質コンホメーションを誘導し、これによりPAI-1がプロテアーゼにより切断されることが可能となる。
プラスミンは、線維性組織の主要なタンパク質性成分であるコラーゲンを含む大部分のECMタンパク質を分解することができる酵素であるMMPを活性化する。この点において、プラスミンはしばしばMMPの一般活性化因子として挙げられる(Loskutoff、et al. J. Clin.
Invest. 106(12):1441-43 (2000)を参照のこと)。PAI-1は、プラスミン生成をブロック
し、続いて線維芽細胞アポトーシスを阻害することによりMMP活性化及びマトリックス分
解を減少させる。MMPの活性化を刺激するA44v11の能力を、肺細胞ベースの系で調べた。ATCC (Manassas、Virginia)からの初代肺線維芽細胞LL29(CCL-134)及びLL97A(CCL-191)を
、12ウェルプレートにおいて1ウェルあたり250,000細胞の濃度で終夜プレーティング
した。細胞を48時間A44V11又はアイソタイプコントロール(IgG)及びLys-プラスミノーゲ
ン(Molecular Innovation、カタログ番号HGPG-712)とともに0.1μMの濃度でインキュベー
トした。48時間後、細胞上清を採取し、そして様々なMMP(例えば、MMP-1、2、3、7、8
、9、12、13、及び14を含む)の活性を、Sensolyte 520 Generic MMPアッセイキット(AnaSpec、Fremont、CA、カタログ番号71158)を使用して製造者の指示に従って検出した。
性化を刺激する。この図表は、2つの代表的な別々の実験を示す。A44V11及びプラスミノーゲンで処理された細胞は、陰性IgG1抗体で処理された細胞と比較して、実質的に増加した活性化を示した。この研究は、A44V11がプラスミン媒介現象においてMMPを活性を刺激
するということを実証する。
ブレオマイシンにより誘導される実験的肺線維症は、十分な文献により支持される線維化の十分に研究されたモデルである。肺線維症のこのモデルは、ヒトにおいて見られるものに類似しており、そして潜在的治療剤の効果さらには基本的研究を評価するために使用されている(例えば、Molina-Molina et al. Thorax 61:604-610 (2006)を参照のこと)。
ヒトPAI-1を発現するトランスジェニックマウス(ヒト化PAI-1トランスジェニックマウ
ス)を、マウスPAI-1(SERPINE1)遺伝子CDS(エクソン及びイントロン)(NCBI Ref. No. NM_008871)を対応するヒト野生型PAI-1遺伝子CDS(NCBI参照番号NM_000602.3; NC_000007.13)(Klinger、K.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8548 (1987)を参照のこと)で、
内因性マウスPAI-1遺伝子制御配列の制御下でC57BL/6x129マウス(The Jackson Laboratory、Bar Harbor、Maine)において置き換えることにより生成した。分子クローニング及びトランスジェニックマウスの生成は、従来の技術に従って、そして製造者及びブリーダーの指示に従って行われた。ヒトPAI-1の発現及びマウスPAI-1の非発現は接合マウスにおいて確認された。mRNA及びタンパク質レベルの両方が、それぞれ標準的qPCR及びELISAによ
り確認された。8~9週齢体重22~25gの雌性接合ヒト化PAI-1トランスジェニックマウス
を、これらの手順に使用した。齧歯動物食餌及び水を自由に与えた。
に0.9% NaCl 50μlを投与した。これらの手順のために、マウスをイソフルラン(TEM、Lormont、France)で吸入により麻酔し、次いで18Gカニューレを挿管した。カニューレを酸
素/イソフルラン混合物を供給した人工呼吸器に接続して麻酔を維持した。麻酔後に、microsprayerをブレオマイシン注入のために肺に直接カニューレで導入した。次いでマウス
を抜管して麻酔から回復させた。4日目に、3つの群で無作為化した後、PBS中10mg/kg(1mg/ml)でのA44v11又は陰性対照マウスIgG1のいずれかの腹腔内投与により1回処置した。
の心臓内採取により血液収集を行った。左気管支をクランプし、そして左肺を取り出し、組織学的分析のために制御された圧力下で固定器(FineFix(R)、Leica Biosystems、Buffalo Grove、IL)を用いて固定した。次いでカニューレを、気管支肺胞洗浄(BAL)手技(0.9%NaCl 1.5mlを注入し、そして0.5mlの3回の注射で回収)のために気管中に配置した。次いで右肺の4つの葉を採取し、2つに切り、そしてタンパク質分析のために溶解した。全ての実験は欧州倫理法(European ethical lows)に従って行われ、内部倫理礼譲(internal ethical comity)(CEPAL、sanofi)により認められた。
ion、カタログ番号HPAIKT)を使用して決定し、そしてスルホタグ標識された二次抗マウスIgGを使用して検出した(MesoScale Discovery、Gaithersburg、Maryland)。7日間、マウ
スをA44V11で処置し、結果は血漿中200nM、BALF中11nM、そして肺溶解物中12nMであった
。
マイシンチャレンジの7日後に屠殺された動物におけるBAL液及び肺溶解物の阻害におい
てヒト活性PAI-1のほとんど完全な阻害を達成した。9日目の動物について、A44V11(10mg/kg)は肺溶解物においてヒト活性PAI-1のほとんど完全な阻害を達成するが、BALFにおい
て部分的な阻害しか達成しなかった。
を除いて、上記の薬力学研究と類似したプロトコルをマウスに受けさせた。ブレオマイシンチャレンジ後21日目に、動物を上記のように屠殺した。
阻害された右肺重量の増加を誘導する。IgG1陰性対照抗体を使用した繰り返し投薬は、ブレオマイシンチャレンジに起因する右肺重量の増加を阻害しなかった。A44V11処置マウスにおけるブレオマイシン誘導右肺重量増加の減少は、IgG1陰性対照抗体で処置された同様のブレオマイシン誘導マウスと比較した場合に、統計的に有意であった(p<0.001)。統計
分析を、1要因ANOVA、続いてNewman-Keuls検定により行った。この結果は、A44V11がヒ
ト化PAI-1マウス肺におけるブレオマイシン誘導線維症を阻害するが、対照IgG1抗体は阻
害しないということを示す。
Invest. 106(11):1341-1350 (2000)で詳述される。手短には、肺組織を酸性条件(6M HCl)下で22時間105℃にて加水分解し、続いてエバポレートすることにより準備した。第一級アミンは、OPA(フタルアルデヒド)により肺組織においてブロックされ、そしてプロリ
ン/ヒドロキシプロリンは、NBD(4-クロロ-7-ニトロベンゾフラザン)(Santa Cruz Biotech.、Santa Cruz、CA)を使用して特異的に標識された。次いで加水分解産物を、SynergiTM 4 μm Hydro-RP 80Å、LC Column 150x3mmカラム(Phenomenex、Torrance、CA、カタログ番号00F-4375-Y0)でHPLC(Shimazu Corp.、Kyoto、Japan)をアセトニトリルグラジエント
下で分離した。既知の量のヒドロキシプロリンの標準曲線を、ピークを定量するために参照として使用した。定量されたデータの代表を図31に示す。
レンジ動物において増加した。肺コラーゲン蓄積のこの増加は、of 10mg/kgでのA44V11抗体の繰り返し投薬により統計的に減少した(p<0.08)(図31を参照のこと)。IgG1陰性対照抗体を使用した繰り返し投薬は、ブレオマイシンチャレンジに起因する肺コラーゲン蓄積の増加を阻害しなかった。A44V11処置マウスにおけるブレオマイシン誘導コラーゲン蓄積増加の減少は、IgG1陰性対照抗体で処置された同様のブレオマイシン誘導マウスと比較した場合に統計的に有意であった(p<0.05)。A44V11処置マウスは、IgG1対照処置マウスよりも約44%少ない、コラーゲン蓄積の増加を示した。
サルにおける急性リポ多糖(LPS)チャレンジモデルを、インビボでのA44V11のPAI-1中和有効性を決定するために適用した。LPSチャレンジモデルは、Hattori、et al. J Clin Invest. 106(11):1341-1350 (2000)に記載されている。サル血漿及び肝臓サンプルにおけるA44V11 mAbのPAI-1に対する活性を評価した。具体的には、実験は、A44V11(5mg/kg、IP)
又はIgG1(陰性対照、5mg/kg、腹腔内投与)のいずれかで予め処置された(24時間前)麻酔したサルにおけるPAI-1の血漿及び組織レベルに対する高容量のLPS(100μg/kg-IV)の影響を評価するように設計された。実験は欧州倫理法(European ethical lows)に従って行
われ、内部倫理礼譲(internal ethical comity)(CEPAL、sanofi)により認められた。
ラン(1~3%)の気体混合物の吸入を含んでいた。サルの体温を加熱パッドを使用して生理
的範囲内に維持した。カテーテル挿入後、LPS(Serotype 0127-B8)を、副橈側皮静脈(cephalic accessory vein)において1分のボーラスとして100μg/kg(0.4 mL/kg)の用量で投
与した。様々な時点で、血液サンプル及び肝臓サンプルを採取した。血液サンプル(クエ
ン酸/EDTA)を採取し、そして遠心分離して血小板欠乏血漿を単離した。肝臓生検及び終末剖検(terminal necropsy)を-80℃で貯蔵した。
後に強く増加した血漿中の活性PAI-1レベルを減少させない(図32(B)を参照のこと)。
導した。(図33(B)を参照のこと)。
比較した場合、プラスミン-α2抗プラスミン(PAP)複合体の増加したレベルを示した。(図35(A)及び(B)を参照のこと)。PAP複合体及びD-ダイマーのA44V11の存在下での増加は、プラスミン生成の増加を示す。
抗PAI-1抗体A44V11での処置の癒着形成に対する効果を、外科的傷害のマウス子宮角モ
デルにおいて評価した。マウス子宮角接近(approximation)及び電気焼灼手技は、漿膜
表面を分断し、子宮組織に熱損傷を引き起こし、そして治癒プロセスの間に損傷組織表面に接近し、これが最終的に未処置の動物の100%において術後癒着を生じる。モデル及び手術手順は、Haney A.F. et al.、(1993). Fertility and Sterility、60(3): 550-558に以前に記載されている。
重約20gのヒト化トランスジェニック雌性マウスを使用した。42匹の成熟トランスジェニック雌性マウスを2つの群に分け、そしてHaney A.F. et al.、(1993)に詳細に記載さ
れるように、子宮角(UH)の間に癒着を生じるように設計された外科手技にかけた。手短には、各動物をIACUCガイドラインに従って手術のためにイソフルランで麻酔し、そして所
定の正中開腹術(midline laparotomy)を、剣状突起(xyphoid process)に対して約1.0cm尾側に行った。UHを確認し、筋肉壁を通して注意深く配置された各角の1つの7-0Prolene縫合(Ethicon Inc.、Somerville、N.J)を用いて内側に接近させ、そして角を子宮卵管
境界(uterotubal junction)にて卵管接合部のすぐ下で一緒に結んだ。卵巣脈管供給を
損傷しないように注意した。電気焼灼損傷を誘導するために、双極電気焼灼器ユニット(Valley Lab Surgistat、Solid state Electrosurgery Unit、モデル番号B-20)を約2x6mmの領域にわたって各子宮角の内側表面に使用した。焼灼器ユニットを以下のように設定した:ボルト100、130Hz、50-60アンペア。3mm幅の焼灼器先端を、3に設定した純粋な凝固電
流で使用し、電圧供給(power)を開始し、そして1つの角あたり2つの熱傷スポットで1秒間接触させた。筋肉切開を5-0 Vicryl、BV-1テーパー針(Ethicon Inc.)を用いて連続縫合パターンで閉じた。皮膚を5-0 Prolene、BV-1テーパー針(Ethicon Inc.)を用いて水平
マットレス縫合パターンで閉じた。
抗体(30mg/kg)で処置した。各群について、動物を6時間(n=5)、72時間(n=4)、又は7日目(n=12)に安楽死させた。(以下の表34を参照のこと)。72時間と7日目に安楽死の予定を
入れていた動物には、手術の48時間後に抗体の第二の用量(30mg/kg)を腹腔内(IP)注射
した。
示された時点に動物を安楽死させ、そして癒着の形成を評価した。手短には、角の長さを、子宮分岐(uterine bifurcation)から卵管の直下に配置した接近縫合までで測定し
た。子宮角を囲む2つの外部縫合を除去し、そして子宮角間の癒着の長さを、顕微鏡を用いて測定し、文書で記録し、そして存在又は不在(有り/無し)として書き留めた。また、癒着形成に含まれるいずれの組織も記録するが、付着領域の長さには含まれないかもしれない。子宮角間の付着した長さの平均パーセントの分布を、Shapiro-Wilk検定を使用して正常性についてチェックした。これらの群を、正常に分布していた場合はTukey Kramer分析を使用して、そして正常に分布していなかった場合はWilcoxon順位和分析を使用して互いに比較した。全ての場合において、p値≦0.05を統計的に有意とみなした。A44V11で
処置された動物は、接近した子宮角間の癒着形成の長さの有意に低いパーセントを示した(表35を参照のこと)。
安楽死後に、評価のために動物の血液(血漿)、腹腔内液(IPF)、及び子宮角サンプルを
集めた。サンプル収集は従来の技術を使用して行った。血漿、IPF、及び子宮角サンプル
を、活性PAI-1及びtPAレベルについてELISAを使用して評価した。(Human PAI-1 Activity
ELISAキット、カタログ番号HPAIKT、Molecular Innovations、Novi、MI)。データをExcel、JMP、及びPrism Graphパッドソフトウェアを使用して処理した。全ての場合において
、p値≦0.05を統計的に有意とみなした。6時間及び7日の時点で、減少したレベルの活性
PAI-1が、アイソタイプ対照に対してA44V11で処置された動物において腹腔内(IP)液及
び子宮角溶解物において見られた。(図36を参照のこと)。アイソタイプ対照に対して、IPF中6時間での減少したレベルの活性PAI-1は、A44で処置された動物においてIP液中6時間
の時点で示された統計的に有意な結果であった。(スチューデントt検定によりp<0.001)。
Fab A44V11の発現及び精製
組み換えFab(rFab)を、一過性トランスフェクトしたHEK293細胞から、軽鎖又はC末端Hisタグ化重鎖をコードする2つのプラスミドを使用して得た。遠心分離及びフィルタリン
グ後に、細胞上清からのrFabを固定化金属親和性樹脂に適用した。樹脂から溶出した後、rFabをPBSに対して広く透析して4℃で貯蔵した。
組み換え成熟カニクイザルPAI-1(24-402)を、E. coliにおいて封入体として発現させ、そして組み換えタンパク質を従来の方法を使用して精製した。
組み換え成熟ヒトPAI-1(24-402)をMolecular Innovations Inc.(カタログ番号CPAI)から購入した。これをBerkenpasら(1995、EMBO J.、14、2969-2977)により記載されるよう
に、変異(N150H、K154T、Q319L、M354I)を導入することにより活性コンホメーションで安定化させた。
組み換えFab及び抗原を、1.5:1のモル比で混合し、30分間室温でインキュベートし、そして複合体を、25mM MES pH6.5、150mM NaClで平衡化したSuperdex 200 PGカラム(GE Healthcare)で分取サイズ排除によりさらに精製した。
複合体を、10mg/mlまで25mM MES pH6.5、150mM NaCl中で濃縮した。16~24%エタノール、100mM Tris pH8.5中で結晶化した。エチレングリコール(30%)を凍結保護物質として使
用した。結晶は、3.3Åに空間群P321(a=b=193Å、c=144Å)でESRFのID29ビームライン(beamline)で回折した。データをXDS及びScala(GlobalPhasing Ltd.、Cambridge、UK)の組み合わせで処理した。
Fab可変ドメインのモデルを、Maestro (Schrodinger、New York、NY)においてPrimeを
使用して構築した。定常ドメインを、公開された構造3FO2から得た。ヒトPAI-1の2つの
異なるモデルを使用した:潜在コンホメーションを1LJ5から得、活性コンホメーションを1OC0から得た。Matthews計数(VM、タンパク質分子量の単位あたりの結晶体積)の計算は、非対称単位中に4つまでの複合体が存在することを示唆する(VM 2. 2により90キロダルトン(KD)の複合体サイズが推測される)。分子置換をPhaser(CCP4 suite)(McCoy、et al. J. Appl. Cryst.40: 658-674 (2007)を使用して行い、これは潜在PAI-1の2つのモノマー
及びFabの2つの可変ドメインを同定した。さらなる密度は定常ドメインについて明らか
に現れ、これは手動で配置されなければならなかった。4.3のVM(71%溶媒)に対応するこの解を、充填の一貫性についても注意深く調べた。構造をBuster(GlobalPhasing)を用いて
非結晶学的対称性を使用してRfree29.2%(Rfactor 25.8%)まで精密化した。定常ドメイン
は、結晶充填により安定化されず、そして電子密度マップにおいて不十分に分解された。
タンパク質結晶化は、x線結晶学法による生体分子構造決定の障害である。タンパク質結晶化の成功は、結晶化実験において使用されるタンパク質分子の品質に直接比例し、この場合、最も重要な品質基準は溶液中のタンパク質の純度及び均一性(分子及びコンホメーションの両方)である。
℃で800の個々の結晶化条件下で結晶化のためにスクリーニングした。結晶化にヒットすつものは検出されなかった。タンパク質複合体均一性を改善するために、組み換え6-Hisタグ化Fab A44を製造し、生成し、そしてヒト野生型PAI-1タンパク質と複合体化させた
(図36を参照のこと)。
結晶化ヒットという結果となった。従来の結晶化法による結晶化最適化、マイクロシードマトリックスシーディング(Microseed Matrix Seeding)、及びインサイチュトリプシン分解(Trypsinolysis)結晶化は、結晶の質を有意に改善しなかった。最も良好な得られ
た結晶は針状であり、構造決定には不十分な分解能(10Å)でx線を回折した。
前に使用した条件下で新たに結晶化についてスクリーニングした。試験した1000を超える条件からの唯一の結晶化ヒットは、20% PEG3350+0.2M nH4アセテート+4% MPD+50mM Mes pH6の条件下の複合体について同定された(図39(a)を参照のこと)。広範の最適化後に
、3D結晶を得た。シンクロトロン高強度X線ビームを使用したX線回折試験は、回折の証拠を示さなかった(図39(b)を参照のこと、代表的な最適化された結晶を示す)。
り製造することを決定したが、以前に使用した6-Hisのような人工的なタグは用いなかっ
た。首尾良い結晶化のための機会をさらに増やすために、PAI-1の活性形態変異体(N150H
、K154T、Q319L、M354I)をMolecular Innovations(カタログ番号CPAI、Novi、MI)から購
入し、そして人工タグを欠いたFab A44タンパク質との複合体製造のために使用した。複
合体を25mM MES pH 6.5、150mM NaCl中12mg/mlに濃縮した。許容しうる棒状の単結晶を10
% PEG3350、100mM硫酸アンモニウムで得て、30%エチレングリコールを加えることにより凍結保護した(図40を参照のこと)。これらの結晶は、3.7Åに回折し、そして広範な凍結
保護最適化後に、構造決定に適したx線回折データセットを得た(3.3Å)。データセット
をシンクロトロンSOLEIL(Saint-Aubin、France)のビームラインProxima 1で3.3Åまでデ
ータセットを集めた。空間群はP212121 (a=105、b=152 c=298)。データをXDSmeスクリプ
ト(XDS ref、Xdsme ref)を使用して処理した。
Pointless(CCP4)は、空間群認識において40%の信頼性しか示さなかった。結果として、最初の分子置換をAmore(CCP4)を用いて行い、P222点群の全ての可能な空間群変形を試験
した:P212121は明確に確認された。Phaser (Phaser、CCP4)を用いた最終分子置換は、対
称性単位においてFabの活性PAI-1/可変ドメインの4つのダイマーを同定した。定常ドメ
インを電子密度マップに手動で加えた。構造をBuster(GlobalPhasing)を用いて非結晶学
的対称性を使用して、Rfree 28%(Rfactor 24.1%)まで精密化した。
エピトープ及びパラトープ領域を、カニクイザル及びヒト複合体において形成されたと同定し、これらの複合体を比較した。結晶構造を、ヒト及びカニクイザルPAI-1との複合
体のA44V11について3.3Åまで決定した。両方の構造の重ねあわせ(図40を参照のこと)は
、A44V11のパラトープがPAI-1の潜在形態及び活性形態の両方に類似しているということ
を示す。Fab A44は、ヒトPAI-1の活性形態及びカニクイザルPAI-1の潜在形態を認識した
。図42は、活性ヒトPAI-1(図42(A))、及び潜在カニクイザルPAI-1(図42(B))の両方においてFab A44により認識されるPAI-1エピトープを示す。パラトープ認識潜在コンホメーションは、活性コンホメーションを認識するパラトープの一部である。
する。活性ヒトPAI-1と重鎖との相互作用の表面積(4つの複合体の平均)は674Å2である
。活性ヒトPAI-1と軽鎖との間の相互作用の表面積(4つの複合体の平均)は372Å2である
。潜在カニクイザルPAI-1と重鎖との間の表面積(2つの複合体の平均)は703Å2である。
潜在カニクイザルPAI-1と軽鎖都の間の相互作用の表面積(2つの複合体の平均)は360Å2
である。重鎖及び軽鎖のパラトープの描写についてはそれぞれ図43及び44を参照のこと。
互作用に関与するが潜在形態とは関与せず、一方下線を引いた残基は潜在形態とだけ相互作用している。全ての他の残基は両方の接触面に関与する。
E-X-X-Q (配列番号156);
L-X-R (配列番号157);
T-D-X-X-R-Q-F-Q-A-D-F-T-X-X-S-D-Q-E-P-L (配列番号158)
ンホメーションにおいて同一である。Fab A44はヒト及びカニクイザルPAI-1の両方を認識するが、マウスPAI-1もラットPAI-1も認識しないようである。
A44V11の特異性及び反応性を決定するために、A44V11エピトープの配列(上記参照)を使用して、ScanProsite (SIB Swiss Institute of Bioinformatics)データベースを用いた
モチーフ検索を使用して他のタンパク質中の類似したエピトープを検索した。さらなる詳細については、Artimo、P. et al. Nucleic Acids Res. 40(W1):W597-603 (2012)を参照のこと。検索において見つけられた全てのエピトープ配列マッチはPAI-1に関連付けられ
、A44V11抗体がPAI-1に特異的であることを示唆した。
荷、疎水性及び芳香族基を含む、タンパク質表面上の生化学的昨日を検出及び比較する。Med-SuMo分子モデリングは、Jambon、et al. Bioinformatics 21(20):3929-30 (2005)に
おいてさらに記載される。A44V11エピトープの3D検索は、ヒトアルファ-1-抗トリプシン(AAT1)中の類似したモチーフを突き止めた。しかし、さらなる調査の際に、AAT1モチーフ
はA44V11エピトープとの間に、A44V11が結合しないような有意な差異を有することがわかった。従って、A44V11エピトープの配列パターン及び3Dパターン分析は、他のヒトタン
パク質との最少の交差反応性があるだろうということを示唆する。
も認識しないようであるということを示唆する(図45を参照のこと)。例えば、マウスPAI-1アミノ酸Ser300、Thr302、Gln314は、ヒト/カニクイザルPAI-1対応物と異なる。これら
の残基における差異は、マウスPAI-1はA44V11によって認識されることができないような
、提案されたエピトープにおける変化を表す。複合体ヒトPAI-1/A44V11の構造とのマウス
PAI-1の構造比較(図46)は、A44V11抗体からヒト及びマウス活性の両方を得ることは不可
能だろうということをさらに示す。
クチン(vibronectin)のソマトメジンBドメインとの複合体のヒトPAI1の構造は公開されている(1OC0)。これら2つの複合体の構造を比較した(図47を参照のこと)。構造比較は、A44V11の結合がビブロネクチンとのPAI-1の相互作用に影響を及ぼさないことを示唆する
。
らは128~156領域の残基に結合する(Debrock et al. Thromb Haemost、79:597-601 (1998))。
有配列及びA44V11エピトープの3D構造に基づいて、分子モデル研究は、A44V11がヒト及びカニクイザルPAI-1に特異的であることを強く示す。
質量分析(MS)によりモニタリングした水素/重水素交換(HDX)を、本明細書に開示されるPAI-1結合抗体に適用して、各抗体のエピトープをさらに特徴付けした。 HDX MSは、同じタンパク質の多数の状態を比較するために特に有用な技術である。タンパク質治療学へのHDX MSの詳細な方法論及び応用は、Wei、et al.、Drug Discovery Today、19(1): 95-102
(2014)に開示される。手短には、水性、全-H2O 溶媒が独特の分光学的特性を有する水素の同位体で置き換えられる場合、この交換プロセスに従うことができる。最も最新のHDX
実験には、重水素化又は「重」水(D2O)が使用される。特に、骨格窒素に結合された水素(骨格アミド水素とも呼ばれる)は、タンパク質コンホメーションを調べるために有用であ
る。例えば、Marcsisin、et al. Anal Bioanal Chem. 397(3): 967-972 (2010)を参照の
こと。タンパク質の露出した動的領域は、速く交換し、保護された柔軟性のない領域はより遅く交換する。全ての関連する状態(pH、温度、イオン強度など)は一定に維持される
ので、構造の差異のみ(溶媒接近性、水素結合)がこの交換に影響を及ぼす。抗体とPAI-1との相互作用は、抗原の特定の部分の標識をブロックし、従って結合の部位(エピトープ)に基づく異なる読み出しを生じる。
カニクイザル-PAI-1(10uM)、A44v11に結合したカニクイザル-PAI-1(それぞれ10μm)及
びAPGv2に結合したカニクイザル-PAI-1(それぞれ10μm)をPBS中、pH7.2で準備した。タンパク質溶液を、1時間室温でインキュベートすることにより結合平衡に到達させた。<50pMのKd値に基づいて、抗体:抗原複合体の各々は、以下に記載される標識条件下で>99%結合された。
より標識反応をクエンチした。非重水素化対照を同一のやり方でH2O中PBSで10倍希釈することにより調製した。
質をオンラインで、20℃に保持した2.1mmx30mm Enzymate BEHペプシンカラム(Waters Corp.)を用いて消化した。全てのクロマトグラフィー要素を、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)システムの冷却チャンバ内で0.0±0.1℃に保持した。生じたペプチドを捕捉し、そして3分間100μL/分で脱塩し、次いで1.0x100.0 mm ACQUITY UPLC HSS T3カラム(Waters Corp.)で12分、2~40%アセトニトリル:水グラジエントを40μL/分で用いて分離し
た。重水素レベルは、逆交換について補正されず、そして相対的と報告された。全ての比較実験を同一の条件下で、逆交換補正の必要を否定して行った。全ての実験を三連で行った。注入の間のペプチドキャリーオーバーを、1.5Mグアニジン塩酸塩、0.8%ギ酸、及び4%アセトニトリル50μLを各実行後カラム全体に注入することにより除去した。
作されたWaters Synapt G2-Si機器を用いて得た。機器設定は以下のとおりであった:キャピラリーは3.5kVであり、サンプリングコーンは30Vであり、ソースオフセットは30Vであ
り、ソース温度は80℃であり、脱溶媒和温度は175℃であり、コーンガスは50L/時間、脱
溶媒和ガスは600L/hであり、そしてネブライザーガスは6.5barであった。質量スペクトルを50~1700のm/z範囲にわたって得た。質量精度を、ロックマスプローブによる100fmol/uLヒト[Glu1]-フィブリノペプチドBの同時注入により各実行を通して維持した。
オンラインペプシン消化の後、150の重複するカニクイザル-PAI-1消化性ペプチドを同
定し、95.3%の配列包括度を生じた(図48を参照のこと)。重水素取り込みを、3つの異な
るタンパク質の状態について全150ペプチドにおいてモニタリングした(10秒~4時間):(1) カニクイザル-PAI-1単独;(2)カニクイザル-PAI-1に結合したA44v11;及び(3)カニクイザル-PAI-1に結合したAPGv2。
なペプチド領域を示す(残基139~152)。対照的に、 残基44~64を組み込んだペプチドは
、A44v11又はAPGv2のいずれかに結合された場合に交換からの有意な保護(減少した重水
素取り込み)を示した(図49(B))。さらに、残基295~322を組み込んだペプチドもまた、A44v11又はAPGv2のいずれかに結合された場合に交換からの有意な保護を示した(図49(C))
。この領域について、保護の大きさは、カニクイザル-PAI-1がAPGv2よりもむしろA44v11
に結合された場合により大きかった(図49(C)を参照のこと)。このことは、A44v11がカニ
クイザル-PAI-1に結合された場合にAPGv2よりも大きい交換からの全体の保護をもたらし
得るということを示す。
比較研究のために、重水素取り込みを、3つのカニクイザル-PAI-1の状態のそれぞれから生成された150のペプチドの全てについてモニタリングした。(一般的には、Wei、et
al.、Drug Discovery Today、19(1): 95-102 (2014)を参照のこと)。3つの状態のそれ
ぞれからのデータプロットを互いに比較し、そしてデータ解釈を容易にするためにバタフ
ライプロットを生成した(例えば図50(A)、51(A)、及び52(A)を参照のこと)。各バタフライプロットについて、x軸は、比較された150のペプチドのそれぞれの計算されたペプチド中点位置iであり;y軸は平均相対的部分交換(比)である。
重水素取り込みを、他のものから差し引いて、同様にバタフライプロットにプロットした。各ペプチドについての差異の合計を垂直のバーで表す。水平の破線は、個々の測定値(
±0.5Da)又は差異の合計(±1.1Da)のいずれかが測定の誤差を超え、そして2つの状態の
実際の差異とみなされ得る値を表す。この技術に関するさらなる詳細は、Houde D. et al.、J. Pharm. Sci. 100(6):2071-86 (2011)に開示される。
ザル-PAI-1との間の観察された差異は、カニクイザル-PAI-1の2つの領域に主に位置する。1つの領域はN末端に近く(残基44~64)そして他の領域はC末端に近い(残基307~321)(
図50(B)を参照のこと)。
ットを図51(B)に示す。APGv2に結合されたカニクイザル-PAI-1と遊離形態カニクイザル-PAI-1との間の観察された差異は主にカニクイザル-PAI-1の2つの領域に位置している。1つの領域はN末端に近く、そして他方はC末端日欠く、これはA44v11:カニクイザル-PAI-1
の結果と同様である。カニクイザル-PAI-1とのA44v11及びAPGv2複合体は、結合状態にあ
る場合に減少した重水素取り込みを示すペプチドを共有し、これは2つの抗体のエピトープが類似していることを示し得る。
差異はカニクイザル-PAI-1のC末端領域に位置する(図52(B)を参照のこと)。
HDX MSを使用して、A44v11及びAPGv2抗体のエピトープをさらに規定した。HDX MSにお
いて生成された重複ペプチドを使用することにより、抗体エピトープは、ペプチドレベルの解明よりも僅かに良好に精密化され得る(例えば、図48を参照のこと)。A44V11結合と結合して交換からの有意な保護を示したペプチドについてのHDX MSデータをさらに分析して、カニクイザル-PAI-1:A44v11相互作用についてのエピトープを決定した。カニクイザル-PAI-1のA44V11エピトープのHDXデータは、結晶学的アプローチを使用して決定されたエピトープと一致することが見出された。HDX MSを使用して同定されたカニクイザル-PAI-1のA44V11エピトープは図53に示され(太字)、そして以下に略記形式で示される:
T-T-G-G-E-T-R-Q-Q-I-Q (配列番号159);
R-H-L (配列番号160);
T-D-M-X-X-X-F-Q-A-D-F-T-S-L-S-N-Q-E-P-L-H-V (配列番号161)
のHDX MSデータを、カニクイザル-PAI-1:APGv2相互作用についてのエピトープをさらに決定するために分析した。A44v11及びAPGv2についてのHDX MSエピトープマッピングデータ
は、図52に一般的に見られるように、エピトープが同じ領域にあるということを示す。
残基307~321の領域において、同じペプチドは、A44v11及びAPGv2の両方について抗体結
合状態で保護を示す。しかし、保護の大きさは、カニクイザル-PAI-1がAPGv2よりもむし
ろA44v11に結合した場合により高い(図49(C)を参照のこと)。この知見は図52(B)においてより明らかであり、これはカニクイザル-PAI-1の残基307~321領域において差異ピークを示す。これは、カニクイザル-PAI-1とA44V11及びAPGv2抗体のそれぞれとの間の特異的接
触において差異があることを示す。従って、A44V11及びAPGv2の両方のエピトープはPAI-1の類似した領域に位置するが、各抗体についてのエピトープは同じではないようである。
Claims (9)
- 薬学的に有効な量の単離されたモノクローナル抗体を含む、PAI-1の増加した発現又は増加したPAI-1活性に起因する、PAI-1が媒介する疾患を治療するための医薬であって、
前記抗体は、PAI-1に特異的に結合し、
(a)配列番号88又は89のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であって、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、重鎖可変領域;及び
(b)配列番号91、93、94、95、96又は97のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であって、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号36又は配列番号145のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、軽鎖可変領域;
を含む、
前記医薬。 - 前記抗体は、
(a)配列番号88又は89のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であって、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、重鎖可変領域;及び
(b)配列番号91、93、94、95、96又は97のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であって、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号36又は配列番号145のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、軽鎖可変領域;
を含む、
請求項1に記載の医薬。 - 前記抗体は、
(a)配列番号88又は89のアミノ酸配列と少なくとも96%同一であって、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号33のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、重鎖可変領域;及び
(b)配列番号96又は97のアミノ酸配列と少なくとも96%同一であって、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号36又は配列番号145のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、軽鎖可変領域;
を含む、
請求項2に記載の医薬。 - 前記抗体は、
(a)配列番号88又は89のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域;及び
(b)配列番号96又は97のアミノ酸配列と少なくとも96%同一であって、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号36又は配列番号145のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、軽鎖可変領域;
を含む、
請求項3に記載の医薬。 - 前記抗体は、
(a)配列番号89のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域;及び
(b)配列番号97のアミノ酸配列と少なくとも96%同一であって、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR1領域、配列番号36又は配列番号145のアミノ酸配列を含むCDR2領域、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR3領域を含む、軽鎖可変領域;
を含む、
請求項4に記載の医薬。 - 前記抗体は、
(c)配列番号99を含むCH領域、及び/又は配列番号100を含むCL領域
をさらに含む、
請求項1~5のいずれか一項に記載の医薬。 - 前記PAI-1が媒介する疾患は、PAI-1の増加した発現に起因する、請求項1に記載の医薬。
- 前記PAI-1が媒介する疾患は、増加したPAI-1活性に起因する、請求項1に記載の医薬。
- 前記医薬は、患者に、経口的に、注射用液剤により非経口的に、吸入により、又は局所的に投与することができる、請求項1~8のいずれか一項に記載の医薬。
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