ES2585735T3

ES2585735T3 - Nuevas proteínas de fusión y su aplicación para la preparación de vacunas contra la hepatitis C

Info

Publication number: ES2585735T3
Application number: ES09766080.7T
Authority: ES
Inventors: Philippe Roingeard; Christophe Hourioux; Romuald Patient
Original assignee: Universite Francois Rabelais de Tours
Current assignee: Universite de Tours
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2009-06-16
Publication date: 2016-10-07
Anticipated expiration: 2029-06-16
Also published as: EP2285952B1; AU2009261787B2; KR101759812B1; CN105131124A; CA2728233C; TWI450724B; KR20150085128A; CA2728233A1; US20110150921A1; PL2285952T3; BRPI0914846A2; FR2932388B1; CN102112601A; FR2932388A1; MY157396A; CN102112601B; JP2011524178A; US8765143B2; TW201008576A; AR072156A1

Abstract

Proteína de fusión inmunogénica que comprende por lo menos los dos péptidos siguientes: a)- en el lado C-terminal, un primer péptido constituido: - por la secuencia de aminoácidos de la proteína S de un aislado del virus humano de la hepatitis B (HBV), estando dicha proteína S delecionada de su dominio transmembranario situado en su extremo N-terminal, conservando dicha secuencia de aminoácidos la capacidad de formar unas partículas sub-virales no infecciosas inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, o - por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 91%, en particular de por lo menos un 93%, particularmente de por lo menos un 95%, y más particularmente de por lo menos un 97%, con dicha secuencia de aminoácidos de la proteína S delecionada de N-terminal, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, y de que conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales no infecciosas inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, o, - por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha secuencia de aminoácidos de dicha proteína S delecionada, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo Nterminal de la proteína S de HBV, y de que conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales no infecciosas inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, y, b)- en el lado N-terminal, un segundo péptido constituido: - por la secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de por lo menos una proteína de envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C (HCV), o - por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 78%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de una proteína de envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, o - por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de la proteína E1 o E2 de HCV, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, siendo dicha proteína de envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C seleccionada de entre la proteína E1, la proteína E2 o un péptido de fusión que comprende la proteína E1 y la proteína E2.

Description

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imagen4

imagen5

posición C-terminal, presenta la ventaja de inactivar el sitio de escisión de las peptidasas representado en la figura 1 imagen6

por el símbolo

y que es necesario para la maduración de la poliproteína del HCV, pero que es indeseable en el ámbito de las construcciones quiméricas de la presente invención.

5 [1] La invención tiene por objeto una proteína de fusión inmunogénica que comprende por lo menos los dos péptidos siguientes:

a) en el lado C-terminal, un primer péptido constituido:

10 -por la secuencia de aminoácidos de la proteína S de un aislado del virus humano de la hepatitis B (HBV), proteína S que está delecionada de su dominio transmembranario situado en su extremo N-terminal, conservando dicha secuencia de aminoácidos la capacidad de formar unas partículas sub-virales no infecciosas inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, o

15 -por una secuencia de aminoácidos que presentan un porcentaje de identidad de por lo menos un 91%, en particular de por lo menos un 93%, particularmente de por lo menos un 95%, y más particularmente de por lo menos un 97%, con dicha secuencia de aminoácidos de la proteína S delecionada deextremo N, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, y que conserve la capacidad

20 de formar unas partículas sub-virales no infecciosas, inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, o

-por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha secuencia de aminoácidos de la proteína S delecionada, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante

25 sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, y que conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales no infecciosas, inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, y

b) en el lado N-terminal, un segundo péptido constituido: 30 -por la secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de por lo menos una proteína de envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C (HCV), o

-por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 78%, en

35 particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de una proteína de un aislado del virus de la hepatitis C, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario, la capacidad para formar unas partículas sub-virales no infecciosas, y las propiedades inmunogénicas frente al virus de

40 la hepatitis C, o

-por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de la proteína E1 o E2 de HCV, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las

45 propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, siendo dicha proteína de envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C seleccionada de entre la proteína E1, la proteína E2, o un péptido de fusión que comprende la proteína E1 y la proteína E2.

El objeto de la presente invención se refiere en particular a una proteína de fusión que comprende por lo menos:

50 -por un lado, la proteína S de HBV delecionada (Sd), esencialmente constituida por sus tres dominios transmembranarios situados en el extremo C-terminal (figuras 2A y 3A), conservando dicha proteína S delecionada la capacidad de ensamblaje en partículas sub-virales, y conservando las propiedades inmunogénicas contra el virus HBV humano, y

55 -por otro lado, la casi totalidad de la secuencia de una de las proteínas E1 y E2, que conservan también las propiedades inmunogénicas contra el virus HCV,

de manera que dicha proteína de fusión, representada en particular por las figuras 3B o 3C, sea capaz de

60 ensamblarse en partículas sub-virales, en presencia de la proteína S salvaje, y sea susceptible de inducir una inmunización contra los virus HBV y/o HCV, y en particular inducir una doble inmunización contra los virus HBV y HCV.

[1a] Ventajosamente, la presente invención tiene por objeto una proteína de fusión inmunogénica antes mencionada, 65 que comprende en el extremo N-terminal de dicho segundo péptido (E1 o E2) un tercer péptido constituido por la

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secuencia de aminoácidos de un péptido de iniciación de transferencia (PIT) de un aislado del virus de la hepatitis C.

Se entiende por "péptido de iniciación de transferencia" una proteína E1 o E2 (respectivamente PIT1 o PIT2) o de una proteína de fusión según la invención,

* el fragmento peptídico de la poliproteína del virus HCV, y en particular del aislado HCV-1a, localizado en la región comprendida:

- del aminoácido en la posición 166 al de la posición 191 en lo que se refiere a la proteína E1, y

- del aminoácido en la posición 366 al de la posición 383 en lo que se refiere a la proteína E2, o

*: la variante natural procedente de un aislado del virus HCV, o la variante sintética de dicho fragmento peptídico antes mencionado, o

*: cualquier fragmento peptídico injertado en el extremo N-terminal de dicho segundo péptido,

con la condición de que dicho fragmento peptídico, cuando constituye una parte de la proteína de fusión de la presente invención, conserva la capacidad de dirigir, después de la traducción, dicha proteína de fusión al retículo endoplásmico de manera que sea correctamente glicosilada y que su conformación tridimensional, y/o sus calidades antigénicas, sean lo mejor conservadas posible frente a proteínas salvajes.

[2] Según otro aspecto particularmente ventajoso, la presente invención tiene por objeto una proteína de fusión inmunogénica antes mencionada, en la que el segundo péptido situado en el lado N-terminal, está constituido:

-por la totalidad de la secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de la proteína de envoltura E1, o

-por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 75%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90% con dicha secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de la proteína de envoltura E1, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, o

-por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha proteína E1; con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C.

Un objeto particular de la invención reside en la proteína de fusión E1-Sd, de la cual se encuentra una representación esquemática en la figura 3B, y que comprende la casi totalidad de la proteína E1 del HCV, injertada en el extremo N-terminal de la proteína S delecionada de HBV.

(3). Ventajosamente, la presente invención tiene particularmente por objeto una proteína de fusión inmunogénica antes mencionada en la que el segundo péptido situado en el lado N-terminal, está constituido:

-por la totalidad de la secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de la proteína de envoltura E2, o

-por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 78%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de la proteína de envoltura E2, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, o

-por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha proteína E2, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C.

Un objeto particular de la invención reside en la proteína de fusión E2-Sd, de la cual se encuentra una representación esquemática en la figura 3C, y que comprende la casi totalidad de la proteína E2 de HCV, injertada en el extremo N-terminal de la proteína S delecionada de HBV.

(3b). En este aspecto, la invención se refiere más particularmente a una proteína de fusión inmunogénica tal como se reivindica, y que comprende los tres péptidos siguientes:

a)-en el lado C-terminal, un primer péptido constituido:

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constituyen la proteína de fusión inmunogénica son contiguos, y el extremo C-terminal del segundo péptido está unido de manera covalente al extremo N-terminal del primer péptido.

Ventajosamente, según la invención, las proteínas E1 o E2 del virus HCV, o los fragmentos de una proteína de 5 fusión de la invención PIT1-E1, PIT2-E2, E1-E2, o PIT1-E1-E2 están unidos de manera covalente y contigua a la proteína S delecionada del virus HBV.

Según otro aspecto ventajoso de la invención, un péptido de unión une el primer y el segundo péptido que constituyen la proteína de fusión antes mencionada, estando dicho péptido de unión constituido por el aminoácido, o por 2 aminoácidos, o por 3 aminoácidos, o por 4 aminoácidos, o por 5 aminoácidos; con la condición de que dicha proteína de fusión inmunogénica conserve la capacidad de ensamblarse en partículas sub-virales, en presencia de la proteína S salvaje, y las propiedades inmunogénicas frente al virus HCV, o el virus HBV, o los virus HCV y HBV.

(5). La invención tiene también por objeto particular, una proteína de fusión inmunogénica antes mencionada, en la 15 que el primer péptido en la posición C-terminal está constituido:

-por una secuencia de aminoácidos delimitada por los aminoácidos contiguos situados en la región comprendida desde el aminoácido en la posición 23 al de la posición 226 de la proteína S del virus HBV, y particularmente del aislado HBV adw,

y en particular por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 2, conservando dicha secuencia de aminoácidos la capacidad de formar unas partículas sub-virales no infecciosas inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, o

25 -por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 91%, en particular de por lo menos un 93%, particularmente de por lo menos un 95%, y más particularmente de por lo menos un 97%, con dicha secuencia de aminoácidos contiguos de la proteína S, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, y que conserve la capacidad de formar unas partículas subvirales no infecciosas, inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B, o

-por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética, derivada de dicha secuencia de aminoácidos de la proteína S, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante natural o sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de

35 HBV, y que conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales no infecciosas, inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B.

Un objeto más particular de la invención reside en la proteína de fusión E1-Sd o E2-Sd, o E1-E2-Sd, para la cual la proteína S delecionada es la del aislado HBVadw y tiene por secuencia la SEC ID nº 2 (véase la tabla 1).

(6). La invención tiene también por objeto particular una proteína de fusión inmunogénica antes mencionada, en la que el segundo péptido en la posición N-terminal está constituido:

-por una secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de una proteína de

45 envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C (HCV) y delimitada por los aminoácidos contiguos situados en la región comprendida desde el aminoácido en la posición 192 al de la en la posición 380 de la proteína E1 de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a, y en particular de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 4, o

-por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 75%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de aminoácidos contiguos de la citada proteína E1, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, o

55 -por la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha secuencia de aminoácidos contiguos del dominio transmembranario y del ectodominio de dicha proteína E1, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C.

La invención tiene también por objeto particular, una proteína de fusión para la cual la secuencia de proteína E1 procede del aislado HCV-1a, y corresponde específicamente a la región antes mencionada, tal como, en particular, las proteínas de fusión E1-Sd de SEC ID nº 4 o E1-E2-Sd, PIT1-E1-E2-Sd (véase la tabla 1).

65 (7) La invención se refiere particularmente a una proteína de fusión inmunogénica mencionada anteriormente, en la que el primer y el segundo péptido son contiguos, estando dicha proteína de fusión constituida por:

10

-la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 8, o

-una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 88%, en

5 particular de por lo menos un 90%, particularmente de por lo menos un 92%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con SEC ID nº 8, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente a HCV y/o frente a HBV humano, o

-la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha secuencia SEC ID nº 8, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las

15 propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y que conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente a HCV y/o frente a HBV humano.

La invención tiene también por objeto una proteína de fusión E1-Sd para la cual la secuencia de proteína E1 procede del aislado HCV-1a, y está dotada de la secuencia SEC ID nº 8 mencionada anteriormente, correspondiendo dicha secuencia a la SEC ID nº 2 de Sd, injertada secuencia arriba de la SEC ID nº 4 de E1.

(7b). En este aspecto, la invención tiene más particularmente por objeto una proteína de fusión inmunogénica antes mencionada, que comprende un tercer péptido de inicio de transferencia situado en el lado N-terminal del segundo

25 péptido, estando dicha proteína de fusión representada por:

-la SEC ID nº 12, o

-una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de identidad de por lo menos un 83%, en particular de por lo menos un 85%, particularmente de por lo menos un 90%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con dicha SEC ID nº 12, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y que conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus

35 de la hepatitis B humano y/o frente al virus de la hepatitis C, o

-de la secuencia de aminoácidos de una variante sintética derivada de dicha SEQ ID n°12, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus de la hepatitis B humano y/o frente al virus de la hepatitis C.

La invención tiene también por objeto una proteína de fusión PIT1-E1-Sd para la cual la secuencia de proteína E1

45 procede de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a, y está dotada de la secuencia SEQ ID n°12 mencionada anteriormente, correspondiendo dicha secuencia a la SEC ID nº 2 de Sd, injertada en el extremo N-terminal de la SEC ID nº 4 de E1, ella misma injertada en N-terminal de la secuencia de aminoácidos del péptido de inicio de transferencia de la proteína E1 (PIT1) comprendido en la región constituida desde el aminoácido en la posición 166 al de la posición 191 de HCV.

La inserción de un péptido de inicio de transferencia en el extremo N-terminal de la proteína de fusión E1-Sd mencionada anteriormente tiene como ventaja particular dirigir esta última una vez traducida al retículo endoplásmico, de manera que esté correctamente glicosilada y que su conformación tridimensional y/o que sus cualidades antigénicas no presenten alteración sustancial frente a proteínas salvajes.

55 (8). La invención tiene también por objeto una proteína de fusión inmunogénica antes mencionada, en la que el segundo péptido en la posición N-terminal está constituido:

-por una secuencia de aminoácidos del dominio transmembranario y del ectodominio de una proteína de envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C (HCV) y delimitada por los aminoácidos contiguos situados desde el aminoácido en la posición 384 al de la posición 743 de la proteína E2 de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a,

-y en particular por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 6, o

65 -por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 78%, en

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Preferentemente, el promotor utilizado en el vector Semliki y el vector lentiviral utilizados como vector de expresión, es un promotor homólogo y es un promotor del citomegolovirus (CMV).

Unos ejemplos no limitativos de promotores heterólogos comprenden en particular (i) los promotores virales tales como el promotor SV40 (Virus simien 40), el promotor del gen de la timidina-cinasa del virus simplex del herpes (TK-HSV-1), el LTR del virus de la sarcoma de Rous (RSV), el promotor del citomegolovirus (CMV) y el promotor último mayor adenoviral (MLP), así como (ii) cualquier promotor celular que controla la transcripción de los genes que codifican para unos péptidos en eucariotas superiores, tal como el promotor del gen de fosfoglicerato-cinasa (PGK) constitutivo (Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74), el promotor de los genes específicos del hígado alfal-antitripsina y FIX y el promotor SM22 específico de las células del músculo liso (Moessler et al., 1996, Development, 122: 24152425).

La invención se refiere particularmente a un vector antes mencionado, que comprende además un vector lentiviral

Un vector lentiviral mencionado anteriormente, puede ser el vector pLenti.

Este último se ha descrito antes particularmente por Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., y Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263-7.

La invención tiene también por objeto un vector mencionado anteriormente, que comprende además un vector viral defectivo derivado del genoma del virus del bosque Semliki.

Estos últimos se han descrito antes particularmente por Schlesinger, S., y T. M. Dubensky, Jr. 1999. Alphavirus vectors for gene expression and vaccines. Curr. Opin. Biotechnol. 10:434-439.

La invención tiene en particular por objeto un vector mencionado anteriormente, en el que el vector viral defectivo que deriva del genoma del virus del bosque Semliki es el vector SFV1, siendo este último en particular comercializado por Invitrogen.

Para este propósito, la invención tiene más particularmente por objeto un vector mencionado anteriormente, en el que la molécula de ácidos nucleicos híbrida está constituida:

-por la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 11, o

-por una secuencia de ácidos nucleicos que presenta una homología de por lo menos un 78%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia SEC ID nº 11, con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica para una proteína de fusión capaz de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente a HCV y/o HBV,

-estando dicho vector representado en particular por la SEC ID nº 15, o

-por la secuencia de ácidos nucleicos de una variante sintética derivada de secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 11, con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos codificada para una proteína de fusión capaz de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente a HCV y/o HBV.

La invención tiene también por objeto un vector derivado de pSFV de secuencia SEC ID nº 15, que comprende una molécula de ácidos nucleicos hibrida (en particular pit1-e1-sd de SEC ID nº 11) que codifica para la proteína de fusión mencionada anteriormente (en particular PIT1-E1-Sd de SEC ID nº 12), y para la cual:

-la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína E1 procede de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a, y es la secuencia SEQ ID nº 3 mencionada anteriormente y para la cual

-la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína S procede de HBV, y particularmente del aislado HBVadw, y es la secuencia SEQ ID nº 1 mencionada anteriormente, siendo dicha SEC ID nº 1 injertada en 5' de la SEC ID nº 3 de E1, ella misma injertada en 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el péptido de inicio de transferencia de la proteína E1 (PIT1) comprendido en la región constituida por el ácido nucleico en la posición 837 al de la posición 914 de HCV.

Para ello, la invención tiene más particularmente por objeto uno de los vectores mencionados anteriormente, en el que la molécula de ácidos nucleicos híbrida está constituida:

-por la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 13, o

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-por una secuencia de ácidos nucleicos que presenta una homología de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, más particularmente de por lo menos un 90%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con dicha secuencia SEC ID nº 13, con la condición de que dicha secuencia de ácidos

5 nucleicos codifique para un péptido capaz de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus de HBV y/o HCV,

-estando dicho vector representado en particular por la SEC ID nº 16,

-por la secuencia de ácidos nucleicos de una variante sintética, derivada de dicha SEC ID nº 13, con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos codifique para un péptido capaz de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus de HBV y/o HCV.

La invención tiene también por objeto un vector de SEC ID nº 16, que comprende una molécula de ácidos nucleicos

15 híbrida (en particular pit1-e1-sd de SEC ID nº 13) que codifica para la proteína de fusión mencionada anteriormente (en particular PIT1-E1-Sd de SEC ID nº 14), y para la cual:

-la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína E2 procede de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a, y es la secuencia SEC ID nº 5 mencionada anteriormente, y para la cual

-la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína S procede de HBV, y particularmente del aislado HBVadw, y es la secuencia SEC ID nº 1 mencionada anteriormente,

-siendo dicha SEC ID nº 1 injertada en 5' de la SEC ID nº 5 de E2, ella misma injertada en 5' de la secuencia 25 de ácidos nucleicos que codifica para el péptido de inicio de transferencia de la proteína E2 (PIT2) comprendido en la región constituida por el ácido nucleico en la posición 1437 al de la posición 1490 de HCV.

La invención se refiere también a un vector mencionado anteriormente, que comprende una molécula de ácidos nucleicos híbrida constituida por las tres secuencias de ácidos nucleicos siguientes:

a)-en el lado 3', una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína S delecionada de su dominio transmembranario situado en su extremo N-terminal (Sd), de un aislado del virus de la hepatitis B, o

-de una secuencia de ácidos nucleicos que presenta una homología de por lo menos un 91 %, en

35 particular de por lo menos un 93%, particularmente de por lo menos un 95%, y más particularmente de por lo menos un 97%, con dicha secuencia de ácidos nucleicos de la proteína S delecionada de Nterminal, con la condición de que dicha secuencia de ácidos nucleicos codifique para un péptido capaz de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus de HBV, o

-de la secuencia de ácidos nucleicos de una variante natural procedente de un aislado del virus HCV o de una variante sintética derivada de dicha secuencia de ácidos nucleicos que codifican para la proteína S delecionada (Sd), con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos codifique para un péptido capaz de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus de HBV, y,

45 b)-en el extremo 5' de dicha primera secuencia de ácidos nucleicos, una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el dominio transmembranario y el ectodominio de por lo menos una proteína de envoltura E1 o E2, de un aislado del virus de la hepatitis C, o

-de una secuencia de ácidos nucleicos que presenta una homología de por lo menos un 78%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de ácidos nucleicos que codifican para una de dichas proteínas E1 o E2, de un aislado del virus de la hepatitis C, con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos codifique para un péptido inmunógeno frente al virus de la hepatitis C, o

55 -de la secuencia de ácidos nucleicos de una variante natural procedente de un aislado del virus HCV o de una variante sintética derivada de dicha segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína de envoltura E1 o E2, con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos codifique para un péptido inmunogénico frente al virus de la hepatitis C,

-siendo dicha segunda secuencia seleccionada de entre las secuencias que codifican para la proteína E1, para la proteína E2 o para un péptido de fusión que comprende la proteína E1 y la proteína E2, y,

c)-en el extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácidos nucleicos, una tercera secuencia de ácidos nucleicos 65 que codifica para un péptido de inicio de transferencia (PIT) de un aislado del virus de la hepatitis Ci, o

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-la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 10, o

-una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 86%, en particular de por lo menos un 88%, particularmente de por lo menos un 90%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con SEC ID nº 10, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus de la hepatitis B humano y/o frente al virus de la hepatitis C, o

-de la secuencia de aminoácidos de una variante sintética, derivada de la SEC ID nº 10, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus de la hepatitis B humano y/o frente al virus de la hepatitis C.

La invención tiene también por objeto una partícula sub-viral quimérica inmunogénica mencionada anteriormente que comprende dos proteínas de fusión mencionada anteriormente (en particular E1-Sd de SEC ID nº 8, o E1-E2-Sd; y E2-Sd de SEC ID nº 10).

La invención se refiere también a una partícula sub-viral quimérica inmunogénica mencionada anteriormente, en la que la proteína de fusión inmunogénica comprende por lo menos una de las proteínas de envoltura (E1) de un aislado del virus de la hepatitis C, siendo dicha proteína constituida:

-por una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos de aminoácidos situados en la région que comprende el aminoácido de la posición 192 al de la posición 380 de la proteína salvaje de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a, o

-por una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 75%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de la proteína E1 salvaje de un aislado de HCV, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, o

-por la secuencia de aminoácidos de una variante natural procedente de un aislado del virus HCV o de una variante sintética, derivado de dicha proteína E1, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C.

La invención tiene también por objeto una partícula sub-viral quimérica inmunogénica mencionada anteriormente que comprende una proteína de fusión mencionada anteriormente (en particular E1-Sd, o E1-E2-Sd o PIT1-E1-E2-Sd, o PIT2-E2-E1-Sd), para la mencionada secuencia de la proteína E1 procede del aislado HCV-1a.

La invención tiene también por objeto una partícula sub-viral quimérica inmunogénica mencionada anteriormente, en la que la proteína de fusión inmunogénica comprende por lo menos una de las proteínas de envoltura de un aislado del virus de la hepatitis C, siendo dicha proteína constituida por secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre las siguientes:

-una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos de aminoácidos situados en la región que comprende el aminoácido de la posición 384 al de la posición 743 de la proteína salvaje E2 de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a, o

-una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 78%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de la proteína E2 salvaje de dicho aislado HCV, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, o

-la secuencia de aminoácidos de una variante natural procedente de un aislado del virus HCV o de una variante sintética, derivada de dicha proteína E2, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C.

La invención tiene también por objeto una partícula sub-viral quimérica inmunogénica mencionada anteriormente que comprende una proteína de fusión mencionada anteriormente (en particular E2-Sd, o E1-E2-Sd o PIT1-E1-E2-Sd), para la mencionada secuencia de la proteína E2 procede del aislado HCV-1a.

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Según un aspecto particular, la invención se refiere también a una partícula sub-viral quimérica inmunogénica mencionada anteriormente, que comprende las dos proteínas de fusión siguientes:

-la proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos constituida por el aminoácido de la posición 192 al de la posición 383, y particularmente de la posición 192 al de la posición 380 de la proteína salvaje E1 de HCV, y particularmente por el aislado HCV-1a; o

-de una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 75%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia de la proteína E1 salvaje de un aislado de HCV, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, o

-de la secuencia de aminoácidos de una variante natural procedente de un aislado del virus HCV o de una variante sintética, derivado de dicha proteína E1, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C, y

-la proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos constituida del aminoácido de la posición 384 al de la posición 746, y particularmente de la posición 384 al de la posición 743 de la proteína salvaje E2 de HCV, y particularmente del aislado HCV-1a, o

-de la secuencia de aminoácidos de una variante natural procedente de un aislado del virus HCV o de una variante sintética, derivada de dicha proteína E2, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos conserve las propiedades de dicho dominio transmembranario y las propiedades inmunogénicas frente al virus de la hepatitis C.

La invención tiene también por objeto una partícula sub-viral quimérica inmunogénica mencionada anteriormente que comprende dos proteínas de fusión mencionadas anteriormente (en particular E1-Sd, o PIT1-E1-Sd o E2-Sd o PIT1-E1-Sd o E1-E2-Sd o PIT1-E1-E2-Sd).

La invención tiene también por objeto una composición inmunogénica que comprende como sustancia activa por lo menos un compuesto seleccionado de entre:

-una proteína de fusión mencionada anteriormente,

-una molécula de ácidos nucleicos híbrida descrita anteriormente,

-un vector mencionado anteriormente que comprende dicha molécula de ácidos nucleicos híbrida,

-una partícula sub-viral quimérica descrita anteriormente,

-y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Según un modo de realización particular de la invención, la composición farmacéutica contiene también un vehículo farmacéuticamente apropiado cuyo experto en la materia determinará fácilmente la naturaleza y la cantidad a utilizar en función de parámetros habituales y de los constituyentes de la composición farmacéutica, la forma farmacéutica y el modo de administración deseado.

Las composiciones farmacéuticas de la invención son apropiadas para la administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica, local, intratraqueal, intranasal, transdérmica, rectal, intraocular, intraauricular, pudiendo dicho principio activo ser administrado en forma unitaria de administración.

Las formas unitarias de administración pueden ser, por ejemplo, unos comprimidos, unas cápsulas duras, unos granulados, unos polvos, unas soluciones inyectables o suspensiones orales, unos parches transdérmicos (patch), unas formas de administración sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, intra-auricular, por inhalación, unas formas de administración tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa, unas formas de administración rectal o unos implantes. Para la administración tópica, se pueden considerar unas cremas, geles, pomadas, lociones o colirios.

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* la secuencia de aminoácidos de una variante sintética, derivada de la SEC ID nº 10, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades

5 del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C.

Un objeto particular de la invención se refiere a uno de los tres compuestos siguientes:

a)-la proteína de fusión mencionada anteriormente que comprende la proteína E2 (en particular E2-Sd, PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PIT1-E1-E2-Sd), de la cual se encuentra una representación esquemática en la figura 3C, y que comprende la casi totalidad de la proteína E2 de HCV, injertada en N-terminal de la proteína S delecionada de HBV, o

15 b)-la molécula de ácidos nucleicos híbrida mencionada anteriormente que comprende la secuencia de ácidos nucleico que codifica para la proteína E2 (en particular e2-sd, pit2-e2-sd, e1-e2-sd, pit1-el-e2-sd), y que comprende la casi totalidad de la secuencia de ácidos nucleico que codifica para la proteína E1 de HCV, injertada en 5' de la secuencia de ácidos nucleico que codifica para la proteína S delecionada de HBV, o

c)-la partícula sub-viral mencionada anteriormente que comprende la proteína E1 (en particular E1-Sd, PIT-E1-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2-Sd), y que comprende la casi totalidad de la proteína E2 de HCV, injertada en Nterminal de la proteína S delecionada de HBV.

25 Conforme a un aspecto ventajoso de la invención, la composición inmunogénica mencionada anteriormente comprende como sustancia activa una partícula sub-viral quimérica, que comprende por lo menos las dos proteínas de fusión inmunogénicas constituidas por:

- la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 8, o

-una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 88%, en particular de por lo menos un 90%, particularmente de por lo menos un 92%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con dicha SEC ID nº 8, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de

35 HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C, o

-la secuencia de aminoácidos de una variante sintética, derivada de la SEC ID nº 8, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C, y,

45 -la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 10, o

-una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 86%, en particular de por lo menos un 88%, particularmente de por lo menos un 90%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con SEC ID nº 10 de E2-Sd, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C, o

55 -la secuencia de aminoácidos de una variante sintética, derivada de la SEC ID nº 10, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C.

Un objeto particular de la invención se refiere a la partícula sub-viral mencionada anteriormente que comprende dos proteínas de fusión mencionadas anteriormente, comprendiendo una: 65 -la proteína E1 de HCV (en particular E1-Sd, PIT1-E1-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2-Sd), y la proteína E2 de HCV,

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injertada en N-terminal de la proteína S delecionada de HBV, y la otra

-la proteína E2 de HCV (en particular E2-Sd, PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PIT-E1-E2-Sd), injertada en N-terminal de la proteína S delecionada de HBV.

5 Según un aspecto particularmente ventajoso de la invención, la sustancia activa de la composición inmunogénica mencionada anteriormente está constituida por la mezcla que comprende:

-por lo menos dos proteínas de fusión siguiente:

* una constituida por:

-la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 8, o

15 -una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 88%, en particular de por lo menos un 90%, particularmente de por lo menos un 92%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con SEC ID nº 8, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C, o

-la secuencia de aminoácidos de una variante sintética, derivada de la SEC ID nº 8, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio

25 transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C;

* la otra constituida por:

-la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 10, o

-una secuencia de aminoácidos que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos un 86%, en

35 particular de por lo menos un 88%, particularmente de por lo menos un 90%, y más particularmente de por lo menos un 95%, con SEC ID nº 10, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C, o

-la secuencia de aminoácidos de una variante sintética, derivada de la SEC ID nº 10, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos de dicha variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las

45 propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente al virus humano de la hepatitis B y/o frente al virus de la hepatitis C.

-por lo menos dos moléculas de ácidos nucleicos híbridas siguientes:

* una constituida por:

-la secuencia de ácidos nucleicos representada por SEC ID nº 11, o

55 -una secuencia de ácidos nucleicos que presenta una homología de por lo menos un 78%, en particular de por lo menos un 80%, particularmente de por lo menos un 85%, y más particularmente de por lo menos un 90%, con dicha secuencia SEC ID nº 11, con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo N-terminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la proteína de envoltura de HCV y conserve la capacidad de formar unas partículas sub-virales, no infecciosas e inmunogénicas frente a HCV y/o HBV humano, o

-la secuencia de ácidos nucleicos de una variante sintética derivado de dicha secuencia SEC ID nº 11, con la condición de que la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos de dicha 65 variante sintética esté también delecionada del dominio transmembranario situado en el extremo Nterminal de la proteína S de HBV, conserve las propiedades del dominio transmembranario de la

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El vector pSFV1 (Invitrogen) que posee una estructura bicistrónica de 11033 pb se utiliza para las construcciones siguientes. Este vector está dotado de una secuencia promotora de la SP6-ARN-polimerasa, insertada en 5' del primer cistrón, con el fin de poder iniciar la síntesis de un ARN completo de polaridad positiva (ARN denominado 42S(+)) por transcripción in vitro. Después de la transfección en las células de mamífero, estos ARN recombinantes tapados in vitro se autorreplican en presencia de la replicasa nsP1-4 del SFV y sirven para la producción de proteínas de interés por medio de un ARNm secundario denominado 26S(+).

La obtención del ADN complementario (ADNc) salvaje o de una molécula de ácidos nucleicos híbrida que codifica para una proteína de fusión de la invención se efectúa realizando varias series de amplificaciones por reacciones de polimerización en cadena (PCR). A partir del plásmido pSFV1-E1E2 (que consiste en un vector SFV que contiene la secuencia que codifica para las dos proteínas E1 y E2 del HCV), una primera PCR, denominada PCR A, ha permitido la amplificación de las secuencias que codifican para las proteínas de envoltura E1 o E2 del HCV con su dominio transmembranario y precedidas de las secuencias que codifican para su péptido de inicio de transferencia respectivo de direccionamiento al retículo endoplásmico. A partir del plásmido pHBV1.5 descrito anteriormente (Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., y Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51), una segunda PCR, denominada PCR B ha permitido la amplificación de la secuencia que codifica para la proteína S delecionada del HBV. Las partes «HCV» de las secuencias que codifica para las proteínas de fusión según la invención se han denominado «A» y las partes «HBV» se han denominado «B» (figura 5). Los productos de las PCR A y B se han cuantificado y purificado sobre gel para ser después incluidos a partes iguales en PCR finales. La utilización de cebadores bivalentes HCV-HBV ha permitido la síntesis de productos de PCR A y B que poseen unos dominios que se solapan en sus extremos que permiten, al final, obtener las secuencias de ADNc completas que codifican para las proteínas de fusión de la invención.

I1.1) Amplificación de las secuencias de ADNc que codifica para las proteínas de fusión de la invención (en particular E1-Sd y E2-Sd):

Las amplificaciones por PCR se efectuan en un medio de reacción de 50 µl que contiene 50 ng de ADN, 15 pmoles de cada par de cebadores (Proligo), 200 µM de cada uno de los desoxiribonucleótidos dNTP (Invitrogen) y 10 unidades de Taq-ADN-polimerasa (Takara) que comprenden una actividad correctora con el fin de minimizar los errores relacionados con las amplificaciones sucesivas (figura 5). Con la ayuda de los programas «Vector NTI Advance 10» (Invitrogen) y «Primer premier» (Biosoft International), los cebadores «sentido» de las secuencias A y los cebadores «anti-sentido» de las secuencias B se han definido con el fin de generar un sitio BamHI en los extremos respectivos 5' y 3' de los fragmentos de ADN amplificados.

La tabla 2 "oligonucleótidos utilizados para la amplificación génica de las secuencias A y B constitutivas de las secuencias quiméricas" a continuación indica las secuencias de cebadores utilizadas.

Las secuencias que corresponden al HCV están representadas escritas en negro, las que corresponden al HBV escritas en negro subrayado, las que corresponden al sitio de restricción BamHI escritas en cursiva subrayada, las que corresponden al codón ATG de iniciación de la traducción escritas en negrita, las que corresponden al codón ATT de terminación de la traducción escritas en negrita.

Tabla 2 "oligonucleótidos utilizados para la amplificación génica de las secuencias A y B constitutivas de las secuencias quiméricas".

Fragmento de ADNc amplificado: Par de cebador Secuencia del cebador

e1-sd A: sentido anti-sentido imagen25

e1-sd B: sentido anti-sentido imagen26

e2-sd A: sentido anti-sentido imagen27

e2-sd B: sentido anti-sentido imagen28

Estas reacciones de amplificación efectuadas en termociclador "iCycler" (Biorad) han consistido en una desnautralización inicial de 5 minutos a 95°C, seguida de 25 ciclos que comprenden una desnaturalización de 1 minuto a 95°C, una hibridación de 1 minuto a 60°C y una elongación 1 minuto a 69°C. Los 25 ciclos son seguidos de una elongación final de 10 minutos a 69°C. Los fragmentos amplificados por las PCR A y B son purificados sobre gel de agarosa al 1% con la ayuda del sistema "Wizard SV Gel y PCR Clean-Up System" (promena) según las recomendaciones del fabricante. Los fragmentos purificados de las PCR A y B son después hibridados por una PCR denominada PCRHYB en ausencia de cebadores durante 10 ciclos y después son amplificados por una PCR final denominada PCRFIN durante 25 ciclos en presencia de los cebadores "sentido" de las secuencias A y los cebadores

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