BRPI0914846A2 - novas proteínas de fusão, e sua aplicação na preparação de vacinas contra a hepatite c - Google Patents
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Abstract
NOVAS PROTEÍNAS DE FUSÃO, E SUA APLICAÇÃO NA PREPARAÇÃO DE VACINAS CONTRA A HEPATITE C.
A presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão imunogênica, que eompreende, pelo menos na porção c- . terminal, um prim.eiro peptídeo constituído pela proteína S, · deletada de seu domínio transmembranar situado na sua extremidade n-terminal de um isolado do víms da hepa-tite (VHB), e, na porção n-terminal, um segundo peptídeo constituído pelo domínio transmembranar e pelo ectodomínio de, pelo menos, uma. proteína do envelope de um isolado do vírus da hepatite C (VHC). A invenção também compreende uma molécula híbrida r de ácidos nucléicos, codificante da referida proteína de fusão, assim como um vetor que compreenda a referida molécula híbrida. de ácidos nucléicos, uma partícula subviral compreendendo a aludida proteína de fusão, uma composição imunogênica compreendendo, pelo menos, a referida proteína de fijsão, ou, pelo menos, a referida molécula híbrida de ácidos nucléicos, ou, pelo menos, a referida partícula subviral, assim c.omo uma linhagem celular para a produção da referida proteína de fusão, ou da referida molécula híbrida de ácidos nucléicos, ou da referida partícula subviral.
Description
Relatório Descritivo de Patente de Invenção i para “NOVAS PROTEÍNAS DE FUSÃO, E SUA
APLICAÇÃO NA PREPARAÇÃO DE VACINAS CONTRA A HEPATITE C” O objeto da invenção consiste em novas proteínas de fusão e em sua aplicação, notadamente na preparação de vacinas destinadas à prevenção e/ou ao tratamento profilático e/ou terapêutico da hepatite C, ou à prevenção e/ou ao tratamento . profilático e/ou terapêutico das hepatites C e B. A presente invenção também diz respeito à obtenção de partículas de , envelopes subvirais, quimeras das proteínas do envelope do vírus — da hepatite B(VHB, para designar o vírus da hepatite B), e do vírus da hepatite C (VHC, para designar o vírus da hepatite O).
, O vírus da hepatite C, identificado em 1989, e, em seguida, clonado e sequenciado, representa, ainda hoje em dia, um sério problema de saúde pública, devido à sua ampla disseminação por todo o mundo, e à evolução frequente do curso da doença rumo à cronicidade. No ano 2000, a OMS estimava que um percentual em torno de 3% da população mundial estivesse infectado pelo VHC, ou seja, aproximadamente 170 milhões de pessoas.
O VHC induz a hepatites crônicas, que podem evoluir rumo à cirrose e ao carcinoma hepatocelular. O interferon e a ribavirina, que constituem a base para o tratamento das hepatites crônicas induzidas pelo VHC, ainda apresentam uma eficácia duvidosa, e geram efeitos colaterais relevantes. Os tratamentos disponíveis continuam sendo caros, relativamente i tóxicos, sendo eficazes apenas em relação à metadle dos casos de infecção.
Embora o sequenciamento integral do genoma e as proteínas virais já sejam conhecidos há vários anos, a sua estrutura e sua morfogênese permanecem hipotéticas.
Ainda não existe qualquer vacina contra a hepatite C, de modo que, atualmente, os pesquisadores estão envidando seuns esforços em torno da busca de uma vacina candidata [Houghton, M and Abrignani, S. (2005). Prospects for a vaccine agairast the hepatite . Cvirus.
Nature 436 (7053), 961-6]. No caso de uma vacina profilática, a quase i totalidade das candidatas em potencial se baseia na utilização de * uma das duas, ou das duas proteínas do envelope do VHC, as geralmente designadas como sendo as proteínas El e E2, suscetíveis de induzir, simultaneamente, uma resposta imune celular e uma resposta humoral neutralizante.
Contudo, as proteínas El e E2 do VHC não se autoagregam em partículas subvirais, como pode ocorrer no caso de outros vírus.
Ademais, tendo em vista a maciça retenção de sua região transmembranar no retículo endoplasmático, a sua purificação exige um processo de solubilização, porr meio do uso de detergentes.
Decorrem daí os rendimentos abaixo das expectativas, sendo insignificante a pureza das fr-ações obtidas [Forns, X., Bukh, J., and Purcell, R.H. (2002). The challenge of developing a vaccine against hepatitis C virus. ] Hepatol 37(5), | 684-95].
A alternativa, que consiste no ressorteamento das proteínas do envelope deletadas do seu domínio transmembranar, possibilita o favorecimento da secreção de E1 e E2 fora da célula; contudo, a alteração da conformação tridimensional daí resultante pode se tornar indesejável, devido à diminuição da capacidade antigênica em relação a proteínas do tipo selvagem. O vírus VHB se apresenta sob duas formas: sob . a forma de viriões infecciosos, e sob a forma de partículas de envelope em excesso, encontradas no sangue de indivíduos infectados em quantidades bem maiores que o próprio vírus. Esse > fenômeno se deve à capacidade da proteína S de se autoagrupar e * de se romper em partículas subvirais (ou excesso de envelope) que não contenham proteínas do capsídio e nem ácido nucléico [Moriarty, A. M., Hoyer, B. H., Shih, J. W., Gerin, J. L., and Hamer, D. H. (1981). Expression of the hepatitis B virus surface antigen gene in cell culture by using a simian virus 40 vector. Proc Natl Acad Sci US A 78(4), 2606-10]. A proteína S do tipo selvagem, contida no VHB, compreende quatro domínios transmembranares. As partículas subvirais resultantes do autoagrupamento da proteína S do tipo selvagem não são infecciosas, embora sejam muito imunogênicas: foram consideradas como uma boa candidata a vacina contra a hepatite B nos anos 70. De fato, elas serviram de base para a elaboração de vacinas, já que foi comprovada a sua eficácia na indução de uma resposta imune protetora contra a infec-ção pelo VHB.
O uso de partículas subvirais do envelope do VHB, como vetor para proteínas estranhas ao vírus da hepatite B, s já foi objeto de um trabalho anterior- Com efeito, o pedido de patente no US2004/0146529, intitulado “HBV/HCV virus like particle” (“partícula semelhante ao vírus VAB/VHC"”) mostra a forma de obtenção de quimeras do envelope de VHB-VHC, caracterizada pelo fato de comp:reender, por um lado, sistematicamente, a proteína S total do vírus VHB e, por outro - lado, de acordo com os exemplos, um fragmento do ectodomínio ; : de uma das proteínas do envelope do VHC, enxertado na porção n-terminal final da proteína S do vírus "VHB [Mark Selby, Edward * — Glazer and Michael Houghton “HBV /HCV virus-like particle”, s patente americana nº2004/01465529].
Contudo, não está demonstrado que essas construções possam induzir a formação de partículas subvirais bem estruturadas, e que sejam capazes de induzir uma resposta antigênica de boa qualidade.
Em resposta aos inconvenientes do estado anterior da técnica, o objetivo da presente invenção consiste em fornecer uma proteína de fusão que seja capaz de formar partículas subvirais não-infecciosas, bem estruturadas, secretadas de forma eficiente, e que contenham a quase totalidade de E1 e/ou E.
Um dos objetivos da invenção consiste, ainda, | em fornecer uma vacina contra a hepatite C e/ou contra a hepatite B.
Outro interesse do invento provém do fato de 5 —poder ele ser facilmente adaptado às linhas de produção industrial existentes, destinadas à fabricação das vacinas contra a hepatite B, que são comercializadas atualmente.
O objeto da invenção consiste em uma proteína de fusão imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos os dois peptídeos seguintes: : a) na porção c-terminal, um primeiro peptídeo constituído: - pela sequência de aminoácidos da proteína S — deum isolado do vírus da hepatite B (VHB), sendo tal proteína S * deletada de seu domínio transmembranar situado na sua porção n- terminal, ou - por uma sequência de aminoácidos, que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a referida sequência de aminoácidos da proteína S deletada na porção n-terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um outro isolado do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de i aminoácidos da aludida proteína S deletada, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas, e b) na porção n-terminal, um segundo peptídeo constituído:
- pela sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio de, pelo menos, uma proteína do envelope de um isolado do vírus da hepatite C (VHC), ou
- por uma sequência de aminoácidos, que
. apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo ã menos, 90% com a referida sequência de aminoácidos do e domínio transmembranar e do ectodomínio de uma proteína de um isolado do vírus da hepatite C, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou
- pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos, das ditas proteínas El ou E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C,
sendo o segundo peptídeo escolhido entre a | proteína El, a proteína E2 ou um peptídeo de fusão, que compreenda as proteínas E1 e E2.
A invenção também diz respeito a uma proteína de fusãoimunogênica, que possua uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 83%, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 93% com a sequência de aminoácidos composta pela proteína S deletada da porção n-terminal! do respectivo domínio . —transmembranar (Sd) e do ectodomínio de uma proteína de um isolado do vírus da hepatite C (El ou E2).
“Proteína de fusão” é entendida como qualquer i proteína caracterizada por compreender, pelo menos, a proteína S 5 deletada do respectivo domínio transmembranar, localizada na porção n-terminal de um isolado de VHB (Sd), e a quase integralidade de um envelope das proteínas El e/ou E2 de um isolado do VHC, cujo domínio transmembranar substitua aquele deletado na porção n-terminal da proteína S do VHB (Figuras 3B, 3C,4De4E).
“Proteína imunogênica” é entendida como qualquer proteína e, em particular, qualquer proteína de fusão de acordo com a invenção, bem como qualquer fragmento de quaisquer proteínas de fusão ora mostradas, dotadas de — propriedades antigênicas, e capazes de induzir uma reação ou uma resposta imune. Em particular, considera-se como sendo imunogênica frente ao VHC e/ou VHB qualquer proteína que, | após a imunização, induza uma resposta humoral anti-E1, anti-E2 e anti-S respectivamente, detectada, por exemplo, de acordo com o protocolo descrito: - por Huzly et al., 2008, no que diz respeito ao VHB, [Huzly D, Schenk T, Jilg W, Neumann-Haefelin D. Comparison of nine commercially available assays for quantification of antibody response to hepatitis B virus surface antigen. J Clin Microbiol. 2008 Abr, 46(4):1298-306], ou, - por Hamed et al., 2008, no que diz respeito ao . VHC [Hamed MR, Tarr AW, McClure CP, Ball JK, Hickling TP, Irving WL. Association of antibodies to hepatitis C virus i glycoproteins 1 and 2 (anti-ElIE2) with HCV disease. J Viral Í Hepat. 2008 Mai, 15(5):339-45].
s “A Capacidade de formar partículas subvirais” é entendida como sendo a capacidade de qualquer proteína, sobretudo da proteína S do VHB e, em particular, da proteína S deletada da porção n-terminal do respectivo domínio transmembranar, e, mais especificamente, de uma proteína de fusão da invenção, caracterizada por compreender a proteína S deletada da porção n-terminal, de se autoagrupar na presença da proteína S do tipo selvagem ou, se for o caso, de se autoagrupar em partículas subvirais filamentosas ou esféricas; a dita capacidade de formar partículas pode ser destacada, pelo menos, pela observação de acordo com uma análise microscópica de elétrons em especial e, sobretudo, pelo teste descrito nos exemplos 1 e 2 (parágrafos 1-5 e II-7) desse documento, e, em particular, ilustrada pelas figuras 7D, 7/G, e 11Ba 1 1D. “Partícula — subviral! — não-imfecciosa” — é entendida como qualquer partícula filamentosa, resultante do s agrupamento da proteína S do tipo selvagem, comtida no VHB (figura 2B), e/ou da proteína S deletada da porção n-terminal do respectivo domínio transmembranar, sendo tal partícula desprovida do genoma do vírus, e, em especial, sintetizada e secretada em excesso, podendo ser analisada por qualquer protocolo que possibilite destacar a falta de fragmentos . — específicos do nucleotídeo do VHB ou VHC, e, em particular, E pela amplificação por PCR, anteriormente mostrada, por exemplo: - no tocante ao VHC, por [Halfom P, Bourliêre À M, Ouzan D, Sêne D, Saadoun D, Khiri H, Pénaranda G, “ Martineau A, Oulês V, Cacoub P.Occult HCV infection revisited with ultra-sensitive real-time PCR assay.
Clin.
Mãcrobiol. 2008 Abr 30], - no tocante ao VHC, por [Thibau lt V, Pichoud C, Mullen C, Rhoads J, Smith JB, Bitbol A, Thamm S, Zoulim F.
Characterization of a new sensitive PCR assay for quantification of viral DNA isolated from patients with hepatitis B virus infections.
Clin.
Microbiol. 2007 Dez. 45(12):3948-53], e cujo resultado é negativo. “Isolado do vírus VHC” é entendido como — qualquer membro isolado da família do Flavivirida , pertencente ao gênero Hepacivirus, e composto por uma poliproteína com mais de 3.000 aminoácidos do vírus VHC, conforme | esquematizado na Figura 1 [Choo, Q.
L., Kuo, G., Weiner, A.
J., Overby, L.
R., Bradley, D.
W., and Houghton, M (1989). Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, —non-B viral hepatitis genome.
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Proc.
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USA (1991) v88:2451-2455; Han et al.
Characterization of the terminal regions of hepatitis C viral RNA: identification of conserved sequences in the 5' untranslated region and poly(A) tails at the 3' end.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (1991) 88:1711-1715], ou qualquer isolado classificado pelo - Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (“ICTV”) como sendo relacionado ao VHC. | “Isolado do vírus VHB” é entendido como * sendo qualquer membro isolado da família dos Hepadnaviridae, e s pertencente ao gênero Orthohepadnavirus, ou qualquer isolado classificado pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus ' (“ICTV”) como sendo relacionado ao VHB [Schaefer S.
Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes.
World J Gastroenterol. 2007 Jan 7: 13(1):14-21]. “Proteínas 8” ou “proteinas S do tipo selvagem” (S) são entendidas como: - a proteína do envelope de um isolado do vírus VHB, caracterizada por compreender quatro domínios transmembranares (Figura 2A) e, em particular, a proteína do —envelope do isolado de VHBadw, ou
- a variante natural, derivada de um isolado do vírus VHB, ou a variante sintética da supramencionada proteína S. “Agrupamento” —é entendido como a capacidade de uma proteína de formar partículas subvirais por meio da associação com a proteína S do tipo selvagem. “Autoagrupamento” é entendido como a capacidade de uma proteína de formar, por si mesma, partículas subvirais. “Proteína S deletada do domínio transmembranar, localizada na porção n-terminal final” ou . “proteína S deletada na porção m-terminal”, ou “proteína S deletada” (Sd) são entendidas como : -a proteína S, conforme definida acima, deletada da região do aminoácido na posição 1 para a região na posição 19, ouna posição | para a região na posição 20, ou na posição 1 para a região na posição 21 e, preferenckalmente, na posição 1 para a região na posição 22 da proteína S le um isolado do vírus VHB, ou - a supramencionacla proteína S, que possua um percentual de identidade de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a referida região da proteína S deletada, ou - a “variante natura 1”, derivada de um isolado do vírus VAB, ou a “variante sintética” da supramencionada proteína S deletada.
“A proteína do envelope de um isolado do | vírus da hepatite C” é entendida como sendo a quase integralidade de uma das duas proteínas El e E2, composta por seu ectodomínio e seu domínio transmembranar (Figuras 4B e 4C),eque corresponde:
*aos fragmentos de peptídeos da poliproteína do vírus VHC e, em particular, do isolado do VHC-la do vírus VHC, localizado nas regiões que se estendem:
- do aminoácido na posição 192 àquele na posição 383 ou, em particular, do aminoácido na posição 192
. —àquelena posição 380, no que diz respeito à proteína El, e
: - do aminoácido na posição 384 àquele na posição 746 ou, em particular, do aminoácido na posição 384 i àquele na posição 743, no que diz respeito à proteína E2; ou
5 *aos fragmentos que possuam um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida região El, ou
*aos fragmentos que possuam um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida região E2, ou
*às variantes naturais ou sintéticas da poliproteína de um isolado do vírus VHC.
“O Ectodomínio das proteínas do envelope do i vírus da hepatite C” é entendido como sendo constituído: *pelas partes de fragmentos de peptídeos de E1 ou E2, derivadas da poliproteína do vírus VHC e, em particular, doisolado VHC-la do vírus VHC, localizado nas regiões que se estendem: - do aminoácido na posição 192 àquele na posição 352 ou, em particular, do aminoácido na posição 192 àquele na posição 352, que se relaciona ao ectodomínio da proteína El, e ' - do aminoácido na posição 384 àquele na posição 717 ou, em particular, do aminoácido na posição 384 i àquele na posição 717, que se relaciona ao ectodomínio da proteína E2; ou *pelos fragmentos que possuam um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a supramencionada região El, ou * pelos fragmentos que possuam um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a supramencionada região E2, ou *pelas variantes naturais ou sintéticas da poliproteína de um isolado do vírus VHC.
“Os “domínios transmembranares dias À proteínas do envelope do vírus da hepatite C” são entendidos como sendo constituídos: *pelas partes de fragmentos de peptídeos de E] ouFE2, derivadas da poliproteína do vírus VHC e, em particul:ar, do isolado VHC-la do vírus VHC, localizado nas regiões que se estendem: - do aminoácido na posição 353 àquele na posição 383 e, de forma mais benéfica, do aminoácido na posiç ão 353 àquele na posição 380, no que diz respeito ao domíraio . —transmembranar da proteína El, e : - do aminoácido na posição 718 àquele na posição 746, e, de forma mais benéfica, do aminoácido na posiç ão 78 àquele na posição 743, no que diz respeito ao domímio transmembranar da proteína E2; ou *pelos fragmentos que possuam um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a supramenciona=-da região El, ou * pelos fragmentos que possuam um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a supramencionadda região E2, ou
*pelas variantes naturais ou sintéticas da | poliproteína de um isolado do vírus VHC.
“Percentual de identidade” é entendido como sendo o percentual resultante da comparação direta entre duas —sequências de moléculas de polipeptídeos, pela determinação do número de resíduos de aminoácidos em ambas as sequências e, em seguida, pela divisão deste valor pelo número de resíduos de aminoácidos da sequência mais longa e, por fim, pela multiplicação do resultado por 100.
Um dos objetos da presente invenção se refere a . uma proteína de fusão, que seja caracterizada pelo fato de compreender qualquer sequência de nucleotídeos e/ou peptídeos de qualquer isolado do vírus VHC e/ou do vírus VHB, independentemente do supramencionado percentual de identidade da aludida sequência em relação às sequências específicas ora mostradas.
A expressão “variante natural” se refere a qualquer variabilidade, a qualquer polimorfismo, ou a qualquer diversidade de uma sequência de DNA, de um alelo, de uma sequência de proteínas, entre isolados de uma mesma espécie, ou de uma mesma população. O “percentual de variabilidade natural” é determinado pela comparação direta entre dois polipeptídeos ou moléculas de polinucleotídeos, derivados de uma molécula de referência do tipo selvagem, e dotados de propriedades biológicas de interesse como, por exemplo, propriedades imunogênicas e/ou a capacidade de formar partículas subvirais. Ele é quantificado pela deterrminação do i número exato de resíduos idênticos de aminoácidos ou de ácidos nucléicos entre as duas sequências e, em seguida, pela divisão desses valores pelo número de resíduos de aminoácãdos, ou de ácidos nucléicos, da sequência mais curta, e, finalmente, pela multiplicação do resultado por 100.
O referido percentual de variabilidade entre duas sequências é particularmente oscilante, poãs depende sobretudo do vírus considerado, do genótipo cons&ãderado, do fragmento de sequência considerado — sendo, por exemplo, a . região do ectodomínio do VHC mais variável que a região do domínio transmembranar — etc... Assim, o percentual de : variabilidade das proteínas El e E2 do VHC é de 88% de — nucleotídeos e 90% de aminoácidos, entre cepas de um mesmo genótipo. Contudo, esse percentual cai para 55% de mucleotídeos e 59% de aminoácidos entre cepas de genótipos diferentes. Como o VHB é um vírus dotado de DNA, ele é muito menos variável que o VHC [Zhang M, Gaschen B, Blay W, Foley B., Haigwood N, Kuiken C, Korber B. Tracking global patterns Of N-linked glycosylation site variation in highly variable viral glycoproteins: HIV, SIV, and HCV envelopes and influenza hemmagglutinin. Glycobiology. 2004 Dez. 14(12):1229-46].
Um dos objetos da presente invenção se refere a uma proteína de fusão, e/ou a uma molécula híbrida de ácido —nucleico, que seja caracterizada pelo fato de cxompreender qualquer variante natural, ou qualquer fragmento .de variante natural, contendo um peptídeo e/ou uma sequência de nucleotídeos derivados de qualquer isolado do vírus VHC ou desse próprio vírus, independentemente do supramencionado percentual de variabilidade natural e/ou sintética da aludida —sequência, em relação às sequências específicas ora aludidas.
A expressão “variante sintética” se refere a qualquer polipeptídeo ou molécula de polinucleotídeos de acordo com a invenção, ou a qualquer fragmento de polipeptídeos ou de molécula de polinucleotídeos ora mostrados, derivados, por recombinação, de uma molécula de referência do tipo selvagem, . sejapor adição, deleção ou substituição; ela diz respeito, ainda, à molécula de referência do tipo selvagem, desde que conserve as | propriedades biológicas de interesse, tais como as propriedades : imunogênicas e/ou a capacidade de formar partículas subvirais. O “percentual de variabilidade sintética” é determinado pela comparação direta entre a referida molécula derivada e a aludida molécula de referência do tipo selvagem, e pela determinação do número exato de resíduos idênticos de aminoácidos ou de ácidos nucléicos entre as duas sequências, em relação à sua posição e à sua natureza, e, em seguida, pela divisão desses valores pelo número de resíduos de aminoácidos, ou de ácidos nucléicos, da sequência mais curta, e, finalmente, pela multiplicação do resultado por 100.
Um dos objetos da presente invenção diz respeito a uma proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender qualquer variante ou fragmento de variante sintética,
contendo um nucleotídeo e/ou uma sequência de peptídeos i derivada de qualquer isolado do vírus VHC e/ou do vírus VHB. De acordo com um aspecto particularmente vantajoso da invenção, os domínios transmaembranares de E1l e/ou de E2, que constitlaem uma parte da proteína de fusão, são deletados de, pelo menos, um dos três últimos aminoácidos e, em particular, dos últimos três aminoácidos, posicionados na porção c-terminal, de modo que os aludidos domínios transmembranares deletados de E1 e/ou de E2 possuam um percentual de identidade com os domínios transmembranares do tipro selvagem E1 e/ou E2 . de, pelomenos, 91% em relação a El e d«e, pelo menos, 90% em relação a E2.
A aludida deleção de, pselo menos, um dos três * aminoácidos e, em particular, dos últimos três aminoácidos posicionados na porção c-terminal, apresenta a vantagem de inativar o local de clivagem das peptãdases, representado na figura 1 pelo símbolo 3< , e que é nec essário à maturação da poliproteína do VHC, embora seja indesejável dentro do escopo das construções quiméricas referidas na presente invenção.
[1] O objeto da inverinção consiste em uma proteína de fusão imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos os dois peptídeo s seguintes: a) na porção c-terminall, um primeiro peptídeo constituído: os pela sequência de am inoácidos da proteína S de um isolado do vírus da hepatite B (VIAB), sendo tal proteina S deletada de seu domínio transmembranar situado na sua porção n- i terminal final, ou
- por uma sequência de aminoácidos, que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97%
com a referida sequência de aminoácidos da proteína S deletada na porção n-terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da . hepatiteB,ou
- pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um outro isolado do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos da aludida proteína S deletada, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, e b) na porção n-terminal, um segundo peptídeo constituído:
- pela sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio de, pelo menos, uma proteína do envelope de um isolado do vírus da hepatite C (VHC), ou
- por uma sequência de aminoácidos, que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% i com a referida sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio de uma proteína de um isolado do vírus da hepatite C, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma Variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos, . das ditas proteínas El ou E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, : sendo o segundo peptídeo escolhido entre a proteina El, a proteína E2 ou um peptídeo de fusão, que compreenda as proteínas E1 e E2.
O objeto da presente invenção se refere, especificamente, a uma proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos: - por um lado, a proteína S deletada do VHB (Sd), essencialmente composta pelos seus três domínios transmembranares localizados no final da porção c-terminal (figuras 2A e 3A), devendo a referida proteina S deletada conservar a capacidade de se agregar em partículas subvirais, bem — como as propriedades imunogênicas contra o vírus VHB, e
- por outro lado, a quase integralidade da : sequência de uma das proteínas El e E2, que também deve conservar as propriedades imunogênicas contra o vírus VHC, de modo que a aludida proteína de fusão, e, em particular, aquela representada pelas figuras 3B ou 3C, seja capaz de se autoagregar em partículas subvirais, na presença da proteína S do tipo selvagem, e seja capaz de induzir uma imunização contra os vírus VHB e/ou VHC e, em particular, de induzir uma dupla imunização contra os vírus VHB e/ou VHC. [1a] Como uma das vantagens apresentadas, o - objeto da presente invenção consiste em uma proteína imunogênica de fusão, conforme mencionado acima, : caracterizada pelo fato de compreender, na porção n-terminal do * aludido segundo peptídeo (El ou E2), um terceiro peptídeo composto por uma sequência de aminoácidos de um peptídeo de iniciação de transferência (PIT) de um isolado do vírus da hepatite C. “Peptídeo de iniciação de transferência” é entendido como uma proteína El ou E2 (PITI e PIT2 respectivamente), ou uma proteína de fusão de acordo com a invenção, constituída *pelo fragmento da poliproteína do vírus VHC e, em particular, do isolado VHC-la do vírus VHC, localizado nas regiões que se estendem: - do aminoácido na posição 166 àquele na posição 191, no que diz respeito à proteína El, e
- do aminoácido na posição 366 àquele na i posição 383, no que diz respeito à proteína E2; ou *pela variante natural, derivada de um isolado do vírus VHC, ou pela variante sintética do supramencionado fragmento de peptídeo, ou *por qualquer fragmento de peptídeo enxertado na porção n-terminal do aludido segundo peptídeo, desde que o referido fragmento de peptídeo, ao integrar a proteína de fusão da presente invenção, mantenha a capacidade de encaminhar, após a tradução, a referida proteína de . fusão ao retículo endoplasmático, de modo a que ela seja corretamente glicosilada, e que a sua conformação tridimensional &/ou as suas características antigênicas sejam mais preservadas em relação às proteínas S do tipo selvagem.
as [2] De acordo com outro aspecto particularmente vantajoso, o objeto da presente invenção consiste em uma proteína de fusão imunogênica, conforme mencionado acima, caracterizada pelo fato de o segundo peptídeo da porção n- terminal ser constituído: - pela totalidade da sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína de envelope E1l, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90%
: com a referida sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína do envelope El, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da dita proteína El, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedlades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
Um objeto peculiar da invenção consiste na proteína de fusão El-Sd, cuja representação esquemática é apresentada na figura 3B, e que é caracterizada pelo fato de compreender a quase-integralidade da proteína El do WHC, f enxertada na porção n-terminal da proteína S deletada do VHB.
[3] De acordo com outro aspecto vantajoso, o objeto da presente invenção consiste, particularmente, em uma proteína de fusão imunogênica, conforme mencionado a.cima, caracterizada pelo fato de o segundo peptídeo da porção n- terminal ser constituído: - pela totalidade da sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteima de envelope E2, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, —notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de , pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos-, 90%
com a referida sequência de aminoácidos do domínio | transmembranar e do ectodomínio da proteína do envelope E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da dita proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
Um objeto peculiar da invenção consiste na . proteína de fusão E2-Sd, cuja representação esquemática é apresentada na figura 3C, e que é caracterizada pelo fato de compreender a quase-integralidade da proteína E2 do VHC, ' enxertada na porção n-terminal da proteína S deletada do VHB.
[3b] Sob esse aspecto, a invenção diz respeito, mais particularmente, a uma proteína de fusão imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender os três peptídeos descritos abaixo: a) na porção c-terminal, um primeiro peptídeo constituído: - pela sequência de aminoácidos da proteína S deletada de seu domínio transmembranar situado na porção n- terminal de um isolado do vírus da hepatite B (VHB), ou - por uma sequência de aminoácidos, que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% E com a referida sequência de aminoácidos da proteína S deletacla na porção n-terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas —subvirais não-infecciosas, e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, ou
- pela sequência de aminoácidos de umma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácicios da aludida proteína S deletada da porção n-terminal, desde que a
« aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas, e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B;
é b) por um segundo peptídeo da sequência,
constituído:
- pela totalidade da sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína de envelope E2 de um isolado do vírus da hepatite C, ou
- por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de aminoácidos do dormínio transmembranar e do ectodomínio da aludida proteína do envelope, desde que a referida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da sequência de aminoácidos da dita proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C,e c) na porção n-terminal, um terceiro peptídeo composto:
" - pela totalidade da sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio de uma proteína de envelope E1, de um isolado do vírus da hepatite C (VHO), ou
| - por uma sequência de aminoácidos, que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da referida proteína de envelope, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou
- pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos de uma proteína El, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imuno gênicas frente ao i vírus da hepatite C, sendo o segundo peptídeo Localizado entre o primeiro e o terceiro, e sendo, de preferência, contíguos os três peptídeos acima.
Um objeto peculiar da invenção consiste na proteína de fusão EI-E2-Sd, caracterizada pelo fato de compreender o ectodomínio de El do VHC, enxertado na porção n-terminal da quase-integralidade da proteína E2, que, por sua Vez, é enxertada na porção n-terminal da proteína S deletada do VHB. Um objeto peculiar da invenção também consiste na proteína de fusão E2-E1-Sd, caracterizacla pelo fato de i compreender o ectodomínio de E2 do VHC, «enxert.ado na porção n-terminal da quase-integralidade da proteína El. que, por sua vez, é enxertada na porção n-terminal da preoteína S deletada do VHB.
[4] De acordo com um aspecto particularmente vantajoso da invenção, o primeiro e o segundo peptídeos que constituem a proteína de fusão imunogênica são ceontíguos, sendo a porção c-terminal do segundo peptídeo ligada mor covalência à porção n-terminal do primeiro peptídeo.
Uma das vantagens trazidas pela invenção consiste no fato de que as proteínas El ou E2 do vírus VHC, ou os fragmentos de uma das proteínas de fiasão de acordo com a invenção, a saber, PITI-EI, PIT2-E2, E1-E2 -ou PITI-EI-E2,
: mantêm uma ligação covalente e de contiguidade com a proteína S, deletada do vírus VHB.
Outra vantagem oferecida pela invenção consiste no fato de que um peptídeo ligante conecta o primeiro s —peptídeo ao segundo, para constituir a supramencionada proteína de fusão, sendo esse peptídeo ligante composto por 1, ou 2, ou 3, ou 4 ou 5 aminoácidos; desde que a referida proteína de fusão imunogênica conserve a propriedade de se autoagregar em partículas subvirais, na presença da proteína S do tipo selvagem, e mantenha as propriedades imunogênicas frente ao VHC, ou ao - “VHB,ouaambos. : [5] Outra peculiaridade do objeto da invenção — consiste em uma proteína de fusão imunogênica, caracterizada pelo fato de o primeiro peptídeo da porção c-terminal ser s constituído:
- por uma sequência de aminoácidos, delimitada pelos aminoácidos contíguos, situados na região compreendida entre os aminoácidos nas posições 23 a 226 da proteína S, deletada na porção n-terminal do VHB, e, particularmente, do isolado do subtipo adw do VHB,
e, notadamente, pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID no. 2, ou
- por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 91%,
— notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97%
com a referida sequência de aminoácidos contíguos à proteína S f deletada na porção n-terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatiteB,ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos da aludida proteína S deletada na porção n-terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de . — formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B. Um objeto ainda mais peculiar da invenção Í consiste na proteína de fusão E1-Sd, ou E2-Sd, ou E1-E2-Sd, para asquaisa proteína S deletada seja aquela do isolado HBVadw, sendo sequenciada pela SEQ ID no. 2 (cf. a tabela 1).
[6] Outro objeto peculiar da invenção consiste na proteína de fusão imunogênica, conforme mencionado acima, caracterizada pelo fato de o segundo peptídeo da porção n- terminal ser constituído: - por uma sequência de aminoácidos, delimitada pelos aminoácidos contíguos, situados na região compreendida entre os aminoácidos localizados nas posições 192 a 380 da proteína El do VHC, e, em particular, do isolado 1a do VHC, e, notadamente, pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID no. 4, ou
- por uma sequência de aminoácidoos que i apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% coma referida sequência de aminoácidos contíguos da referida proteína El, desde que a aludida sequência de amimoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma Variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou. de uma . — Variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos : contíguos à aludida proteína E1, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao | vírus da hepatite C.
Outro objeto peculiar da invenção consiste em uma proteína de fusão, em relação à qual a sequência da proteína El seja derivada de um isolado do VHC-la, e corresponda especificamente à região acima mencionada, e, em partiscular, às proteínas de fusão E1-Sd da SEQ ID no. 4, ou E1-E2-S-d, PIT1- EI-E2-Sd (cf. a tabela 1).
[7] A invenção se refere, em particular, a uma proteína de fusão imunogênica, conforme mencionado acima, caracterizada pelo fato de o primeiro e o segundo peptídeos serem contíguos, sendo a referida proteína de fusão constituída: - pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID no. 8, ou
- por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% s coma referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a . aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB.
i Outro objeto da invenção consiste em uma proteína de fusão El-Sd, em relação à qual a sequência da proteína E2 seja derivada de um isolado do VHC-la, e que contenha a supramencionada sequência SEQ ID n. 8, que corresponde à SEQ ID no. 2, enxertada na parte da frente da SEQ ID no. 4 de EI.
[7b] Sob esse aspecto, o objeto da invenção consiste, mais particularmente, em uma proteína de fusão imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender um terceiro peptídeo de iniciação de transferência, localizado na porção n- terminal do segundo peptídeo, sendo a aludida proteína de fusão representada: - pela SEQ ID no. 12, ou
- por uma sequência de aminoácidos que É apresente uma homologia de, pelo menos, 83 %, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 12, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partícwilas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 12, desde que a . aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e: imunogênicas frente | ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB. | Outro objeto da invenção consiste na proteína de fusão PITI-E1-Sd, em relação à qual a sequência da proteína El seja derivada do VHC e, mais particular mente, de um isolado do VHC-la, e que contenha a supramencionada sequência SEQ ID n. 12, que corresponde à SEQ ID no. 2 de Sd, enxertada na porção n-terminal da SEQ ID no. 4 de El, que, por sua vez, foi enxertada na porção n-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo de iniciação de transferência da proteína El (PITI), incluído na região que se estende do aminoácido na posição 166 àquele na posição 191 do VHC.
A inserção de um peptídeo de iniciação de transferência na porção n-terminal da supramencionada proteína de fusão E1-Sd apresenta a vantagem peculiar de encaminhar essa última, logo após ser traduzida, ao retículo endoplasmático, de modo a que seja corretamente glicosilada e que suas características antigênicas não apresentem qualquer alteração substancial em relação às proteínas do tipo selvagem.
[8] Outro objeto da invenção consiste em uma proteína de fusão imunogênica, conforme mencionado acima, caracterizada pelo fato de o segundo peptídeo da porção n- terminal ser constituído: - por uma sequência de aminoácidos, delimitada pelos aminoácidos contíguos, situados na região compreendida . entre os aminoácidos localizados nas posições 384 a 743 da proteína E2 do VHC, e, em particular, do isolado 1a do VHC, | e, notadamente, pela sequência de aminoácidos | representada pela SEQ ID no. 6, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de aminoácidos contíguos da referida proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos contíguos à aludida proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C. Outro objeto da invenção consiste na proteína de fusão E2-Sd ou E1-E2-Sd, em relação à qual a sequência da s proteína E2 seja derivada do VHC e, em particular, do isolado VHC-1 a, correspondendo, especificamente, à supramencionada região da sequência da proteína E2.
[9] A. invenção se refere, em particular, a uma proteína de fusão imwunogênica, conforme mencionado acima, caracterizada pelo fato de o primeiro e o segundo peptídeos . — serem contíguos, sendo a referida proteína de fusão constituída: : - pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou ' - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percenttual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais —não-infecciosas e imu nogênicas frente ao vírus da hepatite B, e/ou ao da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética der vada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de — formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, e/ou ao da hepatite C.
Outro objeto da invenção consiste na proteína i de fusão E2-Sd, em relação à qual a sequência da proteína E2 seja derivada do isolado VHC-I a, e contenha a supramencionada sequência SEQ ID no. 10 que corresponde à SEQ ID no. 2 de Sd, —enxertada, pela frente, com a SEQ ID no. 6 de E2.
[9b] Sob esse aspecto, o objeto da invenção consiste, mais particularmente, em uma proteína de fusão imunogênica (PIT2-E2-Sd), caracterizada pelo fato de compreender um terceiro peptídeo de iniciação de transferência, localizado na porção n-terminal do segundo peptídeo, sendo a . — referida proteína de fusão representada: i - pela SEQ ID no. 14, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente uma homologia de, pelo menos, 82%, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID no. 14, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 14, desde que a aludida SEQ ID no. 14 conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, e/ou ao da hepatite C.
Outro objeto da invenção consiste na proteína de fusão PIT2-E2-Sd, em relação à qual a sequência da proteína E2 seja derivada do isolado VHC-l a, e contenha a supramencionada sequência SEQ ID no. 14, que corresponde à
SEQ ID no. 2 de Sd, enxertada, na porção n-terminal da SEQ ID no. 6 de E2 que, por sua vez, é enxertada na porção n-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo de iniciação de transferência da proteína E2 (PIT2), incluída na região composta s pelo aminoácido na posição 366 até aquele na posição 383 do VHC.
Outro objeto da invenção consiste na proteína de fusão E1-E2-Sd ou PITI-E1-E2-Sd. Outro objeto do invento consiste nas supramencionadas proteínas de fusão, em sua forma purificada.
. A invenção também diz respeito a uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, que codifique qualquer das supramencionadas proteínas de fusão.
| “Molécula híbrida de ácidos nucléicos” é entendida como qualquer molécula de ácidos mnucléicos caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, uma sequência que codifique a proteína S, deletada do domínio transmembranar, localizada na porção n-terminal de um isolado do vírus da hepatite B, e, pelo menos, uma sequência que codifique a quase-integralidade de uma proteína de envelope de um isolado do vírus da hepatite C, ou qualquer molécula derivada de uma molécula, conforme definido acima, e cuja modificação segue o curso da degeneração natural do seu código genético.
Uma das vantagens oferecidas pela invenção consiste em uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima, e que codifique uma proteína de fusão acima definida, e caracterizada pelo fato de compreender as três E sequências de ácidos nucléicos, descritas a seguir: a) — Na extremidade 3, uma prirmeira sequência de ácidos nucléicos que codifique a proteína S del etada do domínio transmembranar, localizada na porção n-terminal de um isolado do vírus da hepatite B (VHB), ou - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95 %, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a re ferida . — sequência de ácidos nucléicos da porção n-terminal da proteína S deletada, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas | subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VAIB, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante natural de outro isolado do vírus VHB, ou de uma variante sintética, derivada de uma sequência de ácidos nucléicos da porção n-terminal da proteína S deletada, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB, e b) no lado 5 da primeira sequência, uma segunda sequência de ácidos nucléicos que codifique o d omínio transmembranar e o ectodomínio de, pelo menos, uma prot eina de — envelope El ou E2 de um isolado do vírus da hepatite C, ou
- de uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de ácidos nucléicos que codifica uma das aludidas proteínas El e E2 de um isolado di vírus da hepatite C, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC, ou - pela sequência de ácidos nucléicos, derivada de uma variante natural derivada de um isolado do vírus VHC, ou . —deuma variante sintética derivada da referida sequência de ácidos nucléicos de uma das referidas proteínas El ou E2, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos h conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, sendo a referida segunda sequência escolhida a partir das sequências que codificam a proteína E1, a proteína E2, ou um peptídeo de fusão, caracterizado pelo dato de compreender as proteínas El e E2, e c) no lado 5 da segunda sequência, uma terceira sequência de ácidos nucléicos que codifique um peptídeo de iniciação de transferência de uma proteína de envelope El ou E2, de um isolado do vírus da hepatite C (PIT), ou - uma sequência de ácidos nucléicos de uma variante natural, derivada de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética, derivada da referida sequência de ácidos nucléicos da proteína que codifica um peptídeo de iniciação de | transferência (PIT), desde que o peptídeo de iniciação de transferência, codificado pela referida sequência de ácidos nucléicos, mantenha a capacidade de encaminhar, após a tradução, a aludida proteína de fusão ao retículo endoplasmático, para que ela seja corretamente glicosilada, para que a sua conformação tridimensional apresente o menor número possível de alterações, e para que as suas características antigênicas sejam mais preservadas, em relação às proteínas S do tipo selvagem, ou - qualquer sequência de ácidos nucléicos que . —codifique um peptídeo capaz de encaminhar, após a tradução, a -— — aludida proteína de fusão ao retículo endoplasmático, para que ela seja corretamente glicosilada, para que a sua conformação i tridimensional apresente o menor número possível de alterações, e para que as suas características antigênicas sejam mais preservadas, em relação às proteínas do tipo selvagem.
Como mais uma vantagem oferecida pela invenção, o objeto desta consiste também em uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima, (em particular, as moléculas el-sd ou e2-sd, ou el-e2-sd, pit1-e1-sd ou pit2-e2-sd, conforme definido na tabela 1 abaixo), que codifique uma proteína de fusão, conforme mencionado acima, (em particular, as moléculas E1-Sd ou E2-Sd, ou E1-E2-Sd, PITI-E1- Sd ou PIT2-E2-Sd), caracterizada pelo fato de compreender, da sua porção final 5 à sua porção final 3, uma sequência de ácidos nucléicos, que codifique um peptídeo de iniciação de transferência (PIT) de um isolado do vírus da hepatite C, uma sequência de ácidos nucléicos que codifique uma proteína El ou E2 de um isolado do vírus VHC, ou uma sequência de ácidos nucléicos que codifique a proteína S deletada de um isolado do vírus VHB.
A inserção de uma sequência de ácidos nucléicos codificante do referido peptídeo de iniciação de transferência, enxertado na porção n-terminal da supramencionada proteína de fusão (em particular, E1-Sd ou E2- Sd ou EI-E2-Sd) apresenta, como uma vantagem, o fato de que . essa última, logo após a tradução, é encaminhada ao retículo endoplasmático, para que seja corretamente glicosilada, para que a sua conformação tridimensional e/ou suas características i antigênicas não apresentem alterações substanciais em relação às as proteínas do tipo selvagem.
Outro objeto da presente invenção consiste em uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima, caracterizada pelo fato de compreender, apenas, as duas primeiras sequências de ácidos nucléicos acima referidas, sendo desprovida de qualquer sequência de ácidos nucléicos que codifique um peptídeo de iniciação de transferência.
O objeto da presente invenção diz respeito, especificamente, a uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima, que codifica uma proteína de fusão da invenção, sendo caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos:
- a sequência de á cidos nucléicos que codifique É a proteína S, deletada do VHB (Sd», e composta, principalmente, por seus três domínios transmembraanares localizados na porção c- terminal (figuras 2A e 3A), devendo a referida proteína S deletada conservar a capacidade de se agre gar em partículas subvirais, e manter as suas propriedades imunogênicas contra o vírus VHB, e - a sequência de Ácidos nucléicos que codifique a quase-totalidade da sequência de uma das proteínas El ou E2 (figuras 3B e 3C), sendo igualmente capaz de conservar as suas propriedades imunogênicas contra o vírus VHC, E - a sequência de ácidos nucléicos codificante de um peptídeo de iniciação de transferência, aludido na invenção, que conserve a capacidade de, logo após a tradução, encaminhar a i referida proteína de fusão ao retículo endoplasmático, para que ela seja corretamente glicosilada., para que a sua conformação tridimensional sofra o menor níúamero possível de alterações, e para que as suas características antigênicas sejam mais preservadas em relação às proteínas do tipo selvagem, de tal modo que a proteína de fusão, codificada pela supramencionada molécula híbrida de ácidos nucléicos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais, e conserve as suas propriedades imunogêniscas frente aos vírus VHB e/ou VHC e, em particular, a propriedade de induzir uma dupla imunização contra os vírus VHB «e VHC. “Percentual de homologia” é definido como sendo o percentual determinado pela comparação direta entre duas sequências de moléculas de polinucleotídeos, pela i determinação do número de resíduos de ácidos nucléicos das duas sequências e, em seguida, pela divisão desse valore pelo número de resíduos de ácidos nucléicos da sequência mais longa, e, finalmente, pela multiplicação do resultado por 100.
De acordo com um aspecto particularmente vantajoso da invenção, as sequências de ácidos nucléicos que codificam os domínios transmembranares de El e/ou de E2 são deletados em parte, perdendo, no mínimo, um dos últimos nove ácidos nucléicos e, preferencialmente, os últimos nove ácidos . —nucléicos,localizadosna 3”. posição, de modo a que as sequências de ácidos nucléicos que codificam os domínios transmembranares de El e/ou de E2 correspondam: | - aos fragmentos de nucleotídeos do genoma de um isolado do VHC, localizados nas regiões que se estendem: *do ácido nucléico na posição 1398 àquele na posição 1490 e, de forma mais vantajosa, do ácido nucléico na posição 1398 àquele na posição 1481, no que diz respeito à sequência de ácidos nucléicos que codifica os domínios transmembranares de E1, ou *do ácido nucléico na posição 2493 àquele na posição 2579 e, de forma mais vantajosa, do ácido nucléico na posição 2493 àquele na posição 2570, no que diz respeito à sequência de ácidos nucléicos que codifica os domínios transmembranares de E2, ou
- aos fragmentos de nucleotídeos do genoma de Í um isolado do VHC, que apresentem um percentual de homologia com os supramencionados fragmentos de nucleotídeos, do tipo selvagem, do genoma do VHC de, pelo menos, 91% em relação a El,ede,pelomenos, 90% em relação a E2, ou - aos fragmentos de nucleotídeos extraídos de variantes naturais do vírus VHC, e/ou extraídos das variantes sintéticas dos referidos fragmentos de nucleotídeos, do tipo selvagem, do genoma de um isolado do VHC.
A expressão “domínios transmembranares de E1 . e/ou E2, deletados de, pelo menos, um dos últimos nove ácidos nucléicos localizados na posição 3, diz respeito às deleções de 3, 6 ou 9 ácidos nucléicos localizados na posição 3 de um dos | referidos domínios transmembranares.
De forma vantajosa, a primeira e a segunda sequências de ácidos nucléicos da supramencionada molécula híbrida de ácidos nucléicos, que codificam a aludida proteína de fusão imunogênica, são contíguas, sendo a extremidade 5 da primeira sequência de ácidos nucléicos ligada, de forma covalente, à extremidade 3 da segunda sequência de ácidos nucléicos.
De acordo com um aspecto particularmente vantajoso, a molécula híbrida de ácidos nucléicos, definida acima, corresponde, por exemplo, às moléculas el-sd, e2-sd, ou pil-el- sd ou pit2-e2-sd, que codificam as proteínas de fusão E1-Sd, E2- Sd, ou PITI-E1-Sd ou PIT2-E2-Sd.
De acordo com outro aspecto vantajoso da | invenção, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ligante conecta as supramencionadas primeira e segunda sequências de nucleotídeo, sendo a referida sequência de s “nucleotídeos composta: - por 3, 6, 9, 12 ou 15 ácidos nucléicos, ou - por qualquer sequência de nucleotídeos, que codifique qualquer peptídeo ligante; desde que a proteína de fusão imunogênica, codificada pela molécula híbrida de ácidos nucléicos, e . Ccaracterizada pelo fato de compreender o referido peptídeo ligante, que é codificado pela referida sequência de nucleotídeos, mantenha a capacidade de se autoagregar em partículas subvirais- | não-infecciosas, na presença da proteína S do tipo selvagem, e CONServe as propriedades imunogênicas frente aos vírus VHC e/ou VHB.
Sob esse aspecto, o objeto da invenção consiste, em particular, em uma molécula híbrida de ácidos nucléicos., conforme mencionado acima, onde a primeira sequência de ácidos — nucléicos, codificante da proteína S deletada na porção n-termina 1 do VHB e, em particular, de um isolado do VHBadw, esteja localizada na extremidade 3 da dita molécula híbrida de ácido:s nucléicos, sendo composta: - por uma sequência de ácidos nucléicos, ligad:a pelos ácidos nucléicos contíguos, localizados no espaço entre as posições 1630 e 2241 do genoma do VHB e, em particular,
- pela sequência de ácidos nucléicos representada pela SEQ ID no. 1, ou - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a referida sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína S deletada na porção n-terminal, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente . aovírus VAHB,ou
E - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHB, ou de uma | variante sintética derivada da referida sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína S deletada na porção n- terminal, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB.
Um objeto mais peculiar da invenção diz respeito a uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima (em especial, el-sd ou e2-sd, ou el-e2-sd, pitl-el-sd ou pit2-e2-sd, ou pitl-el-e2-sd), que codifique uma proteína de fusão acima mencionada (em especial, E1-Sd ou E2- Sd, ou E1-E2-Sd, PITI-E1I-Sd ou PIT2-E2-Sd ou PITI-E1-E2- Sd), para a qual a dita sequência de ácidos nucléicos que codifica a proteína S deletada do VHC seja a sequência do isolado do h VHBadw, contendo a SEQ ID no. 1. Mais uma vez, neste particular, a invenção diz respeito, de forma mais específica, a uma moléculia híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima, onde a segunda sequência de ácidos mnucléicos, codificante do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína El do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, esteja localizada na extremidade 5 da dita molécula híbrida de ácidos nucléicos, sendo composta: - por uma sequência de ácidos nuc-léicos, ligada . — pelos ácidos nucléicos contíguos, localizados no espaço entre as posições 915 e 1490 e, particularmente, entre as posições 915 e 1481 do genoma do VHC e, em particular, do isolado VHC-I a, | e, em especial, pela sequência de ácidos nucléicos representada pela SEQ ID no. 3, ou - por uma sequência de ácidos mucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de ácidos nucléicos da proteína El, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácãdos nucléicos conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC, ou - pela sequência de ácidos nucLéicos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VEIC, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína El, desde que a proteína i codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC.
Um objeto mais peculiar da invenção diz respeito a uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima (em especial, el-sd ou pit1-el-sd, ou el-e2-sd, ou pitl-el-e2-sd), que codifique uma proteína de fusão acima mencionada (em especial, EIl-Sd ou PITI-E1-Sd, ou E1-E2-Sd, ou PITI-EI-E2-Sd), para a qual a dita sequência de ácidos nucléicos que codifica a proteína El seja a sequência do isolado . —do VHC-la, contendo a SEQ ID no. 3. A invenção se refere, em particular, a uma i molécula híbrida de ácidos nucléicos caracterizada pelo fato de i ser codificante de uma proteína de fusão acima mencionada, que compreenda um peptídeo de iniciação de transferência, localizado na porção n-terminal, sendo a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos representada: - pela SEQ ID no. 11, ou - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a dita SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VHC, ou
- pela sequência de ácidos nucléicos de uma À variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite —C,e/ouaoda hepatite B.
A sequência de ácid-os nucléicos SEQ ID no. 11, também designada como pitl-el-sd, codifica a proteína de fusão PIT1I-E1-Sd da SEQ ID no. 12 (cf. a tabela 1).
Outro objeto da invenção consiste em uma molécula híbrida de ácidos nucléicos (em particular, pit1-el-sd da -. —“SEQIDno.1l),paraa qual: - a sequência de áci dos nucléicos, codificante da À proteína El, seja extraída do VHC e:, particularmente, do isolado — VHCI a, e seja a supramencionada sequência SEQ ID No. 3, e - a sequência de ácãdos nucléicos, codificante da proteína S, seja extraída do VHB e. particularmente, do isolado HBVadw, e seja a supramencionadia sequência SEQ ID No 1, sendo tal sequência enxertada na 5º. extremidade da SEQ ID No. 3 de El que, por sua vez, é enxerrtada na 5º. extremidade da sequência de ácidos nucléicos, codificante do peptídeo de iniciação de transferência da proteína El (PIT1), inserida na região compreendida entre os ácidos nucléicos nas posições 837 e 914 do VHC. Neste particular, a invenção diz respeito, de forma mais específica, a uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima, onde a segunda sequência de ácidos mnucléicos, codificante do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína E2 do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, esteja localizada na extremidade 5 da dita molécula híbrida de ácidos nucléicos, sendo composta: - por uma sequência de ácidos nucléicos, ligada pelos ácidos nucléicos contíguos, localizados no espaço entre as posições 1491 e 2579 e, particularmente, entre as posições 1491 e 2570 do genoma do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, e, em especial, pela sequência de ácidos nucléicos representada pela SEQ ID no. 5, ou D - por uma sequência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, i pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, i ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de ácidos nucléicos da proteína E2, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID No. 5, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC.
Um objeto mais peculiar da invenção diz respeito a uma molécula híbrida de ácidos nucléicos (em particular, e2-sd ou pit2-e2-sd), que codifique uma proteína de i fusão (em particular, E2-Sd ou PIT2-E2-Sd). A invenção se refere, em particular, a uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, caracterizada pelo fato de s —ser codificante de uma proteína de fusão acima mencionada, que compreenda um peptídeo de iniciação de transferência, locali zado na porção n-terminal, sendo a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos representada: - pela SEQ ID no. 13, ou - por uma sequência de ácidos nucleicos que . — apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, f ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ — IDno. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB, ou - pela sequência de ácidos nucléicos, derivada de uma variante sintética derivada da referida SEQ 1 D no. 13, desde que a proteína codificada pela re ferida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, e/ou ao da hepatite B.
A sequência de ácidos nucléicos SEQ ID no. 13, também denominada pit2-e2-sd, codifica a proteína de fusão —PIT2-E2-Sd da SEQ ID no. 14 (cf. a tabela 1).
Outro objeto da invenção consiste em uma molécula híbrida de ácidos nucléicos (em particular, pit2-e2-sd da SEQ ID no. 13), para a qual: - a sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína E2, seja extraída do VHC e, particularmente, do isolado VHCIa, e seja a supramencionada sequência SEQ ID No. 5, e, | para a qual | - a sequência de ácidos nucléicos, codificante da | proteína S, seja extraída do VHB e, particularmente, do isolado HBVadw, e seja a supramencionada sequência SEQ ID No |, . —sendotal sequência enxertada na 5º. extremidade da SEQ ID No. 5 de E2 que, por sua vez, é enxertada na 5º. extremidade da : sequência de ácidos nucléicos, codificante do peptídeo de Í iniciação de transferência da proteína E2 (PIT2), inserida na região compreendida entre os ácidos nucléicos nas posições 1437 e 1490 do VHC.
Outro objeto da invenção consiste em um vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme mencionado acima, que codifique uma proteína de fusão acima aludida, bem como os meios necessários à sua expressão, relacionada, de forma operacional, à referida molécula híbrida de ácidos nucléicos.
Quanto aos vetores de expressão adequados para os fins desta invenção, podem ser citados, como exemplo, os — plasmídios, os vetores virais do tipo lentiviral, vírus da floresta de
Semliki, adenovírus, poxvírus, vírus de vacinas, baculovírus, | vetores bacterianos do tipo salmonella, e BCG.
“Meios necessários à expressão” são definidos como sendo uma proteína, em cuja conceituação se inclui qualquer molécula de aminoácidos, tais como proteínas, proteínas de fusão, fragmentos de proteínas, peptídeos, poliproteínas, polipeptídeos, etc..., ou seja, quaisquer meios que possibilitem a obtenção de uma proteína e, em particular, um agente promotor, um terminador de transcrição, uma origem de replicação e, preferencialmente, um marcador de seleção. Os meios necessários . à expressão de um peptídeo estão relacionados, de forma . Operacional, à sequência de ácido nucléico que codifique o peptídeo de interesse.
| “Relacionado de uma forma operacional” é uma expressão aqui definida como sendo uma justaposição dos componentes necessários à expressão e à codificação, pelo gene, do peptídeo de interesse, relacionando-os, de forma a permitir que eles funcionem da maneira esperada. Por exemplo, podem existir bases suplementares entre o promotor e o gene de interesse, enquanto for mantida a sua relação funcional.
Os meios necessários à expressão de um peptídeo podem ser homólogos ou, em outras palavras, incluídos no genoma do vetor utilizado, ou, pelo contrário, podem ser heterólogos, caso em que os referidos meios são clonados ao — peptídeo de interesse a ser expresso.
Preferencialmente, o promotor é utilizado no E vetor constituído pelo vírus da floresta de Semliki, e o vetor lentiviral usado como vetor de expressão é um promotor homólogo, sendo um promotor do citomegalovírus (CMV).
A título meramente exemplificativo, podem ser mencionados exemplos de promotores heterólogos que compreendem, em particular, (1) promotores virais, como o promotor do SV40 (vírus 40 de Simian), o promotor do gene da timidina-quinase do vírus do Herpes simples (TK-HSV-1), o LTR do vírus do sarcoma de Rows (RSV), o promotor do . — citomegalovírus (CMV), e o principal promotor tardio do adenovírus (MLP), assim como (ii) qualquer promotor celular que controle a transcrição de genes codificantes de peptídeos em eucariotos mais avançados como, por exemplo, o promotor do gene constitutivo da fosfoglicermato-quinase (PGK) (Adra et al, 1987, Gene, 60: 65-74), o proamotor de genes específicos da antitripsina-alfa do fígado, o FIX, e o promotor SM22, específico para as células da musculatura lisa (Moessler et al., 1996, Development, 122: 2415-2425).
A invenção diz respeito, em especial, a um vetor, conforme mencionado acima, caracterizado pelo fato de compreender, ainda, um vetor lentiviral.
O objeto da invenção consiste, mais i particularmente, em um vetor, conforme mencionado acima, caracterizado pelo fato de compreender um vetor lentiviral do tipo pLenti.
Esse último já havia sido mostrado À anteriormente, e, em particular, por Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H., Verma, I. M., and Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of —nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263- T7.
Outro objeto da invenção consiste em um vetor, conforme mencionado acima, caracterizado pelo fato de compreender, ainda, um vetor viral defectivo, extraído do genoma do vírus da floresta de Semliki.
' Esse último já havia sido mostrado anteriormente, e, em particular, por Schlesinger, S., and T. M.
| Dubensky, Jr. 1999. Alphavirus vectors for gene expression and vaccines. Curr. Opin. Biotechnol. 10:434—439, Em particular, um dos objetos da invenção consiste em um vetor, conforme mencionado acima, onde o vetor viral defectivo, extraído do genoma do vírus da floresta de Semliki, seja o vetor pSV1, sendo, este último, comercializado pela empresa Invitrogen.
A propósito, o objeto da invenção consiste, mais particularmente, em um vetor, cuja molécula híbrida de ácidos nucléicos seja caracterizada pelo fato de ser composta: - pela sequência de ácidos nucléicos representada pela SEQ ID no. 11, ou - por uma sequência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de,
pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, f ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a dita SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos, codificante de uma proteína de fusão, conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VHC, cujo vetor seja especialmente representado pela SEQ ID no. 15, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma . — Variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos, i codificante de uma proteína de fusão, conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VHC.
Outro objeto da invenção consiste em um vetor extraído de pSFV1 da sequência SEQ ID no. 15, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácido nucléico (em particular, pitl-el-sd da SEQ ID no. 11), codificante da supramencionada proteína de fusão (em particular, PIT1-E1-Sd da SEQ ID no. 12), e para a qual: - a sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína El, seja extraída do VHC e, particularmente, do isolado VHCIa, e seja a supramencionada sequência SEQ ID No. 3, e, paraaqual
- a sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína S, seja extraída do VHB e, particularmente, do isolado HBVadw, e seja a supramencionada sequência SEQ ID No 1, sendo tal sequência enxertada naa 5º. extremidade da SEQ ID No. 3 deEl que, por sua vez, é «enxertada na 5º. extremidade da sequência de ácidos nucléicos, codificante do peptídeo de iniciação de transferência da proteína El (PITI), inserida na região compreendida entre os ácidos nucléicos nas posições 837 e 914 do VHC.
A propósito, O objeto da invenção consiste, mais . — particularmente, em um dos vetores acima referidos, cuja molécula híbrida de ácidos nu«cléicos seja caracterizada pelo fato : de ser composta: i - pela sequência de ácidos nucléicos representada pela SEQ ID no. 13, ou - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particu larmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, d e, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID no. 13, desde que a referida sequência de ácidos nucleicos codifique um peptídeo capaz de formar partículas não-infecciosas e imunogênicas frente ao víruis VHC e/ou frente ao vírus VHB, cujo vetor seja especialmente representado pela SEQ ID no. 16, ou - pela sequência de ácidos nucléicos, derivada de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 13,
desde que a referida sequência de ácidos nucleicos codifique um i peptídeo capaz de formar partículas não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB.
Outro objeto da invenção consiste em um vetor da SEQID no. 16, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácido nucléico (em particular, pitl-el-sd da SEQ ID no. 13), codificante da supramencionada proteína de fusão (em particular, PITI-E1-Sd da SEQ ID no. 14), e para a qual: - a sequência de ácidos nucléicos, codificante da . — proteína E2, seja extraída do VHC e, particularmente, do isolado ó VHCla, e seja a supramencionada sequência SEQ ID No. 5, e, para a qual | - a sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína S, seja extraída do VHB e, particularmente, do isolado HBVadw, e seja a supramencionada sequência SEQ ID No |, sendo tal sequência enxertada na 5º. extremidade da SEQ ID No. 5 de E2 que, por sua vez, é enxertada na 5º. extremidade da sequência de ácidos nucléicos, codificante do peptídeo de iniciação de transferência da proteína E2 (PIT2), inserida na região compreendida entre os ácidos nucléicos nas posições 1437 e 1490 do VHC.
A invenção também se refere a um vetor acima aludido, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, composta pelas três sequências de ácidos nucléicos abaixo:
a)- No lado 3, uma primeira sequência de ácidos nucléicos que codifique a proteína S deletada do domínio transmembranar, localizada na porção n-terminal (Sd) de um isolado do vírus da hepatite B (VHB), ou - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a referida sequência de ácidos nucléicos da porção n-terminal da proteína S deletada, desde que a referida sequência de ácidos nucléicos . — codifique um peptídeo capaz de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma f variante natural de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética, derivada de uma sequência de ácidos nucléicos que codifique a proteína S deletada (Sd), desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos codifique um peptídeo, capaz de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB, e b) no lado 5 da primeira sequência, uma segunda sequência de ácidos nucléicos que codifique o domínio transmembranar e o ectodomínio de, pelo menos, uma proteína de envelope El ou E2 de um isolado do vírus da hepatite C, ou - de uma sequência de ácidos nucléicos que —apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e,
ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida À sequência de ácidos nucléicos que codifica uma das alu&lidas proteínas E1l e E2 de um isolado do vírus da hepatite C, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleficos —codifique um peptídeo imunogênico frente ao vírus VHC, ou - pela sequência de ácidos nucléicos, derãvada de uma variante natural derivada de um isolado do vírus VH'C, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de áacidos nucléicos, que codifique uma das referidas proteínas de envelope El ou E2, desde que a proteína codificada pela referida sequência . — deácidosnucléicos codifique um peptídeo imunogênico frente ao vírus VAHC, | sendo a referida segunda sequência escol hida aa : partir das sequências que codificam a proteína E1, a proteína E2., ouum peptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de compreender as proteínas E] e E2, e c) no lado 5 da segunda sequência, uma terceir:a sequência de ácidos nucléicos que codifique um peptí-deo de iniciação de transferência (PIT) de um isolado do virus dia hepatite C, ou - uma sequência de ácidos nucléicos «de uma variante natural, derivada de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética, derivada da referida sequência de ácid.os nucléicos da proteína que codifica um peptídeo de inicãação de transferência (PIT), desde que o peptídeo de iniciação de transferência, codificado pela referida sequência de ácidos nucléicos, mantenha a capacidade de encaminhar, após a tradução, a aludida proteína de fusão ao retículo endoplasmático, para que ela seja corretamente glicosilada, para que a sua conformação tridimensional apresente o menor número possível de alterações, e/ou para que as suas características antigênicas sejam mais preservadas, em relação às proteínas do tipo selvagem, ou - qualquer sequência de ácidos nucléicos que codifique um peptídeo capaz de encaminhar, após a tradução, a aludida proteína de fusão ao retículo endoplasmático, para que ela . Seja corretamente glicosilada, para que a sua conformação tridimensional apresente o menor número possível de alterações, €&/ou para que as suas características antigênicas sejam mais i preservadas, em relação às proteínas do tipo selvagem.
De forma vantajosa, outro objeto da invenção consiste em um vetor acima mencionado, onde a primeira e a segunda sequências de ácidos nucléicos da supramencionada molécula híbrida de ácidos nucléicos (em particular, el-sd ou el- e2-sd), que codificam a aludida proteína de fusão imunogênica (em particular, El-Sd ou E2-Sd), são contíguas, sendo a extremidade 5 da primeira sequência de ácidos nucléicos ligada, de forma covalente, à extremidade 3 da segunda sequência de ácidos nucléicos.
Sob um outro aspecto vantajoso, a invenção diz respeito ao supramencionado vetor (em particular, em vetor lentiviral como, por exemplo, o vetor pLenti, ou um vetor viral defectivo, extraído do genoma do vírus da floresta de Semliki É como, por exemplo, o vetor pSFVI1), para o qual uma sequência de nucleotídeos, codificante de um peptídeo ligante, conecte a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos, que codificam a —supramencionada proteína de fusão imunogê-nica (erm particular, E1-Sd ou E2-Sd), sendo a referida sequência de nucleotídeos composta por 3, 6, 9, 12, ou 15 ácidos nucléicos, desde que a referida sequência de nucleotídeos, codificante de um peptídeo ligante, não altere a capacidade da supramemcionadaa proteína de fusão imunogênica (em particular, EI-Sd ou E2-Sd) de se E autoagregar em partículas subvirais, na presença da proteína S do tipo selvagem, permitindo, ainda, que esta última coÂserve as suas | propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou ao vírus VEB.
De forma vantajosa, o vet:or acim a mencionado é caracterizado pelo fato de compreender a primeira sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína S deletada na porção n- terminal do VHB e, em particular, de um isolado VHBadw, sendo a referida sequência composta: - por uma sequência de ácidos nuacléicos, ligada pelos ácidos nucléicos contíguos, localizacdlos no espaço entre as posições 1630 e 2241 do VHB e, em particular, do isolado VHBadw, e, em particular, pela sequêmcia de ácidos — nucléicos representada pela SEQ ID no. 1, -ou
- por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a referida SEQID no. 1, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHB, ou de uma .- — variante sintética derivada da SEQ ID no. 1, desde que a proteína : codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e | imunogênicas frente ao vírus VHB.
Um objeto mais peculiar da invenção consiste no supramencionado vetor (em particular, um vetor lentiviral como, por exemplo, o vetor pLenti, ou um vetor viral defectivo derivado do genoma do vírus da Floresta de Semliki como, por exemplo, o vetor pSFV1), caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácidos nucléicos (em particular, el-sd ou e2-sd, ou el-e2-sd, pit1-el-sd ou pit2-e2-sd), que codifique uma proteína de fusão (em particular, E1-Sd ou Ed-Sd, ou E1-E2-Sd, PITI-E1-Sd ou PIT2-E2-Sd), para a qual a sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteína S, deletada do VHB, seja a —sequência do isolado VHBadw, e contenha a SEQ ID no. 1.
De acordo com Outro aspecto peculiar da invenção, o vetor supramencionado & caracterizado pelo fato de compreender a segunda sequência de ácidos nucléicos, codificante do domínio transmembwrranar e do ectodomínio da proteína El do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, que está localizada na extremidade 5 da dita molécula, sendo composta: - por uma sequência de ácidos nucléicos, ligada pelos ácidos nucléicos contíguos, localizados no espaço entre as posições 915 e 1490 e, particularmente, entre as posições 915 e y 1481 do genoma do VHC e, em partãcular, do isolado VHC-1 a, e, em especial, pela sequência de ácidos | nucléicos representada pela SEQID no. 3, ou | - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmemte, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de ácidos nucléicos que codificam a proteína E1, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos — nucléicos conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC, ou - pela sequência. de ácidos nucléicos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de ácidos nucléicos, codificante da aludida proteína El, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC.
Outra peculiaridade do objeto da invenção diz respeito ao supramencionado vetor (em particular, um vetor lentiviral como, por exemplo, o vetor pLenti, ou um vetor viral defectivo, extraído do genoma do vírus da floresta de Semliki como, por exemplo, o vetor pSFV1), caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácidos nucléicos (em particular, el-sd ou el-e2-sd, pitl-el-sd), codificante de uma proteína de fusão (em particular, E1-Sd, ou E1-E2-Sd, PIT-E1- : Sd), para a qual a sequência de ácidos nucléicos codificante da proteína El do VHC seja aquela do isolado VHC-la, contendo a — SEQIDno.3.
| De acordo com outro aspecto vantajoso da invenção, o vetor supramencionado é caracterizado pelo fato de compreender a segunda sequência de ácidos nucléicos, codificante do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína E2 do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, que está localizada na extremidade 5 da dita molécula, sendo composta: - por uma sequência de ácidos nucléicos, ligada pelos ácidos nucléicos contíguos, localizados no espaço entre as posições 1491 e 2579, e, particularmente, entre as posições 1491 € 2570 do genoma do VHC e, em particular, do isolado VHC-1 a, e, em especial, pela sequência de ácidos nucléicos representada pela SEQ ID no. 5, ou
- por uma sequência de ácidos nucleicos que i apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de ácidos nucléicos que codificam a proteína E2, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma . Variante sintética derivada da referida sequência de ácidos nucléicos, codificante da aludida proteína E2, desde que a | proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos | conserve as suas propriedades imunogênicas frente ao vírus VHC.
Outra peculiaridade do objeto da invenção diz respeito ao supramencionado vetor (em particular, um vetor lentiviral como, por exemplo, o vetor pLenti, ou um vetor viral defectivo, extraído do genoma do vírus da floresta de Semliki como, por exemplo, o vetor pSFVI), caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácidos nucléicos (em particular, e2-sd ou el-e2-sd, pit2-e2-sd), codificante de uma proteína de fusão (em particular, E2-Sd, ou E1-E2-Sd, PIT-E2- Sd), para a qual a sequência de ácidos nucléicos codificante da proteína E2 do VHC seja aquela do isolado VHC-la, contendo a
SEQIDno.5.
Outro objeto da invenção consiste em uma : partícula de envelope subviral, quimérica, imunogênica e não- infecciosa, caracterizada pelo fato de compreender as seguintes proteínas: - a proteína composta pela proteína S do tipo selvagem, presente no antígeno de superfície de um isolado do vírus da hepatite B (VHB), e - pelo menos, uma proteína de fusão imunogênica acima mencionada.
A expressão “partícula subviral quimérica” é . — definida como sendo qualquer partícula subviral, caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, a proteína S do tipo | selvagem de VHB, e uma proteína de fusão imunogênica acima Í mencionada, resultante da autoagregação da proteína S do tipo selvagem, ou da agregação da supramencionada proteína de fusão, na presença da proteína S do tipo selvagem.
Como uma das vantagens trazidas pela invenção, a proteína de fusão imunogênica da supramencionada partícula subviral quimérica é caracterizada pelo fato de ser constituída: - pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 8, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95%
com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural extraída de um isolado do vírus VHC e/ou do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB.
: Outro objeto da invenção consiste na , supramencionada partícula subviral quimérica e imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender uma proteína de fusão | acima mencionada e, em particular, a proteína de fusão E1-Sd da SEQID no. 8 ou a E1-E2-Sd, e, para a qual, a sequência da proteína El consista, especialmente, na supramencionada SEQ ID no. 4, sendo especialmente enxertada na porção c-terminal da sequência de aminoácidos da proteína S (Sd), deletada da SEQ ID no. 2.
De acordo com uma outra peculiaridade da invenção, a proteína de fusão imunogênica da supramencionada partícula subviral quimérica imunogênica é caracterizada pelo fato de ser constituída: - pela sequência de aminoácidos, representada — pela SEQID no. 10, ou
- por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo rnenos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo: menos, 95% coma referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partícwilas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a . aludida sequência de aminoácidos conserve a c.apacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunosgênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C. : Outro objeto da invenção consiste na supramencionada partícula subviral quimérica e imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender uma proteína de fusão acima mencionada e, em particular, a proteína de fuisão E1-Sd da SEQ ID no. 10 ou a E1I-E2-Sd, e, para a qual, a sequência da proteína El consista, especialmente, na supramencionada SEQ ID no. 6, sendo especialmente enxertada na porção c-terminal da sequência de aminoácidos da proteína S (Sd), deletada da SEQ ID no. 2. De acordo com um outro aspecto vantajoso da invenção, a supramencionada partícula subviral quimérica imunogênica é caracterizada pelo fato de compreender as duas proteínas de fusão seguintes:
- a sequência de aminoácidos, representada pela Á SEQ ID no. 8, ou - uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelomenos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida SEQ ID no. 8 codifique uma proteína que conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou : - a sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida | SEQ ID no. 8 codifique uma proteína que conserve a capacidade * de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, e - a sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou - uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao Vírus da hepatite C, ou
- a sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve: a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírusda hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
Outro objeto da imvenção consiste em uma partícula subviral quimérica imunosênica acima mencionada, caracterizada pelo fato de compreender as duas proteínas de fusão acima mencionadas (em particular, E1-Sd da SEQ ID no. 8, ou E1I-E2-Sd; e E2-Sd da SEQ ID no. 10X). ; A invenção também diz respeito a uma partícula subviral quimérica imunogênica acima mencionada, onde a | proteína de fusão imunogênica seja caracterizada pelo fato de i compreender, pelo menos, uma das proteínas do envelope (E1) de um isolado do vírus da hepatite C, semdo tal proteína composta: - por uma sequêmcia de aminoácidos que corresponda aos resíduos de aminoá-.cidos localizados na região compreendida entre os aminoácidos nas posições 192 a 380, da proteína S do tipo selvagem do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com areferida sequência de proteínas: E] do tipo selvagem, de um isolado do VHC, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite i C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida proteína El, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
Outro objeto da invenção consiste em uma partícula subviral quimérica imunogênica acima mencionada, caracterizada pelo fato de compreender uma proteína de fusão . acima mencionada (em particular, El-Sd ou E1-E2-Sd, ou PIT1- E1-E2-Sd ou PIT2-E2-E1-Sd), para a qual a sequência da proteína É El seja derivada do isolado VHC-1 a.
Í Outra objeto da invenção consiste em uma partícula subviral quimérica imunogênica acima mencionada, onde a proteína de fusão imunogênica seja caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, uma das proteínas do envelope (El) de um isolado do vírus da hepatite C, sendo tal proteína composta por sequências de aminoácidos escolhidas dentre as seguintes: - uma sequência de aminoácidos que corresponda aos resíduos de aminoácidos localizados na região compreendida entre os aminoácidos nas posições 384 a 743, da proteína S do tipo selvagem da proteína E2 do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%,
notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo ] menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com as referidas sequências de proteínas E2 do tipo selvagem, do referido isolado do VHC, desde que a aludida sequência de s aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades — — imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
Outro objeto da invenção consiste em uma partícula subviral quimérica imunogênica acima mencionada, " caracterizada pelo fato de compreender uma proteína de fusão acima mencionada (em particular, E2-Sd ou E1-E2-Sd, ou PIT1- E1-E2-Sd), para a qual a sequência da proteína E2 seja derivada do isolado VHC-I1 a.
De acordo com outra de suas peculiaridades, a invenção também diz respeito a uma partícula subviral quimérica imunogênica acima mencionada, caracterizada pelo fato de compreender as duas proteínas de fusão seguintes: - a proteína de fusão caracterizada pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos constituída pelos aminoácidos localizados na região compreendida entre os aminoácidos nas posições 192 a 383, e, em particular, nas posições 192 a 380 da proteína S do tipo selvagem da proteína E1 do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, ou - uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelomenos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com as referidas sequências de proteínas El do tipo selvagem, de um isolado do VHC, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - a sequência de aminoácidos de uma variante : natural extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida proteína El, desde que a aludida : sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
- a proteína de fusão caracterizada pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos constituída pelos aminoácidos localizados na região compreendida entre os aminoácidos nas posições 384 a 746, e, em particular, nas posições 384 a 743 da proteína E2 do tipo selvagem, do VHC e, em particular, do isolado VHC-la, ou - uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com as referidas —sequências de proteínas E2 do tipo selvagem, do referido isolado do VHC, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve À as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - a sequência de aminoácidos de uma variante natural extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
Outro objeto da invenção consiste em uma partícula subviral quimérica imunogênica acima mencionada, caracterizada pelo fato de compreender duas proteínas de fusão , acima mencionadas (em particular, E1-Sd ou PIT1-E1-Sd, ou E2- Sd ou PITI-E1-Sd, ou E1-E2-Sd, ou PITI-E1-E2-Sd).
: Outro objeto da invenção consiste em uma | composição imunogênica caracterizada pelo fato de compreender, como elemento ativo, pelo menos um composto escolhido dentre OS seguintes: - uma proteína de fusão acima mencionada, - uma molécula híbrida de ácido nucléico, conforme descrito anteriormente, - um vetor acima mencionado, caracterizado pelo fato de compreender a referida molécula híbrida de ácido nucléico, - uma partícula subviral quimérica, conforme descrito acima, e um veículo aceitável, sob o ponto de vista farmacêutico.
De acordo com uma forma peculiar de realização da invenção, a composição farmacêutica também contém um veículo aceitável, sob o ponto de vista farmacêutico, a partir do qual todos aqueles versados na área técnica en volvida poderão verificar, com facilidade, a natureza e a quantidade a ser usada, em função dos parâmetros e dos elementos constitu intes da composição farmacêutica desejável, da forma farmacológica e do modo de administração.
As composições farmacêuticas da inveração são adequadas à administração oral, sublingual, subcutânea, : intramuscular, intravenosa, tópica, local, intratraqueal, inttranasal, transdérmica, retal, administração intraocular, intra-auricular, podendo a substância ativa ser administrada pela via de | administração por dose unitária.
As vias de administração por dose unitária podem, por exemplo, consistir em tabletes, cápsulas, grânulos, pós, soluções injetáveis ou suspensões orais, adesivos transdérmicos, vias de administração sublinguali bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, intra-auricular, bem como inalação, vias de administração tópica, transdérmica, sulocutânea, intramuscular ou intravenosa, vias de administração retal ou implantes. No tocante à administração tópica, pode ser considerada a possibilidade de uso de cremes, géis, ppomadas, loções ou colírios.
De forma mais vantajosa a comnposição imunogênica acima mencionada é caracterizada pelo: fato de incluir, como substância ativa, pelo menos um composto i escolhido dentre os três seguintes: a) uma proteína de fusão acima mencionada, que seja constituída: * pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 8, ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% . coma referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais | não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou i ao vírus da hepatite C, ou * pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, b) uma molécula híbrida de ácidos nucléicos que seja constituída: * pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela SEQ ID no. 11, ou * por uma sequência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e,
ainda mais particularmente, de, pelo menos:, 90% com a dita SEQ : ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidad.e de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou * pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vínus VHB e/ou frente ao vírus VHC, ou por um vetor que compreenda a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos; À c) uma partícula subviral quimérica, que compreenda a proteína de fusão imunogêmica constituída: * pela sequência de anmainoácidos, representada pela SEQ ID no. 8, ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de forrmar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao» vírus da hepatite B e/ou —ao vírus da hepatite C, ou
* pela sequência de aminoácidos de uma ó variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírusda hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
Um objeto peculiar da invenção diz respeito a um dos três compostos seguintes: a) — a supramencionada proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender a proteína El (em particular, El-Sd, PITI-E1-Sd, E1-E2-Sd, PITI1-E1-E2-Sd), cuja . representação gráfica é fornecida pela figura 3B, e que compreende a quase-totalidade da proteína El do VHC, enxertada ! na porção n-terminal da proteína S, deletada do VHB, ou i b) - a supramencionada molécula híbrida de ácidos nucléicos, caracterizada pelo fato de compreender a proteína El (em particular, el-sd, pitl-el-sd, el-e2-sd, pitl-el- e2-sd), que compreende a quase-totalidade da sequência de ácidos nucléicos que codifica a proteína El do VHC, enxertada na 5º extremidade da sequência de ácidos nucléicos, que codifica a proteína S, deletada do VHB, ou c) - a supramencionada partícula subviral, caracterizada pelo fato de compreender a proteína El (em particular, E1-Sd, PITI-E1-Sd, E1-E2-Sd, PITI-E1-E2-Sd), cuja representação gráfica é fornecida pela figura 3B, e que compreende a quase-totalidade da proteína El do VHC, enxertada na porção n-terminal da proteína S, deletada do VHB.
De acordo com outro aspecto peculiar da h invenção, a supramencionadda composição imunogênica é caracterizada pelo fato de incluir como substância ativa pelo menos um composto escolhido dentre os seguintes: a) uma proteíma de fusão, que seja constituída: * pela sequêmcia de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo À menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de f aminoácidos conserve a capac-idade de formar partículas subvirais * não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou * a sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao Vírus da hepatite B e/ou ao vítus da hepatite C, b) uma molécula híbrida de ácidos nucléicos que seja constituída: * pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela SEQ ID no». 13, ou * por uma: sequência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de,
pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, Í ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas s subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou * pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou i ou por um vetor que compreenda a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos; c) uma partícula subviral quimérica, que compreenda a proteína de fusão imunogênica constituída: * pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais —não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou
* pela sequência de aminoácidos de uma ' variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente —aovírusda hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
Um objeto peculiar da invenção diz respeito a um dos três compostos seguintes: a) — a supramencionada proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender a proteína E2 (em particular, E2-Sd, PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PITI-E1-E2-Sd), cuja E representação gráfica é fornecida pela figura 3C, e que compreende a quase-totalidade da proteína E2 do VHC, enxertada na porção n-terminal da proteína S, deletada do VHB, ou b) - a supramencionada molécula híbrida de ácidos nucléicos, caracterizada pelo fato de compreender a proteína E2 (em particular, e2-sd, pit2-e2-sd, el-e2-sd, pitl-el- e2-sd), que compreende a quase-totalidade da sequência de ácidos nucléicos que codifica a proteína El do VHC, enxertada na 5º extremidade da sequência de ácidos nucléicos, que codifica a proteína S, deletada do VHB, ou c) - a supramencionada partícula subviral, caracterizada pelo fato de compreender a proteína El (em particular, E1-Sd, PIT1-E1-Sd, E1-E2-Sd, PIT1-E1-E2-Sd), e que compreende a quase-totalidade da proteína E2 do VHC, enxertada na porção n-terminal da proteína S, deletada do VHB.
De acordo com outro aspecto vantajoso da á invenção, a supramencionada composição imunogênica é caracterizada pelo fato de a substância ativa ser uma partícula subviral quimérica, e que compreenda, pelo menos, as duas s proteínas de fusão imunogênicas constituídas: - pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 8, ou, - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo» : menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas sunbvirai:s É não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos die umaa variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas fremte ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, e - pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou, - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, —notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 9 5% Mo com a referida SEQ ID no. 10 de E2-Sd, desde que a aludida ] sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C. Um objeto peculiar da invenção diz respeito à — Supramencionada partícula subviral, caracterizada pelo fato de compreender duas proteínas de fusão acima aludidas, sendo uma i delas caracterizada pelo fato de compreender: e - a proteína El do VHC (em particular, E1-Sd, PITI-EI-Sd, EI1-E2-Sd, PITI-E1-E2-Sd), e pela proteína E2 do VHC, enxertada na porção n-terminal da proteína S, deletada do VHB; e, sendo a outra caracterizada pelo fato de compreender - a proteína E2 do VHC (em particular, E2-Sd, PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PIT1-E1-E2-Sd), enxertada na porção n- terminal da proteína S, deletada do VHB.
[27] De acordo com um aspecto particularmente vantajoso da invenção, a composição imunogênica acima mencionada é caracterizada pelo fato de a substância ativa ser constituída pela mistura que compreende: - pelo menos duas proteínas de fusão, conforme especificado abaixo:
* sendo uma delas constituída: f * pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 8, ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partíc-ulas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da h epatite B e/ou : ao vírus da hepatite C, ou : - a sequência de aminoácidos de: uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida | sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênmicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, * e sendo a outra constituída: * pel sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pe:lo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de — aminoácidos conserve a capacidade de formar p artículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou Á ao vírus da hepatite C, ou a sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C; - pelo menos duas moléculas híbridas de ácidos nucléicos seguintes: * sendo uma delas constituída: : * pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela SEQ ID no. 11, ou * —por uma sequência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, as pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a dita SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou * — pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VHC,
ou por um vetor que compreenda a dita h molécula híbrida de ácidos nucléicos; *sendo a outra constituída: e pela sequência de ácidos nucléicos, — representada pela SEQ ID no. 13, ou * —poruma sequência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência E de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas : subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou * — pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou por um vetor que compreenda a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos; - pelo menos, duas partículas subvirais quiméricas, conforme especificado abaixo: * uma delas compreenderá a proteína de fusão —imunogênica constituída:
e pela sequência de aminoácidos, à representada pela SEQ ID no. 8, ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou : * pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a | aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, * uma delas compreenderá a proteína de fusão imunogênica constituída: e pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de —aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/Ou Í ao vírus da hepatite C, ou e pela sequência de aminoácidos de urma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
Um objeto peculiar da invenção diz respeito à mistura caracterizada pelo fato de compreender os seguintes compostos: ; a) — pelo menos duas das supramencionaddas proteínas de fusão, sendo uma delas caracterizada pelo fato de compreender a proteína El (em particular, E1-Sd da SEQ ID no. 8 “ou PITIEI-Sd, El-E2Sdy PITIEI-E2SO, e a outra caracterizada pelo fato de compreender a proteína E2 Cem particular, E2-Sd da SEQ ID no. 10 ou PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PITI-E1-E2-Sd) do VHC, sendo essa última enxertada na porção n-terminal da proteína S, deletada do VHB, ou b) — pelo menos duas das supramencionaadas moléculas híbridas de ácidos nucléicos, sendo uma delas caracterizada pelo fato de codificar a proteína El (em particular, pit1-e1-Sd da SEQ ID no. 11 ou el-sd ou el-e2-sd, ou pit1-el -e2- sd), e a outra caracterizada pelo fato de codificar a proteína El (em particular, pit2-e2-sd da SEQ ID no. 13 ou e2-sd ou el-e2-sd, ou pitl-el-e2-sd), sendo essa última enxertada na 5º extremiclade da sequência de ácidos nucléicos codificante da proteína S, ' deletada do VHB ou c) — pelo menos duas das supramencionadas partículas subvirais, sendo uma delas caracterizada pelo fato de s “compreender a proteína El (em particular, E1-Sd da SEQ ID no. 8 ou PITI-EI-Sdy EI-E2-Sd, PITI-EI-E2-Sd), e a outra caracterizada pelo fato de compreender a proteína E2 (em particular, E2-Sd da SEQ ID no. 10 ou PIT2-E2-Sd, E1-E2-Sd, PITI-E1-E2-Sd) do VHC, sendo essa última enxertada na porção n-terminal da proteína S, deletada do VHB.
Outro objeto da invenção consiste no uso da supramencionada composição imunogênica para a fabricação de um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico, * e/ouparaa prevenção da hepatite C.
Ts A presente invenção também diz respeito ao uso de uma composição imunogênica supramencionada para a fabricação de um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico, e/ou para a prevenção da hepatite B.
De forma vantajosa, o objeto da invenção consiste no uso da supramencionada composição imunogênica para a fabricação de um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico, e/ou para a prevenção da hepatite B e da hepatite C.
Outro objeto da invenção consiste em uma linhagem celular que expresse as partículas subvirais não- infecciosas, imunogênicas e quiméricas, descritas anteriormente.
Como exemplos de micro-organismos f adequados para as finalidades da invenção, podem ser citados fungos, como aqueles pertencentes às seguintes famílias: preferencialmente, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, s — Kluveromyces, Pichia, Hanseluna, Yarowia, Schwaniomyces, Zygosaccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis e Kluveromyces lactis; e bactérias como, por exemplo, E. Coli, e aquelas pertencentes às seguintes famílias: Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus e Streptomyces.
: Como exemplos de células euczarióticas, podem ser citadas as células de animais como, por exemplo, os i mamíferos, os répteis, os insetos, e seres análogos. As células — eucarióticas preferíveis são as células do hamster chinês (células CHO), do macaco (COS e células Vero), do rim do hamster anão (células BHK), do rim do porco (células PK 15), do rim do coelho (células RK 13), linhagens celulares humanas do osteosarcoma (células 143 B), linhagens celulares de Hel.a de humanos, linhagens celulares do hepatoma de humanos (c&lulas do tipo Hep G2), assim como linhagens celulares de insetos (por exemplo, Spodoptera fugiperda).
De forma vantajosa, o objeto da presente invenção diz respeito a uma linhagem celular a.cima mencionada, do tipo da linhagem de células do ovário do hamster chinês, — conhecida como CHO.
Tais células já haviam sido mostradas ' anteriormente, e, em particular, por Michel ML, Pontisso P, Sobczak E, Malpiêce Y, Streeck RE, Tiollais P.
Synthesis in animal cells of hepatitis B surface antigen particles carrying a receptor for polymerized human serum albumin.
Proc Natl Acad Sci US A. 1984 Dez; 81(24):7708-12. A presente invenção também diz respeito a uma linhagem celular acima mencionada, que consiste em um fungo e, em particular, no Saccharomyces cerevisae.
Outro objeto da invenção consiste na linhagem celular mostrada acima, que consiste na linhagem celular do rim do hamster recém-nascido (BHK), sendo, em particular, a linhagem celular do rim do hamster recém-nascido (BHK1). Í Essa última já foi mostrada anteriormente, e, em particular, por Goldman RD, Follett EA.
Birefringent filamentous organelle in BHK-21 cells and its possible role in cell spreading and motility.
Science. 1970 Jul 17; 169(942):286-8. De acordo com outro aspecto peculiar, a invenção também diz respeito a um método de produção das supramencionadas partículas subvirais não-infecciosas, imunogênicas e quiméricas, a partir de uma linhagem celular acima mencionada, caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas: 1 — uma etapa de TRANSDUÇÃO das células da linhagem celular, por meio de um vetor lentiviral, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de ácidos nucléicos, codificante da proteíma S do tipo selvagem, de um Ô isolado do vírus da hepatite B, 2 — uma etapa de CULTURA das referidas células, de modo a produzir vama linhagem celular capaz de expressar as partículas de envelope subvirais, do tipo selvagem, do vírus da hepatite B.
3 — uma etapa de SELEÇÃO de um clone, que apresente uma secreção ótima das partículas de envelope subvirais, do tipo selvagem, do vírus da hepatite B.
4 —- uma etapa de AUMENTO DA E TRANSDUÇÃO do referido clone, por meio de um vetor acima mencionado, ! 5 - uma etapa de CULTURA das referidas — células, de modo a produzir uma linhagem celular capaz de expressar as partículas subvirais não-infecciosas, imunogênicas e quiméricas acima mencionadas, 6 — uma etapa de SELEÇÃO das referidas células, capazes de secretar, de uma forma ótima, as partículas subvirais não-infecciosas, imuinogênicas e quiméricas acima mencionadas, 7 — uma etapa de CULTURA do referido clone para a produção das partículas subvirais não-infecciosas, imunogênicas e quiméricas acinna mencionadas, e 8 — uma etapa. de PURIFICAÇÃO das partículas —subvirais, a partir de um meio le cultura coletado (centrifugação,
ultracentrifugação com gradientes, separação das frações positivas para as partículas subvirais quiméricas, diálise).
A tabela 1 fornece uma lista das sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos, mostrados na presente s invenção. Convencionou-se que as letras minúsculas sejam utilizadas para as sequências de ácidos nucléicos, e que as maiúsculas sejam usadas para as sequências de aminoácidos.
Tabela 1: LISTA DAS SEQUÊNCIAS i
À | * As demais características e vantagens da invenção se tornarão mais claras a partir da leitura da seguinte descrição de uma forma preferencial de realização da invenção, reportada por um exemplo não-restritivo, e pela referência às figuras em anexo, dentre as quais: A Figura 1 esquematiza a topologia de um fragmento da poliproteína do vírus VHC, com mais de 3.000 aminoácidos. As clivagens realizadas pelas peptidases celulares
(3<) acarretam a maturação da referida poliproteína, sobretudo : nas proteínas estruturais (capsídios, proteínas de envelope E1 e E2). Os números indicam a posição dos resíduos de aminoácidos que ligam os domínios das diferentes proteínas estruturais da —poliproteina.
As Figuras 2A e 2B esquematizam a topologia transmembranar da proteína S, do tipo selvagem, do vírus VHB.
- A Figura 2A esquematiza os 226 resíduos de aminoácidos da proteína S, do tipo selvagem, do vírus VHB, caracterizada pelo fato de compreender, em particular, quatro : domínios - transmembranares, representados por retângulos verticais cinzas, bem como as porções n- e c-terminal, orientadas É em direção à luz do RE. No caso do isolado VHBadw, essa i proteína de, aproximadamente, 25 kD, é caracterizada pelo fato de compreender 226 resíduos de aminoácidos.
- A Figura 2B representa uma partícula subviral, obtida após a autoagregação da referida proteína S, do tipo selvagem.
As Figuras 3A a 3C representam a coexpressão das proteínas de fusão E1-Sd (Figura 3B) ou E2-Sd (Figura 3C), que, na presença da proteína S, do tipo selvagem (Figura 3B), se agregue nas partículas subvirais quiméricas da presente invenção.
- A Figura 3A representa a proteína S, do tipo selvagem, do VHB, que se autoagrega em partículas subvirais.
- A Figura 3B representa a proteína de fusão E1-Sd, que resulta da substituição do domínio transmembranar localizado na porção n-terminal da proteína S, do tipo selvagem, E pelo domínio transmembranar da proteína do envelope El do vírus VHC, representado por um retângulo vertical negro, e pelo ectodomínio de El, representado por linhas pontilhadas; em seguida, esquematiza a agregação da referida proteína de fusão E1-Sd, na presença da proteína S, do tipo selvagem, nas partículas subvirais S + E1-Sd.
De acordo com uma forma peculiar de realização da invenção, que não é restritiva, a proteína de fusão El-Sd de, aproximadamente, 50 kD, é caracterizada pelo fato de ; compreender 393 resíduos de aminoácidos, derivados da proteína El e do domínio S. Os resíduos 192 a 380 da proteína El i completa são conectados à porção n-terminal da proteína S | deletada, composta pelos resíduos 23 a 226 da proteína S do tipo selvagem.
- A Figura 3C representa a proteína de fusão E2-Sd, que resulta da substituição do domínio transmembranar localizado na porção n-terminal da proteína S, do tipo selvagem, pelo domínio transmembranar da proteína do envelope E2 do vírus VHC, representado por um retângulo vertical branco, e pelo ectodomínio de E2, representado por linhas pontilhadas; em seguida, esquematiza a agregação da referida proteína de fusão E2-Sd, na presença da proteína S, do tipo selvagem, nas partículas subvirais S + E2-Sd.
De acordo com uma forma peculiar de: realização da invenção, que não é restritiva, a proteína de fusão.
E2-Sd de, aproximadamente, 85 kD, é caracterizada pelo fato de f compreender 564 resíduos de aminoácidos, derivados da proteína E2 e do domínio S.
Os resíduos 384 a 743 da proteína E2 completa são conectados à porção n-terminal da proteína S deletada, composta pelos resíduos 23 a 226 da proteína S do tipo selvagem.
As Figuras 4A a 4E esquematizam a topologia das proteínas S de envelope, do tipo selvagem, do vírus VHB, de El e E2 do VHC, bem como das proteínas de fusão El-Sd e E2- Sd. - A Figura 4A representa a topologia da i proteína de envelope El, do tipo selvagem, do VHC, que é i composta por um único domínio transmembranar (retângulo vertical negro), e um amplo ectodomínio, orientado em direção à is luz do RE.
No caso do isolado HCVI a, essa proteína, de aproximadamente 35 KkD, é caracterizada pelo fato de compreender 192 resíduos de aminoácidos. - A Figura 4B representa a topologia da proteína de envelope E2, do tipo selvagem, do VHC, que é composta por um único domínio transmembranar (retângulo vertical branco), e um amplo ectodomínio, orientado em direção à luz do RE.
No caso do isolado HCVI a, essa proteína, de aproximadamente 70 kD, é caracterizada pelo fato de compreender 363 resíduos de aminoácidos. - A Figura 4C representa a topologia da proteína S de envelope, do tipo selvagem, do VHB, caracterizada por “compreender, em especial, quatro domínios : transmembranares (retângulos verticais cinzas). - A Figura 4D representa a sequência de DNA da molécula híbrida de ácidos nucléicos pit1-el-sd, composta, nas suas extremidades finais 5 e 3:
- pela sequência que codifica o peptídeo de iniciação de transferência PIT1 do vírus VHC,
- pela sequência que codifica o ectodomínio total da proteína El, e pela sequência que codifica o domínio transmembranar da proteína E1, deletada dos últimos 3 códons da . extremidade final 3, do vírus VHC, - pela sequência que codifica a proteína S, i deletada do vírus VHB, i e representa, ainda, o seu uso paraa a produção da proteína de fusão E1-Sd da invenção. - A Figura 4E representa a s.equência de DNAc da molécula híbrida de ácidos nucléicos pit2-e2-sd, composta, nas suas extremidades finais 5 e 3: - pela sequência que codifica o peptídeo de iniciação de transferência PIT2 do vírus VHC,
- pela sequência que codifica o ectodomínio total da proteína E2, e pela sequência que codifica o domínio transmembranar da proteína E2, deletada dos últimos 3 códons da extremidade final 3, do vírus VHC,
- pela sequência que codifica a proteína S, deletada do vírus VHB,
e representa, ainda, o seu uso para a produção f da proteína de fusão E2-Sd da invenção. A Figura 5 esquematiza o protocolo utilizado para a obtenção do DNAc, codificante das proteínas de fusão da invenção. À sequência que codifica as proteínas El e E2 é representada por uma linha negra (sequência A). A sequência que codifica a proteína S deletada é representada por uma linha cinza (sequência B). O local de restrição BamHI é representado por um diamante negro. Os primers forward e reversos, utilizados para a amplificação das sequências de ácidos nucléicos el-sd A, el-sd B, . e2-sd A e e2-sd B, estão listados na tabela x. As Figuras 6A e 6B propõem uma i representação esquemática do protocolo experimental para a ' produção transitória de uma das proteínas de fusão da invenção, a saber El-Sd ou E2-Sd, no sistema de células Semliki/BHK-21.
- A Figura 6A mostra que o RNA extraído do plasmídio pSFV1-E1-Sd é transfectado nas células BHK-21, com o objetivo de obter a produção de partículas de envelope subvirais e quiméricas E1-Sd. - A Figura 6B mostra que o RNA extraído do plasmídio pSFV1-E2-Sd é transfectado nas células BHK-21, com o objetivo de obter a produção de partículas de envelope subvirais e quiméricas E2-Sd. As Figuras 6C e 6D mostram os resultados — obtidos por Western-blot, seja com o uso de um anticorpo anti-S (6C), ou com o uso de um anticorpo anti-E1l e anti-E2 (6D), nos lisados de células transfectadas pelo RN.A extraído dos plasmídios ã PSFVI-E1-Sd e pSFV1-E2-Sd. - A Figura 6€C mostra que as proteínas de fusão EI-Sd e E2-Sd (bandas enquadradas) são detectadas nos tamanhos de 50 kD e 80 kD respectiva-mente, que correspondem aos tamanhos em teoria. M: marcador de peso molecular (kD).
- A Figura 6D mostra que as proteínas de fusão El-Sd e E2-Sd (bandas enquadradas) são detectadas nos tamanhos de 50 kD e 80 kD respectivamente, pelo uso de anticorpos anti-El e anti-E2. M: marcador de peso molecular E (KD). As Figuras 7A e 7B mostram a coprodução da i proteína S, do tipo selvagem, do VHB, e as duas proteínas de — fusão El-Sd e E2-Sd no sistema de céluilas Semliki/BHK-21. is Legenda: M: marcador de peso molecular (kD); as canaletas de O-gal, EIE2 e S representam os lisados de controle celular, extraídos das transfe cções das células BHK-21 pelo respectivo RNA de SFV. - A Figura 7 A propõe uma representação esquemática do protocolo experimentaal. Os RNAs extraídos dos plasmídios pSFVI-EI-Sd e pSFVI—-E2-Sd são cotransferidos individualmente para as células BHK-21, com o RNA extraído do plasmídio pSFVI-S, com o objetivo dle obter a produção de dois tipos de partículas de envelope subv&rais quiméricas S+E1-Sd e S+E2-Sd,y, sendo a primeira caracterizada pelo fato de compreender a proteína S do tipo selwagem e a proteína de fusão
E1-Sd, e a segunda caracterizada pelo fato de compreender a í proteína S do tipo selvagem e a proteína de fusão E2-Sd. - A Figura 7B mostra os resultados obtidos por Western blot com o uso de um anticorpo anti-El sobre as partículas intracelulares purificadas a partir das células transfectadas pelo RNA extraído dos vetores pSFVI-E1l-Sd e PSFVI-S. Os resultados mostram que a proteína de fusão E1-Sd (banda enquadrada) é detectada no tamanho de 50 kD, correspondente ao seu tamanho em teoria. - A Figura 7C mostra os resultados obtidos por À Western blot com o uso de um anticorpo anti-S sobre as partículas intracelulares purificadas a partir das células transfectadas pelo i RNA extraído dos vetores pSFVI-EI-Sd e pSFVI-S. Os — resultados mostram que a proteína de fusão El-Sd (banda is enquadrada) é detectada no tamanho de 50 kD, correspondente ao seu tamanho em teoria.
- A Figura 7D mostra uma micrografia por microscopia eletrônica de transmissão, por meio de uma coloração negativa sobre as partículas intracelulares purificadas a partir das células transfectadas pelo RNA extraído dos plasmídios PSFVI-E1-Sd e pSFV1-S. Barra: 100 nm.
- A Figura 7E mostra os resultados obtidos por Western blot com o uso de um anticorpo anti-E2 sobre as partículas intracelulares purificadas a partir das células 25s transfectadas pelo RNA extraído dos vetores pSFV1-E2-Sd e PSFVI-S. Os resultados mostram que a proteína de fusão E2-Sd
: (banda enquadrada) é detectada no tamanho de 85 KkD, correspondente ao seu tamanho em teoria. - A Figura 7F mostra os resultados obtidos por Western blot com o uso de um anticorpo anti-S sobre as partículas —intracelulares purificacias a partir das células transfectadas pelo RNA extraído dos vetores pSFVI-E2-Sd e pSFVI-S. Os resultados mostram que a proteína de fusão E2-Sd (banda enquadrada) é detectacia no tamanho de 85 kD, correspondente ao seu tamanho em teoria.
- A Figura 7G mostra uma micrografia por f microscopia eletrônica de transmissão, por meio de uma . coloração negativa so bre as partículas intracelulares purificadas a - — partir das células transfectadas pelo RNA extraído dos plasmídios — —PpSFVI-E2-SdepSFWVI1-S. Barra: 100 nm.
A Figura 8 representa o protocolo para a obtenção de clones de uma linhagem CHO, que produzam a proteína S do tipo selvagem e as proteínas de fusão da invenção. Ela esquematiza a forma como, a partir de uma linhagem celular CHO, a transdução p or meio de um lentivírus (LV) que contenha um gene de resistência à higromicina (hph), bem como o gene codificante da prote£na S do tipo selvagem do VHB, permite o desenvolvimento de wm primeiro clone celular denominado CHO- S, e produtor da proteína S do tipo selvagem. Em seguida, esse clone sofreu um grande aumento na transdução por meio de um lentivírus (LV), que. contenha um gene GFP (gfp) bem como o gene codificante de qualquer das proteínas de fusão E1-Sd ou E2-
Sd. Essa segunda transdução permitiu o desenvolvimento de dois á outros clones celulares denominados CHO-S/E1-Sd e —S/E2-Sd.
A Figura 9 mostra uma análise, por Western- Blot, da produção intracelular da proteína S do tipo selvagem e das proteínas de fusão da invenção, nos diferentes clones CHO estáveis. Ela mostra que as proteínas intracelulares dos clones CHO-S, CHO-S/E1I-Sd e CHO-S/E2-Sd são revelados por meio dos anticorpos anti-El, anti-E2 e anti-S. As proteínas de fusão que foram pesquisadas estão indicadas nas caixas escuras. M: marcador de peso molecular (kD); as canaletas de [-gal, EIE2 e : S representam os lisados de controle celular, extraídos das transfecções das células BHK-21 pelo respectivo RNA de SFV. : A Figura 10 representa um histograma de | quantificação da proteína S, do tipo selvagem, pelo método ELISA nas frações coletadas no gradiente de CsCl. A abcissa mostra as diferentes frações coletadas, enquanto que a ordenada indica a densidade ótica em 290 nm de cada uma. A partir dos sobrenadantes de cultura dos clones CHO-S, CHO-S/EI-Sd e CHO-S/E2-Sd, as partículas S subvirais e quiméricas são purificadas por ultracentrifugação em CsCLl. As frações são coletadas do topo do gradiente (fração 1), e a quantidade de proteína S do tipo selvagem foi analisada por ELISA. O histograma em preto representa a distribuição da proteína S do tipo selvagem pelas frações do clone CHO-S/E1-Sd, enquanto —queo histograma em cinza representa a distribuição da proteína S do tipo selvagem pelas frações do clone CHO-S/E2-Sd.
A Figura 11A mostra que o conteúdo protéico il das partículas purificadas por CsCI foi analisado por Western- blot, por meio dos anticorpos anti-E1, anti-E2 e anti-S. A proteína S do tipo selvagem é detectada sob os seus dois estados de glicosilação (24 e 27 kD), nos três tipos de partículas subvirais. As proteínas de fusão El-Sd ou E2-Sd são detectadas nos tamanhos correspondentes ao seu tamanho em teoria, a saber, 50 e 85 kD respectivamente, em suas respectivas partículas. M: marcador de peso molecular (KD). A Figura 11B mostra a análise, por meio de ' uma coloração negativa por microscopia eletrônica de transmissão, da purificação, a partir do sobrenadante da cultura do | clone CHO-S, das partículas subvirais resultantes da i autoagregação da proteína S, do tipo selvagem e esférica, com um diâmetro em torno de 20 mm. Barra: 20 nm.
A Figura 11C mostra a análise, por meio de uma coloração negativa por microscopia eletrônica de transmissão, da purificação, a partir do sobrenadante da cultura do clone CHO-S/El-Sd, das partículas subvirais quiméricas — resultantes da agregação da proteína de fusão E1-Sd, na presença da proteína S, do tipo selvagem. Essas partículas são dotadas de uma forma esférica, com um diâmetro em torno de 20 mm. Barra: 20 nm.
A Figura 11D mostra a análise, por meio de 2s uma coloração negativa por microscopia eletrônica de transmissão, da purificação, a partir do sobrenadante da cultura do clone CHO-S/E2-Sd, das partículas subvirais quiméricas À resultantes da agregação da proteína de fusão E1-Sd, na presença da proteína S, do tipo selvagem.
Essas partículas são dotacdlas de uma forma esférica, com um diâmetro em torno de 20 mm.
Barra: s 20nm Por meio de um exemplo meramente ilustrrativo, passa a ser relatada, a seguir, uma forma peculiar de realização da invenção, para a obtenção de partículas de envelope subvirais do vírus da hepatite C (VHC) pelo sistema de Semliki (conforme as figuras4a7). E Essa forma de realização da invenção se baseia na obtenção de proteínas de fusão imunogênicas da inveração e, | em particular, nas proteínas de fusão EI-Sd ou E2-Sd i caracterizadas pelo fato de compreenderem, por um lado, a is proteína de envelope S, deletada na porção n-termimal do respectivo domínio transmembranar, do vírus da hepatite B (VHB), e, por outro lado, a quase totalidade de uma das pr-oteínas de envelope El ou E2 do VHC.
Essa forma de realização transitória demonstra a capacidade de agregação da referida proteína S deletada (Sd), na presença da proteína S do tipo selvagem, tornando possível a obtenção das supramencãonadas partículas subvirais quiméricas, graças, sobretudo, ao elevado nível de expressão do vetor, resultante das proprieda-des de replicação do vírus da floresta de Semliki (vetor pSFV), antes de proceder à obtenção dos clones estáveis, que produzem as referidas partículas por meio do uso de vetores lentivirais.
Exemplo 1: a obtenção de partículas L subvirais quiméricas do vírus da hepatite C, pelo sistema de Semliki (pSFEV) L1) A construção dos plasmídios pSFV1-E1- SdepSFVI-E2-Sd O vetor pSVl1 (Invitrogen), dotado de uma estrutura bicistrônica de 11033 pb, é utilizado nas seguintes construções. O vetor possui uma sequência promotora de SP6, ou seja, de uma enzima RNA polimerase, inserida na 5º. extremidade do primeiro cístron, de modo a conseguir a síntese completa de um RNA de polaridade positiva (RNA designado como 42S(+)), por meio de um transcrição in vitro. Após a transfecção nas i células de mamíferos, esses RNAs recombinantes, “encapados” in vitro, se autorreplicam na presença da nsP1-4 replicase do SFV, is sendo úteis para a produção de proteínas de interesse, por meio de um RNAm secundário designado como 26S(+).
A obtenção do DNA complementar do tipo selvagem (DNAc), ou de uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, codificante de uma proteína de fusão da invenção, é alcançada pela realização de várias séries de amplificações por reações em cadeia da polimerase (PCR). Ao iniciar o procedimento pelo plasmídio pSFVI-E1E2 (que consiste em um vetor contendo a sequência codificante das duas proteínas E1 e E2 do VHC), para a realização de um primeiro PCR, designado como —PCRA, permitiu-se a amplificação das sequências codificantes das proteínas de envelope El ou E2 do VHC com seu domínio transmembranar, e precedidas pelas sequências que codificam o ' seu respectivo peptídeo de iniciação de transferência, para o encaminhamento ao retículo endoplasmático. Ao iniciar o procedimento pelo plasmídio pHBV1,5, j á mostrado [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Vitus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51], para a realização de um s-egundo PCR, designado como PCR B, permitiu-se a amplificação la sequência codificante da proteína S, deletada do VHB. As porções “VHC” das : sequências que codificam as proteínas de- fusão de acordo com a invenção foram designadas como “A”, enquanto que as porções i “VHB” foram designadas como “B” (figura 5). Os produtos dos i PCRs, tanto do A quanto do B, foram quantificados e purificados is em pgel para serem, em seguida, incluídos em partes iguais no PCR final. O uso de primers bivalentes VHC-VHB permitiu a síntese de produtos do PCR A e B, cujos domínios se sobrepõem nas suas extremidades, tornando possível obter, ao final do processo, sequências completas de DN Ac, que codifiquem as proteínas de fusão da invenção.
L1.1) Amplificação da s sequências de DNAc que codificam as proteínas de fusão da invenção (em particular, E1-Sd e E2-Sd): A amplificação por PCR é realizada em um —meio de reação de 50 OL, contendo 50 rag de DNA, 15 pmol de cada par de primers (Proligo), 200 LIM de cada um dos desoxirribonucleotídeos dNTP (Invitrogen), e 10 unidades «le Taq í DNA polimerase (Takara), sendo o processo caracterizado pelo fato de compreender uma atividade corretora, de m-odo a minimizar os erros relacionados às sucessivas amplificações (figura 5). Com a utilização dos softwares “Vector NTI Aclvance 10” (Invitrogen) e “Primer premier” (Biosoft International), foram definidos os primers forward das sequências A e os primers reversos das sequências B, de modo a gerar um local Bam HI nas respectivas extremidades 5 e 3 dos fragmentos do DNA amplificado.
: A Tabela 2 abaixo, intitulada “Oligonucleotídeos usados para a amplificação genética das | sequências A e B, constitutivas das sequências quimétricas”, — indicaas sequências de primers utilizados.
Nela, as sequências que correspondem ao VHC são representadas em caracteres em preto, as que correspondem ao VHB são representadas em caracteres em preto, sublimhados, as que correspondem ao local de restrição BamHI em caracteres em itálico, sublinhados, as que correspondem ao códon A TG de iniciação da tradução em caracteres negritados, assim como as que correspondem ao códon ATG de terminação da tradução.
Tabela 2 - “Oligonucleotídeos usados para a amplificação genética das sequências A e B, constitutivas das sequências quiméricas” Fragmen| Par de
DNAc amplifica do el-sd A | forward| 5º Teverso | ATAGGATCCATGACAGGGAACCTTICCTGGTT GC -3 3º - AACGACAAGCGGTCGTGTTCTTAGGAG -5s el-sd B | forward| 5º - GCTGITCGCCAGCACAAGAATCCTEC - 3º reverso 3
TAAAAGAAAACAGAGACCCATATGTAAATT CCTAGGATA - 5º h e2-sd A | forward | 5º - . reverso | ATAGGATCCATGGGGAACTGGGCGAAGGT + h 3 3º : ACGATGAGTATAGGGTTTGTTCTTAGGAGTG TTATGG - 5º e2-sd B | forward | 5º - Feversº | GCTACTCATATCCCAAACAAGAATCCTCACA ATACC - 3º 3” -
TAAAAGAAAACAGAGACCCATATGTAAATT CCTAGGATA - 5º Essas reações de amplificação, obtidas em um ciclador térmico “iCycler” (Biorad), consistiam em uma desnaturação inicial de 5 mintos, a 95º. C, seguida por 25 ciclos, caracterizados pelo fato de compreenderem uma desnaturação de
1 minuto, a 95º.
C, uma hibridização de 1 minuto, a 60º.
C, e uma ii elongação de 1 minuto, a 69º.
Esse 25 ciclos são seguidos de uma elongação final de 10 minutos, a 69º.
Os fragmentos amplificados pelos PCRs A e B são purificados com gel de agarose a 1%, por meio do sistema “Wizarl SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega), de acordo com as recomendações do fabricante.
Em seguida, os fragmentos puri ficados dos PCRs À e B são hibridizados por meio de um PCR denominado PCRHYB, sem o uso de primers para 10 ciclos, e, logo após, amplificados por meio de um PCR final, denominado PCRIFIN, para 25 ciclos, na presença de primers forward de sequêncizas A, e de primers reversos de sequências B.
Os programas para Os ciclos desses dois ' últimos PCRs são semelhantes àqueles utilizactos para os PCRs À “ eBOs fragmentos amplificados de moléculas híbridas de ácidos nucléicos da invenção, ora obtidos, são pwrificados em gel,
conforme descrito acima.
L1.2) Clonagem de sequêmcias híbridas de
DNArc, no vetor pSFV1 Os produtos do PCRFIN, fá purificados, são clonados no vetor PpGEM-TO vector (“PGEM-T Easy Vector System”, Promega), de acordo com as recomendações do fabricante.
Os fragmentos de moléculas híbridas de ácidos nucléicos da invenção são liberados do PpPGEM-TO, pela restrição com o uso da enzima BamHI (Biolabs) e, em seguida, clonados no local BamHI do plasmídio pSFV1. Os diferentes plasmídios que compreendem as proteínas de fusão da invenção (em particular, os plasmídios pSFVI-EI-Sd e pSFVI-E2-Sd) são f amplificados por meio de uma transformação bacteriana e, em seguida, purificados por meio de uma maxipreparação do DNA em fenol/clorofórmio. A orientação da inserção é verificada por meio da restrição enzimática, e todas as construções são verificadas pelo sequenciamento.
12) Obtenção da linhagem celular, temporariamente transfectada pelo RNA de diferentes construções de SFEV Os procedimentos para a cultura de células do rim de hamsters recém-nascidos (BHK-21), assim como os protocolos para a transcrição in vitro de plasmídios de matriz SFV | e para a transfecção de RNA recombinante autorreplicativo foram — idênticos àqueles já descritos anteriormente [Patient, R, is Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. Foi utilizada como controle a construção do PSF V-S, expressando a proteína S do tipo selvagem do VHB, e já mostrada no artigo acima referido.
1-3) Análise da produção intracelular de proteínas de envelope quiméricas, do tipo selvagem Os procedimentos bioquímicos para a análise das proteínas de interesse (em particular, S, Sd, El, E2, E1l-Sd, E2-Sd, etc...) por meio de um microscópio de fluorescência confocal e por Western Blot, os procedimentos para a análise ultraestrutural, por microscopia eletrônica de transmissão, de ' células transfectadas, assim como os procedimentos de quantificação (por ELISA)/purificação (gradiente de sacarose e, em seguida, cromatografia le afinidade) das partículas de envelope subvirais quiméricas «de VHC-VHB já foram mostrados anteriormente [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingear-«d, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular
Trafficking J Virol, 81(8), 3842—51]. A detecção dass porteínas S do tipo selvagem E1 ; e E2 do VHC e das proteínas de fusão da invenção é realizada por meio de um anticorpo murino e monoclonal anti-El (AA, | fornecido por Dr Harry Green berg, Universidade de Stanford, Califórnia) [Dubuisson, J., Hsu, H.
H., Cheung, R.
C., Greenberg, H B, Russell, D.
G., and Rice, C.
M. (1994). Formation and intracellular localization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis viruses.
J Virol 68(10), 6147-60), ou de um anticorpo anti-E2 (H52, fornecido por Dr Jean Dubuisson, Instituto Pasteur, deLille) [Deleersnyder, V., Pillez, A., Wychowski, C., Blight, K., Xu, J., Hahn, Y.
S., Rice, C.
M., and Dubuisson, J. (1997). Formation of native hepatitis C wirus glycoprotein complexes.
Virol 71(1), 697-704]. 1-4) Análise do sobrenadante de cultura
Após a transfeceção, o sobrenadante da cultura com um valor aproximado de 10 células transfectadas é limpo por uma centrifugação de 10 minutos, a 1500 g, e, em seguida, À ultracentrifugado a 4º. C, por 16 horas, a 35.000 rpm, por meio de um rotor SW41 (Ultracentrífuga L70, Beckman). O resíduo é absorvido em 50 OL do tampão de lise e, em seguida, analisado por Western-blot.
1.5) Produção das proteínas de fusão E1-Sd e E2-Sd da invenção Decorridas dezesseis horas da transfecção pelos plasmídios pSFVI, caracterizada pelo fato de compreender as moléculas híbridas de ácidos nucléicos da invenção, pit1-el-sd e E pit2-e2-sd, as células BHK-21 foram lisadas e, em seguida, analisadas por Western-blot, com anticorpos monoclonais anti-E1 i e anti-E2. Após a produção transitória nas células BHK-21, os tamanhos das proteínas de fusão E1-Sd e E2-Sd correspondem a valores aproximados de 50 kD para a proteína E1-Sd, e de 85 kD para a proteína E2-Sd. Esses resultados, quando correlacionados com a imunofluorescência intensa obtida pela detecção das referidas proteínas de fusão da invenção, após o uso dos anticorpos anti-El, anti-E2 e anti-S, mostram que as aludidas proteinas foram produzidas corretamente, glicolisadas corretamente, e, portanto, exibidas de acordo com a topologia transmembranar pretendida (figuras 6A a 6D). De modo a restaurar a capacidade de secreção das diferentes proteínas de fusão da invenção, foram realizadas —cotransfecções, pela apresentação, in trans, da proteína S do VHB, em sua forma selvagem, a cada uma das proteínas de fusão da invenção (figura 7A). Decorridas dezesseis horas após a T transfecção, as células cotransfectadas são moídas, e as partículas subvirais intracelulares são purificadas por um gradiente de sacarose e, em seguida, submetidas a uma cromatografia de afinidade, conforme já descrito anteriormente [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. Em todos os casos, as partículas subvirais são estudadas por microscopia eletrônica de transmissão e por ' Western-blot, utilizando-se, para tanto, os anticorpos anti-s, anti- El ou anti-E2, já descritos no exemplo 1.3 (Figuras 7B a 7G).
As imagens obtidas por microscopia eletrônica | de transmissão mostram que, em todos esses experimentos de coprodução da proteína S do tipo selvagem, com uma das proteínas de fusão da invenção, é possível produzir uma quantidade relevante de partículas subvirais esféricas e filamentosas. As análises por Western-blot mostram a abundância das proteínas de fusão da invenção nessas partículas virais, mais oumenos filamentosas. A realização da invenção, na forma do exemplo 1, em um sistema de “Semliki”, mostra que as proteínas de fusão da invenção, contendo a quase-totalidade das proteínas El ou E2 do VHC (cujo domínio transmembranar substitui aquele localizado na porção n-terminal da proteína S do VHB), se agrupam em partículas subvirais quiméricas da mesma natureza que as partículas subvirais usadas na produção de vacinas contra a ' hepatite B, facilitando, desse modo, a purificação das ditas partículas subvirais quiméricas da invenção e, potencialmente, o desenvolvimento de uma aplicação industrial de uma vacima contrao VHC, reproduzindo a da vacina contra o VHB.
A forma de realização da invenção, de acordo com o exemplo 1, também mostra a produção de proteínas de fusão, caracterizadas pelo fato de compreenderem as proteínas não-truncadas El e/ou E2 do VHC. Essa característica pode s.e mostrar determinante para a indução de uma resposta imune celular neutralizante e otimizada.
Contudo, no sistema de “Semliki”, as partículas subvirais quiméricas são produzidas por transfecção temporária i das células. De fato, a elevada toxicidade desses vetores torna impossível obter uma secreção eficiente, por longo prazo, das partículas subvirais quiméricas. Além disso, a purificação das referidas partículas a partir do homogenato das células cotransfectadas exige uma implantação relativamente trabalhosa, o que não condiz com as necessidades de uma produção industrial.
A título meramente exemplificativo, uma das formas de realização da invenção, referente às figuras 8 a 11, diz respeito à obtenção das partículas de envelope subvirais do vírus da hepatite C, a partir das linhagens do tipo CHO que expressem, de maneira estável, a proteína S, de tipo selvagem, do VHB, assim como a proteína de fusão E1-Sd, ou a proteína de fusão E2-
Sd.
A obtenção desses clones estáveis de CHO se tornou possível graças ao uso de vetores integrativos, do tipo lentiviral.
Um dos benefícios desse sistema consiste no fato de que a produção de proteínas recombinantes como, por exemplo, as proteínas de fusão da invenção, não acarreta maiores efeitos citotóxicos de curto prazo como, por exemplo, aqueles verificados no sistema SFV.
Um dos objetivos dessa forma de realização consiste, também, na obtenção de um sistema celular de produção de partículas subvirais quiméricas da invenção, análogo àquele utilizado na produção industrial da vacina contra a hepatite B.
Exemplo II: A obtenção das partículas de | envelope subvirais do vírus da hepatite C, no sistema lentiviral i O uso de vetores lentivirais possibilitou o desenvolvimento de clones celulares, capazes de produzir, de modo estável, a proteína S, do tipo selvagem, do VHB, associada a uma das proteínas de fusão E1-Sd e/ou E2-Sd.
IL.1) Vetores lentivirais do plasmídio pLenti O plasmídio de 9955 pb pLENTI” caracterizado pelo fato de compreender o gene de seleção P*, e codificante de uma proteína de resistência à higromicina como marcador de selação, foi utilizado nas seguintes construções [Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F.
H., Verma, I.
M., and Trono, D. (1996). In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector.
Science 272(5259), 263-7].
i 116 Em primeiro lugar, a sequência de ácidos : nucléicos codificante da proteína S do tipo selvagem é liberada a partir de pSFV1-S, conforme mostrado anteriormente [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S. Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficlking J Virol, 81(8), 3842-51], por restrição e com o uso da enzima BamHI (Biolabs); em seguida, é purificada em gel de agarose a 1%, por meio do sistema “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega), de acordo com as recomendações do faboricante. Esse ; fragmento purificado foi, em seguida, clomado no local BamHI, incluído no local de clonagem múltipla do plasmídio pLENTI” sã : por meio de uma ligase T4 de DNA (Biolabs), de acordo com as | recomendações do fabricante. Finalmente, o plasmídio pLENTI””"-S foi amplificado por uma transformação bacteriana e, em seguida, purificado por uma maxipreparação do DNA, por meio do sistema “Nucleobond PC 500 Kit”* (Qiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. A orientação da inserção foi, em seguida, verificada pela restrição enzimática.
Da mesma forma, as «diferentes moléculas híbridas de ácidos nucléicos da invenção do DNAc, codificante das proteínas de fusão da invenção (em particular, E-1-Sd e E2- Sd), são clonadas no local BamHI do plasmídio pLENTI?", Os plasmídios obtidos dessa forma (em particular, pLENT ITgfp-E1-Sd e E2-Sd) são, em seguida, amplificados, pur&ficados e sequenciados (cf. II-1).
* 117 i 11-2) Produção de lentivírus recombinante h No período das vinte e quatro horas que antecederam a transfecção dos plasmídios lentivirais, as células HEK 293T foram semeadas a uma taxa de 3,10 células por frasco de75 cm (Falcon), em meio de DMEM-glutamax (Invitrogen), suplementado com 10% de soro fetal bovino descomplementado (ATFC), 100 Ul/mL de penicilina e 100 OgmL de estreptomicina.
Essas células foram cultivadas sob 5% de CO,, e o meio de cultura foi trocado quatro horas antes da transfecção.
Um pmol de cada plasmídio p8.74, pvVSV-G e pLENTI : (PLENTI?"-S, pLENTIZ* , El-Sd, E2-Sd) foi transfectado simultaneamente nas células HEK 293T, por meio do sistema i “Calcium Phosphate Transfection Kit” system (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante.
O meio de cultura é trocado 24 horas depois da transfecção, e coletado 48 e 72 horas - após a transfecção.
Os meios coletados são filtrados a 0,45 Um e, em seguida, concentrados por ultracentrifugação em um colchão de sacarose a 20%, a 4º.
C, durante 90 minutos, a 100.000 g.
O resíduo contendo os lentivírus recombinantes é absorvido em 500 OL de tampão de fosfato (PBS), e conservado a -80º.
São gerados lotes de vetores lebtivirais recombinantes, dentre os quais, em particular, os vetores lentivirais LVPA-S, LVP-EI-Sd, e LVP-E2L-Sd.
À titulação das unidades transdutoras lentivirais (TU) de cada lote é determinada a partir do ensaio da proteína p24,e por meio do sistema “Innotest HIV Kit” (Innogenetics), de acordo com as recomendações do fabricante.
v 118 i 113) Cultura de células e transdução " A linhagem celular usada para a produção estável e constitutiva de partículas subvirais quiméricas de VHC- VHB consiste em uma linhagem de ovário de um hamster chinês, s “denominada CHO. O uso dessa linhagem já foi amplamente consagrado para a produção de proteínas recombinantes de interesse médico e, em particular, de vacina contra a hepatite B “GenHevac B Pasteur&” (Sanofi Pastexr MSD). Essas células CHO são cultivadas sob 5% de CO, em meio DMEM-FI12 (Invitrogen), suplementado com 10% de soro fetal bovino À descomplementado (ATFC), 100 UI/mL de penicilina e 100 Og/mL de estreptomicina. Com urna antecedência de 24 horas da i transdução, as células CHO são p ostas e:m cultura em uma placa : com 6 poços (Falcon), a uma tax:a de 105 células por poço. Em seguida, elas são transduzidas Em um. novo meio, com uma multiplicidade de infecção de 2,5 «(ou sejza, uma razão de unidades de transdução (TU) por células de 2,5), na presença de 4 Ig/mL de polibrene (Sigma-Aldrich) e, logo após, cultivadas por 24 horas. No dia seguinte, o meio de transdwição é retirado, as células obtidas de acordo com a realizaação da presente invenção são lavadas em tampão de PBS e, em seguida, mantidas normalmente em cultura, pelos dois dias seguin tes.
113.1) Geração de um clone CHO estável, produtor da proteína S do tipo selvagem A linhagem CHO uszada é transduzida com o lentivírus LV'?"-S, de acordo com o p rotocolo descrito acima e x 119 esquematizado na Figura 8. A eficácia da transdução é verificada . por imunofluorescência, por meio de um anticorpo dirigido contra a proteína S do tipo selvagem, de acordo com um protocolo já utilizado anteriormente [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., s Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. Decorridos três dias da transdução, as células são tripsinizadas, recultivadas em uma caixa de cultura de 10 cm de diâmetro (Falcon), com 1 mg/mL de higromicina (Euromedex), e mantidas em cultura por três semanas. Os clones celulares daí resultantes são recuperados de | um cilindro de clonagem (Invitrogen) e, então, amplificados em i placas de 24 poços (Falcon). O clone CHO, utilizado em seguida, i é selecionado, por ELISA, após a quantificação no sobrenadante de cultura da proteína S, do tipo selvagem [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842- 51]. Esse clone celular foi designado de CHO-S.
11-3.2) Geração de clones CHO estáveis, produtores da proteína S, do tipo selvagem, do vírus VHB, e das proteínas de fusão E1-Sd e E2-Sd da invenção.
Posteriormente, o clone celular CHO-S é supertransduzido com lentivírus recombinante LV&C , codificante da proteina GFP como um marcador de seleção, e caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácidos x 120 nucléicos da invenção, em particular, o lentivírus vetor LV%- ' PITI-EI1-Sd ou LVSP-PIT2-E2—Sd, de acordo com o protocolo descrito acima, no parágrafo II-3.1 (Figura 8). Devido ao uso da proteína GFP, a eficácia da tramsdução é verificada por citometria de fluxo (FacScalibur da Becto n-Dickinson). Decorridos três dias da transdução, as células são tripsinizadas, recultivadas por diluição limitante em placa de 96 poços (Falcon), a uma taxa de 1 célula por poço, e mantidas em cultura por três semanas.
Os clones celulares GFP+ daí resultantes são recuperados e, em seguida, amplificados em gramde quantidade.
Os clones celulares assim obtidos são especialmente designados CHO-E1-Sd ou | CHO-E2-Sd. 1-4) Análise da produção intracelular de : proteínas de envelope de VIHB e VHC, quiméricas e do tipo “5 selvagem.
Os procedirnentos de análise bioquímica, por imunofluorescência e por We stern-blot, das proteínas de interesse S, El-Sd ou E2-Sd de cada clone celular, já foram mostrados anteriormente, no exemplo 1, no parágrafo 1-4. II-5) Purificação e análise de partículas subvirais quiméricas, derivadas do sobrenadante de cultura : Um volume aproximado de 200 mL de sobrenadante de cultura para cada clone selecionado é obtido por centrifugação a 4º.
C, por 10 minutos, a 1500 g.
As proteínas são —precipitadas por adição de Lama solução de (NH4)2SO4 (pH 7.5; 45 % final) e, em seguidas, centrifugadas a 4º.
C, por 15 minutos x 121 i a 10.000 g. O resíduo é absorvido em um volume mínimo de f tampão de TNE (10 mM Tris/HCI pH 7.5/ 100 mM NaCI / 1 mM EDTA). Após uma série de diálises em tampão de TNE, é adicionado CsCl até que ser obtida uma densidade aproximada de 1,22 g/ocm?, e, em seguida, duas ultracentrifugações isopicmais sucessivas são realizadas a 15º. C, for 48 horas, a 40.000 rpm, por meio de um rotor 45Ti (Ultracentrífuga, Beckman). As fraç ões são coletadas a partir do topo do gradiente, sendo a proteína S do tipo selvagem quantificada por ELISA [Patient, R., Hourioux, C., Sizaret, P.Y., Trassard, S., Sureau, C., and Roingeard, P., (2007) ; Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis and Intracellular Trafficking J Virol, 81(8), 3842-51]. As frações ' positivas foram misturadas e dialisadas a 4º. C, em tampão de
TNE As preparações purificadas foram, finalmente, analisadas por Western Blot e por microscopia eletrônica de transmissão, conforme mostrado anteriormente no exemplo 1, no parágrafo 1-4. 11-6) Produção intracelular da proteína S. e das proteínas de fusão Após a sua expansão, os clones celulares CHO- S, CHO-EI-Sd e CHO-E2-Sd foram analisados por imunofluorescência e, em seguida, por Western-blot, com os anticorpos anti-Sd, anti-El ou anti-E2 (cf. o exemplo IL, mo parágrafo I-4 e figura 9). Conforme o esperado, todos os clones permitem uma intensa produção da proteína S, do tipo selvagern,
x 122 É do VHB, sob dois estados de glicosilação (p24 e gp27). De forma hi análoga, os clones CHO-S, CHO-E1-Sd e CHO-E2-Sd permitem uma intensa produção citoplasmática das proteínas de fusão da invenção, dentro dos tamanhos esperados. Portanto, esses resultados mostram que todas as proteínas de fusão da invenção são corretamente produzidas na linhagem CHO.
11-7) Purificação das partículas Foi realizado um primeiro teste de purificação a partir de 200 mL de sobrenadante de cultura do clone CHO-S, CHO-EI-Sd ou CHO-E2-Sd. Esses sobrenadantes, cuja i concentração na proteína S do tipo selvagem é determinada por ELISA, encontrando-se em torno de 100 ng/mL para os três i clones, são ultracentrifugados em gradiente isopicnal de CsCI. As frações de cada gradiente formado são, em seguida, analisadas pela quantificação da proteína S do tipo selvagem (figura 10). Para os três tipos de partículas subvirais quiméricas purificadas (S, E1-Sd, e E2-Sd), o pico da concentração da proteína S do tipo selvagem pôde ser observado na fração 9, correspondente a uma densidade entre 1,17 e 1,18. As frações no. 8, 9 e 10 de cada preparado são, em seguida, reagrupadas para serem dialisadas e, em seguida, analisadas por Western-blot, com anticorpos anti-S, anti-El ou anti-E2 (cf.: exemplo I no parágrafo 1-4 e (figura 11- À)), e por microscopia eletrônica de transmissão, com coloração negativa (figuras 11B e 11D).
Para cada purificação, é depositado o correspondente a um Ug da proteína S do tipo selvagem, para a
+ 123 f análise em gel de acrilamida.
Isso possibilita mostrar que as É proteínas de fusão El1-Sd e E2-Sd da invenç ão são detectadas no tamanho esperado, e na quantidade adequacla no seu respectivo preparado, com o uso dos anticorpos anti-El ou anti-E2. De forma análoga, as duas formas esperadas de glicosilação da proteína S do tipo selvagem são detectadas ern cada preparado.
À análise por coloração negativa, em micros copia eletrônica de transmissão, tornou possível confirmar a existência, nos três preparados estudados, de partículas de envelope subvirais esféricas de, aproximadamente, 20 mm de diârnetro. ; Exemplo II: a obtenção de partículas de envelope — subvirais, caracterizadas pelo fato de À compreenderem as duas proteínas de fusão E1-Sd e E2-Sd E É formado um novo plasmídio pLENTIP“ , caracterizado pelo fato de compreender o gene de seleção gluc de Gaussia princeps, no lugar do gene g/p, e que codifica uma luciferase (GLuc) secretada como marcador de seleção.
O fragmento do DNAc, codificante da proteína de fusão El-Sd é clonado no local de pLENTIE"“ . O plasmídio pLENTIE*-E1-Sd, ora obtido, é amplificado, purificado e sequencãado (cf.
II-1). IL 1. Produção de lentivírus recombinante.
No período das vinte e quatro horas que antecederam a transfecção dos plasmídios lentivirais, as células HEK 293T foram cultivadas a uma taxa de 3,10” células por frasco de 75 cm” (Falcon), em meio de DMEM-glutamax (Invitrogen), suplementado com 10% de s.oro fetal bovino
+ 124 descomplementado (ATFC), 100 UI/mL de penicilina e 100 E Og/mL de estreptomicina. Essas células for-am cultivadas sob 5% de CO;, e o meio de cultura foi trocado quatro horas antes da transfecção. Um pmol de cada plasmídio p8.74, pVSV-G e pLENTIE" —El-Sd foi transfectado simultaneamente nas células HEK 293T, por meio do sistema ““Calcium Phosphate Transfection Kit” system (Invitrogen),) de acordo com as recomendações do fabricante. O meio de cultura é trocado 24 horas depois da transfecção, e coletado 48 e 72 horas após a transfecção. Os meios coletados são filtrad-os a 0,45 Om e, em d seguida, concentrados por ultracentrifugação em um colchão de sacarose a 20%, a 4º. C, durante 90 minustos, a 100.000 g. O í resíduo contendo os lentivírus recombinantes é absorvido em 500 OL de tampão de fosfato (PBS), e conservado a -80º. C. É gerado um novo lote de lentivírus recombinante: LV" —E1l-Sd . A titulação das unidades transdutoras lentivirais (TU) desse lote é determinada a partir do ensaio da proteína p24, e por meio do sistema “Innotest HIV Kit” (Innogenetics)., de acordo com as recomendações do fabricante.
I11-2) Geração de um clone CHO estável, produtor da proteína S, do tipo selvagem, do vírus VHB, e das proteínas de fusão E1-Sd e E2-Sd da invenção.
A cultura das células CHO, e o método de transdução mostrado e usado para o exemplo II, são adaptados a esse exemplo. Após uma primeira transdução com o lentivírus LV"PAS, permitindo a obtenção de um clone celular CHO-S, foi
« 125 realizada uma segunda transdução com o lentivírus LVºP-E2-Sd, í de acordo com o protocolo mostrado no exemplo II, e permitindo, assim, a obtenção de um clone celular CHO-E2-Sd.
Esse último é, novamente, transduzido com o lentivítus LVE"“ —E1-Sd, de acordo com o protocolo mostrado acima.
Decorridos três dias da transdução, as células são tripsinizadas, recultivadas por diluição limitante em placa de 96 poços (Falcon), a uma taxa de 1 célula por poço.
As células são mantidas em cultura por três semanas, ao final das quais é coletado o sobrenadante dos clones celulares delas resultantes. í Nesses sobrenadantes, a presença de luciferase é detectada pela f medição da atividade enzimática, por meio do sistema “Gaussia É Luciferase Assay Kit” (Biolabs),) de acordo com as recomendações do fabricante.
A luz emitida pela reação enzimática é medida por meio de um luminômetro Centro LB 960 (Berthold Technologies). Os clones celulares correspondentes aos sobrenadantes GLuc+t são recuperados e, em seguida, amplificados em grande quantidade.
O clone ora obtido é denominado CHO-S/E2-Sd/E1-Sd.
Exemplo IV: Análise in vivo da atividade imunológica das partículas subvirais quiméricas Uma quantidade de 5 a 10 miligramas de partículas subvirais quiméricas para cada tipo de partícula (S+E1- Sd, S+E2-Sd, S apenas do VHB) é purificada a partir do
+ 126 : sobrenadante de cultura de céluLas, de acordo com o método A descrito acima.
Quatro grupos de camundongos e coelhos foram inoculados com séries de imunização.
A imunização consiste em três injeções de 10 microgramas da substância imusnogênica, de acordo com o método clássico.
O primeiro grupo foi imunizado com as partículas S+E1-Sd.
O segundo grwupo foi imunizado com as partículas S+E2-Sd.
o O terceiro grupo foi imunizado apenas com as 7 partículas S do VHB. O quarto grupo foi imunizado com a mistura de “15 partículas subvirais quiméricas S+E1-Sd e S+E2-Sd.
A resposta humeoral global produzida por esses animais é detectada por análise de: ELISA e por Western-blot. Em relação aos anticorpos anti-S, o kit comercial ELISA (Abbott, Roche) tornou possível determinar o número de unidades internacionais (UI) de anticorpos anti-S, conhecidos por suas propriedades neutralizantes contra o VHB. Uma concentração de, pelo menos, 10 UI, é considerada protetora contra o VHB (Jilg W, et al. Hepatitis B-vaccination: Strategy for booster doses in high risk population groups. Progress in Hepatitis B Immunization.
Eds. P. Coursaget et al. Colloque Inserm. 1990; 190: 419—427.). Em relação aos anticorpos anti-E El e anti-E2, é utilizado o método
. 127 É Western-blot para avaliar o desencadeamento de resposta aos anticorpos anti-El e anti-E2. Se for o caso, a análise será complementada por uma investigação sobre a presença de anticorpos anti-E1l e anti-E2, neutralizantes do vírus. A análise da neutraliziçção do VHC por esses anticorpos é realizada pelo sistema JFH-1 (Wakita et al., Nat Med 2005), que possibilita propagar uma cepa de VHC de genótipo 2 in vitro, ou pelo uso de cepas virais quiméricas, caracterizadas pelo fato de compreenderem as proteínas estruturais do VHC do genótipo 1 ou
3. -
Claims (33)
1. Proteína de fusão imunogênica, caracterizada pelo : fato de compreender pelo menos os dois peptídeos seguintes: a) na porção c-terminal, um primeiro peptídeo i 5 constituído: - pela sequência de aminoácidos da proteína S de um ' isolado do vírus da hepatite B (VHB), sendo tal proteína S : deletada de seu domínio transmembranar situado na sua porção n- terminal, ou - por uma sequência de aminoácidos, que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a referida | sequência de aminoácidos da proteína S deletada na porção n- ' 15 terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um outro isolado do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos da aludida proteína S deletada, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, e b) na porção n-terminal, um segundo peptídeo constituído:
- pela sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio de, pelo menos, uma proteína , do envelope de um isolado do vírus da hepatite C (VHC), ou - por uma sequência de aminoácidos, que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ' ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida : sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio de uma proteína de um isolado do vírus da hepatite C, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante i natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos, das ditas proteinas El ou E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, sendo o segundo peptídeo escolhido entre a proteína El,a proteina E2 ou um peptídeo de fusão, que compreenda as proteínas El e E2,
2. Proteína de fusão imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o segundo peptídeo situado na porção n-terminal ser constituído:
NAS | 3 - pela totalidade da sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína do i envelope E1, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, : ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida : sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína do envelope El, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante ' sintética derivada da dita proteína El, desde que a aludida : 15 sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
3. Proteína de fusão imunogênica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o segundo peptídeo da porção n-terminal ser constituído: - pela totalidade da sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína de envelope E2, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de aminoácidos do domínio transmembranar e do ectodomínio da proteína do envelope E2, desde que a aludida .: sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou i 5 - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante ; sintética derivada da dita proteína E2, desde que a aludida . sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C.
4. Proteína de fusão imunogênica, de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de o primeiro e o segundo peptídeos constituintes da proteína de fusão imunogênica serem contíguos, e onde a porção c-terminal do | segundo peptídeo está covalentemente ligada à porção n-terminal do primeiro peptídeo.
5. Proteína de fusão imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de o primeiro peptídeo da porção c-terminal ser constituído: - por uma sequência de aminoácidos, delimitada pelos aminoácidos contíguos, situados na região compreendida entre os aminoácidos nas posições 23 a 226 da proteína S, deletada na porção n-terminal do VHB, e, particularmente, do isolado do subtipo adw do VHB, e, notadamente, pela sequência de aminoácidos rtepresentada pela SEQ ID no. 2, ou
- por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 91%, notadamente de, pelo menos, 93%, e, particularmente, de, pelo menos, 95%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 97% com a referida 5 sequência de aminoácidos contíguos à proteína S deletada na porção n-terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos : mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não- . infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos da aludida proteína S deletada na porção n-terminal, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de | formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente aovirusda hepatite B.
6. Proteína de fusão imunogênica, de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de o segundo peptídeo da porção n-terminal ser constituído: - por uma sequência de aminoácidos, delimitada pelos aminoácidos contíguos, situados na região compreendida entre os aminoácidos localizados nas posições 192 a 380 da proteína El do VHC, e, em particular, do isolado 1a do VHC, e, notadamente, pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID no. 4, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 75%, notadamente de,
pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida : sequência de aminoácidos contíguos da referida proteína El, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante ' natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante : sintética derivada da referida sequência de aminoácidos contíguos à aludida proteína El, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao virus da hepatite C.
7. Proteína de fusão imunogênica, de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizada pelo fato de o primeiro e o | segundo peptídeos serem contíguos, sendo a referida proteína de ' 15 fusão constituída; - pela sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID no. 8, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 89%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos mantenha a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VAB, ou
- pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida : sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao i 5 vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB.
8. Proteína de fusão imunogênica, de acordo com ' qualquer das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de o . segundo peptídeo na posição n-terminal ser constituído: - por uma sequência de aminoácidos, delimitada pelos aminoácidos contíguos, situados na região compreendida entre os aminoácidos localizados nas posições 384 a 743 da proteína E2 do VHC, e, em particular, do isolado 1a do VHC, e, notadamente, pela sequência de aminoácidos | representada pela SEQ ID no. 6, ou ' 15 - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, &, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a referida sequência de aminoácidos contíguos da referida proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante natural, extraída de um isolado do vírus VHC, ou de uma variante sintética derivada da referida sequência de aminoácidos contíguos à aludida proteína E2, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C. :
9. Proteína de fusão imunogênica, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de o primeiro e o segundo peptídeos serem contíguos, sendo a referida proteína de fusão constituída: ' - pela sequência de aminoácidos, representada pela . SEQ ID no. 10, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 89%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e S 15 imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, e/ou ao da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B, e/ou ao da hepatite C.,
10. Molécula híbrida de ácidos nucléicos, caracterizada pelo fato de ser codificante de qualquer das proteínas de fusão formada conforme definida em qualquer das reivindicações de 129,
11. Molécula híbrida de ácidos nucléicos, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de a primeira e : segunda sequências de ácidos nucléicos serem contíguas, e onde a extremidade 5 da primeira sequência de ácidos nucléicos é ligada, de forma covalente, à extremidade 5 da segunda sequência de ácidos nucléicos. '
12. Molécula híbrida de ácidos nucléicos, de acordo : com as reivindicações 10 e 11, caracterizada pelo fato de ser codificante de uma proteína de fusão acima mencionada, que compreenda um peptídeo de iniciação de transferência, localizado na porção n-terminal, sendo a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos representada: - pela SEQ ID no. 11, ou | - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a dita SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VHC, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, e/ou ao dahepatite B.
13. Molécula híbrida de ácidos nucléicos, de acordo com qualquer das reivindicações 10 e 11, caracterizada pelo fato : de ser codificante de uma proteína de fusão acima mencionada, que compreenda um peptídeo de iniciação de transferência, localizado na porção n-terminal, sendo a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos representada: ' - pela SEQ ID no. 13, ou : - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao | vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB, ou ' 15 - pela sequência de ácidos nucléicos, derivada de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos conserve as propriedades imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, &/ou ao da hepatite B,
14. Vetor caracterizado pelo fato de compreender uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme definida em qualquer das reivindicações 10 a 13, bem como os meios necessários para expressá-los,
15. Vetor, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender, também, um vetor lentiviral.
16. Vetor, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de o vetor lentíviral ser o vetor pLenti.
17. Vetor, de acordo com uma das reivindicações 14 a | 16, caracterizado pelo fato de a molécula híbrida de ácidos nucléicos ser constituída: - pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela ' SEQ ID no. 11, ou : - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a dita SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucleicos codifique uma proteína de fusão, capaz de | formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente aovírus VAHC e/ou frente ao vírus VHB, cujo vetor seja notadamente representado pela SEQ ID no. 15, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da sequência de ácidos nucléicos representada pela SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos codifique uma proteína de fusão, capaz de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite C, e/ou ao da hepatite B.
18. Vetor, de acordo com uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de a molécula híbrida de ácidos nucléicos ser constituída:
- pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela SEQ ID no. 13, ou : - por uma sequência de ácidos nucleicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de, pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID ' no. 13, desde que a referida sequência de ácidos nucléicos . codifique um peptídeo capaz de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VAC, cujo vetor seja notadamente representado pela SEQ ID no. 16, ou - pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante | sintética derivada da referida SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos codifique um peptídeo capaz de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VAC.
19. Partícula de envelope subviral, quimérica, imunogênica e não-infecciosa, caracterizada pelo fato de compreender as seguintes proteínas: - a proteína constituída pela proteína S selvagem do antígeno de superfície de um isolado do vírus da hepatite B, e - pelo menos uma proteína de fusão imunogênica, conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 9.
20. Partícula subviral, quimérica e imunogênica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de a proteína de fusão imunogênica ser constituída: | - pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQIDno.8, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um ' percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, À pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB, ou | - pela sequência de aminoácidos de uma variante : 15 natural extraída de um isolado do vírus VHC e/ou do vírus VHB, ou de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHC e/ou frente ao vírus VHB.
21. Partícula subviral, quimérica e imunogênica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de a proteína de fusão imunogênica ser constituída: - pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de,
pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida : SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos | conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- ' 5 infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou : - pela sequência de aminoácidos de uma variante : sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
22. Partícula subviral, quimérica e imunogênica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de | | compreender as duas proteínas de fusão seguintes: | : 15 - a sequência de aminoácidos, representada pela SEQ | ID no. 8, ou | - uma sequência de aminoácidos que apresente um | percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, | pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida SEQ ID no. 8 codifique uma proteína que conserve a capacidade de formar partículas subvirais ! não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou | ao vírus da hepatite C, ou | - a sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida SEQ ID | no. 8 codifique uma proteína que conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, e - a sequência de aminoácidos, representada pela SEQ IDno.10,ou - uma sequência de aminoácidos que apresente um ' percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, : pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou | - a sequência de aminoácidos de uma variante sintética ' 15 derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subviraíis não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
23. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de incluir como substância ativa pelo menos um elemento escolhido dentre os seguintes: - uma proteína de fusão, conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 9, - uma molécula híbrida de ácidos nucléicos, conforme definida em qualquer das reivindicações 10 a 13,
- um vetor, conforme definido em qualquer das reivindicações 14 a 18, que compreenda a referida molécula híbrida de ácidos nucléicos, | - uma partícula subviral quimérica, conforme definido emqualquer das reivindicações da 19 à 22, e um veículo que seja aceitável, sob o ponto de vista * farmacêutico. :
24. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de incluir como substância ativa pelo menos um composto escolhido dentre os seguintes: a) uma proteína de fusão acima mencionada, que seja constituída: * pela sequência de aminoácidos, representada pela " 15 SEQID no. 38, ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou * pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar
AJ" ÂAAÁÊÓPÔúC= 2 “P““ “ “ e é“““““.“.ú““““““)º) A CC eo 17 partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, " b) uma molécula híbrida de ácidos nucléicos que seja constituída: i 5 * pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela | SEQ ID no. 11, ou o * por uma sequência de ácidos nucléicos que apresente : uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda | 10 mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a dita SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas | subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da mm hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou Í 15 * pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VHC, ou por um vetor que compreenda a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos; c) uma partícula subviral quimérica, que compreenda a proteína de fusão imunogênica constituída: * pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQIDno.8,ou,
* por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- ' infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao : vírus da hepatite C, ou * pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C. |
25. Composição imunogênica, de acordo com a : 15 reivindicação 23, caracterizada pelo fato de incluir como substância ativa pelo menos um composto escolhido dentre os seguintes: a) uma proteína de fusão, que seja constituída: * pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQID no. 10,ou, * por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-
infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou * a sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao t vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, . b) uma molécula híbrida de ácidos nucléicos que seja constituída: * pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela SEQ ID no. 13, ou * por uma sequência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de, pelo i menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda : 15 mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou * pela sequência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatiteC, ou ou por um vetor que compreenda a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos; c) uma partícula subviral quimérica, que compreenda a proteína de fusão imunogênica constituída: * pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou, : * por uma sequência de aminoácidos que apresente um : percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao i vírus da hepatite C, ou ' 15 * pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
26. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de a substância ativa ser uma partícula subviral quimérica, e que compreenda, pelo menos, as duas proteínas de fusão imunogênicas constituídas: - pela sequência de aminoácidos, representada pela SEQID no. 8, ou,
- por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- : infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao : vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, e | - pela sequência de aminoácidos, representada pela : 15 SEQID no. 10, ou, - por uma sequência de aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou - pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C.
27. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de a substância ativa ser ' 5 constituída pela mistura que compreende: - pelo menos duas proteínas de fusão, conforme : especificado abaixo: . * sendo uma delas constituída: e — pelaseqiênciade aminoácidos, representada pela SEQID no. 38, ou, * —porumaseqiênciade aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, | ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida : 15 SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou - a sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infeceiosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, * e sendo a outra constituída: * — pelaseqiênciade aminoácidos, representada pela SEQ ID no. 10, ou
* —poruma seqiiênciade aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- : infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao . vírus da hepatite C, ou a seqilência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C; | - pelo menos duas moléculas híbridas de ácidos ' 15 nucléicos seguintes: * sendo uma delas constituída: e — pela sequência de ácidos nucléicos, representada pela SEQ ID no. 11, ou * por uma segiiência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 78%, notadamente de, pelo menos, 80%, e, particularmente, de, pelo menos, 85%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 90% com a dita SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou e pela seqiência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 11, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus VHB e/ou frente ao vírus VHC, ' ou por um vetor que compreenda a dita molécula À híbrida de ácidos nucléicos; *sendo a outra constituída: e — pela seqiência de ácidos nucléicos, representada pela SEQ ID no. 13, ou e por uma segiência de ácidos nucléicos que apresente uma homologia de, pelo menos, 80%, notadamente de, | pelo menos, 85%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ' 15 ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a dita SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frente ao da hepatite C, ou * pela segiência de ácidos nucléicos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 13, desde que a proteína codificada pela referida sequência de ácidos nucléicos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou frenteao da hepatite C,
ou por um vetor que compreenda a dita molécula híbrida de ácidos nucléicos; - pelo menos, duas partículas subvirais quiméricas, conforme especificado abaixo: * uma delas compreenderá a proteína de fusão imunogênica constituída: : e — pelaseqiênciade aminoácidos, representada pela - SEQ ID no. 8, ou, e —poruma;seqilênciade aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 88%, notadamente de, pelo menos, 90%, e, particularmente, de, pelo menos, 92%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos l conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- ' 15 infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, ou e — pela sequência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 8, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C, * uma delas compreenderá a proteína de fusão imunogênica constituída: e — pelaseqiiênciade aminoácidos, representada pela SEQID no. 10, ou
* —poruma;seqilênciade aminoácidos que apresente um percentual de identidade de, pelo menos, 86%, notadamente de, pelo menos, 88%, e, particularmente, de, pelo menos, 90%, e, ainda mais particularmente, de, pelo menos, 95% com a referida SEQID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não- . infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao . vírus da hepatite C, ou e — pela seqiência de aminoácidos de uma variante sintética derivada da referida SEQ ID no. 10, desde que a aludida sequência de aminoácidos conserve a capacidade de formar partículas subvirais não-infecciosas e imunogênicas frente ao vírus da hepatite B e/ou ao vírus da hepatite C. |
28. Uso de uma composição imunogênica conforme ' 15 definida em qualquer das reivindicações 23 a 27, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico e/ou para a prevenção da hepatite C,
29. Uso de uma composição imunogênica conforme definida em qualquer das reivindicações 23 a 27, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico e/ou para a prevenção da hepatite B.
30. Uso de uma composição imunogênica conforme definida em qualquer das reivindicações 23 a 27, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico e/ou para a prevenção das hepatites B e C.
31. Linhagem celular, caracterizada pelo fato de exprimir partículas subvirais quiméricas, imunogênicas e não- ] 5 infecciosas, conforme definidas nas reivindicações 19 a 22.
32. Linhagem celular, de acordo com a reivindicação : 31, caracterizada pelo fato de consistir na linhagem extraída do . ovário de hamster chinês, designada como CHO.
33. Linhagem celular, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de consistir em uma levedura, que pode ser, notadamente, a Saccharomyces Cerevisae.
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