CN105131124A - 新的融合蛋白及其用于制备针对丙型肝炎的疫苗的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫原性融合蛋白，其至少包含：在C-末端侧，第一肽，该第一肽由乙型肝炎病毒(HBV)分离株的缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域的S蛋白构成；以及在N-末端侧，第二肽，该第二肽由丙型肝炎病毒(HCV)分离株的至少一种包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域构成。本发明的目标还在于编码所述融合蛋白的杂合核酸分子，以及包含所述杂合核酸分子的载体，包含所述融合蛋白的亚病毒颗粒，包含至少所述融合蛋白、或至少所述杂合核酸分子、或至少所述亚病毒颗粒的免疫原性组合物，以及用于产生所述融合蛋白或所述杂合核酸分子或所述亚病毒颗粒的细胞系。
Description
本申请是申请日为2009年6月16日、申请号为200980130186.X、发明名称为“新的融合蛋白及其用于制备针对丙型肝炎的疫苗的用途”的发明专利申请的分案申请。
本发明的目标在于新的融合蛋白，及其应用，尤其是用于制备旨在预防和/或预防性和/或治疗性治疗丙型肝炎，或旨在预防和/或预防性和/或治疗性治疗丙型肝炎和乙型肝炎的疫苗。本发明还涉及获得乙型肝炎病毒(HBV)的包膜蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)的包膜蛋白之间的嵌合亚病毒包膜颗粒。
由于其在全球范围内的广泛分布并且该疾病经常演变成慢性，丙型肝炎病毒(其于1989年得到鉴定，随后进行了克隆和测序)现在仍代表了真正的公共健康问题。2000年，WHO估计，大约3％的世界人口，即大约1.7亿人感染了HCV。
HCV引起慢性肝炎，其可演变成肝硬化及肝细胞癌。干扰素和利巴韦林形成对于由HCV所引起的慢性肝炎的基本治疗，但这些治疗并不足够有效并且具有重大的副作用。可用的治疗仍是高成本的、相对有毒性的，并且仅在一半左右的感染病例中有效。
虽然多年来已知全部基因组和病毒蛋白质，但是其结构和其形态发生仍是假设的。现今，仍不存在任何针对丙型肝炎的疫苗，并且关于此类疫苗候选物的研究目前是非常活跃的[Houghton,M.和Abrignani,S.(2005).ProspectsforavaccineagainstthehepatitisCvirus.Nature436(7053),961-6]。
在预防性疫苗的情况下，几乎所有的潜在候选物依赖于使用HCV的两种包膜蛋白(通常称为E1和E2蛋白，并且能够诱导细胞免疫应答和中和体液应答)之一或两者。
然而，HCV的E1及E2蛋白并不自装配成亚病毒颗粒，而其他病毒则可自装配成亚病毒颗粒。此外，由于其跨膜区域在内质网中的强烈滞留，它们的纯化需要用去污剂来溶解它们。因此，产率令人失望，并且所获得的级分的纯度不太好[Forns,X.,Bukh,J.和Purcell,R.H.(2002).ThechallengeofdevelopingavaccineagainsthepatitisCvirus.JHepatol37(5),684-95]。
在于采用缺失了其跨膜结构域的包膜蛋白的备选方案使得能够促进E1和E2分泌到细胞外部，但是由于相对于野生型蛋白质而言降低的抗原性质，由此导致的三维构象的变化可能显得不受欢迎。
HBV病毒以两种形式存在：以感染性病毒粒子的形式，和以过量包膜颗粒的形式，其以比病毒本身高得多的量被发现存在于受感染的受试者的血液中。该现象是由于HBV的S蛋白进行自装配和出芽成既不包含衣壳蛋白也不包含核酸的亚病毒颗粒(或过量外膜颗粒)的能力[Moriarty,A.M.,Hoyer,B.H.,Shih,J.W.,Gerin,J.L.和Hamer,D.H.(1981).ExpressionofthehepatitisBvirussurfaceantigengeneincellculturebyusingasimianvirus40vector.ProcNatlAcadSciUSA78(4),2606-10]。HBV的野生型S蛋白包含四个跨膜结构域。由野生型S蛋白的自装配而产生的亚病毒颗粒是非感染性的，但非常具有免疫原性：自二十世纪七十年代中期以来，它们已被视为很好的针对乙型肝炎的疫苗候选物。实际上，它们已用作制造疫苗的基础，这些疫苗已证明了其在诱导对于HBV感染的保护性免疫应答中的效用。
使用HBV包膜亚病毒颗粒作为对于乙型肝炎病毒来说外来的蛋白质的载体已经成为先前工作的目标。因此，题目为“HBV/HCVviruslikeparticle”的专利申请案号US2004/0146529描述了HBV-HCV包膜嵌合体的获得，该嵌合体一方面系统地包含HBV病毒的整个S蛋白，和另一方面根据实施例，包含嫁接在HBV病毒S蛋白的N-末端处的HCVE1或E2包膜蛋白之一的胞外结构域的片段[MarkSelby,EdwardGlazer和MichaelHoughton“HBV/HCVvirus-likeparticle”，美国专利号2004/01465529]。
然而，并未表明，这些构建物可以诱导形成具有良好结构的亚病毒颗粒，以及它们能够诱导优异的抗原应答。
作为对于现有技术的缺点的响应，本发明的目的在于提供HCV-HBV融合蛋白，其能够形成非感染性的、具有良好结构的且有效地分泌的亚病毒颗粒，并且包含E1和/或E2的几乎全部。
本发明目标之一还为提供针对丙型肝炎和/或针对乙型肝炎的疫苗。
本发明的额外的益处来自下述事实：其可以容易地适合于目前商业化的针对乙型肝炎的疫苗的现有的工业生产线。
本发明的目标在于免疫原性融合蛋白，其至少包含下列两个肽：
a)在C-末端侧，第一肽，该第一肽由下述序列构成：
-乙型肝炎病毒(HBV)分离株的S蛋白的氨基酸序列，所述S蛋白缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从另一HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性亚病毒颗粒的能力，以及
b)在N-末端侧，第二肽，该第二肽由下述序列构成：
-丙型肝炎病毒(HCV)分离株的至少一种包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列，或
-与丙型肝炎病毒分离株的蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1或E2蛋白之一的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，
所述第二肽选自E1蛋白、E2蛋白或包含E1蛋白和E2蛋白的融合肽。
本发明还涉及免疫原性融合蛋白，其具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列与由缺失了其N-末端跨膜结构域的S蛋白(Sd)，丙型肝炎病毒分离株的蛋白(E1或E2)的跨膜结构域和胞外结构域构成的氨基酸序列具有至少83％，尤其是至少85％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比。
“融合蛋白”是指这样的任何蛋白质，其至少包含HBV分离株的缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域的S蛋白(Sd)以及HCV分离株的E1和/或E2包膜蛋白的几乎整体，其中所述E1和/或E2包膜蛋白的跨膜结构域代替在HBV的S蛋白的N-末端处缺失的跨膜结构域(图3B、3C、4D和4E)。
“免疫原性蛋白质”是指具有抗原性质并且能够诱导反应或免疫应答的任何蛋白质，尤其是任何根据本发明的融合蛋白，以及任何本文中所描述的融合蛋白的任何片段。特别地，如果例如根据由下列文献所描述的实验方案所检测的，蛋白质在免疫接种后分别诱导抗-E1、抗-E2和/或抗-S的体液应答，那么就认为该蛋白质对于HCV和/或HBV而言具有免疫原性：
-Huzly等人,2008，关于HBV，[HuzlyD,SchenkT,JilgW,Neumann-HaefelinD.ComparisonofninecommerciallyavailableassaysforquantificationofantibodyresponsetohepatitisBvirussurfaceantigen.JClinMicrobiol.2008Apr,46(4):1298-306]，或
-Hamed等人,2008，关于HCV，[HamedMR,TarrAW,McClureCP,BallJK,HicklingTP,IrvingWL.AssociationofantibodiestohepatitisCvirusglycoproteins1and2(anti-E1E2)withHCVdisease.JViralHepat.2008May,15(5):339-45]。
“形成亚病毒颗粒的能力”是指任何蛋白质，尤其是HBV的S蛋白，特别地缺失了其N-末端跨膜结构域的S蛋白，和更特别地包含在N-末端经缺失的S蛋白的本发明的融合蛋白，在野生型S蛋白存在下装配，或如果需要，自装配成丝状或球状亚病毒颗粒的能力；所述形成亚病毒颗粒的能力至少可以通过尤其依照电子显微术分析进行观察，和尤其通过在该文件的实施例1和2(§I-5和§II-7)中所描述的，尤其由图7D、7G、11B-11D所图解说明的测试来揭示。
“非感染性亚病毒颗粒”是指由于HBV的野生型S蛋白(图2B)和/或缺失了其N-末端跨膜结构域的S蛋白的装配而产生的任何丝状或球状颗粒，所述颗粒没有病毒基因组，和尤其以极大过量方式合成和分泌，并且其可以通过使得能够揭示不存在HBV或HCV的特异性核苷酸片段的任何实验方案，例如尤其通过例如由下列文献先前描述的PCR扩增，来进行分析：
-关于HCV，参见[HalfonP,BourlièreM,OuzanD,SèneD,SaadounD,KhiriH,PénarandaG,MartineauA,OulèsV,CacoubP.OccultHCVinfectionrevisitedwithultra-sensitivereal-timePCRassay.J.Clin.Microbiol.2008Apr30]，
-关于HCV，参见[ThibaultV,PichoudC,MullenC,RhoadsJ,SmithJB,BitbolA,ThammS,ZoulimF.CharacterizationofanewsensitivePCRassayforquantificationofviralDNAisolatedfrompatientswithhepatitisBvirusinfections.J.Clin.Microbiol.2007Dec.45(12):3948-53]，
并且其结果为阴性。
“HCV病毒分离株”是指作为黄病毒科(Flaviviridae)的成员且属于丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)的任何分离株，其由HCV病毒的具有超过3000个氨基酸的多蛋白构成，如在图1中图示的[Choo,Q.L.,Kuo,G.,Weiner,A.J.,Overby,L.R.,Bradley,D.W.和Houghton,M(1989).IsolationofacDNAclonederivedfromablood-bornenon-A,non-Bviralhepatitisgenome.Science244(4902),359-362；Choo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)v88:2451-2455；Han等人,CharacterizationoftheterminalregionsofhepatitisCviralRNA:identificationofconservedsequencesinthe5'untranslatedregionandpoly(A)tailsatthe3'end.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:1711-1715]；或者被国际病毒分类委员会(InternationalCommitteefortheTaxonomyofViruses；ICTV)分类为与HCV近似的任何分离株。
“HBV病毒分离株”是指作为嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的成员且属于正嗜肝DNA病毒属(Orthohepadnavirus)的任何分离株，或者被国际病毒分类委员会(ICTV)分类为与HBV近似的任何分离株[SchaeferS.HepatitisBvirustaxonomyandhepatitisBvirusgenotypes.WorldJGastroenterol.2007Jan7:13(1):14-21]。
“S蛋白”或“野生型S蛋白”(S)是指：
-HBV病毒分离株的包膜蛋白，其尤其包含226个氨基酸且包含四个跨膜结构域(图2A)，并且尤其是分离株HBVadw的包膜蛋白，或者
-从HBV病毒分离株来源的天然变体，或上述蛋白质的合成变体。
“装配”是指蛋白质通过与野生型S蛋白相结合而形成亚病毒颗粒的能力。“自装配”是指蛋白质自身形成亚病毒颗粒的能力。
“缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域的S蛋白”或“在N-末端经缺失的S蛋白”或又“经缺失的S蛋白”(Sd)是指：
-上面定义的S蛋白，其缺失了由HBV病毒分离株的S蛋白的位置1处的氨基酸至位置19处的氨基酸，或位置1处的氨基酸至位置20处的氨基酸，或位置1处的氨基酸至位置21处的氨基酸，和优选地位置1处的氨基酸至位置22处的氨基酸组成的区域，或者
-上面提及的S蛋白，其与经缺失的S蛋白的所述区域具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同一性百分比，或者
-从HBV病毒分离株来源的“天然变体”，或上面提及的经缺失的S蛋白的“合成变体”。
“丙型肝炎病毒分离株的包膜蛋白”是指如由其胞外结构域和其跨膜结构域构成的两种蛋白质E1和E2之一的几乎整体(图4B和4C)，并且相应于：
*HCV病毒，尤其是HCV病毒分离株HCV-1a的多蛋白的肽片段，其位于下述区域中：
-关于E1蛋白而言，位置192处的氨基酸至位置383处的氨基酸，或尤其是位置192处的氨基酸至位置380处的氨基酸，和
-关于E2蛋白而言，位置384处的氨基酸至位置746处的氨基酸，或尤其是位置384处的氨基酸至位置743处的氨基酸；或者
*与上面提及的所述E1区域具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的片段；或者
*与上面提及的所述E2区域具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的片段；或者
*HCV病毒分离株的多蛋白的天然变体或合成变体。
“丙型肝炎病毒包膜蛋白的胞外结构域”是指：
*从HCV病毒，尤其是HCV病毒分离株HCV-1a的多蛋白来源的E1或E2的肽片段的部分，其位于下述区域中：
-关于E1蛋白的胞外结构域而言，位置192处的氨基酸至位置352处的氨基酸，或尤其是位置192处的氨基酸至位置352处的氨基酸，和
-关于E2蛋白的胞外结构域而言，位置384处的氨基酸至位置717处的氨基酸，或尤其是位置384处的氨基酸至位置717处的氨基酸；或者
*与上面提及的所述E1区域具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的片段；或者
*与上面提及的所述E2区域具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的片段；或者
*HCV病毒分离株的多蛋白的天然变体或合成变体。
“丙型肝炎病毒包膜蛋白的跨膜结构域”是指：
*从HCV病毒，尤其是HCV病毒分离株HCV-1a的多蛋白来源的E1或E2的肽片段的部分，其位于下述区域中：
-关于E1蛋白的跨膜结构域而言，位置353处的氨基酸至位置383处的氨基酸，和有利地位置353处的氨基酸至位置380处的氨基酸，和
-关于E2蛋白的跨膜结构域而言，位置718处的氨基酸至位置746处的氨基酸，和有利地位置718处的氨基酸至位置743处的氨基酸；或者
*与上面提及的所述E1区域具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的片段；或者
*与上面提及的所述E2区域具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的片段；或者
*HCV病毒分离株的多蛋白的天然变体或合成变体。
“同一性百分比”是指经由下述方式通过两个多肽分子序列的直接比较而确定的百分比：确定所述两个序列中氨基酸残基的数目，随后将其除以这两个序列中最长的序列的氨基酸残基的数目，并将结果乘以100。
本发明的目标涉及包含HCV病毒和/或HBV病毒的任意分离株的任何核苷酸序列和/或肽序列的融合蛋白，无论所述序列相对于本文中所提及的特定序列而言的上述同一性百分比为何。
术语“天然变体”是指同一物种或同一种群的分离株之间DNA序列、等位基因或蛋白质序列的任何变异性、任何多态性、任何多样性。通过从野生型参考分子衍生的且具有目的生物学性质(例如免疫原性性质和/或形成亚病毒颗粒的能力)的两个多肽分子或多核苷酸分子的直接比较来确定“天然变异性百分比”。其通过下述方式来定量：确定在所述两个序列之间相同的氨基酸残基或核酸残基的准确数目，随后将其除以这两个序列中最短的序列的氨基酸残基或核酸残基的数目，并将结果乘以100。
两个序列之间的所述变异性百分比是特别易变的，因为其尤其依赖于所考虑的病毒、所考虑的基因型、所考虑的序列片段(例如，HCV胞外结构域的区域比跨膜结构域的区域更可变)，等等。因此，在相同基因型的毒株之间，HCV的E1和E2蛋白的变异性百分比在核苷酸方面为88％，和在氨基酸方面为90％。但是，在不同基因型的毒株之间，在核苷酸方面，它下降至55％，和在氨基酸方面，它下降至59％。HBV为DNA病毒，其变异性比HCV要低得多[ZhangM,GaschenB,BlayW,FoleyB,HaigwoodN,KuikenC,KorberB.TrackingglobalpatternsofN-linkedglycosylationsitevariationinhighlyvariableviralglycoproteins:HIV,SIV,andHCVenvelopesandinfluenzahemagglutinin.Glycobiology.2004Dec.14(12):1229-46]。
本发明的目标涉及融合蛋白和/或杂合核酸分子，其包含具有从HCV病毒和/或HBV病毒的任意分离株来源的肽序列和/或核苷酸序列的任何天然变体或天然变体的任何片段，无论所述序列相对于本文中所描述的特定序列而言的上述天然和/或合成变异性百分比为何。
术语“合成变体”是指任何根据本发明的多肽或多核苷酸分子，或者本文中所描述的多肽或多核苷酸分子的任何片段，其通过野生型参考分子的重组，即通过对所述野生型参考分子进行添加、缺失、置换而衍生得到，条件是它保留目的生物学性质，例如免疫原性性质和/或形成亚病毒颗粒的能力。经由下述方式，通过所述衍生的分子与所述野生型参考分子的直接比较来确定“合成变异性百分比”：确定在所述两个序列之间相同(从它们的位置和它们的性质方面来看)的氨基酸残基或核酸残基的准确数目，随后将其除以这两个序列中最短的序列的氨基酸残基或核酸残基的数目，并将结果乘以100。
本发明的目标涉及融合蛋白，其包含具有从HCV病毒和/或HBV病毒的任意分离株衍生的核苷酸序列和/或肽序列的任何合成变体或合成变体的任何片段。
根据本发明的一个特别有利的方面，构成融合蛋白的一部分的E1和/或E2的跨膜结构域缺失了位于C-末端位置处的最后三个氨基酸中至少之一，尤其是所有这最后三个氨基酸，从而使得所述经缺失的E1和/或E2的跨膜结构域与野生型E1和/或E2的跨膜结构域具有至少91％(关于E1而言)和至少90％(关于E2而言)的同一性百分比。
在C-末端位置处的三个氨基酸中至少之一，尤其是所有这最后三个氨基酸的所述缺失具有使在图1中由符号所表示的肽酶切割位点失活这样的优点，所述肽酶切割位点对于HCV的多蛋白的成熟来说是所必需的，但在本发明的嵌合构建物的情形下是不希望的。
[1].本发明的目标在于免疫原性融合蛋白，其至少包含下列两个肽：
a)在C-末端侧，第一肽，该第一肽由下述序列构成：
-乙型肝炎病毒(HBV)分离株的S蛋白的氨基酸序列，所述S蛋白缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从另一HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，以及
b)在N-末端侧，第二肽，该第二肽由下述序列构成：
-丙型肝炎病毒(HCV)分离株的至少一种包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列，或
-与丙型肝炎病毒分离株的蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1或E2蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，
所述第二肽选自E1蛋白、E2蛋白或包含E1蛋白和E2蛋白的融合肽。
本发明的目标尤其涉及至少包含下列组分的融合蛋白：
-一方面，HBV的经缺失的S蛋白(Sd)，其基本上由位于C-末端的其三个跨膜结构域构成(图2A和3A)，所述经缺失的S蛋白保留装配成亚病毒颗粒的能力，并且保留针对HBV病毒的免疫原性性质，和
-另一方面，E1和E2蛋白之一的序列的几乎整体，其也保留针对HCV病毒的免疫原性性质，
从而，所述融合蛋白(尤其是由图3B或3C所表示的融合蛋白)能够在野生型S蛋白存在下装配成亚病毒颗粒，并且能够诱导针对HBV和/或HCV病毒的免疫，尤其是诱导针对HBV和HCV病毒的双重免疫。
[1a].有利地，本发明的目标在于上述免疫原性融合蛋白，其在所述第二肽(E1或E2)的N-末端处包含由丙型肝炎病毒分离株的转移起始肽(peptided'initiationdetransfert，PIT)的氨基酸序列构成的第三肽。
E1或E2蛋白或者根据本发明的融合蛋白的“转移起始肽”(分别为PIT1和PIT2)是指：
*HCV病毒，尤其是分离株HCV-1a的多蛋白的肽片段，其位于下述区域中：
-关于E1蛋白而言，位置166处的氨基酸至位置191处的氨基酸，和
-关于E2蛋白而言，位置366处的氨基酸至位置383处的氨基酸；或者
*从HCV病毒分离株来源的天然变体，或上面提及的所述肽片段的合成变体；或者
*嫁接在所述第二肽的N-末端处的任何肽片段，
条件是，当所述肽片段构成本发明的融合蛋白的一部分时，其保留这样的能力，即在翻译后将所述融合蛋白指引至内质网，从而使得所述融合蛋白正确地糖基化，并且其三维构象和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言最好地得到保存。
[2].根据另一个特别有利的方面，本发明的目标在于上述免疫原性融合蛋白，其中位于N-末端侧的第二肽由下述序列构成：
-E1包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列的全部，或
-与E1包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的特别目标在于融合蛋白E1-Sd，其示意性地呈现在图3B中，并且其包含HCV的E1蛋白的几乎整体(其嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处)。
[3].有利地，本发明的目标特别地在于上述免疫原性融合蛋白，其中位于N-末端侧的第二肽由下述序列构成：
-E2包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列的全部，或
-与E2包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E2蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的特别的目标在于融合蛋白E2-Sd，其示意性地呈现在图3C中，并且其包含HCV的E2蛋白的几乎整体(其嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处)。
[3b].在这方面，本发明更特别地涉及包含下述三个肽的免疫原性融合蛋白：
a)在C-末端侧，第一肽，该第一肽由下述序列构成：
-乙型肝炎病毒分离株的缺失了其N-末端的跨膜结构域的S蛋白的氨基酸序列，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，
b)第二肽，该第二肽具有由下述构成的序列：
-丙型肝炎病毒分离株的E2包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列的全部，或
-与所述包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从E2蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，以及
c)在N-末端侧，第三肽，该第三肽具有由下述构成的序列：
-丙型肝炎病毒分离株的E1包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列的全部，或
-与所述包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从E1蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，
其中所述第二肽位于第一肽和第三肽之间，并且第一肽、第二肽和第三肽优选地是相邻接的。
本发明的特别的目标在于融合蛋白E1-E2-Sd，其包含嫁接在E2蛋白的几乎整体的N-末端处的HCV的E1的胞外结构域，而所述E2蛋白的几乎整体本身嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处。
本发明的特别的目标还在于融合蛋白E2-E1-Sd，其包含嫁接在E1蛋白的几乎整体的N-末端处的HCV的E2的胞外结构域，而所述E1蛋白的几乎整体本身嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处。
[4].根据本发明的一个特别有利的方面，构成所述免疫原性融合蛋白的第一肽与第二肽是相邻接的，并且第二肽的C-末端共价连接至第一肽的N-末端。
有利地，根据本发明，HCV病毒的E1或E2蛋白，或者本发明融合蛋白的片段PIT1-E1、PIT2-E2、E1-E2或PIT1-E1-E2以共价和邻接的方式连接至经缺失的HBV病毒的S蛋白。
根据本发明的另一个有利的方面，连接肽将构成上述融合蛋白的第一肽和第二肽连接在一起，所述连接肽由1个氨基酸，或2个氨基酸，或3个氨基酸，或4个氨基酸，或5个氨基酸构成；条件是所述免疫原性融合蛋白保留在野生型S蛋白存在下装配成亚病毒颗粒的能力，以及针对HCV病毒或HBV病毒或HCV和HBV病毒的免疫原性性质。
[5].本发明的特别的目标还在于上述免疫原性融合蛋白，其中在C-末端位置处的第一肽由下述序列构成：
-由邻接氨基酸所界定的氨基酸序列，所述邻接氨基酸位于由HBV病毒，特别是分离株HBVadw的在N-末端经缺失的S蛋白的位置23处的氨基酸至位置226处的氨基酸所组成的区域之中，
尤其是由SEQIDNo.2所表示的氨基酸序列，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述邻接氨基酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力。
本发明的更特别的目标在于融合蛋白E1-Sd或E2-Sd或E1-E2-Sd，其中经缺失的S蛋白为分离株HBVadw的那种，并且其序列为SEQIDNo.2(参见表1)。
[6].本发明的特别的目标还在于上述免疫原性融合蛋白，其中在N-末端位置处的第二肽由下述序列构成：
-由邻接氨基酸所界定的氨基酸序列，所述邻接氨基酸位于由HCV，特别是分离株HCV-1a的E1蛋白的位置192处的氨基酸至位置380处的氨基酸所组成的区域之中，
尤其是由SEQIDNo.4所表示的氨基酸序列，或
-与所述E1蛋白的所述邻接氨基酸序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1蛋白的所述邻接氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的特别的目标还在于其中E1蛋白的序列来源于分离株HCV-1a并且特定地相应于上述区域的融合蛋白，例如尤其是融合蛋白E1-Sd(SEQIDNo.4)或E1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sd(参见表1)。
[7].特别地，本发明涉及上述免疫原性融合蛋白，其中第一肽与第二肽是相邻接的，所述融合蛋白由下述序列构成：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的目标还在于其中E1蛋白的序列来源于分离株HCV-1a并且其具有上述的序列SEQIDNo.8的融合蛋白E1-Sd，所述序列相应于嫁接在E1的SEQIDNo.4上游的Sd的SEQIDNo.2。
[7b].在这方面，本发明的目标更特别地在于上述免疫原性融合蛋白，其包含位于第二肽的N-末端侧的第三转移起始肽，所述融合蛋白由下述序列来表示：
-SEQIDNo.12，或
-与所述SEQIDNo.12具有至少83％，尤其是至少85％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性的同源性的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述SEQIDNo.12衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的目标还在于其中E1蛋白的序列来源于HCV(特别是分离株HCV-1a)并且其具有上述的序列SEQIDNo.12的融合蛋白PIT1-E1-Sd，所述序列相应于嫁接在E1的SEQIDNo.4的N-末端处的Sd的SEQIDNo.2，而所述E1的SEQIDNo.4本身嫁接在E1蛋白的转移起始肽(PIT1)的氨基酸序列的N-末端处，该E1蛋白的转移起始肽的氨基酸序列包含在由HCV的位置166处的氨基酸至位置191处的氨基酸构成的区域中。
将转移起始肽插入到上述融合蛋白E1-Sd的N-末端处具有特别的优点，即一旦经翻译就将所述融合蛋白E1-Sd指引至内质网，从而使得所述融合蛋白E1-Sd正确地糖基化，并且其三维构象和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言没有实质性的改变。
[8].本发明的目标还在于上述免疫原性融合蛋白，其中在N-末端位置处的第二肽由下述序列构成：
-由邻接氨基酸所界定的氨基酸序列，所述邻接氨基酸位于HCV，特别是分离株HCV-1a的E2蛋白的位置384处的氨基酸至位置743处的氨基酸，
尤其是由SEQIDNo.6所表示的氨基酸序列，或
-与E2蛋白的所述邻接氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从E2蛋白的所述邻接氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的目标还在于融合蛋白E2-Sd或E1-E2-Sd，其中E2蛋白的序列来源于HCV，特别是分离株HCV-1a，并且特定地相应于E2蛋白的上述序列的区域。
[9].本发明特别地涉及上述免疫原性融合蛋白，其中第一肽与第二肽是相邻接的，所述融合蛋白由下述序列构成：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的目标还在于其中E2蛋白的序列来源于分离株HCV-1a并且其具有上述的序列SEQIDNo.10的融合蛋白E2-Sd，所述序列相应于嫁接在E2的SEQIDNo.6上游的Sd的SEQIDNo.2。
[9b].在这方面，本发明的目标更特别地在于上述免疫原性融合蛋白(PIT2-E2-Sd)，其包含位于第二肽的N-末端侧的第三转移起始肽，所述融合蛋白由下述序列来表示：
-SEQIDNo.14，或
-与所述SEQIDNo.14具有至少82％，尤其是至少85％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性的同源性的氨基酸序列，或
-从所述SEQIDNo.14衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述SEQIDNo.14保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的目标还在于其中E2蛋白的序列来源于分离株HCV-1a并且其具有上述的序列SEQIDNo.14的融合蛋白PIT2-E2-Sd，所述序列相应于嫁接在E2的SEQIDNo.6的N-末端处的Sd的SEQIDNo.2，而所述E2的SEQIDNo.6本身嫁接在E2蛋白的转移起始肽(PIT2)的氨基酸序列的N-末端处，该E2蛋白的转移起始肽的氨基酸序列包含在由HCV的位置366处的氨基酸至位置383处的氨基酸构成的区域中。
本发明的目标还在于融合蛋白E1-E2-Sd或PIT1-E1-E2-Sd。本发明的目标还在于以经纯化的形式的上述融合蛋白。
本发明还涉及编码上述融合蛋白中任一种融合蛋白的杂合核酸分子。
术语“杂合核酸分子”是指这样的任何核酸分子，其包含至少一个编码乙型肝炎病毒分离株的缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域的S蛋白的序列，以及至少一个编码丙型肝炎病毒分离株的包膜蛋白的几乎整体的序列；或者来源于上面定义的分子并且遵循其遗传密码的天然简并性而进行修饰的任何分子。
有利地，本发明涉及上述杂合核酸分子，其编码上面定义的融合蛋白，包含下述三个核酸序列：
a)-在3'侧，第一核酸序列，其编码乙型肝炎病毒分离株的缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域的S蛋白，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述核酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从另一HBV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从所述在N-末端经缺失的S蛋白的核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，以及
b)-在第一序列的5'侧，第二核酸序列，其编码丙型肝炎病毒分离株的至少一种包膜蛋白E1或E2的跨膜结构域和胞外结构域，或
-与编码丙型肝炎病毒分离株的所述E1或E2蛋白之一的所述核酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从所述E1或E2蛋白之一的所述核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，
所述第二序列选自编码E1蛋白、编码E2蛋白或编码包含E1蛋白和E2蛋白的融合肽的序列，以及
c)-在第二序列的5'侧，第三核酸序列，其编码丙型肝炎病毒分离株的E1或E2包膜蛋白的转移起始肽(PIT)，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从编码转移起始肽(PIT)的蛋白质的所述核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的转移起始肽保留这样的能力，即在翻译后将所述融合蛋白指引至内质网，从而使得所述融合蛋白正确地糖基化，并且其三维构象相对于野生型蛋白质而言呈现最少的可能变化和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言最好地得到保存，或
-编码这样的肽的任何核酸序列，所述肽能够在翻译后将所述融合蛋白指引至内质网，从而使得所述融合蛋白正确地糖基化，并且其三维构象相对于野生型蛋白质而言呈现最少的可能变化和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言最好地得到保存。
有利地，本发明的目标在于编码上述融合蛋白(尤其是E1-Sd或E2-Sd，或者E1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd或PIT2-E2-Sd)的上述杂合核酸分子(尤其是分子e1-sd或e2-sd，或者e1-e2-sd、pit1-e1-sd或pit2-e2-sd，如在下面表1中所定义的)，所述杂合核酸分子从其5'末端至其3'末端分别包含编码丙型肝炎病毒分离株的转移起始肽(PIT)的核酸序列、编码HCV病毒分离株的E1或E2蛋白的核酸序列、编码HBV病毒分离株的经缺失的S蛋白的核酸序列。
插入编码嫁接在上述融合蛋白(尤其是E1-Sd或E2-Sd，或者E1-E2-Sd)的N-末端处的所述转移起始肽的核酸序列具有特别的优点，即一旦经翻译，所述融合蛋白就被指引至内质网，从而使得所述融合蛋白正确地糖基化，并且其三维构象和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言没有实质性的改变。
本发明的目标还在于上述杂合核酸分子，其仅包含上述的前两个核酸序列，并且没有编码转移起始肽的核酸序列。
本发明的目标尤其涉及编码本发明的融合蛋白的上述杂合核酸分子，其至少包含下述序列：
-编码基本上由位于C-末端的其三个跨膜结构域(图2A和3A)构成的HBV的经缺失的S蛋白(Sd)的核酸序列，所述经缺失的S蛋白保留装配成亚病毒颗粒的能力，并且保留针对HBV病毒的免疫原性性质，和
-编码E1和E2蛋白之一的序列的几乎整体(图3B和3C)的核酸序列，所述E1和E2蛋白之一的序列的几乎整体也保留针对HCV病毒的免疫原性性质，
-编码本发明的转移起始肽的核酸序列，所述转移起始肽保留这样的能力，即在翻译后将所述融合蛋白指引至内质网，从而使得所述融合蛋白正确地糖基化，并且其三维构象相对于野生型蛋白质而言呈现最少的可能变化和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言最好地得到保存，
从而，由上面提及的所述杂合核酸分子所编码的融合蛋白保留形成亚病毒颗粒的能力，以及针对HBV和/或HCV病毒的免疫原性性质，尤其是诱导针对HBV和HCV病毒的双重免疫的性质。
“同源性百分比”是指经由下述方式通过两个多核苷酸分子序列的直接比较而确定的百分比：确定所述两个序列的核酸残基的数目，随后将其除以这两个序列中最长的序列的核酸残基的数目，并将结果乘以100。
根据本发明的一个特别有利的方面，编码E1和/或E2的跨膜结构域的核酸序列缺失了位于3'位置处的最后9个核酸中的至少一个，优选地所有最后9个核酸，从而使得编码E1和/或E2的跨膜结构域的核酸序列相应于下述核苷酸片段：
-HCV分离株的基因组的核苷酸片段，其位于下述区域中：
*关于编码E1的跨膜结构域的核酸序列而言，位置1398处的核酸至位置1490处的核酸，和有利地位置1398处的核酸至位置1481处的核酸，或
*关于编码E2的跨膜结构域的核酸序列而言，位置2493处的核酸至位置2579处的核酸，和有利地位置2493处的核酸至位置2570处的核酸，或
-与上面提及的HCV基因组的所述野生型核苷酸片段具有至少91％(关于E1而言)和至少90％(关于E2而言)的同源性百分比的HCV分离株的基因组的核苷酸片段，或
-从HCV病毒的天然变体来源的核苷酸片段，和/或从HCV分离株的基因组的所述野生型核苷酸片段的合成变体来源的核苷酸片段。
表述“缺失了位于3'位置处的最后9个核酸中的至少一个的E1和/或E2的跨膜结构域”涉及位于所述跨膜结构域之一的3'位置处的3个核酸，或6个核酸，或9个核酸的缺失。
有利地，上面提及的并且编码上述免疫原性融合蛋白的杂合核酸分子的第一核酸序列与第二核酸序列是相邻接的，并且第一核酸序列的5'末端共价连接至第二核酸序列的3'末端。
根据一个特别有利的方面，上面定义的杂合核酸分子例如相应于下述分子：e1-sd，e2-sd，或者pit1-e1-sd或pit2-e2-sd，它们分别编码下述融合蛋白：E1-Sd、E2-Sd、PIT1-E1-Sd或PIT2-E2-Sd。
根据本发明的另一个有利的方面，编码连接肽的核苷酸序列将上面提及的所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列连接在一起，所述核苷酸序列由下述构成：
-3个核酸，或6个核酸，或9个核酸，或12个核酸，或15个核酸，或者
-编码任何连接肽的任何核苷酸序列；
条件是，由该杂合核酸分子所编码的并且包含所述连接肽(其本身由所述核苷酸序列编码)的免疫原性融合蛋白保留在野生型S蛋白存在下装配成非感染性亚病毒颗粒的能力，并且保留针对HCV病毒和/或HBV病毒的免疫原性性质。
在这方面，本发明的目标特别地在于上述杂合核酸分子，其中编码HBV，特别是分离株HBVadw的在N-末端经缺失的S蛋白的第一核酸序列位于所述杂合核酸分子的3'侧，并且由下述核酸序列构成：
-由位于HBV基因组的位置1630至位置2241的邻接核酸所界定的核酸序列，和尤其是
-由SEQIDNo.1所表示的核酸序列，或
-与编码所述在N-末端经缺失的S蛋白的所述核酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从HBV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从编码所述在N-末端经缺失的S蛋白的所述核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力。
本发明的更特别的目标涉及编码上述融合蛋白(尤其是E1-Sd或E2-Sd，或者E1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd或PIT2-E2-Sd，或者PIT1-E1-E2-Sd)的上述杂合核酸分子(尤其是e1-sd或e2-sd，或者e1-e2-sd、pit1-e1-sd或pit2-e2-sd，或者pit1-e1-e2-sd)，其中编码HBV的经缺失的S蛋白的所述核酸序列为分离株HBVadw的那种并且其序列为SEQIDNo.1。
还在这方面，本发明更特别地涉及上述杂合核酸分子，其中编码HCV，特别是分离株HCV-1a的E1蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的第二核酸序列位于所述杂合核酸分子的5'侧，并且由下述核酸序列构成：
-由位于HCV，特别是分离株HCV-1a的基因组的位置915至位置1490，特别地位置915至位置1481的邻接核酸所界定的核酸序列，
和尤其是由SEQIDNo.3所表示的核酸序列，或
-与E1蛋白的所述核酸序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从E1蛋白的所述核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的更特别的目标涉及编码融合蛋白(尤其是E1-Sd或PIT1-E1-Sd，或者E1-E2-Sd，或者PIT1-E1-E2-Sd)的上述杂合核酸分子(尤其是e1-sd或pit1-e1-sd，或者e1-e2-sd，或者pit1-e1-e2-sd)，其中编码E1蛋白的所述核酸序列为分离株HCV-1a的那种并且为序列SEQIDNo.3。
本发明特别地涉及上述杂合核酸分子，其编码包含位于N-末端侧的转移起始肽的上述融合蛋白，所述杂合核酸分子由下述序列来表示：
-SEQIDNo.11，或
-与所述SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV的免疫原性性质，或
-从所述SEQIDNo.11衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV的免疫原性性质。
核酸序列SEQIDNo.11(也称为pit1-e1-sd)编码SEQIDNo.12的融合蛋白PIT1-E1-Sd(参见表1)。
本发明的目标还在于杂合核酸分子(尤其是SEQIDNo.11的pit1-e1-sd)，其中：
-编码E1蛋白的核酸序列来源于HCV，特别是分离株HCV-1a，并且为上述的序列SEQIDNo.3，并且
-编码S蛋白的核酸序列来源于HBV，特别是分离株HBVadw，并且为上述的序列SEQIDNo.1，所述SEQIDNo.1嫁接在E1的SEQIDNo.3的5'处，而所述E1的SEQIDNo.3本身嫁接在编码E1蛋白的转移起始肽(PIT1)的核酸序列的5'处，该编码E1蛋白的转移起始肽的核酸序列包含在由HCV的位置837处的核酸至位置914处的核酸构成的区域中。
在这方面，本发明的目标更特别地涉及上述杂合核酸分子，其中编码HCV，特别是分离株HCV-1a的E2蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的第二核酸序列位于所述分子的5'侧，并且由下述核酸序列构成：
-由位于HCV，特别是分离株HCV-1a的基因组的位置1491至位置2579，特别地位置1491至位置2570的邻接核酸所界定的核酸序列，
和尤其是由SEQIDNo.5所表示的核酸序列，或
-与E2蛋白的所述核酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从所述SEQIDNo.5衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的更特别的目标涉及编码融合蛋白(尤其是E2-Sd或PIT2-E2-Sd)的上述杂合核酸分子(尤其是e2-sd或pit2-e2-sd)。
本发明特别地涉及上述杂合核酸分子，其编码包含位于N-末端侧的转移起始肽的本发明的融合蛋白，所述杂合核酸分子由下述序列来表示：
-SEQIDNo.13，或
-与所述SEQIDNo.13具有至少80％，尤其是至少85％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV病毒的免疫原性性质，或
-源自从所述SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV病毒的免疫原性性质。
核酸序列SEQIDNo.13(也称为pit2-e2-sd)编码SEQIDNo.14的融合蛋白PIT2-E2-Sd(参见表1)。
本发明的目标还在于杂合核酸分子(尤其是SEQIDNo.13的pit2-e2-sd)，其中：
-编码E2蛋白的核酸序列来源于HCV，特别是分离株HCV-1a，并且为上述的序列SEQIDNo.5，并且
-编码S蛋白的核酸序列来源于HBV，特别是分离株HBVadw，并且为上述的序列SEQIDNo.1，所述SEQIDNo.1嫁接在E2的SEQIDNo.5的5'处，而所述E2的SEQIDNo.5本身嫁接在编码E2蛋白的转移起始肽(PIT2)的核酸序列的5'处，该编码E2蛋白的转移起始肽的核酸序列包含在由HCV的位置1437处的核酸至位置1490处的核酸构成的区域中。
本发明的目标还在于载体，其包含编码上述融合蛋白的上述杂合核酸分子，以及与所述杂合核酸分子有效地连接的对于其表达来说所必需的工具。
作为适合于本发明目的的表达载体，可以提及例如质粒，慢病毒、塞姆利基、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒、杆状病毒类型的病毒载体，沙门氏菌、BCG类型的细菌病毒。
“对于蛋白质的表达来说所必需的工具(moyen)”是指使得能够获得该蛋白质的任何工具，例如尤其是启动子、转录终止子、复制起点和优选地选择标记，其中术语“蛋白质”用于指任何氨基酸分子，例如蛋白、融合蛋白、蛋白片段、肽、多蛋白、多肽等。对于肽的表达来说所必需的工具与编码目的肽的核酸序列有效地连接。
“有效地连接”是指所述对于表达来说所必需的元件和编码目的肽的基因之间的并置，它们处于这样的关系之下，即该关系允许它们以预期的方式起作用。例如，在启动子和目的基因之间可以存在额外的碱基，只要保存了它们的功能关系。
对于肽的表达来说所必需的工具可以是同源的(即包括在所使用的载体的基因组中的)工具，或可以是异源的。在后一种情况下，将所述工具与待表达的目的肽一起进行克隆。
优选地，在用作表达载体的塞姆利基载体和慢病毒载体之中所使用的启动子为同源启动子，和为巨细胞病毒(CMV)启动子。
异源启动子的非限制性实例尤其包括：(i)病毒启动子，例如SV40(猿猴病毒40)启动子、单纯疱疹病毒的胸苷激酶(TK-HSV-1)基因的启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的LTR、巨细胞病毒(CMV)启动子和腺病毒主要晚期启动子(MLP)，以及(ii)控制高等真核生物中编码肽的基因的转录的任何细胞启动子，例如组成型的磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子(Adra等人,1987,Gene,60:65-74)、特异于肝α1-抗胰蛋白酶和FIX的基因的启动子、和特异于平滑肌细胞的SM22启动子(Moessler等人,1996,Development,122:2415-2425)。
特别地，本发明涉及上述载体，其另外还包含慢病毒载体。
更特别地，本发明的目标为上述载体，其中所述慢病毒载体为pLenti载体。
后者先前已经尤其由下述参考文献进行了描述：Naldini,L.,Blomer,U.,Gallay,P.,Ory,D.,Mulligan,R.,Gage,F.H.,Verma,I.M.和Trono,D.(1996).Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector.Science272(5259),263-7。
本发明的目标还在于上述载体，其另外还包含源自塞姆利基森林病毒基因组的缺陷型病毒载体。
后者先前已经尤其由下述参考文献进行了描述：Schlesinger,S.和T.M.Dubensky,Jr.1999.Alphavirusvectorsforgeneexpressionandvaccines.Curr.Opin.Biotechnol.10:434-439。
本发明的目标尤其在于上述载体，其中所述源自塞姆利基森林病毒基因组的缺陷型病毒载体为pSFV1载体，后者尤其由Invitrogen进行销售。
在这方面，本发明的目标更特别在于上述载体，其中所述杂合核酸分子由下述序列构成：
-由SEQIDNo.11所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码能够形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的融合蛋白，
所述载体尤其由SEQIDNo.15表示，或
-从由SEQIDNo.11所表示的核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码能够形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的融合蛋白。
本发明的目标还在于序列SEQIDNo.15的源自pSFV1的载体，其包含编码上述融合蛋白(尤其是SEQIDNo.12的PIT1-E1-Sd)的杂合核酸分子(尤其是SEQIDNo.11的pit1-e1-sd)，并且其中：
-编码E1蛋白的核酸序列来源于HCV，特别是分离株HCV-1a，并且为上述的序列SEQIDNo.3，并且
-编码S蛋白的核酸序列来源于HBV，特别是分离株HBVadw，并且为上述的序列SEQIDNo.1，所述SEQIDNo.1嫁接在E1的SEQIDNo.3的5'处，而所述E1的SEQIDNo.3本身嫁接在编码E1蛋白的转移起始肽(PIT1)的核酸序列的5'处，该编码E1蛋白的转移起始肽的核酸序列包含在由HCV的位置837处的核酸至位置914处的核酸构成的区域中。
在这方面，本发明的目标更特别地在于上述载体之一，其中所述杂合核酸分子由下述序列构成：
-由SEQIDNo.13所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.13具有至少80％，特别地至少85％，更特别地至少90％，和更特别地至少95％的同源性的核酸序列，条件是所述核酸序列编码能够形成非感染性的并且针对HBV和/或HCV病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的肽，
所述载体尤其由SEQIDNo.16表示，或
-从所述SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码能够形成非感染性的并且针对HBV和/或HCV病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的肽。
本发明的目标还在于SEQIDNo.16的载体，其包含编码上述融合蛋白(尤其是SEQIDNo.14的PIT1-E1-Sd)的杂合核酸分子(尤其是SEQIDNo.13的pit1-e1-sd)，并且其中：
-编码E2蛋白的核酸序列来源于HCV，特别是分离株HCV-1a，并且为上述的序列SEQIDNo.5，并且
-编码S蛋白的核酸序列来源于HBV，特别是分离株HBVadw，并且为上述的序列SEQIDNo.1，所述SEQIDNo.1嫁接在E2的SEQIDNo.5的5'处，而所述E2的SEQIDNo.5本身嫁接在编码E2蛋白的转移起始肽(PIT2)的核酸序列的5'处，该编码E2蛋白的转移起始肽的核酸序列包含在由HCV的位置1437处的核酸至位置1490处的核酸构成的区域中。
本发明还涉及上述载体，其包含由下述三个核酸序列构成的杂合核酸分子：
a)-在3'侧，第一核酸序列，其编码乙型肝炎病毒分离株的缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域的S蛋白(Sd)，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述核酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同源性的核酸序列，条件是所述核酸序列编码能够形成非感染性的并且针对HBV病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的肽，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从编码经缺失的S蛋白(Sd)的所述核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码能够形成非感染性的并且针对HBV病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的肽，以及
b)-在所述第一核酸序列的5'末端，第二核酸序列，其编码丙型肝炎病毒分离株的至少一种包膜蛋白E1或E2的跨膜结构域和胞外结构域，或
-与编码丙型肝炎病毒分离株的所述E1或E2蛋白之一的所述核酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的肽，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从编码E1或E2包膜蛋白的所述第二核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的肽，
所述第二序列选自编码E1蛋白、编码E2蛋白或编码包含E1蛋白和E2蛋白的融合肽的序列，以及
c)-在所述第二核酸序列的5'末端，第三核酸序列，其编码丙型肝炎病毒分离株的转移起始肽(PIT)，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从编码转移起始肽(PIT)的蛋白质的所述核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的转移起始肽保留这样的能力，即在翻译后将所述融合蛋白指引至内质网，从而使得所述融合蛋白正确地糖基化，并且其三维构象相对于野生型蛋白质而言呈现最少的可能变化和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言最好地得到保存，或
-编码这样的肽的任何核酸序列，所述肽能够在翻译后将所述融合蛋白指引至内质网，从而使得所述融合蛋白正确地糖基化，并且其三维构象相对于野生型蛋白质而言呈现最少的可能变化和/或其抗原性质相对于野生型蛋白质而言最好地得到保存。
有利地，本发明的目标还在于上述载体，其中上面提及的并且编码上述免疫原性融合蛋白(尤其是E1-Sd或E2-Sd)的杂合核酸分子(尤其是e1-sd或e1-e2-sd)的第一核酸序列与第二核酸序列是相邻接的，并且第一核酸序列的5'末端共价连接至第二核酸序列的3'末端。
根据另一个有利的方面，本发明涉及上述载体(尤其是慢病毒载体，例如pLenti载体，或者源自塞姆利基森林病毒基因组的缺陷型病毒载体，例如pSFV1载体)，其中编码连接肽的核苷酸序列将编码上述免疫原性融合蛋白(尤其是E1-Sd或E2-Sd)的所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列连接在一起，该核苷酸序列由3个核酸，或6个核酸，或9个核酸，或12个核酸，或15个核酸构成，条件是编码连接肽的所述核苷酸序列不改变上述免疫原性融合蛋白(尤其是E1-Sd或E2-Sd)在野生型S蛋白存在下装配成亚病毒颗粒的能力，并且后者还保留针对HCV病毒和/或HBV病毒的免疫原性性质。
有利地，上述载体包含编码HBV，尤其是乙型肝炎病毒分离株HBVadw的在N-末端经缺失的S蛋白的第一核酸序列，所述序列为：
-由位于HBV(特别是分离株HBVadw)的位置1630至2241的邻接核酸所界定的核酸序列，
和尤其是由SEQIDNo.1所表示的核酸序列，或
-与编码所述SEQIDNo.1具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从HBV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从SEQIDNo.1衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力。
本发明的更特别的目标在于上述载体(尤其是慢病毒载体，例如pLenti载体，或者源自塞姆利基森林病毒基因组的缺陷型病毒载体，例如pSFV1载体)，其包含编码融合蛋白(尤其是E1-Sd或E2-Sd，或者E1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd或PIT2-E2-Sd)的上述杂合核酸分子(尤其是e1-sd或e2-sd，或者e1-e2-sd、pit1-e1-sd或pit2-e2-sd)，其中编码HBV的经缺失的S蛋白的所述核酸序列为分离株HBVadw的那种并且其序列为SEQIDNo.1。
根据本发明的一个特别的方面，上述载体包含编码HCV，特别是分离株HCV-1a的E1蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的第二核酸序列，其位于所述分子的5'侧，并且由下述核酸序列构成：
-由位于HCV，特别是分离株HCV-1a的基因组的位置915至位置1490，特别地位置915至位置1481的邻接核酸所界定的核酸序列，
和尤其是由SEQIDNo.3所表示的核酸序列，或
-与编码E1蛋白的所述核酸序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从编码所述E1蛋白的所述核酸衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的更特别的目标在于上述载体(尤其是慢病毒载体，例如pLenti载体，或者源自塞姆利基森林病毒基因组的缺陷型病毒载体，例如pSFV1载体)，其包含编码融合蛋白(尤其是E1-Sd，或者E1-E2-Sd、PIT1-E1-Sd)的上述杂合核酸分子(尤其是e1-sd，或者e1-e2-sd、pit1-e1-sd)，其中编码HCV的E1蛋白的所述核酸序列为分离株HCV-1a的那种并且其序列为SEQIDNo.3。
根据本发明的一个有利的方面，上述载体包含编码HCV，特别是分离株HCV-1a的E2蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的第二核酸序列，其位于所述分子的5'侧，并且由下述核酸序列构成：
-由位于HCV，特别是分离株HCV-1a的基因组的位置1491至位置2579，特别地位置1491至位置2570的邻接核酸所界定的核酸序列，
和尤其是由SEQIDNo.5所表示的核酸序列，或
-与编码E2蛋白的所述核酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的核酸序列，或从编码所述E2蛋白的所述核酸衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的更特别的目标在于上述载体(尤其是慢病毒载体，例如pLenti载体，或者源自塞姆利基森林病毒基因组的缺陷型病毒载体，例如pSFV1载体)，其包含编码融合蛋白(尤其是E2-Sd，或者E1-E2-Sd、PIT2-E2-Sd)的上述杂合核酸分子(尤其是e2-sd，或者e1-e2-sd、pit2-e2-sd)，其中编码HCV的E2蛋白的所述核酸序列为分离株HCV-1a的那种并且其序列为SEQIDNo.5。
本发明的目标还在于嵌合的、免疫原性的且非感染性的亚病毒包膜颗粒，其包含下列蛋白质：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型S蛋白构成的蛋白质，和
-至少一种上述免疫原性融合蛋白。
术语“嵌合亚病毒颗粒”是指至少包含HBV的野生型S蛋白和上述免疫原性融合蛋白的任何亚病毒颗粒，其由于野生型S蛋白的自装配或者在野生型S蛋白存在下上述融合蛋白的装配而产生。
有利地，上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒的免疫原性融合蛋白为：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从HCV病毒和/或HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的目标还在于上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其包含上述融合蛋白，尤其是融合蛋白E1-Sd(SEQIDNo.8)或E1-E2-Sd，并且其中E1蛋白的序列尤其为上述的SEQIDNo.4，且尤其嫁接在序列SEQIDNo.2的经缺失的S蛋白(Sd)的氨基酸序列的C-末端。
根据本发明的一个特别的方面，上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒的免疫原性融合蛋白由下述序列构成：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的目标还在于上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其包含上述融合蛋白，尤其是融合蛋白E1-Sd(SEQIDNo.10)或E1-E2-Sd，并且其中E1蛋白的序列尤其为上述的SEQIDNo.6，且尤其嫁接在序列SEQIDNo.2的经缺失的S蛋白(Sd)的氨基酸序列的C-末端处。
根据本发明的一个有利的方面，上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒包含下述两种融合蛋白：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述SEQIDNo.8编码保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力的蛋白质，或
-从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述SEQIDNo.8编码保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力的蛋白质；和
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的目标还在于上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其包含两种上述融合蛋白(尤其是SEQIDNo.8的E1-Sd，或E1-E2-Sd；以及SEQIDNo.10的E2-Sd)。
本发明还涉及上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其中免疫原性融合蛋白包含丙型肝炎病毒分离株的包膜蛋白中的至少一种(E1)，所述蛋白质由下述序列构成：
-相应于位于这样的区域中的氨基酸残基的氨基酸序列，所述区域包含HCV，特别是分离株HCV-1a的野生型蛋白质的位置192处的氨基酸至位置380处的氨基酸，或
-与HCV分离株的野生型E1蛋白的所述序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的目标还在于包含上述融合蛋白(尤其是E1-Sd，或者E1-E2-Sd或PIT1-E1-E2-Sd，或者PIT2-E2-E1-Sd)的上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其中E1蛋白的序列来源于分离株HCV-1a。
本发明的目标还在于上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其中免疫原性融合蛋白包含丙型肝炎病毒分离株的包膜蛋白中的至少一种，所述蛋白质由选自下列的氨基酸序列构成：
-相应于位于这样的区域中的氨基酸残基的氨基酸序列，所述区域包含HCV，特别是分离株HCV-1a的野生型E2蛋白的位置384处的氨基酸至位置743处的氨基酸，或
-与所述HCV分离株的野生型E2蛋白的所述序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E2蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的目标还在于包含上述融合蛋白(尤其是E2-Sd，或者E1-E2-Sd或PIT1-E1-E2-Sd)的上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其中E2蛋白的序列来源于分离株HCV-1a。
根据一个特别的方面，本发明还涉及上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其包含下述两种融合蛋白：
-包含由HCV，特别是分离株HCV-1a的野生型E1蛋白的位置192处的氨基酸至位置383处的氨基酸，特别是位置192处的氨基酸至位置380处的氨基酸构成的氨基酸序列的融合蛋白，或
-与HCV分离株的野生型E1蛋白的所述序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质；和
-包含由HCV，特别是分离株HCV-1a的野生型E2蛋白的位置384处的氨基酸至位置746处的氨基酸，特别是位置384处的氨基酸至位置743处的氨基酸构成的氨基酸序列的融合蛋白，或
-与所述HCV分离株的野生型E2蛋白的所述序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E2蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
本发明的目标还在于上述免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其包含上述两种融合蛋白(尤其是E1-Sd或PIT1-E1-Sd，或者E2-Sd或PIT1-E1-Sd，或者E1-E2-Sd或PIT1-E1-E2-Sd)。
本发明的目标还在于免疫原性组合物，其包含作为活性物质的选自下列的至少一种化合物，以及药学上可接受的载体：
-上述融合蛋白，
-前面所描述的杂合核酸分子，
-包含所述杂合核酸分子的上述载体，
-上面所描述的嵌合亚病毒颗粒。
根据本发明的一个特别的实施方案，该药物组合物还包含药学上合适的载体，本领域技术人员将会根据常用参数以及所希望的药物组合物的组分、所希望的药物形式和所希望的施用方式容易地确定其性质和用量。
本发明的药物组合物适合于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、表面、局部、气管内、鼻内、透皮、直肠、眼内、心房内施用，其中所述活性成分可以以单位施用形式进行施用。
单位施用形式可以为例如片剂，明胶胶囊(gélule)，颗粒剂，粉剂，注射溶液或口服悬浮液，透皮膏药(贴剂)，舌下的、颊的、气管内的、眼内的、鼻内的、心房内的、通过吸入的施用形式，表面的、透皮的、皮下的、肌内的或静脉内的施用形式，直肠的施用形式，或者植入物。对于表面施用，可以考虑乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、洗剂或洗眼剂。
有利地，上述免疫原性组合物包含选自下述三种化合物中的至少一种化合物的活性物质：
a)上述融合蛋白，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
b)杂合核酸分子，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.11所表示的核酸序列，或
*与所述序列SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.11衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的上述载体；
c)嵌合亚病毒颗粒，其包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
*由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HBV和HCV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HBV和HCV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的特别的目标涉及下述三种化合物之一：
a)-包含E1蛋白的上述融合蛋白(尤其是E1-Sd、PIT1-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sd)，其示意性图解在图3B中给出，并且其包含HCV的E1蛋白的几乎整体，所述HCV的E1蛋白的几乎整体嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处，或
b)-包含编码E1蛋白的核酸序列的上述杂合核酸分子(尤其是e1-sd、pit1-e1-sd、e1-e2-sd、pit1-e1-e2-sd)，其包含编码HCV的E1蛋白的核酸序列的几乎整体，所述编码HCV的E1蛋白的核酸序列的几乎整体嫁接在编码HBV的经缺失的S蛋白的核酸序列的5'处，或
c)-包含E1蛋白的上述亚病毒颗粒(尤其是E1-Sd、PIT1-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sd)，其示意性图解在图3B中给出，并且其包含HCV的E1蛋白的几乎整体，所述HCV的E1蛋白的几乎整体嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处。
根据本发明的一个特别的方面，上述免疫原性组合物包含选自下述化合物中的至少一种化合物的活性物质：
a)融合蛋白，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
b)杂合核酸分子，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.13所表示的核酸序列，或
*与所述SEQIDNo.13具有至少80％，尤其是至少85％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的上述载体；
c)嵌合亚病毒颗粒，其包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
*由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的特别的目标涉及下述三种化合物之一：
a)-包含E2蛋白的上述融合蛋白(尤其是E2-Sd、PIT2-E2-Sd、E1-E2-Sd、PIT1-E1-E2-Sd)，其示意性图解在图3C中给出，并且其包含HCV的E2蛋白的几乎整体，所述HCV的E2蛋白的几乎整体嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处，或
b)-包含编码E2蛋白的核酸序列的上述杂合核酸分子(尤其是e2-sd、pit2-e2-sd、e1-e2-sd、pit1-e1-e2-sd)，其包含编码HCV的E1蛋白的核酸序列的几乎整体，所述编码HCV的E1蛋白的核酸序列的几乎整体嫁接在编码HBV的经缺失的S蛋白的核酸序列的5'处，或
c)-包含E1蛋白的上述亚病毒颗粒(尤其是E1-Sd、PIT-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT-E1-E2-Sd)，其包含HCV的E2蛋白的几乎整体，所述HCV的E2蛋白的几乎整体嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处。
根据本发明的一个有利的方面，上述免疫原性组合物包含嵌合亚病毒颗粒作为活性物质，所述嵌合亚病毒颗粒至少包含由下述序列构成的两种免疫原性融合蛋白：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；和
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与E2-Sd的SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的特别的目标涉及上述亚病毒颗粒，其包含上述两种融合蛋白，包括：
-一种为嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处的HCV的E1蛋白(尤其是E1-Sd、PIT1-E1-Sd、E1-E2-Sd、PIT-E1-E2-Sd)和HCV的E2蛋白，和
-另一种为嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处的HCV的E2蛋白(尤其是E2-Sd、PIT2-E2-Sd、E1-E2-Sd、PIT-E1-E2-Sd)。
[27].根据本发明的一个特别有利的方面，上述免疫原性组合物的活性物质由包含下列组分的混合物构成：
●至少下述两种融合蛋白：
*一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
*另一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
●至少下述两种杂合核酸分子：
*一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.11所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述序列SEQIDNo.11衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的上述载体；
*另一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.13所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.13具有至少80％，特别地至少85％，更特别地至少90％，和更特别地至少95％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述序列SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的上述载体；
●至少下述两种嵌合亚病毒颗粒：
*一种包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
*另一种包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
本发明的特别的目标涉及包含下述化合物的混合物：
a)-至少上述两种融合蛋白，一种包含HCV的E1蛋白(尤其是序列SEQIDNo.8的E1-Sd，或PIT1-E1-Sd，或E1-E2-Sd，或PIT1-E1-E2-Sd)，另一种包含HCV的E2蛋白(尤其是序列SEQIDNo.10的E2-Sd，或PIT2-E2-Sd，或E1-E2-Sd，或PIT1-E1-E2-Sd)，所述E1蛋白或E2蛋白嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处，或
b)-至少上述两种杂合核酸分子，一种包含编码E1蛋白的核酸序列(尤其是序列SEQIDNo.11的pit1-e1-sd，或e1-sd，或e1-e2-sd，或pit1-e1-e2-sd)，另一种包含编码E2蛋白的核酸序列(尤其是序列SEQIDNo.13的pit2-e2-sd，或e2-sd，或e1-e2-sd，或pit1-e1-e2-sd)，所述编码E1蛋白的核酸序列或编码E2蛋白的核酸序列嫁接在编码HBV的经缺失的S蛋白的核酸序列的5'处，或
c)-至少上述两种亚病毒颗粒，一种包含HCV的E1蛋白(尤其是序列SEQIDNo.8的E1-Sd，或PIT1-E1-Sd，或E1-E2-Sd，或PIT1-E1-E2-Sd)，另一种包含HCV的E2蛋白(尤其是序列SEQIDNo.10的E2-Sd，或PIT2-E2-Sd，或E1-E2-Sd，或PIT1-E1-E2-Sd)，所述E1蛋白或E2蛋白嫁接在HBV的经缺失的S蛋白的N-末端处。
本发明的目标还在于上述免疫原性组合物在制备用于预防性和/或治疗性治疗和/或用于预防丙型肝炎的药物中的用途。
本发明还涉及上述免疫原性组合物在制备用于预防性和/或治疗性治疗和/或用于预防乙型肝炎的药物中的用途。
有利地，本发明的目标涉及上述免疫原性组合物在制备用于预防性和/或治疗性治疗和/或用于预防乙型肝炎和丙型肝炎的药物中的用途。
本发明的目标还在于细胞系，其表达前面所描述的嵌合的、免疫原性的、非感染性的亚病毒颗粒。
作为适合于本发明目的的微生物的实例，可以提及，酵母，例如下列类别中的那些：糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)，其中酿酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、卡尔糖酵母(Saccharomycescarlsbergensis)和乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactis)是优选的；以及细菌，例如大肠杆菌(E.coli)，和下列类别中的那些：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)。
作为真核细胞的实例，可以提及来自动物的细胞，所述动物例如为哺乳动物、爬行动物、昆虫及等价物。优选的真核细胞为来自中国仓鼠(CHO细胞)、猴(COS细胞和Vero细胞)、侏儒仓鼠肾(BHK细胞)、猪肾(PK15细胞)和兔肾(RK13细胞)的细胞，人骨肉瘤细胞系(143B细胞)、人HeLa细胞系和人肝细胞瘤细胞系(HepG2细胞类型)，以及昆虫细胞系(例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的细胞系)。
有利地，本发明的目标涉及上述细胞系，其为被称为CHO的中国仓鼠卵巢细胞系。
后者先前已进行了描述，尤其是由下述参考文献：MichelML,PontissoP,SobczakE,MalpièceY,StreeckRE,TiollaisP.SynthesisinanimalcellsofhepatitisBsurfaceantigenparticlescarryingareceptorforpolymerizedhumanserumalbumin.ProcNatlAcadSciUSA.1984Dec；81(24):7708-12。
本发明还涉及上述细胞系，其为酵母，所述酵母尤其可以为酿酒糖酵母。
本发明的目标还在于上面所描述的细胞系，其为新生仓鼠肾细胞系(BHK)，并且特别地为新生仓鼠肾细胞系(BHK-21)。
后者先前已进行了描述，尤其是由下述参考文献：GoldmanRD,FollettEA.BirefringentfilamentousorganelleinBHK-21cellsanditspossibleroleincellspreadingandmotility.Science.1970Jul17；169(942):286-8。
根据一个特别的方面，本发明还涉及从上述细胞系产生上述的嵌合的、免疫原性的且非感染性的亚病毒颗粒的方法，其包括下列步骤：
1-用包含编码乙型肝炎病毒分离株的野生型S蛋白的核酸序列的慢病毒载体转导该细胞系的细胞的步骤，
2-培养所述细胞以便产生能够表达乙型肝炎病毒野生型包膜亚病毒颗粒的细胞系的步骤。
3-选择呈现出乙型肝炎病毒野生型包膜亚病毒颗粒的最佳分泌的克隆的步骤，
4-用上述载体过量转导所述克隆的步骤，
5-培养所述细胞以便产生能够表达上述的嵌合的、免疫原性的且非感染性的亚病毒颗粒的细胞系的步骤，
6-选择能够最佳地分泌上述的嵌合的、免疫原性的且非感染性的亚病毒颗粒的所述细胞的步骤，
7-培养所述克隆以便产生上述的嵌合的、免疫原性的且非感染性的亚病毒颗粒的步骤，和
8-从所收集的培养基中纯化亚病毒颗粒的步骤(离心，梯度超离心，收集关于嵌合亚病毒颗粒而言阳性的级分，透析)。
表1提供了本发明中所描述的核酸序列和氨基酸序列的列表。按惯例，核酸序列以小写字母书写，而氨基酸序列以大写字母书写。
表1：序列列表
| 核酸 | 氨基酸 |
| SEQ ID No.1：sd | SEQ ID No.2：Sd |
| SEQ ID No.3：e1 | SEQ ID No.4：E1 |
| SEQ ID No.5：e2 | SEQ ID No.6：E2 |
| SEQ ID No.7：e1-sd | SEQ ID No.8：E1-Sd |
| SEQ ID No.9：e2-sd | SEQ ID No.10：E2-Sd |
| SEQ ID No.11：pit1-e1-sd | SEQ ID No.12：PIT1-E1-Sd |
| SEQ ID No.13：pit2-e2-sd | SEQ ID No.14：PIT2-E2-Sd |
| SEQ ID No.15：具有pit1-e1-sd的载体 | / |
| SEQ ID No.16：具有pit2-e2-sd的载体 | / |
在阅读了下面对于作为举例说明性的而非限制性的简单实例而给出的优选实施方案所作的描述以及附图之后，本发明的其他特征和优点将更清楚地显现出来，在所述附图中：
图1图解显示了具有超过3,000个氨基酸的HCV病毒多蛋白的片段的拓扑学。由细胞的肽酶进行的切割导致所述多蛋白成熟，尤其是成为结构蛋白(衣壳，包膜E1和E2)。数字标明了界定该多蛋白的不同结构蛋白的结构域的氨基酸残基的位置。
图2A和2B图解显示了HBV病毒的野生型S蛋白的跨膜拓扑学。
-图2A图解显示了HBV病毒的野生型S蛋白的226个氨基酸残基，所述野生型S蛋白尤其包含四个由灰色垂直矩形所表示的跨膜结构域，并且其N-末端和C-末端朝向ER腔。在分离株HBVadw的情况下，大约25kD的该蛋白质包含226个氨基酸残基。
-图2B显示了在所述野生型S蛋白的自装配之后获得的亚病毒颗粒。
图3A-3C显示了融合蛋白E1-Sd(图3B)或E2-Sd(图3C)的共表达，它们在野生型S蛋白(图3B)存在下装配成本发明的嵌合亚病毒颗粒。
-图3A显示了自装配成亚病毒颗粒的HBV的野生型S蛋白。
-图3B显示了由于用HCV病毒的E1包膜蛋白的跨膜结构域(由黑色垂直矩形所表示的)和E1的胞外结构域(由虚线所表示的)替代位于野生型S蛋白的N-末端的跨膜结构域而产生的融合蛋白E1-Sd；随后图解显示了所述融合蛋白E1-Sd在野生型S蛋白存在下装配成S+E1-Sd亚病毒颗粒。
根据本发明的该特别的但非限制性的实施方案，大约50kD的融合蛋白E1-Sd包含来源于E1蛋白和S结构域的393个氨基酸残基。完整E1蛋白的残基192-380连接至由野生型S蛋白的残基23-226构成的经缺失的S蛋白的N-末端。
-图3C显示了由于用HCV病毒的E2包膜蛋白的跨膜结构域(由白色垂直矩形所表示的)和E2的胞外结构域(由虚线所表示的)替代位于野生型S蛋白的N-末端的跨膜结构域而产生的融合蛋白E2-Sd；随后图解显示了所述融合蛋白E2-Sd在野生型S蛋白存在下装配成S+E2-Sd亚病毒颗粒。
根据本发明的该特别的但非限制性的实施方案，大约85kD的融合蛋白E2-Sd包含来源于E2蛋白和S结构域的564个氨基酸残基。完整E2蛋白的残基384-743连接至由野生型S蛋白的残基23-226构成的经缺失的S蛋白的N-末端。
图4A-4E图解显示了HBV的野生型S包膜蛋白，HCV的E1和E2，以及融合蛋白E1-Sd和E2-Sd的拓扑学。
-图4A显示了由单个跨膜结构域(黑色垂直矩形)和宽的朝向ER腔的胞外结构域构成的HCV的野生型E1包膜蛋白的拓扑学。在HCV1a分离株的情况下，该蛋白质具有大约35kD并且包含192个氨基酸残基。
-图4B显示了由单个跨膜结构域(白色垂直矩形)和宽的朝向ER腔的胞外结构域构成的HCV的野生型E2包膜蛋白的拓扑学。在HCV1a分离株的情况下，该蛋白质具有大约70kD并且包含363个氨基酸残基。
-图4C显示了尤其包含四个跨膜结构域(灰色垂直矩形)的HBV的野生型S包膜蛋白的拓扑学。
-图4D显示了杂合核酸分子pit1-e1-sd的cDNA序列，其从其5'末端至3'末端由下述序列构成：
-编码HCV病毒的转移起始肽PIT1的序列，
-编码HCV病毒的E1蛋白的整个胞外结构域的序列，和编码HCV病毒的E1蛋白的跨膜结构域的序列，其中缺失了3'末端的最后3个密码子，
-编码经缺失的HBV病毒的S蛋白的序列；
以及其用于产生本发明的融合蛋白E1-Sd的用途。
-图4E显示了杂合核酸分子pit2-e2-sd的cDNA序列，其从其5'末端至3'末端由下述序列构成：
-编码HCV病毒的转移起始肽PIT2的序列，
-编码HCV病毒的E2蛋白的整个胞外结构域的序列，编码HCV病毒的E2蛋白的跨膜结构域的序列，其中缺失了3'末端的最后3个密码子，
-编码经缺失的HBV病毒的S蛋白的序列；
以及其用于产生本发明的融合蛋白E2-Sd的用途。
图5图解显示了用于获得编码本发明融合蛋白的cDNA的方案。编码E1和E2蛋白的序列由黑色线表示(序列A)。编码经缺失的S蛋白的序列由灰色线表示(序列B)。BamHI限制位点由黑色菱形表示。用于扩增核酸序列e1-sdA、e1-sdB、e2-sdA和e2-sdB的正向和反向引物在表x中列出。
图6A和6B提供了在“塞姆利基/BHK-21细胞”系统中瞬时产生本发明融合蛋白E1-Sd或E2-Sd之一的实验方案的示意性图解显示。
-图6A显示了，将源自质粒pSFV1-E1-Sd的RNA转染到BHK-21细胞中，以便获得嵌合包膜亚病毒颗粒E1-Sd的产生。
-图6B显示了，将源自质粒pSFV1-E2-Sd的RNA转染到BHK-21细胞中，以便获得嵌合包膜亚病毒颗粒E2-Sd的产生。
图6C和6D显示了对于用源自质粒pSFV1-E1-Sd和pSFV1-E2-Sd的RNA转染的细胞的裂解物，要么通过抗-S抗体(6C)，要么通过抗-E1和抗-E2抗体(6D)所揭示的Western印迹。
-图6C显示了，融合蛋白E1-Sd和E2-Sd(加框的条带)分别在50kD和85kD的大小(其相应于理论大小)处被检测到。M：分子量标准参照物(kD)。
-图6D显示了，融合蛋白E1-Sd和E2-Sd(加框的条带)分别在50kD的85kD的大小处被检测到，其中分别通过抗-E1和抗-E2抗体。M：分子量标准参照物(kD)。
图7A-7B显示了在“塞姆利基/BHK-21细胞”系统中HBV的野生型S蛋白以及两种融合蛋白E1-Sd和E2-Sd的共产生。
图例：M：分子量标准参照物(kD)；泳道β-gal、E1E2或E1E2和S代表从用相应的SFVRNA转染BHK-21细胞而来源的对照细胞裂解物。
-图7A提供了实验方案的示意性图解显示。将源自质粒pSFV1-E1-Sd和pSFV1-E2-Sd的RNA独个地与源自质粒pSFV1-S的RNA一起共转染到BHK-21细胞中，以便获得两种类型的嵌合包膜亚病毒颗粒S+E1-Sd和S+E2-Sd的产生，第一种包含野生型S蛋白和融合蛋白E1-Sd，第二种包含野生型S蛋白和融合蛋白E2-Sd。
-图7B显示了对于从用源自载体pSFV1-E1-Sd和pSFV1-S的RNA转染的细胞开始而纯化出的细胞内颗粒，通过抗-E1抗体所揭示的Western印迹。结果显示，融合蛋白E1-Sd(加框的条带)在相应于理论大小的50kD的大小处被检测到。
-图7C显示了对于从用源自载体pSFV1-E1-Sd和pSFV1-S的RNA转染的细胞开始而纯化出的细胞内颗粒，通过抗-S抗体所揭示的Western印迹。结果显示，融合蛋白E1-Sd(加框的条带)在相应于理论大小的50kD的大小处被检测到。
-图7D显示了对于从用源自质粒pSFV1-E1-Sd和pSFV1-S的RNA转染的细胞开始而纯化出的细胞内颗粒，通过负着色的透射电子显微术显微照相。条状物：100nm。
-图7E显示了对于从用源自质粒pSFV1-E2-Sd和pSFV1-S的RNA转染的细胞开始而纯化出的细胞内颗粒，通过抗-E2抗体所揭示的Western印迹。结果显示，融合蛋白E2-Sd(加框的条带)在相应于理论大小的85kD的大小处被检测到。
-图7F显示了对于从用源自质粒pSFV1-E2-Sd和pSFV1-S的RNA转染的细胞开始而纯化出的细胞内颗粒，通过抗-S抗体所揭示的Western印迹。结果显示，嵌合蛋白E2-Sd(加框的条带)在相应于理论大小的85kD的大小处被检测到。
-图7G显示了对于从用源自质粒pSFV1-E2-Sd和pSFV1-S的RNA转染的细胞开始而纯化出的细胞内颗粒，在通过负着色的透射电子显微术中的显微照相。条状物：100nm。
图8显示了用于获得产生野生型S蛋白和本发明融合蛋白的CHO克隆系的方案。其图解显示了如何从CHO细胞系开始，用包含潮霉素抗性基因(hph)以及编码HBV的野生型S蛋白的基因的慢病毒(LV)进行转导使得能够发展出称为CHO-S且产生野生型S蛋白的第一细胞克隆。然后，该克隆用包含GFP的基因(gfp)以及编码两种融合蛋白E1-Sd或E2-Sd之一的基因的慢病毒(LV)进行过量转导。该第二转导使得能够发展出称为CHO-S/E1-Sd和CHO-S/E2-Sd的两种其他细胞克隆。
图9显示了在不同的CHO稳定克隆中野生型S蛋白和本发明融合蛋白的细胞内产生的Western印迹分析。其显示了，借助于抗-E1、抗-E2和抗-S抗体而揭示了克隆CHO-S、CHO-S/E1-Sd和CHO-S/E2-Sd的细胞内蛋白质。所研究的融合蛋白由黑色框指示。M：分子量标准参照物(kD)；泳道β-gal、E1E2和S：从用相应的SFVRNA转染BHK-21细胞而来源的对照细胞裂解物。
图10显示了在由CsCl梯度收集的级分中通过ELISA对野生型S蛋白进行的定量的直方图。横坐标显示了所收集的不同级分，纵坐标指示了它们中的每一种在290nm下的光密度。从克隆CHO-S、CHO-S/E1-Sd和CHO-S/E2-Sd的培养物上清液开始，通过在CsCl中的超离心来纯化嵌合S亚病毒颗粒。从梯度顶端(级分1)开始收集级分，并且通过ELISA来评价野生型S蛋白的量。黑色直方图显示了在克隆CHO-S的级分中野生型S蛋白的分布，浅灰色直方图显示了在克隆CHO-S/E1-Sd的级分中野生型S蛋白的分布，和深灰色直方图显示了在克隆CHO-S/E2-Sd的级分中野生型S蛋白的分布。
图11A显示了，借助于抗-E1、抗-E2和抗-S抗体，通过Western印迹分析了经CsCl纯化的颗粒的蛋白质含量。在这三种类型的亚病毒颗粒中，以其两种糖基化状态检测到野生型S蛋白(24和27kD)。在其各自的颗粒中，在分别为50kD和85kD的相应于理论大小的大小处检测到融合蛋白E1-Sd或E2-Sd。M：分子量标准参照物(kD)。
图11B显示了对于下述纯化的通过透射电子显微术的负着色分析：从克隆CHO-S的上清液中纯化由于野生型S蛋白的自装配而产生的球状类型(直径为大约20nm)的亚病毒颗粒。条状物：20nm。
图11C显示了对于下述纯化的通过透射电子显微术的负着色分析：从克隆CHO-S/E1-Sd的上清液中纯化由于融合蛋白E1-Sd在野生型S蛋白存在下的装配而产生的嵌合亚病毒颗粒。这些球状类型的颗粒具有大约20nm的直径。条状物：20nm。
图11D显示了对于下述纯化的通过透射电子显微术的负着色分析：从克隆CHO-S/E2-Sd的上清液中纯化由于融合蛋白E1-Sd在野生型S蛋白存在下的装配而产生的嵌合亚病毒颗粒。这些球状类型的颗粒具有大约20nm的直径。条状物：20nm。
作为非限制性的实例，下文给出了用于在塞姆利基系统中获得丙型肝炎病毒(HCV)包膜亚病毒颗粒的本发明的特别的实施方案(参见图4-7)。
该实施方案基于获得本发明的免疫原性融合蛋白，特别是融合蛋白E1-Sd或E2-Sd，其一方面包含乙型肝炎病毒(HBV)的在N-末端缺失了其跨膜结构域的S包膜蛋白(Sd)，和另一方面包含HCV的包膜蛋白E1或E2之一的几乎整体。该瞬时的实施方案证明了所述经缺失的S蛋白(Sd)在野生型S蛋白存在下进行装配的能力，使得能够获得上述嵌合亚病毒颗粒，这尤其归因于基于塞姆利基森林病毒的复制性质的载体(pSFV载体)的高表达水平，然后通过使用慢病毒载体而获得稳定的且产生所述颗粒的克隆。
实施例I：在塞姆利基系统(pSFV)中获得丙型肝炎病毒包膜嵌合亚病毒颗粒
I-1)质粒pSFV1-E1-Sd和pSFV1-E2-Sd的构建。
将具有11033bp的双顺反子结构的pSFV1载体(Invitrogen)用于下述构建。该载体具有插入在第一个顺反子的5'处的SP6-RNA聚合酶的启动子序列，以便能够起始通过体外转录进行的正极性的完整RNA(称为42S(+)的RNA)的合成。在转染到哺乳动物细胞中之后，这些在体外加帽的重组RNA在SFV的nsP1-4复制酶存在下进行自复制，并且用于借助于称为26S(+)的次级mRNA来产生目的蛋白。
通过进行数个系列的聚合酶链反应(PCR)扩增来获得野生型互补DNA(cDNA)或编码本发明融合蛋白的杂合核酸分子。从质粒pSFV1-E1E2(其为包含编码HCV的两种蛋白质E1和E2的序列的SFV载体)开始，第一PCR(称为PCRA)使得能够扩增出编码具有其跨膜结构域的HCVE1或E2包膜蛋白的序列，该序列之前为编码用于指引至内质网的其各自的转移起始肽的序列。从先前所描述的质粒pHBV1.5开始[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]，第二PCR(称为PCRB)使得能够扩增出编码HBV的经缺失的S蛋白的序列。编码根据本发明的融合蛋白的序列中的“HCV”部分称为“A”，和“HBV”部分称为“B”(图5)。对PCRA和B的产物进行定量并在凝胶上进行纯化，以便随后以相等份额包括在最终PCR中。HCV-HBV二价引物的使用使得能够合成具有在其末端交叠的结构域的PCRA和B的产物，这最终使得能够获得编码本发明的融合蛋白的完整cDNA序列。
I-1.1)编码本发明的融合蛋白(尤其是E1-Sd和E2-Sd)的cDNA序列的扩增：
在包含50ngDNA、15pmol每一引物对(Proligo)、200μM每种脱氧核糖核苷酸dNTP(Invitrogen)和10个单位的具有校正活性(以便使与连续扩增相关的误差最小化)的Taq-DNA聚合酶(Takara)的50μL反应介质中进行PCR扩增(图5)。借助于软件“VectorNTIAdvance10”(Invitrogen)和“Primerpremier”(BiosoftInternational)来确定A序列的“正向”引物和B序列的“反向”引物，以便在扩增出的DNA片段的各自5'和3'末端处产生BamHI位点。
下面的表2，“用于进行构成嵌合体序列的A和B序列的基因扩增的寡核苷酸”，指出了所使用的引物的序列。
相应于HCV的序列在那里以黑色字体表示，相应于HBV的序列以加下划线的黑色字体表示，相应于BamHI限制位点的序列以加下划线的斜体字体表示，相应于翻译起始密码子ATG的序列以粗体字体表示，相应于翻译终止密码子ATT的序列以粗体字体表示。
表2：“用于进行构成嵌合体序列的A和B序列的基因扩增的寡核苷酸”
在“iCycler”热循环仪(Biorad)中进行的这些扩增反应包括：在95℃下5分钟的初始变性，随后为25个循环(包括在95℃下变性1分钟，在60℃下杂交1分钟，和在69℃下延伸1分钟)。在这25个循环之后为在69℃下10分钟的最终延伸。根据制造商的建议，使用“WizardSVGelandPCRClean-UpSystem”系统(Promega)，在1％琼脂糖凝胶上纯化通过PCRA和B而扩增出的片段。然后，使PCRA和B的经纯化的片段在不存在引物的情况下通过称为PCRHYB的PCR杂交10个循环，随后在A序列的“正向”引物和B序列的“反向”引物存在下通过称为PCRFIN的最终PCR扩增25个循环。这最后两个PCR的循环程序与用于PCRA和B的循环程序类似。如上所述，在凝胶上纯化如此获得的本发明杂合核酸分子的扩增出的片段。
I-1.2)将杂合cDNA序列克隆到pSFV1载体中
根据制造商的建议，将经纯化的PCRFIN产物克隆到载体(“pGEM-TEasyVectorSystem”，Promega)中。通过用酶BamHI(Biolabs)进行限制性消化而从中释放出本发明杂合核酸分子的片段，随后将其克隆到质粒pSFV1的BamHI位点处。通过细菌转化来扩增包含本发明融合蛋白的不同质粒(尤其是质粒pSFV1-E1-Sd和pSFV1-E2-Sd)，随后通过使用苯酚/氯仿的DNA的大量制备(maxipréparation)来进行纯化。通过酶促限制性消化来检查插入片段的方向，并且通过测序来检查构建物全体。
I-2)用不同SFV构建物的RNA瞬时转染的细胞系的获得。
新生仓鼠肾细胞(BHK-21)的培养操作程序以及SFV母体质粒的体外转录和自复制型重组RNA的转染的方案与先前所描述的那些相同[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]。表达HBV的野生型S蛋白且先前在上面的文章中描述了的构建物pSFV-S用作对照。
I-3)野生型包膜蛋白和嵌合包膜蛋白的细胞内产生的分析。
在共聚焦显微术中通过免疫荧光以及通过Western印迹对目的蛋白(尤其是S、Sd、E1、E2、E1-Sd、E2-Sd等)进行生化分析的操作程序，在透射电子显微术中对经转染的细胞进行超微结构分析的操作程序，以及对HCV-HBV嵌合包膜亚病毒颗粒进行定量(ELISA)/纯化(蔗糖梯度，随后为亲和层析)的操作程序为先前所描述的那些[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]。
使用鼠类抗-E1单克隆抗体(A4，由DrHarryGreenberg,UniversitédeStanford,Californie提供)[Dubuisson,J.,Hsu,H.H.,Cheung,R.C.,Greenberg,H.B.,Russell,D.G.和Rice,C.M.(1994).FormationandintracellularlocalizationofhepatitisCvirusenvelopeglycoproteincomplexesexpressedbyrecombinantvacciniaandSindbisviruses.JVirol68(10),6147-60]或鼠类抗-E2单克隆抗体(H52，由DrJeanDubuisson,InstitutPasteurdeLille提供)[Deleersnyder,V.,Pillez,A.,Wychowski,C.,Blight,K.,Xu,J.,Hahn,Y.S.,Rice,C.M.和Dubuisson,J.(1997).FormationofnativehepatitisCvirusglycoproteincomplexes.JVirol71(1),697-704]来进行对于HCV的野生型蛋白质E1和E2以及本发明融合蛋白的检测。
I-4)培养物上清液的分析。
在转染之后，通过在1500g下离心10分钟来使具有大约107个经转染的细胞的培养物上清液洁净，随后使用SW41转子(L70Ultracentrifuge,Beckman)，在4℃下以35,000rpm超离心16小时。向粒状沉淀提供50μL裂解缓冲液，随后通过Western印迹来进行分析。
I-5)本发明的融合蛋白E1-Sd和E2-Sd的产生。
在用包含本发明的杂合核酸分子(pit1-e1-sd，pit2-e2-sd)的质粒pSFV1进行转染后16小时，将BHK-21细胞裂解，随后使用抗-E1和抗-E2单克隆抗体通过Western印迹进行分析。在BHK-21细胞中瞬时产生之后，融合蛋白E1-Sd和E2-Sd的大小如下：对于蛋白E1-Sd而言为大约50kD，和对于蛋白E2-Sd而言为大约85kD。与通过使用抗-E1、抗-E2和抗-S抗体检测本发明的所述融合蛋白而获得的强烈免疫荧光相关的这些结果显示，它们正确地产生，正确地糖基化，并因此根据所希望的跨膜拓扑学进行布置(图6A-6D)。
为了恢复本发明的不同融合蛋白的分泌能力，以给每一种本发明的融合蛋白反式提供HBVS蛋白的野生型形式这样的方式来进行共转染(图7A)。在转染后16小时，研磨经共转染的细胞，并且通过蔗糖梯度和随后的亲和层析来纯化细胞内的亚病毒颗粒，如先前所描述的[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]。在所有情况下，如前面在实施例I-3中所描述的，通过透射电子显微术和通过使用抗-S、抗-E1或抗-E2抗体的Western印迹来对亚病毒颗粒进行研究(图7B-7G)。
透射电子显微术的照片显示，在共产生野生型S蛋白与本发明的融合蛋白之一的所有这些实验中，可产生大量的球状和丝状的亚病毒颗粒。Western印迹分析显示，这些或多或少丝状的亚病毒颗粒富含本发明的融合蛋白。
本发明根据实施例1在“塞姆利基”系统中的实施显示，包含HCV的E1或E2蛋白的几乎整体(它们的跨膜结构域替代位于HBV的S蛋白的N-末端处的跨膜结构域)的本发明的融合蛋白装配成嵌合亚病毒颗粒，其具有与在生产针对乙型肝炎的疫苗中所使用的亚病毒颗粒相同的性质，因此有助于本发明的所述嵌合亚病毒颗粒的纯化，和潜在地有助于仿照针对HBV的疫苗的工业应用来开发针对HCV的疫苗的工业应用。
本发明根据实施例1的实施还显示，产生了包含HCV的非截短的E1和/或E2蛋白的融合蛋白。该特征可以显得对于诱导最佳的中和性和细胞免疫应答来说是决定性的。
然而，在“塞姆利基”系统中，嵌合亚病毒颗粒通过细胞的瞬时转染来产生。这是因为，这些载体的高细胞毒性不允许获得嵌合亚病毒颗粒的长期有效分泌。此外，从经共转染的细胞的研磨物中纯化所述颗粒需要相对繁重的施行，这不太适于工业生产。
作为非限制性的实例，与图8-11相联系地给出从稳定表达HBV的野生型S蛋白以及融合蛋白E1-Sd或融合蛋白E2-Sd的CHO类型细胞系开始获得丙型肝炎病毒包膜亚病毒颗粒的实施方案。通过使用慢病毒类型的整合载体使得可能获得这些稳定的CHO克隆。该系统的优点之一为，重组蛋白质(例如本发明的融合蛋白)的产生不具有重大的短期细胞毒性效应，例如用SFV系统所遇到的那些。
该实施方案的目标之一还为获得产生本发明的嵌合亚病毒颗粒的细胞系统，其类似于用于工业制备针对乙型肝炎的疫苗的细胞系统。
实施例II：在慢病毒系统中获得丙型肝炎病毒包膜亚病毒颗粒
慢病毒载体的使用已使得能够开发出稳定产生与融合蛋白E1-Sd和/或E2-Sd之一相联合的HBV的野生型S蛋白的细胞克隆。
II-1)慢病毒质粒载体pLENTI。
将包含选择基因hph并且编码作为选择标记的潮霉素抗性蛋白质的、具有9955bp的质粒pLENTIhph用于下列构建[Naldini,L.,Blomer,U.,Gallay,P.,Ory,D.,Mulligan,R.,Gage,F.H.,Verma,I.M.和Trono,D.(1996).Invivogenedeliveryandstabletransductionofnon-dividingcellsbyalentiviralvector.Science272(5259),263-7]。
首先，通过用酶BamHI(Biolabs)进行限制性消化，随后根据制造商的建议，使用“WizardSVGelandPCRClean-UpSystem”系统(Promega)在1％琼脂糖凝胶上进行纯化，而从先前所描述[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]的pSFV1-S中释放出编码野生型S蛋白的核酸序列。然后，根据制造商的建议，使用T4-DNA连接酶(Biolabs)将经纯化的该片段克隆到包含在质粒pLENTIhph的多克隆位点中的BamHI位点处。最后，通过细菌转化来扩增质粒pLENTIhph-S，随后根据制造商的建议，使用“NucleobondPC500Kit”系统(Qiagen)通过DNA的大量制备来进行纯化。通过酶促限制性消化来检查插入片段的方向。
同样地，将编码本发明融合蛋白(尤其是E1-Sd和E2-Sd)的cDNA的不同的本发明杂合核酸分子克隆到质粒pLENTIgfp的BamHI位点处。然后，将如此获得的质粒(尤其是pLENTIgfp-E1-Sd和E2-Sd)进行扩增，纯化，并测序(参见II-1)。
II-2)重组慢病毒的产生。
在慢病毒质粒的转染之前24小时，按照3×106个细胞/75cm2的扁平小瓶(Falcon)将HEK293T细胞接种在补充有10％去补体的胎牛血清(ATGC)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM-glutamax培养基(Invitrogen)中。将这些细胞在5％CO2下进行培养，并且在转染前4小时更换培养基。根据制造商的建议，使用“磷酸钙转染试剂盒(CalciumPhosphateTransfectionKit)”系统(Invitrogen)，将1pmole的每一质粒p8.74、pVSV-G和pLENTI(pLENTIhph-S，pLENTIgfp-E1-Sd，E2-Sd)同时转染到HEK293T细胞中。在转染后24小时更换培养基，并且在转染后48小时和72小时收集培养基。将所收集的培养基在0.45μm下进行过滤，随后通过在4℃下以100,000g在20％蔗糖垫(coussindesucrose)上超离心90分钟来进行浓缩。将包含重组慢病毒的粒状沉淀接纳在500μL磷酸盐缓冲液(PBS)中，并且保存于-80℃。产生出了多批本发明的重组慢病毒载体，其中尤其包括慢病毒载体LVhph-S、LVgfp-E1-Sd、LVgfp-E2-Sd。根据制造商的建议，使用“InnotestHIVKit”系统(Innogenetics)，从测定p24蛋白的含量来确定每一批的慢病毒转导单位(TU)的滴度。
II-3)细胞培养和转导。
用于稳定且组成型地产生HCV-HBV嵌合亚病毒颗粒的细胞系是称为CHO的中国仓鼠卵巢细胞系。该细胞系已经被完全批准用于生产具有医学目的的重组蛋白质，尤其是针对乙型肝炎的疫苗“GenHevacB(SanofiPasteurMSD)。在5％CO2下，在补充有10％去补体的胎牛血清(ATGC)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM-F12培养基(Invitrogen)中培养这些CHO细胞。在转导前24小时，按照105个细胞/孔将CHO细胞接种在6-孔平板(Falcon)中。然后，在新培养基中，在4μg/mLpolybrene(Sigma-Aldrich)存在下将它们以2.5的感染复数(即2.5的“转导单位(TU)/细胞”比率)进行转导，随后培养24小时。第二天，移去转导培养基，将根据本发明实施而获得的细胞在PBS缓冲液中进行漂洗，随后再正常地维持培养2天。
II-3.1)产生野生型S蛋白的稳定CHO克隆的产生
根据上面所描述的且在图8中所图示的方案，用慢病毒LVhph-S转导所使用的CHO细胞系。根据先前所描述的方案[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]，使用针对野生型S蛋白的抗体，通过免疫荧光来检查转导效率。在转导后三天，对细胞进行胰蛋白酶消化，在1mg/mL潮霉素(Euromedex)存在下重新接种在直径为10cm的培养盒(Falcon)中，并且维持培养三周。通过克隆圆柱体(cylindredeclonage)(Invitrogen)来回收所出现的细胞克隆，随后在24-孔平板(Falcon)中进行扩增。然后，在通过ELISA在培养物上清液中对野生型S蛋白进行定量之后，选择后来使用的CHO克隆[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]。该细胞克隆称为CHO-S。
II-3.2)产生HBV病毒的野生型S蛋白以及本发明的融合蛋白E1-Sd和E2-Sd的稳定CHO克隆的产生
然后，根据上面在§II-3.1.中所描述的方案(图8)，用编码作为选择标记的GFP蛋白并且包含本发明杂合核酸分子的重组慢病毒LVgfp，尤其是慢病毒载体LVgfp-PIT1-E1-Sd或LVgfp-PIT2-E2-Sd过量转导CHO-S细胞克隆。由于存在GFP蛋白，因而使用FACScalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)来检查转导效率。在转导后三天，对细胞进行胰蛋白酶消化，按照1个细胞/孔以限度稀释重新接种在96-孔平板(Falcon)中，并且将其维持培养三周。回收所出现的GFP+细胞克隆，随后大量扩增。将如此获得的细胞克隆尤其称为CHO-E1-Sd或CHO-E2-Sd。
II-4)HBV和HCV的野生型和嵌合包膜蛋白的细胞内产生的分析。
通过免疫荧光和通过Western印迹对每种细胞克隆的目的蛋白S、E1-Sd或E2-Sd进行生化分析的操作程序已经在前面在§I-4中关于实施例I而进行了描述。
II-5)来源于培养物上清液的嵌合亚病毒颗粒的纯化和分析。
对于每一种所选择的克隆，通过在4℃下以1500g离心10分钟来使大约200mL培养物上清液澄清。通过添加(NH4)2SO4溶液(pH7.5；最终45％)和随后在4℃下以10,000g离心15分钟来使蛋白质沉淀。将粒状沉淀接纳在最小体积的TNE缓冲液(10mMTris/HClpH7.5/100mMNaCl/1mMEDTA)中。在一系列于TNE缓冲液中的透析之后，添加CsCl直至获得大约1.22g/cm3的密度，随后使用45Ti转子(L70Ultracentrifuge,Beckman)，在15℃下以40,000rpm进行两个相继的等密度超离心48小时。从梯度顶端收集级分，并且通过ELISA来定量野生型S蛋白[Patient,R.,Hourioux,C.,Sizaret,P.Y.,Trassard,S.,Sureau,C.和Roingeard,P.,(2007)HepatitisBVirusSubviralEnvelopeParticleMorphogenesisandIntracellularTraffickingJVirol,81(8),3842-51]。混合阳性级分，并且在4℃下于TNE缓冲液中进行透析。
最后，如前面在§I-4中关于实施例I而描述的，通过Western印迹和通过透射电子显微术来对经纯化的制备物进行分析。
II-6)S蛋白和融合蛋白的细胞内产生。
在它们扩展之后，通过免疫荧光和随后的Western印迹(其中使用针对Sd、E1或E2蛋白的抗体)来分析细胞克隆CHO-S、CHO-E1-Sd和CHO-E2-Sd(参见：实施例I的§I-4，以及图9)。如所预期的，所有克隆均使得能够强烈产生以其两种糖基化状态(p24和gp27)的HBV的野生型S蛋白。同样地，克隆CHO-E1-Sd和CHO-E2-Sd使得能够强烈地和在细胞质中产生具有预期大小的本发明的融合蛋白。因此，这些结果显示，所有本发明的融合蛋白在CHO细胞系中正确地产生。
II-7)颗粒的纯化。
从克隆CHO-S、CHO-E1-Sd或CHO-E2-Sd的200mL培养物上清液开始进行第一纯化试验。将这些上清液(对于该三种克隆，这些上清液中野生型S蛋白的浓度通过ELISA评价为大约100ng/mL)在CsCl等密度梯度上进行超离心。然后，通过定量野生型S蛋白来分析每一所形成的梯度的级分(图10)。对于经纯化的该三种类型的嵌合亚病毒颗粒(S、E1-Sd和E2-Sd)而言，可以在相应于1.17至1.18的密度的第9级分中观察到野生型S蛋白的浓度峰。因而，汇集每一制备物的第8、9和10级分以用于进行透析，随后通过使用针对野生型S蛋白、E1蛋白或E2蛋白的抗体的Western印迹(参见：实施例I的§I-4，以及图11A)和通过以负着色的透射电子显微术进行分析(图11B-11D)。
对于每一纯化，进行相应于1μg野生型S蛋白的放置以用于在丙烯酰胺凝胶中进行分析。这使得能够显示，通过抗-E1或抗-E2抗体，在它们的各自制备物中于预期大小处和以可观的量检测到本发明的融合蛋白E1-Sd和E2-Sd。同样地，在每一制备物中检测到野生型S蛋白的两种预期的糖基化形式。在透射电子显微术中通过负着色进行的分析使得能够证实在所研究的三种制备物中存在有直径为大约20nm的球状包膜亚病毒颗粒。
实施例III：获得包含两种融合蛋白E1-Sd和E2-Sd的包膜亚病毒颗粒
形成包含Gaussiaprinceps的选择基因gluc来代替gfp基因的新质粒pLENTIgluc，其编码作为选择标记的分泌的萤光素酶(GLuc)。将编码融合蛋白E1-Sd的cDNA的片段克隆到质粒pLENTIgluc的BamHI位点处。将如此获得的质粒pLENTIgluc-E1-Sd进行扩增，纯化，并测序(参见II-1)。
III-1)重组慢病毒的产生。
在慢病毒质粒的转染之前24小时，按照3×106个细胞/75cm2的扁平小瓶(Falcon)将HEK293T细胞接种在补充有10％去补体的胎牛血清(ATGC)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM-glutamax培养基(Invitrogen)中。将这些细胞在5％CO2下进行培养，并且在转染前4小时更换培养基。根据制造商的建议，使用“磷酸钙转染试剂盒(CalciumPhosphateTransfectionKit)”系统(Invitrogen)，将1pmole的每一质粒p8.74、pVSV-G和pLENTIgluc-E1-Sd同时转染到HEK293T细胞中。在转染后24小时更换培养基，并且在转染后48小时和72小时收集培养基。将所收集的培养基在0.45μm下进行过滤，随后通过在4℃下以100,000g在20％蔗糖垫(coussindesucrose)上超离心90分钟来进行浓缩。将包含重组慢病毒的粒状沉淀接纳在500μL磷酸盐缓冲液(PBS)中，并且保存于-80℃。因此产生新一批重组慢病毒：LVgluc-E1-Sd。根据制造商的建议，使用“InnotestHIVKit”系统(Innogenetics)，从测定p24蛋白的含量来确定该批的慢病毒转导单位(TU)的滴度。
III-2)产生HBV病毒的野生型S蛋白、本发明的融合蛋白E2-Sd和E1-Sd的稳定CHO克隆的产生。
将关于实施例II而阐述和使用的CHO细胞培养和转导方法进行调整以适合于该实施例。在使用慢病毒LVhph-S进行第一次转导(其使得能够获得CHO-S细胞克隆)之后，根据关于实施例II而描述的方案，使用慢病毒LVgfp-E2-Sd进行第二次转导，其使得能够获得CHO-E2-Sd细胞克隆。
根据上面所描述的方案，用慢病毒LVgluc-E1-Sd再次转导CHO-E2-Sd细胞克隆。在转导后三天，对细胞进行胰蛋白酶消化，并且按照1个细胞/孔以限度稀释重新接种在96-孔平板(Falcon)中。将细胞维持培养三周，在这三周之后收获所出现的细胞克隆的上清液。在这些上清液中，根据制造商的建议，使用“GaussiaLuciferaseAssayKit”系统(Biolabs)通过测量其酶促活性来检测萤光素酶的存在。使用CentroLB960发光计(BertholdTechnologies)来进行经由该酶促反应而发出的光的测量。回收相应于GLuc+上清液的细胞克隆，随后进行大量扩增。如此获得的克隆称为CHO-S/E2-Sd/E1-Sd。
实施例IV：嵌合亚病毒颗粒的免疫学活性的体内分析
根据上面所描述的方法，对于每一类型的颗粒(S+E1-Sd，S+E2-Sd，仅HBV的S)，从细胞培养物上清液中纯化出5至10毫克的嵌合亚病毒颗粒。
将四组小鼠和兔用于一系列免疫接种。
根据常规方法，通过三次注射10微克免疫原来进行免疫接种。
第一组用颗粒“S+E1-Sd”进行免疫。
第二组用颗粒“S+E2-Sd”进行免疫。
第三组用颗粒“仅HBVS”进行免疫。
第四组用嵌合亚病毒颗粒“S+E1-Sd”和嵌合亚病毒颗粒“S+E2-Sd”的混合物进行免疫。
通过ELISA分析和Western印迹来检测在这些动物中产生的总体体液应答。对于抗-S抗体，商业ELISA(Abbott，Roche)使得能够测定已知具有针对HBV的中和性质的抗-S抗体的国际单位(IU)的数目。至少等于10IU的浓度被视为具有针对HBV的保护作用(JilgW等人,HepatitisB-vaccination:Strategyforboosterdosesinhighriskpopulationgroups.ProgressinHepatitisBImmunization.编者P.Coursaget等人,ColloqueInserm.1990；190:419-427)。对于抗-E1和抗-E2抗体，使用Western印迹来评价是否产生了抗-E1和抗-E2抗体应答。如果情况如此，则给该分析补充以下述分析：分析中和该病毒的抗-E1和抗-E2抗体的存在。在允许在体外繁殖基因型2的HCV的毒株的JFH-1系统(Wakita等人,NatMed2005)中，或者通过使用包含基因型1或3的HCV的结构蛋白的嵌合病毒毒株，来进行由这些抗体中和HCV的分析。
Claims (33)
1.免疫原性融合蛋白，其至少包含下列两个肽：
a)在C-末端侧，第一肽，该第一肽由下述序列构成：
-人乙型肝炎病毒(HBV)分离株的S蛋白的氨基酸序列，所述S蛋白缺失了位于其N-末端的其跨膜结构域，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从另一HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，以及
b)在N-末端侧，第二肽，该第二肽由下述序列构成：
-丙型肝炎病毒(HCV)分离株的至少一种包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列，或
-与丙型肝炎病毒分离株的包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1或E2蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，
丙型肝炎病毒分离株的所述包膜蛋白选自E1蛋白、E2蛋白或包含E1蛋白和E2蛋白的融合肽。
2.根据权利要求1的免疫原性融合蛋白，其中位于N-末端侧的第二肽由下述序列构成：
-E1包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列的全部，或
-与E1包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
3.根据权利要求1的免疫原性融合蛋白，其中位于N-末端侧的第二肽由下述序列构成：
-E2包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的氨基酸序列的全部，或
-与E2包膜蛋白的跨膜结构域和胞外结构域的所述氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E2蛋白衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
4.根据权利要求1至3中任一项的免疫原性融合蛋白，其中构成所述免疫原性融合蛋白的第一肽与第二肽是相邻接的，并且第二肽的C-末端共价连接至第一肽的N-末端。
5.根据权利要求1至4中任一项的免疫原性融合蛋白，其中在C-末端位置处的第一肽由下述序列构成：
-由邻接氨基酸所界定的氨基酸序列，所述邻接氨基酸位于由HBV，特别是分离株HBVadw的在N-末端经缺失的S蛋白的位置23处的氨基酸至位置226处的氨基酸所组成的区域之中，
尤其是由SEQIDNo.2所表示的氨基酸序列，或
-与在N-末端经缺失的S蛋白的所述邻接氨基酸序列具有至少91％，尤其是至少93％，特别地至少95％，和更特别地至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力，或
-从HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述在N-末端经缺失的S蛋白的所述氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成针对乙型肝炎病毒而言具有免疫原性的非感染性亚病毒颗粒的能力。
6.根据权利要求1至5中任一项的免疫原性融合蛋白，其中在N-末端位置处的第二肽由下述序列构成：
-由邻接氨基酸所界定的氨基酸序列，所述邻接氨基酸位于由HCV，特别是分离株HCV-1a的E1蛋白的位置192处的氨基酸至位置380处的氨基酸所组成的区域之中，
尤其是由SEQIDNo.4所表示的氨基酸序列，或
-与所述E1蛋白的所述邻接氨基酸序列具有至少75％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述E1蛋白的所述邻接氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
7.根据权利要求5或6中之一的免疫原性融合蛋白，其中第一肽与第二肽是相邻接的，所述融合蛋白由下述序列构成：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少89％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
8.根据权利要求1至5中任一项的免疫原性融合蛋白，其中在N-末端位置处的第二肽由下述序列构成：
-由邻接氨基酸所界定的氨基酸序列，所述邻接氨基酸位于HCV，特别是分离株HCV-1a的E2蛋白的位置384处的氨基酸至位置743处的氨基酸，
尤其是由SEQIDNo.6所表示的氨基酸序列，或
-与E2蛋白的所述邻接氨基酸序列具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质，或
-从HCV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从E2蛋白的所述邻接氨基酸序列衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留针对丙型肝炎病毒的免疫原性性质。
9.根据权利要求7或8之一的免疫原性融合蛋白，其中第一肽与第二肽是相邻接的，所述融合蛋白由下述序列构成：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少89％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
10.杂合核酸分子，其编码根据权利要求1至9中任一项的融合蛋白中的任一种融合蛋白。
11.根据权利要求10的杂合核酸分子，其中第一核酸序列与第二核酸序列是相邻接的，并且第一核酸序列的5'末端共价连接至第二核酸序列的3'末端。
12.根据权利要求10和11中任一项的杂合核酸分子，其编码包含位于N-末端侧的转移起始肽的上述融合蛋白，所述杂合核酸分子由下述序列来表示：
-SEQIDNo.11，或
-与所述SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同一性的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV的免疫原性性质，或
-从所述SEQIDNo.11衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV的免疫原性性质。
13.根据权利要求10和11中任一项的杂合核酸分子，其编码包含位于N-末端侧的转移起始肽的上述融合蛋白，所述杂合核酸分子由下述序列来表示：
-SEQIDNo.13，或
-与所述SEQIDNo.13具有至少80％，尤其是至少85％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV病毒的免疫原性性质，或
-源自从所述SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留针对HCV和/或HBV病毒的免疫原性性质。
14.载体，其包含根据权利要求10至13中任一项的杂合核酸分子，以及对于其表达来说所必需的工具。
15.根据权利要求14的载体，其另外还包含慢病毒载体。
16.根据权利要求15的载体，其中所述慢病毒载体为pLenti载体。
17.根据权利要求14至16之一的载体，其中所述杂合核酸分子由下述序列构成：
-由SEQIDNo.11所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码能够形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的融合蛋白，
所述载体尤其由SEQIDNo.15表示，或
-从由SEQIDNo.11所表示的核酸序列衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码能够形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的融合蛋白。
18.根据权利要求14至16之一的载体，其中所述杂合核酸分子由下述序列构成：
-由SEQIDNo.13所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.13具有至少80％，特别地至少85％，更特别地至少90％，和更特别地至少95％的同源性的核酸序列，条件是所述核酸序列编码能够形成非感染性的并且针对HBV和/或HCV病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的肽，
所述载体尤其由SEQIDNo.16表示，或
-从所述SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质编码能够形成非感染性的并且针对HBV和/或HCV病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的肽。
19.嵌合的、免疫原性的且非感染性的亚病毒包膜颗粒，其包含下列蛋白质：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型S蛋白构成的蛋白质，和
-至少一种根据权利要求1至9中任一项的免疫原性融合蛋白。
20.根据权利要求19的免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其中所述免疫原性融合蛋白由下述序列构成：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从HCV病毒和/或HBV病毒分离株来源的天然变体的氨基酸序列，或从所述SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
21.根据权利要求19的免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其中所述免疫原性融合蛋白由下述序列构成：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
22.根据权利要求19的免疫原性嵌合亚病毒颗粒，其包含下述两种融合蛋白：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述SEQIDNo.8编码保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力的蛋白质，或
-从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述SEQIDNo.8编码保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力的蛋白质；和
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
23.免疫原性组合物，其包含作为活性物质的选自下列的至少一种组分，以及药学上可接受的载体：
-根据权利要求1至9中任一项的融合蛋白，
-根据权利要求10至13中任一项的杂合核酸分子，
-根据权利要求14至18中任一项的载体，其包含所述杂合核酸分子，
-根据权利要求19至22中任一项的嵌合亚病毒颗粒。
24.根据权利要求23的免疫原性组合物，其中所述活性物质选自下述三种化合物中的至少一种：
a)上述融合蛋白，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
b)杂合核酸分子，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.11所表示的核酸序列，或
*与所述序列SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.11衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的载体；
c)嵌合亚病毒颗粒，其包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
*由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HBV和HCV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HBV和HCV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
25.根据权利要求23的免疫原性组合物，其中所述活性物质选自下述化合物中的至少一种：
a)融合蛋白，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
b)杂合核酸分子，其由下述序列构成：
*由SEQIDNo.13所表示的核酸序列，或
*与所述SEQIDNo.13具有至少80％，尤其是至少85％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的载体；
c)嵌合亚病毒颗粒，其包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
*由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
*与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
*从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
26.根据权利要求23的免疫原性组合物，其中所述活性物质为至少包含由下述序列构成的两种免疫原性融合蛋白的嵌合亚病毒颗粒：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；和
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
27.根据权利要求23的免疫原性组合物，其中所述活性物质由包含下列组分的混合物构成：
●至少下述两种融合蛋白：
*一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
*另一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少90％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对乙型肝炎病毒和/或针对丙型肝炎病毒而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
●至少下述两种杂合核酸分子：
*一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.11所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.11具有至少78％，尤其是至少80％，特别地至少85％，和更特别地至少90％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述序列SEQIDNo.11衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的载体；
*另一种由下述序列构成：
-由SEQIDNo.13所表示的核酸序列，或
-与所述序列SEQIDNo.13具有至少80％，特别地至少85％，更特别地至少90％，和更特别地至少95％的同源性的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述序列SEQIDNo.13衍生的合成变体的核酸序列，条件是由所述核酸序列所编码的蛋白质保留形成非感染性的并且针对HCV和/或HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，
或者包含所述杂合核酸分子的载体；
●至少下述两种嵌合亚病毒颗粒：
*一种包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
-由SEQIDNo.8所表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQIDNo.8具有至少88％，尤其是至少90％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从所述SEQIDNo.8衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力；
*另一种包含由下述序列构成的免疫原性融合蛋白：
-由SEQIDNo.10所表示的氨基酸序列，或
-与SEQIDNo.10具有至少86％，尤其是至少88％，特别地至少92％，和更特别地至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力，或
-从SEQIDNo.10衍生的合成变体的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保留形成非感染性的并且针对HCV和/或针对HBV而言具有免疫原性的亚病毒颗粒的能力。
28.根据权利要求23至27中任一项的免疫原性组合物在制备用于预防性和/或治疗性治疗和/或用于预防丙型肝炎的药物中的用途。
29.根据权利要求23至27中任一项的免疫原性组合物在制备用于预防性和/或治疗性治疗和/或用于预防乙型肝炎的药物中的用途。
30.根据权利要求23至27中任一项的免疫原性组合物在制备用于预防性和/或治疗性治疗和/或用于预防乙型肝炎和丙型肝炎的药物中的用途。
31.细胞系，其表达根据权利要求19至22的嵌合的、免疫原性的、非感染性的亚病毒颗粒。
32.根据权利要求31的细胞系，其是被称为CHO的中国仓鼠卵巢细胞系。
33.根据权利要求31的细胞系，其是酵母，所述酵母尤其可以为酿酒糖酵母(Saccharomycescerevisae)。
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