CN101381739B

CN101381739B - 一种周质分泌融合表达型前t载体及其制备与应用

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Publication number: CN101381739B
Application number: CN2007100712148A
Authority: CN
Inventors: 林陈水; 于真真; 杨丹燕; 许明; 任慧颖
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2007-09-06
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2027-09-06
Also published as: CN101381739A

Abstract

本发明提供了一种周质分泌融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII的DNA 1片段；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39’中，得到所述周质分泌融合表达型前T载体。本发明除了使用XcmI制备线形T载体外，不需要用其它限制性内切酶，一步法构建融合表达基因工程菌，为大量制备活性肽工程菌库提供了可行的技术方法。

Description

一种周质分泌融合表达型前T载体及其制备与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种可用于快速构建周质分泌融合表达基因工程菌的周质分泌融合表达型前T载体及其制备与应用。

(二)背景技术

基因工程是将目的基因重组于表达载体中，并将重组表达载体转化至适当的宿主中，表达得到所需要的蛋白质，从而发挥效益。基因工程制药的关键是如何获得高纯度的具有正确空间结构的多肽或蛋白质，基因重组仅仅是一个手段而已，应当尽可能减少基因重组阶段花费的人力与财力。

PCR技术是获得目的基因片段的最常用的方法，是分子生物学和基因工程研究中的一项基本技术，它被广泛用于体外扩增已知或未知的特异DNA片段。市场上已经有用于PCR产物快速克隆的T载体，如pUCm-T载体。因为对PCR产物进行快速有效的克隆是开展杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段等下游实验，实现PCR产物多种用途的必经之路。T-载体是一种用于直接克隆PCR产物的载体，一般为线性，其分子末端各有一个3′dT(脱氧胸苷)突出。利用Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性，在扩增DNA的3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸，通常为脱氧腺苷酸(dA)。这个3′dA突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′dT突出的T-载体上。这样就将PCR产物以粘性末端连接的方式直接克隆到载体上。这种方式不仅克服了常规克隆方法的缺点，而且操作简便、方法快捷、连接效率高，因而其应用范围非常广泛。

但是目前市场上供应的T载体均为克隆型T载体，即T载体用于克隆目的基因的PCR产物，仅仅满足基因保存和测序的需要。即使有使目的基因表达的T载体，其表达产物与目标产物不一致，N端会多出几个氨基酸，得到的蛋白产物与目标蛋白有所不同，因而应用价值不高。如果能将PCR产物直接连接于表达载体的开放性阅读框架中，环状质粒转化表达宿主即可实现基因表达。这样的过程可以省略繁琐的重组工序，省时、省材料。而且，每次可以获得若干个克隆，效率极高。由于基因表达，基因型与表型紧密相联，可以根据表型测定基因型，对需要的克隆进行测序，可以节约大量时间和财力。

目前基因工程方法制备目标蛋白还存在几个技术难题：第一，在大肠杆菌中直接表达重组异源蛋白，往往形成难以溶解的包含体，给下游的复性工作造成麻烦。可以将外源基因与受体菌自身蛋白质编码基因拼接在一起进行融合表达，融合伴侣良好的增溶作用对于融合蛋白复性是极为有利的：可以防止蛋白质分子之间相互作用，避免形成多聚体；可以提高复性时蛋白质的浓度，节约成本，提高生产效率。目前常用的融合表达系统如谷光甘肽转移酶(GST)，二硫键形成蛋白(DsbA)，硫氧化还原蛋白(TrxA)等通常都能够在大肠杆菌中高效表达出可溶性的融合蛋白。直接获得有正确空间结构的蛋白质的有效方法是分泌表达，如酵母分泌表达、大肠杆菌分泌表达等。分泌过程中蛋白质分子相互影响小，而且通过二硫键维持空间结构。比如在大肠杆菌周质中分泌表达，在快速、过量表达的情况下，分子间形成二硫键，目标产物聚合成多聚体，而在适当条件下，如低温、低诱导剂浓度等，可以借助周质空间的氧化环境形成分子内二硫键，从而维持正确的空间结构，利用该策略可以制备出重组肠激酶轻链。第二，许多具有药用价值的天然生物活性肽，是通过分泌机制从一个细胞分泌形成的，基因表达采用Pre-Pro-成熟肽模式，Pre是信号肽基因，指导蛋白质分泌，Pro肽是帮助成熟肽正确折叠的一段肽链，在分泌之前，利用体内的蛋白酶酶切除去Pro肽得到成熟肽，最后分泌得到的成熟肽的第一个氨基酸一般不是甲硫氨酸。比如骨形态发生蛋白BMP-2成熟肽的第一个氨基酸为Gln，BMP-7成熟肽的第一个氨基酸为Ser，防御素HNP-1成熟肽的第一个氨基酸为Ala。为了使目的基因在大肠杆菌或酵母中表达，需要将目的基因置于开放性阅读框架内，即第一个氨基酸必须为ATG编码的甲硫氨酸。但是，在天然活性肽的N端增加一个甲硫氨酸，会导致免疫原性的产生，需要延长临床试验的时间以观察其安全性，大幅度增加新药报批的难度和成本。如果目标生物活性肽与DsbA融合表达，可以设计肠激酶酶切位点，由于肠激酶酶切的位置为Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X的C末端，X为脯氨酸以外其他氨基酸，所以酶切后可以得到与天然氨基酸完全相同的N末端。

第四，由于多肽药物在消化道中被蛋白酶降解而且难以吸收，一般以注射方式给药，因而对纯度有较高的要求。纯化工艺的建立是多肽药物制备的难点。由于宿主细胞含有大量的自身蛋白，需要采用分离纯化的手段将目标产物纯化，如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、亲和层析等，也就是所谓的下游技术。分离纯化的步骤越多，收率越低，成本越高。利用融合表达策略可以使用亲和层析简易纯化融合蛋白，如利用6His与Ni²⁺ 螯合亲和层析纯化，在大规模生产中，可以采用扩张床技术直接将细胞破碎液中的目标蛋白吸附、纯化，从而省略复杂的纯化工艺探索。

大肠杆菌周质空间是介于大肠杆菌细胞膜和细胞壁之间的空间，分泌于该空间的蛋白质在基因表达时需要信号肽的参与。与细胞质相比，该环境具有氧化性，蛋白质分子可利用氧化性环境通过半胱氨酸残基形成二硫键，以维持正确的空间结构，从而得到有生物学活性的蛋白质。将目的基因表达于周质空间，具有抽提方便，宿主蛋白酶和杂蛋白少的特点，可以利用渗透压休克法，无需破碎细胞即可抽提周质蛋白。宿主周质空间蛋白种类只有总蛋白的4％，有利于目标蛋白的下游纯化，蛋白酶少可减少对目标蛋白的破坏。另外，周质空间允许分子量小于600道尔顿的小分子通过，通透性好于细胞质，这一特点十分有利于酶的工业化应用-----有利于底物和产物传质扩散。基于以上原因，有大量的将目的基因表达于周质空间的报道。

由于分泌于周质的蛋白质在基因表达时需要信号肽的参与，要使目标蛋白分泌于周质空间，必须在目的基因的上游重组信号肽基因，在基因表达时，借助信号肽酶的作用，信号肽被切割，目标蛋白不含信号肽。由于分泌效率还和目标蛋白或多肽的N端氨基酸有关，不是所有的目标蛋白或多肽均可重组一种信号肽基因即可高效表达。

将目标蛋白重组于周质蛋白二硫键形成蛋白DsbA基因的下游，使DsbA融合蛋白分泌于周质空间是一种非常有效的方法，因为DsbA本身就是一种周质蛋白，易于分泌表达，在DsbA基因下游、目标蛋白基因上游之间插入连接肽(GSGSG)_N(N＝1～3)可以使目标蛋白与DsbA在空间上相互独立，有利于目标蛋白的折叠，融合蛋白之间插入纯化标签6His，可以使融合蛋白用Ni²⁺螯合亲和纯化的方法快速分离纯化，如重组肠激酶可以利用该技术路线制备得到。

但是要构建一个分泌融合表达载体，涉及基因拼接和基因重组，虽然现代分子生物学技术为这种重组提供了可行的多样的方法，但是过程较为复杂，耗时、耗材，需要使用限制性内切酶、DNA纯化等工序。

T-载体是近年发展起来的一种用于直接克隆PCR产物的新型载体。T-载体一般为线性，其分子末端各有一个3′dT(脱氧胸苷)突出。利用 Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性，在扩增DNA的3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸，通常为脱氧腺苷酸(dA)。这个3′dA突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′dT突出的T-载体上。这样就将PCR产物以粘性末端连接的方式直接克隆到载体上。这种方式不仅克服了常规克隆方法的缺点，而且操作简便、方法快捷、连接效率高，因而其应用范围非常广泛。PCR技术是分子生物学和基因工程研究中的一项基本技术，它被广泛用于体外扩增已知或未知的特异DNA片段。

利用限制性内切酶制备T-载体是T-载体制备方法中最为先进的方式，其中XcmI最适合于制备T-载体，该酶的特异性识别序列为5′CCANNNNN^*NNNNTGG 3′，N可以是A、T、G、C的任意一种。酶法制备T载体首先要得到一个环状的前T质粒载体，经XcmI酶切两个位点后，载体的大片段DNA线性化，而且两个3’末端均带dT，从而得到可用于PCR产物快速克隆的T载体，如市场上供应pUCm-T。

目前市场上供应的主要是克隆型T载体，主要满足基因保存和测序的需要，如果构建一种表达型T载体，将PCR产物直接连接于表达型T载体上，使目的基因位于表达框架内，直接得到表达载体，即可一省略复杂的DNA重组步骤。不仅克隆目的DNA，而且还可以直接表达目的基因。

另外，用酶法制备T载体有可能存在以下几个方面的问题，一，如果酶切质粒DNA质量不高，外源基因不能插入载体中，而载体转化感受态细胞后能够在抗性平板上生长。pUCm-T载体设计了蓝白斑筛选方案以筛选目的DNA片段是否插入载体，如果插入载体，编码半乳糖苷酶α肽的基因LacZ被插入失活，细胞内没有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的筛选平板中白色菌落为插入失活阳性克隆，而兰色菌落为不含外源基因的阴性克隆。这种方法需要使用价格昂贵的X-gal，制备蓝白斑筛选平板也比较麻烦。在特定融合表达载体中不适合应用，需要采用别的筛选方案。二，如果两个XcmI酶切位点空间位置较近，将影响载体的酶切效率，即使载体DNA的纯度很高，酶的质量也很好，也会出现酶切载体一“刀”的情况，这种线性的载体不能和PCR产物连接，而是载体自连，从而导致阴性克隆的产生。

(三)发明内容

本发明则是为了提供一种周质分泌融合表达型前T载体及其制备方法，可利用这种载体简单地、快速地构建分泌于周质的DsbA融合蛋白基因工程菌。除使用XcmI外，无需限制性内切酶即可构建分泌融合表达型基因工程菌。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种周质分泌融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII的DNA片段--DNA1；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39’中，得到所述周质分泌融合表达型前T载体。

所述周质分泌融合表达型前T载体质粒图谱如图1所示。

本发明还涉及所述的周质分泌融合表达型前T载体的制备方法，所述方法如下：

(1)构建编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个 XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39’中，得到所述周质分泌融合表达型前T载体。

所构建的BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII目的结构如下：

所构建的BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII目的基因序列即DNA1，其序列可以有变化，前部分它只要编码这些氨基酸(GSGSG-HHHHHH)就可以，不过编码第五个组氨酸的密码子必须设计为CAC，使该密码子的第三个碱基与第六个组氨酸的密码子的前两个碱基组成XcmI识别序列(CCANNNNN^*NNNNTGG的前半部分关键识别序列CCA，其下游第五个碱基N^*设计为T)；因此，所述DNA1在满足编码所述氨基酸序列的前提下，还应满足如下条件：含有片段 CCANNNNTNNNNTGG，N选自A、T、C、G中的一种，根据其编码的氨基酸进行设计。其中，下划线标记的为关键序列，中间的T是制备T载体所必须的碱基，可作为丝氨酸密码子第一个碱基，在本发明中第六个组氨酸密码子下游设计为氨基酸密码子，不可以设计为TAA、TAG或TGA等终止密码子，否则不能表达为融合蛋白。优选设计甘氨酸密码子。

优选的，所述DNA1序列如下：

5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCAT CA

ATAGGTTAATGTC-3’。

翻译情况如下：

5’-T

C GAG AAA AAA GGT TCT GGT

Tyr Leu Ser Glu Lys Lys Gly Ser Gly

TCT GGT CAT CAT CAT CATCA

Ser Gly His His His His His His Gly

A TAG GTT AAT GTC-3’

Ser

所述DNA1中还可含有卡那霉素除外的普通大肠杆菌敏感的抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因或氯霉素抗性基因等。前T载体有双抗性，如果外源DNA成功地插入于两个XcmI位点之间，前T载体中位于两个XcmI位点之间的抗生素抗性消失，只留下卡那霉素抗性，有利于用影印法快速筛选阳性克隆。

所述DNA1构建方法如下：

(1)引物A、B互为模板进行PCR1反应：

A：5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3’；

B：

5’-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3’；

PCR反应条件：94℃变性10min，48℃退火300s，72℃延伸10min；

(2)以pET11b为模板，利用引物Amp1、Amp2进行PCR2反应：

Amp1：

5′-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3′；

Amp2：

5′-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3′；

Amp2引物的5’末端含有HindIII和XcmI识别序列(CCANNNNN^*NNNNTGG，其中N^*设计为T，N选自A、T、C、G中的一种)。

(3)将PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2进行基因拼接，得到所述编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII的DNA片段——DNA1；拼接反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。

所述的定点突变三个XcmI位点，采用常规SOE技术，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变LacI基因的DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’

所述的周质分泌融合表达型前T载体主要用于制备周质分泌融合表达型T载体。

具体的，所述应用如下：将周质分泌融合表达型前T载体用限制性内切酶XcmI在37℃下酶切2h，再进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到两条明显的亮带，切取大片段，用3S DNA Gel Purification Kit纯化回收，得到周质分泌融合表达型T载体。

DsbA本身就是一种分子伴侣，是大肠杆菌周质空间内的巯基/二硫键氧化酶，主要催化底物蛋白质二硫键的形成，在适当条件下，比如低温、低诱导剂浓度等，目标蛋白在周质空间正确折叠，得到有相应生物活性的目标产物。相比于分泌至培养基的情况，周质表达的产物仍然存在于细胞中，离心收集菌体，通过简单的渗透休克，在无须破菌的情况下即可抽提出目标蛋白，十分方便。另外周质空间蛋白酶种类少，目标蛋白受到蛋白酶破坏的可能性较小。DsbA具有较强的分泌表达能力，本发明可用于酶蛋白的周质融合表达，文献报道，周质空间允许分子量小于600D的小分子自由进出，通透性好于细胞膜。分泌于周质空间的酶蛋白分子因形成二硫键维持空间结构，稳定性好，底物和产物的通透性好，十分有利于工程菌细胞催化生产手性药物中间体。融合蛋白中携带了6His亲和纯化标签，为快速纯化目标蛋白创造了条件，可省略复杂的纯化工艺探索。融合蛋白经蛋白酶酶切后得到的产物，其第一氨基酸可与天然的一致，十分有利于多肽药物的开发。比如6His-Gly-Ser序列C末端可以设计肠激酶的识别序列，融合蛋白经蛋白酶酶切后可以得到与天然氨基酸完全相同的N末端。

本发明的有益效果主要体现在：除了使用XcmI制备T载体外，不需要用其它限制性内切酶，一步法构建融合表达基因工程菌，为大量制备活性肽工程菌库提供了可行的技术方法。

(四)附图说明

图1为本发明周质分泌融合表达型前T载体质粒图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此(实施例中所有试剂、质粒、酶、引物等，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)：

实施例1：LacI基因定点突变消除XcmI位点

采用SOE法，以pET39为PCR模板，六条引物分别设计为：

Lac-1：5’-ttaggatccgcgacccatttgct-3’(含BamHI位点)

Lac-2：5’-agagatatccgcaccaacgcgca-3’(含EcoRV位点)

Lac-3：5’-ctgattggcgttgctacctccagtctggccctgca-3’(用于突变位点1)

Lac-4：5’-gccagactggaggtagcaacgccaatcagcaacga-3’(用于突变位点1)

Lac-5：5’-tcccactgcgatgttagttgctaacgatcagatggcgct-3’(用于突变位点2、3)

Lac-6：5’-catctgatcgttagcaactaacatcgcagtgggaacgatgc 3’(用于突变位点2、3)

表2：位点突变前后序列对比

以Lac-1和Lac-2为引物，pET-39质粒为模板，PCR扩增LacI序列。反应参数如下：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min，产物标记为“Lac1/2”。

(1)定点突变979bp处的XcmI位点：

以Lac-1和Lac-4为引物、Lac1/2为模板进行PCR反应，参数为：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。其产物标记为 “Lac1/4”。

以Lac-2和Lac-3为引物、Lac1/2为模板进行的PCR反应，其参数为：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，48℃退火0.5min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。产物标记为“Lac2/3”，置-20℃保存。

(2)Lac-1和Lac-2为引物对Lac1/4和Lac2/3进行SOE拼接：

SOE参数：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。产物标记为“Lac979”。

(3)定点突变1495bp和1513bp两处的XcmI位点：

以Lac-1和Lac-6为引物、Lac979为模板进行PCR反应，其参数为：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。产物标记为“Lac1/6”。

以Lac-2和Lac-5为引物、Lac979为模板进行PCR反应，其参数为：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，47℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，4个循环；再94℃变性0.5min，50℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，26个循环；72℃延伸10min。产物标记为“Lac2/6”。

(4)以Lac-1和Lac-2为引物对Lac1/6和Lac2/5进行SOE拼接：

SOE参数：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。产物标记为“LacI′”。

拼接产物LacI′利用BamH I和EcoRV定向重组于pET39中(具体方法为：以BamH I和EcoRV分别双酶切LacI′PCR产物和pET39，切胶回收pET39质粒的大片段DNA，与LacI′PCR产物的酶切回收产物连接，转化大肠杆菌克隆宿主DH5α)，得到LacI基因的三个XcmI位点定点突变的pET39’质粒。

实施例2：XcmI酶切盒的制备及前T载体的构建

引物A、B互为模板进行PCR1反应：

A：5′-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3′

B：5′-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3′

反应参数如下：94℃变性10min，48℃退火300s，72℃延伸10min。

以pET11b为模板，利用下列两条引物进行PCR2反应：

Amp1：5′-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3′

Amp2：5′-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3′

反应参数如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。

上述两PCR1和PCR2产物片段用引物A和Amp2进行基因拼接反应，反应参数如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。

得到编码BspTI-GSGSG-HHHHHH-XcmI-Amp^r-XcmI-HindIII的DNA片段，利用BspTI和HindIII定向重组于实施例1已定点突变消除XcmI位点的pET39’中，得到周质分泌融合表达型前T载体。

实施例3：目的基因与分泌融合表达型T载体的重组

TnaA1：

5’-CTGATGACGATGACAAAATGGAAAACTTTAAACATCTC-3’38bp

TnaA2：5’-AAGCTTTTAAACTTCTTTAA-3’21bp

以E.coli K-12为模板，TnaA1和TnaA2为引物，用Taq plusDNA聚合酶PCR扩增色氨酸酶基因，反应参数如下：94℃预变性3min，94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。

将实施例2的表达型前T载体用XcmI限制性内切酶在37℃下酶切2h，再进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果可见两条明显的亮带，切取大片段，用3S DNA Gel Purification Kit或其他DNA纯化试剂盒纯化回收，即得到线性化表达型T载体。

将PCR产物直接与线性化T载体用T4 DNA ligase在4℃冰箱中连接16h，连接产物用CaCl₂法转化E.coli DH5α。

实施例4：正向连接重组子的筛选以及分泌融合表达基因工程菌的构建

表达型重组转化子的筛选：

引物check：5′-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGT-3′

首先，将连接产物的转化液在含100μg/mL卡那霉素的LB固体平板均匀铺开，35℃恒温箱培养16～20h。正向筛选能正常生长的菌落。

然后将在卡那霉素抗性LB固体平板上正常生长的菌落影印到含100μg/mL氨苄霉素LB固体平板上。30℃恒温箱培养16～20h。在卡那霉素抗性平板上挑选相应的不能在氨苄霉素抗性平板上生长的克隆。这一步可以将未酶切和只有一个位点酶切的重组质粒筛掉，称为反向筛选。

最后，将筛选到的克隆，用单菌落PCR法，以鉴定引物check和目的基因的下游引物和用PCR进行鉴定，这一步可以消除平板上残余的未转入宿主细胞的重组质粒的影响并能确定目的基因的插入方向，称为正向筛选。其体系和参数分别为：

10×Buffer(with Mg²⁺) 5μL

10mmol/L each dNTPs 2μL

10mmol TnaA 1 2μL

10mmol/L check 2μL

相应阳性单克隆无菌牙签蘸取

Taq DNA聚合酶 0.5μL

无菌双蒸水补足至50μL

94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃变性0.5min，42℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min。取部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并摄片，有分子量约1500bp条带出现的为阳性克隆。经check引物鉴定为阳性的克隆送英俊生物技术有限公司测序证实，正向测序引物为T7 promoter primer#69348-3，反向测序引物为T7 terminator primer#69337-3。

序列表_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>一种周质分泌融合表达型前T载体及其制备与应用

<130>

<140>200710071214.8

<141>2007-09-06

<160>14

<170>PatentIn version 3.4

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<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

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ttaggatccg cgacccattt gct 23

<210>2

<211>23

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<220>

<223>人工序列

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agagatatcc gcaccaacgc gca 23

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<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

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ctgattggcg ttgctacctc cagtctggcc ctgca 35

<210>4

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<212>DNA

<213>Unknown

<220>

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<400>4

gccagactgg aggtagcaac gccaatcagc aacga 35

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<211>39

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

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tcccactgcg atgttagttg ctaacgatca gatggcgct 39

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<211>41

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

catctgatcg ttagcaacta acatcgcagt gggaacgatg c 41

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<212>DNA

<213>Unknown

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<223>人工序列

<400>7

atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcat 37

<210>8

<211>57

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>8

gacattaacc tatccattag atccatggtg atgatgatga tgaccagaac cagaacc 57

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>9

caccatggat ctaatggata ggttaatgtc atgataata 39

<210>10

<211>45

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>10

cttaagcttc caagggtata atggaaatga agttttaaat caatc 45

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>11

ctgatgacga tgacaaaatg gaaaacttta aacatctc 38

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>12

aagcttttaa acttctttaa 20

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>13

atacttaagc gagaaaaaag gtt 23

<210>14

<211>76

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>14

atacttaagc gagaaaaaag gttctggttc tggtcatcat catcatcacc atggatctaa 60

tggataggtt aatgtc 76

Claims

1.一种周质分泌融合表达型前T载体，由如下方法制备得到：(1)构建DNA1：

5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCATCATCATCAT

CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC-3’；(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’；

(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39’中，得到所述周质分泌融合表达型前T载体。

2.如权利要求1所述的周质分泌融合表达型前T载体，其特征在于所述周质分泌融合表达型前T载体质粒图谱如图1所示。

3.制备如权利要求1或2所述的周质分泌融合表达型前T载体的方法，所述方法如下：(1)构建DNA1：5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGT TCTGGTCATCATCATCAT CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTC-3’；

(2)定点突变pET39质粒中LacI基因内部的三个XcmI位点，在编码氨基酸序列不变的情况下，改变DNA序列，使XcmI识别位点丧失，得到定点突变消除XcmI位点的pET39’；(3)利用BspTI和HindIII将DNA1定向重组于pET39’中，得到所述周质分泌融合表达型前T载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述DNA1构建方法如下：

(1)引物A、B互为模板进行PCR1反应：

A：5’-ATACTTAAGCGAGAAAAAAGGTTCTGGTTCTGGTCAT-3’；

B：5’-GACATTAACCTATCCATTAGATCCATGGTGATGATGATGATGACCAGAACCAGAACC-3’；

PCR反应条件：94℃变性10min，48℃退火300s，72℃延伸10min；

(2)以pET11b为模板，利用引物Amp1、Amp2进行PCR2反应：

Amp1：5′-CACCATGGATCTAATGGATAGGTTAATGTCATGATAATA-3′；

Amp2：

5′-CTTAAGCTTCCAAGGGTATAATGGAAATGAAGTTTTAAATCAATC-3′；

(3)将PCR1和PCR2所得片段用引物A和引物Amp2进行基因拼接，得到所述DNA1；拼接反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环，72℃延伸10min。

5.如权利要求1或2所述的周质分泌融合表达型前T载体在制备周质分泌融合表达型T载体中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用如下：将周质分泌融合表达型前T载体用限制性内切酶XcmI在37℃下酶切2h，再进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到两条明显的亮带，切取大片段，用DNA纯化试剂盒回收DNA，得到周质分泌融合表达型T载体。