KR101934615B1 - 위케라모미세스 시페리이로부터의 아세틸트랜스퍼라제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아세틸화 스핑고이드 염기를 제공하는 신규 효소에 관한 것이다.
Description
아세틸화 스핑고이드 염기를 제공하는 신규 효소가 본 발명의 대상이다.
피키아 시페리이(Pichia ciferrii)는 스핑고이드 염기 및 스핑고지질의 생산을 위해 1960년대의 시작 이래로 이미 사용되어 왔다.
야생형 균주로부터의 스핑고이드 염기 및 스핑고지질의 수율은 항상 개선의 여지가 있다.
스핑고이드 염기, 특히 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌은 피부 보호 및 관리를 위한 화장품 활성 물질로서 다양한 방식으로 사용된다. 이것은 직접적으로 또는 피부-동일 세라미드로의 화학적 전환 후에 화장품 관리 제품에 혼입된다.
비-통상적 효모 피키아 시페리이는 배양 배지 내로 비교적 대량의 아세틸화 스핑고이드 염기, 주로 테트라아세틸피토스핑고신 (TAPS) 및 트리아세틸스핑가닌 (TriASa)을 분비하는 것을 특징으로 한다. 형성된 TAPS는 추출에 의해 배양 브로쓰로부터 추출될 수 있고, 후속적으로 유리 피토스핑고신 및 다양한 세라미드로 화학적으로 전환된다.
효율적인 아세틸화는 배양 배지 내로의 스핑고이드 염기의 수송에 대한 기본 요건인데, 마이크로솜 분획을 이용한 효소 시험은 아세틸화 스핑고이드 염기의 높은 생산성을 갖는 균주 (고생산자)가 저생산자와 비교하여 현저하게 증가된 특이적 아세틸트랜스퍼라제 활성을 나타냄을 보여주었다 (문헌 [Barenholz et al., 1971; Barenhoz et al., 1973]). 따라서, 상기 효소적 활성은 다양한 피키아 시페리이 균주에 의한 아세틸화 스핑고이드 염기의 효율적인 생산에 대한 주요 이유 중 하나로서 확인될 수 있다.
이러한 효소의 정제, 특성화 및 확인에서의 모든 시도는 지금까지는 실패하였으므로, 어떠한 단백질 또는 상응하는 유전자도 공지되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 스핑고이드 염기를 아세틸화시킬 수 있는 효소 및 그의 코딩 서열을 제공하는 것이었다.
발명의 설명
놀랍게도, 하기에 기재된 효소가 본 발명에서 제기된 문제를 해결할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 특허청구범위에 기재된 바와 같은 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 단리된 핵산이 본 발명의 대상이다.
본 발명에 따른 효소의 변형된 활성을 나타내는 재조합 세포는 본 발명의 추가의 대상이다.
본 발명에 기재된 아세틸트랜스퍼라제 및 그것을 코딩하는 DNA 서열은 다수의 이점을 제공한다. 이것은 다양한 관능기 (히드록시 및 아미노 기) 상에서 규정된 기질 (스핑고이드 염기)을 생명공학적으로 및 고도로 특이적으로 아세틸화시키는데 사용될 수 있다. 화학적 아세틸화 공정과 비교하여, 이로써 더 적은 부산물이 생성되고, 그의 결과로서 수율에서의 손실 및 힘든 정제 단계를 최소화할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 높은 산물 순도가 요구되는 적용에 대해 큰 잠재력을 갖는다. 특히 높은 산물 순도는, 특히 화장품, 식품 및 사치 소모품 및 제약 부문에서 필요하기 때문에, 여기서 본 발명은 특히 큰 잠재력을 갖는다. 아세틸화 스핑고이드 염기의 생명공학적 생산은 본 발명에 의해 본질적으로 2가지 상이한 방식으로 수행될 수 있는데, 첫째로, 생산은 생체촉매작용 접근법을 통해 수행될 수 있으며, 여기서 선택된 스핑고이드 염기는 아세틸트랜스퍼라제(들)의 첨가에 의해 적합한 반응기에서 효소적으로 아세틸화된다. 둘째로, 아세틸트랜스퍼라제의 유전자를 사용하여 유전 공학 방법 (대사 공학)에 의해 재조합 미생물 균주를 생성할 수 있으며, 이것은 발효 공정에서 단순한 C 및 N 공급원으로부터 아세틸화 스핑고이드 염기를 직접적으로 합성할 수 있다. 화학적 공정과 비교하여, 발효 공정은 덜 비싸고 생태학적으로 더 지속가능하다. 또한, 이것은 입체특이적인데, 이는 화학적 전체 합성에서는 보장되지 않는다.
본 발명에 기재된 아세틸트랜스퍼라제 또는 그의 유전자 중 하나만 사용함으로써, 불완전 아세틸화 스핑고이드 염기를 특이적으로 생성할 수 있다. 이것은 특정한 생물학적 효과를 가질 수 있고, 따라서 특정한 적용에 대해, 예를 들어 화장품 또는 제약 활성 물질 또는 그의 전구체로서 사용될 수 있다. 불완전 아세틸화 스핑고이드 염기는 극도로 힘들게 화학적으로만 제조될 수 있기 때문에, 생명공학적 접근법에 대한 상당한 비용상의 이점이 발생한다.
달리 언급되지 않는 한, 언급된 모든 백분율 (%)은 질량 퍼센트이다.
문제의 해결책에 대한 기여는, 하기 군 [A1 내지 G1]
A1) 아세틸 조효소 A의 3개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 서열 1에 따른 서열,
B1) A1)에 따른 서열로부터 유래되고, 서열 1에 따른 서열과 동일한 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 인트론-무함유 서열,
C1) 서열 2에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 아세틸 조효소 A의 3개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열,
D1) 아세틸 조효소 A의 3개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는, 군 A1) 내지 C1) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A1)에 따른 서열과 적어도 70%, 특히 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일한 서열,
E1) 아세틸 조효소 A의 3개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는, 군 A1) 내지 D1) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A1)에 따른 서열의 상보적 가닥과 유전자 코드의 축중성을 고려하여 혼성화되거나 또는 혼성화될 서열,
F1) 아세틸 조효소 A의 3개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는, 적어도 1개의 염기, 바람직하게는 적어도 2개의 염기, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 염기, 가장 바람직하게는 적어도 10개의 염기, 그러나 바람직하게는 100개 이하의 염기, 특히 바람직하게는 50개 이하의 염기, 가장 바람직하게는 25개 이하의 염기의 치환, 부가, 역위 및/또는 결실에 의해 획득된 군 A1) 내지 E1) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A1)에 따른 서열의 유도체,
G1) 군 A1) 내지 F1) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A1)에 따른 서열에 대한 상보적 서열
로부터 선택된 서열을 갖는 단리된 핵산에 의해 제공된다.
문제의 해결책에 대한 추가의 기여는, 하기 군 [A2 내지 G2]
A2) 아세틸 조효소 A의 1개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 서열 3에 따른 서열,
B2) A2)에 따른 서열로부터 유래되고, 서열 3에 따른 서열과 동일한 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 인트론-무함유 서열,
C2) 서열 4에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 아세틸 조효소 A의 1개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열,
D2) 아세틸 조효소 A의 1개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는, 군 A2) 내지 C2) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A2)에 따른 서열과 적어도 70%, 특히 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일한 서열,
E2) 아세틸 조효소 A의 1개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는, 군 A2) 내지 D2) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A2)에 따른 서열의 상보적 가닥과 유전자 코드의 축중성을 고려하여 혼성화되거나 또는 혼성화될 서열,
F2) 아세틸 조효소 A의 1개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는, 적어도 1개의 염기, 바람직하게는 적어도 2개의 염기, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 염기, 가장 바람직하게는 적어도 10개의 염기, 그러나 바람직하게는 100개 이하의 염기, 특히 바람직하게는 50개 이하의 염기, 가장 바람직하게는 25개 이하의 염기의 치환, 부가, 역위 및/또는 결실에 의해 획득된 군 A2) 내지 E2) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A2)에 따른 서열의 유도체,
G2) 군 A2) 내지 F2) 중 하나에 따른, 특히 바람직하게는 군 A2)에 따른 서열에 대한 상보적 서열
로부터 선택된 서열을 갖는 단리된 핵산에 의해 제공된다.
"뉴클레오티드 동일성" 또는 "아미노산 동일성"은 공지된 방법에 의해 여기서 결정된다. 특정한 요건을 고려하는 알고리즘을 이용하는 특수한 컴퓨터 프로그램이 일반적으로 사용된다.
동일성의 결정에 바람직한 방법은 먼저 비교할 서열 사이의 최대 매치를 생성한다. 동일성의 결정을 위한 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지, 예컨대 GAP (문헌 [Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi)]), 및 BLASTP, BLASTN 및 FASTA (문헌 [Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410])를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. BLAST 프로그램은 미국 국립 생물 정보 센터 (NCBI) 및 다른 공급원 (문헌 [BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894]; 상기 문헌 [Altschul S. et al.])으로부터 획득할 수 있다.
익히 공지된 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘 또한 뉴클레오티드 동일성의 결정에 사용될 수 있다.
BLASTN 프로그램 (문헌 [Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410])의 사용 시, "뉴클레오티드 동일성"의 결정에 바람직한 파라미터는 하기와 같다:
예상 역치: 10
워드 크기: 28
매치 스코어: 1
미스매치 스코어: -2
갭 코스트: 선형
상기 파라미터는 뉴클레오티드 서열 비교에서의 디폴트 파라미터이다.
GAP 프로그램 또한 상기 파라미터를 사용하는데 적합하다.
BLASTP 프로그램 (문헌 [Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410])의 사용 시, "아미노산 동일성"의 결정에 바람직한 파라미터는 하기와 같다:
예상 역치: 10
워드 크기: 3
매트릭스: BLOSUM62
갭 코스트: 존재: 11; 연장: 1
구성 조정: 조건적 구성 스코어 매트릭스 조정
상기 파라미터는 아미노산 서열 비교에서의 디폴트 파라미터이다.
GAP 프로그램 또한 상기 파라미터를 사용하는데 적합하다.
본 발명과 관련하여, 상기 알고리즘에 따른 60%의 동일성은 60% 동일성을 의미한다. 보다 높은 동일성에 대해서도 동일하게 적용된다.
특징적인 "서열의 상보적 가닥과 유전자 코드의 축중성을 고려하여 혼성화되거나 또는 혼성화될 서열"은 바람직하게는 엄격한 조건 하에 참조 서열의 상보적 가닥과 유전자 코드의 축중성을 고려하여 혼성화되거나 또는 혼성화될 서열을 나타낸다. 예를 들어, 혼성화는 2 x SSC 중 68℃에서 또는 베링거(Boehringer) (만하임)로부터의 디곡시게닌-표지 키트의 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 바람직한 혼성화 조건은, 예를 들어 7% SDS, 1% BSA, 1 mM EDTA 및 250 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.2) 중에서 밤새 65℃에서 인큐베이션한 후, 65℃에서 2 x SSC; 0.1% SDS로 세척하는 것이다. 대체물 F1) 또는 F2)에 따른 본 발명에 따른 단리된 DNA의 유도체는 군 A1) 내지 E1) 및 A2) 내지 E2) 중 하나에 따른 서열의 1개 이상의 염기의 치환, 부가, 역위 및/또는 결실에 의해 획득될 수 있고, 특히 그 서열이 코딩하는 단백질에서 보존적 아미노산 치환, 예컨대 예를 들어 알라닌에 의한 글리신의 치환 또는 글루탐산에 의한 아스파르트산의 치환을 유발하는 서열을 포함한다. 이러한 기능-중립 돌연변이는 센스 돌연변이로서 기재되고, 폴리펩티드의 활성에서의 근본적인 변화를 유발하지 않는다. 또한, 폴리펩티드의 N 및/또는 C 말단에서의 변화는 그의 기능에 유의하게 영향을 미치지 않거나 또는 이를 심지어 안정화시킬 수 있으므로, 상응하게 염기가 본 발명에 따른 핵산에 대해 서열의 3' 말단 또는 5' 말단에서 부착되어 있는 DNA 서열도 본 발명에 의해 또한 포함되는 것으로 이해한다. 당업자는 이에 대한 정보를 특히 문헌 [Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988))] 및 익히 공지된 유전학 및 분자 생물학 교과서에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 벡터, 특히 발현 벡터 또는 유전자 과다발현 카세트이다. 가능한 벡터는 숙주 세포 내로 DNA를 도입시키기 위해 일반적으로 사용되는 당업자에게 공지된 모든 벡터이다. 이들 벡터는, 그것이 복제 기점, 예컨대 예를 들어 2μ 플라스미드 또는 ARS (자율 복제 서열)의 것을 보유하므로 자율적으로 복제될 수 있거나 또는 염색체 (비-복제 플라스미드) 내로 통합될 수 있다. 벡터는 또한 복제 기점, 예컨대 예를 들어 유전자 삽입 또는 유전자 과다발현 카세트를 그 어느 것도 보유하지 않는 선형 DNA 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 유전자 과다발현 카세트는 일반적으로 마커, 과다발현되는 유전자 및 유전자 발현에 관련된 조절 영역, 예컨대 예를 들어 프로모터 및 종결인자로 이루어진다. 임의로, 유전자 과다발현 카세트는 또한 상동 재조합 메카니즘을 통해 숙주 게놈 내로의 표적화 통합을 가능하게 하는 특정한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 유전자 과다발현 카세트의 구조에 따라, 이들은 바람직하게는 단일 또는 다중 형태로 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 바람직한 벡터는 플라스미드 및 카세트, 예컨대 예를 들어 이. 콜라이-효모 셔틀 플라스미드 및 발현 벡터를 포함하는 군으로부터 선택되며, 유전자 삽입 또는 유전자 과다발현 카세트가 특히 바람직하다.
처음에 언급된 문제의 해결책에 대한 기여는, 아세틸화 스핑고이드 염기, 특히 아세틸화 피오스핑고신의 생산에 유리하게 사용될 수 있는 하기 기재된 세포에 의해 제공된다. 본 발명에 따른 세포는, 예를 들어 외인성으로 제조된 스핑고이드 염기와 생체변환 중에 접촉될 수 있고, 이어서 세포가 그의 효소 장비에 의해 아세틸화되거나, 그렇지 않으면 아세틸화되는 스핑고이드 염기를 이미 생산하는 세포 자체가 본 발명에 따른 세포의 생산을 위한 출발 균주로서 사용된다.
따라서, 본 발명의 대상은 그의 야생형과 비교하여 효소 E1 및/또는 E2 중 적어도 하나의 변형된 활성을 갖도록 유전자 변형된 것을 특징으로 하며, 여기서 효소 E1은
서열 2의 폴리펩티드 서열을 갖거나 또는 결실, 삽입, 치환 또는 그의 조합에 의해 서열 2의 참조 서열과 비교하여 아미노산 잔기의 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하, 특히 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하가 변형된 폴리펩티드 서열을 갖고, 서열 2의 참조 서열을 갖는 효소의 효소적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 50%, 특히 바람직하게는 80%, 특히 90% 초과를 여전히 보유하는 효소 E1
로부터 선택되고, 여기서 효소 E1에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A의 3개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되고,
효소 E2는
서열 4의 폴리펩티드 서열을 갖거나 또는 결실, 삽입, 치환 또는 그의 조합에 의해 서열 4의 참조 서열과 비교하여 아미노산 잔기의 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하, 특히 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하가 변형된 폴리펩티드 서열을 갖고, 서열 4의 참조 서열을 갖는 효소의 효소적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 50%, 특히 바람직하게는 80%, 특히 90% 초과를 여전히 보유하는 효소 E2
로부터 선택되고, 여기서 효소 E2에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A의 1개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되는 것인 세포, 바람직하게는 단리된 세포이다.
본원에서의 "야생형"은 그의 게놈이 진화를 통해 자연적으로 발생한 상태로 존재하는 세포를 나타낸다. 상기 용어는 전세포 및 또한 개별 유전자 둘 다에 대해 사용된다. 따라서, 용어 "야생형"은 특히 그의 유전자 서열이 재조합 방법으로써 인간에 의해 적어도 부분적으로 변형된 세포 또는 유전자를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 변형된 활성은 증가된 활성이다. 용어 "효소의 증가된 활성"은 바람직하게는 증가된 세포내 활성으로서 이해되어야 한다.
용어 "그의 야생형과 비교하여 변형된 (증가된 또는 감소된) 활성"에 관해서는, 예를 들어 성장기, 배양 연령 및 배양기와 관련하여 동일하거나 또는 비슷한 상태인 세포 또는 세포 집단을 비교하는 것이 당업자에게 명백하다.
이제 하기의 세포에서의 효소 활성의 증가에 대한 설명은 효소 E1 내지 E2의 활성의 증가 및 또한 그의 활성을 필요한 경우에 증가시킬 수 있는 하기 언급된 모든 효소 둘 다에 대해 적용된다.
본질적으로, 효소적 활성에서의 증가는 강한 프로모터 또는 개선된 리보솜 결합 부위를 사용한 유전자 서열 또는 효소를 코딩하는 유전자 서열의 카피수 증가, 예를 들어 전사 조절제를 사용한 유전자 발현의 음성 조절 약화, 또는 예를 들어 전사 조절제를 사용한 유전자 발현의 양성 조절 강화, 유전자의 코돈 이용 변형, 다양한 방식으로의 mRNA 또는 효소의 반감기 증가, 유전자 발현의 조절 변형, 또는 증가된 활성을 갖는 상응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자의 사용 및 임의로 이들 수단의 조합에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 따라 유전자 변형된 세포는, 예를 들어 목적한 유전자, 상기 유전자의 대립유전자 또는 그의 일부 및 임의로 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터를 함유하는 벡터를 이용한 형질전환, 형질도입, 접합 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성된다. 이종 발현은 특히 유전자 또는 대립유전자를 세포의 염색체 또는 염색체외 복제 벡터 내로 통합시킴으로써 달성된다.
피루베이트 카르복실라제의 경우에 세포에서의 효소 활성을 증가시킬 가능성의 개관은 DE-A-100 31 999에 주어져 있으며, 이는 본원에 참조로 도입되고, 세포에서의 효소 활성을 증가시킬 가능성에 관한 그의 개시 내용은 본 발명의 개시내용의 일부를 형성한다.
상기에 언급되고 하기에 언급된 모든 효소 및 유전자의 발현은 1 및 2차원 단백질 겔 분리 후 적절한 평가 소프트웨어를 이용한 단백질 농도의 광학적 확인에 의해 겔에서 검출가능하다. 효소 활성의 증가가 상응하는 유전자 발현의 증가에 전적으로 기반하는 경우에, 효소 활성에서의 증가의 정량화는 야생형과 유전자 변형 세포 사이의 1 또는 2차원 단백질 분리의 비교에 의해 간단하게 결정될 수 있다. 코리네형 박테리아의 경우에서의 단백질 겔의 제조 및 단백질의 확인을 위한 통상적인 방법은 문헌 [Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)]에 기재된 절차이다. 단백질 농도는 또한 검출할 단백질에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯 혼성화 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989]) 후의, 농도 결정을 위한 적절한 소프트웨어를 이용한 광학적 평가 (문헌 [Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647])에 의해 분석될 수 있다. DNA-결합 단백질의 활성은 DNA 밴드 이동 검정 (겔 지연으로도 기재됨)에 의해 측정될 수 있다 (문헌 [Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155]). 다른 유전자의 발현에 대한 DNA-결합 단백질의 효과는 리포터 유전자 검정의 잘 기재된 다양한 방법 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989])에 의해 검출될 수 있다. 세포내 효소적 활성은 기재된 다양한 방법 (문헌 [Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823])에 의해 결정될 수 있다. 특정 효소의 활성의 결정을 위한 특정한 방법이 하기 설명에서 언급되지 않는 경우에, 효소 활성의 증가의 결정 및 또한 효소 활성의 감소의 결정은 바람직하게는 문헌 [Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) 및 Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)]에 기재된 방법에 의해 수행된다.
효소 활성의 증가가 내인성 유전자의 돌연변이에 의해 수행되는 경우에, 이러한 돌연변이는 전형적인 방법, 예컨대 예를 들어 UV 조사 또는 돌연변이원성 화학물질에 의해 간접적으로, 또는 유전 공학 방법, 예컨대 결실(들), 삽입(들) 및/또는 뉴클레오티드 치환(들)에 의해 특이적으로 생성될 수 있다. 이들 돌연변이를 통해, 변형된 세포가 획득된다. 효소의 특히 바람직한 돌연변이체는 특히 또한 야생형 효소와 비교하여 피드백-, 산물- 또는 기질-억제가능한 것이 더 이상 아니거나 또는 적어도 덜한 효소이다.
효소 활성의 증가가 효소의 합성을 증가시킴으로써 수행되는 경우에는, 예를 들어 관련 유전자의 카피수를 증가시키거나 또는 구조 유전자의 상류에 위치한 프로모터 및 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위를 돌연변이시킨다. 구조 유전자의 상류에 혼입된 발현 카세트는 유사한 효과를 갖는다. 추가로, 유도성 프로모터에 의해, 발현을 임의의 목적한 시점에 증가시키는 것이 가능하다. 그러나, 추가로, 소위 "인핸서"가 또한 조절 서열로서 효소 유전자에 할당될 수 있고, 이것은 마찬가지로 RNA 폴리머라제와 DNA 사이의 개선된 상호작용을 통해 증가된 유전자 발현을 야기한다. 발현은 또한 mRNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 개선된다. 또한, 효소 활성은 또한 효소 단백질의 분해의 방지에 의해 강화된다. 여기서, 유전자 또는 유전자 구축물은 다양한 카피수의 플라스미드에 존재하거나 또는 염색체에 통합되고 필요한 경우에 증폭된다. 대안적으로, 또한, 관련 유전자의 과다발현은 배지 조성 및 배양의 변형에 의해 달성될 수 있다. 당업자는 이에 대한 지시를 특히 문헌 [Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))], EP-A-0 472 869, US 4,601,893, [Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))], WO-A-96/15246, [Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))], JP-A-10-229891, [Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))] 및 익히 공지된 유전학 및 분자 생물학 교과서에서 찾아볼 수 있다. 상기에 기재된 수단은 돌연변이와 같이 또한 유전자 변형 세포를 생성한다.
특정한 유전자의 발현을 증가시키기 위해, 예를 들어 에피솜 또는 통합 플라스미드가 사용된다. 원칙적으로, 플라스미드 또는 벡터로서, 상기 목적을 위해 당업자가 이용가능한 모든 실시양태가 가능하다. 이러한 플라스미드 및 벡터는, 예를 들어 노바젠(Novagen), 프로메가(Promega), 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 클론테크(Clontech) 또는 깁코 BRL(Gibco BRL)의 브로셔로부터 추론될 수 있다. 추가로 바람직한 플라스미드 및 벡터는 문헌 [Glover, D. M. (1985) DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds) (1988) Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; 및 Sambrook, J.; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에서 찾아볼 수 있다.
이어서, 증폭시킬 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환에 의해 목적하는 균주 내로 전달한다. 접합 방법은, 예를 들어 문헌 [Schaefer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994)]에 기재되어 있다. 형질전환 방법은, 예를 들어 문헌 [Schorsch et al., Current Genetics 55(4): 381-389 (2009), Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) 및 Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994)]에 기재되어 있다. 통합 플라스미드 또는 선형 유전자 과다발현 카세트의 경우에, 이들은 이소적으로 (상동이 아님) 또는 상동 재조합 메카니즘 ("교차")에 의해 특이적으로 숙주 균주의 게놈에 통합된다. 플라스미드 또는 유전자 과다발현 카세트의 정확한 구조 및 특정한 재조합 사건에 따라, 생성된 균주는 관련 유전자의 1개 또는 몇몇 카피를 함유한다.
상기 및 하기 설명에 사용된 어구 "그의 야생형과 비교한 효소 Ex의 증가된 활성"은 바람직하게는 항상 적어도 2배, 특히 바람직하게는 적어도 10배, 보다 바람직하게는 적어도 100배, 보다 더 바람직하게는 적어도 1000배, 가장 바람직하게는 적어도 10000배 증가된 특정한 효소 Ex의 활성을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 또한, 특히 "그의 야생형과 비교하여 효소 Ex의 증가된 활성"을 갖는 본 발명에 따른 세포는 또한 그의 야생형이 상기 효소 Ex의 활성을 갖지 않거나 또는 적어도 검출가능한 활성을 갖지 않고, 예를 들어 과다발현에 의해 효소 활성을 증가시킨 후에만 상기 효소 Ex의 검출가능한 활성을 나타내는 세포를 포함한다. 이와 관련하여, 하기 설명에 사용된 용어 "과다발현" 또는 어구 "발현의 증가"는 또한 출발 세포, 예를 들어 야생형 세포가 발현을 나타내지 않거나 또는 적어도 검출가능한 발현을 나타내지 않고 효소 Ex의 검출가능한 합성이 재조합 절차에 의해서만 유도되는 경우를 포함한다.
주어진 폴리펩티드의 특성 및 기능에서 유의한 변화를 유발하지 않는 주어진 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기의 변화는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 소위 보존된 아미노산은 서로 교환될 수 있으며; 이러한 적합한 아미노산 치환의 예는 Ser에 의한 Ala; Lys에 의한 Arg; Gln 또는 His에 의한 Asn; Glu에 의한 Asp; Ser에 의한 Cys; Asn에 의한 Gln; Asp에 의한 Glu; Pro에 의한 Gly; Asn 또는 Gln에 의한 His; Leu 또는 Val에 의한 Ile; Met 또는 Val에 의한 Leu; Arg 또는 Gln 또는 Glu에 의한 Lys; Leu 또는 Ile에 의한 Met; Met 또는 Leu 또는 Tyr에 의한 Phe; Thr에 의한 Ser; Ser에 의한 Thr; Tyr에 의한 Trp; Trp 또는 Phe에 의한 Tyr; 및 Ile 또는 Leu에 의한 Val이다. 마찬가지로, 특히 예를 들어 아미노산 삽입 또는 결실의 형태인 폴리펩티드의 N 또는 C 말단에서의 변화는 종종 폴리펩티드의 기능에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 공지되어 있다.
효소 E1의 활성은 문헌 [Barenholz and Gatt, The Journal of Biological Chemistry 247 (21): 6827-6833 (1972)]에 기재된 바와 같이 결정되고, 여기서 피토스핑고신은 기질로서 사용되고, 그의 아세틸화는 "효소 E1로서 서열 2를 갖는 효소를 함유하는" 특성을 제외하고는 동일한 참조 시스템과 비교된다.
효소 E2의 활성은 문헌 [Barenholz and Gatt, The Journal of Biological Chemistry 247 (21): 6827-6833 (1972)]에 기재된 바와 같이 결정되고, 여기서 트리아세틸화 피토스핑고신은 기질로서 사용되고, 그의 아세틸화는 "효소 E2로서 서열 4를 갖는 효소를 함유하는" 특성을 제외하고는 동일한 참조 시스템과 비교된다.
본 발명에 따른 바람직한 세포는 효소 E1 및 E2 둘 다의 강화된 활성을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 한 대안에서, 트리아세틸 피토스핑고신 및 디아세틸화 스핑고이드 염기 디아세틸 스핑고신, 디아세틸 스핑가닌, 디아세틸-6-히드록시스핑고신 및 디아세틸 스핑가디에닌의 생산을 위해서는, 그의 야생형과 비교하여 효소 E2의 감소된 활성을 갖는 세포가 유용하다. 이와 관련하여, 효소 E2의 감소된 활성 뿐만 아니라 효소 E1의 증가된 활성을 갖는 세포가 특히 유용하다.
본 발명에 따른 바람직한 세포는 미생물, 특히 효모 또는 박테리아이고, 여기서 바람직한 효모 세포는 특히 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 시페리이, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 및 아시비아 고시피이(Ashbya gossypii) 종이 특히 바람직한 사카로미세스, 피키아, 야로위아, 클루이베로미세스, 한세눌라, 아시비아 및 칸디다 속으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 세포의 생산을 위해, 높은 스핑고이드 염기 역가를 이미 가진 출발 균주가 사용되는 경우가 본 발명에 따라 특히 바람직하며; 따라서 본 발명에 따른 바람직한 세포는 특히 WO2006048458, WO2007131720 및 DE102011110959.9에 기재된 세포, 및 피키아 시페리이 NRRL Y-1031 F-60-10 (문헌 [Wickerham and Stodola, Journal of Bacteriology 80: 484-491 (1960)]), WO 95/12683의 실시예에 개시된 피키아 시페리이 균주 및 문헌 [Schorsch et al., 2009, Curr Genet. 55, 381-9]에 기재된 균주 피키아 시페리이 CS.PCΔPro2로 이루어진 군으로부터 선택된 균주로부터 유래된다.
본 발명에서 제기된 문제의 해결책에 대한 추가의 기여는 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포의 용도에 의해 제공된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "스핑고이드 염기"는 피토스핑고신, 스핑고신, 스핑가디에닌, 6-히드록시스핑고신 및 스핑가닌 (디히드로스핑고신), 또한 아세틸화 형태의 것, 예컨대 예를 들어 테트라아세틸피토스핑고신, 트리아세틸피토스핑고신, 디아세틸피토스핑고신, O-아세틸피토스핑고신, 트리아세틸스핑가닌, 디아세틸스핑가닌, O-아세틸스핑가닌, 트리아세틸스핑고신, 디아세틸스핑고신, O-아세틸스핑고신, 테트라아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸-6-히드록시스핑고신, 디아세틸-6-히드록시스핑고신, O-아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸스핑가디에닌, 디아세틸스핑가디에닌 및 O-아세틸스핑가디에닌을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "스핑고지질"은 아미드 결합을 통해 지방산과 공유적으로 연결된 스핑고이드 염기를 포함하는 화합물을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 지방산은 포화 또는 단일 또는 다중 불포화일 수 있다. 지방산 측쇄의 길이는 다양할 수 있다. 지방산 측쇄는 추가로 관능기, 예컨대 히드록시 기를 보유할 수 있다. 스핑고지질은, 예를 들어 피토세라미드, 세라미드 및 디히드로세라미드, 및 보다 복잡한 글루코실세라미드 (세레브로시드) 및 이노시톨 포스포릴세라미드, 만노실-이노시톨 포스포릴세라미드 및 만노실 디-이노시톨 포스포릴세라미드를 포함한다. 스핑고지질 중 여기서 또한 포함되는 것은 아미드 결합을 통해 아세틸 잔기와 연결된 스핑고이드 염기, 예컨대 예를 들어 N-아세틸피토스핑고신, N-아세틸스핑가닌, N-아세틸스핑고신, N-아세틸-6-히드록시스핑고신 및 N-아세틸-스핑가디에닌이다. 이들 화합물은 또한 단쇄 세라미드라는 명칭 하에 공지되어 있다.
특히, 피토스핑고신, 스핑고신, 6-히드록시스핑고신, 스핑가닌 (디히드로스핑고신), 테트라아세틸피토스핑고신 (TAPS), 트리아세틸피토스핑고신, 디아세틸피토스핑고신, O-아세틸피토스핑고신, N-아세틸피토스핑고신, 트리아세틸스핑가닌 (TriASa), 디아세틸스핑가닌, O-아세틸스핑가닌, N-아세틸스핑가닌, 트리아세틸스핑고신 (TriASo), 디아세틸스핑고신, O-아세틸스핑고신, N-아세틸스핑고신, 테트라아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸-6-히드록시스핑고신, 디아세틸-6-히드록시스핑고신, O-아세틸-6-히드록시스핑고신, N-아세틸-6-히드록시스핑고신, 트리아세틸스핑가디에닌, 디아세틸스핑가디에닌, O-아세틸스핑가디에닌 및 N-아세틸스핑가디에닌 군으로부터 선택된 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포의 용도가 유리하다. 매우 특히 바람직한 것은 테트라아세틸피토스핑고신 (TAPS)의 생산을 위한 본 발명에 따른 세포의 용도이다.
본 발명에 따른 하나의 바람직한 용도는 본 발명에 따라 상기에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 바람직한 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제기된 문제의 해결책에 대한 추가의 기여는
a) 본 발명에 따른 세포를 탄소원을 함유하는 배지와 접촉시키는 공정 단계,
b) 세포가 탄소원으로부터 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질을 형성할 수 있게 하는 조건 하에 세포를 배양하는 공정 단계, 및
c) 임의로, 형성된 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질을 단리시키는 공정 단계
를 포함하는, 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질을 생산하는 방법에 의해 제공된다.
본 발명에 따른 바람직한 방법은 본 발명에 따라 바람직한 것으로서 상기에 언급된 세포를 사용한다.
탄소원으로서는, 탄수화물, 예컨대 예를 들어 글루코스, 프룩토스, 글리세린, 사카로스, 말토스 및 당밀, 뿐만 아니라 알콜, 예컨대 예를 들어 에탄올 유기 산, 예컨대 예를 들어 아세테이트를 사용한다. 질소 공급원으로서는, 예를 들어 암모니아, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 유기 질소 화합물 (예컨대 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤 및 옥수수 침지액)을 사용할 수 있다. 또한, 무기 화합물, 예컨대 예를 들어 포스페이트, 마그네슘, 칼륨, 아연 및 철 염 등을 사용할 수 있다.
세포가 탄소원으로부터 스핑고이드 염기 및/또는 스핑고지질을 형성할 수 있게 하는 적합한 배양 조건은, 예를 들어 WO2006048458 및 WO2007131720으로부터의 피키아 시페리이에 대해 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 실험을 필요로 하지 않고 이들 조건을 다른 세포 유형에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 특히 효소 E1 및 E2 둘 다의 강화된 활성을 나타내는 세포를 사용하는 경우에, 테트라아세틸피토스핑고신 (TAPS)의 생산에 특히 적합하다.
기재된 효소는 또한 6 내지 18개의 C 원자를 갖는 지방족 1급 아민, 예컨대 예를 들어 헥사데실아민의 아미노 기의 아세틸화에 유리하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은
A) 효소 E1 또는 E2 중 적어도 하나를, 바람직하게는 선형인 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 것으로부터 특히 선택된 1급 지방족 아민, 및 아세틸 CoA를 함유하는 배지와 접촉시키며, 여기서 효소 E1은
서열 2의 폴리펩티드 서열을 갖거나 또는 결실, 삽입, 치환 또는 그의 조합에 의해 서열 2의 참조 서열과 비교하여 아미노산 잔기의 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하, 특히 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하가 변형된 폴리펩티드 서열을 갖고, 서열 2의 참조 서열을 갖는 효소의 효소적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 50%, 특히 바람직하게는 80%, 특히 90% 초과를 여전히 보유하는 효소 E1
로부터 선택되고, 여기서 효소 E1에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A의 3개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되고,
효소 E2는
서열 4의 폴리펩티드 서열을 갖거나 또는 결실, 삽입, 치환 또는 그의 조합에 의해 서열 4의 참조 서열과 비교하여 아미노산 잔기의 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하, 특히 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하가 변형된 폴리펩티드 서열을 갖고, 서열 4의 참조 서열을 갖는 효소의 효소적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 50%, 특히 바람직하게는 80%, 특히 90% 초과를 여전히 보유하는 효소 E2
로부터 선택되고, 여기서 효소 E2에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A의 1개의 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되는 것인 공정 단계, 및
B) 임의로, 형성된 아세틸화 아민을 단리시키는 공정 단계
를 포함하는, N-아세틸화 1급 지방족 아민을 생산하는 방법이다.
본 발명에 따른 바람직한 방법은 바람직하게는 효소 E1 및/또는 E2로서, 본 발명에 따른 것으로서 상기에 언급된 단리되고/거나 재조합적으로 생산된 효소 및/또는 세포를 사용한다.
하기에 나타낸 실시예에서, 본 발명은, 그의 적용 범위가 전체 설명 및 특허청구범위로부터 나오는 것인 본 발명이 실시예에서 언급된 실시양태에 제한되는 것으로 의도하지 않고, 예로서 기재된다.
실시예
효모 사카로미세스 세레비지아에 균주 K26에서의 PcSLI1의 과다발현
사카로미세스 세레비지아에 균주 K26에서의 PcSLI1의 과다발현을 위해, 먼저 PcSLI1-ORF를 2μ 벡터 p426HXT7-6HIS (문헌 [Hamacher et al. Microbiology 148: 2783-2788 (2002)], (서열 6)) 내로 클로닝하였다. 이를 위해, PcSLI1-ORF를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켰다. 먼저, 게놈 DNA를 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 방법에 의해 피. 시페리이로부터 단리하였다 (문헌 [Murray and Thompson; Nucleic Acids Res 8, 4321-4325 (1980)]). 이를 위해, YEPD 액체 배지 (1% w/v 효모 추출물, 1% w/v 펩톤, 2% w/v 글루코스) (≥ 2 ml, OD600nm > 1) 중에서 성장시킨 배양물 중의 세포를 수확하고, 400 μl CTAB 완충제 [2% (w/v) CTAB, 100 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl] 중에 재현탁시키고, 유리 비드 (0.25 - 0.5 mm Ø) 200 μl로 처리하고, "바이브랙스 브이엑스알 베이직(Vibrax VXR basic)" (2200 rpm) 상에서 4℃로 8분 동안 붕해시켰다. 그 다음, 제조물을 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1부피의 클로로포름을 첨가한 후에, 이어서 10초 동안 균질화시키고, 제조물을 16,000 g로 5분 동안 원심분리하였다. DNA-함유 상청액을 제거하여 0.7부피의 이소프로판올로 -20℃에서 적어도 30분 동안 DNA를 침전시켰다. 이어서, 16,000 g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리한 후에, 침전물을 70% 빙냉 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 50 μl H2O 중에 재현탁시켰다.
이어서, PcSLI1-ORF의 PCR 증폭을 주형으로서의 게놈 피. 시페리이 DNA, 및 2종의 올리고뉴클레오티드 SLI1.HXT7.fw (서열 11) 및 SLI1.CYC1.rv (서열 12)를 사용하여 달성하였다. 여기서 사용된 프라이머는 각각 5' 말단에서 표적 벡터에서의 통합 영역과 상동인 영역을 보유하였다. 에스. 세레비지아에에서, 이들 상동 말단은 생체내에서 증식할 수 있는 원형화 플라스미드를 생성하기 위한 선형화 벡터와 PCR 단편 사이의 상동 재조합을 가능하게 하였다. DNA 폴리머라제로서, 퓨전(Phusion)™ 하이-피델리티(High-Fidelity) DNA 폴리머라제 (핀자임즈(Finnzymes))를 제조업체의 지시에 따라 사용하였다. 증폭을 위해, 하기 온도 프로파일을 선택하였다: 단계 1: 98℃, 2분 (변성); 단계 2: 98℃, 15초 (변성); 단계 3: 60℃, 25초 (어닐링); 단계 4: 72℃, 80초 (신장); 단계 5: 72℃, 5분 (신장). 단계 2-4를 35회 반복하였다. 아가로스 겔 전기영동 후에, 생성된 1.4 kb PCR 단편을 "뉴클레오스핀(NucleoSpin)® 엑스트랙트(Extract) II" 겔 추출 키트 (마슈레-나겔(Macherey-Nagel))를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 정제하였다.
플라스미드 p426HXT7-6HIS (서열 6)를 제조업체의 지침에 따라 BamHI/EcoRI으로 소화시켰다. 아가로스 겔 전기영동 후에, 생성된 6.3 kb 벡터 단편을 또한 "뉴클레오스핀® 엑스트랙트 II" 겔 추출 키트 (마슈레-나겔)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 정제하였다.
BamHI/EcoRI-절단 벡터 내로의 PCR-증폭 PcSLI1-ORF의 클로닝을 에스. 세레비지아에에서의 생체내 재조합에 의해 달성하였다. 기본 방법은 문헌 [Oldenburg et al. (Nucleic Acids Res 25: 451-452 (1994)]에 기재되어 있다. 2종의 정제된 DNA 단편을 에스. 세레비지아에 CEN.PK113-13D (K26) 내로 함께 형질전환시켰고, 그 동안 기에츠(Gietz) 및 쉬에스틀(Schiestl)의 프로토콜 (문헌 [Nat Protoc 2: 31-34 (2007)])을 따랐다. 이어서, 세포를 합성 최소 배지 (0.16% w/v 효모 질소 염기, 0.5% w/v 황산암모늄, 2% w/v 글루코스, 2% w/v 한천) 상에 플레이팅하였다. 이로써, 선형화 벡터와 DNA 단편의 상동 재조합에 기반하여 안정한 원형화 플라스미드를 보유하는 형질전환체를 선택할 수 있다. 이어서, 플라스미드를 효모 클론으로부터 단리하였다. 이를 위해, 합성 최소 배지 (OD600nm > 1) 중에서 성장시킨 2 ml 배양물 중의 세포를 수확하고, 세척하고, 400 μl 완충제 1 [50 mM 글루코스; 10 mM EDTA (타이트리플렉스(Titriplex) III); 25 mM 트리스-HCl (pH 8); RNase A (100 μg/ml)] 중에 재현탁시켰다. 400 μl 완충제 2 (0.2 M NaOH; 1% SDS)를 첨가하고 조심스럽게 혼합한 후에, 유리 비드 (0.25 - 0.5 mm Ø)의 부피의 약 ⅔를 첨가하고, 세포를 "바이브랙스 브이엑스알 베이직" 상에서 2200 rpm으로 8분 동안 4℃에서 붕해시켰다. 상청액 500 μl를 250 μl 완충제 3 [5 M 아세트산칼륨 (pH 5.5)]과 혼합하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하고, 16,000 g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 비 1:1의 이소프로판올로 -20℃에서 적어도 30분 동안 침전시키고, 이어서 16,000 g로 20분 동안 원심분리하였다. 펠릿화된 DNA를 70% 에탄올 (-20℃)로 세척하고, 50 μl 물 중에 용해시켰다. 그 다음, 플라스미드 DNA를 문헌 [Dower et al. (Nucleic Acids Res 16: 6127-6145 (1988)]에 따라 전기천공에 의해 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 전기천공을 위해, 진 펄셔(Gene Pulser)®를 하기 조건: 전압: 2 - 2.5 kV; 저항: 200 Ω; 정전용량: 25 μF 하에 사용하였다. 형질전환체를 40 μg/ml 암피실린으로 보충된 고체 LB 배지 (1% w/v 트립톤, 0.5% w/v 효모 추출물, 0.5% w/v NaCl, 2% 한천, pH 7.5) 상에서 선택하였다. 이. 콜라이로부터 플라스미드를 단리하기 위해, 클론을 40 μg/ml 암피실린으로 보충된 액체 LB 배지 5 ml 중에서 37℃로 밤새 진탕기 상에서 성장시키고, 이어서 진제트(GeneJET)™ 플라스미드 미니프렙 키트 (퍼멘타스 게엠베하(Fermentas GmbH))를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
이어서, 플라스미드를 제한 분석 및 서열분석에 의해 특성화하였다. 선형화 벡터 내로의 PcSLI1-ORF의 정확한 통합은 7.6 kb 플라스미드 pCS.426.SLI1 (서열 7)을 생성하였고, 여기서 PcSLI1-ORF는 에스. 세레비지아에로부터의 단축 HXT7392-1 프로모터 단편 및 CYC1 종결인자의 제어 하에 있었다. 이 배열은 에스. 세레비지아에에서의 PcSLI1의 구성적 과다발현을 가능하게 하였다.
이어서, 플라스미드 pCS.426.SLI1 (서열 7) 및 대조 플라스미드 p426HXT7-6HIS (서열 6)를 에스. 세레비지아에 균주 K26 내로 형질전환시켰고, 이를 위해 다시 기에츠 및 쉬에스틀의 방법 (문헌 [Nat Protoc 2: 31-34 (2007)])을 따랐다. 형질전환체를 합성 최소 배지 (0.16% w/v 효모 질소 염기, 0.5% w/v 황산암모늄, 2% w/v 글루코스, 2% w/v 한천) 상에서 다시 한번 선택하였다. 그 다음, 아세틸화 스핑고이드 염기의 생산에 대한 PcSLI1의 과다발현의 효과를 조사하기 위해, 형질전환체를 액체 TAPS 배지 [리터당 조성: 33 g 글루코스 1수화물, 20 g 프탈산수소 칼륨, 4.83 g 염화암모늄, 1 g 효모 추출물, 1 g 인산이수소칼륨, 0.88 g 황산마그네슘 7수화물, 0.2 g 염화칼슘 2수화물, 60 mg 염화나트륨, 59 mg 미오이노시톨, 미량 원소 [37.3 mg 황산암모늄-철(II) 6수화물, 7.5 mg 황산구리(II) 5수화물, 5 mg 황산아연 7수화물, 1.5 mg 아이오딘화칼륨, 0.6 mg 황산망가니즈(II) 1수화물, 0.6 mg 붕산, 0.6 mg 몰리브데넘산나트륨 2수화물] 및 비타민 (3 mg 니코틴산, 3 mg 칼슘 D-판토테네이트, 3 mg 티아민, 2 mg 4-아미노벤조산, 0.3 mg 피리독신, 10 μg 비오틴); pH 5.4] 중에서 배양하였다. 형질전환체를 회전 진탕 장치 상에서 200 - 250 rpm으로 30℃에서 호기적으로 성장시켰다. 세포를 먼저 전배양으로서 5 ml TAPS 중에서 성장시키고, 고정 성장기의 도달 시에 20 ml TAPS 배지 ( 본배양)의 접종에 사용하였다.
본배양을 0.1의 OD600nm로 시작하였다. LC-MS/MS에 의한 아세틸화 스핑고이드 염기의 분석을 위해, 고정상의 도달 시에 배양 브로쓰 중 1 ml 샘플을 회수하여 추가로 가공할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 지질의 추출을 문헌 [Bjerve et al. (Anal. Biochem. 58: 238-245 (1974)]의 방법에 의해 달성하였다. 이를 위해, 배양 브로쓰 20 μl를 10배 부피의 n-부탄올 중에 녹였다. 홀수 C17 피토스핑고신, C17 스핑가닌 및 중수소-표지된 d9 트리아세틸스핑가닌 20 ng을 내부 표준물로서 첨가하고, 샘플을 70℃에서 격렬하게 혼합하였다. 그 다음, 샘플을 5분 동안 1000 x g로 원심분리하고, 상청액 10 μl를 회수하여 50/50% (v/v) 메탄올/H2O 중에서 10배 희석하였다.
스핑고지질의 LC-MS/MS 분석을 위해, 써모 악셀라(Thermo Accela) HPLC (써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fisher Scientific Inc.), 미국 매사추세츠주 월섬) 장치를 사용하였다. 주입된 샘플 부피는 5 μl였다. 사용된 칼럼은 40℃로 온도조절되고 마이크로보어 가드(Microbore Guard) 칼럼 (뉴클레오두르(Nucleodur) C18 ISIS; 3 μm 입자; 5 x 1 mm; #717759; 마슈레-나겔, 독일 뒤렌)에 의해 보호되는 역상 하이퍼실 골드(Hypersil Gold) C18 칼럼 (1.9 μm 입자; 50 x 2.1 mm; #25002-052130; 써모 피셔 사이언티픽 인크., 미국 매사추세츠주 월섬)이었다. 이동상은 200 μl/분의 유량을 갖고, (A) 0.1% v/v 포름산 및 2% v/v 아세토니트릴을 함유하는 H2O, 및 (B) 0.1% v/v 포름산을 함유하는 아세토니트릴로 이루어졌다. 70% B로 처음 1분 후에, 4-단계 구배를 용리에 사용하였다: 1) 1.5분에 걸쳐 70% B에서 94%로 증가; 2) 3.5분에 걸쳐 94% B에서 100%로 증가; 3) 3.5분에 걸쳐 100% B 유지; 4) 2.5분 동안 100% B에서 70%로 감소 및 유지. MS/MS 분석을 양이온화 모드의 다중 반응 모니터링 (MRM)으로서 수행하였다. 적용된 질량 전이 및 충돌 에너지를 표 1에 나타내었다.
표 1. 질량 전이 및 충돌 에너지. IS, 내부 표준물 (중수소화되거나 또는 홀수 쇄 길이를 갖는 스핑고지질). 볼드체로 인쇄된 값은 검증자로서 사용하였다.
기기 세팅은 하기와 같았다: 모세관 전압, 3.5 kV; 모세관 온도, 350℃, 디클러스터링 전압, 10 V; 시스 기체 압력, 5 au (임의적 단위); 이온 스위프 기체 압력, 0 au; 보조 기체 압력, 5 au, S-렌즈 RF 진폭, 50 V; 충돌 에너지, 10-35 eV; 아르곤 충돌 기체 압력, 1.0 mTorr; 주기 길이, 600 밀리초; 사중극자 1 및 3의 해상도, 0.70 (fwhm). 엑스칼리버(Xcalibur) 소프트웨어 버전 2.1 (써모 피셔 사이언티픽 인크., 미국 매사추세츠주 월섬)을 데이터 기록 및 분석에 사용하였다.
에스. 세레비지아에에서의 아세틸화 스핑고이드 염기의 생산에 대한 PcSLI1 발현의 효과를 표 2에 나타내었다. 디아세틸스핑가닌, 트리아세틸스핑가닌 및 트리아세틸피토스핑고신의 경우에는 현저하게 증가된 역가가 주로 기록되었지만, 형성된 테트라아세틸피토스핑고신의 양은 대조 균주에 비해 변하지 않았다. 이는 PcSLI1 단백질이 3개의 아세틸 잔기만을 피토스핑고신 또는 스핑가닌으로 전달할 수 있음을 명백하게 나타낸다. 그러나, 이 단백질은 트리아세틸피토스핑고신의 테트라아세틸피토스핑고신으로의 최종 아세틸화에 촉매작용할 수는 없었다.
표 2. 재조합 에스. 세레비지아에 균주에서의 아세틸화 및 유리 스핑고이드 염기의 생산. K26L, 대조 플라스미드 p426HXT7-6HIS로 형질전환된 균주 에스. 세레비지아에 K26; K26SLI1, PcSLI1 과다발현 플라스미드 pCS.426.SLI1로 형질전환된 균주 에스. 세레비지아에 K26; Sa, 스핑가닌; DiASa, 디아세틸스핑가닌; TriASa, 트리아세틸스핑가닌; Ps, 피토스핑고신; TriAPS, 트리아세틸피토스핑고신; TAPS, 테트라아세틸피토스핑고신; 값은 발효 브로쓰에서 결정된 mg/l 단위의 역가를 나타낸다.
균주 사카로미세스 세레비지아에 균주 K26에서의 PcSLI1 및 PcATF1의 과다발현
사카로미세스 세레비지아에 균주 K26에서의 피토스핑고신의 테트라아세틸피토스핑고신으로의 완전한 아세틸화를 위해서는, PcSLI1 및 PcATF1의 동시 과다발현이 요구되었다. PcSLI1의 과다발현을 위해, 그의 구축이 이전 실시예에 기재되어 있는 플라스미드 pCS.426.SLI1을 사용하였다. 이를 위해 사용된 발현 벡터 p426HXT7-6HIS (서열 6)는 에스. 세레비지아에 URA3 마커 유전자를 보유하였다. PcATF1의 과다발현을 위해서는, 먼저 PcATF1-ORF를 선택적 마커 유전자를 보유하는 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하여야 한다. 이를 위해, 에스. 세레비지아에 LEU2 유전자를 선택 마커로서 보유하는 플라스미드 p425HXT7-6HIS (문헌 [Becker and Boles; Appl Environ Microbiol 69: 4144-4150 (2003)], (서열 5))를 사용하였다.
먼저, PcATF1 종결인자의 19 bp를 포함하는 PcATF1-ORF를 PCR에 의해 게놈 피. 시페리이 DNA로부터 증폭시켰다. 프라이머로서, 올리고뉴클레오티드 ATF2-HXT.fw (서열 9) 및 ATF2-CYC.rv (서열 10)를 사용하였다. 이를 위해 사용된 프라이머는 각각 5' 말단에서 표적 벡터에서의 통합 영역에 대해 상동인 영역을 보유하였다. 에스. 세레비지아에에서, 이들 상동 말단은 생체내에서 증식할 수 있는 원형화 플라스미드를 생성하기 위한 선형화 벡터와 PCR 단편 사이의 상동 재조합을 가능하게 하였다.
DNA 폴리머라제로서, 퓨전™ 하이-피델리티 DNA 폴리머라제 (핀자임즈)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 증폭을 위해, 하기 온도 프로파일을 선택하였다: 단계 1: 98℃, 2분 (변성); 단계 2: 98℃, 15초 (변성); 단계 3: 61℃, 25초 (어닐링); 단계 4: 72℃, 80초 (신장); 단계 5: 72℃, 5분 (신장). 단계 2-4를 35회 반복하였다. SDS 겔 전기영동 후에, 생성된 1.6 kb PCR 단편을 "뉴클레오스핀® 엑스트랙트 II" 겔 추출 키트 (마슈레-나겔)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 정제하였다.
플라스미드 p425HXT7-6HIS (서열 5)를 제조업체의 지침에 따라 BamHI/HindIII로 소화시켰다. SDS 겔 전기영동 후에, 생성된 7.5 kb 벡터 단편을 또한 "뉴클레오스핀® 엑스트랙트 II" 겔 추출 키트 (마슈레-나겔)로 제조업체의 지침에 따라 정제하였다.
BamHI/EcoRI-절단 벡터 내로의 PCR-증폭 PcATF1-ORF의 클로닝을 에스. 세레비지아에 내로의 생체내 재조합에 의해 달성하였다. 기본 방법은 문헌 [Oldenburg et al. (Nucleic Acids Res 25: 451-452 (1994)]에 기재되어 있다. 2종의 정제된 DNA 단편을 에스. 세레비지아에 균주 10480-2C 내로 함께 형질전환시켰고 (문헌 [Moesch and Fink, Genetics 145: 671-684 (1997)]), 이를 위해 기에츠 및 쉬에스틀의 프로토콜 (문헌 [Nat Protoc 2: 31-34 (2007)])을 따랐다. 이어서, 세포를 20 mg/l 우라실로 보충된 최소 배지 (0.16% w/v 효모 질소 염기, 0.5% w/v 황산암모늄, 2% w/v 글루코스, 2% w/v 한천) 상에 플레이팅하였다. 이로써, 선형화 벡터와 DNA 단편의 상동 재조합으로 인해 안정한 원형화 플라스미드를 보유하는 형질전환체를 선택할 수 있었다. 이어서, 플라스미드를 효모 클론으로부터 단리하였다. 이를 위해, 20 mg/l L-히스티딘 HCl, 20 mg/l 우라실 및 20 mg/l L-트립토판으로 보충된 합성 최소 배지 (OD600nm > 1) 중에서 성장시킨 2 ml 배양물로부터 세포를 수확하고, 세척하고, 400 μl 완충제 1 [50 mM 글루코스; 10 mM EDTA (타이트리플렉스 III); 25 mM 트리스 HCl (pH 8); RNase A (100 μg/ml)] 중에 재현탁시켰다. 400 μl 완충제 2 (0.2 M NaOH; 1% SDS)를 첨가하고 조심스럽게 혼합한 후에, 유리 비드 (0.25 - 0.5 mm Ø)의 부피의 약 ⅔를 첨가하고, 세포를 "바이브랙스 브이엑스알 베이직" 상에서 2200 rpm으로 8분 동안 4℃에서 붕해시켰다. 상청액 500 μl를 250 μl 완충제 3 [5 M 아세트산칼륨 (pH 5.5)]과 혼합하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하고, 16,000 g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 비 1:1의 이소프로판올로 -20℃에서 적어도 30분 동안 침전시키고, 이어서 16,000 g로 20분 동안 원심분리하였다. 펠릿화된 DNA를 70% 에탄올 (-20℃)로 세척하고, 50 μl 물 중에 용해시켰다. 그 다음, 플라스미드 DNA를 문헌 [Dower et al. (Nucleic Acids Res 16: 6127-6145 (1988)]에 따라 전기천공에 의해 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 전기천공을 위해, 진 펄셔®를 하기 조건: 전압: 2 - 2.5 kV; 저항: 200 Ω; 정전용량: 25 μF 하에 사용하였다. 형질전환체를 40 μg/ml 암피실린으로 보충된 고체 LB 배지 (1% w/v 트립톤, 0.5% w/v 효모 추출물, 0.5% w/v NaCl, 2% 한천, pH 7.5) 상에서 선택하였다. 이. 콜라이로부터 플라스미드를 단리하기 위해, 클론을 40 μg/ml 암피실린으로 보충된 5 ml 액체 LB 배지 중에서 37℃로 밤새 진탕기 상에서 성장시키고, 이어서 진제트™ 플라스미드 미니프렙 키트 (퍼멘타스 게엠베하)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
이어서, 플라스미드를 제한 분석 및 서열분석에 의해 특성화하였다. 선형화 벡터 내로의 PcSLI1-ORF의 정확한 통합은 8.9 kb 플라스미드 pCS.425.ATF1 (서열 8)을 생성하였고, 여기서 PcATF1-ORF는 에스. 세레비지아에로부터의 단축 HXT7392-1 프로모터 단편 및 CYC1 종결인자의 제어 하에 있었다. 이 배열은 에스. 세레비지아에에서의 PcATF1의 구성적 과다발현을 가능하게 하였다.
PcSLI1 및 PcATF2의 동시 과다발현을 위해, 이어서 2종의 플라스미드 pCS.426.SLI1 (서열 7) 및 pCS.425.ATF1 (서열 8)을 에스. 세레비지아에 균주 10480-2C 내로 공형질전환시켰고, 이를 위해 다시 한번 기에츠 및 쉬에스틀의 방법 (문헌 [Nat Protoc 2: 31-34 (2007)])을 따랐다. 형질전환체를 합성 최소 배지 (0.16% w/v 효모 질소 염기, 0.5% w/v 황산암모늄, 2% w/v 글루코스, 2% w/v 한천) 상에서 선택하였다. 비교 목적을 위해, 2종의 출발 플라스미드 p425HXT7-6HIS (서열 5) 및 p426HXT7-6HIS (서열 6)를 또한 균주 RH2754 내로 공형질전환시켰다. 그 다음, 아세틸화 스핑고이드 염기의 생산에 대한 PcSLI1 및 PcATF1의 동시 과다발현의 효과를 조사하기 위해, 형질전환체를 액체 TAPS 배지 중에서 배양하였다. 형질전환체를 회전 진탕기 상에서 200 - 250 rpm으로 30℃에서 호기적으로 성장시켰다. 세포를 먼저 전배양으로서 5 ml TAPS 중에서 성장시키고, 고정 성장기에 도달 시에 20 ml TAPS 배지 ( 본배양)의 접종에 사용하였다.
아세틸화 스핑고이드 염기의 생산의 결정을 위한 배양, 샘플의 가공, 및 절차는 이전 실시예와 유사하게 달성하였다.
2종의 플라스미드 pCS.426.SLI1 및 pCS.425.ATF1로 형질전환된 효모 균주의 경우에, 분석은 2종의 대조 플라스미드 (p425HXT7-6HIS 및 p426HXT7-6HIS)로 형질전환된 균주에 비해 현저하게 증가된 테트라아세틸피토스핑고신의 역가를 나타내었다. 이는 사카로미세스 세레비지아에에서의 PcSLI1 및 PcATF1의 동시 과다발현이 피토스핑고신 대사물의 완전한 아세틸화에 영향을 미친다는 명백한 증거이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Evonik Industries
<120> Neue Enzyme
<130> 201100515
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1326
<212> DNA
<213> Pichia ciferrii
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1326)
<400> 1
atg gtg gct gga cca aac aaa gat ctt gaa aac ctg gaa cgt atg atg 48
Met Val Ala Gly Pro Asn Lys Asp Leu Glu Asn Leu Glu Arg Met Met
1 5 10 15
tac tgg aag acc act ttg aaa gct tgg tca tgt ttc ctt gtt ggt gct 96
Tyr Trp Lys Thr Thr Leu Lys Ala Trp Ser Cys Phe Leu Val Gly Ala
20 25 30
aaa tta aac gaa aaa tta gaa aca gat gat att tta aaa ggt atc cac 144
Lys Leu Asn Glu Lys Leu Glu Thr Asp Asp Ile Leu Lys Gly Ile His
35 40 45
aaa tta ttc acg ttg agg gtt cag tta cgt ttg aat gtt ttc caa tat 192
Lys Leu Phe Thr Leu Arg Val Gln Leu Arg Leu Asn Val Phe Gln Tyr
50 55 60
cct aaa aaa agg ttt gtt acc gaa gag ata aat ggt tgg tct gat gat 240
Pro Lys Lys Arg Phe Val Thr Glu Glu Ile Asn Gly Trp Ser Asp Asp
65 70 75 80
ttt gtt gat ttt gtc gat tat cca act gat gat ttt gat att att gaa 288
Phe Val Asp Phe Val Asp Tyr Pro Thr Asp Asp Phe Asp Ile Ile Glu
85 90 95
gct ttt aaa caa caa cat aat caa tat ttt gaa ttg ggt gtt caa aag 336
Ala Phe Lys Gln Gln His Asn Gln Tyr Phe Glu Leu Gly Val Gln Lys
100 105 110
cct tta tgg aaa ttg gtt gta ttg aac cat caa tat tta gtt att ctt 384
Pro Leu Trp Lys Leu Val Val Leu Asn His Gln Tyr Leu Val Ile Leu
115 120 125
tgt gat cat acc tta tat gat ggg aac act gca ctt tat ata tgt gag 432
Cys Asp His Thr Leu Tyr Asp Gly Asn Thr Ala Leu Tyr Ile Cys Glu
130 135 140
gat ttg atc aca ata ttg aat gat cgt gat atc cca gtt gat aga att 480
Asp Leu Ile Thr Ile Leu Asn Asp Arg Asp Ile Pro Val Asp Arg Ile
145 150 155 160
cca gat att aaa cca tat cat gat cta tta aaa cca aaa ctt gga cat 528
Pro Asp Ile Lys Pro Tyr His Asp Leu Leu Lys Pro Lys Leu Gly His
165 170 175
aca atc aaa act gtc atc caa act ttt gca cca aaa tgg gct tat cct 576
Thr Ile Lys Thr Val Ile Gln Thr Phe Ala Pro Lys Trp Ala Tyr Pro
180 185 190
tta gtt aat ctg att tat aga cca aaa agt gaa ttt gaa act ggt gca 624
Leu Val Asn Leu Ile Tyr Arg Pro Lys Ser Glu Phe Glu Thr Gly Ala
195 200 205
tat gat gat tgg gga gta act cat aaa att gaa aga aca aca aat aaa 672
Tyr Asp Asp Trp Gly Val Thr His Lys Ile Glu Arg Thr Thr Asn Lys
210 215 220
tta aag cac tta att aca ata act aat gaa gaa ttt tcc ata att aaa 720
Leu Lys His Leu Ile Thr Ile Thr Asn Glu Glu Phe Ser Ile Ile Lys
225 230 235 240
aaa tta aca aaa tca cat ggt gta aat ttc aca gca ttt tgg gca tat 768
Lys Leu Thr Lys Ser His Gly Val Asn Phe Thr Ala Phe Trp Ala Tyr
245 250 255
atc aat gtt ctt gca gtt gca caa ttg gga aag tca gct gtt gat tta 816
Ile Asn Val Leu Ala Val Ala Gln Leu Gly Lys Ser Ala Val Asp Leu
260 265 270
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Ser Ile Pro Phe Asn Met Arg Thr Asn Leu Leu Pro Pro Glu Tyr Leu
275 280 285
aga tgg tat ggt tta tta gtt tca cat gtt act tta aat gta cat acc 912
Arg Trp Tyr Gly Leu Leu Val Ser His Val Thr Leu Asn Val His Thr
290 295 300
aaa gtt gat cat gat tca att gac tgg gat ttt gtt aga ttt tta aat 960
Lys Val Asp His Asp Ser Ile Asp Trp Asp Phe Val Arg Phe Leu Asn
305 310 315 320
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Gly Ser Val Ala His Lys Tyr Gln Val Lys Gln Ser Gln Met Leu Gly
325 330 335
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Met Ile Lys Tyr Val Ser Ala Arg Gly Leu Ile Glu Ser Ala Leu Lys
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Ser Pro Arg Lys Gly Gly Leu Glu Val Ser Asn Leu Gly Leu Arg Val
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Asp Pro Asp Gly Glu Ser Trp Lys Lys Tyr Thr Pro Glu Glu Phe Phe
370 375 380
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Phe Ser Leu Pro Asn Asp Leu Ser Gly Tyr Asn Val Ser Asn Ala Val
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att tca agt aaa act aaa aca aat att att tta gac ggt gtt cca gaa 1248
Ile Ser Ser Lys Thr Lys Thr Asn Ile Ile Leu Asp Gly Val Pro Glu
405 410 415
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Phe Ala Asn Glu Phe Pro Thr Tyr Ala Asn Asn Val Glu Thr Ile Leu
420 425 430
aga aat gca atc aat ggg tat tat gaa taa 1326
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<213> Pichia ciferrii
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275 280 285
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ctgtaacgag ctactaaaat attgcgaata ccgcttccac aaacattgct caaaagtatc 4920
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gaccaatgaa gaatcatcaa cgctatcact ttctgttcac aaagtatgcg caatccacat 5220
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ttgttagaaa aatagcgctc tcgggatgca tttttgtaga acaaaaaaga agtatagatt 5640
ctttgttggt aaaatagcgc tctcgcgttg catttctgtt ctgtaaaaat gcagctcaga 5700
ttctttgttt gaaaaattag cgctctcgcg ttgcattttt gttttacaaa aatgaagcac 5760
agattcttcg ttggtaaaat agcgctttcg cgttgcattt ctgttctgta aaaatgcagc 5820
tcagattctt tgtttgaaaa attagcgctc tcgcgttgca tttttgttct acaaaatgaa 5880
gcacagatgc ttcgttcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 5940
ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 6000
cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 6060
cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 6120
aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 6180
ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 6240
gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 6300
cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 6360
acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 6420
gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 6480
aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 6540
ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta 6600
ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 6660
gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 6720
aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 6780
aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga 6840
aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 6900
gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 6960
gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 7020
tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 7080
gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 7140
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 7200
actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 7260
acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 7320
cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg 7380
gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta 7440
cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 7500
gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 7560
tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 7590
<210> 8
<211> 8933
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector
<400> 8
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 60
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 120
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 180
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 240
gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg 300
agcgcaacgc aattaatgtg agttacctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta 360
tgcttccggc tcctatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca 420
gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg 480
agctcgtagg aacaatttcg ggcccctgcg tgttcttctg aggttcatct tttacatttg 540
cttctgctgg ataattttca gaggcaacaa ggaaaaatta gatggcaaaa agtcgtcttt 600
caaggaaaaa tccccaccat ctttcgagat cccctgtaac ttattggcaa ctgaaagaat 660
gaaaaggagg aaaatacaaa atatactaga actgaaaaaa aaaaagtata aatagagacg 720
atatatgcca atacttcaca atgttcgaat ctattcttca tttgcagcta ttgtaaaata 780
ataaaacatc aagaacaaac aagctcaact tgtcttttct aagaacaaag aataaacaca 840
aaaacaaaaa gtttttttaa ttttaatcaa aaagtgaata tattttttca agggcccata 900
tatatatata aacacaagaa atgtttattt gaatcattac aatttacttt cttaacctca 960
tcatcaaata tgtcatttaa atatatcaat caaaatgatt caaaatcatt atcaaattta 1020
aaatataaat tatcaaaaaa tcatgcaaga caaatgggtt ttttagaaga tttttttgca 1080
attttacaac gtcaaaaaat gtataaatca tttttcgtta tgtgtaaata taatgaaaaa 1140
attgatgatt ttaaaatttt attccattca ttaagattat taatattaaa attcccaata 1200
ttagcttcca caataattac tcaaaatgtt ccaattaata taaaacctcg tccttatgat 1260
tatattcaaa ttattgatga aataaaattt aatgatttgg tttgggattt aagacctgaa 1320
tattcaaatt tattacaaga agatttatta aataaattaa atgatttaat tataccatat 1380
gaagataata aattagtttg gagattagga atcttggatg attatacatt aatttttata 1440
acaaatcatg ttttacatga tggaatatct ggtaaaaata tttttaatga attatcatta 1500
atttttaatc aattggactt ggattcttta agtgatgatg atgatatcgt gttcaattat 1560
tcacaagatc atttgaattt aggtgaatta ccaaaaccta taactgatct tatgaatcat 1620
attccatcaa ttaaatcttt accaagatat atttataatt cattaattga accaaaactt 1680
ttttgttcat caactttaat tcaaggtcat cttaagaata ttcattatag agttaatata 1740
aatccaatgg aattattaaa aattaaatca ttattatcaa aaaatagttt caataatgtt 1800
aaattaactt taacaccttt cattcaatct atttggaatt atactttata tcaagatgaa 1860
tattataaat catcaaaatc tttattaggt attgcagtgg attctcgtca atttattaat 1920
aaagatgaac aagatttata taaatttggt ttaaatgtat caggttttag taaaatttcc 1980
aaaccaatga aattaattac atggaataaa attaatcaaa ttaatcaaga tttaaaaatt 2040
tcattaaaat tgaaaaaacc tttatattca atgggtatat taggttggga taaaatgatt 2100
aaaaataaac atttagatgt tgatttacca aaaattatga ataaaagaac aggttcaact 2160
ttttcaaata ttggtataat cctaaataac agtgaatcaa atgataaatt tcaaattatt 2220
gatgcaatgt ttacacaaca ttttaatgtt catttttatg atttctcaat cactgcaatt 2280
tctacaatga ctggtgggtt aaatattata attacatcac cagaatctat tggaattgaa 2340
aatttagaaa gaatttgtaa aaaatttcat gaaaatttag ttttatgtga tattaaataa 2400
ggataatttg ggcccgatga attagttatg tcacgcttac attcacgccc tccccccaca 2460
tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt 2520
tttatagtta tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg 2580
tacagacgcg tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga 2640
cgctcgaagg ctttaatttg cggccggtac ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg 2700
cgcgctcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 2760
ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 2820
ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcgac gcgccctgta 2880
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2940
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 3000
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 3060
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 3120
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 3180
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 3240
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 3300
acaaaatatt aacgtttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 3360
tatttcacac cgcatatcga cggtcgagga gaacttctag tatatccaca tacctaatat 3420
tattgcctta ttaaaaatgg aatcccaaca attacatcaa aatccacatt ctcttcaaaa 3480
tcaattgtcc tgtacttcct tgttcatgtg tgttcaaaaa cgttatattt ataggataat 3540
tatactctat ttctcaacaa gtaattggtt gtttggccga gcggtctaag gcgcctgatt 3600
caagaaatat cttgaccgca gttaactgtg ggaatactca ggtatcgtaa gatgcaagag 3660
ttcgaatctc ttagcaacca ttattttttt cctcaacata acgagaacac acaggggcgc 3720
tatcgcacag aatcaaattc gatgactgga aattttttgt taatttcaga ggtcgcctga 3780
cgcatatacc tttttcaact gaaaaattgg gagaaaaagg aaaggtgaga ggccggaacc 3840
ggcttttcat atagaataga gaagcgttca tgactaaatg cttgcatcac aatacttgaa 3900
gttgacaata ttatttaagg acctattgtt ttttccaata ggtggttagc aatcgtctta 3960
ctttctaact tttcttacct tttacatttc agcaatatat atatatattt caaggatata 4020
ccattctaat gtctgcccct atgtctgccc ctaagaagat cgtcgttttg ccaggtgacc 4080
acgttggtca agaaatcaca gccgaagcca ttaaggttct taaagctatt tctgatgttc 4140
gttccaatgt caagttcgat ttcgaaaatc atttaattgg tggtgctgct atcgatgcta 4200
caggtgtccc acttccagat gaggcgctgg aagcctccaa gaaggttgat gccgttttgt 4260
taggtgctgt ggctggtcct aaatggggta ccggtagtgt tagacctgaa caaggtttac 4320
taaaaatccg taaagaactt caattgtacg ccaacttaag accatgtaac tttgcatccg 4380
actctctttt agacttatct ccaatcaagc cacaatttgc taaaggtact gacttcgttg 4440
ttgtcagaga attagtggga ggtatttact ttggtaagag aaaggaagac gatggtgatg 4500
gtgtcgcttg ggatagtgaa caatacaccg ttccagaagt gcaaagaatc acaagaatgg 4560
ccgctttcat ggccctacaa catgagccac cattgcctat ttggtccttg gataaagcta 4620
atcttttggc ctcttcaaga ttatggagaa aaactgtgga ggaaaccatc aagaacgaat 4680
tccctacatt gaaggttcaa catcaattga ttgattctgc cgccatgatc ctagttaaga 4740
acccaaccca cctaaatggt attataatca ccagcaacat gtttggtgat atcatctccg 4800
atgaagcctc cgttatccca ggttccttgg gtttgttgcc atctgcgtcc ttggcctctt 4860
tgccagacaa gaacaccgca tttggtttgt acgaaccatg ccacggttct gctccagatt 4920
tgccaaagaa taaggttgac cctatcgcca ctatcttgtc tgctgcaatg atgttgaaat 4980
tgtcattgaa cttgcctgaa gaaggtaagg ccattgaaga tgcagttaaa aaggttttgg 5040
atgcaggtat cagaactggt gatttaggtg gttccaacag taccaccgaa gtcggtgatg 5100
ctgtcgccga agaagttaag aaaatccttg cttaaaaaga ttctcttttt ttatgatatt 5160
tgtacataaa ctttataaat gaaattcata atagaaacga cacgaaatta caaaatggaa 5220
tatgttcata gggtagacga aactatatac gcaatctaca tacatttatc aagaaggaga 5280
aaaaggagga tagtaaagga atacaggtaa gcaaattgat actaatggct caacgtgata 5340
aggaaaaaga attgcacttt aacattaata ttgacaagga ggagggcacc acacaaaaag 5400
ttaggtgtaa cagaaaatca tgaaactacg attcctaatt tgatattgga ggattttctc 5460
taaaaaaaaa aaaatacaac aaataaaaaa cactcaatga cctgaccatt tgatggagtt 5520
taagtcaata ccttcttgaa gcatttccca taatggtgaa agttccctca agaattttac 5580
tctgtcagaa acggccttac gacgtagtcg atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 5640
gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 5700
gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 5760
tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc 5820
ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agtatgatcc aatatcaaag 5880
gaaatgatag cattgaagga tgagactaat ccaattgagg agtggcagca tatagaacag 5940
ctaaagggta gtgctgaagg aagcatacga taccccgcat ggaatgggat aatatcacag 6000
gaggtactag actacctttc atcctacata aatagacgca tataagtacg catttaagca 6060
taaacacgca ctatgccgtt cttctcatgt atatatatat acaggcaaca cgcagatata 6120
ggtgcgacgt gaacagtgag ctgtatgtgc gcagctcgcg ttgcattttc ggaagcgctc 6180
gttttcggaa acgctttgaa gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga 6240
acttcagagc gcttttgaaa accaaaagcg ctctgaagac gcactttcaa aaaaccaaaa 6300
acgcaccgga ctgtaacgag ctactaaaat attgcgaata ccgcttccac aaacattgct 6360
caaaagtatc tctttgctat atatctctgt gctatatccc tatataacct acccatccac 6420
ctttcgctcc ttgaacttgc atctaaactc gacctctaca ttttttatgt ttatctctag 6480
tattactctt tagacaaaaa aattgtagta agaactattc atagagtgaa tcgaaaacaa 6540
tacgaaaatg taaacatttc ctatacgtag tatatagaga caaaatagaa gaaaccgttc 6600
ataattttct gaccaatgaa gaatcatcaa cgctatcact ttctgttcac aaagtatgcg 6660
caatccacat cggtatagaa tataatcggg gatgccttta tcttgaaaaa atgcacccgc 6720
agcttcgcta gtaatcagta aacgcgggaa gtggagtcag gcttttttta tggaagagaa 6780
aatagacacc aaagtagcct tcttctaacc ttaacggacc tacagtgcaa aaagttatca 6840
agagactgca ttatagagcg cacaaaggag aaaaaaagta atctaagatg ctttgttaga 6900
aaaatagcgc tctcgggatg catttttgta gaacaaaaaa gaagtataga ttctttgttg 6960
gtaaaatagc gctctcgcgt tgcatttctg ttctgtaaaa atgcagctca gattctttgt 7020
ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt ttgttttaca aaaatgaagc acagattctt 7080
cgttggtaaa atagcgcttt cgcgttgcat ttctgttctg taaaaatgca gctcagattc 7140
tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg catttttgtt ctacaaaatg aagcacagat 7200
gcttcgttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 7260
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 7320
atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 7380
tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 7440
tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 7500
ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 7560
atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 7620
ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 7680
catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 7740
cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 7800
ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 7860
cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 7920
cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 7980
tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 8040
agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 8100
ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 8160
gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 8220
atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 8280
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 8340
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 8400
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 8460
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 8520
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 8580
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 8640
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 8700
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 8760
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 8820
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 8880
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gct 8933
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
aaaacaaaaa gtttttttaa ttttaatcaa aaagtgaata tattttttca agggccc 57
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
gagggcgtga atgtaagcgt gacataacta attcatcggg cccaaattat cc 52
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
aaaacaaaaa gtttttttaa ttttaatcaa aaaatggtgg ctggaccaaa c 51
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac taattttatt cataataccc attgattgc 59
Claims (16)
- 하기 군 A1) 내지 D1)으로부터 선택된 서열을 갖는 단리된 핵산:
A1) 아세틸 조효소 A 3개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 서열 1에 따른 서열,
B1) 상기 A1)에 따른 서열로부터 유래되고, 서열 1에 따른 서열과 동일한 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 인트론-무함유 서열,
C1) 서열 2에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 아세틸 조효소 A 3개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열, 및
D1) 상기 군 A1) 내지 C1) 중 하나에 따른 서열에 대한 상보적 서열. - 하기 군 A2) 내지 D2)로부터 선택된 서열을 갖는 단리된 핵산:
A2) 아세틸 조효소 A 1개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 서열 3에 따른 서열,
B2) 상기 A2)에 따른 서열로부터 유래되고, 서열 3에 따른 서열과 동일한 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 인트론-무함유 서열,
C2) 서열 4에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 아세틸 조효소 A 1개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열, 및
D2) 상기 군 A2) 내지 C2) 중 하나에 따른 서열에 대한 상보적 서열. - 야생형과 비교하여 효소 E1 및 E2 중 적어도 하나의 변형된 활성을 나타내도록 유전자 변형된 것을 특징으로 하는 세포이며, 여기서
효소 E1은 서열 2의 폴리펩티드 서열을 갖고, 여기서 효소 E1에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A 3개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되고,
효소 E2는 서열 4의 폴리펩티드 서열을 갖고, 여기서 효소 E2에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A 1개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되는 것인
세포. - 제3항에 있어서, 야생형과 비교하여 효소 E1 및 E2 중 적어도 하나의 증가된 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제3항에 있어서, 야생형과 비교하여 효소 E1 및 E2 둘 다의 증가된 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 시페리이(Pichia ciferrii), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 및 아시비아 고시피이(Ashbya gossypii)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 세포가 사용되는 것을 특징으로 하는, 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다의 생산 방법.
- 제6항에 따른 세포가 사용되는 것을 특징으로 하는, 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다의 생산 방법.
- a) 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 세포를 탄소원을 함유하는 배지와 접촉시키는 공정 단계, 및
b) 세포가 탄소원으로부터 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다를 형성할 수 있게 하는 조건 하에 세포를 배양하는 공정 단계
를 포함하는, 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다를 생산하는 방법. - a) 제6항에 따른 세포를 탄소원을 함유하는 배지와 접촉시키는 공정 단계, 및
b) 세포가 탄소원으로부터 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다를 형성할 수 있게 하는 조건 하에 세포를 배양하는 공정 단계
를 포함하는, 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다를 생산하는 방법. - 제9항에 있어서,
c) 형성된 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다를 단리시키는 공정 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제10항에 있어서,
c) 형성된 스핑고이드 염기 또는 스핑고지질 또는 둘 다를 단리시키는 공정 단계
를 추가로 포함하는 방법. - A) 효소 E1 또는 E2 중 적어도 하나를, 1급 지방족 아민 및 아세틸 CoA를 함유하는 배지와 접촉시키는 공정 단계이며, 여기서
효소 E1은 서열 2의 폴리펩티드 서열을 갖고, 여기서 효소 E1에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A 3개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 피토스핑고신을 트리아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되고,
효소 E2는 서열 4의 폴리펩티드 서열을 갖고, 여기서 효소 E2에 대한 효소적 활성은 아세틸 조효소 A 1개 분자로부터의 아세틸 잔기의 전달에 의해 트리아세틸피토스핑고신을 테트라아세틸피토스핑고신으로 전환하는 능력을 의미하는 것으로 해석되는 것인 공정 단계
를 포함하는, N-아세틸화 1급 지방족 아민을 생산하는 방법. - 제13항에 있어서, 상기 1급 지방족 아민이 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 것으로부터 선택된 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 1급 지방족 아민이 선형인 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
B) 형성된 아세틸화 아민을 단리시키는 공정 단계
를 추가로 포함하는 방법.
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