CN104220592B

CN104220592B - 来自威克汉姆西弗酵母(wickerhamomyces ciferrii)的乙酰转移酶

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Publication number: CN104220592B
Application number: CN201380018786.3A
Authority: CN
Inventors: S·沙费尔; M·法尔维克; H·安德烈埃; T·克勒; D·沃尔夫; F·特尔费尔德; A·珀奇; E·博尔斯; C·朔尔施
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2017-06-27
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: WO2013152913A1; DE102012007491A1; KR101934615B1; KR20140143779A; US9388439B2; EP2836592B1; US20150118721A1; EP2836592A1; CN104220592A

Abstract

本发明涉及提供乙酰化鞘氨醇碱的新型酶。

Description

来自威克汉姆西弗酵母(WICKERHAMOMYCES CIFERRII)的乙酰转移酶

发明领域

本发明的主题是提供乙酰化鞘氨醇碱的新型酶。

现有技术

自从60年代开始已经使用西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)来生产鞘氨醇碱和鞘脂。

来自野生型株的鞘氨醇碱和鞘脂的产量一直需要提高。

鞘氨醇碱，特别是植物鞘氨醇，鞘氨醇和二氢鞘氨醇，在作为美容活性物质的各种用途中使用，以保护和护理皮肤。它们被直接掺入美容护理产品，或在化学转化为皮肤相似的神经酰胺后掺入美容护理产品。

非常规酵母西弗毕赤酵母的特征在于，它在培养基中分泌相对大量的乙酰化鞘氨醇碱，主要是四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)和三乙酰基鞘氨醇(TriASa)。通过提取操作可以从培养肉汤中提取形成的TAPS，然后将其化学转化为游离植物鞘氨醇和各种神经酰胺。

有效的乙酰化是将鞘氨醇碱转运至培养基的基本要求；对微粒体部分的酶测试已经证明，与低产株相比，具有乙酰化鞘氨醇碱高产量的那些菌株(高产株)显示显著增加的特异性乙酰转移酶活性(Barenholz等人，1971；Barenhoz等人，1973)。因此这种酶活性可以被鉴定为各种西弗毕赤酵母菌株有效生产乙酰化鞘氨醇碱的主要原因之一。

迄今为止，所有纯化、表征和鉴定这种酶的努力均告失败，因此所述蛋白和相应基因都是未知的。

本发明的目的是提供能够乙酰化鞘氨醇碱的酶及其编码序列。

发明描述

出人意料的，已经发现下文所述的酶能够解决本发明遇到的问题。

因此本发明的主题是如权利要求所述的编码乙酰转移酶的分离的核酸。

本发明的另一主题是显示本发明酶的修饰活性的重组细胞。

本发明描述的乙酰转移酶以及编码它们的DNA序列提供大量优点。它们可以用于生物工程化和高度特异的在各种功能团(羟基和氨基)上乙酰化指定的底物(鞘氨醇碱)。与化学乙酰化步骤相比，产生的副产品更少，因此可以将产量损失和费力的纯化步骤降到最低。因此本发明具有巨大的潜力，尤其是对于需要高产品纯度的应用而言。尤其在美容、食品和奢侈消费品以及药品方面，特别高的产品纯度是必需的，这样的话本发明具有特别巨大的潜力。可以按照基本上不同的两种方式利用本发明实现乙酰化鞘氨醇碱的生物技术生产：第一种，可以利用生物催化方法实现生产，其中在合适的反应器中通过添加乙酰转移酶将所选鞘氨醇碱酶促乙酰化。第二种，可以通过基因工程方法(代谢工程化)使用乙酰转移酶基因产生重组微生物菌株，其能够在发酵过程中从简单的碳源和氮源直接合成乙酰化鞘氨醇碱。与化工方法相比，发酵方法是更低廉并且生态上更持久。此外，它是立体特异的，而这在化学全合成中是得不到保证的。

只需利用本发明所述的乙酰转移酶之一或其基因，可以特异性产生不完全乙酰化的鞘氨醇碱。这些可以具有特定的生物学效应，因此可用于特定应用，例如作为美容或药物活性物质或其前体。不完全乙酰化的鞘氨醇碱只能极度费力的通过化学法制备，因此生物技术方法具有相当大的成本优势。

除非另有说明，所述的所有百分比(％)都是质量百分比。

通过一种分离的核酸(其具有选自组[A1到G1]的序列)来提供所述问题的解决方案。

A1)Seq ID No.1所示序列，其中所述序列编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白，

B1)无内含子的序列，其来源于A1)所示序列，并与Seq ID No.1所示序列编码相同的蛋白或肽，

C1)编码蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽包括Seq ID No.2所示序列并通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇，

D1)与组A1)到C1)之一所示序列、尤其优选组A1)所示序列具有至少70％、尤其优选至少90％、仍然更优选至少95％和最优选至少99％同一性的序列，其中所述序列编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，

E1)与组A1)到D1)之一所示序列、尤其优选组A1)所示的序列的互补链杂交或考虑到遗传密码的简并性将与其杂交的序列，其中所述序列编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，

F1)组A1)到E1)之一所示序列、尤其优选组A1)所示序列的衍生物，通过取代、添加、倒置和/或缺失至少1个碱基、优选至少2个碱基、仍然更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但优选不超过100个碱基、尤其优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基而获得，其中所述衍生物编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，

G1)组A1)到F1)之一所示序列、尤其优选组A1)所示序列的互补序列。

通过一种分离的核酸(其具有选自组[A2到G2]的序列)来提供所述问题的另一解决方案。

A2)Seq ID No.3所示序列，其中所述序列编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白，

B2)无内含子的序列，其来源于A2)所示序列并与Seq ID No.3所示序列编码相同的蛋白或肽，

C2)编码蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽包括Seq ID No.4所示序列并通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇，

D2)与组A2)到C2)之一所示序列、尤其优选组A2)所示序列具有至少70％、尤其优选至少90％、仍然更优选至少95％和最优选至少99％同一性的序列，其中所述序列编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，

E2)与组A2)到D2)之一所示的序列、尤其优选组A2)所示的序列的互补链杂交或考虑到遗传密码的简并性将与其杂交的序列，其中所述序列编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，

F2)组A2)到E2)之一所示序列、尤其优选组A2)所示序列的衍生物，通过取代、添加、倒置和/或缺失至少1个碱基、优选至少2个碱基、仍然更优选至少5个碱基和最优选至少10个碱基、但优选不超过100个碱基、尤其优选不超过50个碱基和最优选不超过25个碱基而获得，其中所述衍生物编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，

G2)组A2)到F2)之一所示序列、尤其优选组A2)所示序列的互补序列。

“核苷酸同一性”或“氨基酸同一性”通过已知方法来确定。通常使用专门的计算机程序(利用考虑具体要求的算法)。

用于确定同一性的优选方法首先在待比较的序列之间产生最大匹配。用于确定同一性的计算机程序包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Deveroy,J.等人，Nucleic AcidResearch 12(1984),第387页,Genetics Computer Group University of Wisconsin,Medicine(Wi)，以及BLASTP,BLASTN和FASTA(Altschul,S.等人，Journal of MolecularBiology 215(1990),第403-410页)。BLAST程序可以获自国立生物技术信息中心(NationalCenter For Biotechnology Information(NCBI))和其他来源(BLAST Handbuch,AltschulS.等人，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul S.等人，上文)。

还可以使用公知的Smith-Waterman算法来确定核苷酸同一性。

利用BLASTN程序(Altschul,S.等人，Journal of Molecular Biology 215(1990)，第403-410页)来确定“核苷酸同一性”的优选参数是：

上述参数是核苷酸序列比较的缺省参数。

GAP程序也适于使用上述参数。

利用BLASTP程序(Altschul,S.等人，Journal of Molecular Biology 215(1990)，第403-410页)来确定“氨基酸同一性”的优选参数是：

上述参数是氨基酸序列比较的缺省参数。

GAP程序也适于使用上述参数。

根据本发明，根据上述算法的60％的同一性表示60％同一性。这适用于更高的同一性。

特性“与序列的互补链杂交或考虑到遗传密码的简并性将与序列的互补链杂交的序列”表示，在优选的严谨条件下与参照序列的互补链杂交或考虑到遗传密码的简并性将与参照序列的互补链杂交的序列。例如，在68℃2xSSC中或根据Boehringer的地高辛标记试剂盒的方案(Mannheim)进行杂交。优选的杂交条件例如在65℃如下缓冲液中温育过夜：7％SDS，1％BSA，1mM EDTA和250mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)，继之以在65℃用2xSSC；0.1％SDS洗涤。

根据本发明分离的DNA衍生物(其根据选择性的F1)或F2))可以通过根据组A1)到E1)和A2)到E2)之一所示序列的一或多个碱基的取代、添加、倒置和/或缺失来获得，特别包括在它们编码的蛋白中导致保守氨基酸置换的那些序列，诸如例如丙氨酸置换甘氨酸或谷氨酸置换天冬氨酸。这种功能中性突变被称作有义突变，不导致多肽活性的实质变化。此外，已知在多肽N和/或C端的变化不显著影响其功能或甚至可以使其稳定，因此本发明还包括对应的DNA序列，其中碱基在序列的3'端或5'端与本发明的核酸连接。本领域技术人员尤其可以在Ben-Bassat等人(Journal of Bacteriology169:751-757(1987))，O'Regan等人(Gene 77:237-251(1989))，Sahin-Toth等人(Protein Sciences 3:240-247(1994))，Hochuli等人(Bio/Technology6:1321-1325(1988))和公知的遗传学和分子生物学教科书中找到与其有关的信息。

根据本发明的核酸优选是载体，特别是表达载体或基因过表达盒。可能的载体是本领域技术人员已知的通常用于将DNA导入宿主细胞的全部载体。这些载体可以自主复制，因为它们具有复制起点，诸如例如2μ质粒或ARS(autonomously replicating sequence，自主复制序列)的复制起点，或整合入染色体(非复制质粒)。载体还应理解为表示不具有复制起点的线性DNA片段，诸如例如基因插入或基因过表达盒。基因过表达盒通常由标记物、待过表达的基因以及与基因表达有关的调节区(诸如例如启动子和终止子)组成。任选地，基因过表达盒还可以包括特定的DNA序列，其通过同源重组机制能够靶向整合入宿主基因组。根据基因过表达盒的结构，这些可优选以单个或多个形式整合入宿主基因组。

优选的载体选自包括质粒和盒的组中，诸如例如大肠杆菌-酵母穿梭质粒，并且表达载体、基因插入或基因过表达盒是尤其优选的。

最初所述问题的解决方案由如下所述的细胞解决，所述细胞可以有利地用于产生乙酰化鞘氨醇碱基，特别是乙酰化植物鞘氨醇。根据本发明的细胞可以例如在生物转化中与外源制备的鞘氨醇碱基接触，然后细胞通过它们的酶装置将其乙酰化，或使用本身已经产生待乙酰化的鞘氨醇碱基的细胞作为起始菌株以产生根据本发明的细胞。

因此本发明的一个主题是一种细胞，优选分离的细胞，其特征在于它已经被遗传修饰，因此与其野生型相比，它具有酶E₁和/或E₂中至少一种的修饰活性，其中酶E₁选自

酶E₁，具有Seq ID No.2的多肽序列，或与参照序列Seq ID No.2相比，其中直至25％、优选直至20％、尤其优选直至15％、特别是直至10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照序列Seq ID No.2的酶的至少10％、优选50％、尤其优选80％、特别是超过90％的酶活性的多肽序列，其中酶E₁的酶活性旨在表示通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的能力，

和酶E₂选自

酶E₂，具有Seq ID No.4的多肽序列，或与参照序列Seq ID No.4相比，其中直至25％、优选直至20％、尤其优选直至15％、特别是直至10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照序列Seq ID No.4的酶的至少10％、优选50％、尤其优选80％、特别是超过90％的酶活性的多肽序列，其中酶E₂的酶活性旨在表示通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的能力。

本文中，“野生型”表示其基因组以进化过程中天然产生状态存在的细胞。该术语用于全细胞以及单个基因。因此具体来说术语“野生型”不包括其基因序列被人为通过重组方法至少部分修饰的那些细胞或那些基因。

优选修饰的活性是增加的活性。术语“酶增加的活性”应当优选理解为增加的胞内活性。

本领域技术人员显而易见的是，关于术语“与其野生型相比修饰的(增加或降低的)活性”，比较处于相同或类似状态(例如关于生长期，培养时间和培养相)的细胞或细胞群。

现在致力于增加细胞中酶活性的说明既用于增加酶E₁到E₂的活性，还用于下文提及的所有酶，如果需要其活性可以增加。

实质上，酶活性的增加可以通过以下方式实现：增加编码酶的基因序列的拷贝数，使用强启动子或改进的核糖体结合位点，减弱基因表达的负调节，例如利用转录调节因子，或增强基因表达的正调节，例如利用转录调节因子，改变基因的密码子使用，以多种方式增加mRNA或酶的半衰期，改变基因表达的调节或使用编码具有增加活性的对应酶的基因或等位基因，以及任选组合这些措施。根据本发明遗传修饰的细胞例如通过以下方法产生：利用载体进行转化、转导、接合(conjugation)或这些方法的组合，所述载体包含所需基因、该基因的等位基因或其部分和任选存在的能使所述基因表达的启动子。异源表达具体来说通过将基因或等位基因整合入细胞染色体或染色体外复制载体来实现。

就丙酮酸羧化酶来说，关于增加细胞中酶活性的可能性的概述在DE-A-100 31999中给出，因此将其引入作为参考，其关于增加细胞中酶活性的可能性的公开内容构成本发明内容的一部分。

上文提及和所有下文提及的酶和基因的表达在凝胶中都是可检测的，通过1维和2维蛋白凝胶分离继之以利用适当鉴定软件的蛋白浓度光学鉴定。当酶活性的增加仅仅基于增加相应基因的表达时，则酶活性增加的定量可以仅仅通过比较野生型和遗传修饰细胞之间的1维或2维蛋白分离来确定。就棒状杆菌来说，用于制备蛋白凝胶和鉴定蛋白的常用方法是Hermann等(Electrophoresis,22:1712-23(2001))描述的步骤。此外蛋白浓度可以通过以下方法鉴定：利用对待检测的蛋白特异的抗体进行Western印迹杂交(Sambrook等人,Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)，随后利用用于浓度测定的合适软件进行光学鉴定(Lohaus and Meyer(1989)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,Angewandte Chemie111:2630-2492(1999))。DNA结合蛋白的活性可以通过DNA带迁移测定法(也描述为凝胶阻滞)来测量(Wilson等人(2001)Journal of Bacteriology,183：2151-2155)。还可以通过各种详尽描述的报告基因测定法(Sambrook等人,Molecular cloning:a laboratorymanual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)检测DNA结合蛋白对其他基因表达的影响。可以通过各种描述的方法(Donahue等人(2000)Journal of Bacteriology 182(19):5624-5627；Ray等人(2000)Journal ofBacteriology 182(8):2277-2284；Freedberg等人(1973)Journal of Bacteriology 115(3):816-823)测定胞内酶活性。如果在下面说明中没有提及用于测定某一酶活性的特异性方法，优选通过下列描述的方法测定酶活性的增加以及测定酶活性的降低：Hermann等人，Electophoresis,22:1712-23(2001)，Lohaus等人，Biospektrum5 32-39(1998),Lottspeich,Angewandte Chemie 111:2630-2647(1999)和Wilson等人，Journal ofBacteriology 183:2151-2155(2001)。

如果酶活性的增加受到内源基因突变的影响，则这种突变可以通过传统方法非定向产生，诸如例如通过紫外线照射或诱变化学剂，或通过基因工程方法诸如缺失、插入和/或核苷酸取代特异性产生。通过这些突变，获得修饰的细胞。尤其优选的酶突变体具体来说是与野生型酶相比，那些不再或至少更低反馈-抑制性、产物-抑制性或底物-抑制性的酶。

如果酶活性的增加受到酶合成增加的影响，则例如相关基因的拷贝数增加或启动子和调节区或位于结构基因上游的核糖体结合位点被突变。掺入结构基因上游的表达盒具有类似的效果。此外，通过诱导型启动子有可能在任意所需时间增加表达。但是，此外，所谓的“增强子”还可以被指定为作为酶基因的调节序列，其通过改进RNA聚合酶和DNA之间的相互作用同样实现增加的基因表达。通过延长mRNA生存期的措施也可以提高表达。此外，通过阻止酶蛋白降解也可以加强酶活性。在本文中，基因或基因构建体存在于不同拷贝数的质粒中，或整合入染色体并在必要时扩增。此外，可选地，通过改变培养基组合物和培养条件可以实现相关基因的过表达。本领域技术人员尤其可以在下列文献中发现所述方法的指导：Martin等人(Bio/Technology 5,137-146(1987))，Guerrero等人(Gene 138,35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))，Eikmanns 等人(Gene102,93-98(1991))，EP-A-0472869，US 4,601,893，Schwarzer and Pühler(Bio/Technology 9,84-87(1991)，Reinscheid等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60,126-132(1994))，LaBarre等人(Journal of Bacteriology 175,1001-1007(1993))，WO-A-96/15246，Malumbres等人(Gene134,15-24(1993))，JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))以及公知的遗传学和分子生物学教科书。如上所述的措施(像突变)也导致遗传修饰的细胞。

为了增加特定基因的表达，使用例如附加型或整合型质粒。原则上，作为质粒或载体，本领域技术人员可获得的用于所述目的的所有实施方案都是可能的。这种质粒和载体例如可以来自Novagen，Promega，New England Biolabs，Clontech或Gibco BRL的手册。进一步优选的质粒和载体可见于：Glover,D.M.(1985)DNA cloning:a practical approach,Vol.I-III,IRL Press Ltd.,Oxford；Rodriguez,R.L.和Denhardt,D.T(eds)(1988)Vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham；Goeddel,D.V.(1990)Systems for heterologous geneexpression,Methods Enzymol.185,3-7；and Sambrook,J.；Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York。

然后通过接合或转化将包含待扩增基因的质粒载体转移入所需菌株。接合方法例如描述于等人，Applied and Environmental Microbiology60:756-759(1994)。转化方法例如描述于Schorsch等人，Current Genetics55(4):381-389(2009),Thierbach等人，Applied Microbiology and Biotechnology 29:356-362(1988),Dunican andShivnan,Bio/Technology 7:1067-1070(1989)和Tauch等人，FEMS Microbiology Letters123:343-347(1994)。就整合型质粒或线性基因过表达盒来说，它们被异位(非同源)或通过同源重组机制特异性(“交换(crossing over)”)整合入宿主菌株的基因组。根据质粒或基因过表达盒的确切结构以及特定重组事件，所获菌株包含目标基因的一个或数个拷贝。

在上文和下面说明中使用的表述“与其野生型相比酶Ex的活性增加”将优选总是旨在表示特定酶Ex的活性增加至少2倍，尤其优选至少10倍，仍然更优选至少100倍，仍然更优选至少1,000倍和最优选至少10,000倍。此外，根据本发明的具有“与其野生型相比酶Ex的活性增加”的细胞具体来说还包括下述细胞，其野生型没有或至少没有所述酶Ex的可检测活性，并且只有在酶活性增加(例如通过过表达)后才显示所述酶的可检测活性。就此而论，在下面说明中使用的术语“过表达”或措词“表达的增加”还包括以下情况：起始细胞，例如野生型细胞，不显示或至少不显示酶Ex的可检测表达和可检测合成，这只被重组方法所诱导。

不导致指定多肽的性质和功能显著变化的指定多肽序列的氨基酸残基改变是本领域技术人员公知的。因此例如所谓的保守氨基酸可以彼此替换，所述合适氨基酸取代的实例是：Ser替换Ala；Lys替换Arg；Gln或His替换Asn；Glu替换Asp；Ser替换Cys；Asn替换Gln；Asp替换Glu；Pro替换Gly；Asn或Gln替换His；Leu或Val替换Ile；Met或Val替换Leu；Arg或Gln或Glu替换Lys；Leu或Ile替换Met；Met或Leu或Tyr替换Phe；Thr替换Ser；Ser替换Thr；Tyr替换Trp；Trp或Phe替换Tyr；和Ile或Leu替换Val。同样，已知尤其在多肽N或C末端的改变(例如采用氨基酸插入或缺失的形式)通常对多肽功能没有显著影响。

酶E₁活性按照以下描述测定：Barenholz和Gatt,The Journal of BiologicalChemistry 247(21):6827-6833(1972)，其中使用植物鞘氨醇作为底物，并测量与参照系统(除了“包含具有Seq ID No.2的酶作为酶E₁”之外都相同)相比的植物鞘氨醇乙酰化。

酶E₂活性按照以下描述测定：Barenholz和Gatt,The Journal of BiologicalChemistry 247(21):6827-6833(1972)，其中使用三乙酰植物鞘氨醇作为底物，并测量与参照系统(除了“包含具有Seq ID No.4的酶作为酶E₂”之外都相同)相比的三乙酰植物鞘氨醇乙酰化。

根据本发明优选的细胞显示酶E₁和E₂二者活性的加强。

在本发明一个优选的替代中，为了产生三乙酰基植物鞘氨醇和二乙酰化鞘氨醇碱二乙酰基鞘氨醇，二乙酰基二氢鞘氨醇，二乙酰基-6-羟基鞘氨醇和二乙酰基神经鞘二烯(diacetyl sphingadienine)，可以使用与其野生型相比酶E₂活性降低的细胞。就此而论，酶E₂活性降低而酶E₁活性增加的细胞是特别有用的。

根据本发明优选的细胞是微生物，特别是酵母或细菌，其中优选的酵母细胞特别选自以下属：酿酒酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母属(Pichia)，子囊菌酵母属(Yarrowia)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，汉逊酵母属(Hansenula)，棉阿舒囊霉属(Ashbya)和假丝酵母属(Candida)，其中以下种是尤其优选的：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)，粉状毕赤酵母(Pichia pastoris)，西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)，解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)，白色念珠菌(Candida albicans)，实用假性酵母(Candida utilis)和棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)。

如果用于产生本发明的细胞，根据本发明尤其优选使用已经具有高鞘氨醇碱滴度的起始菌株；因此本发明优选的细胞特别来源于WO2006048458，WO2007131720和DE102011110959.9描述的细胞以及选自以下组的菌株：西弗毕赤酵母NRRL Y-1031F-60-10(Wickerham和Stodola,Journal of Bacteriology 80:484-491(1960)，在WO 95/12683的实施例中公开的西弗毕赤酵母菌株，和描述于Schorsch等人(2009,Curr Genet.55,381-9)的西弗毕赤酵母CS.PCΔPro2。

通过使用本发明的细胞来生产鞘氨醇碱和/或鞘脂提供解决本发明问题的另一方案。

根据本发明，术语“鞘氨醇碱”应当旨在表示植物鞘氨醇，鞘氨醇，神经鞘二烯，6-羟基鞘氨醇和二氢鞘氨醇(二氢神经鞘氨醇)，还采用乙酰化形式，诸如例如四乙酰基植物鞘氨醇，三乙酰基植物鞘氨醇，二乙酰基植物鞘氨醇，O-乙酰基植物鞘氨醇，三乙酰基鞘氨醇，二乙酰基鞘氨醇，O-乙酰基二氢鞘氨醇，三乙酰基鞘氨醇，二乙酰基鞘氨醇，O-乙酰基鞘氨醇，四乙酰基-6-羟基鞘氨醇，三乙酰基-6-羟基鞘氨醇，二乙酰基-6-羟基鞘氨醇，O-乙酰基-6-羟基鞘氨醇，三乙酰基神经鞘二烯，二乙酰基神经鞘二烯和O-乙酰基神经鞘二烯。

根据本发明，术语“鞘脂”应当旨在表示包括通过酰胺键与脂肪酸共价连接的鞘氨醇碱的化合物。脂肪酸可以是饱和的，或单不饱和的或多不饱和的。脂肪酸侧链的长度可以不同。脂肪酸侧链还可以具有功能团诸如羟基。鞘脂包括例如植物神经酰胺，神经酰胺和二氢神经酰胺，以及更复杂的葡糖苷酰鞘氨醇(脑苷脂类)和肌醇磷酰基神经酰胺，甘露糖基-肌醇磷酰基神经酰胺和甘露糖基双-肌醇磷酰基神经酰胺。本文中鞘脂还包括通过酰胺键与乙酰残基连接的鞘氨醇碱，诸如例如N-乙酰基植物鞘氨醇，N-乙酰基二氢鞘氨醇，N-乙酰基鞘氨醇，N-乙酰基-6-羟基鞘氨醇和N-乙酰基神经鞘二烯。这些化合物还被称为短链神经酰胺。

具体来说本发明的细胞用于产生鞘氨醇碱和/或鞘脂的用途是有益的，所述鞘氨醇碱和/或鞘脂选自：植物鞘氨醇，鞘氨醇，6-羟基鞘氨醇，二氢鞘氨醇(二氢神经鞘氨醇)，四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)，三乙酰基植物鞘氨醇，二乙酰基植物鞘氨醇，O-乙酰基植物鞘氨醇，N-乙酰基植物鞘氨醇，三乙酰基鞘氨醇(TriASa)，二乙酰基鞘氨醇，O-乙酰基二氢鞘氨醇，N-乙酰基二氢鞘氨醇，三乙酰基鞘氨醇(TriASo)，二乙酰基鞘氨醇，O-乙酰基鞘氨醇，N-乙酰基鞘氨醇，四乙酰基-6-羟基鞘氨醇，三乙酰基-6-羟基鞘氨醇，二乙酰基-6-羟基鞘氨醇，O-乙酰基-6-羟基鞘氨醇，N-乙酰基-6-羟基鞘氨醇，三乙酰基神经鞘二烯，二乙酰基神经鞘二烯，O-乙酰基神经鞘二烯和N-乙酰基神经鞘二烯。相当特别优选的是本发明的细胞用于产生四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)的用途。

本发明一个优选的用途根据本发明其特征在于，使用如上所述的本发明优选的细胞。

通过包括以下处理步骤的生产鞘氨醇碱和/或鞘脂的方法提供解决本发明问题的另一方案：

a)将本发明的细胞与包含碳源的培养基接触，

b)在使细胞能够从碳源形成鞘氨醇碱基和/或鞘脂的条件下培养细胞，和

c)任选地，分离形成的鞘氨醇碱基和/或鞘脂。

根据本发明优选的方法使用上文提及的作为本发明优选的细胞。

作为碳源，使用碳水化合物诸如例如葡萄糖，果糖，甘油，蔗糖，麦芽糖和糖蜜，以及醇诸如例如乙醇，有机酸诸如例如乙酸。作为氮源，可以使用例如氨，硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，有机氮化合物(诸如酵母提取物，麦芽浸膏，蛋白胨，和玉米浆)。此外，可以使用无机化合物诸如例如磷酸盐，镁，钾，锌和铁盐等等。

本领域技术人员已知对于西弗毕赤酵母来说，能够使细胞从碳源形成鞘氨醇碱和/或鞘脂的合适培养条件，例如来自WO2006048458和WO2007131720。本领域技术人员无需实验就可以将这些条件应用于其他细胞类型。

本发明的方法尤其适用于产生四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)，特别是当使用显示酶E₁和E₂活性均加强的细胞时。

所述酶还可以有利地用于具有6到18个C原子的脂肪族伯胺(诸如例如十六烷基胺)的氨基的乙酰化。

因此本发明的另一主题是用于生产N-乙酰化脂肪族伯胺的方法，包括以下处理步骤：

A)将酶E₁或E₂中的至少一种与包含脂肪族伯胺和乙酰辅酶A的培养基接触，所述脂肪族伯胺特别是选自具有6到18个碳原子的那些，其优选是线性的，其中酶E₁选自，

酶E₁，具有Seq ID No.2的多肽序列，或与参照序列Seq ID No.2相比，其中直至25％、优选直至20％、尤其优选直至15％、具体来说直至10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照序列Seq ID No.2的酶至少10％、优选50％、尤其优选80％、特别是超过90％的酶活性的多肽序列，其中酶E₁的酶活性旨在表示通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的能力，

和酶E₂选自

酶E₂，具有Seq ID No.4的多肽序列，或与参照序列Seq ID No.4相比，其中直至25％、优选直至20％、尤其优选直至15％、特别是直至10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照序列Seq ID No.4的酶的至少10％、优选50％、尤其优选80％、特别是超过90％的酶活性的多肽序列，其中酶E₂的酶活性旨在表示通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的能力，

和

B)任选地，分离形成的乙酰化胺。

本发明优选的方法优选使用根据本发明上文提及的分离的和/或重组产生的酶和/或细胞作为酶E₁和/或E₂。

在下面展示的实施例中，本发明通过举例来进行描述，无意表示来自整个说明书和权利要求书的本发明被限制在实施例所提及的实施方案中。

实施例：

酵母酿酒酵母菌株K26中PcSLI1的过表达

为了在酿酒酵母菌株K26中过表达PcSLI1，首先将PcSLI1-ORF克隆入2μ载体p426HXT7-6HIS(Hamacher等人Microbiology 148:2783-2788(2002),(Seq ID No.6))。为此，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增PcSLI1-ORF。首先，通过改进的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)方法(Murray和Thompson；Nucleic Acids Res 8,4321-4325(1980))从西弗毕赤酵母分离基因组DNA。为此，收集在YEPD液体培养基(1％w/v酵母提取物，1％w/v蛋白胨，2％w/v葡萄糖)(≥2ml，OD_600nm>1)中生长的细胞培养物，重悬于400μl CTAB缓冲液[2％(w/v)CTAB,100mM Tris-HCl(pH 8.0),20mM EDTA,1.4M NaCl]，利用200μl玻璃珠处理，并于4℃“在Vibrax VXR basic”(2200rpm)中粉碎8分钟。随后，将制备物在65℃温育30分钟。在添加1体积的氯仿继之以匀浆10秒后，将制备物在16,000g离心5分钟。取出包含DNA的上清液，在-20℃用0.7体积的异丙醇沉淀DNA至少30分钟。然后，在16,000g和4℃离心15分钟，用70％冰冷的乙醇清洗沉淀物，干燥并重悬于50μl H₂O。

然后利用基因组西弗毕赤酵母DNA作为模板和两种寡核苷酸SLI1.HXT7.fw(SeqID No.11)和SLI1.CYC1.rv(Seq ID No.12)实现PcSLI1-ORF的PCR扩增。此处使用的引物在5'端具有与靶载体的整合区域同源的区域。在酿酒酵母中，这些同源末端使得线性化载体和PCR片段之间发生同源重组，以便产生可以在体内增殖的环化质粒。作为DNA聚合酶，按照制造商的指导使用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Finnzymes)。对于扩增，选择下列温度模式：步骤1：98℃，2分钟(变性)；步骤2：98℃，15秒(变性)；步骤3：60℃，25秒(退火)；步骤4：72℃，80秒(延伸)；步骤5：72℃，5分钟(延伸)。步骤2-4重复35次。在琼脂糖凝胶电泳后，根据制造商的说明书，使用“Extract II”凝胶提取试剂盒(Macherey-Nagel)纯化所获1.4kb PCR片段。

根据制造商的说明书，用BamHI/EcoRI消化质粒p426HXT7-6HIS(Seq ID No.6)。在琼脂糖凝胶电泳后，根据制造商的说明书，还使用"Extract II"凝胶提取试剂盒(Macherey-Nagel)纯化所获6.3kb载体片段。

使用酿酒酵母的体内重组将PCR扩增的PcSLI1-ORF克隆入BamHI/EcoRI切割的载体。基本方法描述于Oldenburg等人(Nucleic Acids Res 25:451-452(1994))。将两种纯化的DNA片段一起转化酿酒酵母CEN.PK113-13D(K26，在此期间遵循Gietz和Schiestl(NatProtoc 2:31-34(2007))的方案。然后将细胞种在合成基本培养基(0.16％w/v酵母氮碱，0.5％w/v硫酸铵，2％w/v葡萄糖，2％w/v琼脂)上。从而可以选择转化体，基于DNA片段与线性化载体的同源重组所述转化体具有稳定的环化质粒。然后从酵母克隆分离质粒。为此，收集在合成基本培养基上生长的2ml细胞培养物(OD_600nm>1)，洗涤并重悬于400μl缓冲液1[50mM葡萄糖；10mM EDTA(Titriplex III)；25mM Tris-HCl(pH 8)；RNase A(100μg/ml)]。在添加400μl缓冲液2(0.2M NaOH；1％SDS)并小心混合后，添加大约2/3体积的玻璃珠(0.25-0.5mm O)，并于4℃在“Vibrax VXR basic”以2200rpm将细胞粉碎8分钟。将500μl上清液与250μl缓冲液3[5M醋酸钾(pH 5.5)]混合，在冰上温育10分钟，并在16,000g离心5分钟。将上清液在-20℃用异丙醇按1:1比例沉淀至少30分钟，然后在16,000g离心20分钟。用70％乙醇(-20℃)清洗沉淀的DNA，并溶于50μl水。随后，根据Dower等人(Nucleic AcidsRes 16:6127-6145(1988))的电穿孔将质粒DNA转化入大肠杆菌。对于电穿孔，在下列条件下使用Gene电压：2-2.5kV；电阻：200Ω；电容：25μF。在添加40μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基(1％w/v胰蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v NaCl，2％琼脂，pH 7.5)中筛选转化体。为了从大肠杆菌分离质粒，37℃在添加40μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中将克隆于摇床中生长过夜，然后根据制造商的说明书使用GeneJET^TM质粒Miniprep试剂盒(Fermentas GmbH)。

然后通过限制性分析和测序表征质粒。PcSLI1-ORF正确整合入线性化载体产生7.6kb质粒pCS.426.SLI1(Seq ID No.7)，其中PcSLI1-ORF在缩短的HXT7^392-1启动子片段和来自酿酒酵母的CYC1终止子的控制下。这种排列使得PcSLI1在酿酒酵母中组成型过表达。

然后将质粒pCS.426.SLI1(Seq ID No.7)和对照质粒p426HXT7-6HIS(Seq IDNo.6)转化入酿酒酵母菌株K26，再次按照Gietz和Schiestl的方法(Nat Protoc 2:31-34(2007))。在合成基本培养基(0.16％w/v酵母氮碱，0.5％w/v硫酸铵，2％w/v葡萄糖，2％w/v琼脂)上再次筛选转化体。随后，在液体TAPS培养基[每升组成：33g一水合葡萄糖，20g苯二甲酸氢钾，4.83g氯化铵，1g酵母提取物，1g磷酸二氢钾，0.88g七水合硫酸镁，0.2g二水合氯化钙，60mg氯化钠，59mg肌醇，痕量元素[37.3mg六水合硫酸铵-铁(II)，7.5mg五水合硫酸铜(II)，5mg七水合硫酸锌，1.5mg碘化钾，0.6mg一水合硫酸锰(II)，0.6mg硼酸，0.6mg二水合钼酸钠]和维生素(3mg烟酸，3mg D-泛酸钙，3mg硫胺，2mg 4-氨基苯甲酸，0.3mg吡哆醇，10μg生物素)；pH 5.4]中培养转化体，以便研究PcSLI1过表达对生产乙酰化鞘氨醇碱的影响。在30℃200-250rpm的旋转摇动装置上需氧培养转化体。首先在5ml TAPS中培养细胞作为预培养物，达到稳定生长期时用于接种20ml TAPS medium(主要培养物)。

从0.1的OD_600nm开始主要培养物。为了通过LC-MS/MS分析乙酰化的鞘氨醇碱，取出达到稳定期的1ml培养肉汤样品，并保存于-20℃用于进一步处理。通过Bjerve等人的方法(Anal.Biochem.58:238-245(1974))提取脂质。为此，将20μl培养肉汤用10倍体积的正丁醇抽提。添加20ng奇数C17植物鞘氨醇，C17二氢鞘氨醇和氘标记的d₉三乙酰基鞘氨醇作为内标，并在70℃将样品充分混合。随后，样品在1000x g离心5分钟，取出10μl上清液，并用50/50％(v/v)甲醇/H₂O稀释10倍。

对于鞘脂的LC-MS/MS分析，使用Thermo Accela HPLC(Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,MA,USA)单位。注射的样品体积是5μl。使用的柱是反相Hypersil Gold C18柱，恒温于40℃(1.9μm颗粒；50x 2.1mm；#25002-052130；ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)，并通过Microbore Guard柱保护(NucleodurC18ISIS；3μm颗粒；5x 1mm；#717759；Macherey-Nagel,Dueren,Germany)。流动相具有200μl/min的流速，并由(A)含0.1％v/v甲酸和2％v/v乙腈的H₂O，和(B)含0.1％v/v甲酸的乙腈组成。最初用70％B 1分钟后，使用4-步梯度进行洗脱：1)1.5min内从70％B增加到94％；2)3.5mins内从94％B增加到100％；3)在3.5mins内维持100％B；4)从100％B降低到70％并维持2.5mins。按照阳性电离方式采用多反应监测(Multiple Reaction Monitoring(MRM))进行MS/MS分析。使用的质量转换和碰撞能量显示于表1。

表1.质量转换和碰撞能量。IS，内标(氘化或具有奇数链长的鞘脂)。使用粗体打印值作为限定值。

	前体离子(m/z)	产物离子(m/z)	碰撞能量(eV)
				二氢鞘氨醇	302.3	284.4/266.4	10/25
C17-二氢鞘氨醇IS	288.3	270.4/252.4	10/25
				植物鞘氨醇	318.3	300.4/286.4	11/25
C17-植物鞘氨醇IS	304.3	286.4/250.4	11/25
				三乙酰基鞘氨醇	428.3	368.4/266.4	10/25
三乙酰基植物鞘氨醇	444.3	384.4/264.4	10/25
				四乙酰基植物鞘氨醇	486.3	426.4/264.4	10/25
	437.3	374.4/266.4	10/25

装置设置如下：毛细管电压，3.5kV；毛细管温度，350℃，分块电压，10V；护套气压，5au(任意单位)；离子吹扫气压，0au；辅助气压，5au，S-透镜RF波幅，50V；碰撞能量，10-35eV；氩碰撞气压，1.0mTorr；周期长度，600msecs；四极1和3的分辨率是0.70(fwhm)。使用Xcalibur软件版本2.1(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)进行数据记录和分析。

PcSLI1表达对酿酒酵母中乙酰化鞘氨醇碱的产生的影响显示于表2。主要在二乙酰基鞘氨醇，三乙酰基鞘氨醇和三乙酰基植物鞘氨醇的情况下记录到显著增加的滴度，而形成的四乙酰基植物鞘氨醇数量与对照菌株相比没有变化。这明确指示PcSLI1蛋白只能将3个乙酰残基转移到植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇上。但是这种蛋白无法催化三乙酰基植物鞘氨醇最终乙酰化为四乙酰基植物鞘氨醇。

表2.在重组酿酒酵母菌株中生产乙酰化和游离的鞘氨醇碱。K26L，用对照质粒p426HXT7-6HIS转化的菌株酿酒酵母K26；K26SLI1，用PcSLI1过表达质粒pCS.426.SLI1转化的菌株酿酒酵母K26；Sa，二氢鞘氨醇；DiASa，二乙酰基鞘氨醇；TriASa，三乙酰基鞘氨醇；Ps，植物鞘氨醇；TriAPS，三乙酰基植物鞘氨醇；TAPS，四乙酰基植物鞘氨醇；值显示在发酵肉汤中测定的滴度(mg/l)。

	Sa	DiASa	TriASa	Ps	TriAPS	TAPS
							K26L	0.65	0	0.1	1.0	0	0.1
K26SLI1	0.4	1.5	0.7	0.6	1.4	0.1

PcSLI1和PcATF1在酿酒酵母菌株K26中的过表达

为了在酿酒酵母菌株K26中将植物鞘氨醇完全乙酰化为四乙酰基植物鞘氨醇，需要PcSLI1和PcATF1的同时过表达。为了过表达PcSLI1，使用质粒pCS.426.SLI1，其构建在之前的实施例中描述。为此使用的表达载体p426HXT7-6HIS(Seq ID No.6)载有酿酒酵母URA3标记基因。为了过表达PcATF1，必须首先将PcATF1-ORF克隆入载有选择性标记基因的合适表达载体。为此，使用质粒p425HXT7-6HIS(Becker和Boles；Appl Environ Microbiol 69:4144-4150(2003),(Seq ID No.5))，其载有酿酒酵母LEU2基因作为筛选标记物。

首先，通过PCR从基因组西弗毕赤酵母DNA扩增包括19bp PcATF1终止子的PcATF1-ORF。使用寡核苷酸ATF2-HXT.fw(Seq ID No.9)和ATF2-CYC.rv(Seq ID No.10)作为引物。用于此的引物在5'端具有与靶载体的整合区域同源的区域。在酿酒酵母中，这些同源末端使得线性化载体和PCR片段之间发生同源重组，以便产生可以在体内增殖的环化质粒。

按照制造商的说明书使用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Finnzymes)作为DNA聚合酶。对于扩增，选择下列温度模式：步骤1：98℃，2分钟(变性)；步骤2：98℃，15秒(变性)；步骤3：60℃，25秒(退火)；步骤4：72℃，80秒(延伸)；步骤5：72℃，5分钟(延伸)。步骤2-4重复35次。在SDS凝胶电泳后，根据制造商的说明书，使用"Extract II"凝胶提取试剂盒(Macherey-Nagel)纯化所获1.6kb PCR片段。

根据制造商的说明书，用BamHI/HindIII消化质粒p425HXT7-6HIS(Seq ID No.5)。在SDS凝胶电泳后，根据制造商的说明书，还使用"Extract II"凝胶提取试剂盒(Macherey-Nagel)纯化所获7.5kb载体片段。

使用酿酒酵母的体内重组将PCR扩增的PcSLI1-ORF克隆入BamHI/EcoRI切割的载体。基本方法描述于Oldenburg等人(Nucleic Acids Res 25:451-452(1994))。将两种纯化的DNA片段一起转化酿酒酵母菌株10480-2C(和Fink,Genetics 145:671-684(1997))，为此遵循Gietz和Schiestl(Nat Protoc 2:671-34(2007))的方案。然后将细胞种在添加20mg/l尿嘧啶的基本培养基(0.16％w/v酵母氮碱，0.5％w/v硫酸铵，2％w/v葡萄糖，2％w/v琼脂)上。从而可以选择转化体，因为DNA片段与线性化载体的同源重组所述转化体具有稳定的环化质粒。然后从酵母克隆分离质粒。为此，从在添加20mg/l盐酸L-组氨酸，20mg/l尿嘧啶和20mg/l L-色氨酸的合成基本培养基中生长的2ml培养物(OD_600nm>1)收集细胞，洗涤并重悬于400μl缓冲液1[50mM葡萄糖；10mM EDTA(Titriplex III)；25mM Tris HCl(pH 8)；RNase A(100μg/ml)]。在添加400μl缓冲液2(0.2M NaOH；1％SDS)并小心混合后，添加大约2/3体积的玻璃珠(0.25-0.5mm O)，并于4℃在“Vibrax VXR basic”上以2200rpm将细胞粉碎8分钟。将500μl上清液与250μl缓冲液3[5M醋酸钾(pH 5.5)]混合，在冰上温育10分钟，并在16,000g离心5分钟。将上清液在-20℃用异丙醇按1:1比例沉淀至少30分钟，然后在16,000g离心20分钟。用70％乙醇(-20℃)清洗沉淀的DNA，并溶于50μl水。随后，根据Dower等人(Nucleic Acids Res 16:6127-6145(1988))的电穿孔将质粒DNA转化入大肠杆菌。对于电穿孔，在下列条件下使用Gene电压：2-2.5kV；电阻：200Ω；电容：25μF。在添加40μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基(1％w/v胰蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v NaCl，2％琼脂，pH 7.5)中筛选转化体。为了从大肠杆菌分离质粒，将克隆在添加40μg/ml氨苄青霉素的5ml液体LB培养基中于37℃在摇床上培养过夜，然后根据制造商的说明书使用GeneJET^TM plasmid miniprep试剂盒(Fermentas GmbH)。

然后通过限制性分析和测序表征质粒。PcSLI1-ORF正确整合入线性化载体产生8.9kb质粒pCS.425.ATF1(Seq ID No.8)，其中PcATF1-ORF在缩短的HXT7^392-1启动子片段和来自酿酒酵母的CYC1终止子的控制下。这种排列使得PcATF1在酿酒酵母中组成型过表达。

为了PcSLI1和PcATF2的同时过表达，将两种质粒pCS.426.SLI1(Seq ID No.7)和pCS.425.ATF1(Seq ID No.8)共转化入酿酒酵母菌株10480-2C，再次遵循Gietz和Schiestl的方法(Nat Protoc 2:31-34(2007))。在合成基本培养基(0.16％w/v酵母氮碱，0.5％w/v硫酸铵，2％w/v葡萄糖，2％w/v琼脂)上筛选转化体。为了对比的目的，还将两种起始质粒p425HXT7-6HIS(Seq ID No.5)和p426HXT7-6HIS(Seq ID No.6)共转化入菌株RH2754。随后，在液体TAPS培养基中培养转化体，以便研究PcSLI1和PcATF1的同时过表达对产生乙酰化鞘氨醇碱的影响。在30℃200-250rpm的旋转振荡器上需氧培养转化体。首先在5ml TAPS中培养细胞作为预培养物，达到稳定生长期时用于接种20ml TAPS medium(主培养物)。

培养、样品处理以及用于测定乙酰化鞘氨醇碱产生的方法与先前的实施例类似的进行。

就用两种质粒pCS.426.SLI1和pCS.425.ATF1转化的酵母菌株而言，分析显示，与用两种对照质粒(p425HXT7-6HIS和p426HXT7-6HIS)转化的菌株相比，四乙酰基植物鞘氨醇的滴度显著增加。这是酿酒酵母中PcSLI1和PcATF1的同时过表达实现代谢产物植物鞘氨醇的完全乙酰化的确凿证据。

Claims

1.一种分离的核酸，其由选自组A1)到D1)的序列组成

B1)无内含子的序列，其来源于A1)所示序列并与Seq ID No.1所示序列编码相同的蛋白或肽，

C1)编码蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽由Seq ID No.2所示序列组成并通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇，

D1)组A1)到C1)之一所示序列的互补序列。

2.一种细胞，其特征在于它已经被遗传修饰，因此与其野生型相比，它显示酶E₁的修饰活性，其中酶E₁选自

酶E₁，由Seq ID No.2的多肽序列组成，其中酶E₁的酶活性旨在表示通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的能力，

任选地，与其野生型相比，所述细胞显示酶E₁的活性增加。

3.如权利要求2所述的细胞，其特征在于与其野生型相比，它还显示酶E₂的修饰活性，其中酶E₂选自

酶E₂，由Seq ID No.4的多肽序列组成，其中酶E₂的酶活性旨在表示通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的能力。

4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于与其野生型相比，它显示酶E₁和E₂中至少一种的活性增加。

5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于与其野生型相比，它显示酶E₁和E₂两种酶的活性均增加。

6.如权利要求2-5任一项所述的细胞，其特征在于它选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)，粉状毕赤酵母(Pichia pastoris)，西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)，解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)，白色念珠菌(Candida albicans)，实用假性酵母(Candida utilis)和棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)。

7.如权利要求2-6中至少一项所述的细胞用于生产鞘氨醇碱基和/或鞘脂的用途。

8.一种用于生产鞘氨醇碱基和/或鞘脂的方法，包括如下步骤

a)将权利要求2-6中至少一项所述的细胞与包含碳源的培养基接触，

b)在使细胞能够从所述碳源形成鞘氨醇碱基和/或鞘脂的条件下培养细胞，和

c)任选地，分离形成的鞘氨醇碱基和/或鞘脂。

9.一种用于生产N-乙酰化脂肪族伯胺的方法，包括处理步骤

A)将酶E₁与包含脂肪族伯胺和乙酰辅酶A的培养基接触，其中酶E₁选自

酶E₁，由Seq ID No.2的多肽序列组成，其中酶E₁的酶活性旨在表示通过转移来自乙酰辅酶A的3分子乙酰残基，将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的能力，

B)任选地，分离形成的乙酰化胺。

10.如权利要求9所述的方法，将酶E₁和E₂与包含脂肪族伯胺和乙酰辅酶A的培养基接触，其中酶E₂选自

酶E₂，由Seq ID No.4的多肽序列组成，其中酶E₂的酶活性旨在表示通过转移来自乙酰辅酶A的1分子乙酰残基，将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的能力。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述脂肪族伯胺是选自具有6到18个碳原子的那些。

12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述脂肪族伯胺是线性的。