CN113684162A - 一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过密码子优化、信号肽的筛选，使得小鼠防御素mBD14能够在植物乳杆菌中异源稳定、高效表达；通过将小鼠防御素mBD14在食品级的宿主植物乳杆菌中表达，使得小鼠防御素mBD14随着植物乳杆菌在肠道中起作用，可有效增强肠道屏障、抑制肠道炎症、降低肠道炎症水平，作为一种有效的新型口服产品，具备广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
抗菌肽(AMP)，也称为宿主防御肽，是几乎在所有动植物中都发现的免疫系统进化保守分子。AMP，主要是cathelicidins，defensins和再生的胰岛衍生蛋白，主要表达在上皮表面，由于其杀菌能力，在抵抗感染和调节微生物群中起着至关重要的作用。
防御素是一类富含二硫键的阳离子型多肽，广泛分布于真菌、植物与动物中，是生物免疫系统中的重要调节分子，此外，防御素具有直接的杀菌功能，是一类重要的抗菌肽。β-防御素是Diamond等(1991)首先在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的，后又在牛粒性白细胞中发现了13种与其序列高度相似，但其共有序列与α-防御素不同，故被命名为β-防御素。根据一级结构分析，mBD14与人的直向同源物表现出更高的同源性(68％)，包含三个保守的半胱氨酸键。前期研究表明，小鼠的胰腺内分泌细胞表达β-防御素14(mBD14)可用于治疗小鼠的自身免疫性糖尿病和实验性自身免疫性脑脊髓炎。mBD14是一种小蛋白，在口服mBD14过程中会使得其蛋白三维结构发生变化从而失去活性，故已有研究中的治疗手段均为注射给药，但是在临床应用中注射给药需要较高的技术含量和成本，若采用口服免疫方式给药，将给治疗带来极大的便利。然而口服mBD14易被消化道酶降低、无法实现肠道靶向递送mBD14，如何通过口服mBD14方式实现其免疫调节功能仍然是本领域内需要解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中口服mBD14易被消化道酶降低、无法实现肠道靶向递送mBD14、最大化实现其局部免疫调节效果的缺陷，提供一种分泌表达mBD14蛋白重组植物乳杆菌及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种植物乳杆菌，表达并分泌小鼠防御素mBD14，所述小鼠防御素mBD14基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
在一种实施方式中，所述小鼠防御素mBD14基因通过pNZ8148载体表达。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌FCQHC24L1为宿主。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌FCQHC24L1公开于2019年题为《不同生态位的植物乳杆菌的基因组及主要生理特性差异研究》的论文中，申请人承诺自申请日起20年内向合法途径下实施本发明的公众发放该菌株。
在一种实施方式中，利用信号肽Usp45促进小鼠防御素mBD14的表达。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌表达核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的重组片段；所述重组片段是利用Linker将信号肽Usp45与小鼠防御素mBD14基因连接得到。
在一种实施方式中，所述信号肽Usp45通过linker与小鼠防御素mBD14基因连接，所述linker的序列为GGCGGTGGCGGCAGC；所述信号肽Usp45的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二个目的是提供构建所述植物乳杆菌的方法将核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示的重组片段与pNZ8148连接，得到重组载体，再将重组载体转化至植物乳杆菌细胞中。
在一种实施方式中，利用SphΙ、XbaΙ双酶将重组片段与pNZ8148连接。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌FCQHC24L1为宿主。
本发明的第三个目的是提供含有所述植物乳杆菌的食用或药用组合物。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌在组合物中的含量不低于1.0×106CFU/mL或1.0×106CFU/g。
在一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。
在一种实施方式中，所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
本发明的第四个目的是提供一种疫苗的制备方法，所述疫苗含有所述植物乳杆菌。
在一种实施方式中，将植物乳杆菌以(1～10):100的比例接种于5ug/mL氯霉素GM17液体培养基，28～35℃静置培养过夜，将过夜培养物以(1～10):100的比例接种于含MRS液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，将培养基离心、弃上清，并用PBS溶液悬浮菌泥，作为口服疫苗使用。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌(悬浮菌泥)的浓度达1012CFU/mL数量级。
本发明的第五个目的是提供一种疫苗，所述疫苗含有所述植物乳杆菌。
在一种实施方式中，所述疫苗为口服疫苗，可采用灌胃或饲喂的方式使用。
本发明的第六个目的是提供所述植物乳杆菌在制备可引入肠道的产品中的应用，所述产品具有如下至少一种功能：
(a)提高肠道屏障功能；
(b)抑制肠道炎症；
(c)预防肠道炎症及肠道炎症引起的疾病；
(d)预防因肠道稳态失衡引起的或相关的疾病；
(e)抑制炎症因子IL-6和IL-1β的表达。
在一种实施方式中，所述肠道稳态失衡引起的或相关的疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、代谢综合征、结肠癌。
本发明的第六个目的是提供所述植物乳杆菌在制备预防或治疗结肠炎产品中的应用。
有益效果：本发明通过密码子优化、信号肽的筛选，使得小鼠防御素mBD14能够在植物乳杆菌中异源稳定、高效表达；
本发明将小鼠防御素mBD14在食品级的宿主植物乳杆菌中表达，使得小鼠防御素mBD14随着植物乳杆菌在肠道中起作用，克服了之前mBD14在口服方式中易被消化道酶降解、无法顺利递送至肠道内起到调节作用的难题；
本发明制备得到的重组植物乳杆菌、并将其制备成口服疫苗，施用于小鼠之后，可以有效预防外界对于肠道的刺激与破坏，增强肠道屏障功能，抑制肠道炎症、降低肠道炎症水平。是一种有效的新型口服产品，具备广阔的应用前景。
附图说明
图1为Usp45-Linker-mBD14基因片段的PCR扩增结果图；1为DL2000 DNA Marker；2-4为Usp45-Linker-mBD14基因片段的PCR扩增；
图2为重组植物乳杆菌L.plantarumFCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的质粒鉴定结果图；1为DL2000 DNA Marker；2-4为重组植物乳杆菌L.plantarumFCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的质粒提取鉴定；
图3为重组植物乳杆菌L.plantarumFCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的PCR鉴定结果图；1为DL2000 DNA Marker；2-3为L.plantarumFCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的PCR鉴定。
图4为重组菌L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-mBD14的PCR产物鉴定图。
图5为Usp45-Linker-mBD14的核苷酸序列图对目的蛋白RNA水平表达量影响的比较图；*表示p＜0.05。
图6为信号肽对于目的蛋白RNA水平表达量的影响图。
图7为转入pNZ8148载体正常生长的植物乳杆菌重组菌。
图8为不同处理对小鼠结肠长度的影响图。
图9为不同处理对小鼠体重的影响图；****表示p<0.001。
图10为不同处理对小鼠DAI的影响图；**表示p<0.01，****表示p<0.001。
图11为不同处理对小鼠结肠组织中炎症因子IL-6I和L-1β的影响图；**表示p＜0.01，*表示p＜0.05。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
实施例1：重组质粒pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的构建
(1)相关基因序列的合成：根据目的基因mBD14基因的序列(核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示)，Linker序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)，Usp45信号肽序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，利用Linker序列将目的基因和Usp45信号肽序列连接，得到序列Usp45-Linker-mBD14，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，在SEQ ID NO:6的基础上对其进行优化，得到核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的优化后的Usp45-Linker-mBD14。
所用的引物：XbaΙ-Usp45-Linker-mBD14-F和Usp45-Linker-mBD14-SphΙ-R。XbaΙ-Usp45-Linker-mBD14-F为含有与pNZ8148融合表达的酶切位点XbaΙ和信号肽Usp45-Linker-mBD14的5'端最初一段序列的上游引物，Usp45-Linker-mBD14-SphΙ-R为信号肽Usp45-Linker-mBD14基因反向引物。XbaΙ-Usp45-Linker-mBD14-F，Usp45-Linker-mBD14-SphΙ-R引物序列分别如SEQ ID NO:8和如SEQ ID NO:9所示。
(2)Usp45-Linker-mBD14基因片段的PCR扩增：以优化合成的Usp45-Linker-mBD14基因为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul)1μL，0.3μM的引物XbaΙ-Usp45-Linker-mBD14-F，Usp45-Linker-mBD14-SphΙ-R各1.5μL，模板1.5μL，25mM MgSO4 2μL，2mMdNTPs 5μL，10×Buffer for KOD-Plus-5μL，用ddH2O补至50μL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃后延伸10min。PCR反应完成，将产物进行1.0％琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约382bp的扩增条带，与预期结果一致(如图1)，回收的产物将作为连接模板用于获得添加Usp45-Linker-mBD14序列的完整片段。
(3)重组质粒pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的构建：将步骤(2)中回收的PCR产物用SphΙ、XbaΙ进行双酶切处理，胶回收大小约382bp的条带；以同样的方法对pNZ8148空质粒进行双酶切，胶回收大小约3100bp的条带。分别取4μL双酶切后胶回收的Usp45-Linker-mBD14基因片段和1μL双酶切后胶回收的pNZ8148空质粒，将Usp45-Linker-mBD14和pNZ8148按照摩尔比6：1添加，10×ligation buffer 2μL，T4 DNA Ligase(350U/μL)1μL，用ddH2O补至20μL，混匀后置于4℃条件下连接过夜，将连接产物转化L.plantarum FCQHC24感受态细胞，在含有5μg/mL氯霉素(Chloramphenicol，Ch)的GM17琼脂培养板中，37℃培养两天，然后挑取单个菌落进行PCR鉴定。PCR鉴定以待检菌落为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus(1.0U/ul)1μL，0.3μM的引物SphΙ-Usp45-Linker-mBD14-F，Usp45-Linker-mBD14-XbaΙ-R各1.5μL，模板1.5μL，25mM MgSO4 2μL，2mM dNTPs 5μL，10×Buffer for KOD-Plus 5μL，用ddH2O补至50μL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃后延伸10min。PCR反应完成，将产物进行1.0％琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约382bp的扩增条带，与预期结果一致(如图2)，对检测阳性的菌液用质粒DNA抽提试剂盒进行质粒抽提，并进行双酶切鉴定和测序测定，即为获得了重组质粒pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14。
实施例2：含mBD14基因的分泌型重组植物乳杆菌的构建
(1)植物乳杆菌电转化感受态细胞的制备：从健康人粪便的粪便中分离得到的植物乳杆菌FCQHC24L1，是从江南大学(无锡，中国)的室内食品微生物学培养物保藏中心(CCFM)获得的(2019年公开于《不同生态位的植物乳杆菌的基因组及主要生理特性差异研究》的论文中)。
将冻存的L.plantarum FCQHC24L1植物乳杆菌(划GM17平板复苏，挑取单个菌落在含GS的GM17(17.10g蔗糖，2.50g甘氨酸，5.50g M17培养基，0.5g葡萄糖溶于100mL蒸馏水中，调pH至7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min))培养基的试管中30℃培养过夜，以1:10的体积比接入10mL新的GM17液体培养基30℃培养，监测OD600至0.3-0.4，将培养好的菌液移入干净的离心管中4000rpm，4℃离心20min，收集菌体。用10mL冰水预冷的0.5mol/L蔗糖、100mL/L甘油溶液洗涤，4000rpm，4℃离心15min，收集菌体；用5mL冰水预冷的0.5mol/L蔗糖、100mL/L甘油、50mM EDTA溶液重悬菌体，冰上静置15min，4000rpm，4℃离心15min，收集菌体；最后用100μL预冷的0.5mol/L蔗糖、100mL/L甘油溶液重悬菌体，即为植物乳杆菌感受态细胞，50μL每管分装，-80℃保存备用。
(2)植物乳杆菌的电击转化及转化子的PCR鉴定：各取50μL L.plantarum FCQHC24感受态细胞，冰浴上融解，加入1μL实施例1中制备得到的质粒pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14，轻轻混匀；将以上混合物转入冰预冷的2mm电击杯，迅速给予一个单脉冲，参数设置为2kV，25F，200Ω，电击后立即轻柔加入1mL冰预冷的GM17恢复培养基(3.72gM17培养基，0.19g MgCl2，0.02g CaCl2，0.5g葡萄糖，溶于100mL蒸馏水，调pH至7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min)，将菌液全部吸入一灭菌离心管，盖紧管盖，冰浴5min后30℃静置培养2h；将菌液分为100μL、200μL、600μL均匀涂布于含有5ug/mL氯霉素的GM17平板，30℃静置培养3-4天。重组表达菌命名为L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14。挑取单个菌落，取菌落用DNA微量提取试剂盒提取质粒后进行PCR鉴定，具体操作过程如实施例1的步骤(2)所述，只是模板换成待检重组植物乳杆菌菌液，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的PCR产物可见约382bp的正确扩增条带(图3)。
实施例3：植物乳杆菌制备疫苗中的应用
L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14重组植物乳杆菌口服疫苗的制备：将L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14以1:100的比例接种于5ug/mL氯霉素GM17液体培养基，30℃静置培养过夜，将过夜培养物以1:100的比例接种于10mL含MRS液体培养基，继续培养约2.5h至细菌进入对数生长期(OD690为0.60-0.65)，吸取13mL培养基，3000rpm，4℃离心15min，弃上清，用2ml灭菌后的PBS溶液悬浮菌泥，作为口服疫苗使用，采用梯度稀释涂板测定重组菌的浓度达1012CFU/mL数量级。
实施例4：植物乳杆菌在预防急性结肠炎中的应用
将实施例3制备的含重组植物乳杆菌L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的口服疫苗初步研究重组菌的免疫效果。
将48只6～8周龄周龄的雄性Balb/c小鼠随机分为8组饲养，每组6只，第1组为生理盐水对照(NC)，第2组急性结肠炎模型(M)，第3组L.plantarum FCQHC24组，第4组L.plantarum FCQHC24/pNZ8148(在L.plantarum FCQHC24表达pNZ8148空载)组，第5组L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14组(即口服疫苗)。适应一周后，采用灌胃的方式提前口服免疫(第1-2组灌胃生理盐水，第3组灌胃L.plantarum FCQHC24菌液，第4组灌胃L.plantarum FCQHC24/pNZ8148菌液，第5组灌胃L.plantarum FCQHC24/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14菌液)，连续免疫7天，剂量为每天200μL/只，之后5％DSS饮水7天建立急性结肠炎模型。然后在第14天处死小鼠，对小鼠体重、结肠长度和结肠炎相关炎性指标进行测定。
体重测定方法：每日在灌喂之前用同一个称对每只小鼠体重进行记录；
结肠长度测定：处死小鼠时，完整地取出结肠，并用刻度尺进行测量；
炎性指标(IL-6、IL-1β)测定方法：处死小鼠后，采用实时定量荧光PCR技术(qPCR)对结肠组织中的IL-6、IL-1β表达的mRNA进行测定。
结果如图8-图11所示：
图8显示，第14天时，L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14组的结肠长度为6.20cm，明显比模型组的4.75cm以及L.plantarum FCQHC24L1组的5.10cm、L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148组的4.95cm长；
图9显示，在DSS诱导的第一天开始对小鼠每天称重，L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14组的结肠体重下降相比模型组以及L.plantarum FCQHC24L1组、L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148组有减缓趋势；
图10显示，在DSS溶液诱导结肠炎的第一天开始每天观察小鼠状态并进行打分，L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14组的疾病活动指数(DAI)值相比模型组以及L.plantarum FCQHC24L1组、L.plantarum FCQHC24/L1pNZ8148组有改善；
图11显示，L.plantarum FCQHC24 L1/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14组的结肠组织中炎性因子IL-6和IL-1β相比模型组以及L.plantarum FCQHC24组、L.plantarumFCQHC24/pNZ8148组结肠组织中的表达量显著降低。
上述结果表明，含L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的口服疫苗能够很好地通过减轻炎症因子细胞的分泌、减轻炎症细胞的浸润，从而起到增强肠道屏障、预防肠道疾病的效果。
对比例1
具体实施方式同实施例1，区别在于，质粒pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14替换为pNZ8148-mBD14，结果显示，L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-mBD14的PCR产物可见约382bp的正确扩增条带(图3)，而L.plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-mBD14的PCR产物只有150bp左右的不完全扩增条带(图4)。
对比例2
具体实施方式同实施例1与实施例2，区别在于，Usp45-Linker-mBD14的核苷酸序列(SEQ IDNO：6)替换为优化后序列(SEQ IDNO：7)。将构建得到的重组菌按照实施例4的方式饲喂小鼠，然后在第14天处死小鼠，对结肠中的目的基因的mRNA表达量进行检测，结果显示优化后的Usp45-Linker-mBD14的核苷酸序列目的基因的RNA表达水平显著提高(图5)。
对比例3
具体实施方式同实施例1与实施例2，区别在于Usp45信号肽替换为OmpA信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和PelB信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)，构建得到重组菌，将构建得到的重组菌按照实施例4的方式饲喂小鼠，然后在第14天处死小鼠，对结肠中的目的基因的mRNA表达量进行检测，结果显示，带有Usp45信号肽的mBD14基因相较于带有OmpA信号肽和PelB信号肽基因表达更高(图6)。
对比例4
具体实施方式同实施例1与实施例2，区别在于pNZ8148载体替换为pNZ8100载体，结果显示。pNZ8100载体不适合作为植物乳杆菌重组工程菌载体，表现在于电转化后没有在恢复培养基中长出转化子，而pNZ8148载体则长出转化子(图7)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用
<130> BAA210561A
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggcttcatt atctgctatt tgtattcctc atcttgttct tggtgcctgc tccaggggac 60
gcattcctac caaaaaccct ccgaaaattt ttctgcagaa taagaggtgg ccggtgtgct 120
gtacttaact gccttggaaa ggaagaacaa ataggtcgat gttctaatag cggtcgaaaa 180
tgctgccgaa agaagaagta gtctaga 207
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<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgaaaaaaa aaatcatcag cgcgattctg atgagcaccg ttattctgag tgccgccgcc 60
ccactgagtg gcgtttatgc cgacaccaac agcgatatcg ccaaacaaga tgcc 114
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggcag gtttcgctac cgtcgctcag 60
gct 63
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaaatatg tatgtattac agctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60
atggcc 66
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggcggtggcg gcagc 15
<210> 6
<211> 382
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcatgcaacc gaacttaatg ggaggaaaaa ttaaaaaaga acagttatga aaaaaaagat 60
tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct gcagccccgt tgtcaggtgt 120
ttacgctgac acaaactcag ctcttgctaa acaagatgcg ggcggtggcg gcagcaggct 180
tcattatctg ctatttgtat tcctcatctt gttcttggtg cctgctccag gggacgcatt 240
cctaccaaaa accctccgaa aatttttctg cagaataaga ggtggccggt gtgctgtact 300
taactgcctt ggaaaggaag aacaaatagg tcgatgttct aatagcggtc gaaaatgctg 360
ccgaaagaag aagtagtcta ga 382
<210> 7
<211> 382
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcatgcaacc gaacttaatg ggaggaaaaa ttaaaaaaga acagttatga aaaaaaaaat 60
tatttctgct attttaatgt caacagttat tctttcagct gctgctccac tttctggtgt 120
ttacgctgac acaaactcag ctcttgctaa gcaagatgct ggaggtggag gatcacgtct 180
tcactatctt ttatttgttt ttttaattct tttccttgtt ccagcaccgg gtgacgcttt 240
ccttcctaag acacttcgta aatttttttg tcgtattcgt ggaggtcgtt gcgctgttct 300
taactgcctt ggtaaggagg agcagattgg tcgttgctca aactctggtc gtaagtgctg 360
ccgtaagaag aagtaatcta ga 382
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaattgacgc gtattgggat gcatgcaacc gaacttaatg ggaggaaa 48
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctcggcgcg ccattgggat tctagattac ttcttcttac ggcagcactt acgaccagag 60
tttgag 66
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌，其特征在于，表达并分泌小鼠防御素mBD14，所述小鼠防御素mBD14基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述小鼠防御素mBD14基因通过pNZ8148载体表达。
3.根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌FCQHC24L1为宿主。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌，其特征在于，利用信号肽Usp45促进小鼠防御素mBD14的表达。
5.根据权利要求4所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌表达核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的重组片段；所述重组片段是利用Linker将信号肽Usp45与小鼠防御素mBD14基因连接得到。
6.构建权利要求1～5任一所述植物乳杆菌的方法，其特征在于，将核苷酸序列如SEQID NO:7所示的重组片段与pNZ8148连接，得到重组载体，再将重组载体转化至植物乳杆菌细胞中。
7.含有权利要求1～5任一项所述植物乳杆菌的食用或药用组合物。
8.一种疫苗，其特征在于，含有权利要求1～5任一项所述植物乳杆菌。
9.权利要求1～5任一项所述植物乳杆菌在制备可引入肠道的产品中的应用，其特征在于，所述产品具有如下至少一种功能：
(a)提高肠道屏障功能；
(b)抑制肠道炎症；
(c)预防肠道炎症及肠道炎症引起的疾病；
(d)预防因肠道稳态失衡引起的或相关的疾病；所述肠道稳态失衡引起的或相关的疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、代谢综合征、结肠癌；
(e)抑制炎症因子IL-6和IL-1β的表达。
10.权利要求1～5任一项所述植物乳杆菌在制备预防或治疗结肠炎产品中的应用。
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| CN202110629166.XA CN113684162B (zh) | 2021-06-03 | 2021-06-03 | 一种表达小鼠防御素mBD14基因的重组植物乳杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN113684162B CN113684162B (zh) | 2024-02-27 |
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ID=78576450
Family Applications (1)
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102159233A (zh) * | 2008-07-18 | 2011-08-17 | 诺维信阿德宁生物技术公司 | 使用哺乳动物β防御素的炎性肠病的治疗 |
| CN102438637A (zh) * | 2009-03-05 | 2012-05-02 | 益生菌股份公司 | 具有高抗炎活性的细菌菌株 |
| CN102740867A (zh) * | 2010-01-14 | 2012-10-17 | 法国国家健康与医学研究院 | 用于预防和治疗炎症性肠病(ibd)和肠易激综合征(ibs)的重组益生菌 |
| CN111333713A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-06-26 | 江南大学 | 一种表达小鼠抗菌肽基因的植物乳杆菌 |
-
2021
- 2021-06-03 CN CN202110629166.XA patent/CN113684162B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102159233A (zh) * | 2008-07-18 | 2011-08-17 | 诺维信阿德宁生物技术公司 | 使用哺乳动物β防御素的炎性肠病的治疗 |
| CN102438637A (zh) * | 2009-03-05 | 2012-05-02 | 益生菌股份公司 | 具有高抗炎活性的细菌菌株 |
| CN102740867A (zh) * | 2010-01-14 | 2012-10-17 | 法国国家健康与医学研究院 | 用于预防和治疗炎症性肠病(ibd)和肠易激综合征(ibs)的重组益生菌 |
| CN111333713A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-06-26 | 江南大学 | 一种表达小鼠抗菌肽基因的植物乳杆菌 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DING ET AL.: "Potential role of Lactobacillus plantarum in colitis induced by dextran sulfate sodium through altering gut microbiota and host metabolism in murine model", 《SCI CHINA LIFE SCI》, pages 1 - 11 * |
| JOHANN RÖHRL ET AL.: "Identification and Biological Characterization of Mouse β-Defensin 14, the Orthologue of Human β-Defensin 3", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》, vol. 283, no. 9 * |
| 王婷婷等: "表达禽β-防御素6 重组乳酸菌的构建 及其免疫调节活性检测", 《中国预防兽医学报》, vol. 42, no. 9, pages 931 - 937 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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